JP7498468B2

JP7498468B2 - 生体高分子を認識するハイブリッド型蛍光プローブ

Info

Publication number: JP7498468B2
Application number: JP2023060076A
Authority: JP
Inventors: 隆雄日▲び▼; 凌渡辺; 亮太中; 玄伍柏▲崎▼; 隆北山
Original assignee: Kinki University; Fukui Prefectural University
Current assignee: Kinki University; Fukui Prefectural University
Priority date: 2019-02-27
Filing date: 2023-04-03
Publication date: 2024-06-12
Anticipated expiration: 2039-02-27
Also published as: JP2020139782A; JP7264344B2; JP2023110919A

Description

本発明は、糖類を含む生体高分子を高感度に蛍光認識できるハイブリッド型蛍光プローブ、それを用いた解析方法、およびそれを調製するための合成中間体に関する。

糖類は生体関連分子に広く組み込まれる重要な分子単位であり、特に単糖が２～１０個結合した糖鎖であるオリゴ糖は、腸内環境の整備など、プレバイオティクスの観点からこれまでに多くの研究が報告されており、生理活性を利用した農薬、医薬品、食品添加物等への応用が期待されている。

糖類の定量分析は、従来、（１）フェノール－硫酸法のような、強酸と処理し色素化合物に導く比色定量法（非特許文献１）、（２）Somogyi-Nelson法のような、糖による還元で色素を発色させる比色定量法（非特許文献２および３）、（３）グルコースバイオセンサーとして広く用いられている酵素法、（４）ＨＰＬＣなどクロマトグラフィー法を示差屈折率（ＲＩ）検出法など各種検出法と組み合わせた分離検出法が用いられてきたが、感度や選択的な検出の点で課題があり、いずれもハイスループットアッセイには適していななど問題があった。

また、糖を蛍光誘導体化して検出する蛍光検出法として、リン酸－フェニルヒドラジン法やアルギニン試薬法も実施されているが、糖による誘導体化の反応性の違いや反応収率の影響で再現性のある解析が難しいという課題があった。
他に、糖鎖アレイ解析も実施されているが、アレイ解析によく用いられる蛍光色素Ｃｙ３を糖類の定量に用いた場合は、定量性には優れるが、量子収率が低く、蛍光色素としては不十分なため、検出感度に難があった。

一方、タンパク質の疎水性表面検出用の蛍光プローブとして、N. Dorhらが開発したHydrophobicity (HP) Sensorは、下記の母骨格ＢＯＤＩＰＹを有する蛍光プローブで、非極性溶媒中で高い量子収率と蛍光強度を示し、水溶液中では十分に消光するという特徴を有していた（非特許文献４）。しかしながら、糖類を解析するにあたっては、溶液中での蛍光の安定性に難があり、精密な蛍光定量には適さず、またプローブとしての選択性も不十分であった。

Dubois, M. et al.: Anal. Chem., 28, 350 (1956) P. A. Shaffer, M. Somogyi: J. Biol. Chem., 100, 695 (1933) Nelson, N.: J. Biol. Chem., 153, 375 (1944) N. Dorh, et al., Sci. Reports, 5, 18337 (2015)

本発明の目的は、糖類、特にオリゴ糖を含む生体高分子を定量的に、且つ高感度に解析できる方法を提供することにある。

本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討したところ、タンパク質の解析に用いる蛍光色素の一種であるＢＯＤＩＰＹ（boron-dipyrromethene）の母骨格に水溶性を増大する置換基を導入し、更にジピロメテン骨格の５位に置換アリール基を導入することで、水溶液中ではほとんど蛍光を発しないことで知られたＢＯＤＩＰＹが、オリゴ糖と結合することで分子周辺で極性低下が生じ、その極性低下に応じて、水溶液中で強く飛躍的に安定な蛍光を発することを発見し、またアリール基の置換基として糖類選択的な官能基を導入することが可能となり、高感度で且つ各種糖類に対して選択的となり得るハイブリッド型蛍光プローブが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
［項１］
式（１）：

［式中、
Ｒ^１～Ｒ^４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミン、チオール、エポキシ、カルボン酸、カルボン酸エステル、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_３－８シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、－Ｏ－Ｃ_１－６アルキル、－Ｏ－Ｃ_２－６アルケニル、－Ｏ－Ｃ_３－８シクロアルキル、－Ｏ－アリール、－Ｏ－ヘテロアリール、－Ｏ－ヘテロシクリル、－ＮＨ－Ｃ_１－６アルキル、－Ｎ（Ｃ_１－６アルキル）_２、－ＮＨ－Ｃ_２－６アルケニル、－ＮＨ－Ｃ_３－８シクロアルキル、－ＮＨ－アリール、－ＮＨ－ヘテロアリール、－ＮＨ－ヘテロシクリル、－ＮＨＣＯ－Ｃ_１－６アルキル、－ＮＨＣＯ－Ｃ_２－６アルケニル、－ＮＨＣＯ－Ｃ_３－８シクロアルキル、－ＮＨＣＯ－アリール、－ＮＨＣＯ－ヘテロアリール、－ＮＨＣＯ－ヘテロシクリル、－ＣＯＮＨ－Ｃ_１－６アルキル、－ＣＯＮＨ－Ｃ_２－６アルケニル、－ＣＯＮＨ－Ｃ_３－８シクロアルキル、－ＣＯＮＨ－アリール、－ＣＯＮＨ－ヘテロアリール、－ＣＯＮＨ－ヘテロシクリル、－ＣＯ－Ｃ_１－６アルキル、－ＣＯ－Ｃ_２－６アルケニル、－ＣＯ－Ｃ_３－８シクロアルキル、－ＣＯ－アリール、－ＣＯ－ヘテロアリール、または－ＣＯ－ヘテロシクリルであり、ここでアルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルは、それぞれ独立して、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミン、－ＮＨ－Ｃ_１－６アルキル、－Ｎ（Ｃ_１－６アルキル）_２、カルボン酸、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルコキシ、Ｃ_３－８シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルからなる群から選択される１または２以上の置換基で置換されていてもよく、あるいはＲ^１とＲ^２、および／またはＲ^３とＲ^４が、それぞれの結合可能ないずれかの部位が結合して環を形成してもよく、および
Ｒ^５は、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミン、チオール、エポキシ、カルボン酸、カルボン酸エステル、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_２－６アルキニル、－Ｏ－Ｃ_１－６アルキル、－Ｏ－Ｃ_２－６アルケニル、－Ｏ－Ｃ_２－６アルキニル、－Ｏ－Ｃ_３－８シクロアルキル、－Ｏ－アリール、－Ｏ－ヘテロアリール、－Ｏ－ヘテロシクリル、－ＮＨ－Ｃ_１－６アルキル、－Ｎ（Ｃ_１－６アルキル）_２、－ＮＨ－Ｃ_２－６アルケニル、－ＮＨ－Ｃ_２－６アルキニル、－ＮＨ－Ｃ_３－８シクロアルキル、－ＮＨ－アリール、－ＮＨ－ヘテロアリール、－ＮＨ－ヘテロシクリル、－ＮＨＣＯ－Ｃ_１－６アルキル、－ＮＨＣＯ－Ｃ_２－６アルケニル、－ＮＨＣＯ－Ｃ_２－６アルキニル、－ＮＨＣＯ－Ｃ_３－８シクロアルキル、－ＮＨＣＯ－アリール、－ＮＨＣＯ－ヘテロアリール、－ＮＨＣＯ－ヘテロシクリル、－ＣＯＮＨ－Ｃ_１－６アルキル、－ＣＯＮＨ－Ｃ_２－６アルケニル、－ＣＯＮＨ－Ｃ_２－６アルキニル、－ＣＯＮＨ－Ｃ_３－８シクロアルキル、－ＣＯＮＨ－アリール、－ＣＯＮＨ－ヘテロアリール、－ＣＯＮＨ－ヘテロシクリル、－ＣＯ－Ｃ_１－６アルキル、－ＣＯ－Ｃ_２－６アルケニル、－ＣＯ－Ｃ_２－６アルキニル、－ＣＯ－Ｃ_３－８シクロアルキル、－ＣＯ－アリール、－ＣＯ－ヘテロアリール、または－ＣＯ－ヘテロシクリルであり、ここでアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルは、それぞれ独立して、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミン、－ＮＨ－Ｃ_１－６アルキル、－Ｎ（Ｃ_１－６アルキル）_２、カルボン酸、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルコキシ、Ｃ_３－８シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリル（ここで、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルは、更に適宜置換されていてもよいＣ_１－１２アルキル、適宜置換されていてもよいベンジル、適宜置換されていてもよいアリール、適宜置換されていてもよいヘテロアリール、または適宜置換されていてもよいヘテロシクリルで置換されていてもよい）からなる群から選択される１または２以上の置換基で置換されていてもよく、あるいは
Ｒ^５は、下式：

（式中、Ｒ^６はオリゴ糖認識構造であり、トリアゾール環の１位または３位の窒素原子に結合する）である］
の化合物またはその塩を含むプローブで、糖類をターゲットとした蛍光色素であるプローブ。

［項２］
式（１）の化合物が式（２）：

の化合物である、項１のプローブ。

［項３］
Ｒ^１およびＲ^３が水素原子である、項１または２のプローブ。

［項４］
Ｒ^２およびＲ^４がそれぞれ独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ、アミン、カルボン酸、－Ｏ－Ｃ_１－６アルキル、－Ｏ－Ｃ_２－６アルケニル、－ＮＨ－Ｃ_１－６アルキル、－Ｎ（Ｃ_１－６アルキル）_２、－ＮＨ－Ｃ_２－６アルケニル、－ＮＨＣＯ－Ｃ_１－６アルキル、－ＮＨＣＯ－Ｃ_２－６アルケニル、－ＣＯＮＨ－Ｃ_１－６アルキル、－ＣＯＮＨ－Ｃ_２－６アルケニル、－ＣＯ－Ｃ_１－６アルキル、または－ＣＯ－Ｃ_２－６アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、それぞれ独立して、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミン、－ＮＨ－Ｃ_１－６アルキル、－Ｎ（Ｃ_１－６アルキル）_２、カルボン酸、およびＣ_１－６アルコキシからなる群から選択される１または２以上の置換基で置換されていてもよい、項１～３のいずれかのプローブ。

［項５］
Ｒ^２およびＲ^４がそれぞれ独立して、－ＮＨ－Ｃ_１－６アルキレン－Ｏ－Ｃ_１－６アルキルである、項３のプローブ。

［項６］
Ｒ^２およびＲ^４が、－ＮＨ－ＣＨ_２ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３である、項５のプローブ。

［項７］
Ｒ^５が、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミン、チオール、エポキシ、－Ｏ－Ｃ_１－６アルキル、－Ｏ－Ｃ_２－６アルケニル、－Ｏ－Ｃ_２－６アルキニル、－Ｏ－Ｃ_３－８シクロアルキル、－Ｏ－アリール、－Ｏ－ヘテロアリール、－Ｏ－ヘテロシクリル、－ＮＨ－Ｃ_１－６アルキル、－Ｎ（Ｃ_１－６アルキル）_２、－ＮＨ－Ｃ_２－６アルケニル、－ＮＨ－Ｃ_２－６アルキニル、－ＮＨ－Ｃ_３－８シクロアルキル、－ＮＨ－アリール、－ＮＨ－ヘテロアリール、－ＮＨ－ヘテロシクリル、－ＮＨＣＯ－Ｃ_１－６アルキル、－ＮＨＣＯ－Ｃ_２－６アルケニル、－ＮＨＣＯ－Ｃ_２－６アルキニル、－ＮＨＣＯ－Ｃ_３－８シクロアルキル、－ＮＨＣＯ－アリール、－ＮＨＣＯ－ヘテロアリール、または－ＮＨＣＯ－ヘテロシクリル、であり、ここでアルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルは、それぞれ独立して、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミン、－ＮＨ－Ｃ_１－６アルキル、－Ｎ（Ｃ_１－６アルキル）_２、カルボン酸、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルコキシ、Ｃ_３－８シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリル（ここで、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルは、更に適宜置換されていてもよいＣ_１－１２アルキル、適宜置換されていてもよいベンジル、適宜置換されていてもよいアリール、適宜置換されていてもよいヘテロアリール、または適宜置換されていてもよいヘテロシクリルで置換されていてもよい）からなる群から選択される１または２以上の置換基で置換されていてもよい、項１～６のいずれかのプローブ。

［項８］
Ｒ^５が、水素原子、ニトロ、ヒドロキシ、アミン、チオール、エポキシ、－Ｏ－Ｃ_１－６アルキル、－Ｏ－Ｃ_２－６アルケニル、－Ｏ－Ｃ_２－６アルキニル、－Ｏ－Ｃ_３－８シクロアルキル、－Ｏ－アリール、－Ｏ－ヘテロアリール、－Ｏ－ヘテロシクリル、－ＮＨＣＯ－Ｃ_１－６アルキル、－ＮＨＣＯ－Ｃ_２－６アルケニル、－ＮＨＣＯ－Ｃ_２－６アルキニル、－ＮＨＣＯ－Ｃ_３－８シクロアルキル、－ＮＨＣＯ－アリール、－ＮＨＣＯ－ヘテロアリール、または－ＮＨＣＯ－ヘテロシクリル、であり、ここでアルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルは、それぞれ独立して、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミン、－ＮＨ－Ｃ_１－６アルキル、－Ｎ（Ｃ_１－６アルキル）_２、カルボン酸、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルコキシ、Ｃ_３－８シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリル（ここで、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルは、更に適宜置換されていてもよいＣ_１－１２アルキル、適宜置換されていてもよいベンジル、適宜置換されていてもよいアリール、適宜置換されていてもよいヘテロアリール、または適宜置換されていてもよいヘテロシクリルで置換されていてもよい）からなる群から選択される１または２以上の置換基で置換されていてもよい、項１～７のいずれかのプローブ。

［項９］
Ｒ^５が、Ｃ_２－６アルキニル、－Ｏ－Ｃ_２－６アルキニル、－ＮＨ－Ｃ_２－６アルキニル、－ＮＨＣＯ－Ｃ_２－６アルキニル、または－ＣＯ－Ｃ_２－６アルキニルである、項１～６のいずれかのプローブ。

［項１０］
Ｒ^５が下式：

（式中、Ｒ^６はオリゴ糖認識構造であり、トリアゾール環の１位または３位の窒素原子に結合する）
である、項１～６のいずれかのプローブ。

［項１１］
Ｒ^６が

のいずれかである、項１０のプローブ。

［項１２］
式（１）の化合物が、下記のいずれかである項１のプローブ。

［項１３］
式（１）の化合物が、下記のいずれかである項１のプローブ。

［項１４］
項１０または１１のいずれかのプローブを製造するために用いる式（３）または式（４）：

の合成中間体化合物。

［項１５］
ターゲットの糖類がオリゴ糖である、項１～１３のいずれかのプローブ。

［項１６］
ターゲットの糖類が生体高分子中の糖類である、項１～１３のいずれかのプローブ。

［項１７］
下記のいずれかの化合物。

［項１８］
項１～１３のいずれかに記載のプローブを用いることを特徴とする、糖類を含む生体高分子の解析方法。

本発明のプローブを酵素の多糖類分解活性や糖転移活性の高感度アッセイ系に利用することで、これまで困難であった糖代謝酵素のハイスループットアッセイを汎用的に実用化することが期待される。また、本発明の蛍光プローブにアミノ基、チオール基もしくはエポキシ基を導入することで、ガラスプレート上への固定化することで、糖結合タンパク質の特異性を評価するための高感度な糖鎖蛍光アレイを構築することができれば、糖鎖による生体認識機構の基礎的な解明だけでなく、遺伝子やアミノ酸配列に比べて変異が入りにくい糖鎖をバイオマーカーとする、プレシジョン・メディスンへの応用により、がん治療や生活習慣病予防への応用が期待される。

試験例１の結果を示す。グラフ中ｅｘは励起スペクトルの結果を示し、ｅｍは蛍光スペクトルの結果を示す。試験例３の結果を示す。ｘ軸の数値は化合物番号を示す。各溶媒溶液の蛍光強度を測定（励起波長 565 nm)し、各蛍光色素濃度＝1 μMのときの蛍光強度に補正した上で、アセトン溶液の蛍光強度に対して、エチレングリコール中（黒）および水溶液中（白）の蛍光強度変化を化合物１０（後述）のアセトン溶液中の蛍光強度を100として比較した結果を示す。試験例４の結果を示す。試験例５の結果を示す。試験例６の結果を示す。

本発明において「ハロゲン原子」の具体例としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子が挙げられる。

本発明において「Ｃ_１－６アルキル」は、炭素数１～６個を有する直鎖状もしくは分枝状の飽和炭化水素基を意味する。好ましくは、「Ｃ_１－４アルキル基」である。「Ｃ_１－６アルキル基」の具体例としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１－エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、２－エチルブチル等が挙げられる。

本発明において「Ｃ_２－６アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を含有し、鎖中に含まれる炭素原子数が２～６の脂肪族炭化水素基を意味する。「Ｃ_２－６アルケニル」の具体例としては、例えば、ビニル、アリル、１－プロペニル、１－ブテニルなどが挙げられる。

本発明において「Ｃ_２－６アルキニル」とは、炭素原子数２～６個を有し、三重結合を１個含む直鎖状又は分枝鎖状の不飽和炭化水素基を意味する。「Ｃ_２－６アルキニル」として、好ましくは「Ｃ_２－４アルキニル」が挙げられる。

本発明において「Ｃ_３－８シクロアルキル」は、３員～８員の単環式の飽和または部分不飽和の炭化水素基を意味する。好ましくは、「Ｃ_３－６シクロアルキル」である。「Ｃ_３－８シクロアルキル」の具体例としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロオクチル等が挙げられる。

本発明において「Ｃ_１－６アルコキシ」の「Ｃ_１－６アルキル」部分は、前記「Ｃ_１－６アルキル」と同義である。好ましくは、「Ｃ_１－４アルコキシ」である。「Ｃ_１－６アルコキシ」の具体例としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ等が挙げられる。

本発明において「アリール」は、通常炭素数６～１０個を有する芳香族炭化水素基を意味する。好ましくは「Ｃ_６アリール」（フェニル）である。「Ｃ_６－１０アリール」の具体例としては、例えば、フェニル、１－ナフチルまたは２－ナフチル等が挙げられる。

本発明において「ヘテロアリール」としては、例えば、５員～１０員の単環式もしくは二環式の芳香族ヘテロ環基等が挙げられ、該基は、窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選択される同種または異種のヘテロ原子を１個以上（例えば１～４個）含有する。二環式のヘテロアリール基には、前記単環式のへテロアリール基と芳香族環（ベンゼン、ピリジン等）または非芳香族環（シクロヘキサン、ピペリジン等）とが縮環したものも含む。

本発明において「ヘテロシクリル」としては、例えば、窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選択される同種または異種の原子を１～３個有する４員～１０員の単環式もしくは多環式の飽和ヘテロ環基等が挙げられる。前記窒素原子、酸素原子および硫黄原子はいずれも環を構成する原子である。該ヘテロ環基は、飽和または部分不飽和のいずれであってもよい。好ましくは飽和ヘテロ環基であり、さらに好ましくは５員もしくは６員の飽和ヘテロ環基である。具体的には、ピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフリル、アゼチジニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、アゼパニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジオキソチオモルホリニル、ヘキサメチレンイミニル、オキサゾリジニル、チアゾリジニル、オキソオキサゾリジル、ジオキソオキサゾリジニル、ジオキソチアゾリジニル、５－オキソ－１,２,４－オキサジアゾール－３－イル、５－オキソ－１,２,４－チアジアゾール－３－イル、５－チオキソ－１,２,４－オキサジアゾール－３－イル、１，２，３－トリアゾリル、１，２，４－トリアゾリル等が挙げられる。該基の結合手は、環を構成する炭素原子および窒素原子のいずれであってもよい。

本発明において「Ｃ_１－６アルキレン」は、炭素数１～６個を有する直鎖状もしくは分枝状の二価の飽和炭化水素基、または炭素数３～６個を有する環状構造を含む二価の飽和炭化水素基を意味する。

本発明において「カルボン酸エステル」としては、アルキルエステル、アルケニルエステルなど、種々のエステルを意味し、またここでのアルキル基やアルケニル基は更に種々置換されていてもよい。

本発明において「塩」とは、式（１）で表される化合物が酸性基を有する場合は、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；亜鉛塩等の無機金属塩；トリエチルアミン、トリエタノールアミン、トリヒドロキシメチルアミノメタン、アミノ酸等の有機塩基塩等が挙げられる。
式（１）で表される化合物が塩基性基を有する場合は、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩等の無機酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩等が挙げられる。

本発明において「オリゴ糖認識構造」とは、オリゴ糖に選択的に相互作用できる構造であり、本発明のＢＯＤＩＰＹ骨格からなる蛍光プローブをオリゴ糖と結びつけるはたらきを有する。本発明ではこれらに限定されないが、例えば下記の構造を有する部分構造がオリゴ糖認識構造として挙げられる。

本発明において「糖類」とは、単糖類、二糖類、多糖類など、種々のサイズの糖類を意図し、また構成される各単糖は、これらに限定されないが、グルコース、アロース、マンノース、ガラクトース、フルクトースなどの六炭糖、リボースなどの五炭糖など、種々の単糖が含まれる。
本発明において「オリゴ糖」とは、単糖が２～１０個、好ましくは３～１０個、または３～６個で構成され、それぞれがα－またはβ－グリコシド結合した糖鎖をいう。なお、構成する単糖に還元糖が必ずしも含まれる必要はない。

本発明の化合物の合成は、下記の実施例の方法やそれを一部最適化して変更した方法によって行うことができる。具体的には、各種ベンズアルデヒド誘導体を酸性条件下ピロールと反応させ、適宜クロル化して三フッ化ホウ素と反応させることで得ることができる。

また、下記の実施例で得られた下記の式（３）のアセチレン部分を有する本発明化合物（実施例における化合物５ｄ）を製造中間体として、オリゴ糖認識部位が導入されたアジ化物を反応させることで、アセチレン部分とアジド部分が環化してトリアゾール環を形成させ、オリゴ糖認識部位を有した本発明化合物を合成することができる。また、式（３）の化合物の代わりに、式（４）の化合物（実施例における化合物４ｄ）から同様の環化反応を行い、次いで置換基の変換を行い、最終化合物へと合成してもよい。これらの合成方法により、種々のオリゴ糖に選択的なオリゴ糖認識部位を導入することができ、これにより種々のオリゴ糖に適用可能なプローブを調製することが可能である。

以下に本発明を、実施例および試験例により、さらに具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、以下の実施例において示された化合物名は、必ずしもＩＵＰＡＣ命名法に従うものではない。

４－プロパルギルオキシベンズアルデヒド：化合物１ｄの合成

500 mLナスフラスコに、化合物１ｃ（3.00 g、24.6 mmol）、炭酸カリウム（13.58 g、98.3 mmol、4.00 eq.）、臭化プロパルギル（11.69 g、98.3 mmol、4.00 eq.）、アセトン（250 mL）を加え、還流下４時間撹拌した。その後室温まで冷却し、水を加えた後、反応液をエバポレーターで濃縮し、残渣をジクロロメタンで３回抽出した。その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた生成物をシリカゲル中圧カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１５／１）で分離精製し、白色固体として化合物１ｄを得た（2.94 g、収率74.7 %）。
Mp: 85.0-86.0℃.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 9.91 (1H, s, CHO at C1), 7.86 (2H, d, J = 8.8 Hz, CH at C4 and C6), 7.09 (2H, d, J = 8.8 Hz, CH at C3 and C7), 4.78 (2H, d, J = 2.4 Hz, CH₂ at C8), 2.58 (1H, s, CH at C10).

５－フェニルジピロメタン：化合物２ａの合成

100 mL 三口ナスフラスコに、0.18M ＨＣｌ水溶液（25 mL）を加え、ピロール（0.98 mL、14.1 mmol、3.0 eq.）および化合物１ａ（500 mg、4.7 mmol）をそれぞれ滴下で加え、室温で４時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝８／１）で反応終了を確認し、吸引濾過し、水とヘキサンで洗浄した。その後、得られた固体生成物をシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１５／１）で分離精製し、黄色固体として化合物２ａを得た（555 mg、収率53.0 %）。
Mp: 100.0-101.0℃.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7.91 (2H, brs, NH at N1 and N2), 7.20-7.34 (5H, m, CH at C11, C12, C13, C14 and C15) , 6.70 (2H, m, CH at C1 and C9), 6.17 (2H, dd, J = 5.9, 2.8 Hz, CH at C2 and C8), 5.92 (2H, s, CH at C3 and C7), 5.48 (1H, s, CH at C5).

５－（４－メトキシフェニル）ジピロメタン：化合物２ｂの合成

100 mL 三口ナスフラスコに、0.18M ＨＣｌ水溶液（75 mL）を加え、ピロール（2.29 mL, 33.0 mmol、3.0 eq.）および化合物１ｂ（1.50 g、11.0 mmol）をそれぞれ滴下し、室温で１５時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）で反応終了を確認し、吸引濾過し、水とヘキサンで洗浄した。その後、得られた固体生成物をシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝８／１）で分離精製し、黄色固体として化合物２ｂを得た（1.54 g、収率55.5 %）。
Mp: 99.0-100.0℃.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7.92 (2H, brs, NH, at N1 and N2), 7.13 (2H, d, J = 8.6 Hz, CH at C12 and C14), 6.85 (2H, d, J = 8.6 Hz, CH at C11 and C15), 6.70 (2H, m, CH at C1 and C9), 6.16 (2H, dd, J = 5.9, 2.8 Hz, CH at C2 and C8), 5.91 (2H, s, CH at C3 and C7), 5.44 (1H, s, CH at C5), 3.80 (3H, s, CH₃ at C16).

５－（４－ヒドロキシフェニル）ジピロメタン：化合物２ｃの合成

100 mL 三口ナスフラスコに、0.18 M ＨＣｌ水溶液（25 mL）、ピロール（0.85 mL、12.3 mmol、3.0 eq.）、ＥｔＯＨ（10 mL）に溶解した化合物１ｃ（500 mg、4.09 mmol）を加え、室温で４時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）で反応終了を確認し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で反応停止した。反応液を酢酸エチルで3回抽出し、飽和食塩水溶液で3回洗浄した。その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた生成物をシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）で分離精製し、橙色固体として化合物２ｃを得た（250 mg、収率25.6 %）。
Mp: 107.5-109.5℃.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7.92 (2H, brs, NH at N1 and N2), 7.09 (2H, d, J = 8.5 Hz, CH at C12 and C14), 6.78 (2H, d, J = 8.5 Hz, CH at C11 and C15), 6.70 (2H, m, CH at C1 and C9), 6.16 (2H, dd, J = 5.9, 2.8 Hz, CH at C2 and C8), 5.91 (2H, s, CH at C3 and C7), 5.43 (1H, s, CH at C5), 4.66 (1H, s, OH at C13).
HRMS m/z [M+Na]⁺ Calcd for C₁₅H₁₄N₂NaO⁺ 261.0998; Found 261.1003.

５－（４－プロパルギルオキシフェニル）ジピロメタン：化合物２ｄの合成

300 mL 三口ナスフラスコに、0.18 M ＨＣｌ水溶液（100 mL）を加え、ピロール（2.59 mL、37.5 mmol、3.0 eq.)、化合物１ｄ（2.00 g、12.5 mmol）を加え、室温で１５時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝４／１)で反応終了を確認し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で反応停止した。反応液を酢酸エチルで３回抽出し、飽和食塩水溶液で洗浄した。その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた生成物をシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝８／１）で分離精製し、化合物２ｄ含有の黄色ピロール／酢酸エチル溶液を得た（5.21 g（うち化合物２ｄ 2.19 g）、収率63.4%）。
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7.89 (2H, brs, NH at N1 and N2), 7.12 (2H, d, J = 8.8 Hz, CH at C12 and C14), 6.91 (2H, d, J = 8.8 Hz, CH at C11 and C15), 6.67 (2H, m, CH at C1 and C9), 6.15 (2H, q, J = 2.8 Hz, CH at C2 and C8), 5.90 (2H, s, CH at C3 and C7), 5.43 (1H, s, CH at C5), 4.66 (2H, d, J = 2.6 Hz, CH₂ at C16), 2.50 (1H, t, J = 2.5 Hz, CH at C18).

５－（４－ニトロフェニル）ジピロメタン：化合物２ｅの合成

300 mLナスフラスコに、0.18 M ＨＣｌ水溶液（50 mL）を加え、ピロール（1.37 mL, 19.9 mmol、3.0 eq.）、化合物１ｅ（1.00 g、6.62 mmol）を加え、室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）で反応終了を確認し、吸引ろ過し、水とヘキサンで洗浄し、黄色固体として化合物２ｅを得た（1.73 g、収率98.1 %）。
Mp: 157-160℃.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 8.16 (2H, d, J = 8.7 Hz, CH at C12 and C14), 8.01 (2H, brs, NH at N1 and N2), 7.36 (2H, d, J = 8.7 Hz, CH at C11 and C15), 6.75 (2H, m, CH at C1 and C9), 6.17 (2H, m, CH at C2 and C8), 5.87 (2H, m, CH at C3 and C7), 5.58 (1H, s, CH at C5).

１，９－ジクロロ－５－フェニルジピリン：化合物３ａの合成

窒素雰囲気下の300 mL 三口ナスフラスコに、化合物２ａ（400 mg、1.8 mmol）を加え、ＴＨＦ（20 mL）を加えて撹拌し、－７８℃に冷却した後、ＴＨＦ（20 mL）中のＮＣＳ（577 mg, 4.3 mmol、2.4 eq.）を滴下し、－７８℃のまま２時間撹拌した。その後、室温で更に２時間撹拌し、ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝４／１)で反応終了を確認し、更に、ＴＨＦ（15 mL）中のＤＤＱ（490 mg、2.2 mmol、1.2 eq.）を滴下し、室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝８／１）で反応終了を確認し、反応停止した。反応液をＣＨ_２Ｃｌ_２で３回抽出し、飽和食塩水溶液で３回洗浄した。その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた生成物をシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝８／１、ヘキサン／酢酸エチル＝１５／１）で、２回分離精製し、橙色固体として化合物３ａを得た（412.6 mg、収率79.3 %）。
Mp: 157-160℃.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 12.36 (1H, brs, NH at N1), 7.52-7.41 (5H, m, CH at C11, C12, C13, C14 and C15), 6.52 (2H, d, J = 4.3 Hz, CH at C2 and C8), 6.25 (2H, d, J = 4.3 Hz, CH at C3 and C7).

３，７－ジクロロ－５，５－ジフルオロ－１０－フェニル－５Ｈ－４λ ^４，５λ ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン：化合物４ａの合成

窒素雰囲気下の100 mL 三口ナスフラスコに、化合物３ａ（400 mg、1.4 mmol）を加え、ＣＨ_２Ｃｌ_２（40 mL）を加えて撹拌し、トリエチルアミン（1.2 mL、8.5 mmol、6.0 eq.）を滴下し、室温で１０分間撹拌した。その後、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯塩（1.2 mL、8.5 mmol、6.0 eq.）を滴下し、室温で２４時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝１０／１）で反応終了を確認し、反応停止した。反応液をＣＨ_２Ｃｌ_２で３回抽出し、飽和食塩水溶液で３回洗浄した。その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた生成物をシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１５／１）で分離精製し、赤色固体として化合物４ａを得た（368 mg、収率78.9 %）。
Mp: 68-71℃.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7.50-7.61 (5H, m, CH at C11, C12, C13, C14 and C15), 6.86 (2H, d, J = 4.4 Hz, CH at C2 and C8), 6.45 (2H, d, J = 4.4 Hz, CH at C3 and C7).

３，７－ジクロロ－５，５－ジフルオロ－１０－（４－メトキシフェニル）－５Ｈ－４λ ^４，５λ ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン：化合物４ｂの合成

窒素雰囲気下の300 mL 三口ナスフラスコに、化合物２ｂ（1.50 g、5.94 mmol）を加え、ＴＨＦ（30 mL）を加えて撹拌し、－７８℃に冷却した後、ＴＨＦ（70 mL）中のＮ－クロロコハク酸イミド（1.59 g、11.89 mmol、2.0 eq.）を滴下し、－７８℃のまま１時間撹拌した。その後、－２０℃で更に３時間撹拌し、ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝４／１)で反応終了を確認し、反応停止した。反応液をＣＨ_２Ｃｌ_２で３回抽出し、水で３回洗浄した。その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた残渣を更に窒素雰囲気下の300 mL 三口ナスフラスコに加え、ＣＨ_２Ｃｌ_２（50 mL）を加えて撹拌し、ＣＨ_２Ｃｌ_２（150 mL）中の２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－ｐ－ベンゾキノン（1.62 g、7.13 mmol、1.2 eq.）を滴下し、室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝６／１）で反応終了を確認した。その後、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（10 mL、57.4/1 mmol、9.7 eq.）を滴下し、更に三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯塩（10 mL、79.33 mmol、13.4 eq.）を滴下し、室温で１時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝６／１）で反応終了を確認し、反応停止した。反応液をＣＨ_２Ｃｌ_２で３回抽出し、飽和食塩水溶液で３回洗浄した。その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた生成物をシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）で分離精製し、更にヘキサン／ＣＨ_２Ｃｌ_２で再結晶し、赤褐色固体として化合物４ｂを得た（1.49 g、収率 78.9 %）。
Mp: 157-160℃.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7.46 (2H, d, J = 8.8 Hz, CH at C12 and C14), 7.04 (2H, d, J = 8.8 Hz, CH at C11 and C15), 6.89 (2H, d, J = 4.5 Hz, CH at C2 and C8), 6.44 (2H, d, J = 4.5 Hz, CH at C3 and C7), 3.91 (s, 3H, CH₃ at C16).

４－（３，７－ジクロロ－５，５－ジフルオロ－５Ｈ－４λ ^４，５λ ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－１０－イル）フェノール：化合物４ｃの合成

窒素雰囲気下の300 mL 三口ナスフラスコに、化合物２ｃ（600 mg、5.94 mmol）を加え、ＴＨＦ（15 mL）を加えて撹拌し、－７８℃に冷却した後、ＴＨＦ（40 mL）中のＮ－クロロコハク酸イミド（740 mg、5.54 mmol、2.2 eq.）を滴下し、－７８℃のまま２時間撹拌した。その後、室温で更に３時間撹拌し、ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝２／１)で反応終了を確認し、反応停止した。反応液をＣＨ_２Ｃｌ_２で３回抽出した。その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた残渣を更に窒素雰囲気下の300 mL 一口ナスフラスコに加え、ＣＨ_２Ｃｌ_２（30 mL）を加えて撹拌し、ＣＨ_２Ｃｌ_２（50 mL）中の２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－ｐ－ベンゾキノン（686 mg、3.02 mmol、1.2 eq.）を滴下し、室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝６／１)で反応終了を確認し、その後Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（4.3 mL, 25.18 mmol、10.0 eq.）を滴下し、更に、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯塩（4.4 mL, 35.25 mmol、14.0 eq.）を滴下し、室温で２４時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で反応終了を確認し、反応停止した。反応液をＣＨ_２Ｃｌ_２で３回抽出した。その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた生成物をシリカゲル中圧カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）で分離精製し、赤褐色固体として標題化合物を得た（308.4 mg、収率34.7 %）。
Mp: 223-227℃.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7.40 (2H, d, J = 8.6 Hz, CH at C12 and C14), 7.00 (2H, d, J = 8.6 Hz, CH at C11 and C15), 6.89 (2H, d, J = 4.2 Hz, CH at C2 and C8), 6.44 (2H, d, J = 4.2 Hz, CH at C3 and C7).
HRMS m/z [M+Na]⁺ Calcd for C₁₅H₉BCl₂F₂N₂NaO⁺ 375.0045; Found 375.0032.

３，７－ジクロロ－５，５－ジフルオロ－１０－（４－（プロパ－２－イン－１－イルオキシ）フェニル－５Ｈ－４λ ^４，５λ ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン：化合物４ｄの合成

窒素雰囲気下の300 mL 三口ナスフラスコに、化合物２ｄ溶液（1.58 g、5.72 mmol）を加え、ＴＨＦ（50 mL）を加えて撹拌し、－７８℃に冷却した後、ＴＨＦ（100 mL）中のＮ－クロロコハク酸イミド（1.68 g、12.6 mmol、2.2 eq.）を滴下し、－７８℃のまま１５分間撹拌した。その後、室温で更に２時間撹拌し、ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）で反応終了を確認し、反応停止した。反応液をＣＨ_２Ｃｌ_２で３回抽出した。その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた残渣を更に窒素雰囲気下の500 mL 一口ナスフラスコに加え、ＣＨ_２Ｃｌ_２（50 mL）を加えて撹拌し、ＣＨ_２Ｃｌ_２（150 mL）中の２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－ｐ－ベンゾキノン（1.56 g、6.87 mmol、1.2 eq.）を滴下し、室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝４／１)で反応終了を確認しその後、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン (7.9 mL、45.8 mmol、8.0 eq.）を滴下し、更に、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯塩（7.3 mL、57.2 mmol、10.0 eq.）を滴下し、室温で２４時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で反応終了を確認し、反応停止した。反応液をＣＨ_２Ｃｌ_２で３回抽出した。その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた生成物をシリカゲル中圧カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）で分離精製し、赤褐色固体として化合物４ｄを得た（1.78 g、収率79.5 %）。
Mp: 201-204℃.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7.46 (2H, d, J = 8.7 Hz, CH at C12 and C14), 7.12 (2H, d, J = 8.7 Hz, CH at C11 and C15), 6.89 (2H, d, J = 4.2 Hz, CH at C2 and C8), 6.44 (2H, d, J = 4.2 Hz, CH at C3 and C7), 4.79 (2H, d, J = 2.4 Hz, CH₂ at C16), 2.60 (1H, t, J = 2.4 Hz, CH at C18).

３，７－ジクロロ－５，５－ジフルオロ－１０－（４－ニトロフェニル）－５Ｈ－４λ ^４，５λ ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン：化合物４ｅの合成

窒素雰囲気下の300 mL三口ナスフラスコに、ＴＨＦ（60 mL）に溶解した化合物２ｅ（2.00 g、7.48 mmol）を加え、－７８℃に冷却し、ＴＨＦ（70 mL）中のＮＣＳ（2.51 g、18.9 mmol、2.51 eq.）を滴下し、室温で３時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）で反応終了を確認し、反応停止した。反応液をジクロロメタンで３回抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた残渣を窒素雰囲気下のフラスコに加え、ジクロロメタン（50 mL）に溶解し、ジクロロメタン（50 mL）中のＤＤＱ（2.04 g、8.98 mmol、1.20 eq.）を滴下し、室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）で反応終了を確認し、更にＤＩＰＥＡ（7.42 mL、44.9 mmol、6.00 eq.）を滴下した後に、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯塩（7.9 mL、74.8 mmol、10.0 eq.）を滴下し、室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）で反応終了を確認し、反応停止した。反応液をジクロロメタンで３回抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた生成物をシリカゲル中圧カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル／メタノール＝１０／１／０．１）で分離精製し、赤紫色固体として化合物４ｅを得た（1.57 g、収率55.1 %）。
Mp: 202-207℃.
IR (KBr): 3225, 1562, 1452, 1402, 1348, 1267, 1196, 1105 cm^-1.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 8.41 (2H, d, J = 6.8 Hz, CH at C12 and C14), 7.70 (2H, d, J = 6.8 Hz, CH at C11 and C15), 6.76 (2H, d, J = 3.5 Hz, CH at C2 and C8), 6.49 (2H, d, J = 3.5 Hz, CH at C3 and C7).

５，５－ジフルオロ－Ｎ ^３，Ｎ ^７－ビス（２－メトキシエチル）－１０－フェニル－５Ｈ－４λ ^４，５λ ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３，７－ジアミン：化合物５ａの合成

10.2 cmエース高耐圧チューブに、化合物４ａ（170 mg、0.50 mmol）を加え、ＣＨ_３ＣＮ（4 mL）を加えて撹拌し、さらに２－メトキシエチルアミン（176 μL、2.02 mmol、4.0 eq.）を加えて１００℃で２４時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で反応終了を確認後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた生成物をシリカゲル中圧カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）で分離精製し、青紫色固体として化合物５ａを得た（125 mg、収率60.0 %）。
Mp: 129-130℃.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7.38-7.48 (5H, m, CH at C11, C12, C13, C14 and C15), 6.54 (2H, d, J = 4.4 Hz, CH at C2 and C8), 5.74 (2H, d, J = 4.4 Hz, CH at C3 and C7), 5.77-5.70 (2H, brs, NH at N3 and N4), 3.59 (4H, t, J = 5.5 Hz, CH₂ at C17 and C20), 3.44 (4H, q, J = 5.5 Hz, CH₂ at C16 and C19), 3.40 (6H, s, CH₃ at C18 and C21).
¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ 156.6 (C1 and C9), 135.0 (C10), 130.4 (CH at C11 and C15), 128.9 (C4 and C6), 131.3 (C5), 128.5 (CH at C13), 128.5 (CH at C2 and C8), 127.9 (CH at C12 and C14), 101.1 (CH at C3 and C7), 71.4 (CH₂ at C17 and C20), 59.1 (CH₃ at C18 and C21), 44.3 (CH₂ at C16 and C19).
HRMS m/z [M+Na]⁺ Calcd for C₂₁H₂₅BF₂N₄NaO₂ ⁺ 437.1931; Found 437.1931.

５，５－ジフルオロ－Ｎ ^３，Ｎ ^７－ビス（２－メトキシエチル）－１０－（４－メトキシフェニル）－５Ｈ－４λ ^４，５λ ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３，７－ジアミン：化合物５ｂの合成

10.2 cmエース高耐圧チューブに、化合物４ｂ（600 mg、1.63 mmol）を加え、ＣＮ_３ＣＮ（4 mL）を加えて撹拌し、２－メトキシエチルアミン（1.2 mL、13.08 mmol、8.0 eq.）を加えて１００℃で２４時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で反応終了を確認した。その後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた生成物をシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＣＨ_２Ｃｌ_２／酢酸エチル＝３／２／１）で分離精製し、青紫色固体として化合物５ｂを得た（563 mg、収率77.6 %）。
Mp: 169-170℃.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7.38 (2H, d, J = 8.7 Hz, CH at C12 and C14), 6.94 (2H, d, J = 8.7 Hz, CH at C11 and C15), 6.56 (2H, d, J = 4.2 Hz, CH at C2 and C8), 5.74 (2H, d, J = 4.2 Hz, CH at C3 and C7), 5.77-5.70 (2H, brs, NH at N3 and N4), 3.86 (3H, s, CH₃ at C22), 3.59 (4H, t, J = 5.5 Hz, CH₂ at C17 and C20), 3.44 (4H, q, J = 5.5 Hz, CH₂ at C16 and C19), 3.40 (s, 6H, CH₃ at C18 and C21).
¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ 160.0 (C13), 156.4 (C1 and C9), 131.6 (CH at C12 and C14), 131.2 (C5), 129.0 (C4 and C6), 128.5 (CH at C2 and C8), 127.4 (C10), 113.4 (CH at C11 and C15), 100.9 (CH at C3 and C7), 71.2 (CH₂ at C17 and C20), 59.0 (CH₃ at C18 and C21), 55.3 (CH₃ at C22), 44.3 (CH₂ at C16 and C19).
HRMS m/z [M+Na]⁺ Calcd for C₂₂H₂₇BN₄O₃F₂Na⁺ 467.2036; Found 467.2050.

４－（５，５－ジフルオロ－３，７－ビス（（２－メトキシエチル）アミン）－５Ｈ－４λ ^４，５λ ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－１０－イル）フェノール：化合物５ｃの合成

10.2 cmエース高耐圧チューブに、化合物４ｃ（26.8 mg、0.076 mmol）を加え、ＣＨ_３ＣＮ（4 mL）を加えて撹拌し、２－メトキシエチルアミン（0.2 mL、2.30 mmol、30.0 eq.）を加えて１００℃で２４時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で反応終了を確認した。その後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた生成物をシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＣＨ_２Ｃｌ_２／酢酸エチル＝１／２／１）で分離精製し、青紫色固体として化合物５ｃを得た（8.2 mg、収率25.1 %）。
Mp: 129-130℃.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7.29 (2H, d, J = 8.5 Hz, CH at C12 and C14), 6.84 (2H, d, J = 8.5 Hz, CH at C11 and C15), 6.55 (2H, d, J = 4.3 Hz, CH at C2 and C8), 5.73 (2H, d, J = 4.3 Hz, CH at C3 and C7), 5.80-5.64 (2H, brs, NH at N3 and N4), 3.60 (4H, t, J = 5.4 Hz, CH₂ at C17 and C20), 3.44 (4H, m, CH₂ at C16 and C19), 3.40 (6H, s, CH₃ at C18 and C21).
¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ 156.4 (C1 and C9), 156.3 (C13), 131.7 (CH at C12 and C14), 131.2 (C5), 129.0 (C4 and C6), 128.4 (CH at C2 and C8), 127.4 (C10), 114.9 (CH at C11 and C15), 101.0 (CH at C3 and C7), 71.2 (CH₂ at C17 and C20), 59.0 (CH₃ at C18 and C21), 44.2 (CH₂ at C16 and C19).
HRMS m/z [M+Na]⁺ Calcd for C₂₁H₂₅BF₂N₄NaO₃ ⁺ 453.1880; Found 453.1841.

５，５－ジフルオロ－Ｎ ^３，Ｎ ^７－ビス（２－メトキシエチル）－１０－（４－（プロパ－２－イン－１－イルオキシ）フェニル）－５Ｈ－４λ ^４，５λ ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３，７－ジアミン：化合物５ｄの合成

10.2 cmエース高耐圧チューブに、化合物４ｄ（140 mg、0.036 mmol）を加え、ＣＨ_３ＣＮ（3 mL）を加えて撹拌し、２－メトキシエチルアミン（333 μL、2.30 mmol、10.0 eq.）を加えて１００℃で２４時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で反応終了を確認した。その後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた生成物をシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＣＨ_２Ｃｌ_２／酢酸エチル＝３／２／１）で分離精製し、青紫色固体として化合物５ｄを得た（83 mg、収率49.3 %）。
Mp: 159-162℃.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7.38 (2H, d, J = 8.7 Hz, CH at C12 and C14), 7.01 (2H, d, J = 8.7 Hz, CH at C11 and C15), 6.56 (2H, d, J = 4.2 Hz, CH at C2 and C8), 5.74 (2H, d, J = 4.2 Hz, CH at C3 and C7), 5.77-5.70 (2H, brs, NH at N3 and N4), 4.74 (2H, d, J = 2.4 Hz, CH₂ at C22), 3.59 (4H, t, J = 5.5 Hz, CH₂ at C17 and C20), 3.44 (4H, q, J = 5.5 Hz, CH₂ at C16 and C19), 3.40 (6H, s, CH₃ at C18 and C21), 2.57 (1H, s, CH at C24).
¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ 158.0 (C13), 156.5 (C1 and C9), 131.6 (CH at C12 and C14), 131.5 (C5), 130.9 (C4 and C6), 129.0 (CH at C2 and C8), 128.4 (C10), 114.3 (CH at C11 and C15), 101.0 (CH at C3 and C7), 75.8 (CH₂ at C22), 71.1 (CH₂ at C17 and C20), 59.0 (CH₃ at C18 and C21), 55.9 (CH₃ at C22), 44.3 (CH₂ at C16 and C19), 29.7 (C24).
HRMS m/z [M+Na]⁺ Calcd for C₂₄H₂₇BF₂N₄NaO₃ ⁺ 491.2036; Found 491.2036.

５，５－ジフルオロ－Ｎ ^３，Ｎ ^７－ビス（２－メトキシエチル）－１０－（４－ニトロフェニル）－５Ｈ－４λ ^４，５λ ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３，７－ジアミン：化合物５ｅの合成

10.2 cm エース高耐圧チューブに、ＣＨ_３ＣＮ（5 mL）に溶解した化合物４ｅ（200 mg、0.524 mmol）を加え、２－メトキシエチルアミン（364 μL、4.19 mmol、8.0 eq.）を滴下し、１００℃で２４時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル／ＣＨ_２Ｃｌ_２＝１／１／１）で反応終了を確認した。その後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた生成物をシリカゲルオープカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル／ＣＨ_２Ｃｌ_２＝１／１／１）で分離精製し、黒色固体として化合物５ｅをで得た（149 mg、収率62.1 %）。
Mp: 179-180℃.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 8.23 (2H, d, J = 8.8 Hz, CH at C12 and C14), 7.62 (2H, d, J = 8.8 Hz, CH at C11 and C15), 6.45 (2H, d, J = 4.4 Hz, CH at C2 and C8), 5.81 (2H, br s, NH at N3 and N4), 5.79 (2H, d, J = 4.4 Hz, CH at C3 and C7), 3.60 (4H, t, J = 5.5 Hz, CH₂ at C17 and C20), 3.45 (4H, q, J = 5.5 Hz, CH₂ at C16 and C19), 3.40 (6H, s, CH₃ at C18 and C21).
¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ 156.9 (C at C4 and C6), 148.0 (C at C13), 141.9 (C at C5), 131.2 (CH at C11 and C15), 128.5 (C at C1 and C9), 127.9 (CH at C2 and 8), 127.7 (CH at C10), 123.3 (CH at C12 and C14), 102.1 (CH at C3 and C7), 71.1 (CH₂ at C17 and C20), 59.1 (CH₃ at C18 and C21), 44.3 (CH₂ at C16 and C19).
HRMS m/z: [M+Na]⁺ Calcd for C₂₁H₂₄BN₅O₄F₂Na⁺ 482.1782; Found 482.1787.

１０－（４－アミノフェニル）－５，５－ジフルオロ－Ｎ ^３，Ｎ ^７－ビス（２－メトキシエチル）－５Ｈ－４λ ^４，５λ ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３，７－ジアミン：化合物６の合成

窒素雰囲気下の25 mLナスフラスコに、ＥｔＯＨ（10 mL）に溶解した化合物５ｅ（57.3 mg、0.125 mmol）を加え、１０分間撹拌し、ＮＨ_２ＮＨ_２・Ｈ_２Ｏ（72.8 μL、1.50 mmol、12 eq.）を滴下し、10% Ｐｄ／Ｃ（10 mol%）を加え、還流条件で３０分間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル／ＣＨ_２Ｃｌ_２＝１／１／１）で反応終了を確認し、反応停止した。10% Ｐｄ／Ｃをセライトにより除去した後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた生成物をシリカゲル中圧カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル／ＣＨ_２Ｃｌ_２＝１／１／１）で分離精製し、茶色固体として化合物６を得た（43.2 mg、収率81％）。
Mp: 69-70℃.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7.25 (2H, d, J = 8.4 Hz, CH at C12 and C14), 6.70 (2H, d, J = 8.4 Hz, CH at C11 and C15), 6.61 (2H, d, J = 4.4 Hz, CH at C2 and C8), 5.73 (2H, d, J = 4.3 Hz, CH at C3 and C7), 5.68 (2H, brs, NH at N3 and N4), 3.59 (4H, t, J = 5.4 Hz, CH₂ at C17 and C20), 3.43 (4H, m, CH₂ at C16 and C19), 3.40 (6H, s, CH₃ at C18 and C21).
¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ 156.3 (C at C1 and C9), 147.0 (C at C13), 132.0 (C at C5), 131.6 (CH at C12 and C14), 128.9 (C at C4 and C6), 128.4 (CH at C2 and C8), 125.1 (C at C10), 114.4 (CH at C11 and C15), 100.7 (CH at C3 and C7), 71.2 (CH₂ at C17 and C20), 59.0 (CH₃ at C18 and C21), 44.2 (CH₂ at C16 and C19).
HRMS m/z [M+Na]⁺ Calcd for C₂₁H₂₆BF₂N₅NaO₂ ⁺ 452.2040; Found 452.2045.

Ｎ－（４－（５，５－ジフルオロ－３，７－ビス（（２－メトキシエチル）アミノ）－５Ｈ－４λ ^４，５λ ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－１０－イル）フェニル）アセトアミド：化合物７の合成

20 mL の二口ナスフラスコに、ＣＨ_２Ｃｌ_２（20 mL）に溶解した化合物６（70 mg、0.163 mmol）を加えて氷浴にて０℃まで冷却した。溶液に無水酢酸（360 μL、3.26 mmol、20 eq.）、トリエチルアミン（341 μL、2.45 mmol、15 eq.）をそれぞれ滴下し、ＤＭＡＰ（10 mol%、2.0 mg、16.3 μmol）を加えて室温まで昇温し、２．５時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル／ＣＨ_２Ｃｌ_２＝１／２／１）で反応終了を確認し、反応停止した。溶液を酢酸エチルで３回抽出し、飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水溶液でそれぞれ洗浄した。その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥し、精製操作をせずに黒色固体として化合物７を得た（68.7 mg、収率89 %）。
Mp: 139-140℃.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7.52 (2H, d, J = 8.4 Hz, CH at C12 and C14), 7.35 (2H, d, J = 8.4 Hz, CH at C11 and C15), 7.23 (1H, br s, NH at N5), 6.51 (2H, d, J = 4.4 Hz, CH at C2 and C8), 5.75 (2H, d, J = 4.4 Hz, CH at C3 and C7 ), 5.73 (2H, brs, NH at N3 and N4), 3.58 (4H, t, J = 5.4 Hz, CH₂ at C17 and C20), 3.44 (4H, m, CH₂ at C16 and C19), 3.40 (6H, s, CH₃ at C18 and C20), 2.18 (3H, s, CH₃ at C23).
¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ 168.3 (C at C1 and C9), 156.5 (C at C13), 138.3 (C at C5), 131.1 (CH at C12 and C14), 130.9 (C at C4 and C6), 128.9 (CH at C2 and C8), 128.3 (C at C10), 119.2 (CH at C11 and C15), 101.1 (CH at C3 and C7), 71.1 (CH₂ at C17 and C20), 59.0 (CH₃ at C18 and C21), 44.2 (CH₂ at C16 and C19), 24.7 (CH₃ at C23).
HRMS m/z [M+Na]⁺ Calcd for C₂₃H₂₈BF₂N₅NaO₃ ⁺ 494.2145; Found 494.2151.

Ｎ－（４－（５，５－ジフルオロ－３，７－ビス（（２－メトキシエチル）アミノ）－５Ｈ－４λ ^４，５λ ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－１０－イル）フェニル）ヘキサナミド：化合物８の合成

200 mLの三口フラスコに、ＣＨ_２Ｃｌ_２（50 mL）に溶解した化合物６（100 mg、0.233 mmol）を加え、氷浴で０℃まで冷却した。溶液にトリエチルアミン（97.4 μL、0.699 mmol、3.0 eq.）、塩化ヘキサノイル（72.1 μL、0.466 mmol、2.0 eq.）をそれぞれ滴下し、１時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／ＣＨ_２Ｃｌ_２／酢酸エチル＝２／２／１）で反応終了を確認し、反応停止した。反応液を0.18 M ＨＣｌ（5 mL）、0.5 M ＮａＯＨ（2 mL）、飽和食塩水溶液でそれぞれ３回洗浄した。その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた生成物をシリカゲル中圧カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル／ＣＨ_２Ｃｌ_２＝３／１／２）で分離精製し、黒色固体として化合物８を得た（110.7 mg、収率90.1 %）。
Mp: 99-100℃.
IR (KBr): 3416, 3306, 3177, 3111, 2928, 2868, 1667, 1603, 1555, 1468, 1427, 1427, 1341, 1306, 1244, 1192, 1165, 1094, 1057, 1013, 966, 889, 841, 781, 679, 561, 484, 415 cm^-1.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7.57 (2H, d, J = 8.5 Hz, CH at C12 and C14), 7.40 (2H, d, J = 8.5 Hz, CH at C11 and C15), 7.22 (1H, brs, NH at N5), 6.55 (2H, d, J = 4.4 Hz, CH at C2 and C8), 5.75-5.72 (4H, m, CH at C2 and C8, NH at N3 and N4), 3.59 (4H, t, J = 5.4 Hz, CH₂ at C17 and C20), 3.46 (4H, q, J = 5.6 Hz, CH at C16 and C19), 3.40 (6H, s, CH₃ at C18 and C20), 2.39 (2H, t, J = 7.4 Hz, CH₂ at C23), 1.76 (2H, m, CH₂ at C24), 1.40-1.36 (4H, m, CH₂ at C25 and C26), 0.92 (3H, m, CH₃ at C27).
¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ 171.5 (C at C1 and C9), 156.5 (C at C13), 138.4 (C at C5), 131.1 (CH at C12 and C14), 130.8 (C at C4 and C6), 128.9 (CH at C2 and C8), 128.3 (C at C10), 119.1 (CH at C11 and C15), 101.1 (CH at C3 and C7), 71.1 (CH₂ at C17 and C20), 59.1 (CH₃ at C18 and C21), 44.2 (CH₂ at C16 and C19), 37.9 (CH₂ at C23), 31.4 (CH₂ at C25), 25.3 (CH₂ at C24), 22.4 (CH₂ at C26), 14.0 (CH₃ at C27).
HRMS m/z [M+Na]⁺ Calcd for C₂₇H₃₆BF₂N₅NaO₃ ⁺ 550.2771; Found 550.2777.

３，７－ジクロロ－５，５－ジフルオロ－１０－（４－（（ヘプチル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾル－４－イル）メトキシ）フェニル－５Ｈ－４λ ^４，５λ ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン：化合物９の合成

10 mL一口ナスフラスコに、ヘプチルアジド（16 mg、0.12 mmol、1.5 eq.)を加え、化合物４ｄ（30 mg、0.077 mmol、1.50 eq.）、ＤＭＳＯ（4.0 mL）を加え撹拌し、水（1.0 mL）に溶解したＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ（1.0 mg、5 mol%）及びアスコルビン酸ナトリウム（1.5 mg、10 mol%）を滴下し、室温で１２時間撹拌した後、同量のＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、アスコルビン酸ナトリウム混合の水溶液を加え、更に１２時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１)で反応終了を確認し、反応停止した。反応液をＡｃＯＥｔで３回抽出し、飽和食塩水溶液で３回洗浄した。その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。その後、得られた残渣をシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）で分離精製し、橙油状物として標題化合物を得た（30 mg、収率72.7 %）。
¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz): δ 7.68 (1H, s, CH at C17), 7.45 (2H, d, J = 8.4 Hz, CH at C12 and C14), 7.15 (2H, d, J = 8.4 Hz, CH at C11 and C15), 6.87 (2H, d, J = 4.2 Hz, CH at C2 and C8), 6.44 (2H, d, J = 4.2 Hz, CH at C3 and C7), 5.30 (2H, brs, NH at N3 and N4), 4.38 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH₂ at C17), 1.93 (2H, m, CH₂ at C19), 1.35-1.20 (10H, m, (CH₂)₅ at C20-24), 0.90 (3H, m, CH₃ at C25).
¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz): δ 160.7 (C13), 144.2 (C1 and C9), 143.8 (C9), 143.2 (C15), 133.6 (C5), 132.3 (CH at C2 and C8), 131.4 (CH at C11 and C15), 125.2 (C10) , 122.7 (CH at C18), 118.6 (CH at C3 and C7), 62.1 (CH₂ at C16), 50.5 (CH₂ at C19), 31.5 (CH₂), 30.2 (CH₂), 28.6 (CH₂ at C20), 26.4 (CH₂), 22.5 (CH₂), 14.0 (CH₃ at C25).
HRMS m/z [M+Na]⁺ Calcd for C₂₅H₂₆BCl₂F₂N₅NaO⁺ 554.1468; Found 554.1453.

５，５－ジフルオロ－１０－（４－（（ヘプチル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾル－４－イル）メトキシ）フェニル－Ｎ ^３，Ｎ ^７－ビス（２－メトキシエチル）－５Ｈ－４λ ^４，５λ ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３，７－ジアミン：化合物１０の合成

10.2 cmエース高耐圧チューブに、化合物９（25 mg、0.047 mmol）を加え、ＣＨ_３ＣＮ（1 mL）を加えて撹拌し、２－メトキシエチルアミン（41 μL, 0.47 mmol、10.0 eq.）を加えて１００℃で２４時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で反応終了を確認した。その後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた生成物をシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＣＨ_２Ｃｌ_２／酢酸エチル＝１／１／１）で分離精製し、青紫色油状物として化合物１０を得た（15 mg、収率53.1 %）。
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7.63 (1H, s, CH at C17), 7.38 (2H, d, J = 8.4 Hz, CH at C12 and C14), 7.03 (2H, d, J = 8.4 Hz, CH at C11 and C15), 6.55 (2H, d, J = 4.2 Hz, CH at C2 and C8), 5.74 (2H, d, J = 4.2 Hz, CH at C3 and C7), 5.71 (2H, br s, NH at N3 and N4), 5.26 (2H, s, CH₂ at C22), 4.36 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH₂ at C17), 3.59 (4H, t, J = 5.5 Hz, CH₂ at C17 and C20), 3.43 (4H, d, J = 5.5 Hz, CH₂ at C16 and C19), 3.40 (s, 6H, CH₃ at C18 and C21), 1.93 (2H, m, CH₂ at C19), 1.35-1.20 (10H, m, (CH₂)₅ at C20-24), 0.90 (3H, m, CH₃ at C25).
¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ 158.7 (C13), 156.5 (C1 and C9), 144.0 (C23), 131.7 (CH at C2 and C8), 131.6 (C12 and C14), 129.0 (C5), 128.9 (CH at C2 and C8), 127.9 (C10), 122.5 (CH at C24), 114.3 (CH at C11 and C15), 101.0 (CH at C3 and C7), 71.1 (CH₂ at C17 and C20), 62.2 (CH₂ at C22), 59.0 (CH₃ at C18 and C21), 50.5 (CH₂ at C25), 31.5 (CH₂), 30.2 (CH₂), 28.6 (CH₂ at C20), 26.4 (CH₂), 22.5 (CH₂), 14.0 (CH₃ at C31).
HRMS m/z [M+Na]⁺ Calcd for C₃₁H₄₂BF₂N₇NaO₃ ⁺ 632.3302; Found 632.3264.

１０－（４－（（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾル－４－イル）メトキシ）フェニル）－３，７－ジクロロ－５，５－ジフルオロ－５Ｈ－４λ ^４，５λ ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン：化合物１１の合成

10 mL一口ナスフラスコに、ジクロロメタン（10 mL）に溶解したヨウ化銅（3.8 mg、2 mol%）、ＤＩＰＥＡ（6.9μL、4 mol%）、酢酸（2.3μL、4 mol%）を入れ、化合物４ｄ（391 mg、1.0 mmol）、ベンジルアジド（160 mg、1.2 eq.）を加え、室温で２時間撹拌した。ＴＬＣで反応終了を確認し、反応液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。その後、得られた残渣をシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）で分離精製し、橙固体として標題化合物を得た（381 mg、収率72.6 %）。
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7.63 (1H, s, CH at C17), 7.45-7.35 (4H, m, CH at C12 and C14), 7.31 (2H, m, CH at C11 and C15), 6.86 (2H, d, J = 4.2 Hz, CH at C2 and C8), 6.40 (2H, d, J = 4.2 Hz, CH at C3 and C7), 5.56 (2H, brs, NH at N3 and N4).
¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ 160.7 (C13), 144.2 (C1 and C9), 143.9 (C5), 143.8 (C17), 134.4 (C13 and C20), 133.6 (C4 and C6), 132.3 (CH at C12 and C14), 131.5 (CH at C2 and C8), 129.2 (CH at C21 and C25), 128.9 (CH at C23), 128.2 (CH at C22 and C24), 125.2 (C10), 122.9 (CH at C18), 118.7 (CH at C3 and C7), 115.0 (CH at C11 and C15), 62.2 (CH₂ at C16), 54.4 (CH₂ at C19).
HRMS m/z [M+Na]⁺ Calcd for C₂₅H₁₈BCl₂F₂N₅NaO⁺ 546.0842; Found 546.0847.

１０－（４－（（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾル－４－イル）メトキシ）フェニル）－５，５－ジフルオロ－Ｎ ^３，Ｎ ^７－ビス（２－メトキシエチル）－５Ｈ－４λ ^４，５λ ^４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３，７－ジアミン：化合物１２の合成

10.2 cmエース高耐圧チューブに、化合物１１（200 mg、0.38 mmol）を加え、ＣＨ_３ＣＮ（3 mL）を加えて撹拌し、２－メトキシエチルアミン（332 μL、3.82 mmol、10.0 eq.）を加えて１００℃で２４時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１)で反応終了を確認した。その後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、真空乾燥した。得られた生成物をシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＣＨ_２Ｃｌ_２／酢酸エチル＝３／２／１）で分離精製し、青紫色固体として化合物１２を得た（124 mg、収率54.0 %）。
Mp: 47-48℃.
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7.56 (1H, s, CH at C17), 7.38-7.34 (5H, m, CH at C27-C31), 7.29 (2H, m, CH at C12 and C14), 7.00 (2H, d, J = 4.2 Hz, CH at C11 and C15), 6.53 (2H, d, J = 4.2 Hz, CH at C2 and C8), 5.72 (2H, d, J = 4.2 Hz, CH at C3 and C7), 5.73-5.70 (2H, brs, NH at N3 and N4), 5.22 (2H, s, CH₂ at C22), 3.58 (4H, t, J = 5.5 Hz, CH₂ at C17 and C20), 3.41 (4H, q, J = 5.5 Hz, CH₂ at C16 and C19), 3.39 (6H, s, CH₃ at C18 and C21).
¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ 158.7 (C13), 156.5 (C1 and C9), 144.4 (C23), 134.4 (C26), 131.6 (CH at C2 and C8), 130.9 (C5), 129.2 (CH at C27 and C31), 128.9 (CH at C29), 128.9 (C4 and C6), 128.9 (C5), 128.4 (CH at C28 and C30), 128.1 (CH at C12 and C14) , 127.9 (C10), 122.7 (CH at C24), 114.3 (CH at C11 and C15), 101.0 (CH at C3 and C7), 71.1 (CH₂ at C17 and C20), 62.1 (CH₂ at C22), 59.0 (CH₃ at C18 and C21), 54.3 (CH₂ at C25), 44.2 (CH₂ at C16 and C19).
HRMS m/z [M+Na]⁺ Calcd for C₃₁H₃₄BF₂N₇NaO₃ ⁺ 624.2676; Found 624.2759.

試験例１．蛍光スペクトルの測定
化合物７、８、１２を吸光度が0.05以下となるように、アセトンまたは10 mM ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（pH 7.4）、および100 mM ＮａＣｌを用いて適宜希釈し、蛍光測定に用いた。蛍光測定には、日立分光蛍光光度計FL-7000を使用した。測定は全て25℃で行い、励起スペクトルについては、蛍光波長を578 nmとし、励起波長400－700 nmを掃引して測定を行い、一方、蛍光スペクトルについては、励起波長を564 nmとして蛍光波長570－700 nmを掃引して測定した。結果を図１に示す。

試験例２．相対量子収率の測定
化合物５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄ、５ｅ、６、７、８、１０、１２の相対量子収率を測定した。
化合物５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄ、５ｅ、６、７、８、１０、１２をそれぞれ10－20 mgずつ精秤し、アセトンに溶解し、50 ml溶液を調製した。さらに、100倍希釈液を調製し、日立ダブルビーム分光光度計UV-2900を用い吸収スペクトルを測定し、各吸収極大波長におけるモル吸光係数を求めた。以降の測定に使用する各溶液の濃度は、本モル吸光係数に基づいて決定した。
化合物５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄ、５ｅ、６、７、８、１０、１２を吸光度が0.05以下となるようにアセトンを用いて適宜希釈し、蛍光測定に用いた。蛍光測定には、日立分光蛍光光度計FL-7000を使用した。測定は全て25℃で行い蛍光スペクトルについては、励起波長を543 nmとして蛍光波長550－700 nmを掃引して測定した。量子収率既知の蛍光物質としてはローダミンＢのエタノール溶液を用い、蛍光スペクトル測定を行った。量子収率φは次式に従って算出した。結果を下表に示す。
φ＝φ_標準×（A_標準/A)×(F/F_標準)×(n_アセトン ²／n_{エタノール} ²)×（D/D_標準）
ここで、φ_標準、A_標準、F_標準、D_標準はそれぞれローダミンＢの量子収率、543 nmにおける吸光度、蛍光スペクトルのピーク半値幅の面積および希釈率を、A、F、Dはそれぞれ各色素の吸光度、蛍光スペクトルのピーク半値幅の面積および希釈率を、n_アセトンとn_{エタノール}はアセトンとエタノールの屈折率を表す。

試験例３．溶媒極性の効果
予め50μMの化合物５ｄ、５ｅ、６、７、８、１０、１２のアセトン溶液を用意した。1 mlのアセトン、エチレングリコールまたは10 mM HEPES/NaOH (pH 7.4)、および100 mM NaClを25℃でインキュベートし、各アセトン溶液10μlを加え、蛍光測定に用いた。蛍光測定は、日立分光蛍光光度計FL-7000を使用し25℃で行い、励起波長を564 nmとする蛍光スペクトルを蛍光波長570－700 nmで掃引して測定し、各蛍光スペクトルに基づいて極大蛍光強度を求めた。予め測定しておいた溶液の吸光度から各濃度を求め、1μMの濃度の時の蛍光強度に補正し、アセトン溶媒中の蛍光強度を100%とした場合の、各溶媒中での相対蛍光強度を評価した。結果を図２に示す。
化合物１０と化合物１２は、黒バーと白バーが表す蛍光強度の差が最も大きく、極性変化に対する応答が鋭敏なことを示した。また、白バーが大きな負の値を示し、背景ノイズとなる水系での蛍光強度が小さいことを示した。

試験例４．化合物６によるオリゴ糖定量
予め6μＭの化合物６のアセトン溶液を用意した。各濃度のβシクロデキストリンまたはグルコースを含む10 mM HEPES/NaOH (pH 7.4)、100 mM NaCl 1 mlを25℃でインキュベートし、化合物６のアセトン溶液10μlを加え、蛍光測定に用いた。蛍光測定は、日立分光蛍光光度計FL-7000を使用し25℃で行い、励起波長を564 nmとする蛍光スペクトルを蛍光波長570-700 nmで掃引して測定し、各蛍光スペクトルに基づいて極大蛍光強度を求め、検量線を作成した。βシクロデキストリンについては良好な検量線が得られたが、グルコースについては得られなかった。

試験例５．化合物１０によるオリゴ糖定量
予め17μMの化合物１０アセトン溶液を用意した。各濃度のβシクロデキストリンまたはグルコースを含む10 mM HEPES/NaOH (pH 7.4), 100 mM NaCl 1 mlを25℃でインキュベートし、化合物１０アセトン溶液10μlを加え、蛍光測定に用いた。蛍光測定は、日立分光蛍光光度計FL-7000を使用し25℃で行い、励起波長を564 nmとする蛍光スペクトルを蛍光波長570-700 nmで掃引して測定し、各蛍光スペクトルに基づいて極大蛍光強度を求め、検量線を作成した。βシクロデキストリンについては良好な検量線が得られたが、グルコースについては得られなかった。

試験例６．化合物１２によるオリゴ糖定量
予め5μMの化合物１２アセトン溶液を用意した。各濃度のβシクロデキストリン（ナカライテスク）、マルトデキストリン(メルク)またはグルコース（和光純薬）を含む10 mM HEPES/NaOH (pH 7.4)、100 mM NaCl 1mlを25℃でインキュベートし、化合物１２アセトン溶液10μlを加え、蛍光測定に用いた。蛍光測定は、日立分光蛍光光度計FL-7000を使用し25℃で行い、励起波長を564 nmとする蛍光スペクトルを蛍光波長570-700 nmで掃引して測定し、各蛍光スペクトルに基づいて極大蛍光強度を求めた。また、タンパク質による蛍光強度への影響を確かめるため、塩化リゾチーム（ナカライテスク）を用い、同様の実験を行った。βシクロデキストリンについては良好な検量線が得られたが、グルコースについては得られなかった。リゾチームの影響は2 mg/mlでは無視できることを確認した。

Claims

式（１）：

［式中、
Ｒ^５は、水素原子、ニトロ、ヒドロキシ、アミン、－Ｏ－Ｃ_１－６アルキル、－Ｏ－Ｃ_２－６アルキニル、－ＮＨＣＯ－Ｃ_１－６アルキル、または

であり、
Ｒ^６は、Ｃ_７Ｈ_１５またはベンジルである］
の化合物またはその塩。
Ｒ^５が、水素原子、ニトロ、ヒドロキシ、アミン、－Ｏ－ＣＨ_３、－Ｏ－ＣＨ_２－Ｃ≡ＣＨ、－ＮＨＣＯ－Ｃ_１－６アルキル、または

であり、
Ｒ^６は、Ｃ_７Ｈ_１５またはベンジルである、請求項１の化合物またはその塩。
Ｒ^５が、アミン、－ＮＨＣＯ－ＣＨ_３、－ＮＨＣＯ－Ｃ_５Ｈ_１１、または

であり、
Ｒ^６は、Ｃ_７Ｈ_１５またはベンジルである、請求項１または２の化合物またはその塩。
Ｒ^５が、アミン、または

であり、
Ｒ^６は、Ｃ_７Ｈ_１５またはベンジルである、請求項１～３のいずれかの化合物またはその塩。
式（１）の化合物が、下記のいずれかである請求項１の化合物またはその塩。
式（１）の化合物が、下記のいずれかである請求項１の化合物またはその塩。
式（１）の化合物が、下記のいずれかである請求項１の化合物またはその塩。