JP7426036B2

JP7426036B2 - 認知機能障害改善剤及び認知機能障害改善用経口組成物

Info

Publication number: JP7426036B2
Application number: JP2022192634A
Authority: JP
Inventors: 裕章益崎; 士毅岡本; 育美野村; 千枝堀口; タケル松尾; 暢次朗江口; 加奈仲間
Original assignee: Sentan Pharma
Current assignee: Sentan Pharma
Priority date: 2021-12-23
Filing date: 2022-12-01
Publication date: 2024-02-01
Anticipated expiration: 2042-12-01
Also published as: JP2023094563A

Description

本発明は、認知機能障害改善剤及び認知機能障害改善用経口組成物に関する。

玄米食はインスリン抵抗性を改善し、糖尿病の発症を遅らせることが知られている。玄米には生理活性物質であるγ－オリザノールが含まれており、その多様な作用点と分子機構が明らかにされつつある。特許文献１には、γ－オリザノールが小胞体ストレスの亢進を抑制すること、インスリンの分泌を促進すること、及びグルカゴンの分泌を抑制することが開示されている。特許文献２には、γ－オリザノールが高脂肪食への嗜好性を軽減させることが開示されている。

また、特許文献３には、γ－オリザノールが視床下部における小胞体ストレスの抑制を介して肥満、脂質異常症、耐糖能不全、糖尿病、動脈硬化症及び炎症性疾患に有効であることが開示されている。特許文献４には、γ－オリザノールが脳内報酬系に作用し、ドパミン、ＧＡＢＡ及びアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の異常活性状態を是正し、アルコール依存症の治療に有用であることが開示されている。

特開２０１４－１４１４２３号公報特開２０１３－１４４６５６号公報国際公開第２０１４／０９８１９０号特開２０２０－０９３９８４号公報

特許文献３及び４に開示されたように、γ－オリザノールの脳への作用に関する知見が得られてきている。しかし、γ－オリザノールの認知機能への効果は検討されていない。認知機能が低下すると日常生活全般に様々な支障が生じるため、認知機能障害を予防又は治療する方法の確立が望まれている。特に、認知機能の低下が進行して認知症となる前の軽度認知障害（ＭｉｌｄＣｏｇｎｉｔｉｖｅＩｍｐａｉｒｍｅｎｔ；ＭＣＩ）を予防又は改善できれば、患者の生活の質の向上に貢献できる。

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、認知機能の低下を予防及び回復することができる認知機能障害改善剤及び認知機能障害改善用経口組成物を提供することを目的とする。

本発明の第１の観点に係る認知機能障害改善剤は、
γ－オリザノールを有効成分として含む。

前記γ－オリザノールを含有する生体適合性ナノ粒子をさらに含む、
こととしてもよい。

前記γ－オリザノールは、
玄米抽出物として含まれる、
こととしてもよい。

本発明の第２の観点に係る認知機能障害改善用経口組成物は、
γ－オリザノールを有効成分として含む。

本発明によれば、認知機能の低下を予防及び回復することができる。

実施例１に係るγ－オリザノール含有ナノ粒子の粒度分布を示す図である。試験例１に係るマウスの体重の経時変化を示す図である。試験例１に係る短期記憶認知試験の結果を示す図である。試験例１に係る各ｍＲＮＡの発現量を示す図である。試験例２に係るマウスの体重の経時変化を示す図である。試験例２に係る短期記憶認知試験の結果を示す図である。試験例２に係る各ｍＲＮＡの発現量を示す図である。Ａは試験例２に係る免疫組織化学的検出法を用いてＢｒｄＵ陽性新生細胞を観察したマウス脳切片を示す図である。Ｂは海馬におけるＢｒｄＵ陽性細胞数（新生細胞数）を示す図である。

本発明に係る実施の形態について図面を参照しながら説明する。なお、本発明は下記の実施の形態によって限定されるものではない。

本実施の形態に係る認知機能改善剤は、γ－オリザノールを有効成分として含む。γ－オリザノールは、米糠等の脂質に含有される生理活性物質である。γ－オリザノールは、主に米糠油及び米胚芽油より抽出することができる。認知機能改善剤は、精製又は単離されたγ－オリザノールではなく、玄米抽出物としてγ－オリザノールを含んでもよい。γ－オリザノールとして、市販のγ－オリザノールを利用することもできる。

腸管からの吸収効率及び体内滞留時間の延長等、γ－オリザノールの体内動態を改善するために、γ－オリザノールは、生体適合性ナノ粒子に含有されてもよい。生体適合性ナノ粒子の主成分は、例えば、乳化剤及び分散剤である。

乳化剤は、食品に添加できるものであれば特に限定されない。好ましくは、乳化剤として、ヒドロキシプロピルセルロース（以下、単に「ＨＰＣ」とする）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニールピロリドン、レシチン、サポニン類、ステロール類、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル及びポリソルベートが挙げられる。食品添加用ナノ粒子に用いる乳化剤は、１種類に限定されず、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。

分散剤は、食品に添加できるものであれば特に限定されない。好ましくは、分散剤として糖アルコールが用いられる。糖アルコールは、例えば、エリトリトール、グリセリン、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、ソルビトール及びキシリトール等である。糖アルコールとしては、特にＤ－マンニトールが好ましい。

生体適合性ポリマーは、生体適合性ポリエステルから製造してもよい。生体適合性ポリエステルは、例えば、Ｄ，Ｌ－ラクチド、Ｄ－ラクチド、Ｌ－ラクチド、Ｄ，Ｌ－乳酸、Ｄ－乳酸、Ｌ－乳酸、グリコリド、グリコール酸、ε－カプロラクトン、ε－ヒドロキシヘキサン酸、γ－ブチロラクトン、γ－ヒドロキシ酪酸、δ－バレロラクトン、δ－ヒドロキシ吉草酸、ヒドロキシ酪酸及びリンゴ酸等から選択される１種又はそれ以上のモノマーを重合することにより合成されるポリエステルである。

生体適合性粒子の粒径は、１０００ｎｍ未満で、例えば２．５～９００ｎｍ、好ましくは２５～５００ｎｍ、より好ましくは５０～３００ｎｍ、さらに好ましくは１００～２５０ｎｍ又は１００～１２０ｎｍである。

ナノ粒子の粒子径は、ふるい分け法、沈降法、顕微鏡法、光散乱法、レーザー回折・散乱法、電気的抵抗試験、透過型電子顕微鏡による観察、及び走査型電子顕微鏡による観察等で測定できる。ナノ粒子の粒子径は公知の粒度分布計で測定してもよい。ナノ粒子の粒子径は、測定方法に応じて、ストーク相当径、円相当径、球相当径で表すことができる。また、ナノ粒子の粒子径は、複数の粒子を測定対象として、平均で表した平均粒子径、体積平均粒子径及び面積平均粒子径等であってもよい。

例えば、上述のナノ粒子の粒子径は、レーザー回折・散乱法等の測定に基づく体積分布等から算出される平均粒子径であってもよい。具体的には、粒子の集団の全体積を１００％として累積カーブを求めたとき、その累積カーブが５０％となる点の粒子径である体積平均粒子径（５０％径；Ｄ_５０）を粒子径としてもよい。累積カーブ及びＤ_５０は、市販の粒度分布計を用いて求めることができる。

ナノ粒子の粒子径のスパン値は、好ましくは３．０以下である。スパン値は、（Ｄ_９０－Ｄ_１０）／Ｄ_５０で求められる。ここで、Ｄ_９０は上記累積カーブが９０％となる点の粒子径である９０％径である。Ｄ_１０は上記累積カーブが１０％となる点の粒子径である１０％径である。Ｄ_９０及びＤ_１０は、市販の粒度分布計を用いて求めることができる。好ましくは、ナノ粒子の粒子径のスパン値は、２．０以下である。

生体適合性ナノ粒子は、腸管（小腸）の粘膜層、腸管壁、腎臓及び脾臓に停留しやすい。該生体適合性粒子は、内包するγ－オリザノールを腸、腎臓及び脾臓等で持続して放出するのでγ－オリザノールの効率的な輸送に好適である。また、上記生体適合性ナノ粒子をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）糖で修飾してもよい。生体適合性ナノ粒子表面をＰＥＧで修飾すると、血中安定性が向上する点で好ましい。

本実施の形態に係る認知機能改善剤は公知の方法で製造できる。認知機能改善剤は有効成分としてのγ－オリザノールの他に、薬理学的に許容される他の成分を含んでいてもよい。認知機能改善剤は、例えば、γ－オリザノールと、薬理的に許容される担体とを含む。薬理的に許容される担体は、製剤素材として用いられる各種の有機担体物質又は無機担体物質である。薬理的に許容される担体は、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、又は液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤である。また、必要に応じて、認知機能改善剤に、防腐剤、抗酸化剤、着色剤及び甘味剤等の添加物が配合されてもよい。

γ－オリザノールを含有する生体適合性ナノ粒子は、水中エマルジョン法及び強制薄膜式マイクロリアクターを使用する方法等の公知の任意の方法で製造できる。強制薄膜式マイクロリアクターとしては、好ましくはＵＬＲＥＡＳＳ－１１（エム・テクニック社製）が用いられる。以下では、強制薄膜式マイクロリアクターを用いた生体適合性ナノ粒子の製造方法を例示する。

当該生体適合性ナノ粒子の製造方法は、混合ステップと、析出ステップと、を含む。混合ステップでは、Ａ液とＢ液とを薄膜流体中で混合する。例えば、Ａ液は、水又は、通常、乳化剤及び分散剤の少なくとも一方の水溶液である。Ａ液における乳化剤の濃度は、例えば、０．０１～５．０質量％、０．０５～３．０質量％、好ましくは０．１～２質量％である。Ａ液における分散剤の濃度は、例えば、０．０１～５．０質量％、０．０５～３．０質量％、好ましくは０．０８～２質量％である。

Ｂ液は、γ－オリザノールが溶解する有機溶媒を含む。有機溶媒は特に限定されないが、好ましくは、エタノール、メタノール、酢酸、１－ブタノール、２－プロパノール、１－プロパノール、ヘキサン、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン及びアセトニトリル等である。好ましくは、Ｂ液はγ－オリザノールのエタノール溶液である。Ｂ液中のγ－オリザノールの濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１～１０質量％、０．４～６質量％、０．５～４質量％又は１～３質量％である。Ｂ液は乳化剤を含んでもよい。乳化剤を含む場合、Ｂ液中の乳化剤の濃度は、０．１～２質量％、０．３～１．５質量％又は０．５～１．０質量％である。なお、必要に応じて、Ｂ液の溶媒には、エタノール以外の複数の種類の溶媒が混合されてもよい。また、Ｂ液中のγ－オリザノールとして玄米抽出物を使用してもよい。

混合ステップでは、Ａ液とＢ液とを、互いに対向して配設され、少なくとも一方が他方に対して相対的に回転する処理用面間に導入する。これにより、処理用面間に薄膜流体が形成され、Ａ液とＢ液とが混合される。

混合されたＡ液及びＢ液は薄膜流体中で反応し、γ－オリザノールを含有したナノ粒子が形成される。析出ステップでは、形成されたナノ粒子を薄膜流体中に析出させる。

本実施の形態に係る認知機能改善剤の投与経路は特に限定されない。認知機能改善剤は、外用剤、注射剤及び経口投与剤として用いられるのが好ましい。上記生体適合性ナノ粒子は、腸管での吸収効率が高いことから、認知機能改善剤は経口投与剤として用いられるのが特に好ましい。

本実施の形態に係る認知機能改善剤は、ヒト及び動物に投与される。動物としては、好ましくは哺乳類で、より具体的には、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ及びシカ等があげられる。

本実施の形態に係る認知機能改善剤は、有効成分として０．１～９９質量％、１～５０質量％、好ましくは１～２０質量％のγ－オリザノールを含む。

本実施の形態に係る認知機能改善剤の投与量は、対象の性別、年齢、体重及び症状等によって適宜決定される。当該認知機能改善剤は、γ－オリザノールが有効量となるように投与される。有効量とは、所望の結果を得るために必要なγ－オリザノールの量であり、治療又は処置する状態の進行の遅延、阻害、予防、逆転又は治癒をもたらすのに必要な量である。

当該認知機能改善剤の投与量は、典型的には、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇであり、１日に１回、又はそれ以上に分割して投与することができる。認知機能改善剤を分割して投与する場合、認知機能改善剤は、好ましくは１日に１～４回投与される。また、認知機能改善剤は、毎日、隔日、１週間に１回、隔週、１ヶ月に１回等の様々な投与頻度で投与してもよい。好ましくは、投与頻度は、医師等により容易に決定される。なお、必要に応じて、上記の範囲外の量を用いることもできる。

本実施の形態に係る認知機能改善剤は、下記試験例１に示すように、認知機能障害を予防する。また、当該認知機能改善剤は、下記試験例２に示すように、認知機能障害を改善する。したがって、認知機能改善剤は、認知機能障害の発症の予防又は改善（治療）に好適である。認知機能障害の中でも特に、軽度認知障害（ＭＣＩ）の予防及び治療に有効である。

また、下記試験例１及び試験例２に示すように、海馬のミクログリア炎症反応を抑制し、海馬における神経新生を促す。よって、別の実施の形態では、γ－オリザノールを有効成分として含む、神経新生促進剤が提供される。

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る認知機能改善剤は、認知機能の低下を予防及び回復することができる。また、γ－オリザノールを生体適合性ナノ粒子に含有させることで、低用量のγ－オリザノールで認知機能の低下を予防及び回復することができる。

また、別の実施の形態では、γ－オリザノールを有効成分として含む、認知機能改善用経口組成物が提供される。認知機能改善用経口組成物としては、具体的には、サプリメント、食品組成物、飲食品、機能性食品及び食品添加剤が挙げられる。

サプリメントの形態は、特に制限されず、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、糖衣錠、フィルム剤、トローチ剤、チュアブル剤、溶液、乳濁液及び懸濁液等の任意の形態でよい。サプリメントは、サプリメントとして通常使用される任意の成分を含んでもよい。

“機能性食品”とは、健康の維持の目的で摂取する食品又は飲料を意味し、保健機能食品である特定保健用食品、機能性表示食品、栄養機能食品、健康食品及び栄養補助食品等を含む。機能性食品としては、保健機能食品である特定保健用食品又は栄養機能食品が好ましい。なお、機能性食品として製品化する場合には、食品に用いられる様々な添加剤、具体的には、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、漂白剤、防菌防黴剤、酸味料、甘味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤及び香料等を抗炎症経口組成物に添加してもよい。

機能性食品は、食品であっても飲料であってもよく、経口で摂取できれば特に限定されない。機能性食品の態様としては、例えば、飲料、菓子、穀類加工品、練り製品、乳製品及び調味料等が挙げられる。飲料として、栄養ドリンク、清涼飲料水、紅茶及び緑茶等が例示される。菓子として、キャンデー、クッキー、錠菓、チューインガム及びゼリー等が例示される。穀類加工品麺として、パン、米飯及びビスケット等が例示される。練り製品として、ソーセージ、ハム及びかまぼこ等が例示される。乳製品として、バター及びヨーグルト等が例示される。

認知機能改善用経口組成物は、食品添加剤として食品に添加されてもよい。この場合、当該食品添加剤は、食品に添加しやすいように、ペースト剤、ゲル状剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤及び顆粒剤等であってもよい。

認知機能改善用経口組成物は、認知機能改善作用を維持する範囲で、水、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー、機能性成分及び食品添加物等を含有してもよい。認知機能改善用経口組成物は、必要に応じて上記化合物等以外の他の成分を添加して、公知の方法によって製造することができる。

認知機能改善用経口組成物は、１日の摂取量が上述の摂取量となるように１個又は複数個の容器に分けて収容されてもよく、この場合、好ましくは１個の容器に１日分の認知機能改善用経口組成物が収容される。

認知機能改善用経口組成物は、認知機能障害の治療又は予防に用いられる点において、製品として他の製品と区別することができる態様で提供される。例えば、認知機能改善用経口組成物に係る製品の包装、説明書及び宣伝物の少なくとも１つに、抗炎症作用がある旨が表示される。

別の実施の形態では、γ－オリザノールを対象に投与することにより、対象の認知機能障害を治療、改善又は予防する方法が提供される。また、別の実施の形態は、認知機能障害を治療、改善又は予防するためのγ－オリザノールの使用である。他の実施の形態では、認知機能改善剤としての使用のためのγ－オリザノールが提供される。また、別の実施の形態は、認知機能改善剤の製造のためのγ－オリザノールの使用である。

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。なお、以下では“％”は特に言及のない限り“質量％”を意味する。

（実施例１：γ－オリザノールナノ粒子の調製）
９０％質量以上でγ－オリザノールを含む粉末である玄米胚芽抽出エキス（オカヤス社製）を、ＵＬＲＥＡＳＳ－１１（エム・テクニック社製）を使用して次のようにナノ粒子化した。Ａ液をＡ液タンクに充填し、タンクを０．３ＭＰａに加圧した。その後、設定値５℃（実測値約８℃）でＡ液を３３４ｍＬ／分で送液し、次いで設定値８０℃（実測値約５３℃）でＢ液を１００ｍＬ／分で送液した。Ａ液は０．２％マルチトール、０.１％ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）を含む水溶液である。また、Ｂ液の組成は、玄米胚芽抽出エキス：ＨＰＣ：エタノールが質量比で１.５：０.８：９７.７の溶液である。ディスク回転数を５００ｒｐｍとし、ディスク背圧を０．０２ＭＰａとした。４.３Ｌの吐出液を回収し、エタノールを留去するため、エバポレーターにて２.９Ｌまで濃縮した。溶媒留去した分散液を、－８０℃で凍結し、凍結乾燥機（ＦＤ－５５０Ｒ、東京理化器械社製）で凍結乾燥し、約２５ｇのγ－オリザノール含有ナノ粒子を得た。

上記で調製したγ－オリザノール含有ナノ粒子６.９ｍｇをチューブに量りとり、ミリＱ水６.９ｍＬを加えた。ボルテックスミキサーで３０秒間撹拌後、５分間超音波処理を行った。ミリＱ水を対照とし、γ－オリザノール含有ナノ粒子の粒度分布をＮＩＫＫＩＳＯＮａｎｏｔｒａｃＷａｖｅ－ＥＸ１５０（日機装社製）で測定した。γ－オリザノール含有ナノ粒子のＤ_５０は１１６ｎｍで、スパン値が１.２であった。粒度分布を図１に示す。

上記で調製したγ－オリザノール含有ナノ粒子中の玄米胚芽抽出エキスの含有量をＨＰＬＣ（ＬＣ－２０００Ｐｌｕｓｓｅｒｉｅｓ、日本分光社製）を用いて外部標準法にて測定した。測定の結果、γ－オリザノール含有ナノ粒子の玄米胚芽抽出エキスの含有率は４２．１±０．３３ｗｔ％であった。

ＵＬＲＥＡＳＳ－１１（エム・テクニック社製）を使用して、比較例としてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）－乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ；Ｐｏｌｙ－Ｌａｃｔｉｄｅ－ｃｏ－Ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）ナノ粒子を次のように調製した。Ａ液をＡ液タンクに充填し、タンクを０．３ＭＰａに加圧した。その後、設定値４２℃（実測値約４０℃）でＡ液を１２０ｍＬ／分で送液し、次いで設定値４０℃（実測値約３０℃）でＢ液を１００ｍＬ／分で送液した。Ａ液は２％ポリビニルアルコール（ゴーセノールＥＧ－０５Ｐ、三菱ケミカル社製）を含む水溶液である。また、Ｂ液の組成は、ＰＬＧＡ：ＦＩＴＣ：アセトン：エタノールが質量比で４．０：０．２：６３．９：３１．９の溶液である。ディスク回転数を１０００ｒｐｍとし、ディスク背圧を０．０２ＭＰａとした。２．９Ｌの吐出液を回収し、有機溶媒を留去するため、エバポレーターにて１．９Ｌまで濃縮した。溶媒留去したＦＩＴＣ－ＰＬＧＡナノ粒子分散液を遠心分離し（２２０００Ｇ、３０分）、ナノ粒子を回収した。回収したナノ粒子を超純水に再分散させて再度遠心分離を行う操作を５回繰り返し、ナノ粒子を洗浄した。洗浄したナノ粒子を－８０℃で凍結し、凍結乾燥機（ＦＤ－５５０Ｒ、東京理化器械社製）で凍結乾燥し、約１５ｇのＦＩＴＣ－ＰＬＧＡナノ粒子を得た。

上記で調製したＦＩＴＣ－ＰＬＧＡナノ粒子１０ｍｇをチューブに量りとり、ミリＱ水１０ｍＬを加えた。ボルテックスミキサーで３０秒間撹拌後、５分間超音波処理を行った。ミリＱ水を対照とし、ＦＩＴＣ－ＰＬＧＡナノ粒子の粒度分布をＮＩＫＫＩＳＯＮａｎｏｔｒａｃＷａｖｅ－ＥＸ１５０（日機装社製）で測定した。得られたＦＩＴＣ－ＰＬＧＡナノ粒子はＤ_５０が２５３ｎｍで、スパン値０．９であった。

上記で調製したＦＩＴＣ－ＰＬＧＡナノ粒子のＦＩＴＣの含有量を蛍光マイクロプレートリーダー（ＩｎｆｉｎｉｔｅＭ２００Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ社製）を用いて測定した。測定の結果、ＦＩＴＣ－ＰＬＧＡナノ粒子中のＦＩＴＣの含有率は４．４±０．３ｗｔ％であった。

（試験例１：γ－オリザノール飼料摂餌による認知機能障害予防実験）
５０週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、日本ＳＬＣ社製、２４℃で１２時間／１２時間の明暗サイクルにて飼育）に４か月摂餌させ、短期記憶認知試験を行った。高脂肪食（Ｈｉｇｈｆａｔｄｉｅｔ；ＨＦＤ）群（ｎ＝９）には、高脂肪食（Ｄ１２４９２、ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓ社製）を摂餌させた。１％γ－オリザノール含有高脂肪食（ＨＦＤ－Ｏｒｚ）群（ｎ＝９）には、１％γ－オリザノール（富士フイルム和光純薬社製）を配合した高脂肪食を摂餌させた。ＨＦＤ－Ｏｒｚ群のマウスは、４か月でのγ－オリザノールの摂取量はマウス１匹あたり約３ｇである。対照として通常食（Ｌａｂｃｈｏｗｄｉｅｔ；ＬＣＤ）群（ｎ＝９）に低脂肪コントロール飼料（Ｄ１２４５０Ｊ、ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓ社製）を摂餌させた。高脂肪食、１％γ－オリザノールを含む高脂肪食及び通常食の栄養組成を表１に示す。

４か月の飼育後、短期記憶認知試験としてＹ字迷路試験及び新規物体認識探索試験を行った。Ｙ字迷路試験では、測定時間は８分間とし、空間作業記憶率（認知機能）及び自発行動量を評価した。空間作業記憶率は、３回連続で異なるアームへ進入した回数をアームへの総進入回数から１を引いた値で除した値に１００を乗じた値である。自発行動量はアームへの総進入回数である。新規物体認識探索試験では、前日に観察した物体を記憶させ、翌日に新規物体及び非新規物体に対する探索行動時間を測定し、新規物体に対する探索行動時間の割合を算出した。

短期記憶認知試験の後、短期記憶を司るマウス脳の海馬領域をマウスから回収し、ｍＲＮＡを抽出し、各種遺伝子発現変動をＱ－ＰＣＲにて測定した。測定対象の遺伝子は、Ｉｂａ１、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、Ｄｃｘ、Ｔｅｔ２、ＰＳＤ９５、ＩＬ－３及びＭＢＰとした。

Ｉｂａ１に対するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。ＴＮＦａｌｐｈａに対するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。ＩＬ－６に対するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号５及び６に示す。ＩＬ－１０に対するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号７及び８に示す。Ｄｃｘに対するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号９及び１０に示す。Ｔｅｔ２に対するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号１１及び１２に示す。ＰＳＤ９５に対するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号１３及び１４に示す。ＩＬ－３に対するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号１５及び１６に示す。ＭＢＰに対するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号１７及び１８に示す。

なお、以下のすべてのデータは平均値±標準誤差で示され、一元分散分析及びＴｕｋｅｙのｐｏｓｔ－ｈｏｃテストを用いて検定された。

（結果）
図２は、飼育期間におけるマウスの体重の推移を示す。ＬＣＤ群に比べ、ＨＦＤ群及びＨＦＤ＋Ｏｒｚ群は有意に体重が上昇した。ＨＦＤ群とＨＦＤ＋Ｏｒｚ群との間に有意差はなかった（ｎ＝９、＊：ｐ＜０．０５）。

図３はＹ字迷路試験及び新規物体認識探索試験の結果を示す。ＬＣＤ群に比べ、ＨＦＤ群で有意に空間作業記憶率が減少し、ＨＦＤ＋Ｏｒｚ群ではＨＦＤ群に比べ空間作業記憶率が有意に上昇した（ｎ＝９、＊＊：ｐ＜０．０１）。また、ＬＣＤ群に比べ、ＨＦＤ群は自発行動量が有意に減少した（ｎ＝９、＊＊：ｐ＜０．０１）。新規物体認識探索試験では、各群間に有意な差は見られなかった（Ｎ＝５）。

図４はＬＣＤ群に対する各ｍＲＮＡの発現量を示す。ＬＣＤ群に比べ、ＨＦＤ群では炎症マーカーであるＩｂａ１のｍＲＮＡ量が有意に増加したが、ＨＦＤ＋Ｏｒｚ群では増加しなかった。ＴＮＦａｌｐｈａ及びＩＬ－６等の炎症性サイトカインのｍＲＮＡ量に有意な差は見られないが、神経新生マーカーＤｃｘ及び神経幹細胞マーカーＴｅｔ２のｍＲＮＡ量はＬＣＤ群に比べてＨＦＤ＋Ｏｒｚ群において有意に増加していた。また、シナプス後膜タンパク質ＰＳＤ９５及びアストロサイト由来ＩＬ－３のｍＲＮＡ量は有意に増加し、神経のミエリン鞘校正成分ＭＢＰのｍＲＮＡ量もＬＣＤ群に比べてＨＦＤ＋Ｏｒｚ群において有意に増加した（Ｎ＝５又は６、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）。これらの結果からγ－オリザノールの摂取は海馬における炎症反応を抑制し、神経新生を惹起させると考えられた。

（試験例２：γ－オリザノール含有ナノ粒子投与による認知機能障害改善実験）
５０週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、日本ＳＬＣ社製、２４℃で１２時間／１２時間の明暗サイクルにて飼育）に上記の高脂肪食を４か月間摂餌させ、食事性肥満を誘導した。その後、実施例１で調製したγ－オリザノール含有ナノ粒子（５０ｍｇ／ｍｌ×２５０μｌ／頭又は１００ｍｇ／ｍｌ×２５０μｌ／頭）を、胃ゾンデを用いて週２回経口投与し、投与開始から１か月後又は３か月後に試験例１と同様に短期記憶認知試験を行った。５０ｍｇ／ｍｌのγ－オリザノール含有ナノ粒子を投与した群をＨＦＤ＋ＬｏｗＯｒｚ群とする。１００ｍｇ／ｍｌのγ－オリザノール含有ナノ粒子を投与した群をＨＦＤ＋ＨｉｇｈＯｒｚ群とする。ＦＩＴＣ－ＰＬＧＡナノ粒子を、胃ゾンデを用いて週２回経口投与（５０ｍｇ／ｍｌ×２５０μｌ）した群をＨＦＤ＋ＦＩＴＣ群とした。対照として通常食（ＬＣＤ）群には低脂肪コントロール飼料（Ｄ１２４５０Ｊ、ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓ社製）を摂餌させた。

短期記憶認知試験の後、マウス脳の海馬領域を回収しｍＲＮＡを抽出後、遺伝子発現変動を試験例１と同様にＱ－ＰＣＲを用いて測定した。

また、神経新生を評価するために、γ－オリザノール含有ナノ粒子を同様に週２回３か月間、経口投与したマウスに合成ヌクレオシドであるブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を３日間連続して腹腔内に投与後、脳切片を作成した。

（結果）
図５は、飼育期間におけるマウスの体重の推移を示す。ＨＦＤ＋ＦＩＴＣ群、ＨＦＤ＋ＬｏｗＯｒｚ群及びＨＦＤ＋ＨｉｇｈＯｒｚ群との間に有意差はなかった（ｎ＝６又は７）。ＬＣＤ群は、同じ週のＨＦＤ群に対して有意に体重が小さかった（＊：ｐ＜０．０５）。

図６の上段は、γ－オリザノール含有ナノ粒子を週２回経口投与した１か月後のＹ字迷路探索試験及び新規物体探索試験の結果を示す。図６の下段は、３か月後のＹ字迷路探索試験及び新規物体探索試験の結果を示す。γ－オリザノール含有ナノ粒子投与後１か月では有意な変化は見られないが、３か月後では、ＬＣＤ群に比べ、ＨＦＤ＋ＦＩＴＣ群は有意に空間作業記憶率が減少し、γ－オリザノール含有ナノ粒子を投与したＨＦＤ＋ＬｏｗＯｒｚ群及びＨＦＤ＋ＨｉｇｈＯｒｚ群は用量依存性に空間作業記憶率が有意に回復した。ＨＦＤ＋ＨｉｇｈＯｒｚ群では自発行動量もＬＣＤ群まで回復した（Ｎ＝６又は７、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１）。しかし、新規物体探索試験では、ＨＦＤ＋ＬｏｗＯｒｚ群及びＨＦＤ＋ＨｉｇｈＯｒｚ群において回復傾向はあるものの、有意な回復は見られなかった。

図７はＬＣＤ群に対する各ｍＲＮＡの発現量を示す。ＨＦＤ＋ＨｉｇｈＯｒｚ群では、Ｉｂａ１のｍＲＮＡ量が有意に増加した。ＬＣＤ群と比較してＨＦＤ＋ＦＩＴＣ群及びＨＦＤ＋ＨｉｇｈＯｒｚ群ではＴＮＦａｌｐｈａのｍＲＮ量は有意に増加したが、ＩＬ－６及びＩＬ－３のｍＲＮＡ量には有意な差はなかった。一方、ＤｃｘのｍＲＮＡ量は用量依存性に増加し、Ｔｅｔ２のｍＲＮＡ量も強い増加傾向がみられた。ＭＢＰのｍＲＮＡ発現量はγ－オリザノール含有ナノ粒子の用量依存性に増加傾向はあるものの、有意差は認められなかった。

神経新生の評価では、図８Ａに示すように、免疫組織化学的手法を用いて神経新生が盛んな海馬におけるＢｒｄＵ陽性細胞を検出し、新生細胞数を群間比較した。図８Ｂは、海馬における新生細胞数を示す。ＬＣＤ群に比べ、ＨＦＤ＋ＦＩＴＣ群はＢｒｄＵ陽性新生細胞数が減少し、γ－オリザノール含有ナノ粒子を投与したＨＦＤ＋ＬｏｗＯｒｚ群及びＨＦＤ＋ｈｉｇｈＯｒｚ群は用量依存性に新生細胞数が増加する傾向を示し、ＬＣＤ群と同等までに新生細胞数が回復した。

試験例１及び試験例２の結果から、γ－オリザノールは、ＨＦＤ誘導性高度肥満時に検出されるマウス海馬のミクログリア炎症反応を強く抑制し、むしろ海馬における神経新生を促し、結果的に認知機能障害の予防と回復に寄与する効果を有することが示された。また、ナノ粒子化γ－オリザノールの経口投与は、海馬神経新生を促し、老齢肥満マウスの認知機能障害を有意に回復させる効能を有することが示された。

本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等な発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

本発明は、認知機能の改善を目的とする医薬及び食品等に好適である。

Claims

γ－オリザノールを有効成分として含む、
認知機能障害改善剤。
前記γ－オリザノールを含有する生体適合性ナノ粒子をさらに含む、
請求項１に記載の認知機能障害改善剤。
前記γ－オリザノールは、
玄米抽出物として含まれる、
請求項１又は２に記載の認知機能障害改善剤。
γ－オリザノールを有効成分として含む、
認知機能障害改善用経口組成物。