DE102014101762B4

DE102014101762B4 - Verfahren und Mikroskop zum Abbilden einer Volumenprobe

Info

Publication number: DE102014101762B4
Application number: DE102014101762.5A
Authority: DE
Inventors: Christian Schumann; Andrea Mülter
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2014-02-12
Filing date: 2014-02-12
Publication date: 2021-12-23
Anticipated expiration: 2034-02-13
Also published as: DE102014101762A1; WO2015121190A1; JP2017505924A; US20170168280A1; JP6767871B2; CN105980909A; US10365466B2

Abstract

Verfahren zum mikroskopischen Abbilden einer Volumenprobe (16), bei demein Mikroskopobjektiv (12) nacheinander auf mindestens zwei Referenzebenen fokussiert wird, die sich innerhalb der Volumenprobe (16) längs der optischen Achse (O) des Mikroskopobjektivs (12) in unterschiedlichen Volumenprobentiefen befinden;für jede Referenzebene eine Referenzeinstellung eines Korrektionsgliedes (18) ermittelt wird, bei der ein von der Volumenprobentiefe abhängiger Abbildungsfehler durch das Korrektionsglied (18) korrigiert ist;auf Grundlage der ermittelten Referenzeinstellungen für mindestens eine Zielebene in der Volumenprobe (16) eine Zieleinstellung für das Korrektionsglied (18) bestimmt wird, in welcher der in der Volumenprobentiefe der Zielebene auftretende Abbildungsfehler durch das Korrektionsglied (18) korrigiert ist; undzum Abbilden der Volumenprobe (16) das Mikroskopobjektiv (12) auf die Zielebene fokussiert und das Korrektionsglied (18) in die Zieleinstellung gebracht wird,wobei für jede Referenzebene eine durch das Korrektionsglied (18) in der jeweiligen Referenzeinstellung verursachte Abweichung der Objektschnittweite des Mikroskopobjektivs (12) gegenüber einer Sollschnittweite als Referenzschnittweitenabweichung ermittelt wird,auf Grundlage dieser Referenzschnittweitenabweichungen für die Zielebene eine Zielschnittweitenabweichung bestimmt wird, welche die durch das Korrektionsglied (18) in der Zieleinstellung verursachte Abweichung der Objektschnittweite gegenüber der Sollschnittweite angibt; unddas Mikroskopobjektiv (12) unter Berücksichtigung der Zielschnittweitenabweichung auf die Zielebene fokussiert wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikroskopischen Abbildung einer Volumenprobe sowie ein Mikroskop.
In der Lichtmikroskopie dreidimensional ausgedehnter Proben, im Folgenden auch als Volumenproben bezeichnet, ist eine hochqualitative dreidimensionale Abbildung von zentralem Interesse. Eine der Herausforderungen bilden dabei Abbildungsfehler, die durch den Laufweg des Lichts in der Probe verursacht werden. Dabei sind insbesondere sogenannte Öffnungsfehler zu beachten, die dadurch entstehen, dass der Brechungsindex der Volumenprobe von dem Brechungsindex des die Probe umgebenden Mediums verschieden ist. Je länger der Laufweg des Lichtes innerhalb der Probe ist, desto größer wird der durch eine solche Fehlanpassung des Brechungsindex bedingte Öffnungsfehler. Dadurch wird es insbesondere schwierig, Objektebenen präzise abzubilden, die sich tief innerhalb der Volumenprobe befinden. Variiert der Brechungsindex der Probe längs der optischen Achse des Mikroskopobjektivs, d.h. in Richtung der Probentiefe, so wird es noch schwieriger, eine dreidimensionale Abbildung der Probe hoher Qualität zu erzielen.
Zur Vermeidung vorstehend beschriebener Abbildungsfehler werden meist Immersionsobjektive mit Korrektionsgliedern eingesetzt, die zur Korrektion des Öffnungsfehlers verstellbar sind. Solche aus dem Stand der Technik bekannten Korrektionsglieder weisen beispielsweise motorisch verstellbare Linsenfassungen auf, die eine in dem Mikroskopobjektiv enthaltene Linseneinheit zur Korrektion des Abbildungsfehlers längs der optischen Achse verschieben. Ein Bespiel für eine derartige Korrektionsverstellung ist in der DE 10 2011 051 677 A1 offenbart.
Soll der durch eine Brechungsindexfehlanpassung bedingte Öffnungsfehler in einem weiten axialen Bereich korrigiert werden, so ist es erforderlich, das Korrektionsglied mit einer gewissen Brechkraft zu versehen. Dadurch kann es bei der Korrektionsverstellung zu einer unerwünschten Änderung der Objektschnittweite, d.h. zu einer Verschiebung der abgebildeten Objektebene längs der optischen Achse kommen. Eine solche Änderung der Objektschnittweite führt dann zu einer nicht tolerierbaren Verzerrung des aufgenommenen Volumenbildes.
Zum Stand der Technik wird ferner auf Konzepte verwiesen, die eine tiefenabhängige Einstellung von Mikroskopieparametern, z.B. der Laserleistung in Multiphotonenmikroskopen, vorsehen. Jedoch beeinflussen diese Parameter nicht die Korrektion des Mikroskopobjektivs bezüglich seiner Abbildungsleistung oder seiner Schnittweiteneinstellung. Somit erlaubt der aktuelle Stand der Technik keine in axialer Richtung weit ausgedehnte, hoch qualitative mikroskopische Volumenbildgebung, insbesondere in Proben, die über die Probentiefe hinweg einen inhomogenen Brechungsindex aufweisen.
Aus dem Dokument DE 38 04 642 A1 ist ein konfokales Scanmikroskop bekannt, das zwei verschiebbare Korrektionsglieder aufweist, von denen eines in dem Beleuchtungsstrahlengang und das andere in dem Abbildungsstrahlengang angeordnet ist. Zur Korrektion eines durch die Probe verursachten Öffnungsfehlers werden beide Korrektionsglieder längs der z-Achse bewegt. Die von den beiden Korrektionsgliedern bewirkte Korrektion muss an eine in dem konfokalen Scanmikroskop vorhandene Lochblende angepasst werden. Die Korrektionsglieder werden durch eine zentrale Steuereinheit gesteuert, in der neben der Schichtdicke und der Brechzahl der Probe eine Beziehung zwischen dem Änderungsbetrag der Fokustiefe und dem Änderungsbetrag des Verstellweges der Korrektionsglieder gespeichert ist.
Das Dokument DE 10 2007 038 579 A1 offenbart ein Laser-Scanmikroskop, das darauf ausgelegt ist, eine scharfe Abbildung einer Probe ohne Relativbewegung von Mikroskopobjektiv und Probe zu ermöglichen. Auch eine Objektivinnenfokussierung soll wegen des hierfür benötigten aufwendigen Objektivaufbaus explizit vermieden werden. Vielmehr sieht die in diesem Dokument offenbarte Lösung eine Tubuslinse vor, die längs der optischen Achse verstellbar ist, um die Fokuslage relativ zu einem optischen Frontelement des Mikroskopobjektivs einzustellen.
Aufgabe der Erfindung ist es ein Verfahren und ein Mikroskop anzugeben, die es ermöglichen, eine Volumenprobe in einem weiten Bereich längs der optischen Achse fehlerfrei abzubilden.
Die Erfindung löst diese Aufgabe durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den jeweiligen Unteransprüchen angegeben.
Das erfindungsgemäße Verfahren sieht vor, ein Mikroskopobjektiv nacheinander auf mindestens zwei als Referenzebenen dienende Objektebenen zu fokussieren, die sich innerhalb der Volumenprobe längs der optischen Achse des Mikroskopobjektivs in unterschiedlichen Probentiefen befinden. Für jede Referenzebene wird eine Referenzeinstellung eines Korrektionsgliedes ermittelt, bei der ein von der Probentiefe abhängiger Abbildungsfehler durch das Korrektionsglied korrigiert ist. Auf Grundlage der ermittelten Referenzeinstellungen wird dann für mindestens eine Zielebene in der Probe eine Zieleinstellung für das Korrektionsglied bestimmt, in welcher der in der Probentiefe der Zielebene auftretende Abbildungsfehler durch das Korrektionsglied korrigiert ist. Schließlich wird zum Abbilden der Volumenprobe das Mikroskopobjektiv auf die Zielebene fokussiert und das Korrektionsglied in die Zieleinstellung gebracht.
Indem das Mikroskopobjektiv mittels einer Fokussiereinrichtung auf mindestens zwei Referenzebenen fokussiert wird, wird gleichsam der abzubildende Probenbereich längs der optischen Achse, d.h. das zu mikroskopierende Volumen festgelegt. Im Rahmen dieser Festlegung des zu mikroskopierenden Volumens, die vorzugsweise in einem der eigentlichen Bildaufnahme vorgelagerten Einrichtungsprozess ausgeführt wird, werden für die mindestens zwei Referenzebenen, die sich innerhalb der Probe in unterschiedlichen Probentiefen befinden, Referenzeinstellungen für das Korrektionsglied derart bestimmt, dass in diesen Referenzeinstellungen der von der Probentiefe abhängige Abbildungsfehler jeweils durch das Korrektionsglied in der gewünschten Weise korrigiert ist. Dabei können die Referenzeinstellungen des Korrektionsgliedes manuell durch den Nutzer oder aber mit Hilfe einer hierfür geeigneten Steuereinheit automatisiert ermittelt werden.
Die für die Referenzebenen ermittelten Referenzeinstellungen des Korrektionsgliedes werden anschließend dazu genutzt, für mindestens eine, in der Regel jedoch mehrere Zielebenen jeweils eine Zieleinstellung für das Korrektionsglied zu bestimmen, die später bei der Abbildung der jeweiligen Zielebene dafür sorgt, dass der in dieser Zielebene auftretende, tiefenabhängige Abbildungsfehler bestmöglich korrigiert ist. Die Zielebenen liegen dabei innerhalb des durch die Referenzebenen längs der optischen Achse definierten Abbildungsbereichs.
Die für die einzelnen Referenzebenen bestimmen Referenzeinstellungen bilden somit gleichsam Stützstellen, die dann bei der dreidimensionalen Abbildung der Volumenprobe herangezogen werden können, um in jeder beliebigen Zielebene innerhalb des zu mikroskopierenden Volumens die gewünschte Korrektion des tiefenabhängigen Abbildungsfehlers zu erzielen. Dabei werden die in der dreidimensionalen Abbildung der Volumenprobe jeweils anvisierten Zielebenen in der Regel nicht mit den vorher, im Rahmen der Einrichtung des Mikroskops definierten Referenzebenen übereinstimmen. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass auch eine solche Koinzidenz zwischen den Zielebenen und den Referenzebenen erfindungsgemäß nicht ausgeschlossen ist, d.h. die jeweils betrachtete Zielebene auch mit einer der vorher definierten Referenzebenen zusammenfallen darf.
Für jede Referenzebene wird eine durch das Korrektionsglied in der jeweiligen Referenzeinstellung verursachte Abweichung der Objektschnittweite des Mikroskopobjektivs gegenüber einer Sollschnittweite als Referenzschnittweitenabweichung ermittelt. Dann wird auf Grundlage der für die einzelnen Referenzebenen ermittelten Referenzschnittweitenabweichungen für die Zielebene eine Zielschnittweitenabweichung bestimmt, welche die durch das Korrektionsglied in der Zieleinstellung verursachte Abweichung der Objektschnittweite gegenüber der Sollschnittweite repräsentiert. Schließlich wird das Mikroskopobjektiv unter Berücksichtigung der Zielschnittweitenabweichung auf die Zielebene fokussiert.
Diese Ausgestaltung ermöglicht in besonders vorteilhafter Weise, die Wirkung der Korrektionsverstellung auf die Objektschnittweite des Mikroskopobjektivs, d.h. auf die axiale Lage der Objektebene, auf die das Mikroskopobjektiv gerade fokussiert ist, zu berücksichtigen und zu korrigieren. So wird nämlich eine unerwünschte axiale Verschiebung der Objektebene, die durch das Korrektionsglied verursacht wird, dadurch kompensiert, dass bei Fokussierung des Mikroskopobjektivs auf die abzubildende Zielebene die ermittelte Zielschnittweitenabweichung berücksichtigt wird. Hierzu ist zunächst zu ermitteln, wie sich die jeweilige Verstellung des Korrektionsgliedes auf die Objektschnittweite des Mikroskopobjektivs auswirkt. Eine genaue Kenntnis der Wirkung der Korrektionsverstellung kann beispielsweise über eine geeignete Testprobe oder aber beim Einrichten des Mikroskops durch iteratives Verstellen des Korrektionsgliedes und anschließendes Nachfokussieren des Mikroskopobjektivs erlangt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist es jedoch ebenso möglich, die Kenntnis der Wirkung der Korrektionsverstellung auf die Objektschnittweite allein aus der Kenntnis der optischen Auslegung des Mikroskopobjektivs zu gewinnen und basierend auf dieser Kenntnis die Zielschnittweitenabweichung numerisch zu ermitteln.
Die Berücksichtigung der durch das Korrektionsglied verursachten Veränderung der Objektschnittweite ermöglicht eine weitgehend freie Auswahl des zu verwendenden Korrektionsgliedes. So ist es insbesondere nicht erforderlich, dass das verwendete Korrektionsglied möglichst geringe Brechkraft aufweist, um von vorneherein jegliche Veränderung der Objektschnittweite zu vermeiden. Da sich durch höhere Brechkräfte auch größere Brechungsindexfehlanpassungen, wie sie insbesondere in axial ausgedehnten Volumenproben auftreten, kompensieren lassen, ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren somit eine präzise dreidimensionale Abbildung auch großer Volumenproben.
Vorzugsweise wird auf Grundlage der Referenzschnittweitenabweichungen eine Schnittweitenvorschrift ermittelt, welche die Abweichung der Objektschnittweite in Abhängigkeit der Einstellung des Korrektionsgliedes angibt. Die in der Volumenbildaufnahme genutzte Zielschnittweitenabweichung wird dann anhand dieser Schnittweitenvorschrift bestimmt. Die vorstehend genannte Schnittweitenvorschrift kann beispielsweise in Form einer geeignet parametrisierten Funktion oder einer Wertetabelle gespeichert werden, anhand der im Wege einer mathematischen Interpolation die Zielschnittweitenabweichung berechnet wird. Die Interpolation kann beispielsweise nach einem linearen oder kubischen Verfahren oder einem Spline-Verfahren durchgeführt werden.
In entsprechender Weise kann in einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf Grundlage der Referenzeinstellungen des Korrektionsgliedes eine Korrektionsvorschrift ermittelt werden, welche die zur Korrektion des Abbildungsfehlers vorgesehene Einstellung des Korrektionsgliedes in Abhängigkeit der Probentiefe angibt. Die Zieleinstellung des Korrektionsgliedes kann dann anhand dieser Korrektionsvorschrift insbesondere durch Interpolation bestimmt werden.
Falls sich in Abhängigkeit der Einstellung des Korrektionsgliedes nicht nur die Objektschnittweite, sondern auch die Brennweite des Mikroskopobjektivs und damit auch dessen Vergrößerung ändert, wird vorzugsweise für jede Referenzebene eine durch das Korrektionsglied in der jeweiligen Referenzeinstellung verursachte Abweichung der Vergrößerung des Mikroskopobjektivs gegenüber einer Sollvergrößerung als Referenzvergrößerungsabweichung ermittelt. Auf Grundlage der für die jeweiligen Referenzebenen ermittelten Referenzvergrößerungsabweichungen wird für die Zielebene dann eine Zielvergrößerungsabweichung bestimmt, welche die durch das Korrektionsglied in der Zieleinstellung verursachte Abweichung der Vergrößerung gegenüber der Sollvergrößerung angibt. Um die durch das Korrektionsglied verursachte Vergrößerungsänderung zu kompensieren, wird schließlich ein variables Vergrößerungselement unter Berücksichtigung der Zielvergrößerungsabweichung verstellt. Diese Kompensation der durch das Korrektionsglied geänderten Vergrößerung bzw. Objektbrennweite erfolgt vorzugsweise in Echtzeit parallel zur Korrektion des Abbildungsfehlers und zur Korrektur der Schnittweitenänderung. Das variable Vergrößerungselement ist beispielsweise als Vario-Kameraadapter oder als Teil eines Abtastsystems eines Konfokal- oder Multiphotonenmikroskops realisierbar.
In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung wird für jede Referenzebene mindestens ein Referenzsteuerparameter festgelegt. Auf Grundlage der so festgelegten Referenzsteuerparameter wird dann für die Zielebene ein Zielsteuerparameter bestimmt und eingestellt. Ein Beispiel für einen solchen Referenzsteuerparameter ist etwa die Lichtleistung, mit der die jeweilige Zielebene beim Abbilden der Volumenprobe beleuchtet wird. Dadurch kann über das gesamte mikroskopierte Volumen eine gleichmäßige Bildhelligkeit erzielt werden. Ein weiteres Beispiel ist in der Multiphotonenmikroskopie die sogenannte Prechirp zur Kompensation der Dispersion der Probe.
Vorzugsweise umfassen die mindestens zwei Referenzebenen mehrere längs der optischen Achse äquidistante Ebenen. Da in diesem Fall die beim Einrichten des Mikroskops definierten Referenzebenen längs der optischen Achse gleiche Abstände voneinander haben, bilden die für die Referenzebenen ermittelten Referenzeinstellungen des Korrektionsgliedes eine zuverlässige Grundlage dafür, dass in allen möglichen Zielebenen innerhalb des zu mikroskopierenden Volumens jeweils eine präzise Zieleinstellung für das Korrektionsglied und damit eine gute Korrektion des in der jeweiligen Probentiefe auftretenden Abbildungsfehlers gefunden werden kann.
Um das Mikroskopobjektiv auf die jeweils gewünschte Objektebene zu fokussieren, ist das Mikroskopobjektiv relativ zur Volumenprobe längs der optischen Achse zu bewegen. Dies kann mittels einer Fokussiereinrichtung erfolgen, die an dem Mikroskopobjektiv oder an einem die Volumenprobe tragenden Objekttisch angreift. In der ersten Ausführungsform bewegt also die Fokussiereinrichtung das Mikroskopobjektiv im Raum, während der Objekttisch ortsfest bleibt. Dagegen wird in der zweiten Ausführungsform der Objekttisch bei festgehaltenem Mikroskopobjektiv im Raum bewegt. Auch eine Kombination dieser beiden Fokussierungen ist denkbar.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung ist ein Mikroskop zum Abbilden einer Volumenprobe vorgesehen, das ein Mikroskopobjektiv, ein Korrektionsglied, eine Fokussiereinrichtung und eine Steuereinheit umfasst. Dabei ist die Steuereinheit so ausgebildet, dass das Mikroskopobjektiv, das Korrektionsglied und die Fokussiereinrichtung in der vorstehend erläuterten Weise angesteuert werden.
Vorzugsweise umfasst bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop das Korrektionsglied eine in dem Mikroskopobjektiv enthaltene Linseneinheit und eine Antriebseinheit zum Bewegen der Linseneinheit längs der optischen Achse.
Wird bei dem Mikroskop die durch das Korrektionsglied verursachte Abweichung der Objektschnittweite in oben erläuterter Weise berücksichtigt, so ist es möglich, die Linseneinheit mit einer so großen Brechkraft zu versehen, dass auch große Variationen des Brechungsindex innerhalb der Volumenprobe korrigiert werden können.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung umfasst die Antriebseinheit einen an einem Gehäuse des Mikroskopobjektivs angeordneten, um die optische Achse drehbaren Korrekturring, dessen Drehbewegung in eine Verstellbewegung der Linseneinheit längs der optischen Achse umsetzbar ist. Diese Ausgestaltung des Korrektionsgliedes kann beispielsweise derart realisiert sein, wie dies in der eingangs genannten DE 10 2011 051 677 A1 offenbart ist, deren Offenbarungsgehalt an dieser Stelle im Wege der Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen ist.
Weitere vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die Figuren. Darin zeigen:

1 eine schematische Darstellung, die ein Mikroskopobjektiv zeigt, das bei korrekt eingestelltem Korrektionsglied auf eine erste Referenzebene fokussiert ist;
2 eine der 1 entsprechende schematische Darstellung, in der das Mikroskopobjektiv auf eine zweite Referenzebene fokussiert ist, ohne dass der Abbildungsfehler durch das Korrektionsglied korrigiert ist;
3 eine der 2 entsprechende schematische Darstellung, die eine Schnittweitenabweichung zeigt, die durch das auf die zweite Referenzebene eingestellte Korrektionsglied verursacht wird;
4 eine der 3 entsprechende schematische Darstellung, die eine Schnittweitenkorrektur für die zweite Referenzebene zeigt;
5 ein Ablaufdiagramm, das die Verfahrensschritte zum Einrichten des Mikroskops zeigt;
6 ein Ablaufdiagramm, das die Verfahrensschritte zum Abbilden der Volumenprobe mittels des nach 5 eingerichteten Mikroskops zeigt;
7 das erfindungsgemäße Mikroskop in einer Ausführungsform, die ein aufrechtes Mikroskopstativ und einen verstellbaren Objekttisch als Fokussiereinrichtung aufweist;
8 das erfindungsgenmäße Mikroskop in einer weiteren Ausführungsform, die ein aufrechtes Mikroskopstativ und einen verstellbaren Objektivrevolver als Fokussiereinrichtung aufweist;
9 das erfindungsgemäße Mikroskop in einer weiteren Ausführungsform, die ein inverses Mikroskopstativ und einen verstellbaren Objektivrevolver als Fokussiereinrichtung aufweist; und
10 das erfindungsgemäße Mikroskop in einer weiteren Ausführungsform, die ein inverses Mikroskopstativ und einen verstellbaren Objekttisch als Fokussiereinrichtung aufweist.

Unter Bezugnahme auf die 1 und 4 wird zunächst ganz grundsätzlich erläutert, wie ein durch eine Brechungsindexfehlanpassung verursachter Öffnungsfehler sowie eine durch die Korrektion des Öffnungsfehlers verursachte Veränderung der Objektschnittweite erfindungsgemäß korrigiert werden. Hierzu sind in den 1 bis 4 die Mikroskopkomponenten und die Kenngrößen, die für die Korrektion des Öffnungsfehlers und die Nachjustierung der Objektschnittweite relevant sind, rein schematisch dargestellt, um die Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens zu erleichtern.
Nach den 1 bis 4 umfasst ein allgemein mit 10 bezeichnetes Mikroskop ein Mikroskopobjektiv 12, einen Objekttisch 14, auf dem eine Volumenprobe 16 angeordnet ist, ein Korrektionsglied 18, das im vorliegenden Ausführungsbeispiel Teil des Mikroskopobjektivs 12 ist, sowie eine Steuereinheit 20. Ferner weist das Mikroskop 10 eine Fokussiereinrichtung auf, mit der sich der die Volumenprobe 16 tragende Objekttisch 14 längs der optischen Achse O relativ zu dem Mikroskopobjektiv 12 verstellen lässt. Die Fokussiereinrichtung ist in den 1 bis 4 rein schematisch mit einem Doppelpfeil 22 bezeichnet. Ebenso wie das Korrektionsglied 18 wird auch die Fokussiereinrichtung 22 über die Steuereinheit 20 gesteuert. Hierzu sind das Korrektionsglied 18 und die Fokussiereinrichtung 22 über Verbindungsleitungen 24 bzw. 26 mit der Steuereinheit 20 gekoppelt.
Das Korrektionsglied 18 weist eine Linseneinheit auf, die Teil einer in dem Mikroskopobjektiv enthaltenen, in den 1 bis 4 nicht gezeigten Abbildungsoptik ist. Um einen durch eine Brechungsindexfehlanpassung verursachten Öffnungsfehler in nachfolgend beschriebener Weise zu korrigieren, lässt sich das Korrektionsglied 18 über die Steuereinheit 20 längs der optischen Achse O bewegen.
1 zeigt einen Zustand, in dem das Mikroskopobjektiv 12 auf eine Objektebene 28 fokussiert ist. Dabei soll in dem in 1 dargestellten Zustand das Korrektionsglied 18 längs der optischen Achse O so eingestellt sein, dass der Öffnungsfehler durch das Korrektionsglied 18 bestmöglich korrigiert ist. Diese bestmögliche Korrektionseinstellung ist in 1 mit c₁ bezeichnet.
Die Objektebene 28 bildet eine erste Referenzebene, für welche die gewünschte Einstellung c₁ des Korrektionsgliedes 18, im Folgenden als erste Referenzeinstellung bezeichnet, ermittelt ist.
In dem Zustand nach 1 liegt die erste Referenzebene 28 innerhalb der Probe 16 längs der optischen Achse O an einer Stelle, die der Objektschnittweite des Mikroskopobjektivs 12 entspricht. Diese von der Referenzeinstellung c₁ abhängige Objektschnittweite ist in 1 mit d₀(c₁) bezeichnet. Die Objektschnittweite d₀(c₁) gibt den Abstand der durch die erste Referenzebene 28 gebildeten Objektebene von dem Mikroskopobjektiv 12 (präziser von dessen am weitesten objektseitig angeordneten optischen Fläche) an.
In 1 bezeichnet die Größe z₁ den Abstand des die Volumenprobe 16 tragenden Objekttisches 14 von einem festen Bezugspunkt an dem Mikroskopobjektiv 12. Dieser feste Bezugspunkt an dem Mikroskopobjektiv 12 ist beispielsweise durch eine Anlagefläche des Mikroskopobjektivs 12 an einen in 1 nicht gezeigten Objektivrevolver gegeben. Diese Größe z₁ gibt also den Abstand zwischen der Volumenprobe 16 und dem Mikroskopobjektiv 12 an und repräsentiert somit eine im Folgenden auch als Fokussierabstand bezeichnete Stellgröße der Fokussiereinrichtung 22. Der Fokussierabstand z₁ ist mithin auch ein Maß für die Tiefe, in der die Objektebene 28 innerhalb der Volumenprobe 16 liegt. Dies bedeutet, dass sich bei Änderung des Fokussierabstandes z₁ die Probentiefe, auf die das Mikroskopobjektiv 12 innerhalb der Volumenprobe 16 fokussiert ist, gleichermaßen ändert.
In 2 ist ein Zustand gezeigt, in dem das Mikroskopobjektiv 12 auf eine Tiefe innerhalb der Volumenprobe 16 fokussiert ist, die einem (in diesem Beispiel kleineren) Fokussierabstand z₂ entspricht. Die Objektebene 28 liegt demnach in dem Zustand nach 2 von oben her gesehen tiefer innerhalb der Volumenprobe 16. Diese tiefer liegende Ebene definiert eine zweite Referenzebene.
Da in dem in 2 gezeigten Zustand die Weglänge des aus der Objektebene 28 kommenden Lichtes innerhalb der Volumenprobe 16 länger als in dem Zustand nach 1 ist, tritt in Folge der Brechungsindexfehlanpassung ein Öffnungsfehler auf. Dieser Öffnungsfehler ist in 2 zeichnerisch durch Knicke in den aus der Volumenprobe 16 in Richtung des Mikroskopobjektivs 12 austretenden Lichtstrahlen angedeutet. Da sich in 2 das Korrektionsglied 18 noch immer in der für den Zustand nach 1 optimierten Referenzeinstellung c₁ befindet, ist in 2 der Öffnungsfehler noch unkorrigiert.
3 zeigt, wie durch eine Verstellung des Korrektionsgliedes 18 der in 2 dargestellte Öffnungsfehler korrigiert wird. So ist in 3 für das Korrektionsglied 18 eine von der Einstellung c₁ verschiedene zweite Referenzeinstellung c₂ gewählt, durch die der Öffnungsfehler für die zweite Referenzebene 28 bestmöglich korrigiert ist. Jedoch wird durch die Bewegung des Korrektionsgliedes 18 in die Referenzeinstellung c₂ die Objektschnittweite des Mikroskopobjektivs 12 gegenüber der gewünschten Sollschnittweite geändert. Diese geänderte Objektschnittweite ist in 3 mit d₀(c₂) bezeichnet. Somit wird die Objektebene 28 in 2 längs der optischen Achse O um einen Betrag nach oben verschoben, der gegeben ist durch Δd₀(c₁,c₂) = d₀(c₂)-d₀(c₁).
4 zeigt schließlich, wie die unerwünschte Verschiebung de Objektebene 28 in Folge der Änderung der Objektschnittweite kompensiert wird. So wird mittels der Fokussiereinrichtung 22 der in 3 gegebene Fokussierabstand z₂ in 4 um die durch das Korrektionsglied 18 verursachte Änderung der Objektschnittweite, d.h. Δd₀(c₁,c₂) verringert. Dies bedeutet, dass in dem Beispiel nach 4 der Objekttisch 14 um den Betrag Δd₀(c₁,c₂) längs der optischen Achse O nach oben verschoben wird. Dadurch kann wieder die ursprünglich anvisierte Objektebene 28 innerhalb der Volumenprobe 16 angefahren werden.
5 zeigt ein Ablaufdiagramm, das rein beispielhaft die vor der eigentlichen Bildaufnahme vorgenommene Einrichtung des Mikroskops 10 zeigt, die insbesondere dazu dient, die Referenzebenen festzulegen und für diese Referenzebenen die Referenzeinstellungen für das Korrektionsglied und die Referenzschnittweitenabweichungen gegenüber der Sollschnittweite zu ermitteln. Optional werden auch Referenzvergrößerungsabweichungen berücksichtigt, sofern durch die Verstellung des Korrektionsgliedes 18 auch Abweichungen der Objektbrennweite und damit Abweichungen der Vergrößerung gegenüber einer Sollvergrößerung verursacht werden.
In Schritt S1 wird eine Referenzebene X_n angefahren, indem das Mikroskopobjektiv 12 mittels der Fokussiereinrichtung 22 auf diese Referenzebene X_n fokussiert wird. In Schritt S2 wird das Korrektionsglied 18 in eine Referenzeinstellung c_n gebracht. In dieser Referenzeinstellung c_n ist der Öffnungsfehler, der durch eine Brechungsindexfehlanpassung verursacht wird, für die Referenzebene X_n bestmöglich korrigiert. Kommt es durch die Verstellung des Korrektionsgliedes 18 zu einer Änderung Δd₀(c_n) der Objektschnittweite, so wird die Objektebene entsprechend 4 nachjustiert. Die Größe Δd₀(c_n) entspricht somit der Referenzschnittweitenabweichung. Wird durch die Verstellung des Korrektionsgliedes 18 zudem eine Änderung der Objektbrennweite und damit eine Änderung der Vergrößerung verursacht, so wird zusätzlich eine Referenzvergrößerungsabweichung β(c_n) bestimmt.
Die Schritte S2 und S3 werden so ausgeführt, wie dies vorstehend anhand der 1 bis 4 erläutert wurde. Dabei ist eine Ausführung von Schritt S3 in Echtzeit besonders vorteilhaft.
In Schritt S4 wird entschieden, ob die in den Schritten S2 und S3 ermittelten Größen c_n, Z_n und ggf. β(c_n) als Stützstelle n gespeichert werden sollen oder nicht, wobei n eine ganzzahlige Laufvariable bezeichnet. Sollen die genannten Größen gespeichert werden, so erfolgt diese Speicherung in Schritt S5, und der Ablauf wird mit Schritt S6 fortgesetzt. Soll die Stützstelle n nicht gespeichert werden, so fährt der Ablauf unmittelbar mit Schritt S6 fort.
In Schritt S6 wird bestimmt, ob eine weitere Stützstelle ermittelt werden soll. Ist dies der Fall, so wird die Laufvariable n um 1 (n=n+1) erhöht, und der Steuerablauf kehrt zu Schritt S1 zurück. Soll keine weitere Stützstelle ermittelt werden, so werden in Schritt S7 die Zielebenen z_k, auf die das Mikrokopobjektiv 12 bei der anschließenden Abbildung der Volumenprobe 16 fokussiert werden sollen, festgelegt und in Schritt S8 gespeichert.
6 zeigt ein Ablaufdiagramm, in dem beispielhaft angegeben ist, wie basierend auf der nach 5 vorgenommenen Einrichtung des Mikroskops 10 die Volumenbildaufnahme durchgeführt wird.
In Schritt S10 wird der Bildaufnahmeprozess für eine Zielebene z_k gestartet, wobei k eine ganzzahlige Laufvariable bezeichnet. In Schritt S11 wird eine die Zielebene z_k identifizierende Information, die zuvor bei der Einrichtung des Mikroskops 10 gespeichert worden ist (S8 in 5), ausgelesen. In Schritt S12 werden die den einzelnen Referenzebenen zugeordneten Stützstellen bereitgestellt, d.h. die Referenzeinstellungen c_n und die Referenzschnittweitenabweichungen Z_n (S5 in 5). Die in den Schritten S11 und S12 bereitgestellten Informationen werden im weiteren genutzt, um für die ausgewählte Zielebene z_k die entsprechenden Zielgrößen zu ermitteln, nämlich die Zieleinstellung c_k für das Korrektionsglied 18, die Zielschnittweitenabweichung x_k, mit der die Fokussiereinrichtung 22 angesteuert wird, und (optional) die Zielvergrößerungsabweichung β_k, mit der ein variables Vergrößerungselement angesteuert wird.
Im Einzelnen wird in Schritt S13 für die Zielebene z_k die Zieleinstellung c_k für das Korrektionsglied 18 berechnet. In Schritt S14 wird das Korrektionsglied 18 dann in die Zieleinstellung c_k bewegt, um den Öffnungsfehler in der Zielebene z_k bestmöglich zu korrigieren.
In Schritt S15 wird die Referenzschnittweitenabweichung x_k für die Zielebene z_k berechnet. In Schritt S16 wird die Fokussiereinrichtung 22 entsprechend der Referenzschnittweitenabweichung x_k verstellt.
In Schritt S17 wird die Zielvergrößerungsabweichung β_k für die Zielebene z_k berechnet. In Schritt S18 wird dann das variable Vergrößerungselement entsprechend der Zielvergrößerungsabweichung β_k verstellt.
Dabei werden der durch die Schritte S13 und S14 gebildete Verarbeitungszweig zur Verstellung des Korrektionsgliedes 18, der durch die Schritte S15 und S16 gebildete Verarbeitungszweig zur Verstellung der Fokussiereinrichtung 22 sowie (optional) der durch die Schritte S17 und S18 gebildete Verarbeitungszweig zur Verstellung des variablen Vergrößerungselementes parallel ausgeführt. Diese Verarbeitungszweige münden gemeinsam in den Schritt S19, in dem nach der erfolgten Einstellung der auf die Zielebene z_k bezogenen Zielgrößen c_k, z_k und β_k ein Bild der Zielebene z_k aufgenommen wird. Die so erzeugten Volumenbilddaten werden in Schritt S20 gespeichert. In Schritt S21 erfolgt eine Abfrage, ob eine weitere Zielebene aufgenommen werden soll. Ist dies der Fall, so wird die Laufvariable k um 1 erhöht (k=k+1) und der vorstehend erläuterte Bildaufnahmeprozess erneut durchgeführt. Soll keine weitere Zielebene aufgenommen werden, so endet der Prozess.
Es ist darauf hinzuweisen, dass die unter Bezugnahme auf die 5 und 6 erläuterten Abläufe nur beispielhaft zu verstehen sind. Es sind verschiedene Abwandlungen denkbar, z.B. eine Volumenbildaufnahme, bei der nur die Einstellung des Korrektionsgliedes 18 berücksichtigt wird, nicht jedoch eine Änderung der Objektschnittweite und eine Änderung der Mikroskopvergrößerung infolge der Verstellung des Korrektionsgliedes 18. In diesem Fall können die beiden durch die Schritte S15, S16 bzw. S17, S18 gebildeten Verarbeitungszweige weggelassen werden. Es können jedoch auch zusätzliche, parallel ausgeführte Verarbeitungszweige vorgesehen werden, wie etwa die Einstellung eines auf die Zielebene bezogenen Zielsteuerparameters, z.B. einer Beleuchtungslichtleistung, auf Grundlage vorher definierter, auf die Referenzebenen bezogener Referenzsteuerparameter.
In den 7 bis 10 sind verschiedene Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Mikroskops 10 gezeigt.
Das Mikroskop 10 nach 7 umfasst neben den schon unter Bezugnahme auf die 1 und 4 angegebenen Mikroskopkomponenten ein aufrechtes Mikroskopstativ 30 sowie eine Dokumentationseinheit 32, die über eine Verbindungsleitung 34 mit der Steuereinheit 20 gekoppelt ist. Bei der Ausführungsform nach 7 ist die Fokussiereinrichtung 22 (wie auch in dem Ausführungsbeispiel nach den 1 bis 4) durch den längs der optischen Achse motorisch verstellbaren Objekttisch 14 gegeben. In 7 ist zudem ein Immersionsmedium 36 gezeigt, in das die Volumenprobe 16 eingebettet ist. Der Brechungsindex des Immersionsmediums 36 ist so gewählt, dass er möglichst gut an den Brechungsindex der Volumenprobe 16 angepasst ist.
Die Ausführungsform nach 8 ist gegenüber der in 7 dargestellten Ausführungsform so abgewandelt, dass die Fokussiereinrichtung 22 nicht durch einen verstellbaren Objekttisch, sondern einen längs der optischen Achse bewegbaren Objektivrevolver gebildet ist, an dem das Mikroskopobjektiv 12 gehalten ist.
Die Ausführungsform nach 10 weist demgegenüber ein inverses Mikroskopstativ 38 auf. Die Fokussiereinrichtung 22 ist in dieser Ausführungsform wiederum durch einen längs der optischen Achse verstellbaren Objektivrevolver 40 gebildet.
Die Ausführungsform nach 10 ist schließlich gegenüber der in 9 dargestellten Ausführungsform dadurch abgewandelt, dass die Fokussiereinrichtung 22 wiederum durch den längs der optischen Achse verstellbaren Objekttisch 14 realisiert ist.
Auch die Ausführungsformen nach den 7 bis 10 sind lediglich beispielhaft zu verstehen. Insbesondere ist die Erfindung nicht auf einen bestimmten Mikroskoptyp beschränkt. Vielmehr ist sie in den unterschiedlichsten Mikroskopieverfahren anwendbar, beispielsweise in der Weitfeld-Mikroskopie, in der Konfokal-Mikroskopie, der Multiphotonen-Mikroskopie oder der Lichtblatt-Mikroskopie.
Bezugszeichenliste

10: Mikroskop
12: Mikroskopobjektiv
14: Objekttisch
16: Volumenprobe
18: Korrektionsglied
20: Steuereinheit
22: Fokussiereinrichtung
24: Verbindungsleitung
26: Verbindungsleitung
28: Objektebene
30: aufrechtes Mikroskopstativ
32: Dokumentationseinheit
34: Verbindungsleitung
36: Immersionsmedium
38: inverses Mikroskopstativ
40: Objektivrevolver

Claims

Verfahren zum mikroskopischen Abbilden einer Volumenprobe (16), bei dem ein Mikroskopobjektiv (12) nacheinander auf mindestens zwei Referenzebenen fokussiert wird, die sich innerhalb der Volumenprobe (16) längs der optischen Achse (O) des Mikroskopobjektivs (12) in unterschiedlichen Volumenprobentiefen befinden; für jede Referenzebene eine Referenzeinstellung eines Korrektionsgliedes (18) ermittelt wird, bei der ein von der Volumenprobentiefe abhängiger Abbildungsfehler durch das Korrektionsglied (18) korrigiert ist; auf Grundlage der ermittelten Referenzeinstellungen für mindestens eine Zielebene in der Volumenprobe (16) eine Zieleinstellung für das Korrektionsglied (18) bestimmt wird, in welcher der in der Volumenprobentiefe der Zielebene auftretende Abbildungsfehler durch das Korrektionsglied (18) korrigiert ist; und zum Abbilden der Volumenprobe (16) das Mikroskopobjektiv (12) auf die Zielebene fokussiert und das Korrektionsglied (18) in die Zieleinstellung gebracht wird, wobei für jede Referenzebene eine durch das Korrektionsglied (18) in der jeweiligen Referenzeinstellung verursachte Abweichung der Objektschnittweite des Mikroskopobjektivs (12) gegenüber einer Sollschnittweite als Referenzschnittweitenabweichung ermittelt wird, auf Grundlage dieser Referenzschnittweitenabweichungen für die Zielebene eine Zielschnittweitenabweichung bestimmt wird, welche die durch das Korrektionsglied (18) in der Zieleinstellung verursachte Abweichung der Objektschnittweite gegenüber der Sollschnittweite angibt; und das Mikroskopobjektiv (12) unter Berücksichtigung der Zielschnittweitenabweichung auf die Zielebene fokussiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem auf Grundlage der Referenzschnittweitenabweichungen eine Schnittweitenvorschrift ermittelt wird, welche die Abweichung der Objektschnittweite in Abhängigkeit der Einstellung des Korrektionsgliedes (18) angibt, und die Zielschnittweitenabweichung an Hand dieser Schnittweitenvorschrift insbesondere durch Interpolation bestimmt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem auf Grundlage der Referenzeinstellungen des Korrektionsgliedes (18) eine Korrektionsvorschrift ermittelt wird, welche die zur Korrektion des Abbildungsfehlers vorgesehene Einstellung des Korrektionsgliedes (18) in Abhängigkeit der Volumenprobentiefe angibt, und die Zieleinstellung des Korrektionsgliedes (18) an Hand dieser Korrektionsvorschrift insbesondere durch Interpolation bestimmt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem für jede Referenzebene eine durch das Korrektionsglied (18) in der jeweiligen Referenzeinstellung verursachte Abweichung der Vergrößerung des Mikroskopobjektivs (12) gegenüber einer Sollvergrößerung als Referenzvergrößerungsabweichung ermittelt wird, auf Grundlage dieser Referenzvergrößerungsabweichungen für die Zielebene eine Zielvergrößerungsabweichung bestimmt wird, welche die durch das Korrektionsglied (18) in der Zieleinstellung verursachte Abweichung der Vergrößerung gegenüber der Sollvergrößerung angibt; und ein variables Vergrößerungselement unter Berücksichtigung der Zielvergrößerungsabweichung verstellt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem für jede Referenzebene mindestens ein Referenzsteuerparameter, insbesondere eine Beleuchtungslichtleistung, festgelegt wird; und auf Grundlage dieser Referenzsteuerparameter für die Zielebene ein Zielsteuerparameter bestimmt und eingestellt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die mindestens zwei Referenzebenen mehrere längs der optischen Achse (O) äquidistante Ebenen umfassen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Mikroskopobjektiv (12) zum Fokussieren relativ zur Volumenprobe (16) längs der optischen Achse (O) bewegt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem ein abzubildender Volumenprobenbereich längs der optischen Achse (O) durch die Referenzebene, die sich in der geringsten Volumenprobentiefe befindet, und die Referenzebene, die sich in der größten Volumenprobentiefe befindet, begrenzt wird.
Mikroskop (10) zum Abbilden einer Volumenprobe (16), mit einem Mikroskopobjektiv (12); einem Korrektionsglied (18); einer Fokussiereinrichtung (22); und einer Steuereinheit (20); wobei die Steuereinheit (20) das Mikroskopobjektiv (12) mittels der Fokussiereinrichtung (22) nacheinander auf mindestens zwei Referenzebenen fokussiert, die sich innerhalb der Volumenprobe (16) längs der optischen Achse (O) des Mikroskopobjektivs (12) in unterschiedlichen Volumenprobentiefen befinden; die Steuereinheit (20) für jede Referenzebene eine Referenzeinstellung des Korrektionsgliedes (18) ermittelt, bei der ein von der Volumenprobentiefe abhängiger Abbildungsfehler durch das Korrektionsglied (18) korrigiert ist; die Steuereinheit (20) auf Grundlage der ermittelten Referenzeinstellungen für mindestens eine Zielebene in der Volumenprobe (18) eine Zieleinstellung für das Korrektionsglied (18) bestimmt, in welcher der in der Volumenprobentiefe der Zielebene auftretende Abbildungsfehler durch das Korrektionsglied (18) korrigiert ist; die Steuereinheit (20) das Mikroskopobjektiv (12) mittels der Fokussiereinrichtung (22) zum Abbilden der Volumenprobe auf die Zielebene fokussiert und das Korrektionsglied (18) in die Zieleinstellung bringt, die Steuereinheit (20) für jede Referenzebene eine durch das Korrektionsglied (18) in der jeweiligen Referenzeinstellung verursachte Abweichung der Objektschnittweite des Mikroskopobjektivs (12) gegenüber einer Sollschnittweite als Referenzschnittweitenabweichung ermittelt, die Steuereinheit (20) auf Grundlage dieser Referenzschnittweitenabweichungen für die Zielebene eine Zielschnittweitenabweichung bestimmt, welche die durch das Korrektionsglied (18) in der Zieleinstellung verursachte Abweichung der Objektschnittweite gegenüber der Sollschnittweite angibt; und die Fokussiereinrichtung das Mikroskopobjektiv (12) unter Berücksichtigung der Zielschnittweitenabweichung auf die Zielebene fokussiert.
Mikroskop (10) nach Anspruch 9, bei dem das Korrektionsglied (18) eine in dem Mikroskopobjektiv (12) enthaltene Linseneinheit und eine Antriebseinheit zum Bewegen der Linseneinheit längs der optischen Achse (O) aufweist.
Mikroskop (10) nach Anspruch 10, bei dem die Antriebseinheit einen an einem Gehäuse des Mikroskopobjektivs (12) angeordneten, um die optische Achse (O) drehbaren Korrekturring umfasst, dessen Drehbewegung in eine Verstellbewegung der Linseneinheit längs der optischen Achse (O) umsetzbar ist.
Mikroskop (10) nach einem der Ansprüche 9 bis 11, bei dem die Fokussiereinrichtung (22) zum Verstellen des Mikroskopobjektivs (12) und/oder eines die Volumenprobe (16) tragenden Objekttisches motorisch verstellbar ist.