JP7419891B2

JP7419891B2 - タンパク質安定化剤を含有するタンパク質含有製剤および臨床検査試薬

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Publication number: JP7419891B2
Application number: JP2020040855A
Authority: JP
Inventors: 裕貴鈴木; 友美子笹木; 俊輔櫻井
Original assignee: NOF Corp
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 2020-03-10
Filing date: 2020-03-10
Publication date: 2024-01-23
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Also published as: JP2021143224A

Description

本発明は、タンパク質を含有する溶液中にタンパク質安定化剤が溶解されているタンパク質含有製剤および臨床検査試薬に関する。

タンパク質は、アミノ酸が重合してできた高分子化合物であり、生物の重要な構成成分である。タンパク質は構成アミノ酸の種類や立体構造によって膨大な種類があり、それぞれが固有の機能を有する。タンパク質はその機能によって、酵素、抗体、ホルモン等に分類され、様々な産業分野で利用されている。

例えば医薬分野では、インスリン等のホルモンを利用したホルモン製剤や、抗体を応用したイマチニブ等の分子標的治療薬が製造されている。また臨床検査分野では、種々の抗体やペルオキシダーゼ等の酵素を組合せて、検体中の特定分子の存在量を測定する検査や診断を行うための臨床検査試薬が広く利用されている。
別の例として食品分野では、酵素を用いたデンプン等の分解や、パンの劣化防止などの技術が利用されているほか、酵素そのものを食品に配合することが行われている。
さらに酵素の別の応用例としては、洗浄力の増強を目的として、多糖分解酵素、タンパク質分解酵素、脂質分解酵素などを、衣類用、コンタクトレンズ用等種々の洗浄剤等に配合することが広く行われている。
タンパク質の産業利用に当たっては、その保存安定性がしばしば問題になる。その理由として、タンパク質の機能発現には構成アミノ酸の配列だけではなくその立体配置までが重要になるため、タンパク質は一般的な化合物と比較して容易に変性失活しやすいという特徴を有することが挙げられる。特に、溶液に溶解されているタンパク質は乾燥状態のタンパク質と比較して安定性が低いことが知られている。
タンパク質が変性、失活する要因としては、例えば熱、凍結、光、ｐＨ、塩濃度、酸化、容器への非特異的吸着、タンパク質の自己凝集などが挙げられる。
タンパク質が溶解している溶液を安定化させる方法としては、ウシ血清アルブミン（以後、ＢＳＡと略称する）を該溶液に添加する方法が一般的に知られている。しかし、該方法によるタンパク質の安定化効果は十分ではない。さらに、狂牛病をはじめとした感染症リスク、天然物ゆえのロット間のバラツキ（低再現性）、長期保管時のＢＳＡの凝集沈殿の発生、等々、安定化効果以外にも種々の問題が存在する。
ＢＳＡの代替として、特許文献１はアミノ酸エステルやポリアミンを、特許文献２はホスホリルコリン基を有する共重合体を、非特許文献１はアミノ酸を、非特許文献２はポリエチレングリコールを、含有するタンパク質含有溶液を開示している。

特開２００４－１０８８５０号公報特開１９９８－４５７９４号公報

Ｋ．ｓｈｉｒａｋｉ，ｅｔ．ａｌ．、「Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ」、２００２年、１３２巻、ｐ５９１－５９５ＣｌｅｌａｎｄＪＬ，ｅｔ．ａｌ．、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、１９９２年、２６７巻、ｐ１３３２７－１３３３４

しかしながら、上記のいずれの方法もタンパク質の安定化効果は不十分であり、特に、洗浄剤や臨床検査試薬を初めとしたタンパク質と界面活性剤とを共存させる条件下におけるタンパク質の安定化効果には改善の余地が大きい。そこで、本発明の課題は、界面活性剤を含有した溶液中で、タンパク質を安定に保存するためのタンパク質安定化剤が溶解しているタンパク質含有製剤および臨床検査試薬を提供することにある。

本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、驚くべきことに、重量平均分子量がそれぞれ特定の範囲となるように制御した２種の共重合体を特定の割合で含むタンパク質安定化剤を含有するタンパク質含有製剤および臨床検査試薬を用いることで上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の［１］～［２］を要旨とするものである。

［１］以下の共重合体Ａおよび共重合体Ｂを、Ａ：Ｂ＝４０：１～５：１（重量比）で含むことを特徴とするタンパク質安定化剤を含有する、タンパク質含有製剤。
共重合体Ａ：下記の式１で表される単量体ａ、及び下記の式２で表される単量体ｂを共重合して得られる共重合体であって、前記単量体ａ、単量体ｂの共重合割合がａ：ｂ＝７：３～９：１（モル比）であり、かつ重量平均分子量が４００，０００～８００，０００である共重合体。
共重合体Ｂ：下記の式１で表される単量体ａ、及び下記の式２で表される単量体ｂを共重合して得られる共重合体であって、前記単量体ａ、単量体ｂの共重合割合がａ：ｂ＝２：１～８：１（モル比）であり、重量平均分子量が１，０００，０００～１，５００，０００である共重合体。
（式１中、Ｒ^１は水素原子、またはメチル基を表す。）
（式２中、Ｒ^２は水素原子、またはメチル基を表し、Ｒ^３は炭素数２～６のアルキル基を表す。）
［２］以下の共重合体Ａおよび共重合体Ｂを、Ａ：Ｂ＝４０：１～５：１（重量比）で含むことを特徴とするタンパク質安定化剤を含有する、臨床検査試薬。
共重合体Ａ：下記の式１で表される単量体ａ、及び下記の式２で表される単量体ｂを共重合して得られる共重合体であって、前記単量体ａ、単量体ｂの共重合割合がａ：ｂ＝７：３～９：１（モル比）であり、かつ重量平均分子量が４００，０００～８００，０００である共重合体。
共重合体Ｂ：下記の式１で表される単量体ａ、及び下記の式２で表される単量体ｂを共重合して得られる共重合体であって、前記単量体ａ、単量体ｂの共重合割合がａ：ｂ＝２：１～８：１（モル比）であり、重量平均分子量が１，０００，０００～１，５００，０００である共重合体。
（式１中、Ｒ ^１は水素原子、またはメチル基を表す。）
（式２中、Ｒ ^２は水素原子、またはメチル基を表し、Ｒ ^３は炭素数２～６のアルキル基を表す。）

本発明のタンパク質安定化剤を用いると、タンパク質を溶液中で長期間にわたって安定に保存することができる。また、高いタンパク質安定化効果を有するタンパク質含有製剤を提供することができる。

以下、本発明を更に詳細に説明する。
なお、本明細書において、「（メタ）アクリル酸」とは、「アクリル酸又はメタクリル酸」を意味し、他の類似用語についても同様である。
また、本明細書において、好ましい数値範囲（例えば、含有量や重量平均分子量の範囲）を段階的に記載した場合、各下限値及び上限値は、それぞれ独立して組み合わせることができる。例えば、「好ましくは１０～１００、より好ましくは２０～９０」という記載において、「好ましい下限値：１０」と「より好ましい上限値：９０」とを組み合わせて「１０～９０」とすることができる。

＜タンパク質安定化剤＞
本発明のタンパク質安定化剤は、以下の共重合体Ａ及び共重合体Ｂを、Ａ：Ｂ＝４０：１～５：１（重量比）で含む。
共重合体Ａ：下記の式１で表される単量体ａ、及び下記の式２で表される単量体ｂを共重合して得られる共重合体であって、前記単量体ａ、単量体ｂの共重合割合がａ：ｂ＝７：３～９：１（モル比）であり、かつ重量平均分子量が４００，０００～８００，０００である共重合体。
共重合体Ｂ：下記の式１で表される単量体ａ、及び下記の式２で表される単量体ｂを共重合して得られる共重合体であって、前記単量体ａ、単量体ｂの共重合割合がａ：ｂ＝２：１～８：１（モル比）であり、重量平均分子量が１，０００，０００～１，５００，０００である共重合体。

（式１中、Ｒ^１は水素原子、またはメチル基を表す。）

（式２中、Ｒ^２は水素原子、またはメチル基を表し、Ｒ^３は炭素数２～６のアルキル基を表す。）

［共重合体Ａ］
本発明の共重合体Ａは、式１で表される単量体ａと、式２で表される単量体ｂとの共重合体である。
式１で表される単量体ａのＲ^１は水素原子又はメチル基であり、原料入手性の観点からメチル基が好ましい。
式２で表される単量体ｂのＲ^２は水素原子又はメチル基であり、共重合体の保存安定性の観点からメチル基が好ましい。
またＲ^３は炭素数２～６のアルキル基である。従って単量体ｂの具体例としては、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ペンチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル等を好ましく挙げることができる。特に、タンパク質を安定化する効果が高いため、単量体ｂは、式２においてＲ^３が炭素数３～５のアルキル基である単量体であることが好ましく、中でも（メタ）アクリル酸ブチルがより好ましく、メタクリル酸ブチルが特に好ましい。

共重合体Ａ中の単量体ａ、ｂの共重合割合は、ａ：ｂ＝７：３～９：１（モル比）である。このような範囲にすることにより、タンパク質の安定化効果が高まる。共重合体Ａ中の単量体ａ、ｂの共重合割合は、好ましくは、ａ：ｂ＝３：１～４：１（モル比）である。
なお、本発明の共重合体Ａ及び後述する共重合体Ｂにおける単量体ａ、ｂの共重合割合とは、共重合体中の単量体ａ由来の構成単位（下記式３）と、単量体ｂ由来の構成単位（下記式４）とのモル比を意味する。また前記共重合体割合は、通常、共重合体を重合する際の単量体ａ及び単量体ｂの仕込比に相当する。

上記式において、Ｒ^１は水素原子、またはメチル基を表す。

上記式において、Ｒ^２は水素原子、またはメチル基を表し、Ｒ^３は炭素数２～６のアルキル基を表す。

本発明の共重合体Ａ及びＢは、それぞれ、上記した単量体ａ由来の構成単位（上記式３）と、単量体ｂ由来の構成単位(上記式４)を含む。また、本発明の共重合体Ａ及びＢはそれぞれ、上記した単量体ａ由来の構成単位と、単量体ｂ由来の構成単位のみからなるものであってもよいし、これら以外の構成単位を含むものであってもよいが、単量体ａ由来の構成単位と、単量体ｂ由来の構成単位のみからなるものであることが好ましい。

本発明における共重合体Ａの重量平均分子量は４００，０００～８００，０００であり、５００，０００～７００，０００が好ましい。共重合体Ａの重量平均分子量を上記の範囲に調整することにより、タンパク質を安定化する効果が良好になる。
なお、共重合体Ａ及び後述する共重合体Ｂの重量平均分子量は、例えば、ＥｃｏＳＥＣシステム（東ソー株式会社製）を用いたＧＰＣ（ゲルろ過クロマトグラフィー）測定により、ポリエチレングリコール換算で求められる。

［共重合体Ｂ］
本発明の共重合体Ｂは、式１で表される単量体ａと、式２で表される単量体ｂとの共重合体である。単量体ａ及びｂの構造については、上記共重合体Ａにおいて説明したとおりであり、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３の好適な態様も同様である。ただし、重合に用いる単量体ａの種類は、共重合体ＡとＢとで同一であっても、異なっていてもよく、同様に、単量体ｂの種類は、共重合体ＡとＢとで同一であっても、異なっていてもよい。

共重合体Ｂ中の、単量体ａ、ｂの共重合割合は、ａ：ｂ＝２：１～８：１（モル比）である。このような範囲にすることにより、タンパク質を安定化する効果が良好になる。共重合体Ｂ中の、単量体ａ、ｂの共重合割合は、好ましくはａ：ｂ＝３：１～４：１（モル比）である。
上記の単量体ａ、ｂの共重合割合は、共重合体Ａ、共重合体Ｂで同一でも異なっていてもよい。

本発明における共重合体Ｂの重量平均分子量は１，０００，０００～１，５００，０００であり、１，１００，０００～１，３００，０００が好ましい。共重合体Ｂの重量平均分子量を上記の範囲に調整することにより、タンパク質の安定化効果が良好になる。

［共重合体Ａと共重合体Ｂの併用］
共重合体Ａ及び共重合体Ｂの含有量の比（Ａ：Ｂ）は、タンパク質安定化効果が良好になることから、Ａ：Ｂ＝４０：１～５：１（重量比）とすることが好ましく、Ａ：Ｂ＝３５：１～２５：１（重量比）とすることがより好ましい。
本発明では、重量平均分子量がそれぞれ前述の領域となるように制御した２種の共重合体を前述の割合で用いることにより、それぞれを単独で用いた場合と比較して、相乗的に高いタンパク質安定化効果が得られる。この原理の全容は未だ解明されていないものの、共重合体Ａ及び共重合体Ｂのポリマー分子が絡み合い、タンパク質の安定化に好適なマトリックスを形成しているためと想像される。

本発明のタンパク質安定化剤に用いられる共重合体Ａと共重合体Ｂを合計した含有量は、タンパク質含有製剤中に０．０１～５．０重量％であることが好ましく、０．１～１．０重量％であることがより好ましい。上記含有量が０．０１～５．０重量％であれば、十分なタンパク質安定化効果が得やすく、添加量に応じた効果が得られるため経済的である。なお、タンパク質含有製剤とは、後述するように、本発明のタンパク質安定化剤を含有するものであり、具体的には、タンパク質を含有する溶液中にタンパク質安定化剤が溶解されているものである。

［共重合体の製造方法］
本発明における共重合体Ａ、共重合体Ｂを得るための重合方法としては、溶液重合、塊状重合、乳化重合、懸濁重合等の公知の方法を用いることができ、例えば単量体ａおよび単量体ｂを溶媒中で重合開始剤の存在下で重合させる、ラジカル重合などの方法を採用することができる。

重合反応に用いる開始剤としては、通常用いられる開始剤ならばいずれを用いてもよく、例えば、ラジカル重合の場合には脂肪族アゾ化合物や、有機化酸化物を用いることができる。上記の重合開始剤の例としては例えば、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソジメチルヴァレロニトリル、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート、ｔ－ブチルペルオキシ－２－エチルヘキサノエート、ｔ－ブチルペルオキシピバレート、ｔ－ブチルペルオキシジイソブチレートや、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩が挙げられる。これらの重合開始剤は２種以上を混合して使用してもよい。また、重合開始剤の使用にはレドックス系のラジカル促進剤を使用してもよい。

重合温度としては、３０～８０℃が好ましく、４０～７０℃がより好ましい。また重合時間は２～７２時間が好ましい。重合反応が良好に進行するからである。さらに、重合反応を円滑に行うために溶媒を用いてもよく、該溶媒としては、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ｔ－ブタノール、ベンゼン、トルエン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、クロロホルム、またはこれらの混合溶媒を挙げることができる。

＜タンパク質含有製剤＞
本発明のタンパク質含有製剤は、上記したタンパク質安定化剤を含有する。具体的には、タンパク質含有製剤は、タンパク質を含有する溶液中にタンパク質安定化剤が溶解されているものである。タンパク質含有製剤に含有されるタンパク質は、タンパク質安定化剤によって安定化される。
本発明のタンパク質安定化剤によって安定化可能なタンパク質は特に限定されないが、免疫グロブリン、免疫グロブリン等の抗体、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β－_Ｄ－ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素、上記各タンパク質の複合体等が挙げられる。
本発明のタンパク質安定化剤は、溶液中でタンパク質と共存することによって、タンパク質の失活を防止し、その活性を長期間維持する。好ましくは、本発明のタンパク質安定化剤が溶解した水溶液中にタンパク質を溶解させて保管する。
該水溶液中にはタンパク質と本発明のタンパク質安定化剤のみが溶解していてもよく、または、タンパク質安定化剤の効果を損なわない範囲で、後述するその他の成分が含まれていてもよい。
該溶液中において、本発明のタンパク質安定化剤の濃度は０．０１～５．０質量％が好ましい。タンパク質安定化効果が良好だからである。
なお、安定化させるタンパク質の水溶液中の好ましい濃度は、対象のタンパク質の種類、及び用途によって大きく異なるため、対象とするタンパク質に合わせてその好適な濃度とすればよい。
また、タンパク質の安定化に好適な温度は－３０℃～４０℃であり、特に好ましくは０℃～３０℃である。すなわち、当該温度範囲内で、タンパク質と本発明のタンパク質安定化剤とを溶液中に共存させることにより、タンパク質を長期間安定に保管することができる。

本発明のタンパク質安定化剤は、本発明の効果を損なわない範囲で、界面活性剤を併用使用することができる。
界面活性剤としては例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミドエーテル硫酸塩、Ｎ－アシル－Ｎ－メチルタウリン酸塩、アルキルザルコシネート、アルキルアミドスルホコハク酸塩、アルキル硫酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩、Ｎ－アルキル－Ｎ，Ｎ－ジメチルオキシド等のアニオン性界面活性剤、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル等のノニオン性界面活性剤、アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン、２－アルキル－Ｎ－カルボキシメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルイミタゾリニウムベタイン、アルキルアミドプロピルベタイン、アルキルアミノジ酢酸塩等の両性界面活性剤等が挙げられる。

またさらに、本発明のタンパク質安定化剤は、本発明の効果を阻害しない範囲で、他の試薬類や化合物を併用してもよい。
これらの試薬類や化合物等としては例えば、ポリオール、ポリエーテル、安定化対象のタンパク質以外のタンパク質、有機塩類、無機塩類、緩衝液、その他の生化学試薬、防腐剤、増粘剤、有機溶剤等が挙げられる。

ポリオールとしては例えば、グルコース、スクロース等の糖類や、グリセロール、プロピレングリコール等が挙げられる。
ポリエーテルとして例えば、ポリオキシエチレングリコール等が挙げられる。
タンパク質としては例えば、血清アルブミン、ゼラチン、ムチン、カゼイン等が挙げられる。

有機塩類としては例えば、グリシン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、ヒスチジン等のアミノ酸やそれらの誘導体、及びペプチド類、及びトリスヒドロキシエチルアミノメタン等の塩基性有機化合物、エチレンジアミン四酢酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸等の有機酸が挙げられる。

無機塩類としては種々のナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、リン酸塩、硫酸塩、塩酸塩等が挙げられる。
緩衝液としては例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、各種のグッド緩衝液、グリシン緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液等が挙げられる。

その他の生化学試薬としては例えば、フラビン類、コリパーゼ等の補酵素、ヌクレオシド、ヌクレオチドなどの核酸類等が挙げられる。
防腐剤としては例えば、アジ化ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム、チメロザール、グルコン酸クロルヘキシジン、ポリヘキサメチレンビグアニド等が挙げられる。
増粘剤としては例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリオキシエチレンオキシド-ポリプロピレンオキシドブロック共重合体、無水マレイン酸-メチルビニルエーテル共重合体、（ジメチコン／ビニルジメチコン）クロスポリマー、アラビアガム等が挙げられる。
有機溶剤としては例えば、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、イソアミルアルコール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、グリセロール、フェノール等が挙げられる。

上記したタンパク質含有製剤は、例えば、コンタクトレンズ用処理液や、臨床検査試薬などとして使用することができる。
コンタクトレンズ用処理液は、上記したタンパク質安定化剤を含有するものであり、
具体的には、タンパク質を含有する溶液中にタンパク質安定化剤が溶解されているものである。コンタクトレンズ用処理液に含有されるタンパク質は、特に制限されないが、例えばコンタクトレンズの効果的な洗浄を可能とするタンパク質分解酵素などが挙げられる。本発明のコンタクトレンズ用処理液には、一般のコンタクトレンズ用処理液に使用される界面活性剤などの各種添加剤を適宜添加して使用してもよい。

臨床検査試薬は、上記したタンパク質安定化剤を含有するものであり、具体的には、タンパク質を含有する溶液中にタンパク質安定化剤が溶解されているものである。臨床検査試薬に含有されるタンパク質は、検体中の特定分子の検出に用いられるタンパク質や、測定の正確性を担保するために用いられるタンパク質であり、種々の抗体、酵素をはじめとした様々なタンパク質が挙げられる。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

＜共重合体の合成＞
実施例、及び比較例に用いる共重合体の合成のため、表１に示す３種の共重合体、すなわち、上記した共重合体Ａである共重合体１、及び上記した共重合体Ｂである共重合体２、及び３を合成した。

＜合成例１＞
２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下ＭＰＣと記載）１９．４ｇ、ブチルメタクリレート（以下ＢＭＡと記載）２．２ｇ（モノマー組成モル比：ＭＰＣ／ＢＭＡ＝８／２）を重合用ガラス製フラスコに秤量し、これに重合開始剤として２，２’－アゾビスイソブチロニトリル（以下ＡＩＢＮと記載）８６ｍｇ、及び重合溶媒として精製水３９．２ｇとエタノール３９．２ｇを加えた。反応容器内を十分に窒素置換した後、６０℃で５時間加温することで重合反応を行った。得られた反応液を氷冷し、ジエチルエーテルに滴下することで重合体を沈殿させた。沈殿を濾別し、ジエチルエーテルで洗浄した後、真空乾燥して白色固体の共重合体１を得た。
得られた共重合体１の重量平均分子量は、ＧＰＣ測定により、ポリエチレングリコール換算で６００，０００であった。

＜合成例２＞
ＭＰＣ２１．５ｇ、ＢＭＡ２．９ｇ（モノマー組成モル比：ＭＰＣ／ＢＭＡ＝７／２）を重合用ガラス製フラスコに秤量し、これに重合開始剤として２，２’－アゾビスイソブチロニトリル（以下ＡＩＢＮと記載）９６ｍｇ、及び重合溶媒として精製水３７．８ｇとエタノール３７．８ｇを加えた。反応容器内を十分に窒素置換した後、５０℃で７時間加温することで重合反応を行った。得られた反応液を氷冷し、ジエチルエーテルに滴下することで重合体を沈殿させた。沈殿を濾別し、ジエチルエーテルで洗浄した後、真空乾燥して白色固体の共重合体２を得た。
得られた共重合体２の重量平均分子量は、ＧＰＣ測定により、ポリエチレングリコール換算で１，２１０，０００であった。

＜合成例３＞
ＭＰＣ２１．８ｇ、ＢＭＡ２．６ｇ（モノマー組成モル比：ＭＰＣ／ＢＭＡ＝８／２）を重合用ガラス製フラスコに秤量し、これに重合開始剤として２，２’－アゾビスイソブチロニトリル（以下ＡＩＢＮと記載）９６ｍｇ、及び重合溶媒として精製水３９．３ｇとエタノール３９．３ｇを加えた。反応容器内を十分に窒素置換した後、５０℃で７時間加温することで重合反応を行った。得られた反応液を氷冷し、ジエチルエーテルに滴下することで重合体を沈殿させた。沈殿を濾別し、ジエチルエーテルで洗浄した後、真空乾燥して白色固体の共重合体３を得た。
得られた共重合体３の重量平均分子量は、ＧＰＣ測定により、ポリエチレングリコール換算で１，２４０，０００であった。

＜ＧＰＣ測定＞
以上合成例１～３の各共重合体のＧＰＣ測定は以下の条件で実施した。
ＧＰＣシステム：高速液体クロマトグラフィーシステムＣＣＰ＆８０２０シリーズ（東ソー株式会社製）
カラム：ＳｈｏｄｅｘＯＨｐａｋＳＢ－８０２．５ＨＱ（昭和電工株式会社製）、及びＳＢ－８０６ＨＱ（昭和電工株式会社製）を直列に接続
展開溶媒：２０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）
検出器：示差屈折率検出器、ＵＶ検出器（波長２１０ｎｍ）
分子量標準：ＥａｓｉＶｉａｌＰＥＧ／ＰＥＯ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
流速：０．５ｍＬ／分
カラム温度：４５℃
サンプル：得られた共重合体を終濃度０．１重量％となるよう展開溶媒で希釈

以上合成例１～３を表１にまとめた。

＜タンパク質安定化剤、タンパク質安定化製剤の調製＞
本発明の共重合体Ａである共重合体１、共重合体Ｂである共重合体２、または３を用いて各実施例、比較例の各タンパク質安定化剤を調製し、これらの各タンパク質安定化剤を用いて各タンパク質含有製剤を調製し、下記の通り、タンパク質安定化効果の評価試験を実施した。

［プロテアーゼ含有洗浄液の例］
（実施例１－１～１－４、比較例１－１～１－４）
本発明の共重合体Ａである共重合体１、共重合体Ｂである共重合体２、または３、及びその他成分を、表２に示す割合で配合してタンパク質含有製剤を調製し、これをプロテアーゼを含有する洗浄液モデルとした。ここで、実例１－１～１－４における安定化対象タンパク質は当該プロテアーゼである。
この洗浄液モデルを温度４０℃、湿度７０％ＲＨ（強制劣化条件）のインキュベーター内で６ヶ月間保管し、保管直前（開始日）、及び各経過日のプロテアーゼ活性を後述の方法で測定し、下記数式（１）により酵素活性残存率（％）を算出し、また酵素活性残存率の経時変化を指数関数近似し、半減期を算出した。

プロテアーゼ１：ＥｓｐｅｒａｓｅＣＬＣ（ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）
プロテアーゼ２：ＣｌｅａｒＬｅｎｓＰｒｏ（ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）

プロテアーゼ活性の測定は以下の方法で行った。
（１）検体として、洗浄液モデルの一部をサンプリングし、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５、以下同様）で１０倍希釈した。また空試験検体として超純水をトリス塩酸緩衝液で１０倍希釈した。
（２）基質液として、Ｚ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－ｐＮＡ（株式会社ペプチド研究所製）を終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるよう、ジメチルホルムアミド溶液に溶解した。
（３）反応停止液として、フェニルメチルスルホニルフルオリドを終濃度２０ｍＭとなるよう、エタノールに溶解した。
（４）試験管にトリス塩酸緩衝液２．５ｍＬ、基質液０．５ｍＬを加えて３７℃で５分間予備加温した。
（５）検体液０．１ｍＬを加えて素早くボルテックスし、３７℃で正確に１５分間加熱した。
（６）反応停止液０．１ｍＬを加えて素早くボルテックスした。
（７）４１０ｎｍにおける吸光度を測定した。この値をＡ_Ｓとする。
（８）空試験検体を用いて同様に、吸光度を測定した。この値をＡ_０とする。
（９）Ａ_Ｓ－Ａ_０をプロテアーゼ活性値とした。
結果を表３に示す。

表３から明らかな様に、各実施例は各比較例に対し、タンパク質（プロテアーゼ）の安定化効果が顕著に優れていることが分かる。なお、酵素活性残存率が経日により若干増加した値を示す場合があるが、測定誤差であると思われる。

［酵素標識抗体含有検査試薬の例］
（実施例２－１～２－３、比較例２－１～２－３）
本発明の共重合体Ａである共重合体１、共重合体Ｂである共重合体２、または３、及びその他成分を、表４に示す割合で配合してタンパク質含有製剤を調製し、これを酵素標識抗体を含有する臨床検査試薬モデルとした。ここで、実施例２－１～２－２における安定化対象タンパク質は当該酵素標識抗体である。
この洗浄液モデルを温度２５℃（室温条件）のインキュベーター内で１６日間保管し、保管直前（開始日）、及び各経過日のペルオキシダーゼ活性を後述の方法で測定し、下記数式（２）により酵素活性残存率（％）を算出し、また酵素活性残存率の経時変化を指数関数近似し、半減期を算出した。

酵素標識抗体：ＧｏａｔＡｎｔｉ－ＭｏｕｓｅＩｇＧ（Ｈ+Ｌ）－ＨＲＰＣｏｎｊｕｇａｔｅ（ＢｉｏＲａｄ社、ＣＡＴＮＯ．１７０６５１６）

ペルオキシダーゼ活性の測定は以下の方法で行った。
（１）検査試薬モデルから８μＬをサンプリングし、９６ウェルプレートに移した。
（２）３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン溶液（ＳｅｒａＣａｒｅ社製、ＣＡＴＮＯ．５１２０－００４７）を１００μＬ添加し、室温で正確に７分間反応させた。
（３）１Ｍの硫酸を５０μＬ加え、反応を停止させた。
（４）マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ３、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ社製）を用いて波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
（５）得られた吸光度測定値をペルオキシダーゼ活性値とした。
結果を表５に示す。

表５から明らかなように、各実施例は各比較例に対し、タンパク質（酵素標識抗体）の安定化効果が顕著に優れていることが分かる。なお、酵素活性残存率が経日により若干増加した値を示す場合があるが、測定誤差であると思われる。
以上の実施例により、本発明により、界面活性剤を含有した溶液中でタンパク質を安定に保存するためのタンパク質安定化剤を提供できること、また該タンパク質安定化剤が溶解しているタンパク質含有製剤を提供できることが示された。

Claims

以下の共重合体Ａおよび共重合体Ｂを、Ａ：Ｂ＝４０：１～５：１（重量比）で含むことを特徴とするタンパク質安定化剤を含有する、タンパク質含有製剤。
共重合体Ａ：下記の式１で表される単量体ａ、及び下記の式２で表される単量体ｂを共重合して得られる共重合体であって、前記単量体ａ、単量体ｂの共重合割合がａ：ｂ＝７：３～９：１（モル比）であり、かつ重量平均分子量が４００，０００～８００，０００である共重合体。
共重合体Ｂ：下記の式１で表される単量体ａ、及び下記の式２で表される単量体ｂを共重合して得られる共重合体であって、前記単量体ａ、単量体ｂの共重合割合がａ：ｂ＝２：１～８：１（モル比）であり、重量平均分子量が１，０００，０００～１，５００，０００である共重合体。
（式１中、Ｒ^１は水素原子、またはメチル基を表す。）
（式２中、Ｒ^２は水素原子、またはメチル基を表し、Ｒ^３は炭素数２～６のアルキル基を表す。）
以下の共重合体Ａおよび共重合体Ｂを、Ａ：Ｂ＝４０：１～５：１（重量比）で含むことを特徴とするタンパク質安定化剤を含有する、臨床検査試薬。
共重合体Ａ：下記の式１で表される単量体ａ、及び下記の式２で表される単量体ｂを共重合して得られる共重合体であって、前記単量体ａ、単量体ｂの共重合割合がａ：ｂ＝７：３～９：１（モル比）であり、かつ重量平均分子量が４００，０００～８００，０００である共重合体。
共重合体Ｂ：下記の式１で表される単量体ａ、及び下記の式２で表される単量体ｂを共重合して得られる共重合体であって、前記単量体ａ、単量体ｂの共重合割合がａ：ｂ＝２：１～８：１（モル比）であり、重量平均分子量が１，０００，０００～１，５００，０００である共重合体。
（式１中、Ｒ ^１は水素原子、またはメチル基を表す。）
（式２中、Ｒ ^２は水素原子、またはメチル基を表し、Ｒ ^３は炭素数２～６のアルキル基を表す。）