WO2012156150A1 - Verfahren und vorrichtung zum festlegen eines z-bereiches in einer probe, in dem ein z-stapel der probe mittels eines mikroskops aufzunehmen ist - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum festlegen eines z-bereiches in einer probe, in dem ein z-stapel der probe mittels eines mikroskops aufzunehmen ist Download PDF

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WO2012156150A1
WO2012156150A1 PCT/EP2012/056210 EP2012056210W WO2012156150A1 WO 2012156150 A1 WO2012156150 A1 WO 2012156150A1 EP 2012056210 W EP2012056210 W EP 2012056210W WO 2012156150 A1 WO2012156150 A1 WO 2012156150A1
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WO
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sample
range
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determined
stack
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PCT/EP2012/056210
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Inventor
Horst Wolff
Daniel Svejdar
Markus Eichinger
Original Assignee
Carl Zeiss Microscopy Gmbh
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    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
    • G—PHYSICS
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    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/006—Optical details of the image generation focusing arrangements; selection of the plane to be imaged
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
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    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/24—Base structure
    • G02B21/241—Devices for focusing
    • G02B21/244—Devices for focusing using image analysis techniques

Definitions

  • the present invention relates to a method and apparatus for defining a z-region in a sample in which a z-stack of the sample is to be picked up by means of a microscope.
  • the recording of a z-stack or the recording of image series in the z-direction has been part of the state of the art for many years.
  • a plurality of individual images at different z-values (focus planes) within the z-range are performed in a fixed z-range in order, for.
  • an object in the sample such as a cell to record in different levels and then based on the individual images of the z-stack z.
  • B. perform a three-dimensional reconstruction of the z-range and thus the object or to calculate an image of the object with extended depth of field.
  • the user of the microscope determines the essential parameters for receiving the z-stack. If several similar samples are to be included in the context of an experiment, in addition to the determination of the parameters prior to the beginning of the experiment, usually at least some parameters are set manually again before the current series of photographs.
  • the key parameters for z-stack capture include the number of z-planes in which an image is captured, the spacing of each z-plane, and the area where the z-stack is captured.
  • the range is fixed, only the number of z-levels or the spacing of the individual z-levels need to be specified.
  • the other parameter then results taking into account the specified z-range.
  • Especially the definition of the area in which the z-stack is to be recorded is difficult even for experienced microscopy users, since the determination is subject to subjective impressions and in particular depends on the specific presentation on the appropriate screen. So it is z.
  • the step of setting is usually very time consuming, which also brings a usually undesirably high load on the sample, since only slowly the manual adjustment of the upper and lower limits of the z-range is possible.
  • the manual adjustment always involves the difficulty of large deviations of the reception of a z-stack of a first sample and the inclusion of a z-stack of a second sample in an experiment, since instead of an objective criterion only the visual impression that the user of of the respective sample has determined in which area the z-stack is taken up.
  • the object is achieved by a method for determining a z-range in a sample in which a z-stack of the sample is to be recorded by means of a microscope, based on a z-value lying in the sample and taking into account at least one predetermined Parameters of z range is set automatically.
  • the z-range is automatically determined on the basis of a z-value (which stands in particular for a focus plane of the sample) and at least one predetermined parameter, the difficulties described above can be overcome. It is no longer necessary for the user to manually define the z-range, which makes possible a fast, good and highly reproducible determination of the z-range.
  • one of the predetermined parameters may be a sharpness (eg, a contrast function) of the sample, e.g. B. can be determined and evaluated without the intervention of a user.
  • This can be very objectively set the z-range in the sample in which the object to be recorded is located.
  • a value of the predetermined parameter may be determined which has an influence on the extent of the z-range or defines the limits of the z-range.
  • This predetermined parameter is in particular a sample-independent parameter. This is understood here to mean that the parameter can be used with different samples and rarely needs to be changed by the user, especially inexperienced users.
  • a relative percentage value x with respect to a maximum or minimum parameter value of the predetermined parameter is suitable as the parameter value.
  • the relative percentage x indicates that a z-range limit has been reached when the sharpening value at a z position has dropped to the xth percentile of the maximum sharpening value at the given sample position is.
  • arbitrary sharpness measurement functions can serve as parameters for determining a sharpness parameter.
  • the z-value lying in the sample can be determined automatically, in particular by an autofocusing method.
  • the autofocusing method can be used to determine the sharpest z-value (focus position) in the sample.
  • the z-range in the sample can be determined completely automatically, since both the z-value lying in the sample is automatically determined, and the z-range based on this z-value and on the parameter z.
  • the Autofokussier Kunststoffs eg., A sharpness
  • the z-range can be determined in particular on the basis of the data of the automatic determination (eg of the autofocusing method, which preferably determines the z position in the sample having the highest sharpness value (focus position) as the z value) of the z value in the sample be determined.
  • the autofocusing method used to determine the z-value in the sample can also be used to determine the z-range, so that the z-range can be set very quickly.
  • the upper and lower limits of the z-range can be determined symmetrically or asymmetrically with respect to the z-value lying in the sample. For example, if the z value is determined by an autofocus method by evaluating the decrease in the sharpness value, the upper and lower limits of the z-range are determined symmetrically or asymmetrically relative to the z-value in the sample (which here corresponds to the focus position). Thus, for example, a very fast z-range determination is possible.
  • a limit of the z-range to be determined can be determined on the basis of a predetermined value of the at least one parameter.
  • the z-range is determined to be symmetrical to the z-value in the sample.
  • the symmetrical determination of the z-range is particularly advantageous if the z-value lying in the sample was determined by means of an autofocusing method as the sharpest z-value (focus position).
  • the z-value lying in the sample should correspond to the focus position
  • the value of a parameter which serves as the predetermined parameter for determining the z-range is determined.
  • the characteristic may be z. B. to a measurand or an observable and in particular a sharpness measure, which is based for example on contrast, intensity, etc.
  • the stepwise determination of the value of the predetermined parameter can be performed not only in the z-direction but also in the opposite direction (-z-direction).
  • the stride length is preferably constant, but may also vary (eg, increase or decrease).
  • the z-direction is z. B. the direction to the lens of the microscope, so that then the -z-direction is the direction away from the lens. Of course it can be the other way around too.
  • the z-stack of the sample can be recorded in the z-region. Furthermore, in the method according to the invention for determining the z-area, individual recordings of the sample in different z-planes can be made, with at least a portion of the individual recordings being used for the z-stack of the sample to be recorded. This makes it possible to set the z-range automatically and also the recording very quickly z-stack because single shots are used to define the z-range for z-stack capture.
  • At least one further z-region can be determined automatically on the basis of a z-value in the sample and taking into account at least one predetermined parameter.
  • the predetermined parameter (s) for the at least one further z-range is or are in particular the same parameter as for the previously defined z-range.
  • the z-region may be the same sample or the same section of the sample and / or another sample or another section of the sample, in particular laterally or transversely to the z-direction relative to the previously defined z-region can be offset.
  • a mosaic image can be performed. It is also possible to observe the same object in a time series or over a long time.
  • the optimal z-range can be set automatically for every z-stack. By optimizing the number of single shots (not too much, not too little), you can reduce the total recording time, amount of image data, and light exposure of the sample. Thus, unnecessary single shots within a z-stack can be avoided, whereby the total recording time and also the light load of the sample can be reduced. Of course, it is not necessary to set the z-range in accordance with the invention for each z-stack. If z. B.
  • the change of the z-range from the inclusion of a z-stack to the next z-stack is relatively low, the z-range of the previous z-stack can be used again. It is also possible to determine the z-range of a next z-stack (in a time series and / or spatially separated) by interpolation based on at least two already defined z-ranges (eg by linear interpolation) or by extrapolation based on at least set an already defined z-range.
  • a three-dimensional representation of the recorded z-range can be reconstructed on the basis of the recorded z-stack or the recorded z-stack, or an image of the object with extended depth of focus can be calculated and preferably displayed.
  • the microscope for taking the sample can be a wide-field microscope or a confocal microscope (eg a confocal microscope with a single or multi-point scanner, strip scanner or spinning disc).
  • the microscope can work with structured illumination and / or be designed as a fluorescence microscope. If the microscope is designed as a confocal microscope, the sharpness dimension is understood to be, in particular, the mean or the summed intensity of the respective confocal recording.
  • the inventive method for determining a z-range in a sample can be used advantageously in fully and partially automated scanning and screening systems. This leads advantageously for the user of such a system at a much lower cost for setting and configuring.
  • the method according to the invention for determining a z-region in a sample can also be used to determine the sample or preparation thickness at different x / y positions.
  • the sample thickness can be determined by interpolation or extrapolation based on at least one already determined sample thickness value.
  • the z-value lying in the sample can be determined by means of the automatic determination of a focal plane.
  • the magnification in the automatic determination of the focal plane may be equal to, greater or smaller than the magnification that is present when the z-stack is picked up.
  • the appropriate adjustment, if necessary, for the inclusion of the z-stack can be carried out automatically based on the known different magnifications.
  • the distances of the individual z-planes (for the individual images) can be adapted according to the optical laws (eg depth of field).
  • the method according to the invention for determining a z-range in a sample can advantageously be used in systems for automatic screening of multi-well plates or culture dishes.
  • Different wells (wells) of a multi-well plate may have different samples or different height and focus planes.
  • An automatic configuration per well of a multi-well plate makes the work extremely easy for the user or saves a lot of time.
  • the z-region can be optimally determined by the method according to the invention.
  • the object is further achieved by a device for determining a z-range in a sample in which a z-stack of the sample is to be picked up by means of a microscope, the device having a control unit which is designed on the basis of a in the Probe z-value and automatically set the z-range taking into account at least one predetermined parameter.
  • the z-range can be determined automatically with the device according to the invention, whereby the difficulties described above can be overcome.
  • Advantageous developments of the device according to the invention are given in the dependent device claims.
  • the device may contain the microscope itself, wherein the microscope, as already described, may be a wide-field microscope, a confocal microscope or another microscope.
  • the microscope can be designed as a fluorescence microscope.
  • the device according to the invention can be developed so that the method according to the invention (including its developments) can be carried out with it.
  • the method according to the invention can also be developed in such a way that it has the method steps described in connection with the device according to the invention (including its developments).
  • Fig. 1 is a schematic representation of an embodiment of the invention
  • 2a-2c are sectional views of an object to be recorded 9 in a sample 6, wherein different z-recording planes are located;
  • 3a-3c are schematic representations of the sharpness course for the object 9 according to
  • FIGS. 2a-2c; 4 shows a flow chart of a further embodiment of the method according to the invention.
  • Fig. 5 is a plan view for explaining a mosaic photograph of the cell 9;
  • Fig. 6 is a side view of the mosaic sections K21 -K24;
  • FIG. 7 shows a side view according to FIG. 7 for explaining the previously known procedure
  • Fig. 8 is an illustration for explaining the determination of the z-range for a cell whose z-dimension increases with time
  • FIG. 9 is an illustration according to FIG. 8 for explaining the previously known procedure
  • FIG. Fig. 10 is an illustration for explaining the determination of the z-range for a cell 9 which changes its z-position with time;
  • FIG. 11 is an illustration according to FIG. 10 for explaining the previously known procedure
  • FIG. 12 is an illustration of a non-Gaussian sharpness profile for determining the z-range
  • FIG. 13 shows a further illustration of a non-Gaussian sharpness profile for determining the z-range.
  • the microscope 1 comprises a stand 2 with a sample stage 3 and a microscope optics 4, which is shown schematically as an objective revolver with three objectives.
  • the distance between the microscope optics 4 (objective revolver) and the sample stage 3 can be changed to adjust the focal position (z position) or for focusing, as indicated by the double arrow P1 in FIG.
  • the microscope 1 further comprises a recording unit 5 (for example a CCD camera) with which the enlarged image of a sample 6 to be examined can be recorded.
  • the recording unit 5 is connected to a computer 7 shown schematically, which controls the microscope 1 in operation via a control module 8.
  • the microscope 1 contains a z-drive, not shown, with which the distance between the sample stage 3 and the microscope optics 4 (in the z-direction) is variable, and an xy motor, not shown, for the sample table 3, with which the position of the sample table 3 in the xy plane (the y-direction extends perpendicular to the drawing plane of FIG. 1) is adjustable, with both the z-drive and the xy-motor being controlled by means of the control module 8.
  • the microscope 1 according to the invention is designed so that with it image series with different focal positions (different z-values) of the sample 6 and an object within the sample 6, such. B. a cell to be examined, can be recorded in order to reconstruct a three-dimensional representation of the recorded object can.
  • Such a series of images is often also called z-stack, whereby in addition to the spacing of the individual z-planes, the z-range in which the z-stack is recorded is usually also to be defined.
  • an autofocusing is first carried out in the microscope 1 according to the invention, in which the values of a sharpness measure are obtained as a function of the z position by taking pictures in different z positions and a subsequent evaluation.
  • Such a sharpness course is shown schematically in Fig. 3a.
  • Conventional autofocusing methods can be used to obtain the sharpness course profile.
  • a scalar function S (B (x, y, z)) can be used as the sharpness measure, which provides a scalar value (the sharpness value) for each image B (x, y, z) taken with the acquisition unit 5 Image sharpness increases (as shown in Fig. 3a) and at maximum image sharpness has an extreme value.
  • the scalar functional is designed so that the sharpness value decreases with increasing focus and at maximum image sharpness is a minimum value. Since in general the functional S are constructed in such a way that they have a maximum at maximum image sharpness, this is assumed in the further description.
  • the sharpness functionals S provide a scalar as a sharpness measurement value, since in the calculation specification of the respective sharpening function, the two-dimensional recording is summed or integrated via the two recording dimensions. Therefore, the scalar sharpness value for a given image section depends essentially only on z and thus the focus position. Therefore, for a given frame, the functional S may be considered to be dependent on the focus position z (ie S (z)).
  • the maximum sharpness value S max is present here at the z-position z c , which corresponds to the z-plane indicated by the line L 1 (FIG. 2 a), wherein an xz-section through the sample 6 is shown schematically here and the object to be recorded the nucleus 10 of a cell 9 should be, which is shown schematically.
  • the z plane with the z value z c lies exactly in the middle of the cell nucleus 10.
  • the sharpness course shown in Fig. 3a is obtained, this can be used in addition to the determination of the z-plane with the greatest sharpness equal to automatically set the lower and upper limits of the z-range for the z-stack.
  • the sharpness (sharpness) S is thus a predetermined parameter for the determination of the z-range.
  • the position of the corresponding z-plane is indicated in Fig. 2b by the line L2.
  • the upper limit of the z-range is determined.
  • the corresponding position of the z plane is indicated in the illustration of FIG. 2c by the line L3.
  • the z-range (here from z L to z R ) can be set automatically without the user having to intervene.
  • the optimum cutting distance (z-distance for the individual recordings of the z-stack) is then automatically determined and set by means of the computer 7.
  • preferred parameters of the recording such. B. the numerical aperture of the microscope optics 4, etc. taken into account in a known manner.
  • the percentage does not have to be 50%, but can take other values as well.
  • the percentages for determining the sharpness threshold values for the lower and upper limits z L , z R may be different.
  • a predetermined parameter (the sharpening functional) and two values of the predetermined parameter (each indicating the decrease of the sharpness value relative to the maximum sharpness value for the upper and lower limits of the z-range to be set) are given for automatically setting the z-range.
  • the desired z-stack of the cell nucleus 10 is then recorded by means of the microscope 1 using the acquisition parameters thus determined (that is, the z-range and the z-distance).
  • the acquisition parameters thus determined that is, the z-range and the z-distance.
  • a plurality of individual recordings within the determined z-range and with the determined z-range. Distance created) then z. B. to generate a three-dimensional representation of the nucleus 10 can.
  • the images of the sample 6 taken for the autofocusing generally have a lower resolution than the images then taken for the z-stack, whereby a fast autofocusing with a low load of the sample 6 is possible.
  • step S1 an autofocus run is performed to make the z value z c largest To determine image sharpness (step S1).
  • the autofocusing described in connection with FIG. 3a or any other known method can be used.
  • the start position is initialized (as the start position z is here for selected c), the Shurfeshuwert S (z c) are determined and selected, the pitch dz, where selected, for example, as a pitch dz, the depth of field of the microscope 1 and the microscope optical system 4 used can be.
  • a sharpening measure S (z) can z.
  • a scalar sharpening functional may be used that takes into account, for example, entropy measures, performs an image frequency analysis, or a simple sum over gradients. Basically, all image sharpness measures that are suitable for conventional autofocusing algorithms are also suitable for the sharpness functional S according to step S2.
  • steps S3 to S6 are then carried out in succession, the value G L serving to define the lower or left boundary of the z range and having a value of, for example, 0.5 here.
  • the sharpness value S (z) for the image recordings made at the different positions is greater than G L * S (z c ), further recordings are made.
  • the present z-value is the value of the lower limit z L.
  • steps S8-S13 are performed to determine the upper limit z R.
  • 0.5 is used as the value of GR in step S12.
  • the values GL and GR do not have to be the same, but may be different.
  • the two z-range limits are automatically determined so that the z-range is automatically set. It can then be recorded in a known manner the z-stack.
  • steps S8 to S13 can be dispensed with in order to determine the value z R.
  • z R z c + (z c -z L ).
  • steps S3 and S9 the depth of field of the microscope optics 4 used was chosen as the step size. Of course, smaller or larger increments are possible. If you want a higher accuracy, you can choose a smaller increment, with values up to half the depth of field of advantage. If you want a higher speed in the determination of the z-range, you can choose a larger step size. This can, for. B. up to 1, 5 times the depth of field.
  • an arbitrary z-value within the cell 9 can be specified. Due to the steps S2 to S13, even if the z value is not in the optimum sharpness level, the relevant and desired z range can be set extremely accurately.
  • the determination of the z-range according to the invention can be carried out separately for each mosaic element, which leads to avoidance of unnecessary individual recordings, as will be described in detail below.
  • the object to be recorded 9 is shown in plan view and twelve mosaic sections K1 1 -K33 are drawn, wherein in each of the mosaic sections K1 1 -K33 the reception of a z-stack by means of the microscope 1 (FIG. FIG. 6 shows in a side view the object 9 to be recorded in the region of the mosaic sections K21, K22, K23 and K24. Since, for each of the mosaic sections K21-K24, the z-area is first automatically set in the manner described before the recording, the z-area for the mosaic section K21 -K24 is optimally set, as shown by the dashed lines in FIG. which are the upper and lower limits of the z-range is shown.
  • Fig. 7 the previously known solution is indicated, in which the determination of the z-range is carried out before the start of the measurement.
  • the z-range is determined based on the portion of the cell 9 having the largest z-dimension, as shown schematically in FIG.
  • an automatic definition of the z-area can be performed.
  • the z-range may be determined by interpolation from the already-defined z-ranges of two or more adjacent mosaic portions (eg, the mosaic portions K1 1 and K13). A determination by means of extrapolation based on at least one already determined z-range is possible.
  • FIG. 8 Another example of the advantageous application of the method according to the invention for defining a z-range will be described in connection with FIG. 8. There, the cell 9 to be recorded is shown schematically at three different times t1, t2 and t3, it being assumed that the cell 9 grows so that, inter alia, its expansion in the z-direction increases with increasing time.
  • the determination of the z-range according to the invention is carried out automatically, so that there are always optimally adapted limits for the z-range at all times t1 -t3, such as represented by the dashed lines which are to represent the upper and lower limits.
  • the optimum z-range is determined and set, so that the z-stack can then be recorded at these times t1 -t3.
  • the previous approach has been to make an assumption about the minimum and maximum z values of the cell 9 that occur during the measurements and to determine the z-range based on them, which is for example limited to the limits shown in FIG again shown by dashed lines) leads. Images of the z-stack at times t1, t2 and t3 then lead to a multiplicity of unnecessary individual recordings, since the boundaries are very far away from the cell 9 in comparison to the representation of FIG. 10.
  • the sharpness dimension S is shown in a similar manner as in Fig. 3b, wherein in Fig. 12, a non-Gaussian sharpness profile is assumed.
  • z. B. the lower limit of the z-range can be determined by the drop in the sharpness value to 50% based on the local maximum value, as indicated in Fig. 12. Since the sharpness profile increases in the direction of increasing z-values and does not fall off again or lies above a preset threshold value, the upper limit for the z-range z. B. automatically the search limit autofocus routine be used. Alternatively, it is possible to determine the upper limit based on the determined lower limit.
  • Fig. 13 the case is shown that due to the sharpness only the upper limit can be determined.
  • the lower limit is then determined in a manner similar to the upper limit in the variant of FIG. 12.
  • the described method of determining the z-range assumes that this determination is carried out for a receiving channel of the microscope 1. If the sample 9 is colored, z. B. with different fluorescent markers, the z-range can be set separately for each recording channel and also the recording of the z-stack for the corresponding channel with the associated z-range are performed.
  • the microscope 1 is designed as a wide-field microscope.
  • the microscope 1 need not be a wide-field microscope.
  • the microscope 1 can be designed as a confocal microscope. In this case, one may speak of a medium intensity and a mean intensity value instead of the sharpness measure and the sharpness measurement value. All other aspects may be realized in the same or similar manner as in the embodiments described above.

Abstract

Es wird bereitgestellt ein Verfahren zum Festlegen eines z-Bereiches in einer Probe, in dem ein z-Stapel der Probe mittels eines Mikroskops aufzunehmen ist, wobei auf der Basis eines in der Probe liegenden z-Wertes und unter Berücksichtigung zumindest eines vorbestimmten Parameters der z-Bereich automatisch festgelegt wird.

Description

Verfahren und Vorrichtung zum Festlegen eines z-Bereiches in einer Probe, in dem ein z- Stapel der Probe mittels eines Mikroskops aufzunehmen ist
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Festlegen eines z- Bereiches in einer Probe, in dem ein z-Stapel der Probe mittels eines Mikroskops aufzunehmen ist.
In der Mikroskopie gehört die Aufnahme eines z-Stapels bzw. die Aufnahme von Bildserien in der z-Richtung (z. B. entlang der optischen Achse des Mikroskops) seit vielen Jahren zum Stand der Technik. Bei der Aufnahme eines solchen z-Stapels werden in einem festgelegten z- Bereich mehrere Einzelaufnahmen an unterschiedlichen z-Werten (Fokusebenen) innerhalb des z-Bereiches durchgeführt, um z. B. ein Objekt in der Probe, wie beispielsweise eine Zelle, in unterschiedlichen Ebenen aufzunehmen und dann basierend auf den Einzelaufnahmen des z- Stapels z. B. eine dreidimensionale Rekonstruktion des z-Bereiches und somit des Objektes durchzuführen oder ein Bild des Objektes mit erweiterter Tiefenschärfe zu berechnen.
Bisher bestimmt der Benutzer des Mikroskops die wesentlichen Parameter für die Aufnahme des z-Stapels. Wenn mehrere gleichartige Proben im Rahmen eines Experimentes aufzunehmen sind, werden neben der Bestimmung der Parameter vor Beginn des Experimentes üblicherweise zumindest einige Parameter vor der aktuellen Aufnahmeserie nochmals manuell eingestellt. Zu den wesentlichen Parametern für die Aufnahme des z-Stapels gehören die Anzahl der z-Ebenen, in denen ein Bild aufgenommen wird, der Abstand der einzelnen z-Ebenen und der Bereich, in dem der z-Stapel aufgenommen wird.
Wenn der Bereich festgelegt ist, muß lediglich die Anzahl der z-Ebene oder der Abstand der einzelnen z-Ebenen noch festgelegt werden. Der jeweils andere Parameter ergibt sich dann unter Berücksichtigung des festgelegten z-Bereiches. Gerade die Festlegung des Bereiches, in dem der z-Stapel aufgenommen werden soll, ist selbst für erfahrene Mikroskopieanwender schwierig, da die Festlegung subjektiven Eindrücken unterworfen ist und insbesondere von der konkreten Darstellung am entsprechenden Bildschirm abhängt. So ist es z. B. nicht möglich, Intensitäten des Objektes in z-Ebenen mit dem Auge zu quantifizieren und dies später wieder genau so zu reproduzieren. Ferner ist der Schritt des Festlegens in der Regel sehr zeitaufwendig, was auch noch eine in der Regel unerwünscht hohe Belastung der Probe mit sich bringt, da nur langsam die manuelle Einstellung der oberen und unteren Grenze des z-Bereiches möglich ist. Zudem birgt die manuelle Einstellung immer die Schwierigkeit von großen Abweichungen der Aufnahme eines z-Stapels einer ersten Probe und der Aufnahme eines z-Stapels einer zweiten Probe im Rahmen eines Experimentes, da an Stelle eines objektiven Kriteriums lediglich der optische Eindruck, den der Benutzer von der jeweiligen Probe hat, bestimmt, in welchem Bereich der z-Stapel aufgenommen wird.
Ausgehend hiervon ist es daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren oder eine Vorrichtung zum Festlegen eines z-Bereiches in einer Probe, in dem ein z-Stapel der Probe mittels eines Mikroskops aufzunehmen ist, zur Verfügung zu stellen, mit denen die eingangs beschriebenen Schwierigkeiten möglichst vollständig überwunden werden können.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zum Festlegen eines z- Bereiches in einer Probe, in dem ein z-Stapel der Probe mittels eines Mikroskops aufzunehmen ist, wobei auf der Basis eines in der Probe liegenden z-Wertes und unter Berücksichtigung zumindest eines vorbestimmten Parameters der z-Bereich automatisch festgelegt wird.
Da der z-Bereich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren automatisch ausgehend von einem in der Probe liegenden z-Wert (der insbesondere für eine Fokus-Ebene der Probe steht) und zumindest einem vorbestimmten Parameter festgelegt wird, können die eingangs beschriebenen Schwierigkeiten überwunden werden. Es ist keine manuelle Interaktion des Benutzers zur Festlegung des z-Bereiches mehr notwendig, wodurch eine schnelle, gute und hoch reproduzierbare Festlegung des z-Bereiches möglich ist.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann einer der vorbestimmten Parameter ein Schärfemaß (z.B. eine Kontrastfunktion) der Probe sein, das z. B. ohne Zutun eines Benutzers ermittelt und ausgewertet werden kann. Damit kann sehr objektiv der z-Bereich in der Probe festgelegt werden, in dem das aufzunehmende Objekt liegt. So kann z.B. ein Wert des vorbestimmten Parameters festgelegt sein, der Einfluß auf die Ausdehnung des z-Bereichs hat oder die Grenzen des z-Bereichs festlegt. Dieser vorbestimmte Parameter ist insbesondere ein probenunabhängiger Parameter. Hierunter wird hier verstanden, daß der Parameter bei verschiedenen Proben genutzt werden kann und eher selten vom Benutzer, insbesondere unerfahrenen Benutzern, geändert werden muß.
Als Parameterwert eignet sich erfindungsgemäß ein relativer Prozentwert x bezogen auf einen maximalen oder minimalen Parameterwert des vorbestimmten Parameters. Im Zusammenhang mit einer Schärfemaßbestimmung gibt der relative Prozentwert x an, daß eine Grenze des z- Bereichs dann erreicht ist, wenn das Schärfemaß bzw. der Schärfewert an einer z-Position auf den x-ten Prozentanteil bezüglich des maximalen Schärfewertes an der gegebenen Probenposition abgefallen ist. Natürlich können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren als Parameter beliebige Schärfemaßfunktionale zur Bestimmung eines Schärfemaßes dienen. Typischerweise sind dies bei Autofokus-Algorithmen z.B. die Entropie, die Summe über Gradienten-Beträge oder Summe der Intensitäten. Ferner kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren der in der Probe liegende z-Wert automatisch, insbesondere durch ein Autofokussierverfahren, bestimmt werden. Mit dem Autofokussierverfahren kann der schärfste in der Probe liegende z-Wert (Fokusposition) bestimmt werden. Somit kann vollständig automatisch der z-Bereich in der Probe festgelegt werden, da sowohl der in der Probe liegende z-Wert automatisch bestimmt wird, als auch der z- Bereich basierend auf diesem z-Wert und auf dem Parameter z. B. des Autofokussierverfahrens (z. B. ein Schärfemaß) automatisch festgelegt wird.
Im erfindungsgemäßen Verfahren kann der z-Bereich insbesondere anhand der Daten des automatischen Bestimmens (z.B. des Autofokussierverfahrens, das bevorzugt als z-Wert die z- Position in der Probe mit dem höchsten Schärfewert (Fokusposition) ermittelt) des in der Probe liegenden z-Wertes festgelegt werden. Damit kann z.B. das für die Bestimmung des in der Probe liegenden z-Wertes durchgeführte Autofokussierverfahren auch gleich für die Festlegung des z-Bereiches benutzt werden, wodurch die Festlegung des z-Bereiches sehr schnell erfolgen kann.
Ferner kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die obere und untere Grenze des z- Bereiches symmetrisch oder asymmetrisch zu dem in der Probe liegenden z-Wert bestimmt werden. Wenn der z-Wert beispielsweise durch ein Autofokussierverfahren bestimmt ist, kann durch Auswertung des Abfalls des Schärfewertes die obere und untere Grenze des z-Bereichs symmetrisch oder asymmetrisch zu dem in der Probe liegenden z-Wert (was hier dann der Fokusposition entspricht) bestimmt werden. Damit ist beispielsweise eine sehr schnelle z- Bereichsbestimmung möglich.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann anhand eines vorbestimmten Wertes des zumindest einen Parameters eine Grenze des festzulegenden z-Bereichs bestimmt werden. Natürlich ist es möglich, zwei vorbestimmte Werte des zumindest einen Parameters vorzugeben, um beide Grenzen des festzulegenden z-Bereichs bestimmen zu können.
Wenn nur eine Grenze des z-Bereichs basierend auf dem vorbestimmten Wert des zumindest einen vorbestimmten Parameters bestimmt wird, ist es bevorzugt, daß der z-Bereich symmetrisch zu dem in der Probe liegenden z-Wert bestimmt wird. Die symmetrische Bestimmung des z-Bereiches ist besonders vorteilhaft, wenn der in der Probe liegende z-Wert mittels eines Autofokussierverfahrens als schärfster z-Wert (Fokusposition) bestimmt wurde.
Des weiteren kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgehend von dem in der Probe liegenden z-Wert (bei der Bestimmung des z-Wertes mittels einem Autofokussierverfahrens sollte der in der Probe liegende z-Wert der Fokusposition entsprechen) schrittweise mit größer werdendem Abstand in z-Richtung jeweils der Wert einer Kenngröße ermittelt werden, die als der vorbestimmte Parameter zur Festlegung des z-Bereiches dient. Bei der Kenngröße kann es sich z. B. um eine Meßgröße oder um eine Observable und insbesondere um ein Schärfemaß handeln, das beispielsweise auf Kontrast, Intensität, usw. basiert. Die schrittweise Ermittlung des Wertes des vorbestimmten Parameters (z.B. Schärfewert) kann nicht nur in z-Richtung, sondern auch in entgegengesetzter Richtung (-z-Richtung) durchgeführt werden. Die Schrittlänge ist bevorzugt konstant, kann aber auch variieren (z. B. zu- oder abnehmen). Die z-Richtung ist z. B. die Richtung hin zum Objektiv des Mikroskops, so daß dann die -z-Richtung die Richtung weg vom Objektiv ist. Natürlich kann es auch umgekehrt sein.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann nach Festlegung des z-Bereiches der z-Stapel der Probe in dem z-Bereich aufgenommen werden. Ferner können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Festlegung des z-Bereichs Einzelaufnahmen der Probe in verschiedenen z-Ebenen gemacht werden, wobei zumindest ein Teil der Einzelaufnahmen für den aufzunehmenden z-Stapel der Probe genutzt wird. Damit ist es sehr schnell möglich, den z-Bereich automatisch festzulegen und auch noch die Aufnahme des z-Stapels durchzuführen, da Einzelaufnahmen zur Festlegung des z-Bereichs für die Aufnahme des z-Stapels genutzt werden.
Ferner kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren (z.B. nach Aufnahme des z-Stapels der Probe) zumindest ein weiterer z-Bereich jeweils auf der Basis eines in der Probe liegenden z- Wertes und unter Berücksichtigung zumindest eines vorbestimmten Parameters automatisch festgelegt werden. Der vorbestimmte Parameter bzw. die vorbestimmten Parameter für den zumindest einen weiteren z-Bereich ist bzw. sind insbesondere derselbe Parameter wie für den zuvor festgelegten z-Bereich.
Bei dem z-Bereich kann es sich um dieselbe Probe bzw. denselben Abschnitt der Probe und/oder um eine andere Probe bzw. einen anderen Abschnitt der Probe handeln, der insbesondere lateral bzw. quer zur z-Richtung relativ zum zuvor festgelegten z-Bereich versetzt sein kann.
Somit kann beispielsweise eine Mosaikaufnahme durchgeführt werden. Auch ist es möglich, dasselbe Objekt in einer Zeitserie bzw. über lange Zeit zu beobachten. Auf jeden Fall kann für jeden z-Stapel der optimale z-Bereich automatisch festgelegt werden. Durch die hierdurch optimierte Anzahl der Einzelaufnahmen (nicht zu viel, nicht zu wenig) kann die gesamte Aufnahmedauer, Bilddatenmenge und auch die Lichtbelastung der Probe verringert werden. Damit können unnötige Einzelaufnahmen innerhalb eines z-Stapels vermieden werden, wodurch die gesamte Aufnahmedauer und auch die Lichtbelastung der Probe verringert werden kann. Natürlich muß nicht für die Aufnahme jedes z-Stapels in erfindungsgemäßer Weise der z- Bereich festgelegt werden. Wenn z. B. bei einer Zeitserie die Änderung des z-Bereiches von der Aufnahme eines z-Stapels zum nächsten z-Stapel relativ gering ist, kann der z-Bereich des vorhergehenden z-Stapels nochmals verwendet werden. Auch ist es möglich, den z-Bereich eines nächsten z-Stapels (in einer Zeitserie und/oder räumlich beabstandet) durch Interpolation basierend auf zumindest zwei schon festgelegten z-Bereichen (z. B. durch lineare Interpolation) oder durch Extrapolation basierend auf zumindest einem bereits festgelegten z-Bereich festzulegen.
Insbesondere kann anhand des aufgenommenen z-Stapels bzw. der aufgenommenen z-Stapel eine dreidimensionale Darstellung des aufgenommenen z-Bereiches rekonstruiert werden oder ein Bild des Objektes mit erweiterter Tiefenschärfe berechnet und bevorzugt dargestellt werden. Bei dem Mikroskop zur Aufnahme der Probe kann es sich um ein Weitfeldmikroskop oder um ein konfokales Mikroskop (z. B. ein konfokales Mikroskop mit einem Einfach- oder Multi-Punkt- Scanner, Streifenscanner oder Spinning-Disc) handeln. Ebenso kann das Mikroskop mit strukturierter Beleuchtung arbeiten und/oder als Fluoreszenzmikroskop ausgebildet sein. Wenn das Mikroskop als konfokales Mikroskop ausgebildet ist, wird als Schärfemaß insbesondere die mittlere oder die summierte Intensität der jeweiligen konfokalen Aufnahme verstanden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Festlegen eines z-Bereiches in einer Probe kann in vorteilhafter Weise bei voll- und teil-automatisierten Scanning- und Screening-Systemen eingesetzt werden. Dies führt in vorteilhafter Weise für den Benutzer eines solchen Systems zu einem deutlich geringeren Aufwand zum Einstellen und Konfigurieren.
Bei automatischen Systemen zur Aufnahme von Präparaten auf Objektträgern kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Festlegen eines z-Bereiches in einer Probe auch zur Bestimmung der Proben- bzw. Präparatdicke an verschiedenen x/y-Positionen verwendet werden. Dabei kann zumindest an einer x/y-Position die Probendicke durch Interpolation oder Extrapolation basierend auf zumindest einem schon bestimmten Probendickenwert ermittelt werden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann der in der Probe liegende z-Wert mittels der automatischen Bestimmung einer Fokusebene ermittelt werden. Dabei kann die Vergrößerung bei der automatischen Bestimmung der Fokusebene gleich, größer oder kleiner sein als die Vergrößerung, die dann bei der Aufnahme des z-Stapels vorliegt. Die entsprechende Anpassung, sofern nötig, für die Aufnahme des z-Stapels kann basierend auf den bekannten unterschiedlichen Vergrößerungen automatisch durchgeführt werden. Insbesondere können die Abstände der einzelnen z-Ebenen (für die Einzelaufnahmen) nach den optischen Gesetzen (z. B. Schärfentiefe) angepaßt werden.
Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Festlegen eines z-Bereiches in einer Probe vorteilhaft bei Systemen zum automatischen Screening von Multiwell-Platten oder Kulturschalen eingesetzt werden. In verschiedenen Wells (Vertiefungen) einer Multiwell-Platte können sich unterschiedliche Proben befinden bzw. solche, die unterschiedliche Höhe und Schärfeebene aufweisen. Eine automatische Konfiguration pro Vertiefung einer Multiwell-Platte erleichtert dem Benutzer die Arbeit extrem bzw. spart viel Zeit. In ähnlicher Weise kann an verschiedenen Probenpositionen in einer einzelnen Kulturschale mit dem erfindungsgemäßen Verfahren der z- Bereich optimal festgelegt werden. Die Aufgabe wird ferner gelöst durch eine Vorrichtung zum Festlegen eines z-Bereiches in einer Probe, in dem ein z-Stapel der Probe mittels eines Mikroskops aufzunehmen ist, wobei die Vorrichtung eine Steuereinheit aufweist, die dazu ausgebildet ist, auf der Basis eines in der Probe liegenden z-Wertes und unter Berücksichtigung zumindest eines vorbestimmten Parameters den z-Bereich automatisch festzulegen.
Somit kann mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung automatisch der z-Bereich festgelegt werden, wodurch die eingangs beschriebenen Schwierigkeiten überwunden werden können. Vorteilhafte Weiterbildungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind in den abhängigen Vorrichtungsansprüchen angegeben.
Insbesondere kann die Vorrichtung das Mikroskop selbst enthalten, wobei das Mikroskop, wie bereits beschrieben, ein Weitfeldmikroskop, ein konfokales Mikroskop oder ein sonstiges Mikroskop sein kann. Insbesondere kann das Mikroskop als Fluoreszenzmikroskop ausgebildet sein.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann so weitergebildet werden, daß mit ihr das erfindungsgemäße Verfahren (einschließlich seiner Weiterbildungen) durchgeführt werden kann. Auch kann das erfindungsgemäße Verfahren so weitergebildet werden, daß es die in Verbindung mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung (einschließlich ihren Weiterbildungen) beschriebenen Verfahrensschritte aufweist.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Mikroskops;
Fig. 2a-2c Schnittdarstellungen eines aufzunehmenden Objektes 9 in einer Probe 6, wobei unterschiedliche z-Aufnahmeebenen eingezeichnet sind;
Fig. 3a-3c schematische Darstellungen des Schärfemaßverlaufes für das Objekt 9 gemäß
Figuren 2a-2c; Fig. 4 ein Ablaufdiagramm einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens;
Fig. 5 eine Draufsicht zur Erläuterung einer Mosaikaufnahme der Zelle 9;
Fig. 6 eine Seitenansicht für die Mosaikabschnitte K21 -K24;
Fig. 7 eine Seitenansicht gemäß Fig. 7 zur Erläuterung des bisher bekannten Vorgehens; Fig. 8 eine Darstellung zur Erläuterung der Bestimmung des z-Bereiches für eine Zelle deren z-Ausdehnung mit der Zeit größer wird;
Fig. 9 eine Darstellung gemäß Fig. 8 zur Erläuterung des bisher bekannten Vorgehens; Fig. 10 eine Darstellung zur Erläuterung der Bestimmung des z-Bereiches für eine Zelle 9, die ihre z-Position mit der Zeit ändert;
Fig. 1 1 eine Darstellung gemäß Fig. 10 zur Erläuterung des bisher bekannten Vorgehens; Fig. 12 eine Darstellung eines nicht gaußförmigen Schärfeverlaufes zur Bestimmung des z- Bereiches, und
Fig. 13 eine weitere Darstellung eines nicht gaußförmigen Schärfeverlaufes zur Bestimmung des z-Bereiches.
Bei der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Mikroskop 1 ein Stativ 2 mit einem Probentisch 3 und einer Mikroskopoptik 4, die schematisch als Objektivrevolver mit drei Objektiven dargestellt ist. Der Abstand zwischen der Mikroskopoptik 4 (Objektivrevolver) und dem Probentisch 3 ist zur Einstellung der Fokuslage (z-Position) bzw. zur Fokussierung veränderbar, wie durch den Doppelpfeil P1 in Fig. 1 angedeutet ist.
Das Mikroskop 1 umfaßt ferner eine Aufnahmeeinheit 5 (beispielsweise eine CCD-Kamera), mit der das vergrößerte Bild einer zu untersuchenden Probe 6 aufgenommen werden kann. Die Aufnahmeeinheit 5 ist mit einem schematisch dargestellten Computer 7 verbunden, der im Betrieb das Mikroskop 1 über einen Steuermodul 8 steuert.
Das Mikroskop 1 enthält einen nicht gezeigten z-Trieb, mit dem der Abstand zwischen dem Probentisch 3 und der Mikroskopoptik 4 (in z-Richtung) veränderbar ist, sowie einen nicht gezeigten xy-Motor für den Probentisch 3, mit dem die Position des Probentisches 3 in der xy- Ebene (die y-Richtung erstreckt sich senkrecht zur Zeichenebene von Figur 1 ) einstellbar ist, wobei sowohl der z-Trieb als auch der xy-Motor mittels des Steuermoduls 8 gesteuert werden. Das erfindungsgemäße Mikroskop 1 ist so ausgebildet, daß mit ihm Bildserien mit unterschiedlichen Fokuslagen (unterschiedliche z-Werte) der Probe 6 bzw. eines Objektes innerhalb der Probe 6, wie z. B. einer zu untersuchende Zelle, aufgenommen werden können, um daraus eine dreidimensionale Darstellung des aufgenommenen Objektes rekonstruieren zu können. Eine solche Bildserie wird häufig auch z-Stapel genannt, wobei in der Regel neben dem Abstand der einzelnen z-Ebenen noch der z-Bereich, in dem der z-Stapel aufgenommen wird, festzulegen ist. Dazu wird bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop 1 zunächst eine Autofokussierung durchgeführt, bei der Werte eines Schärfemaßes in Abhängigkeit der z-Position durch Aufnahme von Bildern in unterschiedlichen z-Positionen und einer anschließenden Auswertung gewonnen werden. Ein solcher Schärfemaßverlauf ist in Fig. 3a schematisch dargestellt. Zur Gewinnung des Schärfemaßverlaufes können herkömmliche Autofokussierverfahren eingesetzt werden. Beispielsweise kann als Schärfemaß ein skalares Funktional S(B(x,y,z)) eingesetzt werden, das für jedes mit der Aufnahmeeinheit 5 aufgenommenes Bild B(x,y,z) einen skalaren Wert (den Schärfemaßwert) liefert, der mit zunehmender Bildschärfe ansteigt (wie in Fig. 3a gezeigt ist) und bei maximaler Bildschärfe einen Extremwert aufweist. Natürlich ist es auch möglich, daß das skalare Funktional so konstruiert ist, daß der Schärfemaßwert mit zunehmender Bildschärfe abfällt und bei maximaler Bildschärfe ein Minimalwert vorliegt. Da in der Regel die Funktionale S so konstruiert sind, daß sie bei maximaler Bildschärfe ein Maximum aufweisen, wird hiervon in der weiteren Beschreibung ausgegangen. Die Schärfefunktionale S liefern ein Skalar als Schärfenmaßwert, da in der Rechenvorschrift des jeweiligen Schärfefunktionais über die beiden Aufnahmedimensionen der zweidimensionalen Aufnahme summiert bzw. integriert wird. Daher hängt der skalare Schärfemaßwert bei gegebenem Bildabschnitt im wesentlichen nur noch von z und somit der Fokuslage ab. Daher kann bei einem gegebenen Bildausschnitt das Funktional S als von der Fokusposition z abhängig betrachtet werden (also S(z)).
Der maximale Schärfemaßwert Smax liegt hier bei der z-Position zc vor, was der durch die Linie L1 angedeuteten z-Ebene entspricht (Fig. 2a), wobei hier schematisch ein xz-Schnitt durch die Probe 6 dargestellt ist und das aufzunehmende Objekt der Zellkern 1 0 einer Zelle 9 sein soll, die schematisch dargestellt ist. Wie der Darstellung in Fig. 2a zu entnehmen ist, liegt die z- Ebene mit dem z-Wert zc genau in der Mitte des Zellkernes 10.
Da bei der durchgeführten Autofokussierung der in Fig. 3a gezeigte Schärfemaßverlauf erhalten wird, kann dieser neben der Ermittlung der z-Ebene mit der größten Schärfe gleich dazu genutzt werden, die untere und obere Grenze des z-Bereiches für den z-Stapel automatisch festzulegen. Das Schärfemaß (Schärfefunktional) S ist somit ein vorbestimmter Parameter für die Festlegung des z-Bereiches. Bei der hier beschriebenen Ausführungsform wird als untere Grenze der z-Wert zL festgelegt, bei dem der Schärfemaßwert Smid = Smax · 50 % beträgt. Die Lage der entsprechenden z-Ebene ist in Fig. 2b durch die Linie L2 angedeutet. In gleicher Weise wird die obere Grenze des z-Bereiches bestimmt. Auch hier soll der Schärfemaßwert Smid = Smsax · 50 % betragen, so daß der z-Wert zR ermittelt wird. Die entsprechende Lage der z-Ebene ist in der Darstellung von Fig. 2c durch die Linie L3 angedeutet. Somit kann automatisch der z-Bereich (hier von zL bis zR) festgelegt werden, ohne daß der Benutzer eingreifen muß. Ausgehend von dem so festgelegten z-Bereich wird dann mittels des Computers 7 automatisch der optimale Schnittabstand (z-Abstand für die einzelnen Aufnahmen des z-Stapels) ermittelt und eingestellt. Dabei werden bevorzugt Parameter der Aufnahme, wie z. B. die numerische Apertur der Mikroskopoptik 4, etc. in bekannter Art und Weise berücksichtigt.
Natürlich muß der Prozentwert nicht 50 % betragen, sondern kann auch andere Werte annehmen. Insbesondere können die Prozentwerte zur Bestimmung der Schärfemaßgrenzwerte für den unteren und oberen Grenzwert zL, zR unterschiedlich sein.
Es sind somit ein vorbestimmter Parameter (das Schärfefunktional) sowie zwei Werte des vorbestimmten Parameters (die jeweils den Abfall des Schärfewertes relativ zum maximalen Schärfewert für die obere und untere Grenze des festzulegenden z-Bereiches angeben) zur automatischen Festlegung des z-Bereichs vorgegeben.
Mit den so bestimmten Aufnahmeparametern (also dem z-Bereich sowie dem z-Abstand) wird dann der gewünschte z-Stapel des Zellkerns 10 mittels des Mikroskops 1 aufgenommen (es werden also mehrere Einzelaufnahmen innerhalb des bestimmten z-Bereiches und mit dem bestimmten z-Abstand erstellt), um daraus dann z. B. eine dreidimensionale Darstellung des Zellkerns 10 generieren zu können.
Die für die Autofokussierung aufgenommenen Bilder der Probe 6 weisen in der Regel eine geringere Auflösung auf als die dann für den z-Stapel aufgenommenen Bilder, wodurch eine schnelle Autofokussierung mit geringer Belastung der Probe 6 möglich ist.
Nachfolgend wird in Verbindung mit Fig. 4 eine Abwandlung zur Festlegung des z-Bereiches beschrieben. Zunächst wird ein Autofokus-Lauf durchgeführt, um den z-Wert zc größter Bildschärfe zu bestimmen (Schritt S1 ). Dabei kann die in Verbindung mit Fig. 3a beschriebene Autofokussierung verwendet werden oder auch jedes andere bekannte Verfahren.
Im nachfolgenden Schritt S2 wird die Startposition initialisiert (als Startposition z wird hier zc gewählt), der Schärfemaßwert S(zc) bestimmt und die Schrittweite dz gewählt, wobei beispielsweise als Schrittweite dz die Schärfentiefe des Mikroskops 1 bzw. der verwendeten Mikroskopoptik 4 gewählt werden kann. Als Schärfemaß S(z) kann z. B. ein skalares Schärfefunktional verwendet werden, das beispielsweise Entropie-Maße berücksichtigt, eine Bild-Frequenz-Analyse oder eine einfache Summe über Gradienten durchführt. Grundsätzlich sind alle Bildschärfemaße, welche für herkömmliche Autofokussierungsalgorithmen geeignet sind, auch für das Schärfefunktional S gemäß Schritt S2 geeignet.
Es werden dann nacheinander die Schritte S3 bis S6 durchgeführt, wobei der Wert GL zur Festlegung der unteren bzw. linken Grenze des z-Bereiches dient und hier einen Wert von beispielsweise 0,5 aufweist. Solange der Schärfemaßwert S(z) für die an den unterschiedlichen Positionen durchgeführten Bildaufnahmen größer ist als GL · S(zc), werden weitere Aufnahmen durchgeführt. Sobald diese Bedingungen nicht mehr erfüllt sind, ist der vorliegende z-Wert der Wert der unteren Grenze zL. Sobald dieser Grenzwert bestimmt ist (Schritt S7), werden die Schritte S8-S13 durchgeführt, um den oberen Grenzwert zR zu bestimmen. Als Wert für GR in Schritt S12 wird hier wiederum 0,5 verwendet. Natürlich müssen die Werte GL und GR nicht gleich sein, sondern können auch unterschiedlich sein. Nach Durchführung der Schritte S1 -S13 sind die beiden Grenzwerte des z-Bereiches automatisch bestimmt, so daß der z-Bereich automatisch festgelegt wurde. Es kann dann in bekannter Art und Weise der z-Stapel aufgenommen werden.
Um die Geschwindigkeit der Festlegung des z-Bereiches zu erhöhen, kann auf die Schritte S8 bis S13 verzichtet werden, um den Wert zR zu ermitteln. In diesem Fall kann man z. B. einen symmetrischen z-Bereich um zc herum durch folgende Gleichung festlegen zR = zc + (zc - zL).
Bei den Schritten S3 und S9 wurde als Schrittweite die Schärfentiefe der verwendeten Mikroskopoptik 4 gewählt. Natürlich sind auch kleinere oder größere Schrittweiten möglich. Wenn man eine höhere Genauigkeit wünscht, kann man eine geringere Schrittweite wählen, wobei Werte bis zu der halben Schärfentiefe von Vorteil sind. Wenn man eine höhere Geschwindigkeit bei der Ermittlung des z-Bereiches wünscht, kann man eine größere Schrittweite wählen. Diese kann z. B. bis zum 1 ,5-fachen der Schärfentiefe betragen. Bei der in Verbindung mit Fig. 4 beschriebenen Bestimmung des z-Bereiches kann statt einem Autofokuslauf im Schritt S1 ein beliebiger z-Wert innerhalb der Zelle 9 vorgegeben werden. Aufgrund der Schritte S2 bis S13 kann, selbst wenn der z-Wert nicht in der Ebene der optimalen Schärfe liegt, der relevante und gewünschte z-Bereich äußerst genau festgelegt werden.
Wenn eine Mosaikaufnahme der Zelle 9 bzw. eines sonstigen aufzunehmenden Objektes durchzuführen ist, kann die erfindungsgemäße Festlegung des z-Bereiches für jedes Mosaikelement separat durchgeführt werden, was zu einer Vermeidung von unnötigen Einzelaufnahmen führt, wie nachfolgend im Detail beschrieben wird.
In Fig. 5 ist in Draufsicht das aufzunehmende Objekt 9 gezeigt und sind zwölf Mosaikabschnitte K1 1 -K33 eingezeichnet, wobei in jedem der Mosaikabschnitte K1 1 -K33 die Aufnahme eines z- Stapels mittels des Mikroskops 1 (Fig. 1 ) durchzuführen ist. In Fig. 6 ist in einer Seitenansicht das aufzunehmende Objekt 9 im Bereich der Mosaikabschnitte K21 , K22, K23 und K24 dargestellt. Da für jeden der Mosaikabschnitte K21 -K24 vor der Aufnahme zunächst der z- Bereich automatisch in der beschriebenen Art und Weise festgelegt wird, ist der z-Bereich für den Mosaikabschnitt K21 -K24 optimal festgelegt, wie durch die gestrichelten Linien in Fig. 6, die die obere und untere Grenze des z-Bereiches darstellen, gezeigt ist.
In Fig. 7 ist zum Vergleich die bisher bekannte Lösung angegeben, bei der vor Beginn der Messung die Festlegung des z-Bereiches durchgeführt wird. Dabei wird der z-Bereich natürlich basierend auf dem Abschnitt der Zelle 9 festgelegt, der die größte z-Ausdehnung aufweist, wie dies schematisch in Fig. 7 dargestellt ist. Dies führt nachteilig dazu, daß beispielsweise im Mosaikabschnitt K21 bei der Aufnahme des entsprechenden z-Stapels unnötige Einzelaufnahmen durchgeführt werden, die nicht die Zelle 9 selbst enthalten. Dies führt zu einer insgesamt unnötig langen Meßzeit und auch zu einer starken und nicht notwendigen Belastung der Probe durch Einzelaufnahmen, die eigentlich nicht notwendig sind. Bei der Mosaikaufnahme kann, wie beschrieben wurde, für jeden Mosaikabschnitt K1 1 -K34 eine automatische Festlegung des z-Bereiches durchgeführt werden. Es ist jedoch auch möglich, nicht für jeden Mosaikabschnitt K1 1 -K34 den z-Bereich in der angegebenen Art und Weise automatisch festzulegen. Beispielsweise kann für zumindest einen Mosaikabschnitt (hier z. B. der Mosaikabschnitt K12) der z-Bereich durch Interpolation aus den bereits festgelegten z- Bereichen von zwei oder mehreren benachbarten Mosaikabschnitten (beispielsweise die Mosaikabschnitte K1 1 und K13) festgelegt werden. Auch eine Festlegung mittels Extrapolation basierend auf zumindest einem bereits festgelegten z-Bereich ist möglich. Ein weiteres Beispiel der vorteilhaften Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Festlegen eines z-Bereiches wird in Verbindung mit Fig. 8 beschrieben. Dort ist die aufzunehmende Zelle 9 schematisch zu drei verschiedenen Zeitpunkten t1 , t2 und t3 dargestellt, wobei angenommen wird, daß die Zelle 9 wächst, so daß unter anderem ihre Ausdehnung in z-Richtung mit zunehmender Zeit größer wird.
Erfindungsgemäß wird daher vor der Aufnahme eines z-Stapels (bevorzugt vor jeder Aufnahme eines z-Stapels) die erfindungsgemäße Festlegung des z-Bereiches automatisch durchgeführt, so daß stets optimal angepaßte Grenzen für den z-Bereich zu allen Zeitpunkten t1 -t3 vorliegen, wie durch die gestrichelten Linien, die die Ober- und Untergrenze darstellen sollen, dargestellt ist.
Im Vergleich dazu ist in Fig. 9 der herkömmliche Ansatz gezeigt. Bisher mußte man die größte Ausdehnung in z-Richtung in Abhängigkeit der Zeit t annehmen und darauf basierend den z- Bereich bestimmen. Dies führt dazu, daß der z-Bereich für die Zeitpunkte t1 und t2 viel zu groß gewählt ist, so daß wiederum unnötige Einzelaufnahmen während der Aufnahme eines z- Stapels durchgeführt werden, die die Meßzeit verlängern und eine unerwünschte Probenbelastung nach sich ziehen. Des weiteren muß man einen gewissen Sicherheitsabstand vorsehen, so daß die obere und untere Grenze zum Zeitpunkt t3 zu weit von der Zelle 9 entfernt ist. Dies führt somit dazu, daß selbst zum Zeitpunkt t3 unnötige Einzelaufnahmen in z- Abschnitten oberhalb und unterhalb der Zelle 9 gemacht werden, wobei diese unnötigen Einzelaufnahmen in diesen z-Abschnitten auch noch zu den Zeitpunkten t1 und t2 durchgeführt werden. In Fig. 10 ist der Fall gezeigt, daß sich die Position der Zelle 9 in z-Richtung in Abhängigkeit der Zeit ändert. Dies kann beispielsweise der Fall sein, wenn die Zelle 9 in einer Nährlösung vorhanden ist, so daß ein Fixieren in z-Richtung nicht oder nur sehr schwierig möglich ist. Mit dem erfindungsgemäßen Festlegen des z-Bereiches ist dies aber unproblematisch, da vor Durchführung der Messung stets der optimale z-Bereich automatisch festgelegt wird, wie wiederum durch die gestrichelten Linien, die die obere und untere Grenze des z-Bereiches andeuten, dargestellt ist. Zu jedem der gezeigten Zeitpunkte t1 , t2 und t3 wird der optimale z- Bereich bestimmt und festgelegt, so daß dann der z-Stapel zu diesen Zeiten t1 -t3 aufgenommen werden kann. Der bisherige Ansatz bestand darin, eine Annahme über den minimalen und maximalen z-Wert der Zelle 9 zu treffen, die während der Messungen auftreten, und darauf basierend den z- Bereich festzulegen, was beispielsweise zu den in Fig. 1 1 gezeigten Grenzen (die wiederum durch gestrichelte Linien dargestellt sind) führt. Aufnahmen des z-Stapels zu den Zeiten t1 , t2 und t3 führen dann zu einer Vielzahl von unnötigen Einzelaufnahmen, da die Grenzen sehr weit von der Zelle 9 entfernt sind im Vergleich zu der Darstellung von Fig. 10.
Natürlich können die in Verbindung mit Fig. 5 bis 1 1 beschriebenen vorteilhaften Ausführungsformen auch beliebig untereinander kombiniert werden.
In Fig. 12 ist das Schärfemaß S in ähnlicher Weise wie in Fig. 3b dargestellt, wobei bei Fig. 12 ein nicht gaußförmiger Schärfeverlauf angenommen wird. In diesem Fall kann z. B. die untere Grenze des z-Bereiches durch den Abfall des Schärfemaßwertes auf 50 % bezogen auf den lokalen Maximalwert bestimmt werden, wie in Fig. 12 angedeutet ist. Da der Schärfeverlauf in Richtung größer werdender z-Werte ansteigt und nicht wieder abfällt oder oberhalb eines voreingestellten Schwellwertes liegt, kann als obere Grenze für den z-Bereich z. B. automatisch die Suchgrenze die Autofokusroutine verwendet werden. Alternativ ist es möglich, die obere Grenze basierend auf der ermittelten unteren Grenze zu bestimmen.
In Fig. 13 ist der Fall gezeigt, daß aufgrund des Schärfeverlaufes nur die obere Grenze ermittelt werden kann. In diesem Fall wird dann die untere Grenze in ähnlicher Weise wie die obere Grenze bei der Variante gemäß Fig. 12 bestimmt. Die beschriebene Art der Bestimmung des z-Bereiches geht davon aus, daß diese Bestimmung für einen Aufnahmekanal des Mikroskops 1 durchgeführt wird. Wenn die Probe 9 eingefärbt ist, z. B. mit unterschiedlich fluoreszierenden Markierungsstoffen, kann für jeden Aufnahmekanal separat der z-Bereich festgelegt werden und auch die Aufnahme des z-Stapels für den entsprechenden Kanal mit dem zugeordneten z-Bereich durchgeführt werden.
Bei den beschriebenen Ausführungsformen wurde davon ausgegangen, daß das Mikroskop 1 als Weitfeldmikroskop ausgebildet ist. Natürlich muß das Mikroskop 1 kein Weitfeldmikroskop sein. Beispielsweise kann das Mikroskop 1 als konfokales Mikroskop ausgebildet sein. In diesem Fall kann man anstatt von dem Schärfemaß und dem Schärfemaßwert von einer mittleren Intensität und einem mittleren Intensitätswert sprechen. Alle anderen Aspekte können in gleicher oder ähnlicher Weise wie bei den oben beschriebenen Ausführungsformen verwirklicht sein.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zum Festlegen eines z-Bereiches in einer Probe, in dem ein z-Stapel der Probe mittels eines Mikroskops aufzunehmen ist,
wobei auf der Basis eines in der Probe liegenden z-Wertes und unter Berücksichtigung zumindest eines vorbestimmten Parameters der z-Bereich automatisch festgelegt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , bei dem ein Schärfemaß der Probe als der vorbestimmte Parameter berücksichtigt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem eine Kontrastfunktion als der vorbestimmte Parameter berücksichtigt wird.
4. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem der in der Probe liegende z-Wert automatisch, insbesondere durch ein Autofokussierverfahren, bestimmt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem Daten des automatischen Bestimmens des in der Probe liegenden z-Wertes auch zur Festlegung des z-Bereiches genutzt werden.
6. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem die obere und untere Grenze des z-Bereiches symmetrisch zu dem in der Probe liegenden z-Wert bestimmt werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die obere und untere Grenze des z-Bereichs asymmetrisch zu dem in der Probe liegenden z-Wert bestimmt werden.
8. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem ausgehend von dem in der Probe liegenden z-Wert schrittweise mit größer werdendem Abstand in z-Richtung jeweils der Wert des vorbestimmten Parameters ermittelt wird.
9. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem anhand eines vorbestimmten Wertes des zumindest einen vorbestimmten Parameters eine Grenze des festzulegenden z- Bereichs bestimmt wird.
10. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem nach Festlegung des z-Bereiches der z-Stapel der Probe in dem z-Bereich aufgenommen wird.
1 1 . Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem zur Festlegung des z-Bereichs Einzelaufnahmen der Probe in verschiedenen z-Ebenen gemacht werden, wobei zumindest ein Teil der Einzelaufnahmen für den aufzunehmenden z-Stapel der Probe genutzt wird.
12. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem zumindest ein weiterer z-Bereich jeweils auf der Basis eines in der Probe liegenden z-Wertes und unter Berücksichtigung zumindest eines vorbestimmten Parameters automatisch festgelegt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem der zumindest eine weitere z-Bereich für denselben Abschnitt der Probe festgelegt wird, für den der zuvor festgelegte z-Bereich festgelegt wurde, wobei die z-Bereiche bevorzugt zu verschiedenen Zeitpunkten festgelegt werden.
14. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem der zumindest eine weitere z-Bereich für einen Abschnitt der Probe festgelegt wird, der lateral versetzt ist zu dem Abschnitt der Probe, für den der zuvor festgelegte z-Bereich festgelegt wurde.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , bei dem zumindest zwei weitere z-Bereiche jeweils auf der Basis eines in der Probe liegenden z-Wertes und unter Berücksichtigung zumindest eines vorbestimmten Parameters automatisch festgelegt werden, wobei zumindest ein erster der weiteren z-Bereiche für denselben Abschnitt der Probe festgelegt wird, für den bereits zeitlich vorher ein z-Bereich festgelegt wurde, und zumindest ein anderer der weiteren z-Bereiche für einen Abschnitt der Probe festgelegt wird, der lateral versetzt ist zu dem Abschnitt der Probe, für den bereits zeitlich vorher ein z-Bereich festgelegt wurde.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, bei dem nach Festlegen des zumindest einen weiteren z-Bereiches der z-Stapel der Probe in dem zumindest einen weiteren z-Bereich aufgenommen wird.
17. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem basierend auf einem in der Probe liegenden z-Wert und unter Berücksichtigung eines vorbestimmten Parameters die Ausdehnung der Probe in z-Richtung automatisch bestimmt wird.
18. Vorrichtung zum Festlegen eines z-Bereiches in einer Probe, in dem ein z-Stapel der Probe mittels eines Mikroskops aufzunehmen ist,
wobei die Vorrichtung eine Steuereinheit (7) aufweist, die dazu ausgebildet ist, auf der Basis eines in der Probe liegenden z-Wertes und unter Berücksichtigung zumindest eines vorbestimmten Parameters den z-Bereich automatisch festzulegen.
19. Vorrichtung nach Anspruch 18, bei der die Steuereinheit (7) ein Schärfemaß oder eine Kontrastfunktion der Probe als den vorbestimmten Parameter berücksichtigt.
20. Vorrichtung nach Anspruch 18 oder 1 9, die eine Bestimmungseinheit (7, 8) aufweist, die den in der Probe liegenden z-Wert bestimmt, insbesondere durch ein Autofokussierverfahren, und der Steuereinheit (7) mitteilt.
21 . Vorrichtung nach Anspruch 20, bei der die Steuereinheit (7) Daten der Bestimmungseinheit zur Festlegung des z-Bereiches verwendet.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 21 , bei der die Steuereinheit (7) die obere und untere Grenze des z-Bereiches symmetrisch zu dem in der Probe liegenden z-Wert bestimmt.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 21 , bei der die Steuereinheit (7) die obere und untere Grenze des z-Bereichs asymmetrisch zu dem in der Probe liegenden z-Wert bestimmt.
24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 23, bei der die Steuereinheit (7) ausgehend von dem in der Probe liegenden z-Wert schrittweise mit größer werdendem Abstand in z-Richtung jeweils den Wert des vorbestimmten Parameters ermittelt.
25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 24, bei der die Steuereinheit (7) anhand eines vorbestimmten Wertes des zumindest einen vorbestimmten Parameters eine Grenze des z-Bereichs bestimmt.
26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 25, die das Mikroskop (1 ) aufweist, das nach Festlegung des z-Bereiches den z-Stapel der Probe in den z-Bereich aufnimmt.
27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 25, bei der zur Festlegung des z-Bereichs mittels des Mikroskops Einzelaufnahmen der Probe in verschiedenen z-Ebenen gemacht werden, wobei die Steuereinheit (7) zumindest einen Teil der Einzelaufnahmen für den aufzunehmenden z-Stapel der Probe nutzt.
28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 8 bis 27, bei der die Steuereinheit (7) zumindest einen weiteren z-Bereich jeweils auf der Basis eines in der Probe liegenden z-Wertes und unter Berücksichtigung zumindest eines vorbestimmten Parameters automatisch festlegt.
29. Vorrichtung nach Anspruch 28, bei der die Steuereinheit (7) den zumindest einen weiteren z-Bereich für denselben Abschnitt der Probe festlegt, für den der zuvor festgelegte z- Bereich festgelegt wurde, wobei die Steuereinheit die z-Bereiche bevorzugt zu verschiedenen Zeitpunkten festlegt.
30. Vorrichtung nach Anspruch 28, bei der die Steuereinheit (7) den zumindest einen weiteren z-Bereich für einen Abschnitt der Probe festlegt, der lateral versetzt ist zu dem Abschnitt der Probe, für den der zuvor festgelegte z-Bereich festgelegt wurde.
31 . Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 8 bis 27, bei der die Steuereinheit (7) zumindest zwei weitere z-Bereiche jeweils auf der Basis eines in der Probe liegenden z-Wertes und unter Berücksichtigung zumindest eines vorbestimmten Parameters automatisch festlegt, wobei zumindest ein erster der weiteren z-Bereiche für denselben Abschnitt der Probe festgelegt wird, für den bereits zeitlich vorher ein z-Bereich festgelegt wurde, und zumindest ein anderer der weiteren z-Bereiche für einen Abschnitt der Probe festgelegt wird, der lateral versetzt ist zu dem Abschnitt der Probe, für den bereits zeitlich vorher ein z-Bereich festgelegt wurde.
32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 bis 31 , bei der das Mikroskop (1 ) nach Festlegung des zumindest einen weiteren z-Bereiches den z-Stapel der Probe im zumindest einen weiteren z-Bereich aufnimmt.
33. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 32, bei der die Steuereinheit (7) dazu ausgebildet ist, auf der Basis eines in der Probe liegenden z-Wertes und unter Berücksichtigung eines vorbestimmten Parameters die Ausdehnung der Probe in z-Richtung automatisch zu bestimmen.
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