JP7401875B2 - 観察装置 - Google Patents

Description

本発明は、生物細胞の観察に用いられる観察装置に関する。

従来、生物細胞を培養しながら観察するために、染色することなく生物細胞を観察できる位相差顕微鏡が使用されている。観察対象物としての生物細胞は、温度を一定に保つことが可能なインキュベータ内で培養される。生物細胞を観察するために、位相差顕微鏡をインキュベータ内に配置する必要がある。インキュベータ内に組み込み可能に構成した位相差顕微鏡の一例が、特許文献１に開示されている。この位相差顕微鏡は、落射式の位相差顕微鏡であり、照明光学系及び観察光学系の双方が観察対象物に対して同じ側に配置されている。

照明光学系から発光された照明光は、反射面において反射されて反射光になる。反射光は、観察対象物を通過する際に観察対象物の内部で回折せず反射面の表面で反射された直接反射光と、観察対象物を通過する際に観察対象物の内部で回折され位相が１／４波長だけ遅れて反射面の表面で反射された回折反射光と、からなる。位相差顕微鏡による観察では、反射面の表面で反射された直接反射光の位相が、１／４波長だけ進められるか、遅らされる。直接反射光の位相が操作されることで、直接反射光と回折反射光との位相差が０又は１／２波長となり、直接反射光と回折反射光とが強め合うか又は弱め合う。直接反射光と回折反射光との位相差が、明暗のコントラストに変換されるので、人間の目で感知可能な光学像が得られる。

特開平０８－１９４１６０号公報

複数の観察対象物を観察する場合に、観察対象物毎に位相差顕微鏡を設けることは、コストの観点から現実的ではない。したがって、観察対象物又は位相差顕微鏡を移動させる必要がある。ところが、観察対象物又は位相差顕微鏡を移動させると、観察対象物又は位相差顕微鏡の停止位置の精度に限界があるため、位相板から反射面までの距離にばらつきが生じる。

ここで、位相差顕微鏡は、位相を１／４波長だけ変更する位相膜領域と位相を変更しない透過領域とを有する位相板を有している。直接反射光が位相膜領域を通過し且つ回折反射光が透過領域を通過することで、直接反射光の位相が１／４波長だけ変更される。

特許文献１に記載の位相差顕微鏡では、照明光学系から観察対象物に向けて発光される照明光が光軸に対して傾斜している。そのため、位相板から反射面までの距離にばらつきが生じると、直接反射光が位相板において収束する位置（収束点）が変化してしまう。収束点の変動により直接反射光が位相膜領域を通過しなくなると、コントラストに変動が生じ、それまでの調整によって得られた良好な光学像が得られなくなってしまう。したがって、位相差顕微鏡を移動させる度に、直接反射光が位相膜領域を通過するように位相差顕微鏡から観察対象物までの距離、つまり位相板から反射面の距離を調整する作業が必要であるが、これでは作業性の低下を招いてしまう。

本発明は、前述された事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、位相板から反射面までの距離を調整する作業を不要にしながら、コントラストを一定に保つことにより良好な光学像を得ることができる観察装置を提供することにある。

(1) 本発明に係る観察装置によれば、照明光源、上記照明光源からの照明光を生物細胞である観察対象物に出射する照明光学系、上記照明光が上記観察対象物を通過して反射された反射光から上記観察対象物の光学像を形成する観察光学系を備え、上記観察光学系は、上記反射光のうち、反射面で反射された直接反射光の位相を変更する位相板を備え、上記照明光学系及び上記観察光学系の双方が上記観察対象物の下方に配置されている落射式位相差顕微鏡と、上記観察光学系によって得られた上記光学像を光電変換して、上記観察対象物の画像データを作成する撮像素子と、上記画像データを表示する表示装置と、を備えており、上記照明光学系から出射される上記照明光が平行光である。

上記構成によれば、照明光学系から平行な照明光が出射されるので、観察光学系に平行な反射光が入射する。反射光が光軸に対して平行であるので、位相板から反射面までの距離が変動しても、直接反射光の位相板における収束点が変動しない。したがって、落射式位相差顕微鏡を移動させることによって上記距離が変動しても、コントラストを一定に保つことができ、良好な光学像が得られる。

(2) 好ましくは、上記観察装置は、上記観察対象物と上記落射式位相差顕微鏡とを相対的に移動させる移動装置を備えている。

上記構成によれば、上記観察装置は、移動装置を備えているので、手動で観察対象物又は落射式位相差顕微鏡を移動させる必要がない。したがって、作業性が向上する。

(3) 好ましくは、上記観察装置は、開口を有する筐体、上記開口を開閉可能な蓋体、及び、上記筐体及び上記蓋体によって画定される内部空間を上方の培養室及び下方の機械室に区画する区画壁を備えるインキュベータを備えており、上記観察対象物は、上記培養室内に配置されており、上記落射式位相差顕微鏡、上記撮像素子、及び上記移動装置は、上記機械室内に配置されており、上記区画壁は、上記培養室を上記機械室に対して気密性及び水密性を保つように上記筐体に固定され、上記区画壁の少なくとも一部は、上記照明光を透過する透明材料で形成されている。

上記構成によれば、インキュベータ内に落射式位相差顕微鏡が配置されているので、観察対象物を観察するためにインキュベータを開放して外部から顕微鏡をインキュベータに移動させる必要がない。そのため、観察対象物の観察の度に、インキュベータが開放されても差し支えがないように、インキュベータの外部環境を無菌状態に保つ必要もない。したがって、インキュベータの観察に要する作業工数及びコストが軽減される。また、培養室の気密性及び水密性が機械室に対して保たれているので、培養室の雰囲気から機械室の雰囲気が分離されている。そのため、培養室と機械室との間に温度差が発生したとしても、機械室内の落射式位相差顕微鏡に結露が発生することが抑制される。

(4) 好ましくは、上記照明光源は、上記照明光の波長を、複数の異なる波長の間で切り換え可能に構成されている。

上記構成によれば、照明光の波長が複数の異なる波長の間で切り換え可能である。そのため、得られた画像をぼかして、観察対象物の細胞境界における画像データ量を減らすことができ、細胞数の計測を行いやすくすることができる。また、結像面における光学像に含まれる各部のうち、対物レンズに付着したゴミ等の異物による部分は、照明光の波長の変更によって影響を受けない。そのため、照明光の波長の変更により、光学像の各部について、観察対象物の像なのか異物による像なのかが特定できる。

(5) 好ましくは、上記観察装置は、上記画像データを修正する画像処理部を備えており、上記画像データには、色情報として輝度値を含む画素が２次元座標で配列されており、上記画像処理部は、２つの異なる上記波長の上記照明光によって得られた２つの上記画像データについて、同一座標の上記画素毎に、上記輝度値の差分を算出する算出部と、上記差分が所定値よりも小さい上記画素を、誤情報を含むノイズ画素として認識する認識部と、上記２つの画像データからそれぞれ上記ノイズ画素を削除して２つの修正画像データを作成する作成部と、を備える。

観察対象物を通過した反射光の場合、波長が変更されると、焦点位置が収束又は拡散するように変化し、輝度値の差分が変化する。観察対象物を通過していない反射光、例えば対物レンズに付着したゴミからの反射光の場合、波長が変更されても、焦点位置が収束又は拡散するように変化せず、輝度値の差分があまり変化しない。

上記構成によれば、輝度値の差分が所定値よりも小さい画素が、誤情報を含むノイズ画素として認識され、ノイズ画素が削除された２つの修正画像データが作成される。したがって、観察対象物の画像データにおいて、ゴミによる誤情報の影響を排除できる。

(6) 好ましくは、上記観察装置は、上記観察対象物の上方に配置された反射鏡を備えている。

上記構成によれば、観察対象物からの反射光だけでなく、反射鏡からの反射光が観察光学系に入射する。観察光学系に入射する光量が増大するので、より識別性の高い観察対象物の画像データを得ることができる。

(7) 好ましくは、上記観察装置は、透光性材料で構成された下皿及び上皿からなり、上記生物細胞が収納されるシャーレを備え、上記上皿には、上記反射鏡が固定されている。

上記構成によれば、上皿に反射鏡が固定されているので、反射鏡を容易に配置できる。

(8) 好ましくは、上記照明光学系は、上記照明光源からの上記照明光を反射するハーフミラーと、上記ハーフミラーで反射された上記照明光を屈折させる第１対物レンズ及び第２対物レンズと、を備えており、上記観察光学系は、上記観察対象物からの上記反射光を屈折させる上記第１対物レンズ及び上記第２対物レンズと、屈折された上記反射光を透過させる上記ハーフミラーと、を備えている。

本発明の観察装置によれば、位相差顕微鏡から観察対象物までの距離を調整する作業を不要にしながら、コントラストを一定に保つことができ、良好な光学像を得ることができる。

図１は、本実施形態に係る観察装置１０のブロック図である。 図２は、本実施形態に係るインキュベータ１１を示す図であり、図２（ａ）はインキュベータ１１の斜視図であり、図２（ｂ）はインキュベータ１１内に配置された区画壁２３、顕微鏡１２及び移動装置１３を示す斜視図である。 図３は、図２（ａ）のＩＩＩ－ＩＩＩ切断線から視たインキュベータ１１の断面図である。 図４は、顕微鏡１２の概略構成図である。

以下、本発明の好ましい実施形態を説明する。なお、本実施形態は、本発明の一実施態様にすぎず、本発明の要旨を変更しない範囲で実施態様を変更できることは言うまでもない。

［観察装置１０］
図１に示されるように、本実施形態に係る観察装置１０は、生物細胞である観察対象物２８を観察する装置である。観察装置１０は、インキュベータ１１と、落射式位相差顕微鏡（以下、顕微鏡）１２と、移動装置１３と、観察用コンピュータ１４と、表示装置１５と、操作装置１６と、を備えている。インキュベータ１１は、雰囲気制御機構３９を備えている。顕微鏡１２は、照明光源５０を備えている。顕微鏡１２には撮像素子５３が設けられている。観察用コンピュータ１４は、光源制御部４４、画像処理部４５、及び移動制御部４６を備えている。

観察装置１０を構成する要素は、概略的には、以下のように機能する。照明光源５０は、観察対象物２８を照明する。顕微鏡１２は、照明された観察対象物２８の光学像を取得する。移動装置１３は、顕微鏡１２が観察対象物２８の光学像を取得できるように、顕微鏡１２を移動させる。撮像素子５３は、顕微鏡１２によって取得された光学像を光電変換して画像データを作成する。画像処理部４５は、撮像素子５３で得られた画像データを修正する。表示装置１５は、修正前及び修正後の画像データを表示する。移動制御部４６は、移動装置１３の駆動を制御する。光源制御部４４は、照明光源５０の駆動を制御する。操作装置１６は、画像処理部４５への指令を入力可能且つ移動制御部４６への指令を入力可能である。操作装置１６は、例えばキーボード及びマウスである。ユーザは、操作装置１６を操作して、画像処理部４５への処理内容を設定し、且つ、移動装置１３の駆動を介して顕微鏡１２の移動を制御できる。このようにして、観察装置１０により、観察対象物２８が観察される。

［インキュベータ１１］
図２（ａ）に示されるように、インキュベータ１１は、開口２０を有する筐体２１と、開口２０を開閉可能な蓋体２２と、筐体２１内に配置された区画壁２３と、を備える。以下において、上下方向１７、前後方向１８、及び左右方向１９は、図１に示されるインキュベータ１１の姿勢に基づいて定義されている。開口２０は、前後方向１８に開いている。筐体２１及び蓋体２２によってインキュベータ１１の内部空間２４が画定されている。筐体２１及び蓋体２２の外形形状は、直方体形状である。また、内部空間２４の形状も直方体形状である。蓋体２２が閉じられた状態で、内部空間２４は、インキュベータ１１の外気に対して、気密性及び水密性が保たれている。

図２（ａ）及び図２（ｂ）に示されるように、区画壁２３は、内部空間２４を上方の培養室２５及び下方の機械室２６に区画する。培養室２５内には、４つのシャーレ２７が配置されている。シャーレ２７内には、生物細胞である観察対象物２８（図３、図４）が収納されている。機械室２６内には、撮像素子５３が搭載された顕微鏡１２及び移動装置１３が収納されている。

区画壁２３は、上下方向１７より視て四角形である平板形状である。区画壁２３は、４つの開口２９を有する枠板３０と、４つの開口２９にそれぞれ嵌め込まれた透明板３１と、を有する。透明板３１は光を透過する材料で形成されており、上下方向１７に光を透過可能である。透明板３１の材料は、例えば、ガラス又はアクリルである。４つの透明板３１は、上下方向１７より視て四角形の頂点位置にそれぞれ位置している。

［シャーレ２７］
図３に示されるように、シャーレ２７は、入れ子となる下皿４７及び上皿４８を有する。下皿４７及び上皿４８は、共に底面を有する浅い円筒状の容器である。上皿４８が下皿４７よりも大きく、下皿４７を上皿４８に被せることで、シャーレ２７の内部が閉じられる。下皿４７及び上皿４８は、共に光を透過する材料、例えばポリスチレン樹脂により構成されている。

［反射鏡４９］
図１から図３に示されるように、観察装置１０は、顕微鏡１２からの照明光６１を反射する反射鏡４９を備えている。反射鏡４９は、上皿４８の上面に固定されている。反射鏡４９は、円板形状である。反射鏡４９は、本実施形態ではステンレスで形成されており、反射鏡４９の下面に設けられた反射面４９ａ（下面４９ａ）は光を反射可能に鏡面加工されている。

［雰囲気制御機構３９］
再び図１を参照して、インキュベータ１１の雰囲気制御機構３９が説明される。雰囲気制御機構３９は、培養室２５の雰囲気（温度及び湿度）を制御する機構であり、機械室２６の雰囲気とは独立して制御可能である。具体的には、雰囲気制御機構３９は、加熱装置３２と、温度センサ３３と、加湿装置３４と、湿度センサ３５と、培養用コンピュータ３６と、操作装置３７と、表示装置３８と、を備える。加熱装置３２は、培養室２５の温度を加熱可能である。温度センサ３３は、培養室２５の温度を検出可能である。加湿装置３４は、培養室２５の湿度を加湿可能である。湿度センサ３５は、培養室２５の湿度を検出可能である。培養用コンピュータ３６は、加熱装置３２の作動及び加湿装置３４の作動を制御可能である。操作装置３７は、培養室２５の温度及び湿度の目標値を指定可能な装置である。表示装置３８は、温度センサ３３によって検出された温度、湿度センサ３５によって検出された湿度、操作装置３７によって指定された目標値を表示可能である。培養用コンピュータ３６は、温度センサ３３及び湿度センサ３５によって得られた温度及び湿度の検出値が、指定された温度及び湿度の目標値に一致するように、加熱装置３２の作動及び加湿装置３４の作動を制御する。このようにして、培養室２５の雰囲気が制御される。

［移動装置１３］
図２及び図３に示されるように、移動装置１３は、顕微鏡１２が観察対象物２８を収納したシャーレ２７の直下方に位置するように、顕微鏡１２を移動させる装置である。移動装置１３は、底部４０と、本体４１と、第１アーム４２と、第２アーム４３と、を備える。底部４０は、インキュベータ１１の筐体２１に固定されている。本体４１は、底部４０に固定されており、第１アーム４２及び第２アーム４３を駆動する駆動機構及び制御機構を収納する。第１アーム４２及び第２アーム４３は、多関節アームに構成されている。第１アーム４２の基端部が本体４１に対して上下方向１７の軸周りに回転可能に連結されている。第２アーム４３の基端部が第１アーム４２の先端部に対して上下方向１７の軸周りに回転可能に連結されている。第２アーム４３の先端部には顕微鏡１２が固定されている。移動装置１３の駆動により、顕微鏡１２は水平方向で、すなわち前後方向１８及び左右方向１９の双方において移動可能である。そのため、区画壁２３の上方に位置する４つのシャーレ２７のいずれの直下方にも、移動装置１３は移動できる。

［顕微鏡１２］
図４を参照して、顕微鏡１２が説明される。顕微鏡１２は、照明光源５０と、照明光学系５１と、観察光学系５２と、撮像素子５３と、を備えている。照明光学系５１は、照明光源５０からの照明光６１を観察対象物２８に出射する。観察光学系５２は、照明光６１が観察対象物２８を通過して反射面によって反射された反射光６２から、観察対象物２８の光学像を形成する。撮像素子５３は、観察対象物２８の光学像を光電変換して、観察対象物２８の画像データを作成する。

照明光源５０は、照明光６１を出射する光源である。照明光源５０は、波長可変光源であり、照明光６１の波長を変更できる。波長の切換は、ユーザが操作装置１６（図１）を操作することにより行われる。操作装置１６の操作により波長の目標値が指定されると、光源制御部４４（図１）は、当該目標値の波長の照明光６１が出射されるように、照明光６１を制御する。

顕微鏡１２は、落射式の顕微鏡であり、照明光学系５１及び観察光学系５２が観察対象物２８に対して同じ側に、本実施形態では下側に配置されている。これに伴って、照明光源５０も、照明光学系５１及び観察光学系５２と同じ側（下側）に配置されている。照明光学系５１及び観察光学系５２が観察対象物２８の両側にそれぞれ配置されることがないので、顕微鏡１２がコンパクトに構成されている。

照明光学系５１は、ハーフミラー５４と、第１対物レンズ５５と、第２対物レンズ５６と、を備えている。ハーフミラー５４は、照明光源５０からの照明光６１を反射して、観察対象物２８が配置された観察位置に向けて上側へ出射する。ハーフミラー５４と観察対象物２８との間には、第１対物レンズ５５及び第２対物レンズ５６が配置されている。第１対物レンズ５５がハーフミラー５４に近い側に配置され、第２対物レンズ５６は観察対象物２８に近い側に配置されている。ハーフミラー５４からの照明光６１は、第１対物レンズ５５及び第２対物レンズ５６において屈折された後に、透明板３１及び下皿４７（図３）を透過して、観察対象物２８を通過して反射面４９ａに到達する。光軸６０は、ハーフミラー５４から出射される照明光６１の光束の中心軸であり、第１対物レンズ５５及び第２対物レンズ５６の中心軸でもある。光軸６０は、上下方向１７に沿っている。

第２対物レンズ５６から出射される照明光６１は、光軸６０と平行な平行光である。このような平行光が出射されるように、第１対物レンズ５５及び第２対物レンズ５６の屈折率及び配置が設定されている。

照明光６１は、観察対象物２８を通過して反射面４９ａにおいて反射されて反射光６２になる。反射光６２は、反射鏡４９の反射面４９ａで反射された後、観察対象物２８を通過する際に観察対象物２８の内部で回折しない直接反射光６２Ａと、反射鏡４９の反射面４９ａで反射された後、観察対象物２８を通過する際に観察対象物２８の内部で回折されて位相が１／４波長だけ遅れた回折反射光６２Ｂと、からなる。図４において、照明光６１は実線で示され、直接反射光６２Ａは実線で示され、回折反射光６２Ｂは破線で示されている。反射光６２は、直接反射光６２Ａ及び回折反射光６２Ｂを総称する。

本実施形態では、観察対象物２８の上方に反射鏡４９が配置されているので、反射鏡４９の反射面４９ａにおいて、より多くの光が反射されることで反射光６２の光量が増大する。直接反射光６２Ａは、反射鏡４９の反射面４９ａで反射された光のうち、反射の前後において観察対象物２８を２回通過し、観察対象物２８内で回折されなかった光である。回折反射光６２Ｂは、反射鏡４９の反射面４９ａで反射された光のうち、反射の前後において観察対象物２８を２回通過し、観察対象物２８内で回折された光である。

観察光学系５２は、第１対物レンズ５５と、第２対物レンズ５６と、ハーフミラー５４と、位相板５７と、結像面５８と、を備えている。結像面５８は、本実施形態では、撮像素子５３の表面に形成された受光面である。ここで、第１対物レンズ５５及び第２対物レンズ５６と、ハーフミラー５４は、照明光学系５１及び観察光学系５２において共用されている。反射面４９ａで反射した反射光６２は、透明板３１及び下皿４７（図３）を経由して、第１対物レンズ５５及び第２対物レンズ５６において屈折された後に、ハーフミラー５４及び位相板５７を透過して、結像面５８に到達する。

位相板５７は、位相をずらす位相膜領域５７Ａと、位相を変更しない透過領域５７Ｂとを有する。位相膜領域５７Ａは、位相板５７において光軸６０を中心とする円形領域である。透過領域５７Ｂは、位相板５７において光軸６０を中心とする円環状領域であって、位相膜領域５７Ａの外側にある。位相膜領域５７Ａ及び透過領域５７Ｂは、光を透過する材料で構成されている。光が位相膜領域５７Ａを通過すると、その光の位相は１／４波長だけずらされる。本実施形態では、１／４波長だけ位相が遅らされるが、逆に１／４波長だけ位相が進まされてもよい。一方、透過領域５７Ｂは、当該透過領域５７Ｂを通過する光の位相を変更しない。

反射光６２のうち、直接反射光６２Ａが位相膜領域５７Ａを通過するように、第１対物レンズ５５及び第２対物レンズ５６の屈折率及び配置、位相膜領域５７Ａの大きさ（半径）が設定されている。そのため、直接反射光６２Ａの位相は位相膜領域５７Ａにおいてずらされる。一方、回折反射光６２Ｂは透過領域５７Ｂを通過するので、回折反射光６２Ｂの位相は変更されない。直接反射光６２Ａの位相は１／４波長だけ遅らされるので、位相板５７の通過後に、直接反射光６２Ａと回折反射光６２Ｂとの位相差が０となる。直接反射光６２Ａの位相が１／４波長だけ進められた場合は、位相板５７の通過後に、直接反射光６２Ａと回折反射光６２Ｂとの位相差は１／２波長となる。

観察対象物２８の各位置を通過して反射された反射光６２の光束は、結像面５８において収束する。直接反射光６２Ａの位相が１／４波長だけ遅らされた場合は、結像面５８において、直接反射光６２Ａと回折反射光６２Ｂとが強め合うので、観察対象物２８が明るく背景が暗いブライトコントラストの光学像が得られる。直接反射光６２Ａの位相が１／４波長だけ進められた場合は、逆に、観察対象物２８が暗く背景が明るいダークコントラストの光学像が得られる。

結像面５８に形成された光学像は、撮像素子５３により光電変換され、画像データが作成される。画像データは、画像処理部４５（図１）で修正された後、表示装置１５に表示される。

［画像処理部４５］
再び図１を参照して、画像処理部４５が説明される。画像処理部４５は、撮像素子５３により得られた画像データに対してノイズ情報を除去するフィルタ機能を有している。このフィルタ機能は、２つの異なる波長の照明光６１によって得られた２つの画像データに基づいて、画像データから第２対物レンズ５６に付着したゴミ等によるノイズ情報を除去する機能である。

照明光６１の波長の変更は、観察対象物２８から結像面５８までの光路長を変更することに等しい。この変更により、反射光６２が収束する位置が変動する。反射光６２が結像面５８において収束する場合、光学像のピントは合っているが、反射光６２が結像面５８において収束しない場合、光学像のピントがずれている。つまり、２つの異なる波長の照明光６１によって、ピントの合った画像データと、ピントの外れた画像データとが作成される。ここで、第２対物レンズ５６に付着したゴミ等による光学像は、光路長の変動の影響を受けないので、輝度の変動がない。そこで、波長の変更によって得られた２つの画像データにおいて、輝度の変動が比較的小さな部分の画素を特定することで、画像データに含まれるノイズ情報を特定できる。さらに、ノイズ情報を含む画素の情報を削除することで、ノイズ情報の削除された画像データを作成できる。

画像処理部４５にフィルタ機能を発揮させるのに先立って、光源制御部４４が照明光源５０を制御して、照明光６１の波長が変更される。このようにして、第１の波長の照明光６１で得られた画像データと、第２の波長の照明光で得られた画像データとが得られる。ここで、画像データは、２次元座標で配列された画素の集合体である。各画素は、色情報として輝度値の情報を有している。

画像処理部４５は、算出部７１と、認識部７２と、作成部７３と、を備えている。算出部７１は、２つの異なる波長の照明光６１によって得られた２つの画像データについて、同一座標の画素毎に、輝度値の差分を算出する。認識部７２は、この差分が所定値よりも小さい画素を、誤情報を含むノイズ画素として認識する。作成部７３は、２つの画像データからそれぞれノイズ画素を削除して２つの修正画像データを作成する。このようにして、画像データに含まれるノイズ情報の有無が認識され、さらにノイズ情報が削除された画像データが作成される。

［本実施形態の作用効果］
本実施形態に係る観察装置１０によれば、照明光学系５１から平行な照明光６１が出射されるので、観察光学系５２に平行な反射光６２が入射する。反射光６２が光軸６０に対して平行であるので、顕微鏡１２から観察対象物２８までの距離が変動しても、直接反射光６２Ａの位相板５７における収束点が変動しない。したがって、顕微鏡１２を移動させることによって上記距離が変動しても、コントラストを一定に保つことができ、良好な光学像が得られる。

また、観察装置１０は、移動装置１３を備えているので、手動で観察対象物２８又は顕微鏡１２を移動させる必要がない。したがって、作業性が向上する。

また、インキュベータ１１内に顕微鏡１２が配置されているので、観察対象物２８を観察するためにインキュベータ１１を開放して外部から顕微鏡１２をインキュベータ１１に移動させる必要がない。そのため、観察対象物２８の観察の度に、インキュベータ１１が開放されても差し支えがないように、インキュベータ１１の外部環境を無菌状態に保つ必要もない。したがって、インキュベータ１１の観察に要する作業工数及びコストが軽減される。また、培養室２５の気密性及び水密性が機械室２６に対して保たれているので、培養室２５の雰囲気から機械室２６の雰囲気が分離されている。そのため、培養室と機械室との間に温度差が発生したとしても、機械室内の落射式位相差顕微鏡に結露が発生することが抑制される。

また、照明光６１の波長が複数の異なる波長の間で切り換え可能である。そのため、得られた画像をぼかして、観察対象物２８の細胞境界における画像データ量を減らすことができ、細胞数の計測を行いやすくすることができる。また、結像面５８における光学像に含まれる各部のうち、第２対物レンズ５６に付着したゴミ等の異物による部分は、照明光６１の波長の変更によって影響を受けない。そのため、照明光６１の波長の変更により、光学像の各部について、観察対象物２８の像なのか異物による像なのかが特定できる。

また、輝度値の差分が所定値よりも小さい画素が、誤情報を含むノイズ画素として認識され、ノイズ画素が削除された２つの修正画像データが作成される。したがって、観察対象物２８の画像データにおいて、ゴミによる誤情報の影響を排除できる。

また、観察対象物２８からの反射光６２及び反射鏡４９からの反射光６２が観察光学系５２に入射する。観察光学系５２に入射する光量が増大するので、より識別性の高い観察対象物２８の画像データを得ることができる。

また、上皿４８に反射鏡４９が固定されているので、反射鏡４９を容易に配置できる。

［変形例］
本実施形態では、移動装置１３は、顕微鏡１２を移動させる装置であるが、この構成に限定されない。移動装置１３は、観察対象物２８と顕微鏡１２とを相対的に移動させる装置であればよい。移動装置１３は、顕微鏡１２を移動させる代わりに、観察対象物２８を移動させる装置であってもよい。また、本実施形態では、顕微鏡１２を自動で移動させるために移動装置１３が設けられている。移動装置１３は必須の構成要素ではなく、顕微鏡１２又は観察対象物２８を手動で移動させる場合は、移動装置１３が設けられなくてもよい。

本実施形態では、反射面４９ａを下面に設けた反射鏡４９が設けられている。反射鏡４９は必須の構成要素ではなく、反射鏡４９が設けられなくてもよい。この場合、観察対象物２８を通過して別の反射面の表面において反射された反射光６２に基づいて、顕微鏡１２に観察対象物２８の光学像が形成される。例えば、図３における上皿４８の下面、または上皿４８の上下方向１７の上側にさらに下皿４７を載せた場合における下皿４７の下面なども反射面４９ａと同様に反射面として利用することが可能である。

本実施形態では、反射鏡４９は、シャーレ２７の上皿４８に固定された板材であるが、この構成に限定されない。反射鏡４９は、観察対象物２８の上方に配置されて照明光６１を反射可能であれば良く、反射鏡４９が配置される位置や反射鏡４９が固定される対象物は限定されない。反射鏡４９は、培養室２５内に配置されて、インキュベータ１１の筐体２１に固定されてもよい。

本実施形態では、照明光６１の波長を複数の異なる波長の間で切り換えることにより、
得られる画像をぼかすことができ、ゴミ等の異物の画像データの抽出ができるが、これに限らず、照明光６１の波長を異なる波長に切り換えることにより、位相板と反射面の距離を調整することもでき、直接反射光が位相板において収束する位置（収束点）を変化させることもでき、結像面のピントを合わせたりすることもできる。

１０・・・観察装置
１１・・・インキュベータ
１２・・・落射式位相差顕微鏡（顕微鏡）
１３・・・移動装置
１５・・・表示装置
２０・・・開口
２１・・・筐体
２２・・・蓋体
２３・・・区画壁
２４・・・内部空間
２５・・・培養室
２６・・・機械室
２７・・・シャーレ
２８・・・観察対象物
４５・・・画像処理部
４７・・・下皿
４８・・・上皿
４９・・・反射鏡
４９ａ・・反射面（反射鏡の下面）
５０・・・照明光源
５１・・・照明光学系
５２・・・観察光学系
５３・・・撮像素子
６１・・・照明光
６２・・・反射光
７１・・・算出部
７２・・・認識部
７３・・・作成部

Claims (8)

1. 照明光源、上記照明光源からの照明光を生物細胞である観察対象物に出射する照明光学系、上記照明光が上記観察対象物を通過して反射された反射光から上記観察対象物の光学像を形成する観察光学系を備え、上記観察光学系は、上記反射光のうち、反射面で反射された直接反射光の位相を変更する位相板を備え、上記照明光学系及び上記観察光学系の双方が上記観察対象物の下方に配置されている落射式位相差顕微鏡と、
   上記観察光学系によって得られた上記光学像を光電変換して、上記観察対象物の画像データを作成する撮像素子と、
   上記画像データを表示する表示装置と、を備えており、
   上記照明光学系から出射され、上記観察対象物を通過する上記照明光が、上記照明光学系の光軸と平行な平行光である観察装置。
2. 上記観察対象物と上記落射式位相差顕微鏡とを相対的に移動させる移動装置を備えている請求項１に記載の観察装置。
3. 開口を有する筐体、上記開口を開閉可能な蓋体、及び、上記筐体及び上記蓋体によって画定される内部空間を上方の培養室及び下方の機械室に区画する区画壁を備えるインキュベータを備えており、
   上記観察対象物は、上記培養室内に配置されており、
   上記落射式位相差顕微鏡、上記撮像素子、及び上記移動装置は、上記機械室内に配置されており、
   上記区画壁は、上記培養室を上記機械室に対して気密性及び水密性を保つように上記筐体に固定され、上記区画壁の少なくとも一部は、上記照明光を透過する透明材料で形成されている請求項２に記載の観察装置。
4. 上記照明光源は、上記照明光の波長を、複数の異なる波長の間で切り換え可能に構成されている請求項１から３のいずれかに記載の観察装置。
5. 上記画像データを修正する画像処理部を備えており、
   上記画像データには、色情報として輝度値を含む画素が２次元座標で配列されており、
   上記画像処理部は、
   ２つの異なる上記波長の上記照明光によって得られた２つの上記画像データについて、同一座標の上記画素毎に、上記輝度値の差分を算出する算出部と、
   上記差分が所定値よりも小さい上記画素を、誤情報を含むノイズ画素として認識する認識部と、
   上記２つの画像データからそれぞれ上記ノイズ画素を削除して２つの修正画像データを作成する作成部と、を備える請求項４に記載の観察装置。
6. 上記観察対象物の上方に配置された反射鏡を備えている請求項１から５のいずれかに記載の観察装置。
7. 透光性材料で構成された下皿及び上皿からなり、上記生物細胞が収納されるシャーレを備え、
   上記上皿には、上記反射鏡が固定されている請求項６に記載の観察装置。
8. 上記照明光学系は、上記照明光源からの上記照明光を反射するハーフミラーと、上記ハーフミラーで反射された上記照明光を屈折させる第１対物レンズ及び第２対物レンズと、を備えており、
   上記観察光学系は、上記観察対象物からの上記反射光を屈折させる上記第１対物レンズ及び上記第２対物レンズと、屈折された上記反射光を透過させる上記ハーフミラーと、を備えている請求項１から７のいずれかに記載の観察装置。

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