JP7846899B2 - プロテオグリカンを含む軟骨成分混合物の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、プロテオグリカンを含む軟骨成分混合物の製造方法など、に関する。

プロテオグリカン（以下「ＰＧ」と称する場合がある。）は、１本のコアタンパク質にコンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸等のグリコサミノグリカンが数本から数十本共有結合した糖タンパク質であり、細胞外マトリックスの一つとして皮膚や軟骨など体内に広く分布している。軟骨中のＰＧは、コラーゲンやヒアルロン酸と共に凝集体を形成しており、代表的な軟骨型ＰＧは、アグリカンと称される。アグリカンはコアタンパク質に大量のグリコサミノグリカン糖鎖が結合すると共に、そのＮ末端側には、ヒアルロン酸およびリンクタンパク質の結合領域を有する。

グリコサミノグリカンは分岐をもたない長い直鎖構造を持ち、多数の硫酸基とカルボシキル基を持つため負に荷電しており、その電気的反発力のために伸びた形状をとる。また、糖の持つ水親和性により、ＰＧは多量の水を保持し、弾力や衝撃への耐性といった軟骨特有の機能を担っている。さらに、ＰＧには抗炎症作用、ヒアルロン酸合成促進作用、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）様作用等多くの生理機能を有することが明らかとなり、食品や化粧品への応用に期待が寄せられている。

これまで、高純度のＰＧを効率よく製造する方法が研究されてきた。例えば、サケ鼻軟骨から酢酸を用いてＰＧを抽出する方法（特許文献１参照）や、酢酸溶液の抽出温度と撹拌速度を制御してＰＧを抽出する方法（特許文献２参照）が知られている。その他、クエン酸水溶液を用いてＰＧを抽出する方法（特許文献３参照）、特定の酸性溶液または所定濃度のプロテアーゼ存在下で抽出を行うことでプロテオグリカンを軟骨組織から効率的かつ高純度に製造する方法（特許文献４参照）などが報告されている。一方、軟骨には、プロテオグリカンの他にコラーゲンやヒアルロン酸などの軟骨成分が含まれているが、これらを同時に抽出して機能性食品や化粧品の素材として利用することも期待されている。

特許第３７３１１５０号公報 特許第６３１７０５３号公報 特許第５７４９０６７号公報 特開２０２０－１２７３９７号公報

そこで本発明が解決しようとする課題は、軟骨からＰＧを抽出等する際に、コラーゲンなどその他の軟骨成分を、ＰＧと同時に且つ効率よく抽出等することなど、である。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、抽出溶液の濃度や抽出方法などの様々な条件を最適化又は組み合わせることでプロテオグリカンを含む軟骨成分混合物の製造方法を見出すに至った。すなわち、本発明は以下の実施形態を含む。

（１）凍結乾燥された軟骨を粉砕して粉砕物を得る工程と、粉砕物をクエン酸含有エタノール溶液にて洗浄（脱脂、精製なども含む）する工程と、クエン酸含有エタノール溶液で洗浄した粉砕物を、さらにエタノールにて洗浄する工程と、エタノール洗浄後の粉砕物を乾燥及び粉砕して粉末を得る工程と、粉末に水を加えて湿式粉砕する工程と、を含む、プロテオグリカンを含む軟骨成分混合物の製造方法。好ましくは、粉末に水を加えて湿式粉砕する工程の後に、更に湿式粉砕後の水溶液から異物などを除去する工程も含む、当該製造方法。
（２）クエン酸含有エタノール溶液が、１質量％以上３０質量％以下のクエン酸を含む（１）に記載の製造方法。
（３）軟骨成分混合物が、固形分換算で３０質量％以上のプロテオグリカンを含有する（１）又は（２）に記載の製造方法。
（４）軟骨成分混合物が、固形分換算で少なくとも２０質量％の水溶性コラーゲンを含有する（１）～（３）のいずれか一項に記載の製造方法。
（５）プロテオグリカンの分子量が８０万～９０万である（１）～（４）のいずれか一項に記載の製造方法。
（６）軟骨を、０．０３質量％以上４質量％未満の酢酸水溶液中に浸漬して軟骨成分抽出液を得る工程と、得られた抽出液から軟骨成分を回収する工程とを含む、プロテオグリカンを含む軟骨成分混合物の製造方法。
（７）酢酸水溶液の濃度が０．５質量％以上３質量％以下である（６）に記載の製造方法。
（８）軟骨成分混合物が、コラーゲンを含み、コラーゲンの含有率が、固形分換算で少なくとも２０質量％である（６）又は（７）に記載の製造方法。
（９）プロテオグリカンの分子量が４０万～６５万である（６）～（８）のいずれか一項に記載の製造方法。
（１０）軟骨を０．０１質量％以上０．０５質量％未満のクエン酸水溶液中に、３０～８０℃で浸漬して軟骨成分抽出液を得る工程と、この抽出液から軟骨成分を回収する工程と、を含むプロテオグリカンを含む軟骨成分混合物の製造方法。
（１１）プロテオグリカンの分子量が５０万～９０万である（１０）に記載の製造方法。
（１２）軟骨が、サケ頭部の鼻軟骨である（１）～（１１）のいずれか一項に記載の製造方法。
（１３）軟骨を、ｐＨ２．０～４．０の水又は水溶液に浸漬して軟骨成分抽出液を得る工程と、得られた抽出液から軟骨成分を回収する工程とを含む、プロテオグリカンを含む軟骨成分混合物の製造方法。

本発明の方法によれば、効率よくプロテオグリカン及びコラーゲンなどその他の軟骨成分混合物を製造することができる。

図１は、第１の実施形態に係る製造方法の流れを示す工程図である。 図２は、第２又は第３の実施形態に係る製造方法の流れを示す工程図である。

次に、本発明の各実施形態について、図面を参照して説明する。なお、以下に説明する各実施形態は、特許請求の範囲に係る発明を限定するものではなく、また、各実施形態の中で説明されている諸要素及びその組み合わせの全てが本発明の解決手段に必須であるとは限らない。

本発明の製造方法は、プロテオグリカンを含む軟骨成分混合物を得ることを目的とするが、最初に、この軟骨成分混合物について説明し、続いて、その具体的な製造方法について詳細に説明する。

（軟骨成分混合物）
本発明の製造方法により得られる生産物は、プロテオグリカンと共に、その他の軟骨成分を含む混合物である。このプロテオグリカン以外の軟骨成分としては、コラーゲン及びヒアルロン酸を含むがこれらに限定されない。軟骨とは、脊椎動物の鼻、肋骨、関節、気管の周囲、耳殻、椎間板などに存在する結合組織の１つであり、細胞外基質と、軟骨細胞との複合体をいう。軟骨における細胞外基質を、軟骨基質という場合もある。軟骨基質の主成分は、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸及びプロテオグリカンなどを含む。

プロテオグリカンは、タンパク質をコアとして、コンドロイチン硫酸やデルマタン硫酸等のグリコサミノグリカンが共有結合した複合多糖であり、動物組織、特に軟骨組織に多く存在する。プロテオグリカンは生体内で、コア蛋白質がさらにヒアルロン酸に結合した構造で存在することも知られており、その分子量は、数万～数千万と大きい。軟骨由来の典型的なプロテオグリカンは、アグリカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）と称される。

コラーゲンはアミノ酸が鎖状につながった分子量約１０万のポリペプチド分子が３本集まったらせん構造を有しており、これが繊維状あるいは膜状の構造体を形成するものである。コラーゲンを構成するアミノ酸の種類と数は極めて特徴的で、その特徴の一つとして，一般的なタンパク質を構成する２０種類の基本アミノ酸には含まれないヒドロキシプロリンやヒドロキシリジンといったアミノ酸を含む。これらのアミノ酸はコラーゲンとその近縁の限られたタンパク質にしか含まれない特殊なアミノ酸であり、特にヒドロキシプロリンはコラーゲン中の全アミノ酸の約１０％を占めている。このため、ヒドロキシプロリンがコラーゲン量の目安と考えることができるものである。アミノ酸組成の違いによるコラーゲンの種類は特に限定されないが、軟骨に多く含まれるコラーゲンとしてＩＩ型コラーゲンが好ましい。

ヒアルロン酸は、Ｎ－アセチルグルコサミンとグルクロン酸とが結合した二糖単位がつながった鎖状構造を有する、ムコ多糖高分子化合物である。その他の軟骨成分としては、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチンなどを挙げることができる。

（第１の実施形態）
本発明の第１の実施形態に係るプロテオグリカンを含む軟骨成分混合物の製造方法は、水に溶けにくい成分を効率的に抽出して可溶性成分とすることができる製造方法である。図１は、この製造方法の典型的な実施形態を示す工程図である。第１の実施形態に係る方法は、冷凍軟骨を凍結乾燥及び粉砕する凍結乾燥・粉砕工程（Ｓ０１）と、得られた粉砕物を洗浄（脱脂、精製なども含む）する洗浄工程（Ｓ０２）と、洗浄後の粉砕物を乾燥及び粉砕して粉末を得る粉末化工程（Ｓ０３）とを含む。

本実施形態において、出発原料としての冷凍軟骨は、例えば魚類、軟体動物、鳥類又は哺乳類の軟骨組織を用いることができるが、魚類軟骨組織、特に、サケ頭部の鼻軟骨が好ましい。本実施形態では、入手の容易性、及びコストの面などから、例えば、サケ科の魚の頭部に含まれる鼻軟骨組織由来のものが好適に用いられ、例えば、漁獲されたサケ（主にシロサケ）が、様々な加工品として処理される際、排出される頭部を使用することができる。

凍結乾燥・粉砕工程（Ｓ０１）は、軟骨に含まれる多くの水分を除去したのち粉砕する工程である。凍結乾燥方法は特に限定されるものではないが、品温が３５℃以下で凍結乾燥することが好ましい。凍結乾燥により、質量が約１０分の１程度となった軟骨を適度な大きさに粉砕する。当該粉砕は、例えば、粒子径１０から１６メッシュ（mesh）程度の粗粉末とすることなどである。粉砕方法は特に限定されないが、例えば、くし歯型解砕機、ローラー型粉砕機、乳鉢、ジョークラッシャー、ローラーミル、ジェットミル等で適度な大きさの粉砕物とすることができる。

洗浄工程（Ｓ０２）は、得られた粉砕物をエタノール中に分散して脂質などを取り除く工程である。使用するエタノールの容量及び分散時間は、軟骨原材料に含まれる脂肪をできるだけ除去するように適宜調整することができるが、一例としては、用いる粉砕物に対して約１０倍容量のエタノールを添加し、約５０℃で３０分から１時間程度攪拌することで効率よく洗浄することができる。エタノール洗浄の回数は、複数回行ない、初回のエタノール溶液には、例えばクエン酸又はその塩を添加することが好ましい。クエン酸又はその塩の添加により、脂質などを効率的に取り除くことができ、保存中に脂質の酸化による悪臭を防ぐという効果を有する。クエン酸の添加量の下限は、特に限定されないが、１質量％以上が好ましく、３質量％以上がより好ましく、５質量％以上がさらに好ましい。クエン酸添加量の上限も特に限定されないが、エタノールに溶解する飽和量を超えて添加しても溶けないことなどから３０質量％以下が好ましく、２０質量％以下がより好ましく、１５質量％以下がさらに好ましい。

このようにしてエタノール洗浄された粉砕物は、粉末化工程（Ｓ０３）にて、さらに乾燥及び粉砕する。その結果、例えば、粒子径が４８から８０メッシュ（mesh）程度のより細かな粉末とすることができる。エタノールを蒸発させるための乾燥方法は特に限定されず、室温で放置するだけでもよいが、効率的に行うためには、加熱温度３５℃以下にて減圧乾燥することが好ましい。粉砕方法も特に限定されず、例えば、ハンマーミル、ピンミル等の衝撃式ミル、ボールミル、タワーミル等の媒体ミル、ジェットミル等の乾式粉砕装置を用いることができる。

続いて本実施形態の製造方法は、エタノール洗浄後の粉末に水を加えて湿式粉砕する湿式粉砕工程（Ｓ０４）と、湿式粉砕後の水溶液から不溶物を除去する異物等除去工程（Ｓ０５）と、得られた水溶液を乾燥する乾燥工程（Ｓ０６）と、を含む。

湿式粉砕工程（Ｓ０４）における湿式粉砕とは、エタノール洗浄後の粉末を、水に分散した状態で機械的に粉砕処理する方法である。湿式粉砕に使用する装置としては、例えば、ホモミキサー、ディスパーミキサー、ウルトラミキサー、クレアミックス（商品名：エムテクニック）、マスコロイダー等の撹拌機、超音波ホモジナイザー、高圧ホモジナイザー等を用いることができる。本工程により微粉砕された軟骨成分は水に溶けやすくなってその大部分を水溶液として回収することができる。

異物等除去工程（Ｓ０５）は、好ましくは含まれる工程で、上記湿式粉砕工程で得られた水溶液から、製造工程で混入した異物などを除去する工程である。

乾燥工程（Ｓ０６）は、Ｓ０５の工程を経た水溶液から所定の条件で乾燥方法により乾燥粉末を得る工程である。この乾燥方法としては、通常、この用途で使用される方法であればいずれのものであってもよく、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、棚乾燥、ベルト乾燥、ドラム乾燥などを挙げることができる。このうち、粉体の取り扱いの観点から、噴霧乾燥、凍結乾燥が好ましい。

この第１の実施形態により得られるプロテオグリカンを含む軟骨成分混合物におけるプロテオグリカンの分子量は、好ましくは、８０万～９０万である。

（第２の実施形態）
本発明の第２の実施形態に係る製造方法は、低濃度の酢酸水溶液を用いて軟骨成分を抽出する方法である。図２は、この製造方法の典型的な実施形態を示す工程図である。第２の実施形態に係る方法は、冷凍軟骨を酢酸水溶液に浸漬して軟骨成分抽出液を得る抽出工程（Ｓ１０）と、得られた抽出液から軟骨成分を回収する回収工程（Ｓ２０）とを含む。

抽出工程（Ｓ１０）で用いる酢酸水溶液の濃度の下限は、プロテオグリカンの抽出効率を上げる観点などから、０．０３質量％以上であればよく、０．０５質量％以上が好ましく、０．１質量％以上がより好ましく、０．２５質量％以上がさらに好ましい。一方、酢酸水溶液における酢酸濃度の上限は、同時に抽出されるコラーゲンの抽出効率を上げる観点などから、４質量％未満であればよく、３．５質量％以下が好ましく、３．１質量％以下がより好ましく、２質量％以下がさらに好ましい。

回収工程（Ｓ２０）は、さらに具体的には、残った軟骨を除去する固液分離工程（Ｓ２１）と、回収した抽出液から脂質等を除去する脱脂工程（Ｓ２２）と、ろ過工程（Ｓ２３）と、精製工程（Ｓ２４）と、乾燥工程（Ｓ２５）とを含む。

脱脂工程（Ｓ２２）では、プロテオグリカン抽出液を粉末セルロース及び／又は吸油マットなどを用いることにより、混入すると考えられる脂質など成分を簡便に吸着除去する。ろ過工程（Ｓ２３）では、ろ紙等を用いる通常の方法により脂質等除去後の抽出液を得る。ファインメッシュや限外濾過膜を用いてもよい。例えば、適当な分画分子量を有する分離膜等で固液分離することにより、抽出液を回収する。マグネットトラップ等の通常の方法にて不溶物を除去した後、乾燥工程（Ｓ２５）では得られたろ液を真空凍結乾燥機により固形物にしてもよい。あるいは、スプレードライヤーで乾燥させ、粉末状固形分とすることもできる。

この第２の実施形態により得られるプロテオグリカンを含む軟骨成分混合物におけるプロテオグリカンの分子量は、好ましくは、４０万～６５万である。

（第３の実施形態）
本発明の第３の実施形態に係る製造方法は、第２の実施形態における酢酸水溶液の代わりに、低濃度のクエン酸水溶液を用いて軟骨成分を抽出する方法である。図２に示した第２の実施形態と同様に、本実施形態においても、冷凍軟骨を低濃度のクエン酸水溶液に浸漬して軟骨成分抽出液を得る浸漬工程（Ｓ１０）と、得られた抽出液から軟骨成分を回収する回収工程（Ｓ２０）とを含む。

抽出工程（Ｓ１０）で用いるクエン酸水溶液の濃度の下限は、プロテオグリカンの抽出効率を上げるなど観点から、０．０１質量％以上が好ましく、０．０１５質量％以上がより好ましく、０．０２質量％以上が更に好ましい。一方、クエン酸水溶液におけるクエン酸濃度の上限は、同時に抽出されるコラーゲンの抽出効率を上げるなど観点から、０．０５質量％未満が好ましく、０．０４９質量％以下がより好ましく、０．０４８質量％以下がより好ましく、０．０４７質量％以下がより好ましく、０．０４６質量％以下さらに好ましい。

抽出中のクエン酸水溶液の温度の下限は、浸漬液の腐敗を防止するなど観点から、下限が３０℃以上が好ましく、３３℃以上がより好ましく、３５℃以上が更に好ましい。浸漬中のクエン酸水溶液の温度の上限は、８０℃以下が好ましく、７０℃以下がより好ましく、６０℃以下が更に好ましい。抽出時間の下限は、１０時間以上が好ましく、１５時間以上がより好ましく、２０時間以上が更に好ましい。抽出時間の上限は９６時間以下が好ましくよく、７２時間以下がより好ましく、５０時間以下が更に好ましい。回収工程（Ｓ２０）は第２の実施形態と同様である。

この第３の実施形態により得られるプロテオグリカンを含む軟骨成分混合物におけるプロテオグリカンの分子量は、好ましくは、５０万～９０万である。

（その他）
第２の実施形態及び第３の実施形態で挙げている抽出工程（Ｓ１０）では、酢酸水溶液及びクエン酸水溶液の代わりに、ｐＨ２から４の水又は水溶液を用いることも可能である。プロテオグリカンの抽出効率を上げる観点などから、当該ｐＨは以下の通りである。
・ｐＨの下限は、好ましくは２以上、より好ましくは２．１以上、より好ましくは２．２以上、より好ましくは２．３以上、更に好ましくは２．４以上である。
・ｐＨの上限は、好ましくは４以下、より好ましくは３．９以下、より好ましくは３．８以下、より好ましくは３．７、更に好ましくは３．６以下である。

次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。なお、以下の実施例において、各種成分の添加量を示す数値の単位％は、質量％を意味する。

［実施例１］可溶性軟骨成分混合物の製造
－３０℃～－２０℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を、品温３５℃以下（当該鼻軟骨の温度を３５℃以下を保つこと）の条件で凍結乾燥を行い、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、１４メッシュパス相当の粉砕物を得た。９９％エタノール５５０Ｌに、５５ｋｇのクエン酸を溶解し、先に得られた軟骨粉砕物５５ｋｇを投入し、５０℃で1時間攪拌した。このように攪拌により洗浄した軟骨粉砕物を、遠心分離機を用いてエタノール溶液を除去した後、残渣を５５０Ｌの９９％エタノールに再度投入して５０℃にて３０分間攪拌した。これを遠心脱水機でエタノール溶液を除去した後、残渣を再度５５０Ｌの９９％エタノールに投入して５０℃にて３０分間攪拌洗浄した。エタノール洗浄後の粉砕物を遠心分離機でろ取し、加熱温度３５℃以下にて減圧乾燥し、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、約４０ｋｇの粉砕物を得た。

このようにして得られた６０メッシュパス相当の粉砕物に約８００ｋｇの精製水を加えて分散し、精密乳化分散機クレアミックス（エム・テクニック株式会社）を用いて湿式粉砕した。乳化分散処理後の処理液を、８０℃に上昇させ、３０分間加温して加熱殺菌した後、溶出液をステンレススチールメッシュ（１５０μｍ）でろ過した。ろ過して得られた水溶液を凍結乾燥機（ＦＤＵ－２１００、東京理化器械株式会社）を用いて凍結乾燥し、プロテオグリカンを含む可溶性軟骨成分混合物（約３５ｋｇ）を得た。

（プロテオグリカンの定量）
上記製造方法で得られた乾燥品約１ｇを精密に量り、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えて正確に１０ｍＬとしたものを試料溶液とした。各試料溶液を、０．４５μｍメンブレンフィルターを通した後、以下の操作条件でＨＰＬＣを行い標準品の検量線からプロテオグリカン量を求めた。なお、検量線の作成は、プロテオグリカン標準品（サケ鼻軟骨由来、富士フイルム和光純薬、１６２－２２１３１）を、室温減圧デシケーター（シリカゲル）で３時間乾燥してから採取したものを精密に量り取り、試料と同じリン酸緩衝液に溶解して検量線作成用標準液を調製した。また、分子量マーカーとして、Ｓｈｏｄｅｘ ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ－８２（昭和電工社製）を用いて作成した検量線からピークトップの分子量を求めた。

操作条件
分析計：ＨＰＬＣ分析装置
検出器：示差屈折率検出器（ＲＩＤ－１０Ａ 島津製作所製）
カラム：ゲルろ過カラム（東ソー株式会社製ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ）
カラム温度：４０℃
試料注入量：５０μＬ
移動相：リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ

（コラーゲンの定量）
コラーゲンは、一般的なタンパク質には含まれないヒドロキシプロリンとヒドロキシリジンを含むという特徴がある。ヒドロキシプロリンはコラーゲン中の全アミノ酸の約１０％を占めるといわれ、このヒドロキシプロリンを定量することによってコラーゲン量を推定することが可能である（皮革科学、vol.56、No.2、p71-79、2010「天然素材コラーゲンの機能性」）。上記製造方法で得られた乾燥品試料を、このヒドロキシプロリン量を測定することによりコラーゲン含有率を算出した。

（結果）
実施例１で製造した可溶性軟骨成分混合物に含まれるプロテオグリカンの分子量は約８４万、含有率は約４１％であった。また、この混合物中のコラーゲン含有率は３５～３８％であった。

［試験例１］プロテオグリカン含有の軟骨成分混合物の臭い比較試験
以下比較例１～４、実施例１の変形例（その１及びその２）の当該比較試験を官能試験により行った。
まず、以下比較例１～４、実施例１の変形例（その１及びその２）のプロテオグリカン含有の軟骨成分混合物（粉砕物）を作製した。

［比較例１］粉砕物の製造
－３０℃～－２０℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を、品温３５℃以下の条件で凍結乾燥を行い、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、１４メッシュパス相当の粉砕物を得た。９９％ヘキサン溶液５５０Ｌに、先に得られた軟骨粉砕物５５ｋｇを投入し、２５℃（室温）で１時間攪拌した。このように攪拌により洗浄した軟骨粉砕物を、遠心分離機を用いてヘキサン溶液を除去した後、残渣を５５０Ｌの９９％ヘキサン溶液に再度投入して２５℃にて３０分間攪拌した。これを遠心分離機でヘキサン溶液を除去した後、残渣を再度５５０Ｌの９９％ヘキサン溶液に投入して２５℃にて３０分間攪拌洗浄した。ヘキサン溶液洗浄後の粉砕物を遠心分離機でろ取し、加熱温度３５℃以下にて減圧乾燥し、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、約４０ｋｇの粉砕物を得た。

［比較例２］粉砕物の製造
－３０℃～－２０℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を、品温３５℃以下の条件で凍結乾燥を行い、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、１４メッシュパス相当の粉砕物を得た。９９％アセトン溶液５５０Ｌに、先に得られた軟骨粉砕物５５ｋｇを投入し、２５℃で１時間攪拌した。このように攪拌により洗浄した軟骨粉砕物を、遠心分離機を用いてヘキサン溶液を除去した後、残渣を５５０Ｌの９９％アセトン溶液に再度投入して２５℃にて３０分間攪拌した。これを遠心分離機でアセトン溶液を除去した後、残渣を再度５５０Ｌの９９％アセトン溶液に投入して２５℃にて３０分間攪拌洗浄した。アセトン溶液洗浄後の粉砕物を遠心分離機でろ取し、加熱温度３５℃以下にて減圧乾燥し、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、約４０ｋｇの粉砕物を得た。

［比較例３］粉砕物の製造
－３０℃～－２０℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を、品温３５℃以下の条件で凍結乾燥を行い、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、１４メッシュパス相当の粉砕物を得た。５９％エタノール溶液５５０Ｌに、先に得られた軟骨粉砕物５５ｋｇを投入し、２５℃で１時間攪拌した。このように攪拌により洗浄した軟骨粉砕物を、遠心分離機を用いてエタノール溶液を除去した後、残渣を５５０Ｌの５９％溶液に再度投入して２５℃にて３０分間攪拌した。これを遠心分離機でエタノール溶液を除去した後、残渣を再度５５０Ｌの５９％エタノール溶液に投入して２５℃にて３０分間攪拌洗浄した。エタノール溶液洗浄後の粉砕物を遠心分離機でろ取し、加熱温度３５℃以下にて減圧乾燥し、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、約４０ｋｇの粉砕物を得た。

［比較例４］粉砕物の製造
－３０℃～－２０℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を、品温３５℃以下の条件で凍結乾燥を行い、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、１４メッシュパス相当の粉砕物を得た。９９％エタノール溶液５５０Ｌに、先に得られた軟骨粉砕物５５ｋｇを投入し、２５℃で１時間攪拌した。このように攪拌により洗浄した軟骨粉砕物を、遠心分離機を用いてエタノール溶液を除去した後、残渣を５５０Ｌの９９％溶液に再度投入して２５℃にて３０分間攪拌した。これを遠心分離機でエタノール溶液を除去した後、残渣を再度５５０Ｌの９９％エタノール溶液に投入して２５℃にて３０分間攪拌洗浄した。エタノール溶液洗浄後の粉砕物を遠心分離機でろ取し、加熱温度３５℃以下にて減圧乾燥し、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、約４０ｋｇの粉砕物を得た。

［実施例１の変形例その１］粉砕物の製造
－３０℃～－２０℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を、品温３５℃以下の条件で凍結乾燥を行い、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、１４メッシュパス相当の粉砕物を得た。９９％エタノール５５０Ｌに、５５ｋｇのクエン酸を溶解し、先に得られた軟骨粉砕物５５ｋｇを投入し、６０℃で３０分間攪拌した。当該攪拌は、ホモミキサーにより湿式粉砕を行いながら行った。このように攪拌により洗浄した軟骨粉砕物を、遠心脱水機を用いてエタノール溶液を除去した後、残渣を５５０Ｌの９９％エタノールに再度投入して６０℃にて３０分間攪拌した。これを遠心脱水機でエタノール溶液を除去した後、残渣を再度５５０Ｌの９９％エタノールに投入して６０℃にて３０分間攪拌洗浄した。エタノール洗浄後の粉砕物を遠心分離機でろ取し、加熱温度３５℃以下にて減圧乾燥し、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、約４０ｋｇの粉砕物を得た。

［実施例１の変形例その２］粉砕物の製造
－３０℃～－２０℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を、品温３５℃以下の条件で凍結乾燥を行い、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、１４メッシュパス相当の粉砕物を得た。９９％エタノール５５０Ｌに先に得られた軟骨粉砕物５５ｋｇを投入し、６０℃で1時間攪拌した。当該攪拌は、精密乳化分散機クレアミックス（エム・テクニック株式会社）により湿式粉砕を行いながら行った。このように攪拌により洗浄した軟骨粉砕物を、遠心分離機を用いてエタノール溶液を除去した後、残渣を５５０Ｌの９９％エタノールに再度投入して６０℃にて３０分間攪拌した。これを遠心分離機でエタノール溶液を除去した後、残渣を再度５５０Ｌの９９％エタノールに投入して６０℃にて３０分間攪拌洗浄した。エタノール洗浄後の粉砕物を遠心分離機でろ取し、加熱温度３５℃以下にて減圧乾燥し、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、約４０ｋｇの粉砕物を得た。

当該実施例１、実施例１の変形例、比較例１～４の粉砕物の官能試験（脂質等による臭いの有無確認）を行った。当該官能試験は、「Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi Vol.43, No.12, 1314～1322 (1996)」の方法などを参考にして行った。官能試験の結果を表１に示す。

表１において、○は「臭いあり」、△は「臭いを除けなかった」、×は「臭いなし」を示す。表１で示すように、実施例１の変形例その１及び実施例１の変形例その２では、臭いが除去されていることが示唆された。

［実施例２～９］低濃度酢酸抽出法によるプロテオグリカンとコラーゲンとの粉末混合物の製造
－３０℃～－２０℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を４００ｇ用意し、出発原料とした。これに種々の濃度の酢酸水溶液２０００ｍＬを投入し、抽出温度３０℃～４０℃で４８～７２時間抽出した。種々の濃度（％）、抽出温度（℃）及び抽出時間（hr、時間）は、表２に示す通りである。

この抽出液を濾紙Ｎｏ．２６（１１０ｍｍ）でろ過し、不溶物を除去した。次に、液量に対し２％の粉末セルロース（日本製紙社製、商品名「ＫＣフロックＷ－４００Ｇ」）を加え３０分撹拌後ろ過した。ろ液を分画分子量５万の中空糸膜を用いて液量が１／１０になるまで濃縮した。さらに水で希釈しながら濃縮と精製とを繰り返し、最終的に５００～８００ｇの濃縮液（ｐＨ６～７）を得た。そして、得られた濃縮液を凍結乾燥し、１０～２０ｇのプロテオグリカンとコラーゲンの混合物（凍結乾燥物）を得た。

実施例１に記載の方法を用いて、得られた凍結乾燥物についての以下項目を測定した。その結果を以下表２に示す。
・ＰＧ収率（％）：「（（得られた凍結乾燥物中のプロテオグリカンの含有量）／（当該鼻軟骨の重量４００（ｇ）））×１００」にて算出された値（％）
・ＰＧ分子量（×１０^４）：プロテオグリカン分子量。例えば表２の実施例２の「５６」の記載は分子量が５６０，０００（５６万）を示す。
・ＰＧ含有比率：比較例５の凍結乾燥物中のプロテオグリカンの含有量を１００として、各実施例の凍結乾燥物中のプロテオグリカンの含有量の相対値（比較例５と比較して示す相対値）。
・コラーゲン含有率（％）：凍結乾燥物中のコラーゲン含有率
・「―」：測定していないことを示す。

比較例５に比べ、実施例２～９では、プロテオグリカンの収率等が向上していることが確認できた。

［実施例１０～１２］低濃度クエン酸抽出法によるプロテオグリカンの製造
－３０℃～－２０℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を４００ｇ用意し、出発原料とした。種々の濃度のクエン酸水溶液２０００ｍＬを加え、ゆっくり攪拌しながら種々の抽出温度で２４～４８時間抽出した。種々の濃度（％）、抽出温度（℃）及び抽出時間（hr、時間）は、表３に示す通りである。

この抽出液を濾紙Ｎｏ．６５（１１０ｍｍ）でろ過し、不溶物を除去した。次に、液量に対し２％の粉末セルロース（日本製紙社製、商品名「ＫＣフロックＷ－４００Ｇ」）を加え３０分撹拌後ろ過した。ろ液を分画分子量５万の中空糸膜を用いて液量が１／１０になるまで濃縮した。さらに水で希釈しながら濃縮と精製とを繰り返し、最終的に５００ｇ～８００ｇの濃縮液（ｐＨ６～７）を得た。そして、得られた濃縮液を凍結乾燥し、１０ｇ～２０ｇのプロテオグリカンとコラーゲンの混合物を得た。

実施例１に記載の方法を用いて、得られた凍結乾燥物についての以下項目を測定した。その結果を以下表３に示す。
・ＰＧ収率（％）：「（（得られた凍結乾燥物中のプロテオグリカンの含有量）／（当該鼻軟骨の重量４００（ｇ）））×１００」にて算出された値（％）。
・ＰＧ分子量（×１０^４）：プロテオグリカン分子量。例えば表２の実施例１０の「７２」の記載は分子量が７２０，０００（７２万）を示す。
・ＰＧ／コラーゲンの比率：「当該比率＝（凍結乾燥物中のプロテオグリカンの含有率／凍結乾燥物中のコラーゲンの含有率）」。
・コラーゲン含有率（％）：凍結乾燥物中のコラーゲン含有率。
・「―」：測定していないことを示す。
・腐敗の有無：「×」は凍結乾燥物の製造工程中での腐敗が確認された群、「○」は当該製造工程中での腐敗が確認されなかった群（正常な群）、を示す。なお、比較例６は、当該腐敗が確認されたため、ＰＧ収率、コラーゲン含有率など測定できなかった。

［試験例２］ヒト線維芽細胞増殖試験（その１）
実施例１で得られた可溶性軟骨成分混合物についてのヒト線維芽細胞増殖能の有無を評価した。
まず、ＤＭＥＭ培地（富士フイルム和光純薬、Ｄ－ＭＥＭ（低グルコース）（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）、０４１－２９７７５）を準備した。９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに、０．１％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地細胞浮遊液２００μｌで４×１０^３個の細胞を播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で、７２時間培養した。当該培養後、０．１％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ２００μｌに培地を交換した。当該交換後、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で、２４時間培養した。当該２４時間後、試料入り培地（０．１％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地２００μｌ）に交換した。このとき、所定の試料を入れずに０．１％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地のみで培養したコントロール群を設けた。その後、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で、７２時間培養した。当該培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、添加した試料（試料１から試料３の群）の細胞増殖効果を評価した。得られた試験結果に関し、統計学的有意性はＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔを用いて評価した。表４において、有意差がある場合は、「＊＊」（ｐ＜０．０５）と標記する。各群の正常ヒト皮膚線維芽細胞数を測定することで、当該細胞増殖効果を評価した。当該測定は、コントロール群の細胞数の測定結果を１００として、各群（試料１から試料３の群）において測定した細胞数の相対値を算出した。以下表４では、各群において３サンプルの平均値を算出した結果を用いての相対値を示す。

・コントロール群：試料を添加しないで、０．１％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地で培養した群
・試料１の群：従来品としてプロテオグリカンＦ（一丸ファルコス株式会社製）に含有されるプロテオグリカン５倍濃縮したもの
・試料２の群：実施例１で製造した可溶性軟骨成分混合物
・試料３の群：実施例５で製造した可溶性軟骨成分混合物
・試料４の群：市販品のプロテオグリカン

試料１～４の群において、コントロール群に比べて、線維芽細胞増殖能を示した。特に、試料１～試料３の群では、いずれの添加濃度でも、有意に（ｐ＜０．０５、表４にて＊＊で示している内容）、線維芽細胞増殖能を示した。

［試験例２］ヒト線維芽細胞増殖試験
実施例１０及び実施例１１で得られたプロテオグリカンについて、試験例１と同様の方法にて、ヒト線維芽細胞増殖能の有無を評価した。用いた試料は以下のとおりである。得られた試験結果に関し、統計学的有意性はＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔを用いて評価した。測定結果を表５に示す。表５において、有意差がある場合は、「＊＊」（ｐ＜０．０５）と標記する。各群の正常ヒト皮膚線維芽細胞数を測定することで、当該細胞増殖効果を評価した。当該測定は、コントロール群の細胞数の測定結果を１００として、各群（試料１の群、試料５の群、試料６の群）において測定した細胞数の相対値を算出した。以下表５では、各群において３サンプルの平均値を算出した結果を用いての相対値を示す。
・試料１の群：従来品としてプロテオグリカンＦ（一丸ファルコス株式会社製）に含有されるプロテオグリカン５倍濃縮したもの
・試料５の群：実施例１０で製造したプロテオグリカン
・試料６の群：実施例１１で製造したプロテオグリカン

いずれの試料（試料１、５、６）も、コントロール群に比べて、線維芽細胞増殖能を示した。試料１の群では、有意差（ｐ＜０．０５）が見られた。

［実施例１３と１４］プロテオグリカンとコラーゲンとの粉末混合物の製造
－３０℃～－２０℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を４００ｇ用意し、出発原料とした。これにｐＨ２～４の水又は水溶液２０００ｍＬを投入し、抽出温度３７℃で７２時間抽出した。種々の濃度（％）、抽出温度（℃）及び抽出時間（ｈｒ、時間）は、表６に示す通りである。

この抽出液を濾紙Ｎｏ．２６（１１０ｍｍ）でろ過し、不溶物を除去した。次に、液量に対し２％の粉末セルロース（日本製紙社製、商品名「ＫＣフロックＷ－４００Ｇ」）を加え３０分撹拌後ろ過した。ろ液を分画分子量５万の中空糸膜を用いて液量が１／１０になるまで濃縮した。さらに水で希釈しながら濃縮と精製とを繰り返し、更にｐＨ調整の工程（この工程で用いた溶液は以下表６に記載）を経て、最終的に５００～８００ｇの濃縮液を得た。そして、得られた濃縮液を凍結乾燥し、１０～２０ｇのプロテオグリカンとコラーゲンの混合物（凍結乾燥物）を得た。

実施例１に記載の方法を用いて、得られた凍結乾燥物についての以下項目を測定した。その結果を以下表６に示す。
・ＰＧ収率（％）：「（（得られた凍結乾燥物中のプロテオグリカンの含有量）／（当該鼻軟骨の重量４００（ｇ）））×１００」にて算出された値（％）
・ＰＧ分子量（×１０^４）：プロテオグリカン分子量。例えば表６の実施例１３の「５０」の記載は分子量が５００，０００（５０万）を示す。
・コラーゲン含有率（％）：凍結乾燥物中のコラーゲン含有率
・「―」：測定していないことを示す。

実施例４などと同様に、実施例１３と１４において、一定のプロテオグリカンの収率で、混合物（凍結乾燥物）を得ることができた。

［その他］表２及び表３で示す実施例及び比較例における溶媒のｐＨ
比較例５及び実施例２から９で用いた溶媒（表２、所定濃度の酢酸水溶液２０００ｍＬ）、比較例６及び実施例１０から１２で用いた溶媒（表３、所定濃度のクエン酸水溶液２０００ｍＬ）のｐＨを測定した。測定結果を以下表７に示す。

本発明の製造方法は、軟骨からプロテオグリカンを含む軟骨成分を効率よく抽出、回収できる。このような方法で製造された軟骨成分混合物には、プロテオグリカンの他にコラーゲンやヒアルロン酸なども含まれ、食品、化粧品などの原料などとして利用可能である。

Claims (5)

1. コラーゲンおよびプロテオグリカンを含む軟骨成分混合物の製造方法であって、
   軟骨を、０．０３質量％以上３．５質量％以下の酢酸水溶液中に浸漬して軟骨成分抽出液を得る工程と、得られた抽出液から軟骨成分を回収する工程とを含む、
   コラーゲンおよびプロテオグリカンを含む軟骨成分混合物の製造方法。
2. 前記酢酸水溶液の濃度が０．５質量％以上３質量％以下である請求項１に記載の製造方法。
3. 前記軟骨成分混合物が、コラーゲンを含み、前記コラーゲンの含有率が、固形分換算で少なくとも２０質量％である請求項１又は２に記載の製造方法。
4. プロテオグリカンの分子量が４０万～６５万である請求項１又は２に記載の製造方法。
5. 前記軟骨が、サケ頭部の鼻軟骨である請求項１又は２に記載の製造方法。