JP7093975B2 - 両性イオンポリマー、その製造方法、及び両性イオンポリマーを含むタンパク質安定化剤 - Google Patents
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Description
すなわち、本発明は下記の[1]~[6]を提供する。
〔工程A〕
下記式(2)で表されるスルフィドアクリルアミドモノマーをラジカル重合する工程。
〔工程B〕
前記〔工程A〕で得られたポリマーと、下記式(3)で表されるスルフィド反応性化合物とを反応させる工程。
<両性イオンポリマー>
本発明における両性イオンポリマーとは、式(1)で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーのことであり、側鎖に三級スルホニウム基とカルボキシル基を有する両性イオンポリマーのことである。前記三級スルホニウム基とは、硫黄原子に3つ炭素原子がそれぞれ単結合により結合している置換基であり、カチオン性を示す置換基である。
直鎖アルキル基とは、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、n-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基であり、分岐アルキル基とは例えば、イソプロピル基、2-ブチル基であり、環状アルキル基とは、例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基である。アルキル基の炭素数は、好ましくは1~4であり、より好ましくは1~3である。
炭素数6~20の芳香族基とは、例えば、フェニル基、p-ニトロフェニル基、ブロモフェニル基、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基である。芳香族基の炭素数は、好ましくは6~12であり、より好ましくは6~10である。
R1とR2が互いに連結された炭素数1~6のアルキレン基とは例えば、下記式(7)に示す置換基のアルキレン基である。式(1)のポリマーをタンパク質安定化剤として用いるためにポリマーの水への親和性を向上させるという観点から、R1、R2は、水素原子、メチル基、エチル基、又はプロピル基であることが好ましい。
前記他のモノマーとしては用途によって適宜選択可能であり、例えば、ジエチルアミノエチル(メタ)アクリレート、ポリエチレングリコールモノ(メタ)アクリレート、グリセロール(メタ)アクリレート、(メタ)アクリロイルオキシエチルホスフェート、(メタ)アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、N-メチルカルボキシベタイン(メタ)アクリレート、N-メチルスルホベタイン(メタ)アクリレート、メチル(メタ)アクリレート、エチル(メタ)アクリレート、プロピル(メタ)アクリレート、ブチル(メタ)アクリレート、ペンチル(メタ)アクリレート、ヘキシル(メタ)アクリレート、ステアリル(メタ)アクリレート、グリシジル(メタ)アクリレート、ジメチルアミノエチル(メタ)アクリレート、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、2-メトキシエチル(メタ)アクリレート等の各種(メタ)アクリル酸エステル;メチルビニルエーテル等の各種ビニルエーテル;その他、アクリルアミド、N,N’-ジメチルアクリルアミド、N-イソプロピル(メタ)アクリルアミド、(メタ)アクリル酸、アリルアルコール、アクリロニトリル、アクロレイン、酢酸ビニル、ビニルスルホン酸ナトリウム、スチレン、クロロスチレン、ビニルフェノール、ビニルシンナメート、塩化ビニル、ビニルブロミド、ブタジエン、ビニレンカーボネート、イタコン酸、イタコン酸エステル、フマル酸、フマル酸エステル、マレイン酸、マレイン酸エステル等の各種ラジカル重合性モノマーが挙げられるが、前記式(1)で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーをタンパク質安定化剤として用いる場合、溶媒への溶解性の観点からのバランスから他のモノマーとしては、N,N’-ジメチルアクリルアミド、あるいは、ブチル(メタ)アクリレート、ポリエチレングリコールモノ(メタ)アクリレート等の(メタ)アクリル酸エステルが好ましい。また、他のモノマーの配合量は任意であり、適宜選択できるが、前記式(1)で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーの性能を引き出すためには、配合される前記他のモノマーの含有量が90モル%以下であることが好ましく、より好ましくは70モル%以下である。
両性イオンポリマーにおける前記式(1)で表される繰り返し単位(両性繰り返し単位)のモル数xと、他のモノマーに由来する繰り返し単位のモル数yとの比率x:yの範囲は、例えば、x:y=10:90~95:5であり、好ましくは20:80~92:8であり、より好ましくは30:70~90:10であり、さらに好ましくは、32:68~82:14である。
本発明の側鎖に三級スルホニウム基とカルボキシル基を有する両性イオンポリマーは、少なくとも下記の〔工程A〕、及び〔工程B〕をこの順で行う製造方法により製造する事ができる。
すなわち、式(2)中、R1は、水素原子、炭素数が1~6の直鎖、分岐、もしくは環状のアルキル基、あるいは炭素数が6~20の芳香族基から選択される。直鎖アルキル基とは例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、n-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基であり、分岐アルキル基とは例えば、イソプロピル基、2-ブチル基であり、環状アルキル基とは例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基である。アルキル基の炭素数は、好ましくは1~4であり、より好ましくは1~3である。
芳香族基は、例えば、フェニル基、p-ニトロフェニル基、ブロモフェニル基、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基である。芳香族基の炭素数は、好ましくは6~12であり、より好ましくは6~10である。
タンパク質安定化剤として用いるにはポリマーの水への親和性を向上させるという観点から、R1は、水素原子、メチル基、エチル基、又はプロピル基であることが好ましい。
ラジカル開始剤の使用量は、前記式(2)で表されるスルフィドモノマー100質量部に対して通常0.01から10質量部であることが好ましく、より好ましくは0.01から5質量部である。重合温度および重合時間はラジカル開始剤の種類や他のモノマーの有無や種類などによって適宜選択して決定することができる。例えば、前記式(2)で表されるスルフィドモノマー単独での重合を、AIBNを重合開始剤として用いて行う場合、重合温度は40~90℃、好ましくは50~80℃、より好ましくは60~70℃である。重合時間は1~48時間、好ましくは1~24時間、より好ましくは2~24時間である。
RAFT重合を用いて、前記式(2)で表されるスルフィドモノマーの重合を行う場合、通常のラジカル重合にRAFT剤を添加することができる。前記RAFT剤としては、4-シアノペンタン酸ジチオベンゾエート、2-シアノ-2-プロピルベンゾジチオエート、ベンジルベンゾジチオエート、2-フェニル-2-プロピルベンゾジチオエート、メチル2-フェニル-2-(フェニル-カーボノチオイルチオ)アセテート、4-シアノ-4-(フェニルカルボノチオイルチオ)ペンタン酸N-スクシンイミジルエステル、4-シアノ-4-(ドデシルスルファニル-チオカルボニル)スルファニルペンタン酸、4-シアノ-4-(ドデシルスルファニル-チオカルボニル)スルファニルペンタノール、2-シアノ-2-プロピルドデシルトリチオカーボネート、2-(ドデシルチオカルボニルチオイルチオ)-2-メチルプロピオン酸、4-シアノ-4-(ドデシルスルファニル-チオカルボニル)スルファニルペンタン酸ポリエチレングリコールメチルエーテルエステル、2-(ドデシルチオカルボニルチオイルチオ)-2-メチルプロピオン酸3-アジド-1-プロパノールエステル、ベンジル1H-ピロール-1-カルボジチオエート、2-シアノプロパン-2-イル-N-メチル-N-ピリジン4-イルカルボジチオエート、プロピオン酸エチル-2-エチルザンテートから選択され、例えばR3が水酸基である前記式(2)で表されるスルフィドモノマーを用いる場合には、重合制御可能なモノマーとRAFT剤の組み合わせの観点から、4-シアノペンタン酸ジチオベンゾエート、4-シアノ-4-(ドデシルスルファニル-チオカルボニル)スルファニルペンタン酸、ベンジル1H-ピロール-1-カルボジチオエートが好ましい。
RAFT剤の使用量としては、前記式(2)で表されるスルフィドモノマー100質量部に対して通常0.01から20質量部が好ましく、より好ましくは0.01から5質量部である。
前記式(3)中、R2は特に限定されないが、式(1)におけるR1と同様に定義され得る。式(3)中、R2は、水素原子、炭素数が1~6の直鎖、分岐、もしくは環状のアルキル基、あるいは炭素数が6~20の芳香族基から選択される。
直鎖アルキル基とは例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、n-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基であり、分岐アルキル基とは例えば、イソプロピル基、2-ブチル基であり、環状アルキル基とは例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基である。アルキル基の炭素数は、好ましくは1~4であり、より好ましくは1~3である。
また、芳香族置換基とは例えば、フェニル基、p-ニトロフェニル基、ブロモフェニル基、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基である。芳香族基の炭素数は、好ましくは6~12であり、より好ましくは6~10である。
タンパク質安定化剤として用いるにはポリマーの水への親和性を向上させるという観点から、R2は、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基であることが好ましい。
直鎖アルキル基とは例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、n-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基であり、分岐アルキル基とは例えば、イソプロピル基、2-ブチル基であり、環状アルキル基とは例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基である。アルキル基の炭素数は、好ましくは1~4であり、より好ましくは1~3である。
また、芳香族基とは例えば、フェニル基、p-ニトロフェニル基、ブロモフェニル基、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基である。芳香族基の炭素数は、好ましくは6~12であり、より好ましくは6~10である。
R1とR2が互いに連結された炭素数1~6のアルキレン基とは例えば、下記式(7)に示す置換基である。
タンパク質安定化剤として用いるにはポリマーの水への親和性を向上させるという観点から、R1、及びR2は、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基のいずれかであることが好ましい。
前記他のモノマーとしては用途によって適宜選択可能であり、例えば、ジエチルアミノエチル(メタ)アクリレート、ポリエチレングリコールモノ(メタ)アクリレート、グリセロール(メタ)アクリレート、(メタ)アクリロイルオキシエチルホスフェート、(メタ)アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、N-メチルカルボキシベタイン(メタ)アクリレート、N-メチルスルホベタイン(メタ)アクリレート、エチル(メタ)アクリレート、プロピル(メタ)アクリレート、ブチル(メタ)アクリレート、ペンチル(メタ)アクリレート、ヘキシル(メタ)アクリレート、ステアリル(メタ)アクリレート、グリシジル(メタ)アクリレート、ジメチルアミノエチル(メタ)アクリレート、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、2-メトキシエチル(メタ)アクリレート等の各種(メタ)アクリル酸エステル;メチルビニルエーテル等の各種ビニルエーテル;その他、アクリルアミド、N,N’-ジメチルアクリルアミド、N-イソプロピル(メタ)アクリルアミド、(メタ)アクリル酸、アリルアルコール、アクリロニトリル、アクロレイン、酢酸ビニル、ビニルスルホン酸ナトリウム、スチレン、クロロスチレン、ビニルフェノール、ビニルシンナメート、塩化ビニル、ビニルブロミド、イタコン酸、イタコン酸エステル、フマル酸、マレイン酸、等の各種ラジカル重合性モノマーが挙げられるが、前記式(1)で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーをタンパク質安定化剤として用いる場合、溶媒への溶解性の観点からのバランスから他のモノマーとしてはN,N’-ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコールモノ(メタ)アクリレートが好ましい。また、他のモノマーの配合量は任意であり、適宜選択できるが、前記式(1)で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーの性能を引き出すためには、配合される前記他のモノマーが90モル%以下であることが好ましく、より好ましくは70モル%以下である。
RAFT剤の使用量としては、前記式(4)で表される両性イオンモノマー100質量部に対して通常0.01から20質量部が好ましく、より好ましくは、0.01から10質量部である。
本発明のタンパク質安定化剤は、前記式(1)で表される繰り返し単位を有する両性イオンポリマーを含む。タンパク質安定化剤は、好ましくは両性イオンポリマーの水溶液であり、水としては、精製水、純水、イオン交換水等が好ましく、水を含有する各種緩衝液がより好ましい。各種緩衝液としては、タンパク質の酵素活性、抗原性等の生理活性を失わせるようなものでなければ、通常この分野で用いられる緩衝液を用いることができる。例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液等が挙げられ、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液が特に好ましい。
本発明のタンパク質安定化剤によってタンパク質を安定化させるにあたって、タンパク質安定化溶液を保持する温度は、2℃~40℃が好ましい。2℃以下であるとタンパク質安定化溶液が凍結する可能性があり、40℃以上になると、タンパク質を安定化できる期間が短くなり得るからである。
(合成例1-1:モノマー2の合成)
収量 9.9g
1H-NMR(CD3OD、400MHz)
6.2-6.4ppm(CH 2 =CH,m,2H),5.65ppm(CH2=CH,t,1H), 4.63ppm(NH-CH-COOH,t,1H),2.4-2.6ppm(CH2-CH 2 -S,m,2H),2.0-2.2ppm(CH 2 -CH2-S,m,2H),1.92ppm(S-CH 3 ,s,3H)
収量 1.4g
1H-NMR(CD3OD、400MHz)
4.3-4.6ppm(NH-CH-COOH),2.6-2.8ppm(CH2-CH 2 -S),2.0-2.6ppm(CH 2 -CH2-S,S-CH 3 ),1.6-2.6ppm(ポリマー主鎖)
収量1.1g
1H-NMR(D2O、400MHz)
4.3-4.6ppm(NH-CH-COOH),3.2-3.4ppm(CH2-CH 2 -S(CH3)2),2.8-3.0ppm(CH2-S(CH 3 )2),1.4-2.4ppm(CH 2 -CH2-S、ポリマー主鎖)
得られたポリマーAの数平均分子量および分子量分布(重量平均分子量/数平均分子量)は、検出器に示差屈折率計を用いたゲル浸透クロマトグラフィー測定によりもとめた。ポンプに島津製作所(株)社製 LC-720ADを、検出器(示差屈折率計)に島津製作所(株)社製 RID10Aを、検出器(UV)にSPD-20Aを用いた。カラムには、東ソー(株)社製TSKGel G3000PWXLとTSKGel G5000PWXL(カラムサイズ 4.6mm×25cm)とを二本連結したものを用いた。展開溶媒は、pH9.0に調製した50mMリン酸バッファー/アセトニトリル(9/1 v/v)を用いた。測定条件は、流速 0.6ml/min、カラム温度 40℃、サンプル濃度 0.2mg/ml、注入量 70μLであった。スタンダートとしてポリエチレングリコールを用いた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ポリマーAの数平均分子量は19000、分子量分布は1.95であった。
(合成例2-1:ポリマー4の合成)
収量 1.4g
1H-NMR(CD3OD、400MHz)
4.3-4.6ppm(NH-CH-COOH),2.6-2.8ppm(CH2-CH 2 -S),2.0-2.6ppm(CH 2 -CH2-S,S-CH 3 ),1.6-2.6ppm(ポリマー主鎖)
収量 1.1g
1H-NMR(D2O、400MHz)
4.3-4.6ppm(NH-CH-COOH),3.2-3.4ppm(CH2-CH 2 -S(CH3)2),2.8-3.0ppm(CH2-S(CH 3 )2),1.4-2.4ppm(CH 2 -CH2-S、ポリマー主鎖)
得られたポリマーBの数平均分子量および分子量分布(重量平均分子量/数平均分子量)は、合成例3と同様にして求めた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ポリマーAの数平均分子量は7900、分子量分布は1.25であった。
収量 1.1g
1H-NMR(D2O、400MHz)
4.3-4.6ppm(NH-CH-COOH),3.2-3.4ppm(CH2-CH 2 -S(CH3)2),2.8-3.0ppm(CH2-S(CH 3 )2),0.8-2.4ppm(ブチル基、CH 2 -CH2-S、ポリマー主鎖)
得られたポリマーCの数平均分子量および分子量分布は前記実施例1と同様にして求めた。ポリマーCの数平均分子量は8100、分子量分布は1.23であった。
(合成例4-1:ポリマー5の合成)
組成比(モル比) x:y=32:68
収量 140mg
1H-NMR(CDCl3、400MHz)
4.1-4.6ppm(NH-CH-COOH),3.9-4.1(COO-CH 2 -CH2(BA)),2.6-2.8ppm(CH2-CH 2 -S),2.0-2.6ppm(CH 2 -CH2-S,S-CH 3 ),1.6-2.6ppm(CH 2 -CH 2 -CH3(BA)、ポリマー主鎖),0.8-1.0ppm(CH2-CH 3 (BA))
収量 100mg
1H-NMR(CD3OD、400MHz)
4.1-4.6ppm(NH-CH-COOH、COO-CH 2 -CH2(BA)),3.2-3.4ppm(CH2-CH 2 -S(CH3)2),2.8-3.0ppm(CH2-S(CH 3 )2),1.0-2.4ppm(CH 2 -CH 2 -CH3(BA)、CH 2 -CH2-S、ポリマー主鎖),0.8-1.0ppm(CH2-CH 3 (BA)) 得られたポリマーDの数平均分子量および分子量分布(重量平均分子量/数平均分子量)は、検出器に示差屈折率計を用いたゲル浸透クロマトグラフィー測定によりもとめた。
使用した機器は、前記実施例1と同様であった。カラムとしては、Agilent社製 Mixed-D(粒子径 5μm、カラムサイズ 4.6mm×25cm)を二本連結したものを用いた。展開溶媒には、0.5質量% 臭化リチウム含有クロロホルム/メタノール=6/4 (v/v)を用いた。測定条件は、流速 0.6ml/min、カラム温度 40℃、サンプル濃度 0.2mg/ml、注入量 70μlであった。スタンダートとしてポリエチレングリコールを用いた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ポリマーDの数平均分子量は21000、分子量分布は2.06であった。
(合成例5-1:ポリマー6の合成)
収量 640mg
組成比(モル比) x:y=44:56
1H-NMR(CDCl3、400MHz)
4.1-4.6ppm(NH-CH-COOH,COO-CH 2 -CH2(PEGA)),3.8-3.9ppm(CH 2 -CH 2 -O-(PEGA)),3.4ppm(O-CH 3 (PEGA)),2.6-2.8ppm(CH2-CH 2 -S),2.0-2.6ppm(CH 2 -CH2-S,S-CH 3 ),1.6-2.6ppm(ポリマー主鎖)
収量 100mg
1H-NMR(D2O、400MHz)
4.1-4.6ppm(NH-CH-COOH,COO-CH 2 -CH2(PEGA)),,3.8-3.9ppm(CH 2 -CH 2 -O-(PEGA)),3.2-3.4ppm(O-CH 3 (PEGA),CH2-CH 2 -S(CH3)2),2.8-3.0ppm(CH2-S(CH 3 )2),1.6-2.4ppm(ポリマー主鎖)
得られたポリマーEの数平均分子量および分子量分布(重量平均分子量/数平均分子量)は、検出器に示差屈折率計を用いたゲル浸透クロマトグラフィー測定によりもとめた。
使用した機器は前記実施例1と同様に行った。カラムとしては、Agilent社製 Mixed-D(粒子径 5μm、カラムサイズ 4.6mm×25cm)を二本連結したものを用いた。展開溶媒には、11.5mM 臭化リチウム含有ジメチルホルムアミドを用いた。測定条件は、流速 0.6ml/min、カラム温度 40℃、サンプル濃度 0.2mg/ml、注入量 70μLであった。スタンダートとしてポリエチレングリコールを用いた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ポリマーEの数平均分子量は15000、分子量分布は1.30であった。
(合成例6-1:モノマー7の合成)
収量 600mg
1H-NMR(D2O、400MHz)
6.2-6.4ppm(CH 2 =CH,m,2H),5.65ppm(CH2=CH,t,1H), 4.63ppm(NH-CH-COOH,t,1H),3.48ppm(CH2-CH 2 -S,t,2H),3.05ppm(CH2-S(CH 3 )2,s,6H), 2.2-2.5ppm(CH 2 -CH2-S,m,2H)
収量 100mg
1H-NMR(D2O、400MHz)
4.3-4.6ppm(NH-CH-COOH),3.2-3.4ppm(CH2-CH 2 -S(CH3)2),2.8-3.0ppm(CH2-S(CH 3 )2),1.4-2.4ppm(CH 2 -CH2-S、ポリマー主鎖)
得られたポリマーFの数平均分子量および分子量分布(重量平均分子量/数平均分子量)は、検出器に前記実施例1と同様に、示差屈折率計を用いたゲル浸透クロマトグラフィー測定によりもとめた。ポリマーFの数平均分子量は4900、分子量分布は2.53であった。
(合成例7-1:ポリマー8の合成)
収量 1.4g
1H-NMR(CD3CN、400MHz)
7.2-7.4ppm(フェニル基, 5H),6.4ppm(ピロール基, 2H),2.3-3.0ppm(CONH(CH 3 )2),1.1-1.9ppm(ポリマー主鎖)
得られたポリマー8の数平均分子量および分子量分布(重量平均分子量/数平均分子量)は、検出器に示差屈折率計を用いたゲル浸透クロマトグラフィー測定によりもとめた。
使用した機器は、前記実施例1と同様であった。カラムとしては、Agilent社製 Mixed-D(粒子径 5μm、カラムサイズ 4.6mm×25cm)を二本連結したものを用いた。展開溶媒には、11.5mM 臭化リチウム含有ジメチルホルムアミドを用いた。測定条件は、流速 0.6ml/min、カラム温度 40℃、サンプル濃度 0.2mg/ml、注入量 70μLであった。スタンダートとしてポリエチレングリコールを用いた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ポリマー8の数平均分子量は5300、分子量分布は1.11であった。
収量 120mg
1H-NMR(D2O、400MHz)
4.3-4.6ppm(NH-CH-COOH),3.2-3.4ppm(CH2-CH 2 -S(CH3)2),2.8-3.0ppm(CONH(CH 3 )2(DMAAm),CH2-S(CH 3 )2),1.4-2.4ppm(CH 2 -CH2-S、ポリマー主鎖)
得られたポリマーGの数平均分子量および分子量分布(重量平均分子量/数平均分子量)は、実施例1と同様にして求めた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ポリマーGの数平均分子量は8300、分子量分布は1.20であった。
(タンパク質安定化剤の調製)
実施例1で合成したポリマーAを濃度が1質量%となるようにリン酸バッファー(pH=7.4)に溶解させ、2種類の濃度のタンパク質安定化剤溶液を調製した。
西洋わさび由来のペルオキシダーゼを、濃度が2ug/mlとなるようにリン酸緩衝液(pH7.4)に溶解させ、タンパク質溶液を調製した。
前記タンパク質安定化剤溶液1mlに前記タンパク質溶液50μlを加え、評価用溶液を調整した。前記評価用溶液を4℃で保存し,2.5日後、96ウェルプレートに10μlずつ加え、そこにABTS(2,2‘-アゾビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)アンモニウム塩)溶液(SeraCare Lifescience社)100μlを加え、室温で30分振とうした。振とう後、1質量%のドデシル硫酸ナトリウム溶液100μlを加え、反応を停止した。410nmにおける吸光度を測定し、タンパク質安定化効果の評価を行った。
すなわち評価用溶液調製直後の吸光度と前記保存による2.5日後の吸光度を測定し、下記数式(数式1)により、酵素活性残存率(%)を算出した。タンパク質安定化効果は、酵素活性残存率により評価し、酵素活性残存率が高いほどタンパク質安定化効果が高いことを表す。評価結果を表1に示す。
測定機器:DSファーマバイオメディカル社製プレートリーダー
測定条件:室温 410nm
タンパク質安定化剤としてポリマーBを使用し、濃度が1質量%および0.1質量%となるようにリン酸バッファー(pH=7.4)に溶解させてタンパク質安定化剤溶液を調製したこと以外は、実施例8-1と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表1に示す。
(凍結融解安定化効果の評価)
実施例8-2に記載のタンパク質安定化剤溶液1mlに前記タンパク質溶液50μlを加え、凍結融解安定性評価用溶液を調整した。凍結融解安定性評価用溶液を-78℃で凍結、4℃で融解を3回~10回繰り返した後、96ウェルプレートに10μlずつ加え、そこにABTS(2,2’-アゾビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)アンモニウム塩)溶液(SeraCare Lifescience社)100μlを加え、室温で30分振とうした。振とう後、1質量%のドデシル硫酸ナトリウム溶液100μlを加え、反応を停止した。410nmにおける吸光度を測定し、凍結融解安定化効果の評価を行った。
すなわち、凍結融解安定性評価用の溶液を調製した直後の吸光度と、前記凍結融解を3~10回繰り返した後の吸光度を測定し、下記数式(数式2)により、酵素活性残存率(%)を算出した。凍結融解安定化効果は酵素活性残存率により評価し、酵素活性残存率が高いほど凍結融解安定化効果が高いことを表す。評価結果を表2に示す。
測定機器:DSファーマバイオメディカル社製プレートリーダー
測定条件:室温 410nm
(タンパク質安定化剤溶液の調製)
実施例2で合成したポリマーBを、濃度が0.2、0.1、0.05質量%となるように50体積%エタノール水溶液に溶解させたタンパク質安定化剤溶液を調製した。
DPPH(1,1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル)を濃度が0.25 mMとなるようにエタノールに溶解させ、DPPH溶液を調製した。
96ウェルプレートに上記各濃度の前記タンパク質安定化剤溶液50μlずつ加え、そこに0.25M酢酸緩衝液(pH5.5)100μlと前記DPPH溶液100μlを加え、抗酸化性評価溶液を調製した。抗酸化性評価溶液を調製後、30分間、暗所で静置し、540nmにおける吸光度を測定した。 前記抗酸化性評価溶液の調製と同様に、ただし前記タンパク質安定化剤溶液の代わりに50%エタノール水溶液50μlを加え、ブランク溶液1とした。
前記抗酸化性評価溶液の調製と同様に、ただし前記DPPH溶液の代わりにエタノール100μlを加え、ブランク溶液2とした。
前記抗酸化性評価溶液の調製と同様に、ただし前記タンパク質安定化剤溶液の代わりに50%エタノール水溶液50μlを加え、前記DPPH溶液の代わりにエタノール100μlを加え、ブランク溶液3とした。
そして、タンパク質安定化剤溶液の吸光度と前記ブランク溶液1、2、3の吸光度を測定し、下記数式(数式3)により、DPPHラジカル消去率(%)を算出した。抗酸化性はDPPHラジカル消去率により評価し、DPPHラジカル消去率が高いほど抗酸化性が高いことを表す。評価結果を表3に示す。
測定機器:DSファーマバイオメディカル社製プレートリーダー
測定条件:室温 540nm
(合成例6-2の重合溶媒をDMF中重合温度70℃で行った場合)
二口フラスコにモノマー7(100mg,0.50mmol)、4,4’-アゾビス(4-シアノ吉草酸)(1.6mg,5.0μmol)をDMF(0.5ml)に溶解させた。15分窒素バブリング後、反応系を70℃まで昇温し重合を開始させた。20時間後の反応溶液をアセトン10 mlで再沈殿させたが、ポリマーを得ることができなかった。
(合成例6-2の重合温度70℃で行った場合)
二口フラスコにモノマー7(100mg,0.50mmol)、4,4’-アゾビス(4-シアノ吉草酸)(1.6mg,5.0μmol)をH2O(0.5ml)に溶解させた。15分窒素バブリング後、反応系を70℃まで昇温し重合を開始させた。20時間後の反応溶液をアセトン10 mlで再沈殿させたが、ポリマーを得ることができなかった。
タンパク質安定化剤を用いずにリン酸緩衝液(pH7.4)のみを使用したこと以外は、実施例8-1と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表1に示す。
タンパク質安定化剤としてDMSPを使用し、濃度が0.1質量%となるようにリン酸バッファー(pH=7.4)に溶解させてタンパク質安定化剤溶液を調製したこと以外は、実施例8-1と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表1に示す。
タンパク質安定化剤としてポリエチレングリコール(PEG)を使用し、濃度が0.1質量%および0.1質量%となるようにリン酸バッファー(pH=7.4)に溶解させてタンパク質安定化剤溶液を調製したこと以外は、実施例8-1と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表1に示す。
タンパク質安定化剤としてBSA(牛血清アルブミン)を使用し、濃度が1質量%となるようにリン酸バッファー(pH=7.4)に溶解させてタンパク質安定化剤溶液を調製したこと以外は、実施例8-1と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表1に示す。
タンパク質安定化剤を用いずにリン酸緩衝液(pH7.4)のみを使用したこと以外は、実施例9と同様にして凍結融解安定化効果の評価を行った。評価結果を表2に示す。
タンパク質安定化剤としてDMSPを使用し、濃度が0.1質量%となるようにリン酸バッファー(pH=7.4)に溶解させてタンパク質安定化剤溶液を調製したこと以外は、実施例9と同様にして凍結融解安定化効果の評価を行った。評価結果を表2に示す。
タンパク質安定化剤としてBSA(牛血清アルブミン)を使用し、濃度が1質量%となるようにリン酸バッファー(pH=7.4)に溶解させてタンパク質安定化剤溶液を調製したこと以外は、実施例9と同様にして凍結融解安定化効果の評価を行った。評価結果を表2に示す。
抗酸化剤としてDMSPを使用し、濃度が0.2、0.1、0.05質量%となるように50%エタノール水溶液に溶解させて抗酸化剤溶液を調製したこと以外は、実施例10と同様にして抗酸化性の評価を行った。評価結果を表3に示す。
抗酸化剤としてPEG(分子量:4000)を使用し、濃度が0.2、0.1、0.05質量%となるように50%エタノール水溶液に溶解させて抗酸化剤溶液を調製したこと以外は、実施例10と同様にして抗酸化性の評価を行った。評価結果を表3に示す。
(合成例8-1:ポリマー9の合成)
組成比(モル比) x:y=86:14
収量 1.8g
ナスフラスコにポリマー9(1.00g)をいれ、エタノール10mlに溶解した。反応溶液にヨードメタン2mLを加え、室温で20時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、ポリマーHを得た。
収量 1.8g
得られたポリマーHの数平均分子量および分子量分布(重量平均分子量/数平均分子量)は、前記実施例1と同様にしてもとめた。
ポリマーHの数平均分子量は8300、分子量分布は1.31であった。
(合成例9-1:ポリマー10の合成)
モノマー2(1.4g,7.0mmol)、ブチルアクリレート(384mg,3.0mmol)を用いたこと以外は合成例8-1と同様にしてポリマー10を得た。
組成比(モル比) x:y=68:32
収量 1.7g
合成例8-2と同様にしてポリマー10からポリマーIを得た。
収量 1.8g
得られたポリマーIの数平均分子量および分子量分布(重量平均分子量/数平均分子量)は、前記実施例4と同様にしてもとめた。
ポリマーIの数平均分子量は13200、分子量分布は1.08であった。
(合成例10-1:ポリマー11の合成)
モノマー2(1.0g,5.0mmol)、ブチルアクリレート(640mg,5.0mmol)を用いたこと以外は合成例8-1と同様にしてポリマー11を得た。
組成比(モル比) x:y=50:50
収量 1.6g
合成例8-2と同様にしてポリマー11からポリマーJを得た。
収量 1.7g
得られたポリマーJの数平均分子量および分子量分布(重量平均分子量/数平均分子量)は、前記実施例4と同様にしてもとめた。
ポリマーJの数平均分子量は14000、分子量分布は1.10であった。
(合成例11-1:ポリマー12の合成)
モノマー2(0.6g,3.0mmol)、ブチルアクリレート(896mg,7.0mmol)を用いたこと以外は合成例8-1と同様にしてポリマー12を得た。
組成比(モル比) x:y=32:68
収量 1.4g
合成例8-2と同様にしてポリマー12からポリマーKを得た。
収量 1.5g
得られたポリマーKの数平均分子量および分子量分布(重量平均分子量/数平均分子量)は、前記実施例4と同様にしてもとめた。
ポリマーJの数平均分子量は13000、分子量分布は1.16であった。
なお、実施例11~14にて、得られたポリマー9~12、及び、ポリマーH,I,J,及びKにおける、両性xとyの構成単位のモル比は、以下の表5に示す通りである。
<実施例15-1>
ポリマーBのタンパク質安定化効果は4℃での保存期間を13日、28日、62日間とした以外は実施例8-2と同様して評価を行った。評価結果を表4に示す。
タンパク質安定化剤としてポリマーBの代わりにポリマーHを用いたこと以外は前記実施例15-1と同様にしてタンパク質安定化剤溶液を調製した。評価結果を表4に示す。
タンパク質安定化剤としてポリマーBの代わりにポリマーIを用いたこと以外は前記実施例15-1と同様にしてタンパク質安定化剤溶液を調製した。評価結果を表4に示す。
タンパク質安定化剤としてポリマーBの代わりにポリマーJを用いたこと以外は前記実施例15-1と同様にしてタンパク質安定化剤溶液を調製した。評価結果を表4に示す。
タンパク質安定化剤としてポリマーBの代わりにポリマーKを用いたこと以外は前記実施例15-1と同様にしてタンパク質安定化剤溶液を調製した。評価結果を表4に示す。
タンパク質安定化剤を用いずにリン酸緩衝液(pH7.4)のみを使用したこと以外は前記実施例15-1と同様にしてタンパク質安定化剤溶液を調製した。評価結果を表4に示す。
Claims (7)
- 前記式(1)中、R1、R2がともに水素原子である、請求項1に記載の両性イオンポリマー。
- (メタ)アクリル酸エステルに由来の構成単位をさらに有し、前記式(1)で表される繰り返し単位のモル数xと、(メタ)アクリル酸エステルに由来の構成単位のモル数yとの比が、x:y=10:90~95:5の範囲内である、請求項1に記載の両性イオンポリマー。
- 下記〔工程A〕、及び〔工程B〕をこの順で行うことを特徴とする、請求項1に記載の両性イオンポリマーの製造方法。
〔工程A〕
下記式(2)で表されるスルフィドアクリルアミドモノマーをラジカル重合する工程。
〔工程B〕
前記〔工程A〕で得られたポリマーと、下記式(3)で表されるスルフィド反応性化合物とを反応させる工程。
- 請求項1~3のいずれかに記載の両性イオンポリマーを含む、タンパク質安定化剤。
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