CN113396350B - 使用投影参照物来引导校正光学器件的调节的成像系统和方法 - Google Patents

Abstract

使用投影参照物来引导校正光学器件的调节的系统和方法。在示例性方法中，可以通过光大致沿光轴传播而将参照物投影到成像检测器上，该光轴从参照物通过物镜延伸到达样品保持器的表面，并且从该表面通过物镜返回延伸到成像检测器。光可以传播通过位于成像检测器上游并与光轴间隔开的离轴光圈。可以使用成像检测器并且利用校正光学器件在两个或更多个不同设置下捕获参照物的多个图像。可以基于多个图像选择用于校正光学器件的设置，并且可以在校正光学器件具有所选设置时对样品进行成像。

Description

使用投影参照物来引导校正光学器件的调节的成像系统和 方法

相关申请

本申请要求在2019年2月6日提交的美国临时申请no.16/268,842的优先权，该美国临时申请的内容通过引用全文并入本文。

背景技术

由肉眼不可见的微小物体构成的样品可以在样品容纳在保持器中(例如容纳在显微镜载玻片或井中)的情况下用显微镜观察。保持器又由载物台支撑，使得样品与显微镜的物镜对齐并与其保持适当的距离。物镜收集来自样品的光，该光被聚焦以在用户的视网膜或检测器的光敏区域上形成样品的图像。保持器的壁位于样品和物镜中间。因此，来自样品的由物镜收集的光已经传播通过壁到达物镜。

显微镜通常利用具有球面的光学元件来折射或反射光。出于实际原因，光学元件被制造为具有球面。然而，球面劣于抛物面，因为球面不限定单个焦点。相反，焦点根据距光轴的径向距离而沿球面改变，这导致图像清晰度的损失(称为球面像差)。

显微镜物镜通常具有被布置成校正球面像差以提高图像质量的透镜系统。这些物镜被设计成在如下情况下工作最佳：当具有标准厚度和标准折射率的盖玻片提供在样品和物镜之间的壁时。(例如，标准厚度可以为0.17mm，标准折射率可以是1.515。)

与标准厚度或标准折射率的偏差会引入显著的图像像差。例如，图1示出了对于具有不同数值光圈的物镜，将用显微镜捕获的图像中的点对象的最大强度作为盖玻片的厚度误差的函数的曲线图。点对象的最大强度是图像清晰度的度量，并且与像差的量成反比。随着数值光圈增加，盖玻片厚度的小误差对于降低图像清晰度而言成指数地变得更加显著。

显微镜物镜通常配备有校正环，以补偿盖玻片厚度(和/或非标准折射率)的误差。调节校正环来改变物镜内透镜的配置，这可以减小图像中的球面像差。然而，校正环的调节的优化困难、令人失望并且耗时，因为校正环的调节也可能使图像散焦。

发明内容

本公开提供了一种使用投影参照物来引导校正光学器件的调节的系统和方法。在示例性方法中，可以通过光的传播将参照物投影到成像检测器上，该光的传播通常沿从参照物通过物镜延伸到样品保持器的表面并且从该表面通过物镜返回成像检测器的光轴。光可以传播通过位于成像检测器上游并且与光轴间隔开的离轴光圈。可以使用成像检测器并且利用校正光学器件在两个或更多个不同设置下捕获参照物的多个图像。可以基于多个图像选择用于校正光学器件的设置，并且可以在校正光学器件具有所选择的设置的同时对样品成像。

附图说明

图1是对于具有不同数值光圈的物镜，将用显微镜捕获的图像中的点对象的最大强度作为盖玻片的厚度误差的函数的曲线图，其中光在点对象和显微镜的物镜之间通过盖玻片。(参见https://www.microscopyu.com/microscopy-basics/coverslip-correction。)

图2是根据本公开方面的利用参照物和离轴光圈的示例性显微镜成像系统的示意图，该参照物和离轴光圈用于利用物镜自动聚焦和利用物镜的校正光学器件自动校正。

图3是根据本公开方面的另一示例性显微镜成像系统的示意图，该系统类似于图2的系统，除了校正光学器件与物镜分开。

图4是根据本公开方面的可以在物镜(沿图4中的水平轴线示出)和校正光学器件(沿图4中的竖向轴示出)的一系列不同设置处利用图2的显微镜成像系统捕获的参照物的一组图像的程式化表示。

图5是根据本公开方面的可以在物镜(沿图5中的水平轴线示出)和校正光学器件(沿图5中的竖向轴线示出)的一系列不同设置处利用图3的显微镜成像系统捕获的参照物的一组图像的程式化表示

图6是根据本公开方面的图2的显微镜成像系统的实施例的示意图，其中校正光学器件是物镜的透镜或透镜组并且可利用校正环进行调节。

图7是根据本公开方面的图6的显微镜成像系统的示例性光学布局的视图，并示出了光从参照物光源传播到样品保持器的远侧表面以及从远侧表面传播到成像检测器的光轴和光路，其中光在到达成像检测器之前穿过物镜下游的离轴光圈。

图8是根据本公开方面的图7的显微镜成像系统的物镜以及用于自动调节校正光学器件的系统的示例性致动器的选定方面的侧视图。

图9是图8的物镜和致动器大致沿图8的线9-9截取的顶视图。

图10是图8的物镜和致动器大致沿图8的线10-10截取的剖视图。

图11是图7的显微镜成像系统的光学布局的选定方面的简化程式化视图，其在通过传播穿过样品保持器的壁而将参照物投影到成像检测器上时截取的，并且在画面A、B和C中示出了物镜的不同设置如何可以影响参照物的光学对应物在成像检测器处的位置、尺寸、形状和/或强度。

图12是图7的显微镜成像系统的光学布局的选定方面的简化程式化视图，如图11中截取，除了在画面A、B和C中示出了通过转动校正环而产生的校正光学器件的不同设置如何影响成像检测器处的参照物的光学对应物的位置、尺寸、形状和/或强度。

图13是根据本公开方面的图6的显微镜成像系统的另一示例性光学布局的视图，其中光学布局类似于图7的光学布局，除了光穿过物镜上游的离轴光圈之外。

图14是根据本公开方面的图6的显微镜成像系统的又一示例性光学布局的视图，其中参照物是由掩模创建的图案化参照物。

图15是图14的掩膜大致沿图14的线15-15截取的视图。

具体实施方式

本公开提供了一种使用投影参照物来引导校正光学器件的调节的系统和方法。在示例性方法中，可以通过光的传播将参照物投影到成像检测器上，该光的传播通常沿从参照物通过物镜延伸到样品保持器的表面并且从该表面通过物镜返回成像检测器的光轴。光可以传播通过位于成像检测器上游并且与光轴间隔开的离轴光圈。可以使用成像检测器并且利用校正光学器件在两个或更多个不同设置处捕获参照物的多个图像。可以基于多个图像选择用于校正光学器件的设置，并且可以在校正光学器件具有所选择的设置的同时对样品成像。

本文公开的利用经由离轴光圈投影的参照物的成像系统和方法提供了图像的聚焦和校正的优点。首先，即使当由已经以相对大的尺寸公差制造的低成本样品保持器支撑时，样品也可以以高清晰度和一致的图像质量成像。其次，通过离轴光圈投影参照物可以通过将聚焦和校正至少部分地彼此解耦而使得物镜和校正光学器件的调节更有效。结果，从参照物的捕获图像获得的各个不同图像性质可以指示图像是否被聚焦和校正。例如，至少一个图像性质(例如，参照物在捕获的图像中的位置和/或形状)可以被描述为聚焦性质，该聚焦性质主要根据物镜的前焦点和由样品保持器的远端表面限定的对象平面的轴向位置关系而变化，该对象平面将来自参照物的光朝向下游成像检测器反射。因此，通过基于来自参照物的捕获图像的聚焦性质的值的反馈来调节物镜(和/或载物台)，可以主要在图像校正之前执行聚焦。然后，可以通过调节校正光学器件同时保持参照物的聚焦(基于聚焦性质)来执行图像校正，以基于来自捕获的图像的至少一个其他图像性质的值的反馈来优化至少一个其他图像性质(例如，图像对比度和/或参照物强度)。

本公开的另外方面在以下章节中描述：(I)定义，(II)系统概述，(III)成像方法，以及(IV)示例。

I.定义

本公开中使用的技术术语具有本领域技术人员通常认可的含义。然而，以下术语可以如下所述进一步定义。

光圈构件-具有至少大致围绕光透射区域(光圈，光穿过该光透射区域)的遮光区域的光学元件。光圈构件也可以称为光圈光阑。示例性光透射区域包括开口和孔，诸如针孔、虹膜(irises)和狭缝等。光透射区域可以被任何光学透明介质(诸如空气、玻璃、塑料等)占据。光圈可以相对于光轴“离轴”(在不存在光圈构件的情况下限定)，这意味着光轴与光圈构件的遮光区域相交，但不与光透射区域相交。光圈构件可以将入射光线束(入射光束)限制成其空间受限的子集，以便在光圈构件的下游传播。离轴光圈可以阻挡入射光束的中心光线等的传播。

校正光学器件-光学元件，诸如至少一个透镜和/或至少一个反射镜，其可调节以减小成像系统中的光学像差。校正光学器件的调节可以改变校正光学器件和/或其光学元件的位置、配置和/或形状等。校正光学器件可以减小任何合适的像差，诸如球面像差、色差、彗差、像散、畸变和/或场曲等。校正光学器件可以形成物镜的一部分或者可以与物镜分开。在示例性实施例中，校正光学器件是物镜的至少一个透镜，并且可以经由物镜的校正环可调节。

检查区域-位于成像系统的光轴上的区域，诸如样品和/或样品保持器的对象被放置到该区域中以用于检查(即，利用成像检测器成像)。检查区域可以在载物台附近或在载物台处，载物台是用于对象的平台或其他支撑物。

图像-在距对象一定距离处并且至少部分地利用已经与对象交互和/或由对象生成的光形成的对象的光学对应物(即，光学图像)，或者通过检测光学对应物的光而创建的光学对应物(并且因此对象)的捕获表示(即，捕获图像)。在一些实施例中，所捕获的图像可以是数字图像，该数字图像是光学图像(和对象)的数值表示。当用作动词时，“图像”表示形成对象的光学图像和/或捕获光学图像。

成像检测器-检测形成光学图像的光并创建与光学图像对应的捕获图像(例如，数字图像)的传感器设备。光检测和图像创建的耦合过程在此被描述为图像捕获。成像检测器能够检测光在光敏检测区域上的空间变化(例如，强度变化)。成像检测器可以是阵列检测器，诸如电荷耦合器件(CCD)传感器、有源像素传感器(例如，互补金属氧化物半导体(CMOS)传感器)、混合CCD-CMOS传感器等。成像检测器可以创建为二维图像的表示的光栅图像，诸如像素的矩形阵列，并且成像检测器可以构造成创建彩色图像、灰度(单色)图像或两者。本文公开的成像系统可具有用于捕获参照物和样品的图像的单个成像检测器，或至少一对成像检测器(例如，一个用于捕获参照物的图像，另一个用于捕获样品图像)。

光-光学辐射，包括紫外线辐射、可见光辐射(即，可见光)和/或红外线辐射。

光源-通过任何合适的机制产生光的设备，所述机制包括电致发光、受激发射、热辐射和/或光致发光等。光源可包括半导体器件、激光器(例如，固态激光器、气体激光器、准分子激光器、染料激光器、半导体激光器等)、弧光灯等。示例性半导体光源包括激光二极管、发光二极管(LED)和超发光二极管等。

对象-被成像的材料或物品。对象可以是参照物、样品和/或样品保持器等。

物镜-收集来自成像系统的检查区域的光的光学元件或光学元件组。物镜通常至少构成成像系统的收集光学器件的上游端。物镜单独地或与收集光学器件的一个或多个其他光学元件(例如，镜筒透镜和/或中继镜)组合地构造成形成位于检查区域中的对象的共轭图像。因此，物镜可以聚焦或通常准直从检查区域接收的光。物镜和检查区域可以沿光轴(例如沿z轴)相对于彼此移动，以改变物镜的设置(例如z轴位置)。在一些实施例中，物镜可包括包含在壳体中的多个光学元件，例如透镜。一个或多个物镜光学元件可以是校正光学器件，校正光学器件可相对于物镜的另一个(或多个)光学元件沿z轴移动。在一些实施例中(例如，利用落射照明)，物镜还可以将光透射到检查区域。

光轴-如由其光学元件所限定的，表示光学系统的旋转对称轴的假想线。光轴通常对应于光沿其传播的光路，例如从光源到检查区域以及从检查区域到检测器。如本文所述，离轴光圈可以使光路的至少一部分从光轴径向偏移。光轴可以通过反射而“折叠”一次或多次，这意味着每次光轴被折叠，光轴以任何合适的角度(诸如45度、60度、90度、120度、135度、150度或180度等)而改变方向。

光学器件-成像系统的光学元件组，其可以沿光源和检查区域之间的光路(照明光学器件)和/或沿检查区域和成像检测器之间的光路布置(收集光学器件)。光学元件可以是与光相互作用，例如收集、引导、聚焦和/或准直光，和/或至少部分地阻挡(例如，过滤)光的任何设备或结构。光学元件可以通过任何合适的机制来起作用，该合适的机制例如为反射、折射、散射、衍射、吸收和/或过滤等。示例性光学元件包括透镜、反射镜、漫射器、光栅、棱镜、滤光器、光圈构件、掩模、分束器、透射光纤(光纤)等。

处理器-对数据执行操作的电子电路。处理器可以基于指令集来执行操作。数据和/或指令可以存储在处理器外部的存储器中，和/或数据可以由数据流提供。

图像的性质-图像(通常是所捕获的图像)的特征、质量或其他可测量特性。对应于图像聚焦和/或光学像差的示例性图像性质包括图像中的参照物的光学对应物和/或整个图像的位置、大小、形状、对比度和/或强度。每个性质可以被描述为图像的质量度量。

参照物-具有预定尺寸、形状和/或图案的对象。参照物可以被投影到样品保持器的一个或多个表面上，并且通过在该一个或多个表面处的反射被投影到成像检测器上，等等。

对象可以是点源对象。点源对象可具有与物镜的衍射极限(分辨能力)相当或比其小的尺寸。例如，点源对象可具有小于约2微米、1微米、0.8微米或0.5微米等的直径。因此，点源对象在成像时(在对焦并校正了像差时)可以产生艾里图案。例如，点源对象可以与光源(例如，整体光圈)集成和/或可以由与光源分开的光圈形成。在其他情况下，对象可以是由掩模创建的图案化对象。

样品-被成像的试样。样品可具有任何合适的性质。样品可以是有机的和/或无机的、天然的和/或制造的，并且可包括任何合适的组件、材料、物质、分开物、提取物、颗粒等。在示例性实施例中，样品是生物样品并且包括待成像的生物细胞。生物细胞可以是真核的或原核的，并且可以是活的或死的(例如，固定的)。示例性生物细胞包括已建立的细胞(细胞系)、原代细胞、组织样品的细胞、来自临床样品(例如，血液样品、流体抽吸物、组织切片等)的细胞、细菌细胞等。样品还可包括任何合适的介质，通常是水性介质，该介质可包括水、盐、缓冲液、葡萄糖、去污剂、染料、蛋白质、氨基酸或其任何组合等。介质可以是或可以不是生物细胞的生长介质。

样品保持器-用于保持至少一个样品或任何空间隔离的样品阵列的设备。样品保持器可具有水平壁，该水平壁包括可以彼此平行的近端表面(更靠近物镜)和远端表面(更远离物镜)。样品可以位于远端表面上，并且样品的光学图像可以由已经穿过水平壁至少一次或两次的光形成。水平壁可以是井的底壁(例如，形成井的底部)、盖玻片等。

样品保持器可包括至少一个井。井可具有任何合适的流体总容量，例如小于约10mL、5mL、2mL、1mL、0.5mL、0.2mL或0.1mL，和/或大于约0.025mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL或1mL等。井的内径从井的顶部到底部可以是恒定的或可以变化(例如，可以减小)。如果内径朝向底部减小，则直径可以平滑地、阶梯式地或其组合地减小。在一些实施例中，内径可以线性地减小，或者平滑地但非线性地减小。如在水平横截面中所限定的，井的形状从井的顶部到底部可以是恒定的，或者可以变化。该形状和/或底部的周边可以是圆形、椭圆形、多边形(例如，矩形，诸如正方形)等。井可以由任何合适的材料形成，但是聚合物可以是优选的。井的底部和/或侧壁可以用另一种材料涂覆，例如用胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白等涂覆，以促进细胞粘附。井可以由具有井阵列的保持器(例如多井板)提供。样品保持器的这些井可以彼此附接(例如，通过诸如注射成型彼此一体地形成)，以形成具有水平井阵列的多井样品保持器，该水平井阵列具有彼此基本共面的底部和/或底壁。样品保持器可具有任何合适数量的井，例如至少或确切地4、6、12、24、48、96或384等个井。井可以以矩形阵列布置，例如，对于具有六个井的多井板是2×3阵列，或者对于具有96个井的多井板是8×12阵列。

在其他实施例中，样品保持器可以是载玻片和盖玻片的组件、流式芯片、或用于培养细胞的板或瓶等。

设置-位置、取向和/或配置。校正光学器件和物镜中的每一个可以被调节到多个不同的设置，以改变参照物的图像的一个或多个性质。

II.系统概述

本节提供了示例性显微镜成像系统50、50'的概述，其利用经由离轴光圈构件54投影到成像检测器56的参照物52，来提供来自所捕获的图像58的反馈，用于调节物镜60和/或校正光学器件62；参见图2-5。

系统50和50'是类似的，除了校正光学器件62与系统50中的物镜60是一体的(参见图2)，而与系统50'中的物镜60是分开的(参见图3)。以下讨论将仅参照物图2的系统50，但同样与图3的系统50'有关。

系统50包括载物台64，以在与载物台64相关联的检查区域70中的物镜60的焦平面68处支撑样品保持器66。样品保持器66可以容纳至少一个样品72，诸如这里所示的生物细胞74。样品可以由样品保持室(例如由井76限定的室)，或载玻片和盖玻片之间的空间等容纳。然而，在一些实施例中，当用于聚焦或校正程序时，样品保持器可以不将样品保持在光轴上(和/或可以不容纳一个或多个样品)。

样品保持器66提供了设置在样品72(或样品保持室)和物镜60之间的壁78。壁78具有沿从物镜延伸的光轴分别远离和靠近物镜60的远端表面80和近端表面82。表面80、82可以彼此平行并且分开小于一毫米，例如小于约500微米、300微米或200微米等。远端表面80可在物镜60和/或校正光学器件62的调节期间反射光84(由虚线箭头指示)，以提供聚焦和/或光学校正，如下文更详细地描述。

系统50具有一个或多个光源，例如参照物光源86和至少一个样品光源88，以产生光(例如光84)。在系统50的所示状态下激励参照物光源86，并在聚焦和/或校正过程期间照射参照物52。当系统50处于样品成像状态时，样品光源88可以被激励(并且参照物光源可以被关闭)，以产生用于样品72的落射照明或透射照明的光。在一些实施例中，相同的光源可以用于聚焦/校正以及样品成像(例如，通过利用来自参照物光源的光束扫描样品)。

光从每个光源86、88传播到样品保持器66和/或样品72，并从样品保持器和/或样品经由光学器件90传播到成像检测器56。光学器件包括引导和影响该传播的光学元件组，但是光学元件的不同子集可以操作用于照明检查区域70和收集来自检查区域70的光。此外，光学元件的不同子集可以用于利用相应的光源86、88对检查区域70进行照明。例如，光学元件中的一个或多个可以专用于每个光源。此外，当每个光源工作时，光学元件的不同子集可以用于收集来自检查区域70的光，使得所收集的光入射到与每个光源相对应的不同成像检测器上。例如，该系统可具有专用于捕获投影参照物的图像的参照物成像检测器，以及专用于样品成像的样品成像检测器。

光学器件90包括物镜60、校正光学器件62和离轴光圈构件54。当每个相应的光源86、88工作时，物镜60和校正光学器件62可以位于从检查区域70到相同或不同的成像检测器56的收集路径上。如果检查区域被落射照明，则物镜和校正光学器件还可以操作性地定位在从每个光源86、88到检查区域70的照明路径上。相反，离轴光圈构件54通常用于限制仅来自参照物光源86的光的通过。换言之，离轴光圈构件54可以设置在来自参照物光源86(而不是来自样品光源88)的照明路径的上游，或者可以设置在到系统的参照物成像检测器(而不是专用样品成像检测器)的收集路径的下游。因此，如果光圈构件54位于物镜的下游，并且同一成像检测器用于参照物和样品成像，则在利用参照物进行聚焦/校正之后并且在执行样品成像之前，可能需要从光路移除光圈构件。在一些实施例中，当参照物光源86被激励时，可以使用一对离轴光圈构件54，例如，分别在物镜60的上游和下游的光圈构件54。然而，多于一个离轴光圈构件54的存在通常需要将对应的光圈彼此对准，以允许光穿过两个光圈。

物镜60、校正光学器件62和载物台64的位置和/或配置可以通过相应的致动器92、94和96来调节。每个致动器可以由马达98驱动和/或在计算机100，特别是其处理器102的控制下自动操作，如在所描述的实施例中所述。计算机100(和/或处理器102)可以(经由有线或无线连接)连接到成像系统50的设备(诸如每个成像检测器56、每个光源86、88和/或每个致动器92、94和96等)的任何适当组合。在一些实施例中，可以由用户基于经由计算机100传送的调节指令手动地操作至少一个致动器，例如用于校正光学器件62的致动器94。

致动器92、94和96在系统50中可具有任何合适的作用。物镜致动器92可操作以调节物镜60的设置，从而通过改变物镜60和载物台64相对于彼此的z位置和/或通过改变物镜的配置来提供聚焦。例如，物镜致动器92可以驱动物镜相对于载物台64沿z轴移动(和/或可以相对于物镜60沿z轴驱动载物台64)。校正致动器94可以操作以改变校正光学器件62的设置，例如通过相对于物镜60的至少一个光学元件沿光轴(例如，沿z轴)移动校正光学器件。载物台致动器96可以驱动载物台64在xy平面中的移动，例如以对样品保持器的不同井中的样品进行成像和/或扫描大于物镜的视场的样品。载物台致动器也可以或替代地能够驱动载物台64沿z轴的移动。

计算机100可具有任何合适的硬件，以便于与处理器102通信和/或处理器102的操作。示例性硬件包括存储器104，其存储用于处理器102执行任何合适的过程的指令，诸如确定一个或多个图像性质的值的图像处理、这些值彼此之间和/或与一个或多个阈值的比较、光学器件(例如，物镜和/或校正光学器件)的设置的计算、用于致动器的以改变这些设置的控制信号的生成、经由一个或多个用户接口与用户的通信等。存储器104还可以存储与系统相关的数据，诸如存储定义用于参照物的对焦区域的图像坐标(参见下文)。可能合适的示例性用户界面包括输入设备106(例如，键盘、小键盘、鼠标、触摸屏等)和输出设备108(例如，监视器、打印机、触摸屏等)。在一些实施例中(例如，具有触摸屏的实施例中)，相同的设备可以处理来自用户的输入和来自处理器的输出。

图4示出了当参照物是点源对象(也参见图2)时，可以用显微镜成像系统50收集的参照物52的一组所捕获的图像58的程式化表示。更准确地说，参照物52的每个图像58记录在成像检测器56的光敏区域上形成的参照物52的光学对应物110。所捕获的图像58是在物镜60的一系列不同设置(沿水平轴线112在A、B、C和D处示出的)下获得的，并且在校正光学器件62的一系列不同设置(沿竖向轴线114在E、F、G和H处示出的)下获得的。每个轴线112、114表示物镜60或校正光学器件62的连续设置范围，但是物镜和/或校正光学器件也可以是连续可调节的或可以不是连续可调节的。

还示出了附加的图像特征。每个光学对应物110的质心116用十字标记。质心表示光学对应物的“质量”的中心，其中质量是图像平面中光学对应物的总强度。当光学对应物110大致处于焦点对准状态时质心116所在的焦点区域118用虚线框标记，并且焦点区域118可以由所捕获图像内的x和y图像坐标来限定。图像坐标可以存储在计算机100的存储器104中，并且可以由处理器102访问。焦点区域118在所捕获的图像58内的位置可以由制造商或用户预先确定。在本示例中，为了方便起见，焦点区域118位于所捕获的图像的中心，但替代地焦点区域118可具有所捕获的图像内的任何其他合适位置。

在成像系统50或50'中使用离轴光圈构件54可以在物镜60和校正光学器件62的调节期间使光学对应物110的各种性质产生特性变化。这些特性可包括(a)所捕获的图像58内质心116相对于焦点区域118的位置，(b)光学对应物110的形状(例如，其形态)，(c)光学对应物110的尺寸，(d)光学对应物110的强度(例如，其最大强度)，和/或(e)每个所捕获的图像58的对比度。在图4中示出了这些性质的示例性变化。

当光学对应物110聚焦和散焦时，质心116的位置变化能够简化对物镜设置(例如A-D之一)和校正设置(例如E-H之一)的适当组合的搜索。当光学对应物110散焦时，质心116在焦点区域118之外(例如，参见设置组合AH和DE)。质心116距焦点区域118的距离一般表示散焦的程度(例如，比较设置组合AG、BG和CG)。质心116与焦点区域118间隔开的方向(例如，这里所示的左或右)通常表示一个或两个设置需要被改变所沿的方向(例如，比较BG和DG)。

光学对应物110和/或相应图像58的其他性质通常也可与光学对应物110的位置相关。例如，在本示例中，当质心116位于焦点区域118中时，光学对应物110大致是圆形的，并且根据散焦程度(例如，比较设置组合BF、CF和DF)而变得越来越长。光学对应物的尺寸也可与散焦的程度直接相关(例如，比较设置组合AE、BE、CD和DE)，因此光学对应物110的最大强度可与散焦的程度反相关。

目标通常是有效地找到用于物镜和校正环的最佳设置组合。结合到本公开的系统和方法中的离轴光圈能够通过将由光学对应物的位置和/或形状指示的聚焦/散焦程度与校正/去校正的程度解耦来减少需要生成和比较的组合的数量。例如，在本示例中，利用设置组合AE、BF、CG和DH产生的光学对应物大致处于焦点对准，但是利用校正光学器件校正的CG中是最佳的，因为对于组合CG，光学对应物110的尺寸较小，且其强度较大。

图5示出了当参照物是点源对象时，可以用显微镜成像系统50'(见图3)收集的参照物52的光学对应物110的一组所捕获的图像58的程式化表示。在成像系统50'中，校正光学器件62与物镜60分开。因此，校正光学器件的调节对物镜60的前焦平面的位置的影响比在成像系统50中的影响小得多(比较图2和3)。结果，在校正光学器件62的任何调节之前，可将物镜60调节到最终设置。例如，从校正光学器件62的设置E-FI中任一项开始，可将物镜60调节到将质心116置于焦点区域118中的C列设置。然后可以调节校正光学器件62以找到最佳图像清晰度(在该示例中为图像CG)，而基本上不改变质心116的位置。

在本公开的其他地方，例如在章节I、III和IV中描述了可能合适的成像系统50和50'的其他方面。

III.成像方法

本章节描述了对参照物和/或样品成像的示例性方法。可以使用本公开的任何系统以任何合适的顺序和组合来执行本章节中描述的步骤。

可以将参照物投影到成像检测器上。参照物可以是点源对象或图案化对象等。为了投影参照物，光可以从光源通过参照物、通过物镜，并且通过样品保持器的壁到达壁的远端表面自上游到下游传播。远端表面非常接近于并因此对应于样品的目标平面。光从远端表面反射，返回穿过壁和物镜，到达成像检测器的检测区域。光穿过参照物下游和成像检测器上游的离轴光圈。可以使用成像检测器来捕获所投影的参照物的图像。每个所捕获的图像可表示物镜和/或校正光学器件的不同设置，并且因此表示设置的不同组合。可以利用处理器处理这些图像以获得这些图像的一个或多个性质的值，所述性质诸如所投影的参照物的位置、形状、尺寸、强度和/或对比度。在一些实施例中，可以组合两个或更多个性质的值以产生作为共同用于两个或更多个性质的分数的值。

可以基于所捕获的图像，并且特别地基于通过处理所捕获的图像而获得的一个或多个图像性质的值，来选择用于物镜和/或校正光学器件的设置。例如，可以比较图像的两个或更多个性质的分数来选择设置。在一些实施例中，可以在校正光学器件之前调节物镜，以基于所捕获的图像的第一子集实现聚焦(例如，粗略或近似聚焦)。然后，可以可选地通过进一步调节物镜来调节校正光学器件，以基于在第一子集之后所捕获的图像的第二子集来优化所捕获的图像的清晰度。图像清晰度的量度可由所捕获图像的对比度和/或强度来提供。

当物镜和/或校正光学器件具有选定的设置或选定的设置组合时，可以对样品成像。样品可以位于(第一)样品保持器的相同远端表面上、相同(第一)样品保持器的不同但对应的远端表面(例如，第一样品保持器的不同井的底部)上、或与第一样品保持器大致相同的第二样品保持器的对应远端表面上。可以用与用于投影参照物不同的光源来照射样品，并且用同一成像检测器或不同成像检测器来捕获图像。

IV.示例

以下示例描述了成像系统和方法的所选方面和实施例，其利用来自投影参照物的图像的反馈来引导在样品成像之前对光学器件的调节。这些方面和实施例旨在用于说明目的，而不应限制本公开的整个范围。

示例1.具有自动校正环调节的显微镜系统

该示例描述了显微镜成像系统50的示例性实施例130，该显微镜成像系统50包括物镜60，物镜60具有耦合到物镜的校正环132的校正光学器件62。校正环132可以构造成自动地(或手动地)调节以减少图像像差，诸如球面像差；参见图6-12。

成像系统130可具有上文针对系统50描述的元件、部件和特征的任何合适组合。已经在上面针对图2描述的部件在图6中由相同的附图标记标识。

校正致动器94包括校正环132，校正环132是物镜60的一部分。校正环132通过校正致动器94在任一旋转方向上的旋转驱动物镜60的透镜或透镜组134在相反的轴向上的相应运动，其中透镜或透镜组134构成校正光学器件62。

图7示出了显微镜成像系统130的示例性光学布局。如用一对代表性光线136所描绘的，光84通常沿参照物光源86和成像检测器56之间的折叠光轴138传播。光线136所遵循的光路140用一系列箭头标识。

光84从参照物光源86的参照物52沿光路140的第一段传播。该光由准直透镜142准直以形成平行光束，由分束器144反射，并由物镜60的无限远校正实施例聚焦到样品保持器66的远端表面80上。由此，通过光路140的第一段将参照物52投影以在远端表面80上形成参照物52的中间图像。

光84被远端表面80反射，并沿光路140再远端表面80和成像检测器56之间的第二段传播。该光被无限远校正物镜60收集并大致准直以形成平行光束，并穿过分束器144和光圈构件54。镜筒透镜146将光聚焦到成像检测器56上。光圈构件54允许光线136穿过光圈构件的光圈148。然而，通过阻挡未与光圈148对准的光线，光圈构件的不透明区域150使从光圈148出射的光束变窄并横向偏移。结果，光路140的延伸到成像检测器56的最后区段相对于光轴138偏斜，这可以产生上面在章节II中关于图4和/或图5所述的光学对应物110的性质。

图8和图9示出了校正致动器94和校正光学器件62的透镜134之间的示例性耦合的选定方面。校正致动器94可包括固定到共同轴154的齿轮152。该共同轴可以由校正致动器94的马达(例如伺服马达)如156处的旋转箭头所示的旋转地驱动。齿轮152与校正环132啮合，使得齿轮152的旋转驱动校正环132如在158处所示的旋转。

图10示出了校正环132的旋转如何驱动校正透镜134相对于物镜60的固定的近端透镜160和远端透镜162的轴向移动。校正透镜134可以安装到框架164上，框架164具有与物镜60的壳体168的螺纹连接166。校正环132的旋转根据旋转方向驱动框架164(和透镜134)在壳体168内向上或向下的螺纹行进。

图11示出了成像系统130的光路140的第二段的简化的程式化版本，其中物镜60处于画面A-C中的三种不同设置。三个图示出了调节物镜60可如何在由成像检测器56捕获的图像58中使参照物52的光学对应物110聚焦和散焦(也参见图4和图7)。图像58中光学对应物110的位置、尺寸、形状和强度在画面A和B之间以及画面B和C之间变化。在画面B中，光学对应物110处于焦点对准状态。物镜60的前焦平面与样品保持器66的远端表面80大致共面，并且光学对应物110是在图像58中居中的小的高强度光斑。在画面A和C中，光学对应物是散焦的。物镜60的前焦平面在样品保持器66的远端表面80的上方(画面A)或下方(画面C)，光学对应物110比画面B中的更大、更细长、强度更低。光学对应物110的位置移动到画面B中其位置的左侧(画面A)或右侧(画面C)。

图12与图11相似，除了校正光学器件62处于画面A-C中的三种不同设置，而不是物镜60。校正光学器件62可以通过沿旋转方向158或170转动校正环132来调节。调节校正光学器件62还可以以与上述图11类似的方式改变物镜60的前平面的位置(比较图11的画面A-C与图12的画面A-C)。因此，成像系统130可能需要调节物镜60和校正光学器件62两者以找到给定样品固持器的最佳设置组合。

示例2.具有上游离轴光圈的成像系统

该示例描述了示例性成像系统180，其包括在光路140中位于物镜60上游的离轴光圈148；参见图13。

成像系统180类似于成像系统130(比较图7和图13)，除了光圈构件54具有沿光轴138的不同位置。更具体地说，光圈构件54位于准直透镜142的下游和分束器144的上游。因此，在两个系统中，无论是物镜60的上游(成像系统180)还是物镜60的下游(成像系统130)，光圈构件都使平行光束变窄并使其相对于光轴138离轴移动。

实施例3.具有图案化参照物的显微镜成像系统

该示例描述了示例性显微镜成像系统200，其包括形成图案化参照物52的掩模202；参见图14和15。

图14示出了成像系统200的光学布局。成像系统200类似于成像系统180(参见图13)，除了点源参照物52(系统180)被掩模202形式的图案化参照物52(系统200)代替。可以使用由参照物光源86产生的光84将掩模202投影到成像检测器56上，该参照物光源可以是点源(例如，光源可以是发光二极管)或不是点源。可以用位于掩模上游的光轴138上的准直透镜206产生的准直光束204照射掩模202。如上对于点源参照物所述，掩模202的光学对应物的质心在用成像检测器56所捕获的图像中的位置根据散焦的程度而改变。在将质心保持在图像的焦点区域中的同时可以优化所捕获的图像的对比度，以找到最佳焦点和图像校正。

图15示出了沿光轴观察的掩模202。掩模可具有多个径向布置的并通过遮光区段彼此分开的光透射区段208。然而，光透射区域的任何合适的规则或不规则布置可以提供足够的对比度。

实施例4.选定的实施例

该示例将本公开所选定的实施例描述为一系列的索引段落。

段落1.一种成像的方法，所述方法包括：(a)通过使光大致沿光轴传播而将参照物投影到成像检测器上，所述光轴从所述参照物通过物镜延伸到样品保持器的表面，并且从所述表面通过所述物镜返回延伸到所述成像检测器，其中，所述光传播通过位于所述成像检测器上游并且与所述光轴间隔开的离轴光圈；(b)使用所述成像检测器并且利用校正光学器件在两个或更多个不同设置下捕获所述参照物的多个图像；(c)基于所述多个图像选择用于所述校正光学器件的设置；以及(d)在所述校正光学器件具有所选设置时对样品进行成像。

段落2.根据段落1所述的方法，其中，所述参照物是点源对象。

段落3.根据段落1或2所述的方法，其中，用于投影步骤的光由激光二极管产生，并且其中，所述参照物与所述激光二极管成一体。

段落4.根据段落1至3中任何一项所述的方法，其中，所述参照物是由掩模形成的图案化对象。

段落5.根据段落4所述的方法，其中，所述投影步骤包括在掩模的上游准直光，并且使所准直的光的一部分穿过所述掩模。

段落6.根据段落1至5中任一项所述的方法，其中，所述光圈位于所述成像检测器的上游且在所述参照物的下游。

段落7.根据段落6所述的方法，其中，所述光轴具有从所述参照物延伸到所述样品保持器的表面的第一段，并且其中，所述光圈位于所述物镜的上游并且从所述光轴的所述第一段径向偏移。

段落8.根据段落6所述的方法，其中，所述光轴具有从所述样品保持器的表面延伸到所述成像检测器的第二段，并且其中，所述光圈位于所述物镜的下游并且从所述光轴的第二段径向偏移。

段落9.根据段落1至8中任一项所述的方法，其中，所述投影步骤在所述成像检测器上形成所述参照物的光学对应物。

段落10.根据段落9所述的方法，其中，所述光学对应物在所述成像检测器上具有这样的位置：如果所述物镜和所述样品保持器沿z轴相对于彼此移动，则该位置改变。

段落11.根据段落9或10所述的方法，其中，所述光学对应物在所述成像检测器上具有这样的位置：如果所述校正光学器件和所述样品保持器沿z轴相对于彼此移动而不移动作为一个单元的物镜，则该位置改变。

段落12.根据段落1至11中任一项所述的方法，其中，所述物镜包括所述校正光学器件和一个或多个其他光学元件，所述方法还包括如下步骤：相对于所述一个或多个其他光学元件移动所述校正光学器件以将所述校正光学器件置于所述两个或更多个不同设置中的每一个。

段落13.根据段落1至12中任一项所述的方法，还包括：确定来自所述多个图像中的每个图像的至少一个性质或性质组合的值，其中，所述至少一个性质或性质组合中的每个性质选自由所述图像中的所述参照物的形状、大小、强度、位置和对比度组成的组；以及将所述多个图像的值彼此进行比较；其中，基于比较所述值来选择用于所述校正光学器件的所述设置。

段落14.根据段落13所述的方法，所述方法还包括：当所述多个图像被捕获时，基于从已经捕获的所述图像的子集确定的所述至少一个性质或性质组合的值来调节所述物镜。

段落15.根据段落13或14所述的方法，所述方法还包括：当所述多个图像正被捕获时，基于从已经捕获的所述图像的子集确定的所述至少一个性质或性质的组合的值来调节所述校正光学器件。

段落16.根据段落1至15中任一项所述的方法，所述方法还包括：基于来自所述多个图像的第一子集的反馈来调节所述物镜，以将所述参照物的光学对应物的质心定位在预定图像区域中；以及基于来自在所述第一子集之后捕获的所述多个图像的第二子集的反馈来调节所述校正光学器件和所述物镜，以在改进所述光学对应物的清晰度的同时将所述光学对应物保持在所述预定图像区域中。

段落17.根据段落1至16中任一项所述的方法，其中，通过选择用于所述物镜的设置和用于所述校正光学器件的设置的组合来执行所述选择步骤，该组合优化所述多个图像中的至少一个性质或性质的组合。

段落18.根据段落17所述的方法，其中，选择组合的步骤包括将从利用所述设置的第一组合捕获的图像所确定的性质或性质组合的第一值与从利用所述设置的第二组合捕获的另一图像所确定的性质或性质组合的第二值进行比较。

段落19.根据段落18所述的方法，还包括：确定所述参照物在利用所述第一组合捕获的所述图像中的第一位置及所述参照物在利用所述第二组合捕获的所述图像中的第二位置，其中，所述第一位置与所述第二位置大致相同。

段落20.根据段落17至19中任一项所述的方法，还包括如下步骤：在使用来自所述成像检测器的反馈的捕获步骤期间搜索所述物镜的设置和所述校正光学器件的设置的组合。

段落21.根据段落20所述的方法，其中，所述搜索步骤基于表示所述参照物在所述图像的至少一个子集的每个图像内的位置的第一性质和表示所述参照物在所述图像的至少一个子集的每个图像中的形状、大小、强度和/或对比度的第二性质。

段落22.根据段落1至21中任一项所述的方法，其中，在所述物镜的不同设置下同时所述校正光学器件具有相同设置下捕获所述多个图像中的至少两个图像。

段落23.根据段落1至22中任一项所述的方法，其中，在所述校正光学器件的不同设置下同时所述物镜具有相同z位置下捕获所述多个图像中的至少两个图像。

段落24.根据段落1至23中任一项所述的方法，其中，所述表面是所述样品保持器的远端表面，其中，所述样品保持器具有平行于所述远端表面的近端表面，并且其中，所述投影步骤包括使光穿过所述近端表面以到达所述远端表面，并且将光从所述远端表面反射通过在所述成像检测器的上游的所述近端表面。

段落25.根据段落1至24中任一项所述的方法，其中，所述样品包括生物细胞。

段落26.根据段落1至25中任一项所述的方法，其中，所述样品保持器是第一样品保持器，并且其中，所述样品由所述第一样品保持器或与第一样品保持器大致相同的第二样品保持器支撑。

段落27.根据段落26所述的方法，其中，所述样品位于所述第一样品保持器的表面上或位于所述第一样品保持器或第二样品保持器的对应表面上。

段落28.根据段落26或27所述的方法，其中，所述表面形成所述第一样品保持器的井的底部，并且其中，所述样品位于所述第一样品保持器或所述第二样品保持器的井的底部上。

段落29.根据段落1至28中任一项所述的方法，其中，所述样品保持器的表面是盖玻片的表面，并且其中，所述样品位于所述盖玻片的表面上。

段落30.根据段落1至29中任一项所述的方法，其中，所述对样品成像的步骤包括对所述样品落射照明。

段落31.根据段落30所述的方法，其中，所述对样品成像的步骤包括检测来自所述样品的光致发光。

段落32.根据段落30或31所述的方法，其中，第一光源产生用于所述投影步骤的光，并且第二光源产生用于所述成像步骤的光。

段落33.根据段落1至32中任一项所述的方法，其中，所述对样品成像的步骤包括落射照明所述样品。

段落34.根据段落1至33中任一项所述的方法，其中，所述成像检测器是第一成像检测器，并且其中，所述对样品成像的步骤通过使用第二成像检测器捕获所述样品的图像来执行。

段落35.根据段落1至34中任一项所述的方法，其中，所述成像检测器与处理器通信，并且其中，所述处理器选择用于所述校正光学器件的设置。

段落36.根据段落1至35中任一项所述的方法，该方法还包括：手动调节所述校正光学器件以将所述校正光学器件置于这些不同设置中的每一个。

段落37.根据段落36所述的方法，其中，所述手动调节校正光学器件的步骤包括手动调节所述物镜的校正环的步骤。

段落38.根据段落36或37所述的方法，其中，处理器指示用户手动地将所述校正光学器件调节到不同设置中的每一个。

段落39.根据段落1至36中任一项所述的方法，还包括自动驱动所述校正光学器件的调节以将所述校正光学器件置于这些不同设置中的每一个。

段落40.根据段落1至39中任一项所述的方法，其中，所述校正光学器件是利用致动器可调节的，并且其中，处理器控制所述致动器的操作。

段落41.根据段落1至40中任一项所述的方法，其中，在所述物镜的两个或更多个不同设置处捕获多个图像，并且其中，处理器控制致动器的操作，所述致动器将所述物镜调节到所述物镜的不同设置中的每一个。

段落42.一种用于成像的系统，包括：(a)用于支撑样品保持器的载物台；(b)光源；(c)参照物；(d)一组光学元件，其中所述一组光学元件包括物镜、光圈和校正光学器件；(e)成像检测器；其中，所述光源和所述一组光学元件构造成通过使来自所述光源的光大致沿光轴传播而将所述参照物投影到所述成像检测器上，所述光轴从所述参照物通过所述物镜延伸到所述样品保持器的表面，并且从所述表面通过所述物镜返回延伸到所述成像检测器，其中，所述光圈是与所述光轴间隔开的离轴光圈，并且其中，所述光通过所述离轴光圈传播；以及(f)处理器，其构造成(1)控制使用所述成像检测器收集所述参照物的多个图像，其中所述校正光学器件处于两个或更多个不同的设置，以及(2)基于所述多个图像选择用于所述校正光学器件的设置。

段落43.根据段落42所述的系统，还包括操作地连接到校正光学器件的致动器，其中处理器被配置成控制致动器以将校正光学器件置于两个或更多个不同设置中的每一个。

段落44.根据段落42所述的系统，还包括可操作地连接到所述物镜的致动器，其中所述处理器构造成控制所述致动器以利用所述物镜将所述参照物的光学对应物聚焦。

段落45.根据段落42所述的系统，其中，所述参照物与所述光源成一体。

段落46.根据段落42所述的系统，其中，所述光源包括激光二极管。

段落47.根据段落42所述的系统，其中，所述参照物是由掩模形成的图案化对象。

段落48.根据段落42所述的系统，其中，所述处理器访问表示预定图像区域的数据，其中，当所述光学对应物大致聚焦在所述成像检测器上时，所述参照物的光学对应物位于所捕获的图像中。

段落49.根据段落42所述的方法，其中，如果所述物镜和所述样品保持器沿z轴相对于彼此移动，则所述光学对应物的质心在所述成像检测器上的位置改变。

段落50.根据段落42所述的系统，其中，所述光轴具有从所述光源延伸到所述样品保持器的表面的第一段，并且其中，所述光圈位于所述物镜的上游并且从所述光轴的所述第一段径向偏移。

段落51.根据段落42所述的系统，其中，所述光轴具有从所述样品保持器的表面延伸到所述成像检测器的第二段，并且其中，所述光圈位于所述物镜的下游并且从所述光轴的第二段径向偏移。

段落52.根据段落42所述的系统，其中，所述处理器构造成在所述校正光学器件处于所选定设置时使用与所述校正光学器件相互作用的光来控制对样品的图像的捕获。

段落53.根据段落52所述的系统，其中，所述成像检测器是第一成像检测器，所述系统还包括第二成像检测器，以捕获所述样品的图像。

段落54.根据段落42所述的系统，其中，所述校正光学器件是所述物镜的一部分。

段落55.根据段落42所述的系统，其中，所述校正光学器件与所述物镜分开。

如本公开中所使用的术语“示例性”是指“说明性的”或“用作示例”。类似地，如本公开中所使用的术语“例示”是指“通过给定示例示出”。两个术语都不意味着期望性或优越性。

上述公开内容可包含具有独立效用的多个不同的发明。尽管这些发明中的每一个都以其优选形式公开，但是这里公开和示出的其具体实施例不应被认为是限制性的，因为许多变化是可能的。本发明的主题包括本文公开的各种元件、特征、功能和/或性质的所有新颖和非显而易见的组合和子组合。所附的权利要求特别指出了被认为是新颖的和非显而易见的某些组合和子组合。在特征、功能、元件和/或性质的其他组合和子组合中实施的发明可以在要求本申请或相关申请的优先权的申请中要求保护。无论是针对不同的发明还是针对相同的发明，并且无论是比原始权利要求的范围更宽、更窄、相等或不同，这样的权利要求也被认为包括在本公开的发明的主题内。此外，除非另外明确说明，否则用于所标识的元件的诸如第一、第二或第三的顺序指示用于区分元件，而不指示这些元件的特定位置或顺序。

Claims (20)

1.一种成像的方法，所述方法包括：

通过使光沿光轴传播而将参照物投影到成像检测器上，所述光轴从所述参照物通过物镜延伸到样品保持器的表面，并且从所述表面通过所述物镜返回延伸到所述成像检测器，其中，所述光传播通过位于所述成像检测器上游并且与所述光轴间隔开的离轴光圈；

使用所述成像检测器并且利用校正光学器件在两个或更多个不同设置下捕获所述参照物的多个图像；

基于所述多个图像选择用于所述校正光学器件的设置；以及

在所述校正光学器件具有所选设置时对样品进行成像。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述参照物是点源对象。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，用于投影步骤的光由激光二极管产生，并且其中，所述参照物与所述激光二极管成一体。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述参照物是由掩模形成的图案化对象。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述物镜包括所述校正光学器件和一个或多个其他光学元件，所述方法还包括如下步骤：相对于所述一个或多个其他光学元件移动所述校正光学器件以将所述校正光学器件置于所述两个或更多个不同设置中的每一个。

6.根据权利要求1所述的方法，还包括：

确定来自所述多个图像中的每个图像的至少一个性质或性质组合的值，其中，所述至少一个性质或性质组合中的每个性质选自由所述图像中的所述参照物的形状、大小、强度、位置和对比度组成的组；以及

将所述多个图像的值彼此进行比较；

其中，基于比较所述值来选择用于所述校正光学器件的所述设置。

7.根据权利要求6所述的方法，所述方法还包括：

当所述多个图像被捕获时，基于从已经捕获的所述图像的子集确定的所述至少一个性质或性质组合的值来调节所述物镜。

8.根据权利要求6所述的方法，所述方法还包括：

当所述多个图像正被捕获时，基于从已经捕获的所述图像的子集确定的所述至少一个性质或性质组合的值来调节所述校正光学器件。

9.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：

基于来自所述多个图像的第一子集的反馈来调节所述物镜，以将所述参照物的光学对应物的质心定位在预定图像区域中；以及

基于来自在所述第一子集之后捕获的所述多个图像的第二子集的反馈来调节所述校正光学器件和所述物镜，以在改进所述光学对应物的清晰度的同时将所述光学对应物保持在所述预定图像区域中。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，通过选择用于所述物镜的设置和用于所述校正光学器件的设置的组合来执行所述选择步骤，所述组合优化所述多个图像中的至少一个性质或性质的组合。

11.根据权利要求10所述的方法，还包括如下步骤：在使用来自所述成像检测器的反馈的捕获步骤期间搜索所述物镜的设置和所述校正光学器件的设置的组合。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述搜索步骤基于表示所述参照物在所述图像的至少一个子集的每个图像内的位置的第一性质和表示所述参照物在所述图像的至少一个子集的每个图像中的形状、大小、强度和/或对比度的第二性质。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述表面是所述样品保持器的远端表面，其中，所述样品保持器具有平行于所述远端表面的近端表面，并且其中，所述投影步骤包括使光穿过所述近端表面以到达所述远端表面，并且将光从所述远端表面反射通过在所述成像检测器的上游的所述近端表面。

14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品保持器是第一样品保持器，并且其中，所述样品由所述第一样品保持器或与所述第一样品保持器相同的第二样品保持器支撑。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述样品位于所述第一样品保持器的表面上或位于所述第一样品保持器或所述第二样品保持器的对应表面上。

16.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：

手动调节所述校正光学器件以将所述校正光学器件置于这些不同设置中的每一个。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述手动调节校正光学器件的步骤包括手动调节所述物镜的校正环的步骤。

18.一种用于成像的系统，包括：

用于支撑样品保持器的载物台；

光源；

参照物；

一组光学元件，其中所述一组光学元件包括物镜、光圈和校正光学器件；

成像检测器；

其中，所述光源和所述一组光学元件构造成通过使来自所述光源的光沿光轴传播而将所述参照物投影到所述成像检测器上，所述光轴从所述参照物通过所述物镜延伸到所述样品保持器的表面，并且从所述表面通过所述物镜返回延伸到所述成像检测器，其中，所述光圈是与所述光轴间隔开的离轴光圈，并且其中，所述光通过所述离轴光圈传播；以及

处理器，其构造成(i)控制使用所述成像检测器收集所述参照物的多个图像，其中所述校正光学器件处于两个或更多个不同的设置，(ii)基于所述多个图像选择用于所述校正光学器件的设置，以及(iii)在所述校正光学器件具有所选设置时对样品进行成像。

19.根据权利要求18所述的系统，其中，所述参照物与所述光源成一体。

20.根据权利要求18所述的系统，其中，所述处理器访问表示预定图像区域的数据，其中，当所述参照物的光学对应物聚焦在所述成像检测器上时，所述参照物的光学对应物位于所捕获的图像中。