JP7790973B2 - パーキンソン病のための自家細胞置換療法 - Google Patents

パーキンソン病のための自家細胞置換療法

Info

Publication number
JP7790973B2
JP7790973B2 JP2021569378A JP2021569378A JP7790973B2 JP 7790973 B2 JP7790973 B2 JP 7790973B2 JP 2021569378 A JP2021569378 A JP 2021569378A JP 2021569378 A JP2021569378 A JP 2021569378A JP 7790973 B2 JP7790973 B2 JP 7790973B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
mir
cell
months
ipscs
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2021569378A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2020237104A5 (ja
JP2022534693A (ja
Inventor
キム，クヮン－スー
Original Assignee
ザ マクリーン ホスピタル コーポレーション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ザ マクリーン ホスピタル コーポレーション filed Critical ザ マクリーン ホスピタル コーポレーション
Publication of JP2022534693A publication Critical patent/JP2022534693A/ja
Publication of JPWO2020237104A5 publication Critical patent/JPWO2020237104A5/ja
Priority to JP2025153269A priority Critical patent/JP2026012673A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7790973B2 publication Critical patent/JP7790973B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/10—Petri dish
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/01—Modulators of cAMP or cGMP, e.g. non-hydrolysable analogs, phosphodiesterase inhibitors, cholera toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)

Description

優先権の主張
本出願は、２０１９年５月２３日に出願された米国特許仮出願第６２／８５２，００８号、２０１９年１２月１８日に出願された同第６２／９４９，９０６号の利益を主張する。前出の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府の後援を受けた調査研究または開発
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられる助成金第ＮＳ０７０５７７号の下にある政府助成によりなされた。米国連邦政府は、本発明において、一定の権利を有する。
本明細書では、パーキンソン病（ＰＤ）における自家細胞療法に有用な中脳ドーパミン（ｍＤＡ）神経前駆細胞を作出するための方法、細胞を含む組成物、およびその使用法について記載される。
運動系および非運動系の両方の病態により特徴づけられるパーキンソン病（ＰＤ）は、アルツハイマー病に次いで、２番目に一般的な神経変性障害である。６０歳を超える人口のうちの、約１％が罹患し、その蔓延は、社会的負荷の増大となる。人口が老齢化するにつれて、２０３０年までに、世界中で、１４００万人を超える人々が、ＰＤを患うことが予測されるからである（１）。１９６０年代におけるその導入以来、ドーパミン（ＤＡ）置換療法（例えば、Ｌ－ＤＯＰＡおよびＤＡアゴニスト）は、薬理学的処置のゴールドスタンダードであり続けている。ＰＤ患者の生活の質を、著明に改善する一方、これらの医薬の使用の長期化は、通例（＞８０％）、運動障害および運動変動など、所望されない副作用を結果としてもたらす（２）。
パーキンソン病（ＰＤ）とは、黒質内の中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロンの変性に続発する、線条体内ドーパミンの喪失と関連する、一般的な神経変性障害であり、細胞移植を、有望な治療的戦略とする。ＰＤのためのヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）ベースの自家細胞療法を確立するために、本発明者らは、安全かつ有効な治療薬としてのｍＤＡ前駆細胞の作製のためのコア技法のプラットフォームを開発した。第１に、代謝調節性マイクロＲＮＡを、再プログラム化因子と組み合わせることにより、本発明者らは、ゲノム完全性、および偏りのない潜在的多能性により証拠立てられる通り、臨床グレードのｉＰＳＣを、より効率的に作出する方法を開発した。第２に、本発明者らは、機能的、かつ健常なｍＤＡ細胞を、細胞喪失量が著明に少ない、拡大可能な形で作出する、「スポッティング」ベースのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化法を確立した。第３に、本発明者らは、新生物化の可能性がある未分化細胞を、最終生成物から、極めて効率的に、安全に消失させる化学的方法を開発した。このようにして作製されたドーパミン作動性細胞は、高レベルの特徴的ｍＤＡマーカーを発現し、ドーパミンを産生および分泌し、ｍＤＡ細胞に典型的な、電気生理学的特色を呈する。さらに、これらの細胞の、ＰＤの齧歯動物モデルへの移植は、宿主脳に、顕著な神経再支配をもたらす一方で、腫瘍形成の証拠、または植え込まれた細胞の再分布を示さず、運動失調を、ロバストに回復させた。加えて、この方法を使用して導出された細胞の、ＰＤを患うヒトへの植込みは、疾患過程を停止させ、おそらく、これを反転させたと考えられる（実施例１０を参照されたい）。したがって、このプラットフォームは、ＰＤのための、個別化、自家、細胞置換療法を成功させる実施に適する。
したがって、本明細書では、分化細胞、例えば、ニューロン、例えば、中脳ドーパミン作動性前駆細胞（ｍＤＡＰ）の集団を作出する方法が提示される。方法は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、好ましくは、ヒトｉＰＳＣの集団を用意するステップ；生体マトリックスハイドロゲル支持体内の、領域間の分離を維持するのに十分な領域間の距離をとって、個別の領域、好ましくは、実質的に円形の領域（「スポット」）内に、細胞集団を、領域１つ当たりの細胞約５，０００～２０，０００、例えば、約１０，０００個の密度で播種するステップ；およびｉＰＳＣが、例えば、ニューロン、例えば、ｍＤＡＰへと分化するのに十分な条件下で、細胞を維持するステップを含む。
一部の実施形態では、生体マトリックスハイドロゲル支持体は、基底膜抽出物、または合成マトリックスである。
一部の実施形態では、細胞は、播種の前に、例えば、約１０μｌのゲル中に懸濁させられる。
一部の実施形態では、領域は、直径が約２～１０ｍｍ、例えば、約５ｍｍである。
一部の実施形態では、領域間の距離は、１～３ｃｍである。
一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）およびＴＲＡ－１－６０を発現する。
一部の実施形態では、ｍＤＡＰは、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＬＭＸ１Ａ、および／またはＥＮ１、好ましくは、少なくとも、ＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａを含む、１つ、２つ、またはこれを超えるマーカーを発現し；任意選択で、ｍＤＡＰは、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、およびＮＵＲＲ１を共発現するＴＨ＋細胞である。
一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、初代細胞の集団を、対象から得るステップであって、好ましくは、初代細胞が、線維芽細胞、ヘアケラチノサイト（ｈａｉｒ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）、血液細胞、または骨髄間葉幹細胞（ＭＳＣ）であるステップ；細胞内における、少なくとも、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、およびＳＯＸ２、ならびに／またはＬ－ＭＹＣおよび／もしくはＣ－ＭＹＣの発現を誘導するステップ；ならびに初代細胞が、ｉＰＳＣとなるのに十分な条件下で、細胞を維持するステップを含む方法により作出される。
一部の実施形態では、少なくとも、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、およびＳＯＸ２、ならびに／またはＬ－ＭＹＣおよび／もしくはＣ－ＭＹＣの発現を誘導するステップは、初代細胞に、口蹄疫ウイルスの２Ａ配列（ＯＣＴ４－Ｆ２Ａ）と連結されたヒトＯｃｔ４、ＫＬＦ４、およびブタテッショウウイルスの２Ａ配列（ＳＯＸ２－Ｐ２Ａ）と連結されたＳＯＸ２、および／もしくはＬ－ＭＹＣのコード配列、および／もしくはＣ－ＭＹＣのコード配列を含むポリシストロニックのエピソームベクターをトランスフェクトすることを含む。
一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、細胞内で、ｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉＲ－１０６ｂ、ｍｉＲ－１３６ｓ、ｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－３０２ｓ、ｍｉＲ－３６９ｓ、およびｍｉＲ－３７１／３７３からなる群から選択される、１つまたは複数の外因性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現させるステップを含む方法により作出される。ｍｉＲ－３０２ｓとは、３０２ａ、３０２ｂ、３０２ｃ、３０２ｄ、および３６７を含む、５つのｍｉＲＮＡを包含するｍｉＲ－３０２クラスターを指し示す。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－３０２ｓおよびｍｉＲ－２００ｃの一方または両方を含む。
一部の実施形態では、方法は、細胞へと、ｍｉＲ－３０２ｓおよびｍｉＲ－２００ｃをコードする配列を含むエピソームベクターを導入するステップを含む。
一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、初代細胞内で、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ｍｉＲ－３０２ｓ、およびｍｉＲ－２００ｃの全て；またはＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、Ｌ－ＭＹＣ／Ｃ－ＭＹＣ、ｍｉＲ－３０２ｓ、およびｍｉＲ－２００ｃを発現させるステップを含む方法により作出される。
一部の実施形態では、方法は、細胞へと、（ｉ）口蹄疫ウイルスの２Ａ配列（ＯＣＴ４－Ｆ２Ａ）と連結されたヒトＯｃｔ４、ＫＬＦ４、ブタテッショウウイルスの２Ａ配列（ＳＯＸ２－Ｐ２Ａ）と連結されたＳＯＸ２、Ｌ－ＭＹＣのコード配列、およびＣ－ＭＹＣのコード配列を含む、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、またはＡＡＶベクター）もしくはポリシストロニックのエピソームベクター、またはＯｃｔ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、Ｌ－ＭＹＣ／Ｃ－ＭＹＣのうちのいずれか１つもしくは複数の成熟ＲＮＡ、または対応するタンパク質、ならびに（ｉｉ）ｍｉＲ－３０２ｓおよびｍｉＲ－２００ｃ、または成熟ｍｉＲ－３０２ｓおよび成熟ｍｉＲ－２００ｃをコードする配列を含む、ウイルスベクターまたはエピソームベクターのうちのいずれか１つまたは複数を導入するステップを含む。
一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、Ｌ－ＭＹＣの代わりにＣ－ＭＹＣが使用され、かつ／またはこの逆も成り立つ。
一部の実施形態では、本明細書で記載される方法は、好ましくは、ＢＩＲＣ５遺伝子を阻害することによる、未分化ｉＰＳＣの低減を含む。
本明細書ではまた、本明細書で記載される方法により作製された、ｍＤＡＰを含む細胞集団、および細胞を含む組成物も提示される。一部の実施形態では、細胞は、初代細胞内に存在しない、１つまたは複数の体細胞突然変異を有し、かつ／またはがんと因果関係があることが公知の体細胞突然変異を有さない。
さらに、本明細書では、パーキンソン病（ＰＤ）を有するか、またはこれを発症する危険性がある対象を処置するために細胞を使用する方法が提示される。方法は、好ましくは、ＰＤを有するか、またはこれを発症する危険性がある対象、または自家移植対象から初代体細胞を得、初代細胞から、ｉＰＳＣを作出するステップ；好ましくは、ＳＯＸ１陽性細胞、ＫＩ６７陽性細胞、ＳＯＸ１／ＫＩ６７二重陽性細胞、ＳＯＸ１／ＰＡＸ６二重陽性細胞、およびＳＯＸ１／ＰＡＸ６／ＫＩ６７三重陽性細胞の数を低減するのに十分な時間にわたり、ｉＰＳＣを、ケルセチンで処理するステップ；本明細書で記載される方法により、ｍＤＡＰを含む細胞集団を作出するステップ；ならびに細胞集団を、対象へと投与するステップを含みうる。一部の実施形態では、細胞は、任意選択で、磁気共鳴イメージング誘導定位固定手術を使用して、対象の脳の罹患領域へと直接、またはこの近傍に、好ましくは、両側において、尾状核、被殻、および黒質のうちの１つまたは複数へと植え込まれることにより投与される。
一部の実施形態では、細胞は、好ましくは、大脳皮質の上傍矢状部に、単一の注入地点を伴う、好ましくは、３つの注入路により、被殻の矢状方向の広がりに及ぶカラムを創出する、好ましくは、デバイス（例えば、Schweitzer et al., Oper Neurosurg (Hagerstown) 2019において記載されている）による注射を介して投与される。一部の実施形態では、用量約１００万個、２００万個、３００万個、４００万個、５００万個、６００万個、７００万個、または８００万個の細胞が、投与され、好ましくは、細胞は、３つの注入路間で、均等に分割される。一部の実施形態では、細胞は、単一の処置において投与される。一部の実施形態では、細胞は、２つまたはこれを超える処置において投与される。
一部の実施形態では、脳の両半球が処置され、細胞は、第１の処置において、第１の半球へと投与され、第２の処置において、他の半球へと投与される。一部の実施形態では、第１の処置と第２の処置との間の時間は、約２週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、１２カ月間、１８カ月間、２４カ月間、３０カ月間、３６カ月間、４８カ月間、５４カ月間、または６０カ月間である。
一部の実施形態では、少なくとも１つの抗生剤は、手術前、手術中、および／または手術後に投与される。
本明細書ではまた、例えば、本明細書で記載される方法における使用のための細胞を培養するための培養ディッシュであって、ディッシュの裏面に、グリッド線の間の距離を１．５～２．５ｃｍとするグリッド、例えば、約２ｃｍ、例えば、２×２ｃｍのグリッドが施された培養ディッシュも提示される。一部の実施形態では、グリッドは、裏面にプリントまたはエッチングされた、ディッシュの部分として形成される。一部の実施形態では、ディッシュは、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、およびポリビニル製の熱可塑性樹脂を含む。一部の実施形態では、ディッシュは、その中に配置された、生体マトリックスハイドロゲル支持体、好ましくは、基底膜抽出物、または合成マトリックスの層を含む。
付録１および２、ならびにこれらの中で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース項目、および他の参考文献は、任意の目的および全ての目的で、それらの全体において、参照により本明細書に組み込まれる。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により、一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明における使用のために、本明細書で記載される方法および材料が使用されるが、当技術分野で公知である、他の適切な方法および材料もまた使用されうる。材料、方法、および例は、例示的なものであるに過ぎず、限定的であることを意図するものではない。本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース項目、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。齟齬が生じる場合は、定義を含む本明細書に従う。
本発明の、他の特色および利点は、以下の詳細な記載および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
Ｙ４Ｆと、代謝調節性ｍｉＲＮＡとを組み合わせる、改良再プログラム化法を示す図である。（Ａ～Ｄ）Ｙ３Ｆ（Ａ）、Ｙ４Ｆ（Ｂ）、Ｙ３Ｆ＋３（Ｃ）、またはＹ４Ｆ＋３（Ｄ）による、ｈＤＦからの、ｈｉＰＳＣ様コロニーの作出を、空ベクター（モック）対照と比べて増強するｍｉＲＮＡについてのスクリーニングである。平均値±標準偏差、ｎ＝５、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、チューキーの事後検定を伴う、一元ＡＮＯＶＡである。（Ｅ～Ｆ）Ｙ４Ｆ、ｍｉＲ－３０２ｓ、および／またはｍｉＲ－２００ｃを感染させたｈＤＦ内における、ＯＣＲ（Ｅ）およびＥＣＡＲ（Ｆ）の時間経過である。平均値±標準偏差、ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５、チューキーの事後検定を伴う、二元ＡＮＯＶＡである。（Ｇ）Ｙ４Ｆ、Ｙ４Ｆ＋３、またはＹ４Ｆ＋３＋２をコードするレンチウイルスの感染後における、ＡＰ＋コロニー中の、ＴＲＡ－１－６０＋コロニーの百分率である。平均値±標準偏差、ｎ＝６、＊＊＊ｐ＜０．００５、チューキーの事後検定を伴う、二元ＡＮＯＶＡである。（Ｈ）Ｙ４Ｆ、Ｙ４Ｆ＋３、またはＹ４Ｆ＋３＋２をコードするエピソームベクターのトランスフェクション後における、ＡＰ＋コロニー中の、ＴＲＡ－１－６０＋コロニーの百分率である。平均値±標準偏差、ｎ＝４、＊＊ｐ＜０．０１、チューキーの事後検定を伴う、二元ＡＮＯＶＡである。 （上記の通り。） 本発明者らの改良再プログラム化法から作出された、高品質のｈｉＰＳＣ細胞系を示す図である。（Ａ）確立されたｈｉＰＳＣ細胞系における多能性マーカーの、元のｈＤＦおよびｈＥＳＣ細胞系（Ｈ９）と比較した遺伝子発現レベルについて描示するヒートマップである（ｎ＝３）。（Ｂ）Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２による核染色（挿入図）と併せた、多能性マーカー（例えば、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ－１－６０、およびＳＯＸ２）に対する特異的抗体による、異なる組合せにより作出されたｈｉＰＳＣ細胞系の免疫染色である。スケールバー：１００μｍである。（Ｃ）７日間にわたる自発的分化後における、外胚葉（ＯＴＸ２）、中胚葉（ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ）、および内胚葉（ＳＯＸ１７）に対する、細胞系統特異的マーカーについての免疫染色である。スケールバー：１００μｍである。（Ｄ）ｐＹ４Ｆ、ｐＹ４Ｆ＋３、またはｐＹ４Ｆ＋３＋２により作出されたｈｉＰＳＣ細胞系における、外胚葉（ＰＡＸ６およびＭＡＰ２）、内胚葉（ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、およびＣＫ８）の早期分化マーカー、および中胚葉マーカー（ＭＳＸ１、ＭＹＬ２Ａ、およびＣＯＬ６Ａ２）の遺伝子発現レベルについて描示するヒートマップである（ｎ＝２）。 （上記の通り。） 孤発性ＰＤ患者の皮膚生検から作出されたｈｉＰＳＣ細胞系のゲノム完全性を示す図である。（Ａ）４つのｈｉＰＳＣ細胞系内で見出された体細胞突然変異である。柱状グラフは、各ｈｉＰＳＣ細胞系（ｈｉＰＳＣ細胞系ごとに異なる色）内の、シングルトン突然変異の数、および２つまたはこれを超えるｈｉＰＳＣ細胞系内で見出された、固有の突然変異の数（黒色の柱状グラフ）を示す。黒色の柱状グラフの下方に、先端部をつないだ点線により、突然変異を共有するｈｉＰＳＣ細胞系を指し示す。左下バーは、シングルトンの突然変異、および２つまたはこれを超えるｈｉＰＳＣ細胞系内で見出される突然変異の両方を含む突然変異の総数を表す。Ｃ４は、最小数の体細胞突然変異（ｎ＝９２）を有し、これらのうちの８０はシングルトンであり、１２はＣ４および他のｈｉＰＳＣ細胞系において見出された。（Ｂ）コード領域およびがん関連遺伝子における突然変異量を、公表されているデータセットと比較した。本発明者らのｈｉＰＳＣ細胞系内の非同義突然変異の数は、ｈＥＳＣ細胞系より著明に小さかった。平均で、ＨｉｐＳｃｉプロジェクトによるｉＰＳＣ細胞系内の非同義突然変異の数は、本発明者らのｈｉＰＳＣ細胞系の非同義突然変異の数と同様であった。全体的に、Ｃ４は、最小の突然変異量を示す（赤）。がん関連遺伝子内の体細胞突然変異について述べると、２つの広く使用されるｈＥＳＣ細胞系（Ｈ１およびＨ９、青色）、およびＣ４ ｈｉＰＳＣ細胞系（赤）（右パネル）では、体細胞突然変異が見出されなかった。（Ｃ）４つのｈｉＰＳＣ細胞系内の、全ての体細胞突然変異についての、マイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）の分布である。０．５のＭＡＦ近辺のピークは、クローン体細胞突然変異を表示する。０．１という、低値のＭＡＦを伴う第２のピークは、サブクローン突然変異を表示する。各プロットについて、２つのピークを伴う密度曲線は、体細胞突然変異のＭＡＦの分布を示し、曲線の色は、各ｈｉＰＳＣ細胞系については、（Ａ）と合致し、異なる色を伴う曲線（０．０のＭＡＦ近辺でピークをなす）は、他のｈｉＰＳＣ細胞系により検出される体細胞突然変異についての曲線である。 （上記の通り。） スポッティングベースのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化が、結果として得られるドーパミン細胞の収量および品質を改善することを示す図である。（Ａ）最適化された物理的培養条件を見出す実験スキームである。０～１５日目に、生存率に関わらず、全ての細胞を、矢印でマークされる通り、ＦＡＣＳおよび／または手作業の細胞計数により定量した。１５日目に、細胞を、免疫細胞化学解析のためにカバーガラス上に再播種するか、または定量的リアルタイムＰＣＲのために採取した。（Ｂ～Ｃ）ｈＥＳＣ（Ｈ９およびＨ７）、およびｈｉＰＳＣ（Ｃ４およびＮ３）の両方についての、１日目～１４日目における細胞喪失（剥離に起因する）、および１５日目における細胞採取の程度（Ｂ）、ならびに１５日目における死細胞の百分率（Ｃ）についての、常套的な単層ベースの方法と、スポッティングベースの方法との比較である。従来の方法、およびスポッティングベースの方法のそれぞれのために、１ｃｍ２当たり１１，０００個、およびスポット１つ当たり１０，０００個の細胞密度を使用した。提示されるデータは、測定可能な転帰を伴う実験を反映する（図１３Ａについてのキャプションを参照されたい）。平均値±標準偏差、ｎ＝４、一元ＡＮＯＶＡである。（Ｄ）免疫細胞化学解析を使用する、１５日目における、最終的な採取細胞からの、瀕死細胞の定量である。切断型カスパーゼ３に対する抗体を使用して、アポトーシス性細胞を検出した。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染色により、核凝縮を視覚化して、死細胞または瀕死細胞を検出した。スポッティング法により播種された細胞は、切断型カスパーゼ３陽性細胞の数の有意な低減を示した。スケールバー：１００μｍである。 （上記の通り。） （上記の通り。） ケルセチン処理の、未分化細胞および分化細胞に対する効果を示す図である。（Ａ）最適なケルセチン処理条件を決定するスクリーニングである。異なるケルセチン濃度および持続時間による処理の後に、血球計を使用して、生存ｈｉＰＳＣをカウントした。（Ｂ～Ｃ）９日目におけるケルセチン処理後の１１日目における、ドーパミン作動性細胞の生存率（Ｂ）、および全細胞数（Ｃ）である。５、１０、２０、４０、および１００μＭで、１６時間にわたり、培養物を処理した。平均値±標準偏差、ｎ＝４、一元ＡＮＯＶＡである。（Ｄ）一定数の線維芽細胞（１０５個）と共に、１０５～１個において、１０倍で系列希釈されたｈｉＰＳＣによるコロニー形成である。細胞を、４０μＭのケルセチン（ＱＣ）で、１６時間にわたり処理するか、または非処理のまま放置し、次いで、６日間にわたり培養するのに続き、アルカリホスファターゼ活性について染色した。２つの個別の実験からの代表的結果である。（Ｅ）カウントされた最終コロニー数を、元のインプットｈｉＰＳＣ数に対してプロットする。（Ｆ）ｑＲＴ－ＰＣＲによる、インプットｈｉＰＳＣ数に対するＯＣＴ４コピー数についての検量線の作成である。ｑＲＴ－ＰＣＲにより、ＯＣＴ４コピー数を測定し、細胞１０５～１０２個において、１０倍で系列希釈されたｈｉＰＳＣから計算した。（Ｇ）ＱＣ処理を伴うか、または伴わない、多様な時点における、ｈｉＰＳＣから分化させられたｍＤＡ細胞中の、ＯＣＴ４陽性細胞数についての、ＯＣＴ４ ｑＲＴ－ＰＣＲを使用する測定である。平均値±標準偏差、ｎ＝２、＊＊＊ｐ＜０．００５、二元ＡＮＯＶＡである。 （上記の通り。） （上記の通り。） ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化させたＣ４ ｈｉＰＳＣについての分子的特徴付け、細胞的特徴付け、および生理学的特徴づけを示す図である。（Ａ）スポッティングプロトコールに基づく、ｍＤＡ分化法についての概略図である。数は、ｎｇ／ｍｌ単位の濃度を表し、カッコ内の数は、μＭ単位の濃度を表す。ＡＡ：アスコルビン酸；β－ｍｅｒ：ベータ－メルカプトエタノール；ＢＤＮＦ：脳由来神経栄養因子；ＣＨＩＲ：ＣＨＩＲ９９０２１；ｄｂｃＡＭＰ：ジブチル環状アデノシン一リン酸；ＦＧＦ－８、線維芽細胞増殖因子８；ＧＤＮＦ：グリア細胞系由来神経栄養因子；ＫＳＲ：ノックアウト血清置換；ＬＤＮ：ＬＤＮ１９３１８９；Ｌ－Ｇｌｕ：Ｌ－グルタミン；ＮＥＡＡ：非必須アミノ酸；ＰＭＮ：プルモルファミン；ＱＣ：ケルセチン；ＳＢ：ＳＢ４３１５４２；ＳＨＨ：Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ；ＴＧＦ－β３、形質転換増殖因子ベータ３である。（Ｂ）ｍＤＡ分化細胞内の、段階特異的神経マーカーの遺伝子発現についてのヒートマップである。（Ｃ）分化時における、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＮＵＲＲ１、およびＴＨの遺伝子発現の漸進的増大である。（Ｄ）分化Ｄ２８細胞内の、神経前駆細胞マーカー（ＮＥＳＴＩＮ）、ｍＤＡＰマーカー（ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ／ＴＨ）、ｍＤＡＮマーカー（ＭＡＰ２、ＮＵＲＲ１／ＴＨ）、および増殖マーカーである、ＰＡＸ６／ＳＯＸ１／ＫＩ６７についての免疫蛍光染色である。スケールバー：１００μｍである。（Ｅ）全Ｄ２８細胞中の、ＮＥＳＴＩＮ＋細胞、ＭＡＰ２＋細胞、ＴＨ＋細胞、およびＮＵＲＲ１＋細胞の百分率である（ｎ＝６）。（Ｆ）全Ｄ２８細胞中の、ＦＯＸＡ２＋細胞、ＬＭＸＡ１＋細胞、およびＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１Ａ＋細胞の百分率である（ｎ＝６）。（Ｇ）ＴＨ＋Ｄ２８細胞中の、ＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１Ａ＋細胞およびＮＵＲＲ１＋細胞の百分率である（ｎ＝６）。（Ｈ）全Ｄ２８細胞中の、ＰＡＸ６＋細胞、ＳＯＸ１＋細胞、およびＰＡＸ６＋／ＳＯＸ１＋／ＫＩ６７＋細胞の百分率である（ｎ＝６）。Ｎ．Ｄ：検出なしである。（Ｉ）４７日目における、ドーパミンおよびドーパミン代謝物（３，４－ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ））の、ＫＣｌ誘導放出についてのＨＰＬＣ解析である。データは、平均値±ＳＥＭとして提示する。 （上記の通り。） （上記の通り。） ｉｎ ｖｉｖｏのＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスにおける、Ｃ４由来ｍＤＡ細胞の安全性を示す図である。（Ａ）１４日目（中）または２８日目（右）の、Ｃ４ ｉＰＳ細胞（０日目、左）またはＣ４由来ｍＤＡ前駆細胞の線条体内移植の後における、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス脳についてのＨ＆Ｅ染色である。Ｄ１４群における白丸は、ロゼット様構造を同定する。（Ｂ）ケルセチンを伴わない（ｎ＝４）、０日目（ｎ＝４）および１４日目、ならびにケルセチン処理を伴う、１４日目（ｎ＝１９）および２８日目（ｎ＝２３）における奇形腫形成百分率の定量である。ＱＣ＝ケルセチンである。（Ｃ）ケルセチンを伴わない、分化の１４日目、ならびにケルセチン処理を伴う１４日目および２８日目における、ロゼット形成の定量である。（Ｄ）Ｄ１４群およびＤ２８群における、ビメンチンについての免疫組織化学である。（Ｅ～Ｆ）Ｄ１４群（Ｅ）およびＤ２８群（Ｆ）における、ＳＯＸ１、ＰＡＸ６、およびＫＩ６７についての免疫蛍光染色である。（Ｇ）Ｄ１４群およびＤ２８群における、ＳＯＸ１＋集団、ＫＩ６７＋集団、ＳＯＸ１＋／ＫＩ６７＋集団、ＳＯＸ１＋／ＰＡＸ６＋集団、ＳＯＸ１＋／ＰＡＸ６＋／ＫＩ６７＋集団の定量である。データは、平均値±ＳＥＭ.、ｎ＝４、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定として提示する。（Ｈ）生体内分布アッセイである。既に６カ月間にわたり、ｈｉＰＳＣ由来Ｄ２８ドーパミン作動性前駆細胞移植片を、線条体内に施されているＮＯＤ ＳＣＩＤマウスの、「脳ミックス」（嗅球と小脳との混合物）、脊髄、肺、心臓、脾臓、腎臓、および肝臓における、ヒト特異的遺伝子発現またはマウス特異的遺伝子発現についてのＲＴ－ＰＣＲである。ｈｉＰＳＣは、陽性対照として用いられる。ヒト特異的遺伝子は、第１０染色体の、２９１２５６５０～２９１２５９６７に位置する。マウス特異的遺伝子は、マウスＴＮＦαの一部である。Ｎ．Ｄ：検出なしである。指定の記載がない限り、全てのスケールバーは、１００μｍを指し示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） ｉｎ ｖｉｖｏにおける、Ｃ４ ｈｉＰＳＣ由来ｍＤＡ細胞の生存および機能を示す図である。（Ａ～Ｄ）薬物誘導回旋行動試験（Ａ）、コリドー試験（Ｂ）、シリンダー試験（Ｃ）およびステッピング試験（Ｄ）を使用する、Ｄ２８群および凍結保存（「凍結」）Ｄ２８群における、行動学的評価である（ｎ＝９）。（Ｅ～Ｆ）宿主脳の、移植片由来ｈＮＣＡＭ＋神経支配、およびＴＨ＋神経支配についての概観である。（Ｇ～Ｌ）無傷側、移植側、および病変を施された非移植側の宿主における、ＳＴＲ、ＮＡｃ、およびＰＦＣへの、移植片由来ｈＮＣＡＭ＋ニューロン（Ｇ～Ｉ）またはＴＨ＋ニューロン（Ｊ～Ｌ）による神経支配である。（Ｍ）移植片由来神経支配を示す高倍率画像である。（Ｎ）移植されたニューロン内の、ヒト特異的シナプスマーカーであるシナプトフィシン、ＴＨ、およびＤＡＲＰＰ３２についての免疫蛍光染色である。全ての移植片解析データ（Ｅ～Ｍ）は、移植の２６週間後に得た。ＡＣ：前交連；ｃｃ：脳梁；ｄＳＴＲ：背側線条体；ＬＶ：側脳室；ＮＡｃ：側座核；ＰＦＣ：前頭前皮質；Ｔ：移植である。データは、平均値±ＳＥＭとして提示する。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定である。スケールバー：５００μｍ（Ｇ～Ｌ）；１００μｍ（Ｍ～Ｎ）である。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） 代謝の再プログラム化を調節するマイクロＲＮＡの同定、およびそれらのＹ４Ｆとの組合せに基づく、改良再プログラム化法を示す図である。（Ａ～Ｂ）ＸＦｐ解析器を使用して、対照（Ｓｃｒ）またはｍｉＲ－２００ｃ（２００ｃ）について、トランスフェクションの３日後において、マイクロＲＮＡ模倣体をトランスフェクトされたｈＤＦの、酸素消費速度（ＯＣＲ）（Ａ）、および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）（Ｂ）を評価した。平均値±標準偏差、ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、対応のない両側ｔ検定である。（Ｃ）トランスフェクションの３日後における、ＳｃｒまたはｍｉＲ－２００ｃをトランスフェクトされたｈＤＦのＯＸＰＨＯＳ能である。平均値±標準偏差（ｎ＝３）である。（Ｄ～Ｅ）ＦＣＣＰ注射の後における、基礎呼吸、ＡＴＰ代謝回転、最大呼吸、酸化予備能（Ｄ）、または相対ＯＣＲ変化（Ｅ）である。平均値±標準偏差、ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、対応のない両側ｔ検定である。（Ｆ～Ｇ）形質導入の３（Ｆ）または８（Ｇ）日間後において、Ｙ４Ｆおよび／またはｍｉＲ－２００ｃ（２００ｃ）を発現させるレンチウイルスを感染させられたｈＤＦについて、ＯＣＲを示す。平均値±標準偏差（ｎ＝３）である。（Ｈ～Ｉ）図９Ｆ～Ｇで示されたのと同様の、形質導入の３（Ｈ）または８（Ｉ）日間後のｈＤＦにおける、基礎呼吸、ＡＴＰ代謝回転、最大呼吸、および酸化予備能である。平均値±標準偏差、ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５、チューキーの事後検定を伴う、一元ＡＮＯＶＡである。（Ｊ～Ｋ）図９Ｆ～Ｇで示されたのと同様の、形質導入後のｈＤＦの、ＦＣＣＰ注射の後における、ＯＣＲ／ＥＣＡＲ比（Ｊ）、または相対ＯＣＲ変化（Ｋ）である。平均値±標準偏差、ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、チューキーの事後検定を伴う、二元ＡＮＯＶＡである。（Ｌ～Ｍ）形質導入の３日間後において、個々のｍｉＲＮＡを発現させるレンチウイルスを形質導入されたｈＤＦにおける、ＯＣＲ（Ｌ）およびＥＣＡＲ（Ｍ）である。平均値±標準偏差、ｎ＝９、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５、チューキーの事後検定を伴う、一元ＡＮＯＶＡである。（Ｎ）図９Ｌ～Ｍで示されたのと同様の、ＯＣＲ／ＥＣＡＲ比である。平均値±標準偏差、ｎ＝９、＊＊＊ｐ＜０．００５、チューキーの事後検定を伴う、一元ＡＮＯＶＡである。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） Ｙ４Ｆ＋３＋２再プログラム化プロトコールの同定を示す図である。（Ａ）形質導入の１４日後における、ＴＲＡ－１－６０陽性コロニー（上）、またはＡＰ陽性コロニー（下）についての代表的写真である。（Ｂ）レンチウイルスによる、Ｙ４Ｆ、Ｙ４Ｆ＋３、またはＹ４Ｆ＋３＋２の、ヒト成人線維芽細胞（ＧＭ０３５２９）への形質導入後における、ＡＰ＋コロニー中の、ＴＲＡ－１－６０＋コロニーの百分率である。平均値±標準偏差、ｎ＝６、＊＊ｐ＜０．０１、チューキーの事後検定を伴う、二元ＡＮＯＶＡである。（Ｃ～Ｄ）ｐＹ４Ｆ（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、およびＬ－ＭＹＣ）（Ｃ）、ならびにｍｉＲ－３０２ｓおよびｍｉＲ－２００ｃ（ｐ３＋２）（Ｄ）をコードするプラスミドのマップである。（Ｅ）本発明者らが確立したエピソームシステムベースの再プログラム化法であって、ｐＹ４ＦおよびｐＹ３＋２の単回のトランスフェクションを使用する再プログラム化法についての概略図である。 （上記の通り。） （上記の通り。） 本発明者らの改良再プログラム化法により作出されたｈｉＰＳＣ細胞系についての免疫細胞化学染色を示す図である。Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからの、９例の線維芽細胞系（３例の家族性ＰＤ、３例の孤発性ＰＤ、および３例の健常対象：Ａ）、および新たな皮膚生検からの、４例の試料（３例の健常対象、および１例の孤発性ＰＤ患者：Ｂ）を含む、複数の供給源に由来する、多様なヒト成人線維芽細胞から、本発明者らのエピソーム法により作出されたヒトｉＰＳＣについての免疫細胞化学染色である。 （上記の通り。） 本発明者らの改良再プログラム化法により作出されたｈｉＰＳＣ細胞系についての特徴づけを示す図である。（Ａ）ｑＲＴ－ＰＣＲによる、ＥＢＮＡ－１特異的配列（ＥＢ－０１）の検出についての検量線である。（Ｂ）任意のｈｉＰＳＣ細胞系の細胞質中で、残留プラスミドＤＮＡは検出されなかった。元の線維芽細胞（Ｆｉｂ）、ヒトＥＳＣ細胞系（Ｈ９）、および陰性対照（蒸留水：ＤＷ）に由来する試料についてもまた調べた。ｑＲＴ－ＰＣＲ解析のために、ＥＢＮＡ配列（ＥＢ－０１）に基づく、プラスミド特異的プライマーを使用した。（Ｃ）宿主ゲノムに組み込まれたプラスミドＤＮＡの検出である。１つの細胞系（Ｎ１７）は、プラスミドＤＮＡ配列を、宿主染色体ＤＮＡへと組み込んでいることが見出された。（Ｄ）組み込まれたプラスミド配列についてのｑＲＴ－ＰＣＲ解析である。平均値±標準偏差、ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．００５、一元ＡＮＯＶＡである。（Ｅ）孤発性ＰＤ患者の皮膚生検に由来するｈｉＰＳＣ細胞系（ＭＣＬ５４０）についての、染色体遺伝子型解析である。パターンを、それぞれ、陽性対照および陰性対照としての、元の線維芽細胞（Ｆｉｂ）およびｈＥＳＣ細胞系（Ｈ９）に由来する試料と比較した。ＤＷ：蒸留水である。（Ｆ）Ｃ４およびＮ３の正常核型についての代表的画像である。（Ｇ）ＷｉＣｅｌｌ製の１９－９－１１Ｔ ｈｉＰＳＣ細胞系（上）、Ｃ４（中）、およびＮ３（下）からの奇形腫形成、およびこれらに由来する３つ胚葉組織についての代表的画像である。スケールバー：１００μｍである。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） スポッティングベースの分化プロトコールについての概略を示す図である。（Ａ）単層ベースの方法、またはスポッティングベースの方法を使用する、ｈＥＳＣおよびｈｉＰＳＣの分化成功率である（ｈＥＳＣについてのｎ＝７６、およびｈｉＰＳＣについてのｎ＝４８）。１）１５日目に、細胞が、＞５０％のコンフルエンシーで生存しうる場合、および２）免疫細胞化学による、さらなる特徴づけのために、細胞が採取され、カバーガラス上に播種されうる場合に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分化は、成功であると考えられた。（Ｂ～Ｃ）６つのスポットを伴う、６ｃｍの培養プレート、および１２スポットを伴う、１０ｃｍの培養プレートのための、スポッティングについての概略図である。 （上記の通り。） スポッティングベースのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化と、単層ベースのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化との比較を示す図である。単層ベースの方法、およびスポッティングベースの方法において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化を使用する、（Ａ）Ｃ４およびＨ９（ｎ＝４）の、分化１５日目における、細胞喪失量と、細胞収量との比の比較である。細胞喪失数および細胞採取数は、ＦＡＣＳにより得た。同じく、（Ｂ）Ｃ４およびＨ９（ｎ＝４）の両方について、異なる時点において採取された上清のｐＨ値の比較である。同じく、（Ｃ）Ｃ４の、４日目、８日目、１２日目、および１５日目における、形状的特色の比較である。スケールバーは、２０μｍを提示する。データは、平均値±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００５として提示する。対応のある両側ｔ検定（Ａ）、チューキーの多重比較検定を伴う、一元ＡＮＯＶＡ（Ｂ）を使用して、統計学的有意性を決定した。 （上記の通り。） （上記の通り。） ケルセチン処理による、未分化ｈｉＰＳＣの除去を示す図である。（Ａ）全細胞１００×１０３個中、線維芽細胞により、１０倍で系列希釈された未分化ｈｉＰＳＣについての、抗ＳＳＥＡ－４およびＴＲＡ－１－６０によるＦＡＣＳ解析である。（Ｂ）インプットｈｉＰＳＣの数を、結果として得られるＳＳＥＡ－４＋／ＴＲＡ－１－６０＋細胞の百分率と対比したプロットである。（Ｃ）ケルセチン処理を伴うか、または伴わないＤ１４細胞中の、ＮＡＮＯＧについての免疫染色である。スケールバー：１００μｍである。 （上記の通り。） ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化させたＣ４ ｈｉＰＳＣについての特徴づけを示す図である。（Ａ）３日目～４０日目における分化細胞についての明視野画像である。（Ｂ）神経前駆細胞（ＮＥＳＴＩＮ）、ｍＤＡＰ（ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ）、ｍＤＡＮ（ＭＡＰ２およびＴＨ）、ＧＡＢＡ作動性ニューロン（ＧＡＢＡ）、およびセロトニン作動性ニューロン（５－ＨＴ）陽性細胞についての、かつ、ｍＤＡ分化の１４日目、２１日目、２８日目、および５０日目における、免疫蛍光染色および百分率である。スケールバー：１００μｍである。データは、平均値±ＳＥＭとして提示する（ｎ＝６）。 ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化させたＣ４ ｈｉＰＳＣについての細胞運命解析を示す図である。（Ａ）電気生理学的に記録された、ＴＨ、ＭＡＰ２、ＳＹＰ（シナプトフィシン）、ＤＡＴ（ドーパミン輸送体）、ＶＭＡＴ２（小胞モノアミン輸送体２）、およびＰＩＴＸ３を共発現するＤ７０細胞についての免疫蛍光染色である。スケールバー：１００μｍである。（Ｂ）ＴＨ陽性細胞を伴う、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＧＩＲＫ２、およびカルビンジンについての、免疫蛍光染色である。スケールバー：１００μｍである。 ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化させたＣ４ ｈｉＰＳＣについての電気生理学的特色を示す図である。（Ａ）７０日目において、脱分極電流注入（５００ミリ秒）により誘導される活動電位についての、代表的電圧出力波形である。（Ｂ）電圧固定モードにおいて、電圧パルスにより誘発される、代表的な電流出力波形である。左：増分を１０ｍＶとして、－７０ｍＶ～＋４０ｍＶの電圧パルスにより誘導される、一過性の内向き電流、および持続的外向き電流（１００ミリ秒の持続時間）である。中：内向き電流は、ＴＴＸ（１μＭ）により完全に遮断された。右：ＴＴＸの存在下で記録された出力波形を、対照条件下で記録された出力波形から差し引いて、異なる膜電位における、電圧依存性Ｎａ＋電流を分離した。（Ｃ）電圧固定モードにおいて、－７０ｍＶで記録された、自発的シナプス後電流である。（Ｄ）電流固定モードの、静止膜電位における、分化細胞の自発発火である。（Ｅ）個々の記録された細胞についての免疫蛍光染色である。ニューロビオチンで満たされた細胞（赤）は、ＴＨ陽性であること（緑）を示す。スケールバー：１００μｍである。（Ｆ）マルチ電極アレイを使用する、３０日目、３７日目、および４４日目における、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化させたＣ４ ｈｉＰＳＣの、累積活動マップおよびスパイキング活動である。（Ｇ～Ｈ）グルタミン酸受容体アンタゴニストである、ＮＢＱＸ＋ＡＰ５と、ＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストである、ピクロトキシンとの組合せによる処理を伴うか、または伴わない、Ｄ４４分化Ｃ４ ｈｉＰＳＣの、平均スパイク数（Ｇ）、および活動電極数（Ｈ）である。データは、平均値±ＳＥＭとして提示する（ｎ＝４）。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） ｉｎ ｖｉｖｏの、ＰＤについての無胸腺ラットモデルにおける、移植転帰についての解析を示す図である。（Ａ）Ｃ４由来Ｄ２８ ＤＡ前駆細胞（細胞１００，０００または３００，０００個）の移植の前ならびに、４、８、１２、および１６週間後における、６－ヒドロキシドーパミンにより病変を施されたＴａｃｏｎｉｃラットの、アンフェタミン誘導回旋行動試験である。データは、平均値±ＳＥＭとして提示する。＊＊は、ｐ＜０．０１を意味し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を意味する。（Ｂ）Ｄ２８細胞移植の６カ月間後における、無胸腺ラット脳についてのＨ＆Ｅ染色である。（Ｃ）ｈＮＣＡＭについての免疫組織化学は、冠状面連続切片において、宿主脳全体にわたる複数の領域への、広範な線維伸長を明らかにする。（Ｄ～Ｇ）高倍率のｈＮＣＡＭ染色は、移植片から、前頭前皮質（Ｄ）、中隔核（Ｅ）、側座核（Ｆ）、および脳梁（Ｇ）への伸長パターンを例示する。（Ｈ～Ｊ）移植の６カ月後における、Ｄ２８ ＤＡ前駆細胞により作製された移植片内の、ＴＨ＋ドーパミン作動性ニューロンについての組織学的解析である。大型で角張った細胞体を伴う、Ａ９様ニューロンの形状（Ｉ）のほか、小型で球形のＡ１０様ニューロン（Ｊ）に留意されたい。（Ｋ）ｉｎ ｖｉｖｏの、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ製無胸腺ラットにおける実験についての概略図である。（Ｌ）新規調製Ｄ２８細胞と、液体窒素中における１週間の後で解凍した凍結Ｄ２８細胞とにおける、細胞生存率、ならびにＦＯＸＡ２陽性細胞数、ＬＭＸ１Ａ陽性細胞数、およびＴＨ陽性細胞数についての比較である（ｎ＝３～４）。（Ｍ）Ｄ２８細胞および凍結Ｄ２８細胞の移植の２４～５２週間後における、アンフェタミン誘導回旋行動試験である（ｎ＝３～４）。データは、平均値±ＳＥＭとして提示する。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定である。ＡＣ：前交連；ｃｃ：脳梁；ＮＡｃ：側座核；ＰＦＣ：前頭前皮質である。指定の記載がない限り、全てのスケールバーは、１００μｍを指し示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） ｉｎ ｖｉｖｏにおける移植についての、機能解析および神経支配解析を示す図である。（Ａ）Ｈ９ ｈＥＳＣ由来Ｄ２８細胞およびＣ４ ｈｉＰＳＣ由来Ｄ２８細胞の移植後における、アンフェタミン誘導回旋行動試験である（ｎ＝５～８）。（Ｂ）各群からの、６－ヒドロキシドーパミンにより病変を施された脳についての代表的画像である。（Ｃ）移植片の、ＳＴＲおよびＮＡｃへの神経支配についての高倍率画像である。データは、平均値±ＳＥＭとして提示する。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定である。ＳＴＲ：線条体；ＮＡｃ：側座核である。 （上記の通り。） Ｃ４由来ｍＤＡ細胞の移植後における移植片解析を示す図である。（Ａ）Ｄ２８移植片内および凍結Ｄ２８移植片内の、ＴＨ＋ニューロン（Ａ９様ニューロンおよびＡ１０様ニューロンの両方）についての免疫染色である。（Ｂ）Ｄ２８移植片内および凍結Ｄ２８移植片内の、生存ＴＨ＋ニューロン数についての推定である（ｎ＝４）。（Ｃ）Ｄ２８移植片および凍結Ｄ２８移植片における、移植片容量についての推定である（ｎ＝４）。（Ｄ～Ｆ）Ｄ２８移植片内の、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ（Ｄ）およびＮＵＲＲ１（Ｅ）と、ＴＨとについての免疫蛍光共染色である（ｎ＝４）。（Ｆ）Ｄ２８移植片内および凍結Ｄ２８移植片内で、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、これらのマーカーの両方、またはＮＵＲＲ１を共発現するＴＨ＋ニューロンについての定量である（ｎ＝４）。（Ｇ）ＤＡＴおよびＴＨについての免疫蛍光共染色である。（Ｈ）移植ニューロン内の、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、およびＫｉ６７についての免疫蛍光染色である。（Ｉ）Ｄ２８移植片内および凍結Ｄ２８移植片内の、ＰＡＸ６＋細胞、ＳＯＸ１＋細胞、およびＫｉ６７＋細胞の定量である（ｎ＝４）。（Ｊ～Ｌ）Ｄ２８移植片内および凍結Ｄ２８移植片内のＴＨについての、ＧＩＲＫ２＋ニューロン（Ｊ）およびカルビンジン＋ニューロン（Ｋ）の免疫蛍光共染色である（ｎ＝４）。（Ｌ）Ｄ２８移植片内および凍結Ｄ２８移植片内の、カルビンジン＋ニューロンおよびＧＩＲＫ２＋ニューロンの定量である。（Ｍ～Ｏ）Ｄ２８移植片内の、ＴＨ＋、ＡＬＤＨ１Ａ１＋、およびＳＯＸ６＋（Ｍ）、ＴＨ＋、ＡＬＤＨ１Ａ１＋、およびＧＩＲＫ２＋（Ｎ）、ＴＨ＋、ＡＬＤＨ１Ａ１＋、およびカルビンジン＋（Ｏ）についての免疫蛍光共染色である。Ｔａｃｏｎｉｃラットについての、全ての移植片解析データは、移植の１８週間後に得た。Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒラットについての、全ての移植片解析データは、移植の２６週間後に得た。ＡＣ：前交連；ｃｃ：脳梁；ＮＡｃ：側座核；ＰＦＣ：前頭前皮質；ＳＮｐｃ：黒質緻密部；ＳＴＲ：線条体；Ｔ：移植；ＶＴＡ：腹側被殻領域である。スケールバー：５０μｍ（Ａ）；１００μｍ（Ｄ～Ｏ）である。 （上記の通り。） （上記の通り。） ＧＭＰ分化プロトコールについての概観および品質管理結果を示す図である。（Ａ）各段階における細胞収量を、赤色で示した、ＧＭＰ分化プロトコールについての概略図である。ＱＣは、品質管理を指し示す。（Ｂ）ＯＣＴ４およびＳＳＥＡ－４についてのＤ０免疫細胞化学ＱＣ染色である。（Ｃ）ｑＲＴ－ＰＣＲを使用する、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇのｍＲＮＡ発現レベルについてのＤ０ ＱＣである。（Ｄ）Ｃ４ Ｄ２６についてのＤＮＡフィンガープリンティングＱＣが、元の線維芽細胞を同じパターンで示す一方で、陰性対照が異なるパターンであることは、作業用細胞バンクからのＣ４ ｉＰＳ細胞が、患者の線維芽細胞に由来することを確認する。Ｆｉｂ：線維芽細胞である。Ｍ：ＤＮＡマーカーである。（Ｅ）ｑＲＴ－ＰＣＲを使用する、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、およびＴＨのｍＲＮＡ発現レベルについてのＤ２６ ＱＣである。（Ｆ）Ｄ０未分化細胞を、陰性対照として使用する、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、およびＮｕｒｒ１についての、Ｄ２６免疫細胞化学ＱＣ染色である。（Ｇ）（Ｆ）による、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、およびＮｕｒｒ１の発現の定量である。（Ｈ）Ｄ０未分化細胞のＯＣＴ４およびＳＳＥＡ－４についての染色を陰性対照として使用する、ＴＨ、５－ＨＴ、ＴＰＨ、ＯＣＴ４、およびＳＳＥＡ－４についての、Ｄ２６免疫細胞化学品質管理染色である。（Ｉ）（Ｈ）による、ＴＨ、５－ＨＴ、ＴＰＨ、ＯＣＴ４、およびＳＳＥＡ－４の発現の定量である。一部の細胞は、免疫細胞化学ＱＣのために、２６日目に採取して、細胞のカバースリップへの接着、および完全な染色、および解析過程を可能としてから、２８日目における最終的な採取を行った。スケールバー：１００μｍである。各実験についてのｎ＝３である。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） ヒト化マウスにおける、ｍＤＡ前駆細胞の免疫原性を示す図である。ＡおよびＢは、生存移植片の存在およびドーパミン作動性分化を検出するように、自家ｍＤＡＰおよび同種ｍＤＡＰの移植の２週間後において、ｈＮＣＡＭ（Ａ）およびＴＨ／ｈＮＣＡＭ（Ｂ）に対する抗体で染色されたマウス脳切片を示す。（Ｃ）患者ヒト化動物に移入された同種移植片だけにおける、著明な細胞喪失およびＴ細胞浸潤を裏付ける、抗ＣＤ４による染色である。全てのスケールバーは、１００μｍを指し示す。ＮＳＧ：ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒγヌルマウス；Ｃ４－ ｈｕ：患者由来ＰＢＭＣでヒト化されたＮＳＧマウス；Ｋ１－ｈｕ：ボランティア由来ＰＢＭＣでヒト化されたＮＳＧマウスである。Ｃ４－ｍＤＡＰ：患者由来ｍＤＡＰ；Ｈ９－ｍＤＡＰ：ヒト胚性細胞系由来ｍＤＡＰである。 イメージングを示す図である。（Ａ）表示の時点：ベースライン（第１の手術の４カ月前）、左側インプラントの３カ月後、右側インプラントの６カ月後であり、かつ、左側インプラントの１２カ月後、および左側インプラントの２４カ月後であり、かつ、右側インプラントの１８カ月後の、大脳基底核基準面における、軸方向の１８Ｆ－ＤＯＰＡ ＰＥＴ画像である。初期の、左側インプラントの３カ月後における、１８Ｆ－ＤＯＰＡ取込みの一過性減少に続き、両側の、主に、移植部位近傍の被殻後方において、ドーパミン取込みのわずかな漸進的増大（左側より、右側において大きい）が見られた。（Ｂ）左側植込みの１８カ月間後、および右側植込みの１２カ月間後における、Ｔ２ブレード法によるＭＲ画像である。矢印は、インプラントの位置を指し示す。 パーキンソン病に関連する運動機能、非運動機能、および生活の質についての、長期的臨床評価を示す図である。第１の半球インプラント（左）、および第２の半球インプラント（右）の時点を、垂直方向の点線で表示する。（Ａ）レボドーパの一晩にわたる休薬（「オフ」）の後、およびレボドーパのピーク用量（「オン」）時における、ＭＤＳ－ＵＰＤＲＳの第ＩＩＩ部による運動スコアである。（Ｂ）表示のＰＤＱ評定スケールについての時間経過であり；数が小さいことは、症状の重症度が低度であることを指し示す。
黒質（ＳＮ）内のＡ９ｍＤＡニューロン（ｍＤＡＮ）の選択的変性は、パーキンソン病の、鍵となる病理学的特色であり、疾患の主要な運動症状と直接関連するので、ドーパミン作動性細胞移植が、潜在的治療戦略として提起されている（３）。胎児細胞移植を使用する、かつての介入は、多くの移植片が、２０年間またはこれを超えて持続する、著明な回復を示す、一部の患者を含む、多様な程度の機能回復と共に、標的領域の神経再支配に成功する、「概念実証」をもたらしたことは、これを裏書きする（４～７）。これらの有望な結果にもかかわらず、中絶されたヒト胎児に由来する組織は、ＰＤの処置のための生細胞の供給源として、根本的な倫理的限界、実際的限界、および医学的限界を有する。
２００６年に、山中らは、４つの転写因子、すなわち、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃ（本明細書の以下では、Ｙ４Ｆ（山中４因子）と表記される）を導入することにより、哺乳動物線維芽細胞が、胚性幹細胞（ＥＳＣ）様人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）へと転換されうることを示す画期的研究を公表した（８）。その後、山中の研究グループ、および他の２つの研究グループが、ヒト体細胞を、ヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）へと再プログラム化することにより、ヒト体細胞について、この偉業を達成し（９～１１）、患者特異的幹細胞を作出する可能性を開いた。当初のこの高揚にもかかわらず、ｈｉＰＳＣ技術が、自家細胞療法に、たやすく使用されうるのかどうかは、未だ不確実なままである。実際、大半のｈｉＰＳＣ調査研究の主要な目標は、個別化細胞療法から、ヒト疾患および発症についての機構的研究へと推移している（１２）。ＰＤのためのｈｉＰＳＣベースの細胞療法の実施には、いくつかの大きな障害が存在する。第１に、おそらく、再プログラム化過程についての、我々の理解が限られていることに起因して、個々のｈｉＰＳＣ細胞系の分化能の間には、広範なばらつきが存在する（１３、１４）。第２に、ｈｉＰＳＣベースの細胞療法の安全性は、未だ、十分に確立されていない。特に、依然として未分化であるか、またはサブクローン性の腫瘍形成性突然変異を保有する、任意のｈｉＰＳＣは、新生物化の可能性を有する（１５、１６）ので、このような細胞を、治療薬から、完全に消失させることが、極めて重要である。最初のｈｉＰＳＣベースのヒト試験（１７）における、２例の患者のうちの１例により例示される通り、安全な臨床使用は、ｈｉＰＳＣのゲノム完全性が、全ゲノム／エクソーム－シーケンシング（ＷＧＳ／ＷＥＳ）により確認されることを要求する。第３に、複数の研究室による、多数の研究にもかかわらず、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ｈｉＰＳＣの、機能的ｍＤＡＮへの分化プロトコールは、依然として最適未満であり、最終生成物のばらつきを増大させている（７、１８）。最後に、できるだけ多くの患者に利益をもたらすためには、長期的な費用効果性および再現性も必要となろう。
本開示は、これらの難題に取り組み、ｈｉＰＳＣベースの個別化細胞療法を、ＰＤの処置のための、実行可能な選択肢とする。まず、本発明者らは、再プログラム化過程時に、代謝変化を直接調節する複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を同定し、これらのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－３０２ｓおよびｍｉＲ－２００ｃ）の、カノニカルの再プログラム化因子との最適の組合せが、効率的に、かつ、信頼できる形で、高品質のｉＰＳＣを作出しうることを示した。この新たなエピソーム再プログラム化法は、１３の異なる供給源に由来する成人ヒト線維芽細胞を使用して、複数のｈｉＰＳＣを作出するのに適用されて成功している。単一の孤発性ＰＤ患者の皮膚生検に由来する線維芽細胞を使用する結果として創出されたｈｉＰＳＣについての全エクソームシーケンシング（ＷＥＳ）解析および核型解析は、いかなる公知の発がん性突然変異も伴わない、安定な染色体およびゲノム完全性を示した。第２に、本発明者らは、効率的に、かつ、信頼できる形で、未分化ｈｉＰＳＣを消失させ、移植後の腫瘍形成を回避しうる化学的方法（ケルセチン法）を確立した。例えば、米国特許第２０１６０００２６０４号明細書を参照されたい。第３に、本発明者らは、常套的な単層法と比較して、細胞喪失量の劇的な低減、および健常細胞収量の増大を結果としてもたらす、新規の「スポッティング」法に基づく、効率的なｉｎ ｖｉｔｒｏ分化プロトコールを確立した。第４に、このｉｎ ｖｉｔｒｏ分化プロトコールにより作出されたｍＤＡ細胞の移植は、新鮮細胞を利用した場合であれ、凍結保存細胞を利用した場合であれ、ＰＤについての無胸腺ラットモデルにおいて、運動失調のロバストな是正をもたらし、宿主脳への、顕著な神経再支配を示した。最後に、本発明者らは、本発明者らのプラットフォームを、医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準（ＧＭＰ）準拠施設において実施し、大量の高品質ｍＤＡ細胞を作製することに成功した。したがって、本明細書で記載されるコア技法は、ＰＤのための、個別化、自家、細胞置換療法を成功させる実施に適するプロトコールをもたらす。
ＰＤは、十分に特徴づけられた細胞型（Ａ９型ｍＤＡＮ）の選択的変性が、運動失調と関連する状態の主因であるため、細胞置換療法のための、特に有望な標的である。多数の研究者が、胎児組織、成人自家幹細胞、および同種ｍＤＡ細胞を含む、多様な細胞供給源（５～７、５４）を使用する、ＰＤのための細胞療法について調べている。本発明者らは、倫理的問題、実際的問題、および医学的問題におけるその固有の利点のために、ｈｉＰＳＣ由来自家細胞置換法に焦点を当てている。ＰＤのための個別化自家細胞療法の潜在的可能性を実現する一助とするために、本発明者らは、この治療戦略の実施に対する、現行の技術的／科学的障害に取り組もうとした。
個別化細胞療法は、処置される各患者に由来する、臨床グレードのｈｉＰＳＣの作出を要求するため、このような細胞系の、効率的、かつ、信頼できる作出を可能とする再プログラム化技術を確立することが極めて重要である。本発明者らは、２つの代謝モジュレーティングｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－３０２ｓおよびｍｉＲ－２００ｃ）の、カノニカルの山中因子（Ｙ４Ｆ）との組合せが、厳密な品質基準を満たすｈｉＰＳＣの作出を容易とすることを見出した：まず、本発明者らのｈｉＰＳＣ細胞系は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＥＳＲＲＢ、ＲＥＸ１、ＧＤＦ３、ＥＣＡＴ１、ＧＢＸ２、およびＴＲＡ－１－６０を含む、真正な多能性マーカーの、Ｈ９による発現レベル同様な発現レベルを示した（図２Ａおよび２Ｂ）。第２に、３つの胚葉特異的マーカーについての免疫染色および遺伝子発現により決定される通り、Ｙ４Ｆ＋３＋２（本発明者の最終法）により作出された、Ｈ９ ｈＥＳＣ細胞系およびｈｉＰＳＣ細胞系は、３つの胚葉細胞系統全てへと、十分に均等に分化させられたが、Ｙ４ＦまたはＹ４Ｆ＋３により作出された細胞系は、そのように分化させられなかった（図２Ｃおよび２Ｄ）。第３に、複数のｈＤＦに由来する、本発明者らのｈｉＰＳＣ細胞系は、輪郭が十分に明確な、典型的なｈＥＳＣ様凝縮コロニー形状を示した（図１０Ａおよび１１Ａ）。この方法のロバスト性は、１３の異なる成人ｈＤＦ供給源からの、複数のｈｉＰＳＣ細胞系作出の成功により検証された。代替的な送達法（例えば、成熟ＲＮＡ／ｍｉＲＮＡまたはセンダイウイルス）、および他の細胞型（例えば、血液細胞および尿細胞）を使用して、この同じ組合せが、どのような成果をもたらすのかについては、さらなる研究が必要である。
ｈｉＰＳＣが、治療のために使用される前に、それらのゲノム完全性が確立されるべきである。例えば、Ｍｅｒｋｌｅらは、Ｈ９を含む、いくつかのｈＥＳＣ細胞系が、ヒトがんにおいて一般に見られる突然変異である、腫瘍抑制因子Ｐ５３をコードするＴＰ５３遺伝子において、突然変異を発生させることを報告した（２８）。とりわけ、最初のｈｉＰＳＣベースのヒト試験では、２例の患者のうちの１例に由来するｈｉＰＳＣは、この第２の患者の細胞処置の中止を結果としてもたらす、マイナーな発がん性突然変異を有することが見出された（１７）。ゲノム完全性を確認するために、本発明者らは、核型解析、ｑＲＴ－ＰＣＲ、およびＷＥＳ解析により、孤発性ＰＤ患者に由来する、５つの独立のｈｉＰＳＣ細胞系（表ＣにおけるＭＣＬ５４０）について解析し、５つのクローンのうちの４つ（Ｃ４、Ｎ３、Ｃ１１、Ｃ５）が、組み込まれたプラスミドＤＮＡを含有せず、がんに原因として関与している体細胞突然変異を含有しないことを見出したことは、本発明者らの再プログラム化法が、臨床的に使用可能なｈｉＰＳＣ細胞系を、信頼できる形で作出することを示す（表２）。これら４つのｈｉＰＳＣクローンは、Ｍｅｒｋｌｅら（２８）により研究された、１４０のｈＥＳＣ細胞系と比較して、細胞系１つ当たり著明に少数の変異体を含有した。特に、これら４つのｈｉＰＳＣクローンは、ＣＯＳＭＩＣデータベースにおいて報告された遺伝子内に、著明に少数のコード変異体を含有した（図３）。ｈｉＰＳＣベースの治療が直面する、別の極めて重要な安全性問題は、新生物化の可能性がある残留未分化細胞を消失させる必要である。本研究では、本発明者らは、ｈＰＳＣ特異的ＢＩＲＣ５をターゲティングする、ケルセチンを使用する、化学的方法を確立した（４０）が、これは、未分化ＰＳＣを、＞９９．９９％の効率で消失させた（図５）。ＯＣＴ４発現についてのｑＲＴ－ＰＣＲ解析に基づく理論的計算は、ケルセチン処理後におけるＤ２８細胞１０００万個当たりの未分化細胞０．００１７個を予測する。こうして、全ての種類の神経膠腫についての自然発生率が、１００，０００人当たり４．６７～５．７３例の範囲である（５５）ことを踏まえるなら、腫瘍形成の危険性は、神経膠腫の自然発生率に比べても有利であろう。本方法は、簡単で、実効性があり、細胞分取またはガンマ線照射などの、さらなる操作（４５、５６）を要求しないので、たやすく、ＧＭＰ基準を満たしうる。しかし、ケルセチン処理が、ロゼット形成上皮細胞からの神経異常増殖を、直接消失させるわけではないことは、ケルセチン処理を、十分なｉｎ ｖｉｔｒｏ分化（例えば、２８日間）と組み合わせることの重要性を強調する（図７）。
本方法は、高細胞密度のスポットへの物理的分離を使用して、少数の初期細胞が、増殖および分化させられる、「スポッティング」法に基づく、効率的なｉｎ ｖｉｔｒｏ分化プロトコールをもたらす結果として、従来のコンフルエント単層法と比較して、細胞喪失量の著明な減少、および健常ｍＤＡ細胞の産生をもたらし、死細胞または瀕死細胞を顕著に減少させる（図４）。重要なことは、単層培養培地が、培地交換の頻度に関わらず、有意に酸性化し（図１４Ｂ）、おそらく、単層培養における細胞健康不良に寄与するのに対し、スポッティング培養培地は酸性化しないことである。このようなＤ２８細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、さらに分化させたところ、Ｄ２８細胞は、成熟し、４７日目に、ドーパミンを、顕著に放出し（３．１ｎｇ／ｍｌ）、７０日目までに、ｍＤＡＮに特徴的な電気生理学的特性を呈した。これらのデータは、この分化プロトコールの２８日目における培養物は、大半が、真正なｍＤＡＰからなり、移植のための、有望な供給源を表すことを示す。本発明者らは、ＧＭＰ施設において、このプロトコールをスケールアップして、臨床的に適切な数量の、高品質のｍＤＡＰを作製することに成功した（図２２Ａ～２２Ｆ）。
多数の研究が、ｈＥＳＣ／ｈｉＰＳＣの、ｍＤＡ表現型への、高度に効率的な分化を裏付けているが、それらのｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性は、最良の場合でも可変的であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるデータとは、ほとんど相関しないことが多い（７）。一部のかつての臨床試験では、最初に、適切な動物モデルにおける、広範な機能的検証にかけられていないＤＡ産生細胞の移植は、臨床的利益をもたらさなかった（５、６）。本明細書で記載される細胞移植片の有効性は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＰＤについての動物モデルを使用して、例えば、いくつかの基準：（１）十分量のｍＤＡＮが、移植片内で分化し、長期にわたり生存すること；（２）これらのｍＤＡＮが、宿主線条体内の標的領域を、広範に神経再支配すること；および（３）複数の適切な行動学試験において、運動失調が、実質的に改善されることにより確認されている。Ｄ２８ Ｃ４細胞を、６－ヒドロキシドーパミンにより片側病変を施された、Ｔａｃｏｎｉｃ無胸腺ラットまたはＣｈａｒｌｅｓｓ Ｒｉｖｅｒ無胸腺ラットへと移植したところ、ＤＡ収量は大きく、移植片は、宿主構造の、広範かつ適切な神経再支配を提示した。移植は、薬理学的に誘導された回旋行動の完全な回復を結果としてもたらした。本研究におけるＤＡ収量（生存ＤＡニューロンの、移植された細胞数に対する比）、および行動学的回復の程度は、比較可能なｈｉＰＳＣベースの研究におけるより、顕著に高度であった（表４）（４４、４５、５７～６４）。とりわけ、回旋行動の回復は、最長５２週間にわたり維持され（図１９Ｍ）、自発的なものであり、薬理学的に刺激されたものではないため、臨床的なＰＤ症状の近似物でありうる、コリドー試験、シリンダー試験、およびステッピング試験を含む、いくつかの試験でも、有意な回復が観察された（図８）。
ｈｉＰＳＣベースの個別化細胞療法の臨床妥当性を確立するために、治療薬を、確立された「ゴールドスタンダード」と比較することが重要である。幹細胞分野では、Ｈ９ ｈＥＳＣが、ヒト多能性幹細胞のための、このスタンダードを表しており、ヒト胎児ＶＭ細胞は、ＰＤのために移植可能な細胞供給源として、ゴールドスタンダードとなっている。Ｐａｒｍａｒらは、ｉｎ ｖｉｖｏの運動機能の回復における有効性について、Ｈ９由来ｍＤＡ細胞の有効性を、ヒト胎児ＶＭ細胞と、精緻に比較することで、Ｈ９由来ドーパミン細胞が、ヒト胎児ＶＭ細胞と同様に有効であることを裏付けた（５３）。本動物移植研究は、Ｈ９（ｈＥＳＣ）が供給源の場合であれ、Ｃ４（ｈｉＰＳＣ）が供給源の場合であれ、回旋行動について、同一な回復の程度および時間経過を確認した（図２０Ａ）。推定により、これらのデータは、本発明者らのプロトコールにより、患者由来ｈｉＰＳＣから作出されたドーパミン細胞が、機能的に、胎児ＶＭ細胞と同様に有効であることを、強く示唆する。高橋らによる近年の研究は、ＭＰＴＰにより病変を施されたサルモデルにおいて、ｈｉＰＳＣ由来ＤＡ細胞が生存し、運動行動を改善することを、精緻に示した（６５）が、使用されたプラットフォームの種類が異なることにより、これらの結果の、本発明者らの研究との直接的な比較は妨げられている。本発明者らは、全ての試験において、新鮮Ｃ４ Ｄ２８細胞、および凍結保存されたＣ４ Ｄ２８細胞が、同様な収量の生存ＤＡニューロン、および行動の改善を結果としてもたらしたことは、ｈｉＰＳＣに由来するｍＤＡＰが、凍結保存され、保管され、移植のための手術実施施設へと送付されうることを示唆することを見出した。実際的で、費用効果的な、臨床治療を開発することの重要性は、どれだけ強調しても強調し過ぎることがない。
したがって、本方法は、ＰＤへの臨床適用可能な個別化自家細胞療法をもたらす。
また、米国特許第２０１８０３７１４２２号明細書；米国特許第２０１２０１２８６５５号明細書；米国特許第２０１３００５２２６８号明細書；米国特許第２０１６０００２６０４号明細書；米国特許第２０１４０１９９２７４号明細書；および米国特許第２００９０２２６４０１号明細書のほか、米国特許第９６５７２７３号明細書および米国特許第９７５０７６８号明細書も参照されたい。
細胞療法のための自家細胞の作出
本明細書で記載される方法は、当技術分野で公知であるか、または本明細書で記載される方法を使用して作出されうる、例えば、神経原性底板細胞と類似する、人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の使用を含みうる。一部の実施形態では、ｈｉＰＳＣを作出するための方法は、対象、例えば、ＰＤに罹患し、ＰＤのための処置を必要とする対象に由来する初代体細胞の集団を得るステップを含みうる。好ましくは、対象は、哺乳動物、例えば、ヒトである。一部の実施形態では、体細胞は、線維芽細胞である。線維芽細胞は、例えば、公知の生検法を使用して、哺乳動物体内の結合組織、例えば、皮膚、例えば、眼瞼、耳の後部、瘢痕（例えば、腹部の帝王切開瘢痕）、または鼠径部に由来する皮膚（例えば、Fernandes et al., Cytotechnology. 2016 Mar; 68(2): 223-228を参照されたい）から得られうる。ｈｉＰＳＣのための体細胞の、他の供給源は、ヘアケラチノサイト（Raab et al., Stem Cells Int. 2014;2014:768391）、血液細胞、または骨髄間葉幹細胞（ＭＳＣ） （Streckfuss-Bomeke et al., Eur Heart J. 2013 Sep;34(33):2618-29）を含む。
本方法に従い、細胞（例えば、線維芽細胞）は、ｉＰＳＣへの再プログラム化を誘導する因子へと曝露される。プログラム化のための、他のプロトコール（例えば、当技術分野で公知であるか、または本明細書で記載される）も使用されうるが、好ましい実施形態では、方法は、４つの転写因子、すなわち、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびＬ－Ｍｙｃを導入するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、細胞に、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、およびＬ－ＭＹＣを発現させる、ポリシストロニックのエピソームベクターであって、例えば、コード配列の間に、「自己切断型」２Ａペプチドをコードする介在配列を含むエピソームベクターをトランスフェクトするステップを含む。２Ａペプチドとは、真核細胞内の翻訳時に、ポリペプチドの切断を媒介する、１８～２２アミノ酸長のウイルスペプチドである。２Ａペプチドは、Ｆ２Ａ（口蹄疫ウイルス）、Ｅ２Ａ（Ａ型ウマ鼻炎ウイルス）、Ｐ２Ａ（１型ブタテッショウウイルス２Ａ）、およびＴ２Ａ（ゾセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス２Ａ）を含み、一般に、Ｃ末端に、配列ＧＤＶＥＸＮＰＧＰ（配列番号１）を含む。例えば、Liu et al., Sci Rep. 2017; 7: 2193を参照されたい。以下の表は、例示的な２Ａ配列を提示する。
一部の実施形態では、方法は、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、およびＬ－ＭＹＣを発現させるために、細胞に、口蹄疫ウイルスの２Ａ配列（ＯＣＴ４－Ｆ２Ａ）と連結されたヒトＯｃｔ４、ＫＬＦ４、ブタテッショウウイルスの２Ａ配列（ＳＯＸ２－Ｐ２Ａ）と連結されたＳＯＸ２、およびＬ－ＭＹＣのコード配列を含むポリシストロニックのエピソームベクターをトランスフェクトするステップを含む。
ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、およびＬ－ＭＹＣの例示的な配列に対する参照番号は、以下の表に提示されている。
一部の実施形態では、方法はまた、細胞内で、１つまたは複数の外因性マイクロＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉＲ－１０６ｂ、ｍｉＲ－１３６ｓ、ｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－３０２ｓ、ｍｉＲ－３６９ｓ、およびｍｉＲ－３７１／３７３のうちの１つまたは複数を発現させるステップも含むか、またはこれを代替的に含む。ｍｉＲ－３０２ｓとは、３０２ａ、３０２ｂ、３０２ｃ、３０２ｄ、および３６７を含む、５つのｍｉＲＮＡを包含するｍｉＲ－３０２クラスターを指し示し；それらのうちのいずれか１つまたは複数が使用されうる。好ましい実施形態では、方法は、細胞内で、例えば、単一のエピソームベクターから、ｍｉＲ－３０２ｓおよびｍｉＲ－２００ｃを発現させるステップを含む。一部の実施形態では、方法は、細胞へと、ｍｉＲ－３０２ｓおよびｍｉＲ－２００ｃをコードする配列を含むエピソームベクターを導入するステップを含む。
ｍｉＲＮＡの例示的な配列は、以下の表に提示される。太字の配列は、成熟ｍｉＲＮＡを表す。
使用される配列は、本明細書で提示される例示（参照）配列と、少なくとも８０、８５、９０、９５、または１００％同一でありうるが、例示（参照）配列の所望の活性を保持するものとする。２つの配列の間の「同一性」の計算は、以下の通りに実施されうる。配列は、最適の比較目的でアライメントされる（例えば、最適のアライメントのために、第１の核酸配列および第２の核酸配列の、一方または両方へと、ギャップが導入され、同一でない配列は、比較目的で棄却される場合がある）。比較目的でアライメントされる配列の長さは、参照配列の長さの、少なくとも６０％（例えば、少なくとも７０％、８０％、９０％、または１００％）である。次いで、対応するヌクレオチド位置におけるヌクレオチドが比較される。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じヌクレオチドにより占有されている場合は、分子は、この位置において同一である。２つの配列の間の同一性パーセントとは、２つの配列の、最適のアライメントのために導入される必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮するときに、配列により共有される、同一な位置の数の関数である。
２つの配列の間の配列の比較、および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達せられうる。一部の実施形態では、２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ギャップペナルティーを１２とし、ギャップ伸長ペナルティーを４とし、フレームシフトギャップペナルティーを５とする、Ｂｌｏｓｕｍ ６２評定マトリックスを使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを使用して決定される。
一部の実施形態では、方法は、細胞内で、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、Ｌ－ＭＹＣ、ｍｉＲ－３０２ｓ、およびｍｉＲ－２００ｃの全てを発現させるステップを含む。実施形態では、方法は、細胞へと、口蹄疫ウイルスの２Ａ配列（ＯＣＴ４－Ｆ２Ａ）と連結されたヒトＯｃｔ４、ＫＬＦ４、ブタテッショウウイルスの２Ａ配列（ＳＯＸ２－Ｐ２Ａ）と連結されたＳＯＸ２、およびＬ－ＭＹＣのコード配列を含む、レンチウイルスベクターまたはポリシストロニックのエピソームベクター、ならびにｍｉＲ－３０２ｓ（例えば、上記で示された）およびｍｉＲ－２００ｃ（例えば、上記で示された配列、またはｕａａｕａｃｕｇｃｃｇｇｇｕａａｕｇａｕｇｇａ（配列番号２１））をコードする配列を含むベクター、例えば、レンチウイルスベクターまたはエピソームベクターを導入するステップを含む。
初代体細胞に、直接トランスフェクトされる場合もあり、トランスフェクションが実行される前に、まず培養され、培養プレートから除去され、再懸濁させられる場合もある。細胞は、トランスフェクションを達するために、例えば、それらのゲノムへと、安定的に組み込むように、外因性核酸配列と組み合わされ、処理される。本明細書で使用される、「トランスフェクション」という用語は、外因性核酸を、細胞導入するための様々な技法であって、それらの全てが当技術分野で公知である、リン酸カルシウム沈殿または塩化カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ－デキストリン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔を含む技法を含む。ベクターが、ウイルスベクターである場合、トランスフェクションは、ウイルス粒子を、細胞へと形質導入することを含みうる。
これらの因子を、細胞へと導入した後で、細胞を、条件下で、因子の発現、およびｉＰＳ細胞、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）のほか、より厳密な多能性マーカーであるＴＲＡ－１－６０を発現する細胞への再プログラム化の誘導に十分な時間にわたり維持する（Chan et al., 2009; Tanabe et al., 2013）。当技術分野では、多数の方法が公知であり；例えば、Malik and Rao, Methods Mol Biol. 2013;997:23-33を参照されたい。一部の実施形態では、条件は、細胞を、培地、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｌ－グルタミン（例えば、２ｍＭ）、血清、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（例えば、１０％）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、例えば、１倍濃度）、ニコチン酸アミド（ＮＡＭ、例えば、１ｍＭ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）（例えば、２５ｍＭ）、およびアスコルビン酸（ＡＡ、例えば、５０μｇ／ｍｌ）を含む培地中で維持することを含むが；代替的に、ノックアウト血清置換、グルタミン、およびβ－メルカプトエタノールを伴うＤＭＥＭ培地（ＫＳＲ、既知組成、ＦＢＳ非含有培地）も使用されうる。当業者は、他の濃度も使用されうることを理解するであろう。例えば、細胞は、４～６、例えば、５～６日間にわたりインキュベートされる。
好ましい実施形態では、細胞は、生体マトリックスハイドロゲル支持体、例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ、ＰＡＴＨＣＬＥＡＲ Ｇｒａｄｅ基底膜抽出物（Ａｍｓｂｉｏ）などの基底膜抽出物、または、例えば、Nguyen et al., Nat Biomed Eng. 2017;1. pii: 0096に記載されている、他の合成代替物、例えば、約１０μｌのゲルを使用して、プレート上の、直径が２～１０ｍｍ、例えば、約５ｍｍである、個別の領域、好ましくは、実質的に円形または楕円形の領域（本明細書ではまた、「スポット」とも称される）内へと播種されうる。スポットは、スポット間の分離を維持するように（スポットが、互いに接触し合わないように）、例えば、適切な容量の液滴を、プレートへと、約１～３ｃｍの間隔で、例えば、２×２ｃｍのグリッドの交点上に配置することにより施されうる（図１１Ｃ）。例えば、直径が約２～１０ｍｍ、例えば、約５ｍｍのスポットを施すように、約１０μｌのゲルが、グリッド入り培養プレートのグリッド交点へと配置されうる。十分な時間、例えば、１０～６０分間、例えば、２５～４５分間、例えば、約３０分間にわたるインキュベーションの後、ゲルは、スポットから、部分的に吸引され（ゲルが完全に乾燥する前に停止する）、ゲルの層を、スポット内に放置する。本明細書では、この方式で調製されたプレート（例えば、本明細書で記載されるゲルスポットを有する）もまた提示される。プレートが調製された後で、次いで、細胞は、例えば、スポット１つ当たりの細胞約５，０００～２０，０００個、例えば、約１０，０００個の密度で、例えば、細胞懸濁液約１０μｌの密度を１μｌ当たり１０，０００個として播種される。
ｉＰＳＣへの再プログラム化の後、細胞は、例えば、任意選択で、（１）３つの胚葉マーカー（外胚葉マーカーである、ＯＴＸ２；内胚葉マーカーである、ＳＯＸ１７；および中胚葉マーカーである、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ）に対する抗体による染色；（２）細胞系統特異的マーカー（例えば、外胚葉についてのＰＡＸ６およびＭＡＰ２、内胚葉についてのＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、およびＣＫ８、および中胚葉についてのＭＳＸ１、ＭＹＬ２Ａ、およびＣＯＬ６Ａ２）の遺伝子発現により同定されうる、ＥＳ様コロニーの形成まで、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｌ－グルタミン（例えば、２ｍＭ）、ＫＳＲ（例えば、２０％）、ＮＥＡＡ、ＮＡＭ、ＮａＢ、およびｂＦＧＦを含む、ｈｉＰＳＣ培地中で維持されうる。一部の実施形態では、ｉＰＳＣ細胞を、ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ８培地中、またはその同等物、すなわち、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｌ－アスコルビン酸、セレニウム、トランスフェリン、ＮａＨＣＯ３、インスリン、ＦＧＦ２、およびＴＧＦβ１を含むか、またはこれらから本質的になる同等物中で維持する。例えば、Chen et al., Nat Methods 8(5):424-429を参照されたい。
ｉＰＳ細胞が作出されるたら、これらは、ｉＰＳ細胞系として維持されうる。一部の実施形態では、各患者のために、複数のｉＰＳＣ細胞系が作出され、特徴づけられたら、最良の細胞系（例えば、１つ、２つ、３つ、またはこれを超える、最良の細胞系）が選び出される。
本明細書ではまた、本明細書で記載される方法により作製された細胞、例えば、ｉＰＳ細胞系、および細胞を含む組成物も提示される。
ウイルスベクター
本方法および本組成物における使用のためのウイルスベクターは、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレンチウイルスを含む。
本方法において、内耳への核酸の送達に有用な、好ましいウイルスベクターシステムは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶは、２５ｎｍのカプシドを有する、微小な非エンベロープウイルスである。野生型ウイルスと関連することが公知であるか、または示されている疾患は存在しない。ＡＡＶは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを有する。ＡＡＶは、エピソームにおける、長期にわたるトランス遺伝子発現を呈することが示されており、ＡＡＶは、脳内、特に、ニューロンにおける、優れたトランス遺伝子発現が裏付けられている。３００塩基対という少数の塩基対を含有するＡＡＶベクターは、パッケージングされ、組み込まれうる。外因性ＤＮＡのための空間は、約４．７ｋｂに限定される。Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985)において記載されているＡＡＶベクターなどのＡＡＶベクターは、ＤＮＡを、細胞へと導入するのに使用されうる。ＡＡＶベクターを使用して、様々な核酸が、異なる細胞型へと導入されている（例えば、Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470 (1984); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1985); Wondisford et al., Mol. Endocrinol. 2:32-39 (1988); Tratschin et al., J. Virol. 51:611-619 (1984); and Flotte et al., J. Biol. Chem. 268:3781-3790 (1993)を参照されたい）。多数の代替的なＡＡＶ変異体（１００を超えるＡＡＶ変異体がクローニングされている）、およびＡＡＶ変異体が、所望の特徴に基づき同定されている。例えば、ＡＡＶ９は、血液脳関門を、効率的に越えることが示されている。さらに、ＡＡＶカプシドは、例えば、ビオチニル化ＡＡＶベクター、指向的分子進化、自己相補性ＡＡＶゲノムなど、形質導入の効率および選択性を増大させるように遺伝子操作されうる。一部の実施形態では、ＡＡＶ１が使用される。
代替的に、レトロウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターも、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、特に、ヒトへの外因性遺伝子の導入のための組換え遺伝子送達システムとして使用されうる。これらのベクターは、遺伝子の、細胞への効率的送達をもたらし、導入された核酸は、宿主の染色体ＤＮＡへと、安定的に組み込まれる。複製欠損レトロウイルスだけを産生する特化細胞系（「パッケージング細胞」と称する）の開発は、遺伝子治療のためのレトロウイルスの有用性を増大させており、欠損レトロウイルスは、遺伝子治療を目的とする遺伝子導入における使用のために特徴づけられている（総説については、Miller, Blood 76:271 (1990)を参照されたい）。複製欠損レトロウイルスは、標準的技法により、ヘルパーウイルスの使用を介して、標的細胞に感染させるのに使用されうるビリオンへとパッケージングされうる。組換えレトロウイルスを作製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、細胞に、このようなウイルスを感染させるためのプロトコールは、Ausubel, et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14、および他の標準的実験室マニュアルにおいて見出されうる。適切なレトロウイルスの例は、当業者に公知である、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、およびｐＥＭを含む。同種指向性レトロウイルスシステム、および両種性レトロウイルスシステムの両方を調製するのに適するパッケージングウイルスの例は、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２、およびΨＡｍを含む。レトロウイルスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、様々な遺伝子を、上皮細胞を含む、多くの異なる細胞型へと導入するのに使用されている（例えば、Eglitis, et al. (1985) Science 230:1395-1398; Danos and Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150:4104-4115；米国特許第４，８６８，１１６号明細書；米国特許第４，９８０，２８６号明細書；ＰＣＴ出願国際公開第８９／０７１３６号パンフレット；ＰＣＴ出願国際公開第８９／０２４６８号パンフレット；ＰＣＴ出願国際公開第８９／０５３４５号パンフレット；およびＰＣＴ出願国際公開第９２／０７５７３号パンフレットを参照されたい）。
本方法で有用な、別のウイルス遺伝子送達システムは、アデノウイルス由来ベクターを利用する。アデノウイルスのゲノムは、それが、目的の遺伝子産物をコードし、発現するように操作されうるが、正常の溶解性ウイルスの生活環における、その複製能の点では不活化される。例えば、Berkner et al., BioTechniques 6:616 (1988); Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); and Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992)を参照されたい。当業者には、アデノウイルス株Ａｄ５型ｄｌ３２４、または他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、またはＡｄ７など）に由来する、適切なアデノウイルスベクターが公知である。組換えアデノウイルスは、ある特定の状況下では、非分裂細胞に感染することが可能であり、上皮細胞を含む、多種多様な細胞型に感染させるのに使用されうる点で有利でありうる（Rosenfeld et al., (1992) supra）。さらに、ウイルス粒子は、比較的安定であり、精製および濃縮に適し、上述の通り、感染性のスペクトルに影響を及ぼすように改変されうる。加えて、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびその中に含有される外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムへと組み込まれず、エピソーム内にとどまるため、導入されたＤＮＡが、宿主ゲノムへと組み込まれる（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）、ｉｎ ｓｉｔｕにおける、挿入性突然変異誘発の結果として生じうる、潜在的問題を回避する。さらに、アデノウイルスゲノムの、外来ＤＮＡに対する保有能は、他の遺伝子送達ベクターと比べて大きい（最大で、８キロ塩基）（Berkner et al., supra; Haj-Ahmand and Graham, J. Virol. 57:267 (1986)）。
ｍＤＡＰ／ｍＤＡＮへの分化
一部の実施形態では、方法は、ｍＤＡＰまたはｍＤＡＮを、以下の通りに作製するのに使用される。底板誘導のために、トランスフェクションの後、細胞を、１５％のＫＳＲ、グルタミン、β－メルカプトエタノールを伴うＤＭＥＭ培地中で、約６日間（１日目～６日目）にわたり維持する。神経前駆細胞誘導段階である、６日目～１２日目（Ｄ６～Ｄ１２）にわたり、細胞を、１１．５％のＫＳＲ、０．２５％のＮ２（６～８日目）、７．５％のＫＳＲ、０．５％のＮ２（８～１０日目）、３．７５％のＫＳＲ、Ｌ－グルタミン、β－メルカプトエタノール、および非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を含む、０．７５％のＮ２（１０～１２日目）を伴うＤＭＥＭ培地中で維持する。例えば、それぞれ、１日目～１２日目、および１日目～８日目に、二重Ｓｍａｄ阻害剤である、０．２μＭのＬＤＮ１９３１８９、および１０μＭのＳＢ４３１５４２を添加する場合がある。例えば、２日目～１０日目に、１つまたは複数のＳＨＨアゴニスト（例えば、２μＭのプルモルファミンおよび１００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ）を、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ８と共に添加する場合がある。Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１（１μＭ）を、例えば、４日目～１２日目に組み入れる場合がある。９日目に、細胞を、例えば、４０μＭのケルセチンで、例えば、６～２４または１２～１８時間にわたり、例えば、１６時間にわたり処理する場合がある。
ＤＡ前駆細胞の誘導／成熟段階（１２＋日目）のために、細胞は、Ｎ２である、ＢＤＮＦ（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）、ＧＤＮＦ（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）、ｄｂｃＡＭＰ（例えば、５００μＭ）、アスコルビン酸（例えば、２００μＭ）、ＴＧＦ－β３（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）が、ガンマセクレターゼ阻害剤（例えば、ＤＡＰＴ、例えば、１０μＭ）、およびＷｎｔアゴニスト（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、例えば、１μＭ）と共に補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２培地中で、約１２～１５日目にわたり維持されうる。
約１５日目に、スポット内の細胞は、採取され、例えば、ＥＤＴＡを使用して、例えば、化学的に、酵素的に、または機械的に解離させられる場合があり、単一細胞懸濁液は、例えば、ポリＬ－オルニチン／フィブロネクチン／ラミニンコーティング（ＰＬＯ／ＦＮ／Ｌコーティング）ディッシュ内に再播種されうる。１５日目に、培地、例えば、Ｎ２である、ＢＤＮＦ（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）、ＧＤＮＦ（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）、ｄｂｃＡＭＰ（例えば、５００μＭ）、アスコルビン酸（例えば、２００μＭ）、およびＴＧＦ－β３（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）を含む増殖因子を伴う、ＤＭＥＭ：Ｆ１２が適用されうる。ＲＯＣＫ阻害剤、例えば、Ｙ－２７６３２（例えば、１０μＭ）が、解離日のために添加され、次いで、除去されうる。次いで、細胞は、ｍＤＡ前駆細胞（ｍＤＡＰ）および／またはｍＤＡニューロン（ｍＤＡＮ）の誘導まで、例えば、ｍＤＡＰマーカー（例えば、ＯＴＸ２、ＬＭＸ１Ａ、およびＥＮ１）の発現、および／またはｍＤＡＮマーカー（例えば、ＴＨ、ＤＡＴ、およびＰＩＴＸ３）の発現に十分な、少なくとも２１～２８日間にわたり、培養物中で維持されうる。
当業者は、他の試薬および濃度も使用されうることを理解するであろう。例えば、ＳＨＨアゴニストは、プルモルファミン、オキシステロール、およびＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト（ＳＡＧ）を含み；多数のＷｎｔアゴニストは、表Ａに提示される。
他のガンマセクレターゼ阻害剤は、ＲＯ４９２９０９７；ＤＡＰＴ（Ｎ－［（３，５－ジフルオロフェニル）アセチル］－Ｌ－アラニル－２－フェニル］グリシン－１，１－ジメチルエチルエステル）；Ｌ－６８５４５８（（５Ｓ）－（ｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－６－フェニル－（４Ｒ）ヒドロキシ－（２Ｒ）ベンジルヘキサノイル）－Ｌ－ｌｅｕ－Ｌ－ｐｈｅ－アミド）；ＢＭＳ－７０８１６３（アバガセスタット）；ＢＭＳ－２９９８９７（２－［（１Ｒ）－１－［［（４－クロロフェニル）スルホニル］（２，５－ジフルオロフェニル）アミノ］エチル－５－フルオロベンゼン酪酸）；ＭＫ－０７５２；ＹＯ－０１０２７；ＭＤＬ２８１７０（Ｓｉｇｍａ）；ＬＹ４１１５７５（Ｎ－２（（２Ｓ）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）－２－ヒドロキシエタノイル）－Ｎ１－（（７Ｓ）－５－メチル－６－オキソ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ジベンゾ［ｂ，ｄ］アゼピン－７－イル）－ｌ－アラニンアミド、ＵＳ６，５４１，４６６を参照されたい）；ＥＬＮ－４６７１９（ＬＹ４１１５７５の２－ヒドロキシ－吉草酸アミド類似体（ここで、ＬＹ４１１５７５は、３，５－ジフルオロ－マンデル酸アミドである）（米国特許第６，５４１，４６６号明細書））；ＰＦ－０３０８４０１４（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－５，７－ジフルオロ－１，２，３，４－テトラヒドロナフタレン－３－イルアミノ）－Ｎ－（１－（２－メチル－１－（ネオペンチルアミノ）プロパン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）ペンタンアミド、Samon et al., Mol Cancer Ther 2012;11:1565-1575）；化合物Ｅ（（２Ｓ）－２－｛［（３，５－ジフルオロフェニル）アセチル］アミノ｝－Ｎ－［（３Ｓ）－１－メチル－２－オキソ－５－フェニル－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－１，４－ベンゾジアゼピン－３－イル］プロパンアミド；国際公開第９８／２８２６８号パンフレット；およびSamon et al., Mol Cancer Ther 2012;11:1565-1575を参照されたい）；およびセマガセスタット（ＬＹ４５０１３９；（２Ｓ）－２－ヒドロキシ－３－メチル－Ｎ－（（１Ｓ）－１－メチル－２－｛［（１Ｓ）－３－メチル－２－オキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１Ｈ－３－ベンズアゼピン－１－イル］アミノ｝－２－オキソエチル）ブタンアミド）、または薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される、ガンマセクレターゼ阻害剤を含む。
本明細書ではまた、本明細書で記載される方法により作製された細胞、例えば、ｍＤＡＰまたはｍＤＡＮ細胞、および細胞を含む組成物も提示される。
本方法は、ｉＰＳＣの、ドーパミン作動性ニューロンへの分化について例示するが、スポッティング法は、他のニューロン型を含む、他の細胞型のための分化プロトコールにおいても使用されうる。当技術分野では、多数のニューロン分化プロトコールが公知であり；例えば、Salimi et al., Mol Biol Rep. 2014 Mar;41(3):1713-21；Gunhnlar et al., Molecular Psychiatry 23:1336-1344 (2018)；Trilck et al., Methods Mol Biol. 2016;1353:233-59；Zhang et al., Stem Cell Res Ther. 2018 Mar 15;9(1):67；D’Aiuto et al., Organogenesis. 2014;10(4):365-77；Marton and Ioannidis, Stem Cells Translational Medicine 2019;8:366-374；Bell et al. Bio-protocol 9(5): e3188 (2019). DOI: 10.21769/BioProtoc.3188；Bianchi et al., Stem Cell Research 32:126-134 (2018)を参照されたい。
処置法
本明細書で記載される方法を使用して作出されるｍＤＡＰおよびｍＤＡＮは、例えば、細胞モデルとして使用される場合があり、パーキンソン病（ＰＤ）を有する（またはＰＤを発症する危険性のある）対象を処置するのに使用されうる。このような対象は、当技術分野で公知の方法を使用して、医療ケア提供技術分野の当業者により同定されうる。方法は、初代体細胞を得るステップ；ｍＤＡＰを含む細胞集団を作出するステップ；および細胞を投与するステップを含みうる。好ましくは、初代体細胞は、ＰＤを有する（またはＰＤを発症する危険性のある）、処置される対象から得られるが、一部の実施形態では、細胞は、好ましくは、処置される対象（すなわち、自家細胞）と同じ種の、異なる対象、好ましくは、免疫学的にマッチさせられた対象から得られる。好ましくは、本明細書で記載される方法により、１つ、２つ、またはこれを超えるｍＤＡＰマーカーを発現する細胞（例えば、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＬＭＸ１Ａ、およびＥＮ１、例えば、ＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａ；任意選択で、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、およびＮＵＲＲ１を共発現するＴＨ＋細胞）を含み、任意選択で、１つ、２つ、またはこれを超えるｍＤＡＮマーカー（例えば、ＴＨ、ＤＡＴ、およびＰＩＴＸ３）を発現する細胞を含むが、ＳＯＸ１、ＰＡＸ６、およびＫＩ６７を発現する細胞を含まない集団を作出するのに十分なｍＤＡＰが作出される。
細胞は、当技術分野で公知の方法を使用して投与される。一部の実施形態では、細胞は、例えば、磁気共鳴イメージング誘導定位固定手術を使用して、対象の脳の罹患領域へと直接、またはこの近傍に、例えば、両側において、尾状核、被殻、および黒質のうちの１つまたは複数へと植え込まれることにより投与される。例えば、Garitaonandia et al., Stem Cells Dev. 2018 Jul 15;27(14):951-957；Kikuchi et al., Nature 548 : 592-596 (31 August 2017)；MOrizane et al., Nature Communications 8:385 (2017)；Sonntag et al., Prog Neurobiol. 2018 Sep;168:1-20を参照されたい。
培養ディッシュ
本明細書ではまた、本明細書で記載される方法における使用のための培養ディッシュも提示される。ディッシュは、底部に、グリッド線の間の距離を１．５～２．５ｃｍとするグリッド、例えば、約２ｃｍ、例えば、２×２ｃｍのグリッドを有する。グリッドは、例えば、底部にプリントまたはエッチングされた、ディッシュの部分として形成されうる。培養ディッシュは、例えば、常套的な射出成形法または熱形成法を使用する、当技術分野で公知の方法、ならびに培養ディッシュに許容可能な、任意の材料、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、およびポリビニル製の熱可塑性樹脂を使用して作製されうる。別の適切な材料は、ガラスである。一部の実施形態では、ディッシュは、実質的な平底を有するが；代替的に、グリッド線の交点において、例えば、直径を約２～１０ｍｍ、例えば、約３～７ｍｍ、例えば、約５ｍｍとする、円形または楕円形のくぼみまたは陥没が存在する場合もある。陥没は、例えば、０．０１～０．２ｍｍの深さでありうる。一部の実施形態では、ディッシュは、生体マトリックスハイドロゲル支持体、すなわち、基底膜抽出物、または合成マトリックスを有する。
一部の実施形態では、グリッドを有する培養ディッシュは、細胞を播種するために、それぞれ、１２または６つの交点を伴う、１０または６ｃｍの、丸形培養ディッシュである。細胞配置領域間の（スポットの中心～隣接するスポットの中心の）距離は、２ｃｍであり、細胞スポットの直径は、０．５ｃｍである。周長は、約１．５７ｃｍであり、面積は、約０．２ｃｍ２である。したがって、グリッド線の交点において、６ｃｍディッシュについては、６つだけの可能なスポットが存在し、１０ｃｍディッシュについては、１２の可能なスポットが存在する。
特許請求の範囲で記載される、本発明の範囲を限定するものではない、以下の例において、本発明について、さらに記載する。
材料および方法
下記の実施例では、以下の材料および方法を使用した。
使用される抗体および試薬を、表Ｂに示す。
生検
ＩＲＢ承認プロトコール（ＩＲＢパートナー番号：２０１０Ｐ００１１００）下で、３例の健常対象、および１例の孤発性ＰＤ患者から、皮膚生検（表Ｃ）を採取した。
実験動物
各群内の動物の株の詳細および数は、以下の通りである：
６－ヒドロキシドーパミンにより病変を施された無胸腺ラット（ＮＴａｃ：ＮＩＨ－Ｆｏｘｎ１ｒｎｕ、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、雄、１２～１４週齢。無胸腺ラット（Ｃｒｌ：ＮＩＨ－Ｆｏｘｎ１ｒｎｕ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ株コード番号：３１６）、雄、１２～１４週齢。ＮＯＤ－ＳＣＩＤ（ＮＯＤ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＮＣｒＣｒｌ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ株コード番号：３９４）、雄または雌、８～１０週齢。全ての動物は、滅菌の不断給餌および給水を伴う、１２時間の明暗サイクル下に置かれた、通風ケージ内で飼育された。
細胞培養物
ヒトＢＪ皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ）およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＡＴＣＣから購入し、既に公表されているプロトコール（１９）に従い増殖させた。ｈｉＰＳＣを誘導するために、トランスフェクション後５日間にわたり、感染細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、２ｍＭのＬ－グルタミン、１０％のＦＢＳ、１倍濃度のＮＥＡＡ、１ｍＭのＮＡＭ、２５ｍＭのＮａＢ、および５０μｇ／ｍｌのＡＡを含有する誘導培地中で維持し、次いで、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、２ｍＭのＬ－グルタミン、２０％のＫＳＲ、１倍濃度のＮＥＡＡ、１ｍＭのＮＡＭ、２５ｍＭのＮａＢ、および１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有するｈｉＰＳＣ培地中で維持した。Ｈ９ ｈＥＳＣ細胞系は、ＷｉＣｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから得た。Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリックスを使用して、全てのｈｉＰＳＣ細胞系を、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中で維持し、穏和な解離のために、０．５ｍＭのＥＤＴＡ溶液を使用して継代培養した。全てのｈＥＳＣ細胞系を、Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリックスを使用して、ｍＴｅＳＲ（商標）１培地中で維持した。本研究で使用される細胞系は、ＩＣＬＡＣおよびＮＣＢＩ Ｂｉｏｓａｍｐｌｅにより維持されている、一般的な誤同定細胞系のデータベース内で見出されなかった。全ての細胞系は、種間決定（アイソザイム解析およびＳＴＲ解析）を介して、提供企業により認証され、規定により、マイコプラズマ検出について調べられた。
ヒトｉＰＳＣの作出
レンチウイルスベースでｈｉＰＳＣを作出するために、一晩にわたり、Ｙ４因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、およびＣ－ＭＹＣ；Ｇｕｓｔａｖｏ Ｍｏｓｔｏｓｌａｖｓｋｙ博士により恵与された）および／またはｍｉＲＮＡを含有する個別のレンチウイルスベクター、またはポリシストロニックのＳＴＥＭＣＣＡベクターに由来するレンチウイルス粒子を、細胞へと形質導入した。翌日、培地を、誘導培地と交換し、細胞を、５日間にわたりインキュベートした。６日目に、細胞に、ｈｉＰＳＣ培地をフィードし、ＥＳ様コロニーの形成まで、この培地中で保持した。観察されるＥＳＣ様コロニーを、手作業で採取し、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティング組織培養プレート上の、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地へと導入して、ｈｉＰＳＣ細胞系を作出した。
エピソームシステムベースでｈｉＰＳＣを作出するために、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステムを使用して、細胞を、再プログラム化因子を発現させるｐＣＸＬＥベクターで電気穿孔し、次いで、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティング６ウェルプレート上の、１０μＭのＹ－２７６３２を補充したｈＤＦ培地へと播種した。翌日、細胞に、さらに５日間にわたる誘導培地をフィードした。
プラスミドの構築およびレンチウイルスの産生
ｍｉＲ－１７／９２、ｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉＲ－１０６ｂ、ｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－３０２ｓ、ｍｉＲ－３６９ｓ、およびｍｉＲ－３７１／３７３について、個々のｍｉＲＮＡのコード配列を、Ｈ９ ｈＥＳＣからＰＣＲ増幅し、ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙベクターへとクローニングし、それらの配列であることは、シーケンシングにより確認した。その後、ｍｉＲＮＡのコード配列を、ＦＵＷ－ｔｅｔＯベクターのＥｃｏＲＩ部位へと導入した。ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、およびＬ－ＭＹＣを発現させる、ポリシストロニックのエピソームベクターのために、口蹄疫ウイルスの２Ａ配列（ＯＣＴ４－Ｆ２Ａ）と連結されたヒトＯｃｔ４、ＫＬＦ４、ブタテッショウウイルスの２Ａ配列（ＳＯＸ２－Ｐ２Ａ）と連結されたＳＯＸ２、およびＬ－ＭＹＣのコード配列を、Ｈ９ ｈＥＳＣからＰＣＲ増幅し、次いで、ＥＧＦＰ配列を含まない改変ｐＣＸＬＥエピソームベクターへと、逐次的に導入した。ｍｉＲ－３０２ｓおよび／またはｍｉＲ－２００ｃを発現させるエピソームベクターのために、ヒトｍｉＲ－３０２ｓまたはヒトｍｉＲ－２００ｃのコード配列を、改変ｐＣＸＬＥベクターへと導入した。
レンチウイルスの産生は、わずかに改変して、既に記載されている（Cha et al., 2017. Nat Cell Biol 19:445-456）通りに実施した。略述すると、製造元の指示書に従い、ＰｏｌｙＪｅｔトランスフェクション試薬を使用して、２９３Ｔ細胞に、レンチウイルスベクターを、ｐＭＤ２．ＧおよびｐｓＰＡＸ２を含むパッケージングプラスミドと共に共トランスフェクトし、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で維持した。レンチウイルスを含有する上清を、トランスフェクションの４８時間後に回収し、０．４５μｍのＭｉｌｌｅｘ－ＨＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターを通して濾過して、細胞破砕物を除去した。
ｈｉＰＳＣ形成アッセイ
ＴＲＡ－１－６０による染色のために、細胞を、４％のホルムアルデヒドで、５分間にわたり固定し、ＰＢＳで洗浄し、次いで、抗ＴＲＡ－１－６０抗体（１：５００）と共に、４℃で、一晩にわたりインキュベートした。ＰＢＳによる、３回にわたる洗浄の後、細胞を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５００）と共に、１時間にわたりインキュベートした。ＰＢＳ中に０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００による、３回にわたる洗浄の後、製造元の指示書に従い、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で、細胞を染色した。ＡＰによる染色のために、固定細胞を、ＰＢＳで洗浄し、次いで、アルカリホスファターゼ基質である、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液で染色するのに続き、ＰＢＳにより、３回にわたり洗浄して、反応を停止させた。
生細胞代謝解析
酸素消費速度（ＯＣＲ）および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）は、製造元の指示書に従い、ＸＦｐ解析器（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して測定した。略述すると、細胞を、ＸＦ ｍｉｎｉ－ｐｌａｔｅのウェルへと播種し、ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、一晩にわたりインキュベートした。アッセイは、細胞を、非ＣＯ２インキュベーター内、１０ｍＭのグルコース、５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および２ｍＭのＬ－グルタミンを補充した、ＸＦアッセイ培地中で、１時間にわたり平衡化させた後で実施した。１μＭのオリゴマイシン（Ｏｌｉｇｏ）、２μＭのＦＣＣＰ、および０．５μＭのアンチマイシンＡ／ロテノン（Ａｎｔｉ／Ｒｏｔ）の逐次的注入を介して、ｈＤＦのミトコンドリア活性をモニタリングして、基礎呼吸（＝ベースラインＯＣＲ－Ａｎｔｉ／Ｒｏｔ ＯＣＲ）、ＡＴＰ代謝回転（＝基礎呼吸－Ｏｌｉｇｏ ＯＣＲ）、最大呼吸（＝ＦＣＣＰ ＯＣＲ－Ａｎｔｉ／Ｒｏｔ ＯＣＲ）、および酸化予備能（＝最大呼吸－基礎呼吸）を計算した。Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用して、各プロット値を、定量された全タンパク質に照らして正規化した。
定量的ＲＴ－ＰＣＲ
全ＲＮＡを抽出するために、Ｔｒｉｚｏｌにより、細胞を溶解させ、製造元の推奨に従い、ＲＮＡを分離した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＲＮＡ濃度を測定した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩを使用して、オリゴｄＴプライマーにより、ＲＮＡを逆転写した。リアルタイム定量的ＲＴ－ＰＣＲのために、本発明者らは、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘを使用し、ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で、反応を実施した。遺伝子特異的プライマー（表Ｄ）を使用して、ＰＣＲ増幅を行った。Ｃｔ比較法を介する、内因性アクチンに照らした正規化により、標的遺伝子の発現を決定した。
核型解析
ヒトｉＰＳ細胞染色体の数および構造について査定するため、ヒトｉＰＳ細胞を、標準的なＧバンド核型解析のための、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）へと送付した。
エピソームプラスミドの検出
Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｇｅｎｅ ＪＥＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットにより、細胞質ゾルプラスミドを分離して、組み込まれなかった、残留ベクターの存在を検出した。２０μｌの抽出物からの２μｌずつを、ＥＢＮＡ－１特異的プライマーを伴う、９５℃で、３０秒間、５５℃で、３０秒間、および７２℃で、３０秒間の３０サイクルによる、常套的ＰＣＲ増幅のために使用した。ゲノムＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ製のＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅキットにより調製した。プラスミド由来の配列を検出するために、本発明者らは、同じＰＣＲ条件およびＥＢＮＡ－１プライマーを使用した。ＧＡＰＤＨプライマーを、インプット対照として使用した。ＥＢＮＡ－１およびＧＡＰＤＨのプライマー配列を、表Ｄに提示する。
ＤＮＡのフィンガープリンティング
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅキットを使用して、ゲノムＤＮＡを、細胞から抽出し、２０μｌの全容量中で、標準的緩衝液条件、０．２μｇのＤＮＡ、およびＧｏＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、９５℃で３０秒間にわたる変性、５５℃で３０秒間にわたるアニーリング、および７２℃で１分間にわたる伸長を伴う、３５サイクルを用いて、ＰＣＲを実施した。本研究で使用されるプライマーを、表Ｄで一覧する。
全エクソームシーケンシング
線維芽細胞の再プログラム化、および再プログラム化されたｉＰＳＣの継代の結果として得られる体細胞突然変異を同定するために、本発明者らは、＞１，４００のがん関連遺伝子を含む、＞８，０００の医学的に関連する遺伝子についての拡張カバレッジを提供する、Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｓ ＡＣＥ ＷＥＳサービスを使用して、線維芽細胞、および４つのｉＰＳＣ細胞系についてのＷＥＳを実施した（Patwardhan et al. 2015. Genome Med 7:71）。標的領域についてのカバレッジの平均値深度は、全ての試料にわたり、７５倍であった。４つのｉＰＳＣ細胞系について、本発明者らは、ＭｕＴｅｃｔ２を使用して、線維芽細胞、および各ｉＰＳＣ細胞系について、対応のある解析を実施して、体細胞突然変異を検出した（Cibulskis et al., 2013. Nat Biotechnol 31:213-219）。
シーケンシングリードは、ＢＷＡ－ＭＥＭプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ０．７．１５）を使用して、代替的なコンティグおよびデコイを含む、ＧＲＣｈ３８参照ゲノムに照らしてアライメントした（Li and Durbin, 2010. Bioinformatics 26:589-595）。マッピングされたリードは、ＳＡＭツール（ｖｅｒｓｉｏｎ １．３．１）（Li et al., 2009. Bioinformatics 25:2078-2079）、Ｐｉｃａｒｄツール（broadinstitute.github.io/picard、ｖｅｒｓｉｏｎ ２．５．０）、およびＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌキット（ＧＡＴＫ）ソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ ３．６）（DePristo et al. 2011. Nat Genet 43:491-498）により、さらに加工して、解析の準備ができたＢＡＭファイルを作成した。ＧＡＴＫにおいて、ＭｕＴｅｃｔ２モジュールを使用して、各ｉＰＳＣ細胞系を、体細胞突然変異について、線維芽細胞と比較して解析した（Cibulskis et al., supra）。Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｖａｒｉａｎｔ Ｅｆｆｅｃｔ Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ（ｖｅｒｓｉｏｎ ＧＲＣｈ３８．８９）（McLaren et al., 2016. Genome Biol 17:122）を使用して、同定された体細胞突然変異にアノテーションを施して、それらの遺伝子転写およびタンパク質産物における帰結について調べた。偽陽性の体細胞突然変異判定を低減するために、本発明者らは、全ての試料にわたり、２０またはこれを超える高品質の実効アライメントリードにより十分にカバレッジされた領域内で発見された突然変異だけを、体細胞突然変異であると考えた。候補体細胞突然変異の中で、本発明者らは、Ｅｘｏｍｅ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＥｘＡＣ）データベース（Lek et al. 2016. Nature 536:285-291）において、最大マイナー対立遺伝子頻度＞０．０１％の突然変異を除外して、潜在的な生殖細胞系列変異体にフィルターをかけた。残りの体細胞突然変異候補について、本発明者らは、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ）（cancer.sanger.ac.uk、ｖｅｒｓｉｏｎ ８０）（Forbes et al. 2017. Nucleic Acids Res 45:D777-D783）、およびＣａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｃｅｎｓｕｓ（ＣＧＣ）データベース（Futreal et al. 2004. Nat Rev Cancer 4:177-183）に検索をかけ、がんにおいて、高頻度で報告される突然変異および遺伝子を同定した。ｎｇＣＧＨ（github.com/seandavi/ngCGH、ｖｅｒｓｉｏｎ ０．４．４）、およびＰｅｒｓｏｎａｌｉｓ ＡＣＥ Ｃａｎｃｅｒ Ｅｘｏｍｅパイプライン（Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｓ，Ｉｎｃ．、ＣＡ）による、コピー数変動（ＣＮＶ）についての解析結果を使用して、本発明者らは、染色体異常、および他のコピー数の領域間変化について調べた。本発明者らは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｖｉｅｗｅｒ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．３．７９）により、リードアライメントについて、全てのＣＮＶ候補を、目視により検討した。
ケルセチン処理
ケルセチンの、ヒトｉＰＳＣの採取に対する効果について調べるために、ヒトｉＰＳＣを、６ウェルプレートに播種した。細胞を、各濃度のケルセチン（５、１０、２０、４０、および１００μＭ）により、２、６、１６、および２４時間にわたり処理した。各時点の後、ケルセチン含有培地を、新鮮培地で置きかえ、細胞を、初期ケルセチン処理時間から４８時間にわたり培養した。ＴｒｙｐＬＥを使用して、細胞を解離させ、トリパンブルー除外法および血球計を使用して、細胞生存率を測定した。
フローサイトメトリー
ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６システム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、全てのＦＡＣＳ解析を実施し、製造元の指示書に従い、データ解析を実行した。ＴｒｙｐＬＥまたはＡｃｃｕｔａｓｅのそれぞれを使用して、ヒトｉＰＳ細胞を解離させ、７０μｍの細胞ストレーナーを通して濾過した。まず、単一細胞懸濁液を、４％のホルムアルデヒドで、１０分間にわたり固定し、氷上の透過化緩衝液中で、１５分間にわたり懸濁させた。３０分間にわたりブロッキングした後、細胞を、標識化一次抗体（ＰＥコンジュゲート抗ＳＳＥＡ－４、ＰＥコンジュゲート抗ＴＲＡ－１－６０）と共に、暗所内、氷上で、１時間にわたりインキュベートした。１％のＦＢＳを伴うＰＢＳによる洗浄の後、ＦＡＣＳ解析を実施した。蛍光色素マッチアイソタイプ対照を使用し、解析時に差し引いた。
細胞喪失量／細胞収量解析のために、単層ベースの培養ディッシュまたはスポッティングベースの培養ディッシュから、上清を採取し、ＦＡＣＳにかけた。上清１００μｌ中の粒子数を計算し、１００μｌの、全上清容量に対する比に基づき、全細胞数を得た。
未分化細胞の存在の検出
３つの異なる方法を使用して、未分化Ｃ４細胞の混合物を、全細胞１００，０００個中に、１０倍ずつ（１０５、１０４、１０３、１０２、１０１、および１００倍）のｈＤＦの中で系列希釈して、残留Ｃ４細胞を検出する。コロニー形成アッセイのために、各細胞希釈液を、Ｅ８培地中で、６日間にわたり培養し、ＡＰ染色により、多能性コロニーを同定した。ケルセチンによる未分化細胞の採取のために、細胞を、４０μＭのケルセチンで、１６時間にわたり処理し、新鮮Ｅ８培地中で培養した。蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）のために、ＴｒｙｐＬＥを使用して、Ｃ４細胞を解離させ、７０μｍの細胞ストレーナーを通して濾過した。まず、単一細胞懸濁液を、４％のホルムアルデヒドで、１０分間にわたり固定し、氷上の透過化緩衝液中で、１５分間にわたり懸濁させた。３０分間にわたりブロッキングした後、細胞を、標識化一次抗体（ＰＥコンジュゲート抗ＳＳＥＡ－４、ＰＥコンジュゲート抗ＴＲＡ－１－６０）と共に、暗所内、氷上で、１時間にわたりインキュベートした。１％のＦＢＳを伴うＰＢＳによる洗浄の後、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６システム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、ＦＡＣＳ解析を実施し、製造元の指示書に従い、データ解析を実行した。蛍光色素マッチアイソタイプ対照を使用し、解析時に差し引いた。ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイのために、全ＲＮＡを、全ての希釈液から抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲにかけて、ＯＣＴ４のサイクル時間（Ｃｔ）値を決定した。ＯＣＴ４コピー数は、精製ＯＣＴ４の部分配列に対するｑＲＴ－ＰＣＲから作成された、曲線方程式から計算した。次いで、ＯＣＴ４コピー数を、ＰＳＣ数に対してプロットした。
スポット型ディッシュの調製
図１３Ｂに示される通り、２つの水平方向の直線、および３つの垂直方向の直線からなるグリッドを、６ｃｍディッシュの底部に描出することから、６つの交点を得る。１０μｌの非加熱Ｍａｔｒｉｇｅｌを、各交点にロードして、限界づけられたスポットコーティング領域をもたらした。スポット型ディッシュを、３７℃で、少なくとも３０分間にわたりインキュベートし、細胞を播種する直前に、Ｍａｔｒｉｇｅｌを吸引した。６０ｍｍの細胞培養ディッシュ内に、均一に懸濁させた細胞を、ディッシュ１枚当たり７３０×１０３個の密度で播種するの（通常の播種条件）に対し、スポット型ディッシュには、スポット１０μｌ当たり４０×１０３個、スポット１０μｌ当たり１０×１０３個、スポット１０μｌ当たり２．５×１０３個を施した（スポッティング条件）。
ｍＤＡ前駆細胞の分化
分化培地状条件、および全てのモルフォゲン因子を、図５Ａに示す。分化手順の全体を通して、抗生剤を使用しなかった。底板誘導段階（１～６日目）のために、本発明者らは、１５％のＫＳＲ、グルタミン、β－メルカプトエタノールを伴うＤＭＥＭ培地を使用した。神経前駆細胞誘導段階（６～１２日目）のために、本発明者らは、１１．５％のＫＳＲ、０．２５％のＮ２（６～８日目）、７．５％のＫＳＲ、０．５％のＮ２（８～１０日目）、３．７５％のＫＳＲ、Ｌ－グルタミン、β－メルカプトエタノール、および非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を含む、０．７５％のＮ２（１０～１２日目）を伴うＤＭＥＭ培地を使用した。それぞれ、１日目～１２日目、および１日目～８日目に、二重Ｓｍａｄ阻害剤である、０．２μＭのＬＤＮ１９３１８９、および１０μＭのＳＢ４３１５４２を添加した。２日目～１０日目に、細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ８を伴う、ＳＨＨアゴニスト（２μＭのプルモルファミン、および１００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ）で処理した。Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子である、ＣＨＩＲ９９０２１（１μＭ）を、４日目～１２日目に組み入れた。９日目に、細胞を、４０μＭのケルセチンで、１６時間にわたり処理した。ＤＡ前駆細胞の誘導／成熟段階（１２＋日目）のために、ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地に、Ｎ２サプリメントである、２０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ、５００μＭのｄｂｃＡＭＰ、２００μＭのアスコルビン酸、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－β３を、１０μＭのＤＡＰＴ、および１μＭのＣＨＩＲと共に補充した（１２～１５日目）。１５日目に、細胞を、０．５ｍＭのＥＤＴＡにより解離させ、単一細胞懸濁液を、ポリＬ－オルニチン／フィブロネクチン／ラミニンコーティングディッシュ内に、ディッシュ１枚当たり約２５０万個で再播種した。１５日目以降、ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地に、Ｎ２サプリメントである、２０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ、５００μＭのｄｂｃＡＭＰ、２００μＭのアスコルビン酸、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－β３を適用した。採取時に、１０μＭのＹ－２７６３２を、培地へと添加した。
免疫細胞化学
ｈｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンを、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋）で洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に４％のホルムアルデヒドで、１０分間にわたり固定した。細胞を、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中に０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、および１％のウマ血清）中、室温で、１時間にわたりインキュベートした。細胞を、０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、および１％のウマ血清を含有するＰＢＳ中の初代抗体と共に、一晩にわたりインキュベートした。次いで、細胞を、核染色のためのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を伴う、適正な蛍光コンジュゲート二次抗体と共に、室温で、１時間にわたりインキュベートした。細胞画像は、共焦点顕微鏡法（日本、大阪、株式会社キーエンス）により得た。特異的細胞集団に関するデータは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、顕微鏡画像から決定した（１１）。アポトーシス性細胞を測定するために、細胞を、アポトーシスマーカーである、切断型カスパーゼ３、およびＤＮＡ結合性核色素である、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２について染色した。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２による染色の後、凝縮（ｃｏｍｐａｃｔｅｄ）クロマチンは、正常細胞より明るく、蛍光顕微鏡法により、凝縮（ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ）核をカウントした。特異的細胞集団に関するデータは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアにより、顕微鏡画像から決定した。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）解析
分化の４７日目に、上清を回収し、３００×ｇで、５分間にわたり遠心分離して、細胞破砕物を除去した。試料を、－８０℃で、速やかに保存し、ＤＡおよびＤＯＰＡＣのレベルを決定する、電気化学的検出を伴う逆相ＨＰＬＣのために、Ｅｍｏｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ’ｓ ＨＰＬＣ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｏｒｅへと送付した。略述すると、上清を、未使用の０．２２μＭ ＰＶＤＦ製フィルター付きマイクロ遠心管へと移した。任意の残存粒子状物質を、５０００ｒｐｍ、４℃で、５分間にわたる、スピンフィルターを介する濾過により消失させた。電気化学的検出を伴う逆相ＨＰＬＣにより、モノアミン濃度を決定した。ＨＰＬＣのために、ＥＳＡ ５８４型のポンプ、およびＥＳＡ ５４２型の冷蔵型自動式サンプラーを装備した、ＥＳＡ ５６００Ａ ＣｏｕｌＡｒｒａｙ検出システムを使用した。Ｃ１８カラムガードカートリッジを装備した、ＭＤ－１５０×３．２ｍｍ Ｃ１８カラムを使用して、２５℃で、分離を実施した。移動相は、ｐＨ２．９５で、１．５ｍＭの１－オクタンスルホン酸ナトリウム、７５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．０２５％のトリエチルアミン、および８％のアセトニトリルからなった。試料容量２５μｌを注入した。試料を、０．４ｍＬ／分で定組成溶離し、５０２０型ガードセルを装備した、６２１０型電気化学セル（ＥＳＡ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して検出した。ガードセル電位を、５００ｍＶに設定する一方、解析セル電位は、－１７５、２００、３５０、および４２５ｍＶに設定した。保持時間の基準を、公知の標準物質（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）とマッチさせることにより、解析物を同定した。ピーク面積を、ドミナントセンサー上の標準物質のピーク面積と比較することにより、化合物を定量した。
電気生理学
電気生理学記録のために、７０日目のドーパミン作動性細胞を、記録チャンバーに入れ、９５％のＯ２および５％のＣＯ２で、連続的に気泡攪拌処理された、１３０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＳＯ４、１．２５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２６ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのグルコースからなる人工脳脊髄液により、１．２ｍｌ／分の速度で、連続的に灌流した。ＥＰＣ９増幅器、およびＰｕｌｓｅ ｖ８．８０ソフトウェア（ＨＥＫＡ Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ）を使用して、室温（２２±１．０℃）で、全細胞パッチクランプ記録を実施した。記録電極（５～６ＭΩの抵抗）を、１５０ｍＭのグルコン酸Ｋ、５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＭｇ－ＡＴＰ、０．５ｍＭのＮａ－ＧＴＰ（２９２ｍＯｓｍ、ＫＯＨで、ｐＨ７．３へと補正された）を含有するピペット溶液で満たした。グルコン酸Ｋベースのピペット溶液を使用して、１５．１ｍＶの液界電位を補正した。電流固定モードの静止膜電位で、活動電位発火を記録した。直列（アクセス）抵抗は補償せず、持続的にモニタリングした。Ｍｉｎｉ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｖ６．０．７（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ）、およびＣｌａｍｐｆｉｔ ８．２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）プログラムを使用して、自発的シナプス事象を、オフラインで解析した。１μＭのテトロドトキシン（ＴＴＸ）により、電位依存性ナトリウムチャネルを遮断した。ニューロビオチン（０．２％）を、ピペット内溶液中に組み入れ、記録される細胞を、４％のホルムアルデヒド中、４℃で固定し、ＴＨ抗体で共染色した。
マルチ電極アレイ（ＭＥＡ）による記録
Ａｘｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製の２４ウェルマイクロ電極アレイ（ＭＥＡ）プレートを、ＣＯ２インキュベーター内、各々３７℃で、一晩にわたり、ポリＬ－オルニチン（０．００１５％）、フィブロネクチン（１μｇ／ｍｌ）、およびラミニン（１μｇ／ｍｌ）によりプレコーティングした。翌日、Ｃ４由来のＤ２８細胞を、プレコーティングされたＭＥＡプレート上に、ウェル１枚当たり２０，０００個で播種し、上記で記載したスケジュールと同じスケジュールに従い作出した。Ｄ２８細胞を、３７℃で、５％のＣＯ２を伴う、加湿型インキュベーター内で、２日間にわたり維持して、適正な付着を可能としてから、電気生理学的記録を開始した。６０％の培地交換を、隔日で実施した。化合物による処置の前後に、Ｍａｅｓｔｒｏ ＭＥＡシステム、およびＡｘＩＳ ソフトウェア（Ａｘｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、培養培地中、３７℃で、自発的活動電位の細胞外記録を実施した。このＭＥＡプラットフォームは、３２４チャネルで構成し、２４ウェルプレートを使用する場合、４×４グリッド内のウェル１つ当たり１６の電極を有するようにフォーマットする。細胞約２０，０００個を、各ウェル内の電極グリッド上に点在させて播種した。ＡｘＩＳ Ｎａｖｉｇａｔｏｒ １．５．１ソフトウェアを使用して、ベースラインおよび処置後における生データファイル（*.raw）を、スパイクファイル（*.spk）、およびエクセルファイル（*.csv）へと転換した。これらのファイルフォーマットへの転換は、データのさらなる加工および解析を可能とする。ｍＤＡニューロンのために、ＡｘＩＳソフトウェア内の神経スパイクについての測定を、ハイパス＝２００Ｈｚ～ローパス＝３，０００Ｈｚの範囲内に設定した。スパイク検出のための閾値を、各電極上の、フィルター処理された電界電位のローリング標準偏差の６倍に設定した。５分間にわたる記録を使用して、各ウェル内の平均スパイク数、および活動電極数（「活動電極」）を計算した。活動電極は、１分間当たりのスパイク数が、≧５スパイクである電極として規定した。
活動のロバスト性、ならびにウェル活動の品質および一貫性の両方を検証するために、スパイク列のラスタープロットを検討するのに、Ａｘｉｏｎ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ製のＮｅｕｒａｌ Ｍｅｔｒｉｃ Ｔｏｏｌを使用した。これらのラスタープロットによる視覚化はまた、処理後データの解釈の一助とするようにも使用した。スパイク活動を伴わないか、スパイク活動が希薄であるか、またはバースティングもしくはネットワーク同期が、ほとんどもしくは全く見られないウェルは、実験から除外した。記録が始まる前に、プレートを、システム上で、少なくとも２分間にわたり平衡化させた。ドーパミン作動性ニューロンの自発活動を分離するために、細胞を、全て、ウェル１つ当たり５００μｌの培地中に１０μＭの濃度とする、ＧＡＢＡ作動性アンタゴニストである、ピクロトキシン；ＡＭＰＡ受容体アンタゴニストである、ＮＢＱＸ；およびＮＭＤＡＲアンタゴニストであるＡＰ５の組合せで処理した。遮断剤を添加した後で、平均スパイク数、および平均電極数の両方を計算した。記録および解析は、上述の通りに行った。ｔ検定を使用して、平均スパイク数および平均活動電極数を、対照群と、処置群との間で比較した。
移植のための細胞調製物および凍結保存
Ｃ４由来Ｄ２８細胞を、ＤＰＢＳで、２回にわたりすすぎ、次いで、３７℃で、Ａｃｃｕｔａｓｅにより、５分間にわたり処理した。Ｎ２サプリメントである、２０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ、５００μＭのｄｂｃＡＭＰ、２００μＭのアスコルビン酸、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－β３、および１０μＭのＹ－２７６３２を伴う、ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地を使用して、細胞を採取した。３００×ｇで、３分間にわたる遠心分離の後、細胞ペレットを、移植培地（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（フェノールレッドを伴わない）、２０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ、１０μＭのＹ－２７６３２、２０ｍＭのＢｏｃ－Ｄ－ＦＭＫ）と共に懸濁させた。細胞懸濁液を、７０μｍのストレーナーに通して、大型の細胞塊を除去した。血球計を使用する、トリパンブルー除外法により、細胞濃度を計算した。最終的な細胞生成物は、移植培地中に、１μｌ当たりの細胞５０，０００または１００，０００個からなった。凍結保存のために、細胞ペレットを、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０凍結保存培地中に懸濁させた。クライオバイアル内の細胞を、－８０℃における制御凍結のために、Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（商標）Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ（Ｎａｌｇｅｎｅ）に入れた。次いで、凍結細胞を、液体窒素へと導入した。１週間後で、凍結細胞を、移植のために解凍した。
手術手順
ＳｏｍｎｏＳｕｉｔｅ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｋｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＣＴ）を使用して、イソフルランにより、動物に麻酔をかけた。Ｍｉｃｒｏ４ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ）を装備した、定位固定装置（Ｄａｖｉｄ ＫＯＰＦ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｔｕｊｕｎｇａ、ＣＡ）上で、定位固定手術を実施した。
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ無胸腺ラットに対して、６－ヒドロキシドーパミンの、内側前脳束への定位固定注射により、黒質線条体経路の片側病変を確立した。麻酔の１５分前に、デシプラミン（１０ｍｇ／ｋｇ）を、ラットへと注射して、ノルアドレナリン作動性投射を保護した。２．５μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ）を使用して、２マイクロリットルの６－ヒドロキシドーパミン（０．２％のアスコルビン酸／０．９％の生理食塩液中に７．５ｍｇ／ｍｌ）を注射した。座標は、前頂：前後軸（ＡＰ）、－４．０；正中側面軸（ＭＬ）、－１．３；および背腹軸（ＤＶ）、－７．０を基準として計算した（Torres et al., 2011. J Neurosci Methods 200:29-35）。Ｈ９由来Ｄ２８細胞またはＣ４由来Ｄ２８細胞の線条体内移植のために、２μｌのデポジット１つ（１μｌ当たりの細胞５０，０００個）を、以下の座標：ＡＰ、＋０．８；ＭＬ、－３．０；およびＤＶ、－５．５に配置した。２６Ｇ、０．７５インチのブラントニードルを取り付けた、１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジにより、０．４μｌ／分の速度で、細胞を注入した。Ｔａｃｏｎｉｃ無胸腺ラットのために、Ｃ４ Ｄ２８細胞を、１μｌ当たりの細胞１００，０００個の濃度で懸濁させた。細胞１００，０００個の群については、１マイクロリットルの細胞を、ＡＰ、＋０．８；ＭＬ、－３．０；およびＤＶ、－５．５へと注入した。細胞３００，０００個の群については、１．５μｌのデポジット２つを、以下の座標：ＡＰ、＋０．８；ＭＬ、－３．０；ならびにＤＶ、－５．０およびＤＶ、－６．０に配置した。対照ラットは、移植培地注入だけを受けた。ＮＯＤ ＳＣＩＤマウスへの線条体内注入のために、両側において、前頂に照らした、以下の座標（ｍｍ単位）：ＡＰ：＋０．５；ＭＬ：±１．８；ＤＶ：－３．２に従い、Ｃ４ Ｄ０細胞、Ｃ４ Ｄ１４細胞、またはＣ４ Ｄ２８細胞の、２μｌのデポジット（１μｌ当たりの細胞５０，０００個）１つを、線条体内に注入した。
注射の後、注射針を、脳内に、５分間にわたり保持し、次いで、注射針を、５分間にわたり、ゆっくりと引き抜いた。手術の後、切開された皮膚を、Ａｕｔｏｃｌｉｐ（登録商標）Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｓｕｔｕｒｅ（Ｆｉｎｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｏｏｌ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で縫合し、回復まで、動物を、温熱パッド上でモニタリングした。全ての動物に、ケトプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ；Ｋｅｔｏｆｅｎ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＳＣ－３６３１１５Ｒｘ）を皮下注射して、疼痛を軽減し、０．９％の塩化ナトリウム１ｍｌを腹腔内注射して、脱水を防止した。
ＮＯＤ ＳＣＩＤマウスへの精巣内注入のために、長手方向に、皮膚および腹膜を通る、１ｃｍの切開を施し、精巣を、滅菌ガーゼ上に置いた。１０μｌ（１μｌ当たり５，０００個）のＣ４ ｉＰＳＣを、任意の大血管から、精嚢の中心へと、ゆっくりと注入した。細胞の逆流を回避するために、注射針を、ゆっくりと除去した。精巣および脂肪組織を、腹部における、それらの元の位置へと戻した。
Ｄ－アンフェタミン誘導回旋行動試験
シナプス前（間接的）ＤＡアゴニストである、Ｄ－アンフェタミンを、腹腔内投与（４ｍｇ／ｋｇ）して、６－ヒドロキシドーパミンにより病変を施すことに成功したラットにおける回旋行動を誘導した。自動式システム（ＳＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、回旋行動の偏りを記録した。９０分間（９区間；区間１つ当たり１０分間ずつ）にわたり、ラットを記録した。完全な体幹回旋だけをカウントし、次いで、病変側への回旋行動に正の値を与えて、１分間当たりの正味の回旋数として表した。１分間当たり６回を超える同側回旋を示す動物だけを、病変を施すことに成功したと考えた（Kirkeby et al. 2012.. Cell Rep 1:703-714）。
コリドー試験
非薬理学的な行動の改善を測定するために、本発明者らは、コリドー試験（Dowd et al. 2005. Brain Res Bull 68:24-30）を使用した。まず、試験時における探索行動を低減するために、１０分間ずつ、２日間にわたり、ラットを、砂糖ペレットを散在させたコリドーに慣らせた。翌日、砂糖ペレット５～１０個で満たした、１０対のカップを、床面に沿って、一定の距離を置いて並べたコリドーの末端に、ラットを置いた。動物には、コリドーを、自由に探索させた。どの群であるかについて盲検処理された実験責任者が、取得行動を直接カウントした。「取得行動」は、各回に、ラットが、固有のカップにその鼻を差し入れることとして規定した。２０回の取得行動がなされるか、または試験の持続時間が、５分間に到達するまで、全てのラットについて調べた。試験の前に、全てのラットを、空のコリドーに、５分間にわたり置いて、不慣れな環境になじませた。ラットは、試験の前日、および４日間にわたる試験中において、飼料を制限された。結果は、平均反対側（右側）取得行動回数として計算し、全取得行動回数に対する取得行動回数として提示した。試験は、移植の２４週間後まで、４週間ごとに実施した。
シリンダー試験
探索行動における前肢の非対称性を測定するために、ラットを、ガラス製のシリンダー（直径を２０ｃｍとする）内に置き、壁面への前足の接触を、最大３０回にわたり記録するシリンダータスク（Bjorklund et al. 2010. Brain 133:496-511）を使用して、ラットを評価した。どの群であるかについて盲検処理された実験責任者が、査定を行った。結果は、右側（反対側）前足を使用する接触の平均回数として計算し、全接触回数の平均に対する百分率として提示した。試験は、移植の２４週間後に実施した。
ステッピング試験
前肢無動症を測定するために、前肢調整ステップを、９０ｃｍの全長にわたり定量するサイドステッピング試験（Olsson et al. 1995. J Neurosci 15:3863-3875）を使用して、ラットを評価した。どの群であるかについて盲検処理された実験責任者が、ステップをカウントした。結果は、右側（反対側）前肢ステップの平均回数として計算し、左前肢ステップの平均回数に対する百分率として提示した。試験は、移植の２４週間後に実施した。
生体内分布解析
移植されたヒト細胞の存在を検証するために、本発明者らは、ヒト特異的遺伝子の増幅に特異的なＲＴ－ＰＣＲ法を使用した。まず、製造元の指示書に従い、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅキットにより、１５ｍｇずつのマウス組織（嗅球と小脳との混合物、脊髄、肺、心臓、肝臓、腎臓、および脾臓）から、ＤＮＡを抽出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－１０００分光光度計上で、抽出されたＤＮＡの濃度を測定し、１００ｎｇのＤＮＡを、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応に使用した。ヒト特異的プライマー配列は、以下：フォワード５’－ＡＴＴＧＣＣＣＣＡＡＡＡＣＴＴＴＴＴＴＧ－３’（配列番号１０６）、およびリバース５’－ＴＴＧＡＡＧＡＣＣＡＧＴＣＴＧＧＧＡＡＧ－３’の通りである。内因性マウス遺伝子は、以下のプライマー：フォワード：５’－ＣＣＡＣＡＴＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡ－３’（配列番号１０７）、およびリバース５’－ＡＧＧＧＴＣＴＧＧＧＣＣＡＴＡＧＡＡＣＴ－３’（配列番号１０８）を使用して検出した。
脳の切片化および免疫組織化学
ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（７．５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により、深麻酔を誘導するのに続き、氷冷リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ；０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）による、８分間にわたる心内灌流に続き、流量を１０ｍｌ／分とする、４％のホルムアルデヒドによる、２０分間にわたる灌流を行った。次いで、脳を摘出し、４％のホルムアルデヒド中、４℃で、一晩にわたる固定後、２０％および３０％のスクロース中における連続インキュベーションにより凍結保存した。脳を、ＯＣＴ（ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）化合物中に包埋し、線条体の全体を覆う、冠状面切片（３０μｍ）を、順次回収した（Ｌｅｉｃａ ＣＭ１９５０、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）。脳スライスを、３０％のＨ２Ｏ２を含有するＰＢＳと共に、３０分間にわたりインキュベートし、次いで、ウサギ抗ＴＨ抗体（１：５０００）、マウス抗ｈＮＣＡＭ抗体（１：１０００）、およびマウス抗ｈＮｕｃ（１：１０００）と共に、一晩にわたりインキュベートした。すすいだ後で、試料を、ビオチニル化二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）により、１時間にわたり染色した。最後に、製造元のプロトコールに従い、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット、およびＤＡＢペルオキシダーゼ基質キットにより、切片を視覚化した。移植片内のＴＨ＋ニューロンをカウントするために、５０×５０μｍのカウンティングフレームを伴い、グリッドサイズを２００×２００μｍとする、６３倍の油浸レンズ下で、Ｓｔｅｒｅｏ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒのｏｐｔｉｃａｌ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒプローブ（ＭＢＦ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｌｉｓｔｏｎ、ＶＴ）を使用した。最終カウントを、級数（１：６）について補正して、動物の脳１つ当たりのＴＨ陽性ニューロンの総数の推定値を得た。
ビメンチン免疫組織化学は、Ｒｏｄｅｎｔ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ ａｔ Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡにより実施された。
脳切片についての免疫蛍光
中脳全体の遊離浮遊冠状面切片を、ＰＢＳ中に５％の正常ロバ血清、３％のＢＳＡ、および０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するブロッキング溶液中、室温で、１時間にわたりプレインキュベートした。一次抗体を、ＰＢＳ中に３％のＢＳＡ、および０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中で希釈し、４℃で、一晩にわたり適用した。０．３％のＴｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳによる、３回にわたる洗浄の後、切片を、一次抗体と同じ緩衝液中で希釈された、Ａｌｅｘａ ４８８コンジュゲート二次抗体、Ａｌｅｘａ ５６８コンジュゲート二次抗体、またはＡｌｅｘａ ６４７コンジュゲート二次抗体と共に、室温で、１時間にわたりインキュベートした。全ての切片を、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で対比染色した。３回にわたる、さらなる洗浄の後、カバースリップを、封入剤と共に、切片に適用し、蛍光顕微鏡（日本、大阪、株式会社キーエンス）で視覚化した。二次抗体単独で染色された切片を、同じ条件下で加工および撮影し、陰性対照として使用した。
ヘマトキシリン／エオシン染色
ＮＯＤ ＳＣＩＤマウス精巣の病理学的解析のために、ケタミン／キシラジンにより、各マウスに麻酔をかけ、精巣を摘出し、一時的に、４％のホルムアルデヒド中で保存した。ＮＯＤ ＳＣＩＤマウス脳組織の病理学的解析のために、線条体の全体を覆う、６枚目ごとの冠状面切片を、スライドガラス上に封入した。ヘマトキシリン／エオシン染色のために、精巣および脳組織についてのスライドガラスを、Ｒｏｄｅｎｔ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ ａｔ Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡへと送付した。
定量および統計学的解析
そうでないことが指し示されない限りにおいて、全ての実験は、生物学的三連で実施した。各実験についての「ｎ」は、図のキャプションにおいて見出され、全ての実験について、独立に作成された試料を表す。統計学的解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７ソフトウェアを使用して実施した。＜０．０５のｐ値を、統計学的に有意であると考えた。図を通して、アステリスクは、ｐ値の有意性：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１を指し示す。各ｉＰＳＣ細胞系内の、細胞画分中に存在する突然変異についての検定のために、両側二項検定により、ｐ値を生成し、ボンフェローニ補正により補正した。突然変異データは、Ｒを使用して解析および視覚化した。
[実施例１]
代謝の再プログラム化を調節するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の同定
本発明者らは、近年、ｍｉＲ－２００ｃにより直接ターゲティングされるＳＩＲＴ２が、代謝的再プログラム化およびｈｉＰＳＣの作出に極めて重要であることを示した（１９）。ｍｉＲ－２００ｃと、再プログラム化との機能的連関を検証するために、本発明者らは、ｍｉＲ－２００ｃの強制発現が、代謝変化を誘導するのかどうかについて調べた。実際、ヒト皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ）内のｍｉＲ－２００ｃ過剰発現（ＯＥ）は、酸素消費速度（ＯＣＲ）の減少、および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）の増大を含む、有意な代謝変化を結果としてもたらした（図９Ａおよび９Ｂ）。空ベクターの対照細胞系と比較して、ｍｉＲ－２００ｃ ＯＥ細胞は、カルボニルシアニド－ｐ－トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）注射の後における、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）能の著明な低下、基礎呼吸、ＡＴＰ代謝回転、最大呼吸、および酸化予備能の低下のほか、ＯＣＲ変化を示した（図９Ｃ～９Ｅ）。本発明者らは、次に、ｈＤＦを、ｍｉＲ－２００ｃと併せた、再プログラム化因子（すなわち、Ｙ４Ｆ）で処理した。ｍｉＲ－２００ｃ ＯＥの添加が、ＯＸＰＨＯＳを、Ｙ４Ｆだけと比較して、有意に低減した（図９Ｆ～９Ｋ）ことから、多能性関連ｍｉＲＮＡが、代謝の再プログラム化を容易とすることにより、再プログラム化過程に影響を及ぼすことを示唆する。これについて調べるため、本発明者らは、他のｍｉＲＮＡ（複数可）も、ｍｉＲ－２００ｃと同様に、代謝変化を誘導するのかどうかについて調べた。かつてのｍｉＲＮＡ発現研究（２０～２３）に基づき、本発明者らは、ｈＰＳＣ内で、一貫してエンリッチされる、８つの候補ｍｉＲＮＡクラスター（ｍｉＲ－１７／９２、ｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉＲ－１０６ｂ、ｍｉＲ－１３６ｓ、ｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－３０２ｓ、ｍｉＲ－３６９ｓ、およびｍｉＲ－３７１／３７３）を同定した。本発明者らは、これらのｍｉＲＮＡの、ｈＤＦ内のＯＥが、代謝変化をもたらすのかどうかについて調べた。興味深いことに、本発明者らは、これらの８つのｍｉＲＮＡクラスター（ｍｉＲ－１７／９２を除く）のうちの７つが、ＯＣＲの減少およびＥＣＡＲの増大を含む、有意な代謝の再プログラム化を結果としてもたらし、ＯＣＲ／ＥＣＡＲ比の、空ベクターを形質導入された対照細胞と比較して、１／３～１／２０の範囲のロバストな低減をもたらすことを見出した（図９Ｌ～９Ｎ）。
[実施例２]
代謝調節性ｍｉＲＮＡの、再プログラム化因子との組合せは、高品質のｈｉＰＳＣを、効率的に作出する
本発明者らは、レンチウイルスベクター上の、通例の再プログラム化因子（Ｙ４ＦまたはＹ３Ｆ（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＫＬＦ４））への、これらの代謝調節性ｍｉＲＮＡの付加が、ｈｉＰＳＣの作出を容易とするのかどうかについて調べた。上記で同定された、７つのｍｉＲＮＡクラスターの中で、ｍｉＲ－３０２ｓは、Ｙ３ＦまたはＹ４Ｆと組み合わせた場合に、ｈｉＰＳＣの作出の増強において、最高の効力を呈した（図１Ａおよび１Ｂ）。加えて、ｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉＲ－１０６ｂ、ｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－３６９ｓ、またはｍｉＲ－３７１／３７３クラスターもまた、これには劣るが、ｈｉＰＳＣの作出を、著明に増大させた。次に、本発明者らは、任意のさらなるｍｉＲＮＡが、Ｙ３ＦとｍｉＲ－３０２ｓとの組合せ（Ｙ３Ｆ＋３）、またはＹ４ＦとｍｉＲ－３０２ｓとの組合せ（Ｙ４Ｆ＋３）において、ｈｉＰＳＣの作出を、さらに増強するのかどうかについて調べた。Ｙ３Ｆ＋３の存在下で、他のｍｉＲＮＡクラスターのうちのいずれかの付加は、ｈｉＰＳＣの作出を、有意に増強した（図１Ｃ）。Ｙ４Ｆ＋３を使用する場合、ｍｉＲ－２００ｃだけが、ｈｉＰＳＣの作出を、著明に増強した（図１Ｄ）ので、Ｙ４Ｆ、ｍｉＲ－３０２ｓ、およびｍｉＲ－２００ｃ（Ｙ４Ｆ＋３＋２）の組合せを、最適の組合せとして同定した。本発明者らは、Ｙ４Ｆ、Ｙ４Ｆ＋３、およびＹ４Ｆ＋３＋２により誘導される再プログラム化時における、代謝変化の動態を比較した。とりわけ、Ｙ４Ｆ＋３＋２は、最も顕著な代謝変化（図１Ｅおよび１Ｆ）を誘導したことから、代謝変化と、効率的のｈｉＰＳＣの作出の間の連関を裏書きする。次に、本発明者らは、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、および、より厳密な多能性マーカーである、ＴＲＡ－１－６０（２４、２５）についての染色により、この組合せがまた、ｈｉＰＳＣの全体的な品質にも影響を及ぼしうるのかどうかについて調べた。Ｙ４ＦまたはＹ４Ｆ＋３により作出されるＡＰ＋コロニーのうちの約４０％は、ＴＲＡ－１－６０＋であった。これに対し、Ｙ４Ｆ＋３＋２により作出されるＡＰ＋コロニーのうちの約９０％を超えるコロニーは、ＴＲＡ－１－６０＋であった（図１Ｇおよび図１０Ａ）。さらに、Ｙ４Ｆ＋３＋２により作出されるＴＲＡ－１－６０＋ｈｉＰＳＣコロニーは、典型的なｈＥＳＣ様凝縮コロニー形状を示した（図１０Ａ）。本発明者らまた、成人ｈＤＦ（ＧＭ０３５２９、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）も再プログラム化し、レンチウイルスベクター上で、Ｙ４Ｆ＋３＋２により作出されるコロニーのうちの約９０％を超えるコロニーが、ＡＰ＋／ＴＲＡ－１－６０＋であることを見出した（図１０Ｂ）。
次に、本発明者らは、非ウイルスベクターを使用して、この組合せ（Ｙ４Ｆ＋３＋２）が、高品質のｈｉＰＳＣを作出しうるのかどうかについて調べた。本発明者らは、一方のベクターに、Ｙ４Ｆを保有し（ｐＹ４Ｆ；図１０Ｃ）、他方のベクターに、ｍｉＲ－３０２ｓおよびｍｉＲ－２００ｃのクラスターを保有する（ｐ３＋２；図１０Ｄ）、２つのエピソームベクターを開発した。ｃ－Ｍｙｃの公知の形質転換活性（２６）のために、本発明者らは、ｐＹ４Ｆ上において、これを、Ｌ－ＭＹＣで置きかえた。こうして、本発明者らは、これら２つのベクターの単一のトランスフェクションを使用する、新規のエピソーム再プログラム化プロトコール（図１０Ｅ）を確立したが、このプロトコールは、ｈＤＦコロニーを、＞９０％のＡＰ＋／ＴＲＡ－１－６０＋である、ｈｉＰＳＣコロニーへと効率的に再プログラム化した（図１Ｈ）。本発明者らは、Ｙ４Ｆ、Ｙ４Ｆ＋３、およびＹ４Ｆ＋３＋２により作出された、ｈＥＳＣ様形状を伴うｈｉＰＳＣ細胞系を選択し、それらを＞２０代にわたり継代培養し、それらの特性を特徴づけた。図２Ａおよび２Ｂに示される通り、それらの形状、および多能性マーカーの発現レベルは、Ｈ９ ｈＥＳＣの形状、および多能性マーカーの発現レベルに非常に類似していた。興味深いことに、（１）３つ胚葉マーカーに対する抗体による染色、および（２）細胞系統特異的マーカーの遺伝子発現により証拠立てられる通り、Ｈ９およびＹ４Ｆ＋３＋２により作出されたｈｉＰＳＣが、３つの胚葉細胞系統全てへと、十分に均等に分化させられたのに対し、Ｙ４ＦまたはＹ４Ｆ＋３により作出されたｈｉＰＳＣの分化は、中胚葉細胞系統へと偏向した（図２Ｃおよび２Ｄ）。これらの結果は、Ｙ４Ｆ＋３＋２の組合せが、送達ベクターに関わらず、新生児ヒト線維芽細胞および成人ヒト線維芽細胞の両方からの、常套的な方法（Ｙ４ＦまたはＹ４Ｆ＋３）と比較して、分化能の偏りが小さい、高品質のｈｉＰＳＣの作出を可能とすることを示唆する（表１）。
[実施例３]
ｈｉＰＳＣにおけるゲノム完全性および体細胞突然変異
本発明者らの再プログラム化法が、臨床グレードのｈｉＰＳＣを、信頼できる形で作出しうるのかどうかについて調べるために、本発明者らは、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからの、９例の線維芽細胞系（３例の家族性ＰＤ対象、３例の孤発性ＰＤ対象、および３例の健常対象）、および新規の皮膚生検（３例の健常対象、および１例の孤発性ＰＤ患者）に由来する、４例の試料を含む、複数の供給源に由来する成人ｈＤＦを使用して、ｈｉＰＳＣ細胞系を作出しようと試みた。表ＢおよびＣおよび図１１Ａおよび１１Ｂに示される通り、本発明者らの方法は、ｐＹ４Ｆおよびｐ３＋２の、１回のトランスフェクションを使用して、これらの線維芽細胞の全てから、複数のｈｉＰＳＣ細胞系をもたらし（図１０Ｅ）、全てのｈｉＰＳＣ細胞系は、ｈＥＳＣ様形状、およびＯＣＴ４、ＴＲＡ－１－６０、ＮＡＮＯＧ、およびＳＳＥＡ－４を含む、多能性マーカーの顕著な発現を提示した。
個別化細胞療法に焦点を当てて、本発明者らは、孤発性ＰＤ患者の皮膚生検から作製されたｈｉＰＳＣクローン（表ＢにおけるＭＣＬ５４０）を、ＩＲＢ承認プロトコール（ＩＲＢパートナー番号：２０１０Ｐ００１１００）下でさらに特徴づけた。臨床グレードのｈｉＰＳＣのための基本的基準は、ゲノム完全性の維持、および有害な（例えば、がん原性であることが報告されている）突然変異（複数可）の非存在である（７、１７）。例として述べると、本発明者らは、ＭＣＬ５４０（Ｎ１７、Ｃ４、Ｎ３、Ｃ１１、およびＣ５）からの、元の分離株から、約２０代にわたり継代培養された、５つの独立のｈｉＰＳＣクローンのほか、対照細胞（親線維芽細胞およびＨ９）を、ベクターＤＮＡの、宿主ゲノムへの潜在的組込みについて調べた（表２）。プラスミド由来配列を検出するために、本発明者らは、ＥＢＮＡ－１特異的プライマーの８つのセットをデザインし、プラスミドＤＮＡを特異的に検出する、２つのセット（ＥＢ－０１およびＥＢ－０２）を同定した（図１２Ａ）。プラスミドＤＮＡは、細胞質画分中で検出不能であった（図１２Ｂ）が、５つのクローンのうちの１つ（Ｎ１７）は、プラスミド配列の組込みを示した（図１２Ｃ）。ｑＲＴ－ＰＣＲ解析は、Ｎ１７が、ゲノムＤＮＡ１００ナノグラム当たりのプラスミド配列の組込み１．３～１．７×１０４コピーを含有することを示した（図１２Ｄ）。二倍体細胞内のＤＮＡの量は、約６ピコグラムである（bionumbers.hms.harvard.edu/bionumber.aspx?id=111206）ので、ｑＲＴ－ＰＣＲにおいて使用されたゲノムＤＮＡ １００ナノグラムは、細胞約１．７６×１０４個を表す。したがって、クローンＮ１７は、細胞１個当たりのプラスミド配列約１コピーを含有すると考えられる。これに対し、他の４つのクローン、および陰性対照（元の線維芽細胞およびＨ９）は、プラスミドＤＮＡの組込みを含有しなかった（図１２Ｄ）。こうして、本発明者らは、Ｎ１７を除外し、ＤＮＡフィンガープリンティング、核型解析、およびｉｎ ｖｉｖｏにおける多能性分化により、残りの４つのｈｉＰＳＣクローン（Ｃ４、Ｎ３、Ｃ１１、およびＣ５）についてさらに解析した（図１２Ｅ～１２Ｇ）。
本発明者らは、これら４つのｈｉＰＳＣクローンに対して、全エクソームシーケンシング（ＷＥＳ）を実施し、親線維芽細胞ＤＮＡ配列と比較して、合計５２４の体細胞突然変異であって、１３７の突然変異コードエクソンまたは±２ｂｐのスプライシングアクセプター部位およびスプライシングドナー部位を含む体細胞突然変異を見出した。各ｈｉＰＳＣ細胞系は、１１４．５のシングルトン突然変異の中央値（範囲：８０～１９５）を含む、１２６の体細胞突然変異の中央値（範囲：９２～２０５）を保有した。ｈｉＰＳＣ細胞系の間には、少数の共通の突然変異（ｎ＝１～４）が見られた（図３Ａ）。Ｃ５は、最大数の体細胞突然変異（ｎ＝２０５）を有し、Ｃ４は、８０のシングルトンを含む、最小数の体細胞突然変異（ｎ＝９２）を有した。タンパク質コード領域内の体細胞突然変異のうち、ｈｉＰＳＣ細胞系は、２７（中央値、範囲：１４～３５）の非同義突然変異を含む、中央値３６．５（範囲：１７～５０）の非同義突然変異を保有した。ここでもまた、Ｃ４は、最小の突然変異を有した。本発明者らは、複数のがん型にわたり、高頻度で突然変異していると報告された、１２７の遺伝子内の突然変異について調べた（２７）。本発明者らのｈｉＰＳＣ細胞系は、これらの遺伝子内に、最大で１つの突然変異（同義または非同義）を保有し、非同義突然変異は、Ｃ４またはＮ３から見出されなかった。まとめると、４つのｈｉＰＳＣ細胞系全ての中で発見された体細胞突然変異のうち、がんに原因として関与する突然変異は存在しなかった。最後に、本発明者らは、本発明者らのｈｉＰＳＣ細胞系内の体細胞突然変異量を、公表されているデータセットと比較した（図３Ｂ）。本発明者らは、１４０のｈＥＳＣ細胞系に基づくＷＥＳから、高信頼性の体細胞突然変異（２８）を収集し、Ｈｕｍａｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＨｉｐＳｃｉ）内の、２９９のｈｉＰＳＣ細胞系（センダイウイルス法により作出された）についてのＷＧＳデータから、体細胞のコード突然変異（２９）を収集した。本発明者らのｈｉＰＳＣ細胞系は、ＨｉｐＳｃｉ ｈｉＰＳＣ細胞系と同様であり（中央値：２５、範囲：５～４９２）、ｈＥＳＣ細胞系より有意に少ない（中央値：７０、範囲：３４～２２３）（ウィルコクソンランクサム検定、ｐ値：０．０００７１）（図３Ｂ；左）全突然変異量を示した。本発明者らのｈｉＰＳＣ細胞系はまた、がんにおいて高頻度で突然変異している遺伝子内でも、少数の突然変異を保有した（図３Ｂ；右）。
本発明者らはまた、各ｈｉＰＳＣ細胞系の亜集団において存在しうる、体細胞突然変異についても点検した。本発明者らは、観察された体細胞突然変異内の、対立遺伝子頻度の分布を推定し、ＳＮＶについての中心を４５％とし、インデルについての中心を３５％とする帰無モデルにより、二項検定を実施した（２８、３０）。各ｈｉＰＳＣ細胞系について、ボンフェローニ補正ｐ値を＜０．０１とする場合の中央値を１６とする（範囲を９～１８とする）変異体を、ある細胞画分に由来する体細胞突然変異の潜在的候補と考えた。全てのｈｉＰＳＣ細胞系にわたり見出される、全ての体細胞突然変異についての、マイナー対立遺伝子頻度の分布（図３Ｃ）は、各ｈｉＰＳＣ細胞系では、クローン性突然変異およびサブクローン性突然変異の両方が観察される（プロット内の２つのピークとして同定される）が、サブクローン性突然変異は、個々のｈｉＰＳＣ細胞系に固有であることを示した。本発明者らは、２つまたはこれを超えるｈｉＰＳＣ細胞系にわたり保存される、２０の突然変異を観察したが、ＷＥＳによりアライメントされたショートリードについての、目視による検討が、１４の体細胞突然変異候補についての、親線維芽細胞内の、突然変異体の対立遺伝子に伴う、１つまたは２つショートリードを明らかにしたことは、これらのサブクローン突然変異候補が、潜在的に、生殖細胞系列に由来することを示唆する。とりわけ、本発明者らのｈｉＰＳＣ細胞系では、ＴＰ５３などのがん駆動遺伝子内に、クローンまたはサブクローンの体細胞突然変異は見られなかった（２８）。Ｃ４およびＮ３は、４つのｈｉＰＳＣ細胞系にわたり、体細胞の突然変異量が最低であったので、さらに特徴づけた。
[実施例４]
「スポッティング」培養法は、高収量かつ高品質のｍＤＡ細胞を、信頼できる形で作出する
多数の研究室が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、マウスＰＳＣおよびヒトＰＳＣの、ｍＤＡ細胞運命への分化について調べている。ｍＤＡＮが、神経原性底板に由来し、ＷｎｔシグナルおよびＳｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇシグナルが、極めて重要な役割を果たすという知見（３１～３３）に基づき、近年のｍＤＡ分化プロトコールは、これらのシグナルの活性化因子を利用する（７、３４、３５）。胚様体由来ニューロスフェアベースの方法は、実験間で、高度に可変的であるので（１８、３５、３６）、本発明者らは、「二重ＳＭＡＤ阻害」に基づく、より効率的で再現可能な単層法を確立しようと努めた（３６、３７）。移植研究のために使用されるｍＤＡ細胞は、一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、１６～３２日間にわたり分化させられている（７）。したがって、本発明者らは、まず、既に公表されている最適化条件（３７）に従い、６０ｍｍディッシュ１枚当たりの細胞７３０，０００個（すなわち、１ｃｍ２当たり３４，０００個）で始める、十分に研究されているＨ９（＜３６の継代数）を使用して、底板ベースのｍＤＡ前駆細胞（ｍＤＡＰ）の誘導を決定するのに極めて重要である、最初の１５日間を最適化しようと努めた。驚くべきことに、本発明者らは、高度に可変的な転帰を結果としてもたらす、８日目～１０日目から始まる、重度の細胞死／喪失を観察した。本発明者らの研究室内の、４名の独立の研究者により実施された、複数の実験（ｈＥＳＣについてのｎ＝７６、およびｈｉＰＳＣについてのｎ＝４８）を評価したところ、重度の細胞喪失に起因して、ｈＥＳＣおよびｈｉＰＳＣのいずれについても、＞５０％は、有意味なデータをもたらさなかった（図１３Ａ）。したがって、本発明者らは、培地交換時に、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して、剥離細胞の数を決定することにより、分化過程中における細胞喪失について、注意深くモニタリングした（図４Ａ）。１５日目（Ｄ１５）に、本発明者らは、全採取細胞数をカウントし、次いで、これらの細胞について、さらに特徴づけた。注目すべきことに、２つのｈＥＳＣ細胞系（Ｈ９およびＨ７）、および２つのｈｉＰＳＣ細胞系（Ｃ４およびＮ３）について調べたところ、１日目～１４日目における、剥離／喪失細胞の総数は、採取された細胞の総数より、はるかに大きかった（図４Ｂおよび表３）。したがって、本発明者らは、単層培養を、少数のＨ９細胞およびＣ４細胞（２４０，０００個（１ｃｍ２当たりの細胞１１，０００個）、および６０，０００個（１ｃｍ２当たりの細胞３，５００個））で開始しようと試みた。１ｃｍ２当たりの細胞１１，０００個を使用したところ、本発明者らは、有意な細胞喪失の、同様なパターンを見出した（表３）。１ｃｍ２当たりの細胞３，５００個の、さらなる低密度では、Ｈ９細胞およびＣ４細胞のいずれも、生存率不良を示し、同様に喪失から剥離へと至ったため、最終的な細胞収量も、許容不可能な程度に低量であった。初期細胞濃度に関わらない、この重度の細胞喪失のパターンは、均等に分布させられた単層条件が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ｈｉＰＳＣおよびｈＥＳＣの分化に理想的ではないことを示唆する。こうして、本発明者らは、単層を、分離された小部分（本明細書では、「スポッティング」と呼ばれる）へと分割すれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分化を改善しうるのではないかと仮定した。これについて調べるために、本発明者らは、２×２ｃｍのグリッドの交点において、１０μｌのＭａｔｒｉｇｅｌを使用して、直径約５ｍｍの円形領域（「スポット」）をプレコーティングすることにより、初期の細胞付着を、指定領域へと限定した（図１３Ｂおよび１３Ｃ）。
最適細胞密度を見出すために、本発明者らは、各スポットにおいて、Ｈ９細胞またはＣ４細胞を使用して、３つの異なる数の細胞（４０，０００、１０，０００、および２，５００個）を播種した。注目すべきことに、このスポッティング法は、細胞喪失を、有意に低減し、１５日目に、単層法と比較して、収量を改善した。特に、本発明者らは、スポット１つ当たりの細胞１０，０００個（６０ｍｍディッシュ１枚当たりの全細胞６０，０００個）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化の、ほぼ１００％の成功を結果としてもたらし（図１３Ａ）、１５日目におけるｍＤＡ細胞の最終収量６００～８００万個を結果としてもたらす一方で、総細胞喪失は、細胞３００万個を下回ること（図４Ｂ、表３）を見出した。本発明者らが、Ｈ７ ｈＥＳＣ細胞系およびＮ３ ｈｉＰＳＣ細胞系について、同様なパターンを確認した（図４Ｂ）ことは、このスポッティング法が、ｈＰＳＣ細胞系の、ｍＤＡへの分化に、広く適用可能であることを示唆する。より重要なことは、１５日目に採取された細胞が、少数の死細胞（図４Ｃ）、および著明に少数の切断型カスパーゼ３陽性細胞のほか、プログラム細胞死について周知（３８、３９）のマーカーである、低下した核凝縮（図４Ｄ）を含んだことである。本発明者らは、スポッティング法と単層法との転帰の差違が、単層条件下にある細胞の、不十分な酸素、および栄養に起因すると推測することから、より高頻度の培地交換によりこれを是正しようと試みた。しかし、毎日の培地交換は、細胞喪失量を低減することも、細胞収量を増強することもなかった。逆に、これは、細胞喪失量を増大させた（図１４Ａ）。スポッティング法では、毎日の培地交換は、細胞喪失量にも、細胞収量にも影響を及ぼさず、ここでもまた、単層法による場合より、スポッティングによる場合の方が、分化が安定であることを確認した。とりわけ、本発明者らが、培地交換の頻度に関わらず、単層培養だけにおいて、培養培地が、有意に酸性となることを観察した（図１４Ｂ）ことは、少なくとも部分的に、細胞健康の不良を説明する。まとめると、この新規のスポッティングベースの方法は、細胞喪失量を低減し、最終細胞収量を増大させ、常套的な単層法と比較して、健常ｍＤＡ細胞をもたらした。
表３は、Ｈ９およびＣ４のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化時における細胞喪失レベルについて、３つの異なる細胞密度（１ｃｍ２当たり３４，０００個、１ｃｍ２当たり１１，０００個、１ｃｍ２当たり３，５００個）による単層ベースの方法と３つの異なる細胞密度（スポット１つ当たり４０，０００個、スポット１つ当たり１０，０００個、スポット１つ当たり２，５００個）によるスポッティングベースの方法との比較の結果を示す。ＦＡＣＳを使用して、培地交換後の上清中に存在する剥離細胞をカウントした。
[実施例５]
ケルセチン処理は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化時における未分化細胞を消失させる
ｈＰＳＣベースの細胞療法の最重要問題は、新生物化の可能性がある残留未分化細胞を除去することにより、安全性を確立することである。ｈＰＳＣ内では、ＢＩＲＣ５（スルビビンをコードする）が、体細胞と比較して、高度に発現されるという、かつての知見（４０）に基づき、本発明者らは、スルビビンの化学的阻害が、残留未分化ｈｉＰＳＣを消失させると仮定した。しかし、スルビビンは、神経前駆細胞に重要であることが公知である（４１、４２）ので、この戦略が、ｍＤＡＰの作出に干渉するのかどうかについて調べることが重要である。スルビビン阻害剤（４０）の中で、本発明者らは、フラボノイドである、ケルセチン（３，３’，４’，５，７－ペンタヒドロキシフラボン）を選び出した。この天然化合物が、一般に摂取される野菜中および果実中に高濃度で存在する（４３）ためである。本発明者らはまず、未分化Ｃ４細胞１００，０００個を、５、１０、２０、４０、および１００μＭのケルセチンで、２、６、１６、および２４時間にわたり処理した。新鮮培地により洗浄した後、細胞を、のべ４８時間にわたり、さらに培養した。図５Ａに示される通り、＞２０μＭのケルセチンで、＞１６時間にわたり処理したところ、生細胞が検出不能であったことは、未分化ｈｉＰＳＣが、＞９９．９９％の効率で消失させられることを指し示す。ケルセチンが、ｍＤＡＰの生存に影響を及ぼすのかどうかについて調べるために、本発明者らは、Ｄ９ Ｃ４細胞（大半が神経前駆細胞である）を、異なる濃度のケルセチンで、１６時間にわたり処理し、１１日目における転帰について検討した。１１日目において、細胞の生存率も、細胞数も影響を受けなかった（図５Ｂおよび５Ｃ）ことは、ケルセチンが、ｈｉＰＳＣ由来のｍＤＡＰに影響を及ぼさないことを示唆する。
高感度かつ高特異度のアッセイを確立するために、本発明者らは、全細胞を１００，０００個とする、ｈＤＦ中の、未分化Ｃ４細胞の試験混合物を創出し、３つの異なるアッセイを実施した。第１に、本発明者らが、ＳＳＥＡ－４およびＴＲＡ－１－６０に対するモノクローナル抗体によるＦＡＣＳを使用し（図１５Ａ）、特に、細胞１００個を下回る場合に、インプット細胞数と検出細胞数との間の有意な乖離を見出した（図１５Ｂ）ことは、この方法が、少数の未分化細胞に対して低感度であったことを指し示す。第２に、本発明者らは、希釈細胞試料を、６日間にわたり培養し、ＡＰ＋コロニーを、未分化細胞についてのサロゲートマーカーとしてカウントした（図５Ｄ）。直線的関係が見られたが、ＡＰ＋コロニーの数は、インプット細胞数を踏まえて予測されるコロニー数の約１０分の１であった（図５Ｅ）。この乖離は、個々のｈｉＰＳＣの、限定的な生存および増殖、ならびに／またはコロニー形成時に凝集する、それらの傾向に起因しうる。この限界にもかかわらず、１０５個のｈｉＰＳＣを播種した場合であってもなお、ケルセチンによる処理後に、ＡＰ＋コロニーは検出されなかったので、この結果は、ケルセチン処理の有効性が、＞９９．９９％であることを確認した。にもかかわらず、この方法は、１００，０００個当たりの未分化細胞１０個より少数の未分化細胞数を検出できないので、次に、本発明者らは、ＯＣＴ４の発現を、サロゲートマーカーとして使用する、ｑＲＴ－ＰＣＲ法を使用した。未分化Ｃ４細胞１０２～１０５から調製されたｍＲＮＡについてのｑＲＴ－ＰＣＲ解析を使用して、ＯＣＴ４コピー数についての検量線を作成した（図５Ｆ）ことは、未分化細胞の数を予測することを可能とした。このアッセイを使用したところ、ケルセチン処理を伴わない場合に、１４、２１、および２８日目において計算される、未分化Ｃ４細胞の数は、それぞれ、細胞１００，０００個当たり３０、２、および０．１７であった（図５Ｇ）。したがって、分化の１４日目、２１日目、または２８日目に、細胞１０００万個を、ＰＤ患者へと移植したとすると、移植片は、それぞれ、未分化細胞約３，０００、２００、および１７個を含有するであろう。ケルセチン処理は、＞９９．９９％の効率で、未分化細胞を消失させうるので、ケルセチン処理後における、予測される未分化細胞の数は、最大で、１７×０．０１％＝Ｄ２８細胞１０００万個当たりの細胞０．００１７個となるであろう。ケルセチン処理（９日目に、４０μＭで、１６時間にわたる）後の、１４日目、２１日目、および２８日目において、ｑＲＴ－ＰＣＲ曲線を使用して計算された未分化細胞の数が、細胞１００，０００個当たりの細胞１個よりはるかに少なかった（図５Ｇ）ことは、これと合致する。ケルセチン処理を伴わない１４日目において、少数のＮＡＮＯＧ＋細胞が観察されたが、処理を伴う場合には検出されなかった（図１５Ｃ）ことは、これらの結果と符合する。まとめると、本発明者らの結果は、高感度法を使用して、ケルセチン処理が、未分化細胞の数を、検出不能なレベルまで低減し、これにより、数百万個の分化細胞が、移植される場合であってもなお、腫瘍形成の危険性を、大幅に低減することを指し示す。
[実施例６]
ｍＤＡＰおよびｍＤＡＮの機能的特徴付け
上記で記載した、スポッティング法およびケルセチン処理に基づき、本発明者らは、ｈｉＰＳＣを、ｍＤＡＰ／ｍＤＡＮへと分化させるための、改変ｉｎ ｖｉｔｒｏプロトコール（図６Ａ）を確立した。これらの方法を使用して分化させたＣ４細胞は、凝縮形状の漸進的増大、最小限の剥離（図１４Ｃ）、および神経突起の、先端部からの双極性伸長（図１６Ａ）を示した。１５日目に、細胞を、単一細胞懸濁液へと解離させ、再播種し、さらに分化させた。図６Ｂおよび６Ｃに示される通り、神経前駆細胞マーカー（例えば、ＳＯＸ２、ＳＯＸ１、およびＮＥＳＴＩＮ）、および底板／基板マーカー（例えば、ＧＬＩ１、ＦＯＸＡ２、およびＣＯＲＩＮ）の発現は、７日目に始まり、２８日目まで高レベルで持続し、４０日目に、ようやく低下した。ｍＤＡＰマーカー（例えば、ＯＴＸ２、ＬＭＸ１Ａ、およびＥＮ１）の発現が、２１および２８日目に上昇したのに対し、ｍＤＡＮマーカー（例えば、ＴＨ、ＤＡＴ、およびＰＩＴＸ３）は、その後に増大した。これらのデータは、ＮＥＳＴＩＮの漸進的減少、およびｍＤＡＮマーカーの増大を示す、段階特異的免疫細胞化学解析（図１６Ｂ）により確証された。Ｄ２８細胞は、Ｄ１４細胞より、高度な成熟表現型を呈した（図１６Ｂ）ので、本発明者らは、Ｄ２８細胞が、初期細胞より適すると予測し、こうして、典型的なｍＤＡＰマーカーおよびｍＤＡＮマーカーについての免疫細胞化学を使用して、Ｄ２８細胞について解析した（図６Ｄ～６Ｈ）。全細胞のうちの、約４０％および１５％が、それぞれ、ＭＡＰ２およびＴＨを発現し、細胞のうちの３８％が、ＮＵＲＲ１を発現した（図６Ｄおよび６Ｅ）。全細胞のうちの、８０％を超える細胞が、ｍＤＡ表現型に特徴的な特色である、ＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａを共発現し（図６Ｄおよび６Ｆ）、ＴＨ＋細胞のうちの大部分が、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、およびＮＵＲＲ１を共発現した（図６Ｄおよび６Ｇ）。本発明者らは、Ｄ２８細胞のうちの、約３０％および２０％が、それぞれ、背側パターンマーカーであるＰＡＸ６、および増殖マーカーであるＫＩ６７を発現すること（図６Ｄおよび６Ｈ）を観察した。重要なことは、移植時に、異常な伸長を形成することが公知である（４４、４５）、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、およびＫＩ６７を共発現する細胞が、検出不能であった（図６Ｄおよび６Ｈ）ことである。ＧＡＢＡ＋細胞または５－ＨＴ＋細胞は、分化のいずれの段階においても、ほとんど検出されなかった（図１６Ｂ）。
ＭＡＰ２、ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）、およびシナプトフィシン（ＳＹＰ）を共発現する、多くのＴＨ＋ニューロンを含有する、これらの細胞が、生理学的に機能的なニューロンとなるのかどうかを決定するために、本発明者らは、培養７０日目における、全細胞パッチクランプ記録を実施した（図１７Ａ）。これらのＤ７０ ＴＨ＋ニューロンは、ＰＩＴＸ３およびＶＭＡＴ２を含む、さらなる成熟ｍＤＡマーカーを共発現した（図１７Ａ）。また、ＴＨ＋ＡＬＤＨ１Ａ１＋ニューロンは、それぞれ、Ａ９型ｍＤＡＮおよびＡ１０型ｍＤＡＮを特徴づける、ＧＩＲＫ２、または、場合によって、カルビンジンも共発現した（図１７Ｂ）。電流固定記録モードにおいて、本発明者らは、これらの細胞の内因性膜特性（静止膜電位：－５５．９３±２．４３ｍＶ；入力抵抗：１．５２±０．４４ＧΩ；ニューロンのｎ＝７）、脱分極電流の注入に応答して観察される活動電位（ＡＰ）（図１８Ａ；ＡＰの平均振幅：５４．９６±４．６６ｍＶ；半値幅：６．０４±０．８２ミリ秒；後過分極（ＡＨＰ）の振幅：３．５５±１．４６ｍＶ；細胞のｎ＝７）について評価した。電圧固定記録モードにおいて、－７０ｍＶ～＋４０ｍＶの電圧パルスが、一過性の内向き電流を誘発したが、これが、テトロドトキシン（ＴＴＸ；電圧依存性Ｎａ＋チャネル遮断剤）により完全に遮断されたことは、電圧依存性Ｎａ＋チャネルの発現のほか、カリウム電流を表す、持続的外向き電流（図１８Ｂ）を指し示す。さらに、全細胞電圧固定記録時に、本発明者らは、機能的シナプスの存在（－７０ｍＶの保持電位で、ｓＰＳＣの周波数：０．１１±０．０３Ｈｚ；ピーク振幅、１４．７１±３．０５ｐＡ；立上り時間、０．７３±０．１４ミリ秒；減衰時間、１．７２±０．１９ミリ秒；細胞のｎ＝５）（図１８Ｃ）を指し示す、自発的シナプス後電流（ｓＰＳＣ）を観察した。注入電流の非存在下で、自発発火が観察されたことは、静止膜電位におけるペースメーカー活動（４６）と符合する。記録された細胞は、Ａ９ ｍＤＡＮにおいて典型的に観察される通り、４．４±０．８Ｈｚの平均頻度（ｎ＝４）で、自発的に発火した（図１８Ｄ）。記録された個々のニューロン（記録パッチピペットを介して、ニューロビオチンをロードされた；赤色）が、ＴＨ陽性細胞と共局在したことは、これらの細胞の、ドーパミン作動性ニューロンであることを確認する（図１８Ｅ）。単一細胞パッチクランプ記録に加えて、本発明者らは、マルチ電極アレイ（ＭＥＡ）を使用して、集団レベルの電気活動も測定した。分化細胞は、ニューロンネットワークの成熟を指し示す、ロバストな同期バースティングパターンを発生させた（図１８Ｆ）。累積活性マップは、３０日目～４４日目の間に、ｍＤＡ内のスパイク密度、およびスパイク面積の増大を示した（図１８Ｆ）。ｍＤＡＮからの自発活動を分離するために、培養物を、グルタミン酸受容体アンタゴニストである、ＮＢＱＸ＋ＡＰ５と、ＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストである、ピクロトキシンとの組合せで処理した。このカクテルを投与したところ、活動電極による全スパイキングおよび活動電極数が、わずかに低下するのにとどまった（図１８Ｇおよび１８Ｈ）ことは、これらの培養物中に、ｍＤＡＮが多量に存在することを示唆する。最後に、培養培地についてのＨＰＬＣ解析は、Ｄ４７細胞が、ドーパミン（３．１±０．１ｎｇ／ｍｌ）およびＤＯＰＡＣ（０．２±０．０ｎｇ／ｍｌ）を放出することをさらに示した（図６Ｉ）。
[実施例７]
移植後のｉｎ ｖｉｖｏにおける安全性試験
本発明者らによる、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける特徴づけは、１４日目～２８日目における細胞の大部分が、移植可能な細胞供給源として適切なｍＤＡＰを表すことを示した。それらの安全性について調べるために、本発明者らは、Ｄ１４ Ｃ４細胞またはＤ２８ Ｃ４細胞（ケルセチン処理を伴わないか、またはこれを伴う；動物１匹当たりの細胞１００，０００個）を、免疫不全ＮＯＤ ＳＣＩＤマウスの線条体へと移植した。予測される通り、未分化Ｃ４細胞の移植（０日目）は、４匹の被験マウス全てにおいて、ＰＳＣの規定的特徴である、特徴的な３つの胚葉を含有する奇形腫の形成を誘導した（図７Ａ、左欄）。比較により、ケルセチン処理を伴わないＤ１４細胞（ｎ＝８）、またはこれを伴うＤ１４細胞（ｎ＝１９、図７Ａ、中欄）、およびケルセチン処理を伴うＤ２８細胞（ｎ＝２３；図７Ａ、右欄）を移植したところ、奇形腫形成は、観察されなかった（図７Ｂ）。興味深いことに、本発明者らは、Ｄ１４細胞を移植された宿主脳のうちの、約４０％（ケルセチンを伴わないＤ１４群８例のうちの３例；ケルセチンを伴うＤ１４群１９例のうちの８例；図７Ａの中レーン内の白丸）において、ロゼット様構造を観察した。これに対し、Ｄ２８細胞を移植したところ、ロゼット様構造は見られなかった（マウス２３例中０例；図７Ａおよび７Ｃ）。免疫組織化学は、Ｄ２８移植片と比較して、Ｄ１４移植片は、より多くのビメンチン陽性未成熟細胞含有することを示した（図７Ｄ）。加えて、Ｄ２８細胞に由来する移植片内ではまた、ＳＯＸ１陽性細胞、ＫＩ６７陽性細胞、ＳＯＸ１／ＫＩ６７二重陽性細胞、ＳＯＸ１／ＰＡＸ６二重陽性細胞、およびＳＯＸ１／ＰＡＸ６／ＫＩ６７三重陽性細胞も、Ｄ１４細胞に由来する移植片内より少なかった（３３％対４．５％；５．９％対１．２％；２．１％対０．１５％；１．２％対検出なし；０．７５％対検出なし、図７Ｅ～７Ｇ）ことは、Ｄ２８移植片が、Ｄ１４移植片より少数の、増殖可能性を伴う細胞を含有することを指し示す。これらの結果は、完全な未分化細胞は除去されており、奇形腫も形成されなかったが、Ｄ１４移植片は、依然として、ロゼット様構造を形成することが可能な、未成熟前駆細胞を含有することを示唆する。加えて、Ｄ２８移植片内では、ＳＯＸ１／ＰＡＸ６／ＫＩ６７三重陽性細胞も検出不能であったので、本発明者らは、Ｄ２８細胞が、移植のための、Ｄ１４細胞より安全な細胞供給源を表すことを結論づける。本発明者らは、それらの生体内分布を評価することにより、Ｄ２８細胞の安全性について、さらに調べた。Ｄ２８細胞の、線条体への移植の６カ月後、本発明者らは、中枢神経系領域（嗅球と小脳との混合物、および脊髄）、および５つの末梢臓器（肺、心臓、肝臓、腎臓、および脾臓）を摘出して、線条体内移植片からの、ヒト由来細胞の遊走について探査した。ゲノムｑＰＣＲが、これらの領域のうちのいずれにおいても、ヒトＤＮＡ配列を検出しなかったのに対し、ｈｉＰＳＣ陽性対照は、顕著な発現を示した（図７Ｈ）ことは、移植細胞の、脳内または末梢臓器への、検出可能な再分布が見られないことを裏付ける。
[実施例８]
ＰＤについての動物モデルにおける、ｉｎ ｖｉｖｏの有効性試験および移植片解析
６－ヒドロキシドーパミンにより病変を施されたラットモデルは、開発史上、最初のＰＤ動物モデル（４７）であり、依然として、一般的なモデルであり続けている（４８、４９）。このラットモデルは、細胞移植の、運動に対する効果についての定量的評価のために、とりわけ有用である。無胸腺ラットにおけるその使用は、免疫抑制が不要であるため、好ましいモデルとして認められつつある。２つの異なる供給元（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ）、およびＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ））の無胸腺ラットを使用した。本発明者らはまず、Ｃ４ Ｄ２８細胞１００，０００および３００，０００個を、片側において、６－ヒドロキシドーパミンにより病変を施された無胸腺Ｔａｃｏｎｉｃラットの線条体に移植し、移植後毎月、それらのアンフェタミン誘導回旋行動についてモニタリングした。１２週間後、細胞１００，０００個群、および細胞３００，０００個群のいずれも、同側回旋行動の、有意な低減を示した（図１９Ａ）。１６週間後に、植込みを受けた全てのラットでは、回旋行動が、完全にレスキューされ、一部のラットは、反対側の回旋行動さえも示した。これに対し、媒体を施されたラットは、回復を示さなかった。ヘマトキシリン／エオシン（ＨＥ）染色は、移植片が、奇形腫も、ロゼットも含有しないことを示した（図１９Ｂ）。ヒト神経細胞接着分子（ｈＮＣＡＭ）についての免疫組織化学は、線条体（ＳＴＲ）（図１９Ｃ）、前頭前皮質（ＰＦＣ；図１９Ｄ）、中隔核（図１９Ｅ）、側座核（ＮＡｃ；図１９Ｆ）、および脳梁（ＣＣ；図１９Ｇ）内の、稠密なｈＮＣＡＭ＋神経支配を示した。免疫組織化学は、移植片内の、潤沢なＴＨ＋ニューロンを明らかにした（図１９Ｈ）。立体的定量は、生存ＴＨ＋ニューロンの平均個数が、移植細胞１００，０００個当たり５，６２１±１０２９個（ｎ＝４）であり、Ａ９ニューロンに典型的な、大型の、角張った細胞体（図１９Ｉ）、およびＡ１０に典型的な、小型の、球形ニューロン（図１９Ｊ）を含む、ニューロン形状の混合物を含有することを示した。
Ｄ２８ Ｃ４細胞の安全性および有効性を示唆する、これらのデータにより、本発明者らは、Ｄ２８ Ｃ４細胞について、Ｔａｃｏｎｉｃ株より、身体がロバストであり、長期にわたる解析を容易とする、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ製の無胸腺ラットにおいて、さらに広範に調べた。本発明者らは、移植のために、単一用量（１００，０００個）のＤ２８ Ｃ４細胞を選択し（図１９Ｋ）、凍結保存細胞の有効性および安全性を、新規調製細胞と比較した。凍結保存Ｄ２８ Ｃ４細胞（凍結Ｄ２８）は、新規調製同等物と同等の生存率レベル（約９０％）を保持し、液体窒素中、１週間にわたる保管後において、同じｍＤＡ細胞表現型を提示した（図１９Ｌ）。アンフェタミン誘導回旋行動は、新規Ｄ２８ Ｃ４細胞または凍結Ｄ２８ Ｃ４細胞の移植の１６週間後に、有意に低減され、２０および２４週間後に、完全にレスキューされた（図８Ａ）。Ｔａｃｏｎｉｃラット（図１９Ａ）について認められる通り、一部の動物は、２０および２４週間後において、反対側の回旋行動を呈した。本発明者らはまた、外因性薬理学的刺激を伴わない、いくつかの試験においても、これらの移植片の機能的有効性について査定し、これにより、運動欠損について、ヒトＰＤの運動欠損との類似がより大きな尺度をもたらした。片側化感覚運動応答選択についての高感度試験である、コリドー試験（５０）では、新規Ｄ２８ Ｃ４細胞または凍結Ｄ２８ Ｃ４細胞は、移植の２４週間後において、病変誘導性の同側への偏りを、有意に低減した（図８Ｂ）。とりわけ、１６または２０週間後では、未だ有意な低減が観察されなかったことは、このタスクにおける改善が、回旋行動より多くの時間を要することを示唆する。前肢無動症を測定する、シリンダー試験およびステッピング試験（５１、５２）では、６－ヒドロキシドーパミン病変によりもたらされた前肢機能の機能障害もまた、新規Ｄ２８ Ｃ４細胞または凍結Ｄ２８ Ｃ４細胞の移植により、移植の２４週間後において、有意に改善された（図８Ｃおよび８Ｄ）。まとめると、４つの行動試験全てにおいて、新規Ｄ２８ Ｃ４細胞および凍結Ｄ２８ Ｃ４細胞のいずれも、運動失調を、有意かつ同等に改善した。さらに、後の時点における、さらなる移植動物も、回旋行動の回復が、最終被験時点である５２週間後まで、持続的であることを裏付けた（図１９Ｍ）ことは、移植に起因する機能改善が、良好に維持されたことを示唆する。
Ｈ９由来ｍＤＡ細胞が、ヒト胎児中脳腹側（ＶＭ）細胞と同等に機能的であることについては、広範に検証され、明示的に示されている（５３）ので、本発明者らは、Ｈ９ ｈＥＳＣ由来Ｄ２８細胞およびＣ４ｈｉＰＳＣ由来Ｄ２８細胞について、移植後における転帰を直接比較した。細胞１×１０５および４×１０５個の移植は、いずれの細胞系も、回旋行動について、程度および時間経過のいずれにおいても、同一の回復を結果としてもたらすことを示した（図２０Ａ）。
次に、本発明者らは、移植の２６週間後における移植片について解析し、ｈＮＣＡＭ＋細胞およびＴＨ＋細胞のいずれもが、背外側ＳＴＲ（ｄｌ－ＳＴＲ）、ＰＦＣ、およびＮＡｃなどのドーパミン作動性標的領域への、夥しい伸長を伴う、ＳＴＲの全体に対する、広範な神経支配を提示することを見出した（図８Ｅ～８Ｌおよび図２０Ｂ）。ｄｌ－ＳＴＲにおける、ドーパミン作動性線維内の、ｈＮＣＡＭの広範な共発現により、これらの移植片由来ｍＤＡＮによる、宿主脳に対する、ロバストな神経支配を、さらに検証した（図８Ｍ）。加えて、ＴＨ、ヒトシナプス前タンパク質（シナプトフィシン；ｈＳｙｎ）、および線条体中型有棘ニューロンマーカー（ＤＡＲＰＰ３２）に対する抗体を使用して、三重免疫蛍光染色も実施した。本発明者らは、移植片境界部の、それらの優先的標的、および宿主樹状突起棘（ＤＡＲＰＰ３２＋ニューロン）において、ＴＨ＋／ｈＳｙｎ＋ニューロン終末を観察した。このことは、移植されたＤＡＮが、宿主線条体内ニューロンとのシナプス結合を形成したこと（図８Ｎ）を指し示す。凍結Ｄ２８移植片および新鮮Ｄ２８移植片は、ｈＮＣＡＭ＋／ＴＨ＋である、同様な神経再支配およびシナプス形成パターンを示した（図２０Ｃ）。新規Ｄ２８ Ｃ４細胞および凍結Ｄ２８ Ｃ４細胞のいずれによる移植片も、同様に多数の、Ａ９様形状またはＡ１０様形状を伴うＤＡニューロンを含有した（Ｄ２８：３４，５６０±３，２００；凍結Ｄ２８：４６，０９４±８，９６７；図２１Ａおよび２１Ｂ）。移植片容量もまた、Ｄ２８と凍結Ｄ２８とで同様であった（Ｄ２８：１２．２±１．１ｍｍ３；凍結Ｄ２８：１３．０±１．７ｍｍ３；図２１Ｃ）。Ｄ２８および凍結Ｄ２８のそれぞれによる移植片中の、ｈＮＣＡＭ＋細胞の総数は、約３．０×１０６および２．４５×１０６であり、ＴＨ＋細胞の平均百分率は、１．４８±０．５５％および２．０８±０．６５％であった。これらのＴＨ＋ニューロンの大半（７０～８０％）は、ＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａを共発現し、９０％を超えるＴＨ＋ニューロンが、ＮＵＲＲ１を共発現した（図２１Ｄ～２１Ｆ）。ＴＨ＋ニューロン内では、成熟ＤＡマーカーであるＤＡＴが、大量に発現された（図２１Ｇ）のに対し、増殖可能性と関連するマーカーであるＫＩ６７＋は、細胞のうちの＜１％で発現された（Ｄ２８：０．８６±０．０９％；凍結Ｄ２８：０．５４±０．２１％；図２１Ｈおよび２１Ｉ）。ロゼットまたは奇形腫は、観察されず、ＳＯＸ１、ＰＡＸ６、およびＫＩ６７を共発現する増殖性細胞は、希少であるか、または検出されなかった（ＳＯＸ１＋ＰＡＸ６＋：Ｄ２８：０．３７±０．１０％；凍結Ｄ２８：０．１５±０．１１％；ＳＯＸ１＋ＰＡＸ６＋ＫＩ６７＋：Ｄ２８：０．０２±０．０２％；凍結Ｄ２８：検出なし；図２１Ｈおよび２１Ｉ）。ＴＨ＋ニューロン内では、ＧＩＲＫ２またはカルビンジンが発現され（図２１Ｊおよび２１Ｋ）、大部分は、ＧＩＲＫ２を共発現した（Ｄ２８：７９．２９±４．８８％；凍結Ｄ２８：８１．２８±３．５０％；図２１Ｌ）。移植片内の、これらのＴＨ＋ニューロンは、ＡＬＤＨ１Ａ１など、さらなるＡ９マーカーを共発現する。ＴＨ＋ＡＬＤＨ１Ａ１＋ニューロンは、Ａ９型ｍＤＡＮを表す、ＳＯＸ６およびＧＩＲＫ２を共発現することが多い（図２１Ｍおよび２１Ｎ）のに対し；一部のＴＨ＋ＡＬＤＨ１Ａ１＋ニューロンは、Ａ１０型ｍＤＡＮを表す、カルビンジンを共発現した（図２１Ｏ）。まとめると、これらのデータは、新規Ｄ２８ Ｃ４細胞および凍結Ｄ２８ Ｃ４細胞のいずれによる移植片内でも、ＴＨ＋ニューロンの大部分は、Ａ９型ｍＤＡＮの特徴を有し、行動学試験における、運動失調の、広範かつ長期にわたる回復と符合することを示す。
これらのデータを、６－ヒドロキシドーパミンにより病変を施されたラットモデルにおける、ｈｉＰＳＣ由来ＤＡ細胞についての、近年公表された移植研究（４４、４５、５７～６４）と比較したところ、本研究におけるＤＡ収量（生存ＤＡニューロンの、移植細胞数に対する比）は、これらの他の研究のいずれよりも高値であった（表４）。
[実施例９]
ＧＭＰに従う、分化細胞の作製
最後に、本発明者らは、Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ内のＧＭＰ施設における、本プロトコール下、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、分化Ｃ４細胞の作製および特徴づけにより、本発明者らのプラットフォームの、拡大可能性および臨床への適用可能性について調べた。本発明者らは、Ｄ０ Ｃ４ ｉＰＳ細胞約１００万個から出発して、Ｄ２８細胞＞１６０００万個を作製することに成功した（図２２Ａ～２２Ｆ）。品質管理データ（例えば、ゲノムフットプリント、マーカータンパク質についての免疫細胞化学、ｑＲＴ－ＰＣＲ）は、これらの、臨床的に適切な数量が、ＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋細胞の高百分率（＞８５％）、および不適切なマーカー（例えば、５－ＨＴ、ＤＢＨ、ＯＣＴ４、およびＳＳＥＡ－４；それぞれ、セロトニン作動性、ノルアドレナリン作動性、および多能性マーカーを表す）の非存在により証拠立てられる通り、病原体を含まず、高品質であることを裏付けた。
[実施例１０]
ｉｎ ｖｉｖｏのヒト対象における有効性試験
ＰＤを伴うヒト患者を、本明細書で記載される方法により創出された自家ｍＤＡ前駆細胞の植込みにより処置した。患者は、１０年にわたる、進行性特発性ＰＤの病歴を伴う、６９歳、右利き、男性の医師であった。この患者のＰＤ医薬は、毎日４回３カプセルずつのＲｙｔａｒｙ（カルビドーパ／レボドーパを２３．７５ｍｇ／９５ｍｇとする持続放出剤）、毎日４ｍｇのロチゴチン、および毎日１ｍｇのラサギリン（９０４ｍｇのレボドーパと同等の用量）であった。最良の医学的治療にもかかわらず、この患者は、振戦、姿勢、および微妙な運動制御の悪化により特徴づけられる、１日当たり平均３時間のオフタイムを伴う、最適未満の症状のコントロールを報告した。この患者は、運動障害を有さなかった。説明同意文書は、ＰＤにおける、本技術の最初のヒト使用と関連する危険性についての、徹底的な討議、および現在利用可能な、内科および外科における治療選択肢であって、深部脳刺激を含む治療選択肢についての再検討を含んだ。皮膚生検から採取された線維芽細胞を使用して、複数のｉＰＳＣ細胞系を作出し、これらを、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて、多能性の分化能について広範に調べ、全エクソームシーケンシングを使用して、体細胞突然変異についてスクリーニングした。これらのデータに基づき、公知のがん関連突然変異を欠き、全突然変異量が最小である、単一のクローン（Ｃ４と称する）を、移植可能なｍＤＡＰ細胞の作製のために選択した。ｍＤＡＰ細胞を、臨床使用のために出荷する前に、厳密なＧＭＰ基準および品質管理基準を満たし、Ａ９ ｍＤＡ特異的神経マーカー、および他の神経マーカーの遺伝子発現のほか、全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）により、ゲノム完全性について、試験を実施した。
患者は、ＦＤＡによる規制ガイドラインに準拠して、被殻、左半球に続いて、右半球への植込みのために、６カ月間を隔てて、２つのＭＲＩ誘導定位固定外科手順を受けた。各手術では、前交連の基準面に対して後方の被殻内に、各々が、核の上方～下方範囲にわたる、３つのトラジェクトリーを施した（Schweitzer et al., Oper Neurosurg (Hagerstown) 2019;18:321-328）。各手術手順において、のべ４００万個ずつの細胞を、３つの注入路間で均等に分割して送達した。手術中に、静脈内セファゾリンを投与した。いずれの時点においても、免疫抑制剤、グルココルチコイド、または抗痙攣剤を使用しなかった。各手術の後で、患者を、一晩にわたりモニタリングし、１日後に退院させた。
材料および方法
本実施例では、以下の材料および方法を使用した。
概観
説明同意文書は、現在利用可能な、内科および外科における治療選択肢であって、深部脳刺激を含む治療選択肢についての再検討を伴う、パーキンソン病における、本方法の最初のヒト使用と関連する危険性についての、徹底的な討議を含んだ。研究は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）による規制ガイドライン下で行った。承認は、Ｗｅｉｌｌ Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ａｎｄ ａｔ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌにおける審査委員会から得た。動物における全ての手順は、ＭｃＬｅａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅからの承認を得て行った。
ｉＰＳＣの作製、分化、および前臨床安全性／有効性試験
上記で記載した通り、従来の山中因子を、２つのマイクロＲＮＡクラスターと組み合わせるプロトコールを使用して、ｉＰＳＣを作製した。皮膚生検から採取された線維芽細胞を使用して、複数のｉＰＳＣ細胞系を作出し、これらを、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて、多能性の分化能について調べ、全エクソームシーケンシングにより、タンパク質コード突然変異の存在についてスクリーニングした。正常核型を示す、単一のｉＰＳＣクローン（Ｃ４と称する）を、医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準（ＧＭＰ）に準拠する条件下における、さらなる特徴付け、およびｍＤＡＰの作製のために選択した。「スポッティング」ベースの方法を、上記で記載したＧＭＰ条件下で使用して、Ｃ４ ｉＰＳＣを、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、２８日間にわたり、ｍＤＡ細胞へと分化させた。このプロトコールは、スルビビンをコードする、ＰＳＣ特異的抗アポトーシス性遺伝子である、ＢＩＲＣ５を阻害することにより、残留未分化ｉＰＳＣ（すなわち、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ１、およびＮＡＮＯＧなどの多能性マーカーを発現する細胞）を消失させる、９日目における、一晩にわたる、ケルセチンによる処置を含んだ。上記、およびLee et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2013;110:E3281-90を参照されたい。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化させたｍＤＡＰの特徴付け
上記で記載した、２つの検証実験において、Ｃ４ ｉＰＳＣ由来細胞は、正常核型を示し、ドーパミンニューロン特異的神経マーカー、および他の神経マーカーを伴うｍＤＡＰとして特徴づけられた。Ｃ４ ｉＰＳＣおよびＣ４由来前駆細胞の両方についての全ゲノムシーケンシングを実施し、前駆細胞を、元の供給源線維芽細胞と比較したところ；結果は、前駆細胞内の、公知のがん関連突然変異、および神経変性関連突然変異の非存在を確認した。
本発明者らは、Ｃ４ ｉＰＳＣ内、およびｍＤＡＰ内に、親線維芽細胞と比較して、２３の体細胞突然変異を含むミスセンス変異体およびスプライス部位破壊変異体を見出したが、公知のがん関連遺伝子（すなわち、ＣＥＮＳＵＳデータベースに従う）、神経変性障害について報告されている疾患遺伝子（すなわち、ＨＧＭＤおよびＣｌｉｎＶａｒに従う）、およびチロシン代謝およびドーパミン作動性シナプス経路に関与する遺伝子（すなわち、ＫＥＧＧデータベースに従う）は、これらの変異による影響を受けていなかった。とりわけ、ＦＬＧ２内のミスセンス変異体（ＥＮＳＰ０００００３７３３７０．４：ｐ．Ｖａｌ６７２Ｇｌｙ）は、Ｃ４ ｉＰＳＣ試料中に、低比率で存在したが、これを、Ｃ４ ｉＰＳＣ内のヘテロ接合性変異体と呼んだ。したがって、本発明者らは、このミスセンス変異体が、Ｃ４ ｉＰＳＣおよびｍＤＡＰのいずれにおいても、サブクローン体細胞突然変異として存在すると推定した。Ｃ４ ｉＰＳＣから、ｍＤＡＰへの分化に、新たな体細胞突然変異は、導入されなかった。Ｃ４ ｉＰＳＣまたはｍＤＡＰにおいて見出された突然変異の大部分は、クローン他の試料中では、サブクローンとして現れた（各ボックス内の、最も左側の２つのピーク）。次に、本発明者らは、ＡＳＣＡＴ（ａｌｌｅｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ）（Van Loo et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2010;107:16910-5）を使用して、リード深度ベースのＣＮＶ解析を実施した。本発明者らは、Ｃ４ ｉＰＳＣおよびｍＤＡＰの、ＰＯＤＸＬ遺伝子内で、イントロンおよび単一のエクソンに及ぶ、ヘテロ接合性欠失を見出したが、Ｃ４ ｉＰＳＣと比較して、ｍＤＡＰへと導入された、さらなるＣＮＶを見出さなかった。このコピー数変異体は、ＷＥＳを使用して検出されなかった。ＰＯＤＸＬは、がん駆動遺伝子として報告されていない。
臨床使用の前に、これらの前駆細胞に由来するニューロンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンに特徴的な、ドーパミンの分泌および電気生理学的特性を示し、動物モデルにおいて、上記で記載した通り、胎児中脳由来組織の機能的有効性と同様な機能的有効性を示し、ＦＤＡによる法定出荷基準に合格した。ケルセチンによる処理後に、最終的な細胞生成物（２８日目における）は、免疫染色およびリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応ベースのアッセイに基づき、検出可能な残留未分化ｉＰＳＣを有さなかった（９５％の信頼性区間の上限を、２８日目における分化細胞１０億個当たり≦１個の未分化細胞とする）。最終生成物中に、移植片誘導性運動障害の潜在的原因である、セロトニン作動性ニューロン（Olanow et al. Ann Neurol 2003;54:403-14）は、検出されなかった。
ヒト化マウスにおける同種条件下と対比した、自家条件下における移植片の生存
患者由来ｉＰＳＣ（Ｃ４）および同種ヒト胚性幹細胞（Ｈ９）を、２８日目のｍＤＡＰ（Ｃ４－ｍＤＡＰおよびＨ９－ｍＤＡＰ）へと分化させ、各細胞系の細胞１×１０５個個ずつを、非肥満性糖尿病／重症免疫不全マウス（ＮＯＤ ＳＣＩＤ）および非肥満性糖尿病／重症免疫不全／インターロイキン２受容体γ枯渇マウス（ＮＯＤ ＳＣＩＤガンママウス）、患者ヒト化ＮＯＤ ＳＣＩＤガンママウス（Ｃ４－ｈｕ；手術の２４カ月後［左半球］および１８カ月後［右半球］において得られた、患者の末梢血単核細胞を使用する）、ならびに同種ヒト化マウス（Ｋ１－ｈｕ）の線条体へと移植した。２週間後に、動物を死なせ、ヒト神経細胞接着分子（ｈＮＣＡＭ＋）細胞について標識付けすることにより、移植片の生存、移植片内の、ドーパミン作動性ニューロン（チロシンヒドロキシラーゼ［ＴＨ＋］ニューロン）についてのマーカーを発現するニューロンの存在、および細胞性免疫応答（ＣＤ４＋細胞）について、組織学的に検討した。
患者における手術手順
患者は、細胞の植込みのために、６カ月間を隔てて、左半球に続き、右半球において、２つの外科手順（ＦＤＡによる規制ガイドラインに準拠する）を受けた。ＭＲＩベースのＬｅｋｓｅｌｌ定位固定法を使用した。各手術時に、前頭葉の上傍矢状部の、単一の注入地点から出発して、３つのトラジェクトリーを創出した。細胞は、ＤＦ／ＨＣＣ ＧＭＰ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｒｅにおいて調製され、手術日に採取された。被殻の矢状方向の広がりに及ぶカラムを創出するように特別にデザインされたデバイス（Schweitzer et al. 2019）を使用して、細胞を、各注入路へと注入した。手術中ＣＴを使用して、カニューレをイメージングし、この画像を、手術前外科計画へと戻して融合し、位置特定の精度を確認し、出血を阻止した（図２４Ａ～２４Ｂ）。各手術手順において、のべ４００万個ずつの生細胞を、３つの注入路間で均等に分割して送達した。抗生剤を投与した（セファゾリン、手術中における、３回の投与のために、８時間ごとに、２ｇずつの静脈内投与）が、免疫抑制剤、ステロイド、または抗痙攣剤は使用しなかった。手術後に、患者を、集中治療室内で、一晩にわたりモニタリングしてから、１日後に退院させた。
臨床尺度
神経学的検査を実施し、ベースライン、ならびに各回の植込みの１、３、６、９、および１２カ月後、ならびに以後６カ月間隔で、パーキンソン病特異的尺度を評価した。各回の検査時に、神経科専門医は、患者により報告される、医薬が運動症状を十分にコントロールしない「非コントロール」時間を記録した。あらかじめ指定された評価は、Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ（ＭＤＳ－ＵＰＤＲＳ）の第ＩＩＩ部（高スコアがパーキンソン病の運動徴候の悪化を指し示す、０～１３２の範囲のスコア）（Cha et al., Nat Cell Biol 2017;19:445-56）、および３９項目からなる、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＰＤＱ－３９；高スコアが生活の質の悪化を指し示す、０～１５６の範囲のスコア）（Lee et al., 2013）を含んだ。
脳イメージング
細胞注入の、被殻内の正確な配置を確認するように、手術中に、かつ、植込み部位またはこの近傍における出血スクリーニングのために、手術直後にコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを実施した。連続磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャンおよび磁気共鳴分光法の所見を、腫瘍、脳卒中、または出血の任意の証拠について精査した。連続フッ素１８－Ｌ－ジヒドロキシフェニルアラニン（１８Ｆ－ＤＯＰＡ）ポジトロン断層法（ＰＥＴ）－ＣＴを実施して、生着被殻領域内の、シナプス前終末におけるドーパミン活性の存在について評価した。放射性同位元素取込みの変化は、１８Ｆ－ＤＯＰＡ標準化取込み値の比により、半定量的に判定した。
安全性モニタリング
イメージングの精査と並行して、神経学的有害事象を検出する連続臨床神経学検査を、２名の研究神経科専門医、および研究放射線科医により実施した。患者は、独立に、地域の神経科専門医による処置を受け続けた。
結果
植込み後のヒト化マウスにおける、移植片の免疫原性
図２３Ａおよび上記に示された通り、ＮＯＤ ＳＣＩＤガンママウスでは、患者由来ｍＤＡＰ（Ｃ４－ｍＤＡＰ）および同種ｍＤＡＰ（Ｈ９－ｍＤＡＰ）のいずれも生存したが、同種ヒト化マウス（Ｋ１－ｈｕ）へと移植したところ、いずれの移植片型も拒絶された。患者ヒト化マウス（Ｃ４－ｈｕ）が、植込みの２週間後において、自家Ｃ４－ｍＤＡＰの生存を許容し、移植片は、ｈＮＣＡＭ＋細胞について陽性に染色され、ＴＨ＋ニューロンを含有したのに対し、Ｃ４－ｈｕマウスは、同種Ｈ９－ｍＤＡＰを拒絶し、顕著なＣＤ４＋リンパ球浸潤物を伴った（図２３Ｂ～２３Ｃ）。
植込み０～２４カ月後の患者におけるイメージング
第１の植込みの３カ月後に、１８Ｆ－ＤＯＰＡ ＰＥＴ－ＣＴによるイメージングは、被殻内における、１８Ｆ－ＤＯＰＡの取込みの、ベースラインからの初期減衰に続き、右側および左側のそれぞれにおいて、最長で、植込みの１８カ月後および２４カ月後までの後続の期間に、１８Ｆ－ＤＯＰＡの取込みの小さな増大を示した。色強度スケール、および選択された亜領域についての定量的比較において見られる通り、活性の増大は、左側よりも、右側で大きく（第２の植込み）、移植片部位近傍の被殻後方において、最も顕著であった（図２４Ａ～２４Ｂ）。放射性同位元素取込みの、ベースラインからの半定量的変化は、図２４Ａ～２４Ｂに示され、右側では、－４．０％から１３．５％へと変動し、左側では、－４．８％から９．８％へと変動した。
第１の植込みの６カ月後、および後続の時点におけるＭＲＩは、Ｔ２強調シグナル強度増大領域は、被殻内の移植部位に類似するほか、右側の、白質内の外科的注入路部分に沿って、より顕著であった。（図２４Ａ～２４Ｂ）を示した。６つの被殻植込み部位に、明暗対照の増強は見られなかった。第２の手術の６カ月後に、４ｍｍの増強領域が、１つの注入路内の標的の３ｃｍ上方において観察され；動脈スピン標識化磁気共鳴灌流イメージングおよび磁気共鳴分光法を含むＣＴおよびＭＲＩは、手術後グリオーシスと符合する変化を示した。
臨床評価
第１（左）の植込みの２４カ月後、および第２（右）の植込みの１８カ月後に、患者は、有害事象または機能の減退を報告しなかった。第１の植込みの前、ドーパミン置換療法の、一晩にわたる休止（「オフ」）の後における、ＭＤＳ－ＵＰＤＲＳの第ＩＩＩ部（パーキンソン病の運動徴候を評価する）によるスコアは、患者が、症状の増悪に起因して、投薬の中止を辞退したため、測定しなかった。オフ期間中のスコアは、第１の植込みの４週間後における４３、後続の追跡期間における３３～４１、および２４カ月後における３３であった。ドーパミン置換療法のピーク用量（「オン」）時における、ＭＤＳ－ＵＰＤＲＳの第ＩＩＩ部によるスコアは、植込み時における３８、追跡期間における１９～３５、および２４カ月後における２９であった。ＰＤＱ－３９スコア（パーキンソン病関連の生活の質を評価し、低スコアが生活の質の改善を指し示す）は、植込み時における６２、追跡期間における２～３４、および２４カ月後における２であった（図２５Ａ～２５Ｂおよび表５）。
２４カ月後に、患者のパーキンソン病医薬は、カルビドーパ－レボドーパ徐放剤（それぞれを２３．７５ｍｇおよび９５ｍｇ含有するカプセル、３、３、２、および３カプセルの用量で、毎日４回）、ロチゴチン（毎日４ｍｇ）、ラサギリン（毎日１ｍｇ）、およびドロキシドパ（毎日１００ｍｇ）（毎日の総用量を８４７ｍｇとするレボドーパ同等物）であったが；これは、レボドーパ同等物の、植込みの前と比較した、６％の減少を表した。患者は、１日当たりの「非コントロール」時間が、１時間より短いことを報告した。運動障害は、患者によって報告されることも、臨床検査時に観察されることもなかった（手術前におけるそれらの非存在と同様であった）。
運動スコアおよび運動ＡＤＬの改善に加えて、対象は、ＲＥＭ睡眠の短縮を含む睡眠の質の改善、行動障害症状の軽減、流涎症および嚥下障害の軽減、ならびに不安障害および抑うつ状態の軽減について報告した。主観的認知機能の減退も見られず、ＭｏＣＡスコアは、２７～３０の間を維持した。
パーキンソン病を伴う患者における、ｉＰＳＣ由来自家ドーパミン作動性前駆細胞の作製および植込みについて、臨床結果およびイメージング結果と共に報告する本研究は、治療利益の証拠を提示する。
参考文献
他の実施形態
本発明について、その詳細な記載と共に記載されたが、前出の記載は、付属の特許請求の範囲により規定される、本発明の範囲を例示することを意図するものであり、これを限定することを意図するものではないことが理解されるものとする。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内にある。

以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載の発明を記載する。
［発明１］
中脳ドーパミン作動性前駆細胞（ｍＤＡＰ）の集団を作出する方法であって、
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、好ましくは、ヒトｉＰＳＣの集団を用意するステップ；
生体マトリックスハイドロゲル支持体内の、前記領域間の分離を維持するのに十分な前記領域間の距離をとって、個別の領域内に、前記細胞集団を、領域１つ当たりの細胞約５，０００～２０，０００、好ましくは、約１０，０００個の密度で播種するステップ；および
前記ｉＰＳＣが、ｍＤＡＰへと分化するのに十分な条件下で、前記細胞を維持するステップ
を含む方法。
［発明２］
前記生体マトリックスハイドロゲル支持体が、基底膜抽出物、または合成マトリックスである、発明１に記載の方法。
［発明３］
前記細胞が、播種の前に、の前記ゲル中に懸濁させられる、発明１または２に記載の方法。
［発明４］
前記領域が、直径約２～１０ｍｍである、発明１から３のいずれか一つに記載の方法。
［発明５］
前記領域間の前記距離が、１～３ｃｍである、発明１から４のいずれか一つに記載の方法。
［発明６］
前記ｉＰＳＣが、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）およびＴＲＡ－１－６０を発現する、発明１から５のいずれか一つに記載の方法。
［発明７］
前記ｍＤＡＰが、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＬＭＸ１Ａ、および／またはＥＮ１、好ましくは、少なくとも、ＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａを含む、１つ、２つ、またはこれを超えるマーカーを発現し；任意選択で、前記ｍＤＡＰが、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、およびＮＵＲＲ１を共発現するＴＨ＋細胞である、発明１から６のいずれか一つに記載の方法。
［発明８］
前記ｉＰＳＣが、
初代細胞の集団を、対象から得るステップであって、好ましくは、前記初代細胞が、線維芽細胞、ヘアケラチノサイト、血液細胞、または骨髄間葉幹細胞（ＭＳＣ）であるステップ；
前記細胞内における、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、およびＬ－ＭＹＣの発現を誘導するステップ；ならびに
前記初代細胞が、ｉＰＳＣとなるのに十分な条件下で、前記細胞を維持するステップ
を含む方法により作出される、発明１から７のいずれか一つに記載の方法。
［発明９］
ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、およびＬ－ＭＹＣの発現を誘導するステップが、前記初代細胞に、口蹄疫ウイルスの２Ａ配列（ＯＣＴ４－Ｆ２Ａ）と連結されたヒトＯｃｔ４、ＫＬＦ４、ブタテッショウウイルスの２Ａ配列（ＳＯＸ２－Ｐ２Ａ）と連結されたＳＯＸ２、およびＬ－ＭＹＣのコード配列を含むポリシストロニックのエピソームベクターをトランスフェクトすることを含む、発明８に記載の方法。
［発明１０］
前記ｉＰＳＣが、前記細胞内で、ｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉＲ－１０６ｂ、ｍｉＲ－１３６ｓ、ｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－３０２ｓ、ｍｉＲ－３６９ｓ、およびｍｉＲ－３７１／３７３からなる群から選択される、１つまたは複数の外因性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現させるステップを含む方法により作出される、発明１から９のいずれか一つに記載の方法。
［発明１１］
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－３０２ｓおよびｍｉＲ－２００ｃの一方または両方を含む、発明１０に記載の方法。
［発明１２］
前記細胞へと、ｍｉＲ－３０２ｓおよびｍｉＲ－２００ｃをコードする配列を含むエピソームベクターを導入するステップを含む、発明１１に記載の方法。
［発明１３］
前記ｉＰＳＣが、前記初代細胞内で、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ｍｉＲ－３０２ｓおよびｍｉＲ－２００ｃの全てを発現させるステップを含む方法により作出される、発明１から１２のいずれか一つに記載の方法。
［発明１４］
前記細胞へと（ｉ）口蹄疫ウイルスの２Ａ配列（ＯＣＴ４－Ｆ２Ａ）と連結されたヒトＯｃｔ４、ＫＬＦ４、ブタテッショウウイルスの２Ａ配列（ＳＯＸ２－Ｐ２Ａ）と連結されたＳＯＸ２、およびＬ－ＭＹＣのコード配列を含むベクター、好ましくは、ウイルスベクターもしくはポリシストロニックのエピソームベクター、またはＯｃｔ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、およびＬ－ＭＹＣの成熟ＲＮＡ、または対応するタンパク質、ならびに（ｉｉ）ｍｉＲ－３０２ｓおよびｍｉＲ－２００ｃ、または成熟ｍｉＲ－３０２ｓおよび成熟ｍｉＲ－２００ｃをコードする配列を含むベクター、好ましくは、ウイルスベクターまたはエピソームベクターを導入するステップを含む、発明１３に記載の方法。
［発明１５］
前記細胞が、ヒト細胞である、発明１から１４のいずれか一つに記載の方法。
［発明１６］
好ましくは、ＢＩＲＣ５遺伝子を阻害することによる、未分化ｉＰＳＣの低減をさらに含む、発明８に記載の方法。
［発明１７］
発明１から１６に記載の方法により作製された、ｍＤＡＰを含む細胞集団。
［発明１８］
発明１７に記載の細胞集団を含む組成物。
［発明１９］
パーキンソン病（ＰＤ）を有するか、またはこれを発症する危険性がある対象を処置する方法であって、
好ましくは、ＰＤを有するか、またはこれを発症する危険性がある前記対象から初代体細胞を得、前記初代細胞から、ｉＰＳＣを作出するステップ；
好ましくは、ＳＯＸ１陽性細胞、ＫＩ６７陽性細胞、ＳＯＸ１／ＫＩ６７二重陽性細胞、ＳＯＸ１／ＰＡＸ６二重陽性細胞、およびＳＯＸ１／ＰＡＸ６／ＫＩ６７三重陽性細胞の数を低減するのに十分な時間にわたり、前記ｉＰＳＣを、ケルセチンで処理するステップ；
発明１から１６のいずれか一つに記載の方法により、ｍＤＡＰを含む細胞集団を作出するステップ；ならびに
前記細胞集団を、前記対象へと投与するステップ
を含む方法。
［発明２０］
前記細胞が、任意選択で、磁気共鳴イメージング誘導定位固定手術を使用して、前記対象の脳の罹患領域へと直接、またはこの近傍に、好ましくは、両側において、尾状核、被殻、および黒質のうちの１つまたは複数へと植え込まれることにより投与される、発明１９に記載の方法。
［発明２１］
前記細胞が、好ましくは、大脳皮質の上傍矢状部に、単一の注入地点を伴う、好ましくは、３つの注入路により、被殻の矢状方向の広がりに及ぶカラムを創出する、好ましくは、デバイスによる注射を介して投与される、発明２０に記載の方法。
［発明２２］
用量約１００万個、２００万個、３００万個、４００万個、５００万個、６００万個、７００万個、または８００万個の細胞が、投与され、好ましくは、前記細胞が、前記３つの注入路間で、均等に分割される、発明２１に記載の方法。
［発明２３］
両半球が処置され、前記細胞が、第１の処置において、第１の半球へと投与され、第２の処置において、他の半球へと投与される、発明１９から２２のいずれか一つに記載の方法。
［発明２４］
前記第１の処置と前記第２の処置との間の時間が、約２週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、１２カ月間、１８カ月間、２４カ月間、３０カ月間、３６カ月間、４８カ月間、５４カ月間、または６０カ月間である、発明２３に記載の方法。
［発明２５］
少なくとも１つの抗生剤が、手術前、手術中、および／または手術後に投与される、発明１９から２４のいずれか一つに記載の方法。
［発明２６］
前記ディッシュの裏面に、グリッド線の間の距離を１．５～２．５ｃｍとするグリッド、好ましくは、２×２ｃｍのグリッドが施される、細胞を培養するための培養ディッシュ。
［発明２７］
前記グリッドが、前記裏面にプリントまたはエッチングされた、前記ディッシュの部分として形成される、発明２６に記載の培養ディッシュ。
［発明２８］
ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、およびポリビニル製の熱可塑性樹脂を含む、発明２６に記載の培養ディッシュ。
［発明２９］
その中に配置された、生体マトリックスハイドロゲル支持体、好ましくは、基底膜抽出物、または合成マトリックスの層を含む、発明２６に記載の培養ディッシュ。

Claims (23)

  1. 中脳ドーパミン作動性前駆細胞（ｍＤＡＰ）の集団を作出する方法であって、
    人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、好ましくは、ヒトｉＰＳＣの集団を用意するステップ；
    生体マトリックスハイドロゲル支持体内の、領域間の分離を維持するのに十分な前記領域間の距離をとって、個別の領域内に、前記細胞集団を、領域１つ当たりの細胞約５，０００～２０，０００、好ましくは、約１０，０００個の密度で播種するステップであって、前記領域が、直径約２～１０ｍｍであり、かつ、前記領域間の前記距離が、１～３ｃｍである、前記ステップ；および
    前記ｉＰＳＣが、ｍＤＡＰへと分化するのに十分な条件下で、前記分離がされた領域内で前記細胞を維持するステップ
    を含む方法。
  2. 前記生体マトリックスハイドロゲル支持体が、基底膜抽出物、または合成マトリックスである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記細胞が、播種の前に、前記生体マトリックスハイドロゲル中に懸濁させられる、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ｉＰＳＣが、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）およびＴＲＡ－１－６０を発現する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ｍＤＡＰが、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＬＭＸ１Ａ、および／またはＥＮ１、好ましくは、少なくとも、ＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａを含む、１つ、２つ、またはこれを超えるマーカーを発現し；任意選択で、前記ｍＤＡＰが、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、およびＮＵＲＲ１を共発現するＴＨ＋細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記ｉＰＳＣが、
    対象由来の初代細胞の集団の細胞内における、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、およびＬ－ＭＹＣの発現を誘導するステップ；ならびに
    前記初代細胞が、ｉＰＳＣとなるのに十分な条件下で、前記細胞を維持するステップ
    を含む方法により作出される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、およびＬ－ＭＹＣの発現を誘導するステップが、前記初代細胞に、口蹄疫ウイルスの２Ａ配列（ＯＣＴ４－Ｆ２Ａ）と連結されたヒトＯｃｔ４、ＫＬＦ４、ブタテッショウウイルスの２Ａ配列（ＳＯＸ２－Ｐ２Ａ）と連結されたＳＯＸ２、およびＬ－ＭＹＣのコード配列を含むポリシストロニックのエピソームベクターをトランスフェクトすることを含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ｉＰＳＣが、対象由来の初代細胞内で、ｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉＲ－１０６ｂ、ｍｉＲ－１３６ｓ、ｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－３０２ｓ、ｍｉＲ－３６９ｓ、およびｍｉＲ－３７１／３７３からなる群から選択される、１つまたは複数の外因性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現させるステップを含む方法により作出される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－３０２ｓおよびｍｉＲ－２００ｃの一方または両方を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記細胞へと、ｍｉＲ－３０２ｓおよびｍｉＲ－２００ｃをコードする配列を含むエピソームベクターを導入するステップを含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ｉＰＳＣが、対象由来の初代細胞内で、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ｍｉＲ－３０２ｓおよびｍｉＲ－２００ｃの全てを発現させるステップを含む方法により作出される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記細胞へと（ｉ）口蹄疫ウイルスの２Ａ配列（ＯＣＴ４－Ｆ２Ａ）と連結されたヒトＯｃｔ４、ＫＬＦ４、ブタテッショウウイルスの２Ａ配列（ＳＯＸ２－Ｐ２Ａ）と連結されたＳＯＸ２、およびＬ－ＭＹＣのコード配列を含むベクター、好ましくは、ウイルスベクターもしくはポリシストロニックのエピソームベクター、またはＯｃｔ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、およびＬ－ＭＹＣの成熟ＲＮＡ、または対応するタンパク質、ならびに（ｉｉ）ｍｉＲ－３０２ｓおよびｍｉＲ－２００ｃ、または成熟ｍｉＲ－３０２ｓおよび成熟ｍｉＲ－２００ｃをコードする配列を含むベクター、好ましくは、ウイルスベクターまたはエピソームベクターを導入するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 好ましくは、ＢＩＲＣ５遺伝子を阻害することによる、未分化ｉＰＳＣの低減をさらに含む、請求項６に記載の方法。
  15. 請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法により作製された、ｍＤＡＰを含む細胞集団。
  16. 請求項１５に記載の細胞集団を含む組成物。
  17. パーキンソン病（ＰＤ）を有するか、またはこれを発症する危険性がある対象を処置する方法に使用するための医薬組成物であって、
    好ましくは、ＰＤを有するか、またはこれを発症する危険性がある前記対象から得られる初代体細胞から作出されるｉＰＳＣ（ここで、前記ｉＰＳＣは、好ましくは、ＳＯＸ１陽性細胞、ＫＩ６７陽性細胞、ＳＯＸ１／ＫＩ６７二重陽性細胞、ＳＯＸ１／ＰＡＸ６二重陽性細胞、およびＳＯＸ１／ＰＡＸ６／ＫＩ６７三重陽性細胞の数を低減するのに十分な時間にわたり、ケルセチンで処理されている）を用いて、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法により作出された、ｍＤＡＰを含む細胞集団を含む、
    前記医薬組成物。
  18. 前記医薬組成物は、前記細胞集団が、任意選択で、磁気共鳴イメージング誘導定位固定手術を使用して、前記対象の脳の罹患領域へと直接、またはこの近傍に、好ましくは、両側において、尾状核、被殻、および黒質のうちの１つまたは複数へと植え込まれることにより投与されるように用いられる、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. 前記医薬組成物は、前記細胞集団が、好ましくは、大脳皮質の上傍矢状部に、単一の注入地点を伴う、好ましくは、３つの注入路により、被殻の矢状方向の広がりに及ぶカラムを創出する、好ましくは、デバイスによる注射を介して投与されるように用いられる、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 前記医薬組成物は、用量約１００万個、２００万個、３００万個、４００万個、５００万個、６００万個、７００万個、または８００万個の細胞の前記細胞集団が、投与され、好ましくは、前記細胞集団が、前記３つの注入路間で、均等に分割されるように用いられる、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 前記医薬組成物は、両半球が処置され、前記細胞集団が、第１の処置において、第１の半球へと投与され、第２の処置において、他の半球へと投与されるように用いられる、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  22. 前記第１の処置と前記第２の処置との間の時間が、約２週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、１２カ月間、１８カ月間、２４カ月間、３０カ月間、３６カ月間、４８カ月間、５４カ月間、または６０カ月間である、請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. 前記医薬組成物は、少なくとも１つの抗生剤と組み合わせて使用され、前記抗生剤が、手術前、手術中、および／または手術後に投与されるように用いられる、請求項１７から２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
JP2021569378A 2019-05-23 2020-05-21 パーキンソン病のための自家細胞置換療法 Active JP7790973B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2025153269A JP2026012673A (ja) 2019-05-23 2025-09-16 パーキンソン病のための自家細胞置換療法

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962852008P 2019-05-23 2019-05-23
US62/852,008 2019-05-23
US201962949906P 2019-12-18 2019-12-18
US62/949,906 2019-12-18
PCT/US2020/034098 WO2020237104A1 (en) 2019-05-23 2020-05-21 Autologous cell replacement therapy for parkinson's disease

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2025153269A Division JP2026012673A (ja) 2019-05-23 2025-09-16 パーキンソン病のための自家細胞置換療法

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2022534693A JP2022534693A (ja) 2022-08-03
JPWO2020237104A5 JPWO2020237104A5 (ja) 2023-05-29
JP7790973B2 true JP7790973B2 (ja) 2025-12-23

Family

ID=73458688

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021569378A Active JP7790973B2 (ja) 2019-05-23 2020-05-21 パーキンソン病のための自家細胞置換療法
JP2025153269A Pending JP2026012673A (ja) 2019-05-23 2025-09-16 パーキンソン病のための自家細胞置換療法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2025153269A Pending JP2026012673A (ja) 2019-05-23 2025-09-16 パーキンソン病のための自家細胞置換療法

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP3972617A4 (ja)
JP (2) JP7790973B2 (ja)
KR (1) KR20220024104A (ja)
CN (1) CN114174498A (ja)
CA (1) CA3141716A1 (ja)
WO (1) WO2020237104A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112522425B (zh) * 2020-12-25 2023-11-28 武汉睿健医药科技有限公司 Dpc细胞鉴定分类用标记物基因、筛选方法及应用
EP4709398A2 (en) * 2023-05-09 2026-03-18 The McLean Hospital Corporation Intra-striatal co-transplantation of autologous treg and mda cells in parkinson's disease cell therapy
CN119120587A (zh) * 2024-09-13 2024-12-13 蚌埠医科大学 一种多巴胺能神经元祖细胞及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017511153A (ja) 2014-03-21 2017-04-20 セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド 中脳ドーパミン作動性ニューロンの生産およびその使用方法
WO2018035214A1 (en) 2016-08-16 2018-02-22 Cellular Dynamics International., Inc. Methods for differentiating pluripotent cells

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2331696A1 (en) * 2008-08-12 2011-06-15 Cellular Dynamics International, Inc. Methods for the production of ips cells
US8735116B2 (en) * 2010-09-13 2014-05-27 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration High-density spot seeding for tissue model formation
CA2836483C (en) * 2011-05-20 2020-08-18 The Mclean Hospital Corporation Neuronal progenitor cells and uses
PL3303564T3 (pl) * 2015-06-01 2022-05-09 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Metody in vitro różnicowania neuronów dopaminowych śródmózgowia (mda)
EP3320081A1 (en) * 2015-07-08 2018-05-16 Paris Sciences et Lettres - Quartier Latin Cell culture device

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017511153A (ja) 2014-03-21 2017-04-20 セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド 中脳ドーパミン作動性ニューロンの生産およびその使用方法
WO2018035214A1 (en) 2016-08-16 2018-02-22 Cellular Dynamics International., Inc. Methods for differentiating pluripotent cells

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020237104A1 (en) 2020-11-26
CA3141716A1 (en) 2020-11-26
EP3972617A1 (en) 2022-03-30
EP3972617A4 (en) 2023-06-07
US20220243174A1 (en) 2022-08-04
CN114174498A (zh) 2022-03-11
KR20220024104A (ko) 2022-03-03
JP2026012673A (ja) 2026-01-27
JP2022534693A (ja) 2022-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12305195B2 (en) Induced pluripotent cell-derived oligodendrocyte progenitor cells for the treatment of myelin disorders
JP6756786B2 (ja) 移植用中脳ドーパミン（ｄａ）ニューロン
Samata et al. Purification of functional human ES and iPSC-derived midbrain dopaminergic progenitors using LRTM1
JP6163104B2 (ja) ヒト・トロホブラスト幹細胞からの神経幹細胞の生成
JP2026012673A (ja) パーキンソン病のための自家細胞置換療法
JP6316938B2 (ja) Ｈｍｇａ２を用いて非神経細胞からリプログラミングされた誘導神経幹細胞を調製する方法
Crombie et al. Friedreich's ataxia induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes display electrophysiological abnormalities and calcium handling deficiency
JP7471084B2 (ja) 幹細胞由来星状細胞、作製方法および使用方法
JP2022088676A (ja) 幹細胞由来外胚葉系統前駆体を分化する方法
Mazzara et al. Two factor-based reprogramming of rodent and human fibroblasts into Schwann cells
KR20140004724A (ko) 전분화능을 위한 선천적 잠재력을 갖는 체세포
JP2011522520A (ja) 細胞の脱分化を行う方法
CN112839709A (zh) 治疗神经退行性疾病的神经干细胞组合物和方法
US20190322981A1 (en) Means and methods for the generation of oligodendrocytes
US20090163406A1 (en) Compositions and methods for diagnosing and treating brain cancer and identifying neural stem cells
JP2021500008A (ja) 幹細胞由来外胚葉系統前駆体を分化する方法
US20080293056A1 (en) Method for preparing cancer stem cells
US12584105B2 (en) Autologous cell replacement therapy for Parkinson's disease
Wang et al. A unique adipocyte progenitor population promotes age-related adiposity
KR101552047B1 (ko) 약 유도 시스템을 이용해 체세포를 도파민 신경세포로 직접교차분화 시키는 방법
Swartz Establishment of a human induced pluripotent stem cell derived neuromuscular co-culture system
van Essen Modelling medulloblastoma using cerebellar organoids
Bibliowicz et al. Ectopic proliferation contributes to retinal dysplasia in the juvenile zebrafish patched2 mutant eye
Pérez IDENTIFICATION OF SENESCENCE-ASSOCIATED IL6 AS A KEY COMPONENT FOR CELLULAR REPROGRAMMING
KR101552048B1 (ko) 약 유도 시스템을 이용해 혈액세포를 도파민 신경세포로 직접교차분화 시키는 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230519

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230519

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240730

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20241023

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20250106

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20250130

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20250513

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20250916

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20251030

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20251202

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20251211

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7790973

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150