WO2015121190A1 - Verfahren und mikroskop zum abbilden einer volumenprobe - Google Patents

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WO2015121190A1
WO2015121190A1 PCT/EP2015/052612 EP2015052612W WO2015121190A1 WO 2015121190 A1 WO2015121190 A1 WO 2015121190A1 EP 2015052612 W EP2015052612 W EP 2015052612W WO 2015121190 A1 WO2015121190 A1 WO 2015121190A1
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target
correction
plane
microscope objective
volume sample
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PCT/EP2015/052612
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Christian Schumann
Andrea Mülter
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Leica Microsystems Cms Gmbh
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    • G02B7/02—Mountings, adjusting means, or light-tight connections, for optical elements for lenses
    • G02B7/04—Mountings, adjusting means, or light-tight connections, for optical elements for lenses with mechanism for focusing or varying magnification

Definitions

  • the invention relates to a method for the microscopic imaging of a volume sample and a microscope.
  • volume samples In the light microscopy of three-dimensionally extended samples, also referred to below as volume samples, is a high-quality
  • correction elements that are adjustable to correct the opening error.
  • correction elements have, for example, motor-adjustable lens frames, which contained in the microscope objective
  • Lens unit for correcting the aberration along the optical axis move.
  • An example of such a correction adjustment is disclosed in DE 10 201 1 051 677 A1.
  • Correction member to be provided with a certain refractive power.
  • the prior art also refers to concepts that require depth-dependent adjustment of microscopy parameters, e.g. of the
  • the object of the invention is to provide a method and a microscope which make it possible to image a volume sample without errors over a wide range along the optical axis.
  • the method according to the invention provides for a microscope objective with a correction element to be successively focused on at least two object planes serving as reference planes, which are arranged in different directions within the volume sample along the optical axis of the microscope objective Sample depths are located. For each reference plane, a reference setting of the correction element is determined in which an image error dependent on the sample depth is corrected by the correction element. On the basis of the determined reference settings, a target setting for the correction element is then determined for at least one target plane in the sample in which the aberration occurring in the sample depth of the target plane is corrected by the correction element. Finally, for mapping the
  • the sample area to be imaged along the optical axis i. set the volume to be microscoped.
  • the volume to be microscoped preferably in one of the actual
  • reference settings for the correction element are determined in such a way that in these reference settings the aberration dependent on the sample depth is determined by the
  • Correction member is corrected in the desired manner.
  • the reference settings of the correction member can be determined manually by the user or automatically using a suitable control unit.
  • Correction element are then used to determine a target setting for the correction element for at least one, but generally more than one target plane, which later ensures, when the respective target plane is mapped, that the value occurring in this target plane,
  • the target planes lie within the imaging area defined by the reference planes along the optical axis.
  • the reference settings determined for the individual reference planes thus form, as it were, support points which can then be used in the three-dimensional imaging of the volume sample in order to achieve the desired correction of the depth-dependent aberration in any desired plane within the volume to be microscoped.
  • the target planes targeted in the three-dimensional image of the volume sample will generally not coincide with the reference planes previously defined within the scope of the microscope setup.
  • even such a coincidence between the target levels and the reference levels is not excluded in accordance with the invention, ie that the particular target level considered may coincide with one of the previously defined reference levels.
  • Reference setting caused deviation of the object intercept of the microscope objective with respect to a nominal cutting distance as
  • Reference slice width deviation determined. Then, based on the determined for the individual reference planes
  • Focused microscope objective taking into account the target cross-sectional deviation on the target plane.
  • This embodiment makes it possible in a particularly advantageous manner to take into account and correct the effect of the correction adjustment on the object intercept of the microscope objective, ie, on the axial position of the object plane to which the microscope objective is currently focused. Namely, an undesired axial displacement of the object plane, which is caused by the correction member, compensated by that at Focusing the microscope objective on the target plane to be imaged the determined target cross-sectional deviation is taken into account. For this purpose, first determine how the respective adjustment of the
  • Correction member affects the object intercept of the microscope objective. Exact knowledge of the effect of the correction adjustment, for example, via a suitable test sample or when setting up the microscope by iterative adjustment of the correction element and
  • the method according to the invention thus enables precise three-dimensional imaging even of large volume samples.
  • a cutting width rule is determined which determines the deviation of the
  • a correction rule can be determined on the basis of the reference settings of the correction element, which prescribes the setting of the correction of the aberration intended for the correction of the aberration
  • Correction member indicates depending on the sample depth.
  • the target setting of the correction element can then be determined on the basis of this correction rule, in particular by interpolation.
  • Reference magnification deviation determined. Based on the reference magnification deviations determined for the respective reference planes, a target magnification deviation is then determined for the target plane which indicates the deviation of the magnification from the target magnification caused by the correction element in the target setting. Finally, to compensate for the magnification change caused by the corrector, a variable magnification element is adjusted in consideration of the target magnification deviation.
  • the variable magnification element can be implemented, for example, as a Vario camera adapter or as part of a scanning system of a confocal or multiphoton microscope.
  • at least one reference control parameter is defined for each reference plane. Based on the reference control parameters thus determined, a target control parameter is determined and set for the target plane.
  • An example of such a reference control parameter is, for example, the light output with which the respective target plane is illuminated when imaging the volume sample. As a result, a uniform image brightness can be achieved over the entire microscopic volume.
  • Another example in multiphoton microscopy is the so-called precurp for compensating the dispersion of the sample.
  • the at least two reference planes comprise a plurality of planes equidistant along the optical axis. Since in this case the at least two reference planes comprise a plurality of planes equidistant along the optical axis. Since in this case the at least two reference planes comprise a plurality of planes equidistant along the optical axis. Since in this case the at least two reference planes comprise a plurality of planes equidistant along the optical axis. Since in this case the at
  • Reference levels determined reference settings of the correction element provides a reliable basis for that in each possible target levels within the volume to be microscopically each one precise
  • Target setting for the correction element and thus a good correction of the aberration occurring in the respective sample depth can be found.
  • the microscope objective In order to focus the microscope objective on the respectively desired object plane, the microscope objective is to be moved relative to the volume sample along the optical axis. This can be done by means of a focusing device which acts on the microscope objective or on a sample carrying the bulk sample. In the first embodiment, therefore, the focusing device moves the microscope objective in space while the stage remains stationary. In contrast, in the second embodiment, the stage is moved while holding the microscope objective in space. A combination of these two focusses is conceivable.
  • a microscope for imaging a bulk sample comprising a microscope objective Correction element, a focusing device and a control unit comprises.
  • the control unit is designed so that the microscope objective, the correction element and the focusing device are driven in the manner explained above.
  • the microscope according to the invention the microscope according to the invention.
  • Correction member a lens unit contained in the microscope objective and a drive unit for moving the lens unit along the optical axis.
  • the drive unit comprises a arranged on a housing of the microscope objective, rotatable about the optical axis Korrekturring whose rotational movement in an adjustment movement of the lens unit along the optical axis can be implemented.
  • This embodiment of the correction element can be realized, for example, as disclosed in the aforementioned DE 10 201 1 051 677 A1, the disclosure of which at this point in the way of
  • Fig. 1 is a schematic representation showing a microscope objective, the correctly adjusted correction element to a first
  • Referenced focus level a schematic representation corresponding to Figure 1, in which the microscope objective is focused on a second reference plane, without the aberration is corrected by the correction member; a schematic representation corresponding to Figure 2, showing a cutting width deviation caused by the set to the second reference plane correction member; a schematic representation corresponding to Figure 3, showing a Thomasweitenkorrektur for the second reference plane; a flowchart showing the steps for setting up the microscope; a flow chart showing the method steps for imaging the volume sample by means of the set up according to Figure 5 microscope; the microscope according to the invention in an embodiment having an upright microscope stand and an adjustable stage as a focusing device; the erfindungsgenzeße microscope in another
  • Embodiment comprising an upright microscope stand and an adjustable nosepiece as a focusing device; the microscope according to the invention in a further
  • Embodiment having an inverted microscope stand and an adjustable nosepiece as a focusing device; and 10 shows the microscope according to the invention in a further
  • Embodiment having an inverted microscope stand and an adjustable stage as a focusing device.
  • FIGS. 1 and 4 it will first be explained in principle how an opening error caused by a refractive index mismatch and a change in the object intercept caused by the correction of the aperture error are corrected according to the invention. 1 to 4, the microscope components and the parameters which are used for the correction of the opening error and the
  • a microscope indicated generally at 10, comprises a microscope objective 12, a stage 14 on which a volume sample 16 is disposed, a correction member 18 which is shown in FIGS. 1 to 4,
  • the present embodiment is part of the microscope objective 12, and a control unit 20. Further, the microscope 10 has a
  • Object table 14 along the optical axis O relative to the microscope objective 12 can be adjusted.
  • the focusing device is indicated purely schematically in FIGS. 1 to 4 by a double arrow 22. As well as that
  • Correction member 18 is also the focusing device 22 via the
  • Control unit 20 controlled.
  • the correction member 18 and the focusing device 22 are coupled via connecting lines 24 and 26 to the control unit 20.
  • the correction element 18 has a lens unit which is part of an imaging optics contained in the microscope objective and not shown in FIGS. 1 to 4. To an aperture error caused by a refractive index mismatch in the manner described below Correct, the correction member 18 can be moved via the control unit 20 along the optical axis O.
  • FIG. 1 shows a state in which the microscope objective 12 is focused on an object plane 28.
  • the correction member 18 should be adjusted along the optical axis O so that the opening error is corrected by the correction element 18 as possible.
  • This best possible correction adjustment is designated in FIG. 1 by Ci.
  • the object plane 28 forms a first reference plane for which the desired setting Ci of the correction element 18, referred to below as the first reference setting, is determined.
  • the first reference plane 28 within the sample 16 lies along the optical axis O at a location which is the one of the reference plane
  • Object intercept of the microscope objective 12 corresponds.
  • This object intercept dependent on the reference setting Ci is designated by d 0 (ci) in FIG.
  • the object intercept d 0 (ci) indicates the distance of the object plane formed by the first reference plane 28 from the microscope objective 12 (more precisely from its optical object arranged furthest on the object side).
  • the quantity z-1 designates the distance of the object table 14 carrying the volume sample 16 from a fixed reference point on the
  • Microscope objective 12 This fixed reference point on the microscope objective 12 is given, for example, by a contact surface of the microscope objective 12 to an objective revolver (not shown in FIG. 1). This size z-i thus gives the distance between the volume sample 16 and the
  • Microscope lens 12 and thus represents a hereinafter referred to as the focusing distance manipulated variable of the focusing device 22.
  • the focusing distance z-i is therefore also a measure of the depth in which the
  • Object level 28 is within the volume sample 16. This means that As the focus distance Zi changes, the sample depth to which the microscope objective 12 is focused within the volume sample 16 alters equally.
  • FIG. 2 shows a state in which the microscope objective 12 is focused to a depth within the volume sample 16 that corresponds to a (in this example smaller) focusing distance z 2 . Accordingly, the object plane 28 lies deeper within the volume sample 16 in the state according to FIG. 2 seen from above. This lower level defines a second reference plane.
  • Object level 28 incoming light within the volume sample 16 is longer than in the state of Figure 1, occurs in sequence
  • Refractive index mismatch an aperture error.
  • This opening error is indicated graphically in FIG. 2 by kinks in the light beams emerging from the volume sample 16 in the direction of the microscope objective 12. Since in Figure 2, the correction element 18 is still in the optimized for the state of Figure 1 reference setting Ci, in Figure 2, the aperture error is still uncorrected.
  • FIG. 3 shows how the opening error shown in FIG. 2 is corrected by an adjustment of the correction element 18.
  • the correction member 18 is a different from the setting Ci second
  • Reference setting c 2 selected by the opening error for the second reference plane 28 is corrected as possible. However, by the
  • FIG. 2 shows how the undesired shift of the object plane 28 is compensated as a result of the change in the object intercept.
  • FIG. 5 shows a flowchart which, purely by way of example, shows the device of the microscope 10 which was made prior to the actual image recording, which serves, in particular, to define the reference planes and to determine the reference settings for the correction element and the reference slice width deviations from the nominal slice width for these reference planes.
  • reference magnification deviations are taken into account, provided that the adjustment of the correction element 18 also deviations of the object focal length and thus deviations of the
  • step S1 a reference plane X n is approached by the
  • Microscope objective 12 by means of the focusing device 22 on this
  • Reference plane X n is focused.
  • the correction element 18 is brought into a reference setting c n .
  • this reference setting c n the aperture error caused by a refractive index mismatch is best corrected for the reference plane X n . If, due to the adjustment of the correction element 18, a change Ad 0 (c n ) of the object intercept, the object plane becomes corresponding to FIG. 4
  • Correction element 18 also causes a change in the focal length of the object and thus a change in magnification, so in addition one
  • Steps S2 and S3 are carried out as explained above with reference to FIGS. 1 to 4. In this case, an execution of step S3 in real time is particularly advantageous.
  • step S4 it is decided whether the values determined in steps S2 and S3 c n, Z n and optionally ß (c n) to be stored as a reference point n or not, wherein an integer running variable n denotes. If the specified quantities are to be stored, this storage takes place in step S5, and the sequence is continued with step S6. If the interpolation point n is not to be stored, the process immediately proceeds to step S6.
  • FIG. 6 shows a flowchart in which, by way of example, the volume image acquisition is carried out based on the device of the microscope 10 made according to FIG.
  • step S10 the image pickup process is started for a target level z k, where k is an integer running variable.
  • step S1 information identifying the target plane z k which has been previously stored in the apparatus of the microscope 10 (S8 in Fig. 5) is read out.
  • step S12 the support points assigned to the individual reference planes are provided, ie the reference settings c n and
  • Reference sectional width deviations Z n (S5 in FIG. 5).
  • the information provided in steps S1 1 and S12 is used further in order to determine the corresponding target variables for the selected target plane z k , namely the target setting c k for the correction element 18, which Target incidence deviation x k , with which the focusing device 22 is driven, and (optionally) the target magnification deviation ⁇ k , with which a variable magnification element is driven.
  • the target setting c k for the correction element 18 is calculated in step S13 for the target plane z k .
  • the correction term 18 is then moved to the target setting c k to k as possible to correct the spherical aberration in the target plane z.
  • the reference intercept deviation x k for the target plane z k is calculated.
  • the focusing device 22 is adjusted according to the reference slice width deviation x k .
  • step S17 the target magnification deviation ⁇ k for the target plane z k is calculated.
  • step S18 the variable magnification element is then adjusted according to the target magnification deviation ⁇ k .
  • step S19 in which, after the setting of the target variables c k , z k and ⁇ k related to the target plane z k , an image of the
  • Target level z k is recorded.
  • the volume image data thus generated is stored in step S20.
  • step S21 a query is made as to whether a further target level is to be recorded. If this is the case, then the
  • the two processing branches formed by the steps S15, S16 and S17, S18 may be omitted.
  • additional processing branches running in parallel may also be provided, such as setting one to the target level
  • Target control parameters e.g. an illumination light power
  • FIGS. 7 to 10 show various embodiments of the microscope 10 according to the invention.
  • the microscope 10 according to FIG. 7 comprises, in addition to the microscope components already described with reference to FIGS. 1 and 4, an upright microscope stand 30 and a documentation unit 32, which is coupled to the control unit 20 via a connecting line 34.
  • the focusing device 22 (as also in the exemplary embodiment according to FIGS. 1 to 4) is provided by the object table 14 which is motor-adjustable along the optical axis.
  • FIG. 7 also shows an immersion medium 36 in which the volume sample 16 is embedded.
  • the refractive index of the immersion medium 36 is chosen so that it is adapted as well as possible to the refractive index of the volume sample 16.
  • the embodiment of Figure 8 is compared to the embodiment shown in Figure 7 modified so that the focusing device 22 is not by an adjustable stage, but one along the optical Axis movable revolving nosepiece is formed on which the
  • Microscope lens 12 is held.
  • the embodiment according to FIG. 10 has an inverted microscope stand 38.
  • the focusing device 22 is in this case.
  • Embodiment again formed by an adjustable along the optical axis objective revolver 40.
  • Focusing device 22 is in turn realized by the longitudinal axis of the optical axis adjustable stage 14.
  • FIGS. 7 to 10 are also to be understood as examples only.
  • the invention is not limited to a particular type of microscope. Rather, she is in the
  • microscopy methods applicable, for example, in the wide-field microscopy, in confocal microscopy, multiphoton microscopy or light-sheet microscopy.

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Abstract

Beschrieben ist ein Verfahren zum mikroskopischen Abbilden einer Volumenprobe (16), bei dem ein Mikroskopobjektiv (12) nacheinander auf mindestens zwei Referenzebenen fokussiert wird, die sich innerhalb der Volumenprobe (16) längs der optischen Achse (O) des Mikroskopobjektivs (12) in unterschiedlichen Volumenprobentiefen befinden; für jede Referenzebene eine Referenzeinstellung eines Korrektionsgliedes (18) ermittelt wird, bei der ein von der Volumenprobentiefe abhängiger Abbildungsfehler durch das Korrektionsglied (18) korrigiert ist; auf Grundlage der ermittelten Referenzeinstellungen für mindestens eine Zielebene in der Volumenprobe eine Zieleinstellung für das Korrektionsglied (18) bestimmt wird, in welcher der in der Volumenprobentiefe der Zielebene auftretende Abbildungsfehler durch das Korrektionsglied (18) korrigiert ist; und zum Abbilden der Volumenprobe (16) das Mikroskopobjektiv (12) auf die Zielebene fokussiert und das Korrektionsglied (18) in die Zieleinstellung gebracht wird.

Description

Verfahren und Mikroskop zum Abbilden einer Volumenprobe
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikroskopischen Abbildung einer Volumenprobe sowie ein Mikroskop. In der Lichtmikroskopie dreidimensional ausgedehnter Proben, im Folgenden auch als Volumenproben bezeichnet, ist eine hochqualitative
dreidimensionale Abbildung von zentralem Interesse. Eine der
Herausforderungen bilden dabei Abbildungsfehler, die durch den Laufweg des Lichts in der Probe verursacht werden. Dabei sind insbesondere sogenannte Öffnungsfehler zu beachten, die dadurch entstehen, dass der Brechungsindex der Volumenprobe von dem Brechungsindex des die Probe umgebenden Mediums verschieden ist. Je länger der Laufweg des Lichtes innerhalb der Probe ist, desto größer wird der durch eine solche
Fehlanpassung des Brechungsindex bedingte Öffnungsfehler. Dadurch wird es insbesondere schwierig, Objektebenen präzise abzubilden, die sich tief innerhalb der Volumenprobe befinden. Variiert der Brechungsindex der Probe längs der optischen Achse des Mikroskopobjektivs, d.h. in Richtung der Probentiefe, so wird es noch schwieriger, eine dreidimensionale Abbildung der Probe hoher Qualität zu erzielen.
Zur Vermeidung vorstehend beschriebener Abbildungsfehler werden meist Immersionsobjektive mit Korrektionsgliedern eingesetzt, die zur Korrektion des Öffnungsfehlers verstellbar sind. Solche aus dem Stand der Technik bekannten Korrektionsglieder weisen beispielsweise motorisch verstellbare Linsenfassungen auf, die eine in dem Mikroskopobjektiv enthaltene
Linseneinheit zur Korrektion des Abbildungsfehlers längs der optischen Achse verschieben. Ein Bespiel für eine derartige Korrektionsverstellung ist in der DE 10 201 1 051 677 A1 offenbart.
Soll der durch eine Brechungsindexfehlanpassung bedingte Öffnungsfehler in einem weiten axialen Bereich korrigiert werden, so ist es erforderlich, das
Korrektionsglied mit einer gewissen Brechkraft zu versehen. Dadurch kann es bei der Korrektionsverstellung zu einer unerwünschten Änderung der Objektschnittweite, d.h. zu einer Verschiebung der abgebildeten Objektebene längs der optischen Achse kommen. Eine solche Änderung der
Objektschnittweite führt dann zu einer nicht tolerierbaren Verzerrung des aufgenommenen Volumenbildes.
Zum Stand der Technik wird ferner auf Konzepte verwiesen, die eine tiefenabhängige Einstellung von Mikroskopieparametern, z.B. der
Laserleistung in Multiphotonenmikroskopen, vorsehen. Jedoch beeinflussen diese Parameter nicht die Korrektion des Mikroskopobjektivs bezüglich seiner Abbildungsleistung oder seiner Schnittweiteneinstellung. Somit erlaubt der aktuelle Stand der Technik keine in axialer Richtung weit ausgedehnte, hoch qualitative mikroskopische Volumenbildgebung, insbesondere in Proben, die über die Probentiefe hinweg einen inhomogenen Brechungsindex aufweisen.
Aufgabe der Erfindung ist es ein Verfahren und ein Mikroskop anzugeben, die es ermöglichen, eine Volumenprobe in einem weiten Bereich längs der optischen Achse fehlerfrei abzubilden.
Die Erfindung löst diese Aufgabe durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den jeweiligen
Unteransprüchen angegeben. Das erfindungsgemäße Verfahren sieht vor, ein Mikroskopobjektiv mit einem Korrektionsglied nacheinander auf mindestens zwei als Referenzebenen dienende Objektebenen zu fokussieren, die sich innerhalb der Volumenprobe längs der optischen Achse des Mikroskopobjektivs in unterschiedlichen Probentiefen befinden. Für jede Referenzebene wird eine Referenzeinstellung des Korrektionsgliedes ermittelt, bei der ein von der Probentiefe abhängiger Abbildungsfehler durch das Korrektionsglied korrigiert ist. Auf Grundlage der ermittelten Referenzeinstellungen wird dann für mindestens eine Zielebene in der Probe eine Zieleinstellung für das Korrektionsglied bestimmt, in welcher der in der Probentiefe der Zielebene auftretende Abbildungsfehler durch das Korrektionsglied korrigiert ist. Schließlich wird zum Abbilden der
Volumenprobe das Mikroskopobjektiv auf die Zielebene fokussiert und das Korrektionsglied in die Zieleinstellung gebracht.
Indem das Mikroskopobjektiv mittels einer Fokussiereinrichtung auf mindestens zwei Referenzebenen fokussiert wird, wird gleichsam der abzubildende Probenbereich längs der optischen Achse, d.h. das zu mikroskopierende Volumen festgelegt. Im Rahmen dieser Festlegung des zu mikroskopierenden Volumens, die vorzugsweise in einem der eigentlichen
Bildaufnahme vorgelagerten Einrichtungsprozess ausgeführt wird, werden für die mindestens zwei Referenzebenen, die sich innerhalb der Probe in unterschiedlichen Probentiefen befinden, Referenzeinstellungen für das Korrektionsglied derart bestimmt, dass in diesen Referenzeinstellungen der von der Probentiefe abhängige Abbildungsfehler jeweils durch das
Korrektionsglied in der gewünschten Weise korrigiert ist. Dabei können die Referenzeinstellungen des Korrektionsgliedes manuell durch den Nutzer oder aber mit Hilfe einer hierfür geeigneten Steuereinheit automatisiert ermittelt werden.
Die für die Referenzebenen ermittelten Referenzeinstellungen des
Korrektionsgliedes werden anschließend dazu genutzt, für mindestens eine, in der Regel jedoch mehrere Zielebenen jeweils eine Zieleinstellung für das Korrektionsglied zu bestimmen, die später bei der Abbildung der jeweiligen Zielebene dafür sorgt, dass der in dieser Zielebene auftretende,
tiefenabhängige Abbildungsfehler bestmöglich korrigiert ist. Die Zielebenen liegen dabei innerhalb des durch die Referenzebenen längs der optischen Achse definierten Abbildungsbereichs. Die für die einzelnen Referenzebenen bestimmen Referenzeinstellungen bilden somit gleichsam Stützstellen, die dann bei der dreidimensionalen Abbildung der Volumenprobe herangezogen werden können, um in jeder beliebigen Zielebene innerhalb des zu mikroskopierenden Volumens die gewünschte Korrektion des tiefenabhängigen Abbildungsfehlers zu erzielen. Dabei werden die in der dreidimensionalen Abbildung der Volumenprobe jeweils anvisierten Zielebenen in der Regel nicht mit den vorher, im Rahmen der Einrichtung des Mikroskops definierten Referenzebenen übereinstimmen. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass auch eine solche Koinzidenz zwischen den Zielebenen und den Referenzebenen erfindungsgemäß nicht ausgeschlossen ist, d.h. die jeweils betrachtete Zielebene auch mit einer der vorher definierten Referenzebenen zusammenfallen darf. In einer ganz bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens wird für jede Referenzebene eine durch das Korrektionsglied in der jeweiligen
Referenzeinstellung verursachte Abweichung der Objektschnittweite des Mikroskopobjektivs gegenüber einer Sollschnittweite als
Referenzschnittweitenabweichung ermittelt. Dann wird auf Grundlage der für die einzelnen Referenzebenen ermittelten
Referenzschnittweitenabweichungen für die Zielebene eine
Zielschnittweitenabweichung bestimmt, welche die durch das Korrektionsglied in der Zieleinstellung verursachte Abweichung der Objektschnittweite gegenüber der Sollschnittweite repräsentiert. Schließlich wird das
Mikroskopobjektiv unter Berücksichtigung der Zielschnittweitenabweichung auf die Zielebene fokussiert.
Diese Ausgestaltung ermöglicht in besonders vorteilhafter Weise, die Wirkung der Korrektionsverstellung auf die Objektschnittweite des Mikroskopobjektivs, d.h. auf die axiale Lage der Objektebene, auf die das Mikroskopobjektiv gerade fokussiert ist, zu berücksichtigen und zu korrigieren. So wird nämlich eine unerwünschte axiale Verschiebung der Objektebene, die durch das Korrektionsglied verursacht wird, dadurch kompensiert, dass bei Fokussierung des Mikroskopobjektivs auf die abzubildende Zielebene die ermittelte Zielschnittweitenabweichung berücksichtigt wird. Hierzu ist zunächst zu ermitteln, wie sich die jeweilige Verstellung des
Korrektionsgliedes auf die Objektschnittweite des Mikroskopobjektivs auswirkt. Eine genaue Kenntnis der Wirkung der Korrektionsverstellung kann beispielsweise über eine geeignete Testprobe oder aber beim Einrichten des Mikroskops durch iteratives Verstellen des Korrektionsgliedes und
anschließendes Nachfokussieren des Mikroskopobjektivs erlangt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist es jedoch ebenso möglich, die Kenntnis der Wirkung der Korrektionsverstellung auf die Objektschnittweite allein aus der Kenntnis der optischen Auslegung des Mikroskopobjektivs zu gewinnen und basierend auf dieser Kenntnis die Zielschnittweitenabweichung numerisch zu ermitteln. Die Berücksichtigung der durch das Korrektionsglied verursachten
Veränderung der Objektschnittweite ermöglicht eine weitgehend freie
Auswahl des zu verwendenden Korrektionsgliedes. So ist es insbesondere nicht erforderlich, dass das verwendete Korrektionsglied möglichst geringe Brechkraft aufweist, um von vorneherein jegliche Veränderung der
Objektschnittweite zu vermeiden. Da sich durch höhere Brechkräfte auch größere Brechungsindexfehlanpassungen, wie sie insbesondere in axial ausgedehnten Volumenproben auftreten, kompensieren lassen, ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren somit eine präzise dreidimensionale Abbildung auch großer Volumenproben.
Vorzugsweise wird auf Grundlage der Referenzschnittweitenabweichungen eine Schnittweitenvorschrift ermittelt, welche die Abweichung der
Objektschnittweite in Abhängigkeit der Einstellung des Korrektionsgliedes angibt. Die in der Volumenbildaufnahme genutzte
Zielschnittweitenabweichung wird dann anhand dieser Schnittweitenvorschrift bestimmt. Die vorstehend genannte Schnittweitenvorschrift kann
beispielsweise in Form einer geeignet parametrisierten Funktion oder einer Wertetabelle gespeichert werden, anhand der im Wege einer mathematischen Interpolation die Zielschnittweitenabweichung berechnet wird. Die Interpolation kann beispielsweise nach einem linearen oder kubischen Verfahren oder einem Spline-Verfahren durchgeführt werden. In entsprechender Weise kann in einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf Grundlage der Referenzeinstellungen des Korrektionsgliedes eine Korrektionsvorschrift ermittelt werden, welche die zur Korrektion des Abbildungsfehlers vorgesehene Einstellung des
Korrektionsgliedes in Abhängigkeit der Probentiefe angibt. Die Zieleinstellung des Korrektionsgliedes kann dann anhand dieser Korrektionsvorschrift insbesondere durch Interpolation bestimmt werden.
Falls sich in Abhängigkeit der Einstellung des Korrektionsgliedes nicht nur die Objektschnittweite, sondern auch die Brennweite des Mikroskopobjektivs und damit auch dessen Vergrößerung ändert, wird vorzugsweise für jede
Referenzebene eine durch das Korrektionsglied in der jeweiligen
Referenzeinstellung verursachte Abweichung der Vergrößerung des
Mikroskopobjektivs gegenüber einer Sollvergrößerung als
Referenzvergrößerungsabweichung ermittelt. Auf Grundlage der für die jeweiligen Referenzebenen ermittelten Referenzvergrößerungsabweichungen wird für die Zielebene dann eine Zielvergrößerungsabweichung bestimmt, welche die durch das Korrektionsglied in der Zieleinstellung verursachte Abweichung der Vergrößerung gegenüber der Sollvergrößerung angibt. Um die durch das Korrektionsglied verursachte Vergrößerungsänderung zu kompensieren, wird schließlich ein variables Vergrößerungselement unter Berücksichtigung der Zielvergrößerungsabweichung verstellt. Diese
Kompensation der durch das Korrektionsglied geänderten Vergrößerung bzw. Objektbrennweite erfolgt vorzugsweise in Echtzeit parallel zur Korrektion des Abbildungsfehlers und zur Korrektur der Schnittweitenänderung. Das variable Vergrößerungselement ist beispielsweise als Vario-Kameraadapter oder als Teil eines Abtastsystems eines Konfokal- oder Multiphotonenmikroskops realisierbar. In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung wird für jede Referenzebene mindestens ein Referenzsteuerparameter festgelegt. Auf Grundlage der so festgelegten Referenzsteuerparameter wird dann für die Zielebene ein Zielsteuerparameter bestimmt und eingestellt. Ein Beispiel für einen solchen Referenzsteuerparameter ist etwa die Lichtleistung, mit der die jeweilige Zielebene beim Abbilden der Volumenprobe beleuchtet wird. Dadurch kann über das gesamte mikroskopierte Volumen eine gleichmäßige Bildhelligkeit erzielt werden. Ein weiteres Beispiel ist in der Multiphotonenmikroskopie die sogenannte Prechirp zur Kompensation der Dispersion der Probe.
Vorzugsweise umfassen die mindestens zwei Referenzebenen mehrere längs der optischen Achse äquidistante Ebenen. Da in diesem Fall die beim
Einrichten des Mikroskops definierten Referenzebenen längs der optischen Achse gleiche Abstände voneinander haben, bilden die für die
Referenzebenen ermittelten Referenzeinstellungen des Korrektionsgliedes eine zuverlässige Grundlage dafür, dass in allen möglichen Zielebenen innerhalb des zu mikroskopierenden Volumens jeweils eine präzise
Zieleinstellung für das Korrektionsglied und damit eine gute Korrektion des in der jeweiligen Probentiefe auftretenden Abbildungsfehlers gefunden werden kann.
Um das Mikroskopobjektiv auf die jeweils gewünschte Objektebene zu fokussieren, ist das Mikroskopobjektiv relativ zur Volumenprobe längs der optischen Achse zu bewegen. Dies kann mittels einer Fokussiereinrichtung erfolgen, die an dem Mikroskopobjektiv oder an einem die Volumenprobe tragenden Objekttisch angreift. In der ersten Ausführungsform bewegt also die Fokussiereinrichtung das Mikroskopobjektiv im Raum, während der Objekttisch ortsfest bleibt. Dagegen wird in der zweiten Ausführungsform der Objekttisch bei festgehaltenem Mikroskopobjektiv im Raum bewegt. Auch eine Kombination dieser beiden Fokussierungen ist denkbar.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung ist ein Mikroskop zum Abbilden einer Volumenprobe vorgesehen, das ein Mikroskopobjektiv, ein Korrektionsglied, eine Fokussiereinrichtung und eine Steuereinheit umfasst. Dabei ist die Steuereinheit so ausgebildet, dass das Mikroskopobjektiv, das Korrektionsglied und die Fokussiereinrichtung in der vorstehend erläuterten Weise angesteuert werden.
Vorzugsweise umfasst bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop das
Korrektionsglied eine in dem Mikroskopobjektiv enthaltene Linseneinheit und eine Antriebseinheit zum Bewegen der Linseneinheit längs der optischen Achse.
Wird bei dem Mikroskop die durch das Korrektionsglied verursachte
Abweichung der Objektschnittweite in oben erläuterter Weise berücksichtigt, so ist es möglich, die Linseneinheit mit einer so großen Brechkraft zu versehen, dass auch große Variationen des Brechungsindex innerhalb der Volumenprobe korrigiert werden können.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung umfasst die Antriebseinheit einen an einem Gehäuse des Mikroskopobjektivs angeordneten, um die optische Achse drehbaren Korrekturring, dessen Drehbewegung in eine Verstellbewegung der Linseneinheit längs der optischen Achse umsetzbar ist. Diese Ausgestaltung des Korrektionsgliedes kann beispielsweise derart realisiert sein, wie dies in der eingangs genannten DE 10 201 1 051 677 A1 offenbart ist, deren Offenbarungsgehalt an dieser Stelle im Wege der
Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen ist.
Weitere vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die Figuren. Darin zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung, die ein Mikroskopobjektiv zeigt, das bei korrekt eingestelltem Korrektionsglied auf eine erste
Referenzebene fokussiert ist; eine der Figur 1 entsprechende schematische Darstellung, in der das Mikroskopobjektiv auf eine zweite Referenzebene fokussiert ist, ohne dass der Abbildungsfehler durch das Korrektionsglied korrigiert ist; eine der Figur 2 entsprechende schematische Darstellung, die eine Schnittweitenabweichung zeigt, die durch das auf die zweite Referenzebene eingestellte Korrektionsglied verursacht wird; eine der Figur 3 entsprechende schematische Darstellung, die eine Schnittweitenkorrektur für die zweite Referenzebene zeigt; ein Ablaufdiagramm, das die Verfahrensschritte zum Einrichten des Mikroskops zeigt; ein Ablaufdiagramm, das die Verfahrensschritte zum Abbilden der Volumenprobe mittels des nach Figur 5 eingerichteten Mikroskops zeigt; das erfindungsgemäße Mikroskop in einer Ausführungsform, die ein aufrechtes Mikroskopstativ und einen verstellbaren Objekttisch als Fokussiereinrichtung aufweist; das erfindungsgenmäße Mikroskop in einer weiteren
Ausführungsform, die ein aufrechtes Mikroskopstativ und einen verstellbaren Objektivrevolver als Fokussiereinrichtung aufweist; das erfindungsgemäße Mikroskop in einer weiteren
Ausführungsform, die ein inverses Mikroskopstativ und einen verstellbaren Objektivrevolver als Fokussiereinrichtung aufweist; und Fig. 10 das erfindungsgemäße Mikroskop in einer weiteren
Ausführungsform, die ein inverses Mikroskopstativ und einen verstellbaren Objekttisch als Fokussiereinrichtung aufweist. Unter Bezugnahme auf die Figuren 1 und 4 wird zunächst ganz grundsätzlich erläutert, wie ein durch eine Brechungsindexfehlanpassung verursachter Öffnungsfehler sowie eine durch die Korrektion des Öffnungsfehlers verursachte Veränderung der Objektschnittweite erfindungsgemäß korrigiert werden. Hierzu sind in den Figuren 1 bis 4 die Mikroskopkomponenten und die Kenngrößen, die für die Korrektion des Öffnungsfehlers und die
Nachjustierung der Objektschnittweite relevant sind, rein schematisch dargestellt, um die Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens zu erleichtern. Nach den Figuren 1 bis 4 umfasst ein allgemein mit 10 bezeichnetes Mikroskop ein Mikroskopobjektiv 12, einen Objekttisch 14, auf dem eine Volumenprobe 16 angeordnet ist, ein Korrektionsglied 18, das im
vorliegenden Ausführungsbeispiel Teil des Mikroskopobjektivs 12 ist, sowie eine Steuereinheit 20. Ferner weist das Mikroskop 10 eine
Fokussiereinrichtung auf, mit der sich der die Volumenprobe 16 tragende
Objekttisch 14 längs der optischen Achse O relativ zu dem Mikroskopobjektiv 12 verstellen lässt. Die Fokussiereinrichtung ist in den Figuren 1 bis 4 rein schematisch mit einem Doppelpfeil 22 bezeichnet. Ebenso wie das
Korrektionsglied 18 wird auch die Fokussiereinrichtung 22 über die
Steuereinheit 20 gesteuert. Hierzu sind das Korrektionsglied 18 und die Fokussiereinrichtung 22 über Verbindungsleitungen 24 bzw. 26 mit der Steuereinheit 20 gekoppelt.
Das Korrektionsglied 18 weist eine Linseneinheit auf, die Teil einer in dem Mikroskopobjektiv enthaltenen, in den Figuren 1 bis 4 nicht gezeigten Abbildungsoptik ist. Um einen durch eine Brechungsindexfehlanpassung verursachten Öffnungsfehler in nachfolgend beschriebener Weise zu korrigieren, lässt sich das Korrektionsglied 18 über die Steuereinheit 20 längs der optischen Achse O bewegen.
Figur 1 zeigt einen Zustand, in dem das Mikroskopobjektiv 12 auf eine Objektebene 28 fokussiert ist. Dabei soll in dem in Figur 1 dargestellten Zustand das Korrektionsglied 18 längs der optischen Achse O so eingestellt sein, dass der Öffnungsfehler durch das Korrektionsglied 18 bestmöglich korrigiert ist. Diese bestmögliche Korrektionseinstellung ist in Figur 1 mit Ci bezeichnet.
Die Objektebene 28 bildet eine erste Referenzebene, für welche die gewünschte Einstellung Ci des Korrektionsgliedes 18, im Folgenden als erste Referenzeinstellung bezeichnet, ermittelt ist. In dem Zustand nach Figur 1 liegt die erste Referenzebene 28 innerhalb der Probe 16 längs der optischen Achse O an einer Stelle, die der
Objektschnittweite des Mikroskopobjektivs 12 entspricht. Diese von der Referenzeinstellung Ci abhängige Objektschnittweite ist in Figur 1 mit d0(ci ) bezeichnet. Die Objektschnittweite d0(ci ) gibt den Abstand der durch die erste Referenzebene 28 gebildeten Objektebene von dem Mikroskopobjektiv 12 (präziser von dessen am weitesten objektseitig angeordneten optischen Fläche) an.
In Figur 1 bezeichnet die Größe z-ι den Abstand des die Volumenprobe 16 tragenden Objekttisches 14 von einem festen Bezugspunkt an dem
Mikroskopobjektiv 12. Dieser feste Bezugspunkt an dem Mikroskopobjektiv 12 ist beispielsweise durch eine Anlagefläche des Mikroskopobjektivs 12 an einen in Figur 1 nicht gezeigten Objektivrevolver gegeben. Diese Größe z-i gibt also den Abstand zwischen der Volumenprobe 16 und dem
Mikroskopobjektiv 12 an und repräsentiert somit eine im Folgenden auch als Fokussierabstand bezeichnete Stellgröße der Fokussiereinrichtung 22. Der Fokussierabstand z-i ist mithin auch ein Maß für die Tiefe, in der die
Objektebene 28 innerhalb der Volumenprobe 16 liegt. Dies bedeutet, dass sich bei Änderung des Fokussierabstandes Zi die Probentiefe, auf die das Mikroskopobjektiv 12 innerhalb der Volumenprobe 16 fokussiert ist, gleichermaßen ändert. In Figur 2 ist ein Zustand gezeigt, in dem das Mikroskopobjektiv 12 auf eine Tiefe innerhalb der Volumenprobe 16 fokussiert ist, die einem (in diesem Beispiel kleineren) Fokussierabstand z2 entspricht. Die Objektebene 28 liegt demnach in dem Zustand nach Figur 2 von oben her gesehen tiefer innerhalb der Volumenprobe 16. Diese tiefer liegende Ebene definiert eine zweite Referenzebene.
Da in dem in Figur 2 gezeigten Zustand die Weglänge des aus der
Objektebene 28 kommenden Lichtes innerhalb der Volumenprobe 16 länger als in dem Zustand nach Figur 1 ist, tritt in Folge der
Brechungsindexfehlanpassung ein Öffnungsfehler auf. Dieser Öffnungsfehler ist in Figur 2 zeichnerisch durch Knicke in den aus der Volumenprobe 16 in Richtung des Mikroskopobjektivs 12 austretenden Lichtstrahlen angedeutet. Da sich in Figur 2 das Korrektionsglied 18 noch immer in der für den Zustand nach Figur 1 optimierten Referenzeinstellung Ci befindet, ist in Figur 2 der Öffnungsfehler noch unkorrigiert.
Figur 3 zeigt, wie durch eine Verstellung des Korrektionsgliedes 18 der in Figur 2 dargestellte Öffnungsfehler korrigiert wird. So ist in Figur 3 für das Korrektionsglied 18 eine von der Einstellung Ci verschiedene zweite
Referenzeinstellung c2 gewählt, durch die der Öffnungsfehler für die zweite Referenzebene 28 bestmöglich korrigiert ist. Jedoch wird durch die
Bewegung des Korrektionsgliedes 18 in die Referenzeinstellung c2 die Objektschnittweite des Mikroskopobjektivs 12 gegenüber der gewünschten Sollschnittweite geändert. Diese geänderte Objektschnittweite ist in Figur 3 mit d0(c2) bezeichnet. Somit wird die Objektebene 28 in Figur 2 längs der optischen Achse O um einen Betrag nach oben verschoben, der gegeben ist durch Ad0(ci,c2) = d0(c2)-d0(ci). Figur 4 zeigt schließlich, wie die unerwünschte Verschiebung de Objektebene 28 in Folge der Änderung der Objektschnittweite kompensiert wird. So wird mittels der Fokussiereinrichtung 22 der in Figur 3 gegebene
Fokussierabstand z2 in Figur 4 um die durch das Korrektionsglied 18 verursachte Änderung der Objektschnittweite, d.h. Ado(ci,c2) verringert. Dies bedeutet, dass in dem Beispiel nach Figur 4 der Objekttisch 14 um den Betrag Ad0(c-i,c2) längs der optischen Achse O nach oben verschoben wird. Dadurch kann wieder die ursprünglich anvisierte Objektebene 28 innerhalb der Volumenprobe 16 angefahren werden.
Figur 5 zeigt ein Ablaufdiagramm, das rein beispielhaft die vor der eigentlichen Bildaufnahme vorgenommene Einrichtung des Mikroskops 10 zeigt, die insbesondere dazu dient, die Referenzebenen festzulegen und für diese Referenzebenen die Referenzeinstellungen für das Korrektionsglied und die Referenzschnittweitenabweichungen gegenüber der Sollschnittweite zu ermitteln. Optional werden auch Referenzvergrößerungsabweichungen berücksichtigt, sofern durch die Verstellung des Korrektionsgliedes 18 auch Abweichungen der Objektbrennweite und damit Abweichungen der
Vergrößerung gegenüber einer Sollvergrößerung verursacht werden.
In Schritt S1 wird eine Referenzebene Xn angefahren, indem das
Mikroskopobjektiv 12 mittels der Fokussiereinrichtung 22 auf diese
Referenzebene Xn fokussiert wird. In Schritt S2 wird das Korrektionsglied 18 in eine Referenzeinstellung cn gebracht. In dieser Referenzeinstellung cn ist der Öffnungsfehler, der durch eine Brechungsindexfehlanpassung verursacht wird, für die Referenzebene Xn bestmöglich korrigiert. Kommt es durch die Verstellung des Korrektionsgliedes 18 zu einer Änderung Ad0(cn) der Objektschnittweite, so wird die Objektebene entsprechend Figur 4
nachjustiert. Die Größe Ad0(cn) entspricht somit der
Referenzschnittweitenabweichung. Wird durch die Verstellung des
Korrektionsgliedes 18 zudem eine Änderung der Objektbrennweite und damit eine Änderung der Vergrößerung verursacht, so wird zusätzlich eine
Referenzvergrößerungsabweichung ß(cn) bestimmt. Die Schritte S2 und S3 werden so ausgeführt, wie dies vorstehend anhand der Figuren 1 bis 4 erläutert wurde. Dabei ist eine Ausführung von Schritt S3 in Echtzeit besonders vorteilhaft.
In Schritt S4 wird entschieden, ob die in den Schritten S2 und S3 ermittelten Größen cn, Zn und ggf. ß(cn) als Stützstelle n gespeichert werden sollen oder nicht, wobei n eine ganzzahlige Laufvariable bezeichnet. Sollen die genannten Größen gespeichert werden, so erfolgt diese Speicherung in Schritt S5, und der Ablauf wird mit Schritt S6 fortgesetzt. Soll die Stützstelle n nicht gespeichert werden, so fährt der Ablauf unmittelbar mit Schritt S6 fort.
In Schritt S6 wird bestimmt, ob eine weitere Stützstelle ermittelt werden soll. Ist dies der Fall, so wird die Laufvariable n um 1 (n=n+1 ) erhöht, und der Steuerablauf kehrt zu Schritt S1 zurück. Soll keine weitere Stützstelle ermittelt werden, so werden in Schritt S7 die Zielebenen zk, auf die das
Mikrokopobjektiv 12 bei der anschließenden Abbildung der Volumenprobe 16 fokussiert werden sollen, festgelegt und in Schritt S8 gespeichert. Figur 6 zeigt ein Ablaufdiagramm, in dem beispielhaft angegeben ist, wie basierend auf der nach Figur 5 vorgenommenen Einrichtung des Mikroskops 10 die Volumenbildaufnahme durchgeführt wird.
In Schritt S10 wird der Bildaufnahmeprozess für eine Zielebene zk gestartet, wobei k eine ganzzahlige Laufvariable bezeichnet. In Schritt S1 1 wird eine die Zielebene zk identifizierende Information, die zuvor bei der Einrichtung des Mikroskops 10 gespeichert worden ist (S8 in Figur 5), ausgelesen. In Schritt S12 werden die den einzelnen Referenzebenen zugeordneten Stützstellen bereitgestellt, d.h. die Referenzeinstellungen cn und die
Referenzschnittweitenabweichungen Zn (S5 in Figur 5). Die in den Schritten S1 1 und S12 bereitgestellten Informationen werden im weiteren genutzt, um für die ausgewählte Zielebene zk die entsprechenden Zielgrößen zu ermitteln, nämlich die Zieleinstellung ck für das Korrektionsglied 18, die Zielschnittweitenabweichung xk, mit der die Fokussiereinrichtung 22 angesteuert wird, und (optional) die Zielvergrößerungsabweichung ßk, mit der ein variables Vergrößerungselement angesteuert wird. Im Einzelnen wird in Schritt S13 für die Zielebene zk die Zieleinstellung ck für das Korrektionsglied 18 berechnet. In Schritt S14 wird das Korrektionsglied 18 dann in die Zieleinstellung ck bewegt, um den Öffnungsfehler in der Zielebene zk bestmöglich zu korrigieren. In Schritt S15 wird die Referenzschnittweitenabweichung xk für die Zielebene zk berechnet. In Schritt S16 wird die Fokussiereinrichtung 22 entsprechend der Referenzschnittweitenabweichung xk verstellt.
In Schritt S17 wird die Zielvergrößerungsabweichung ßk für die Zielebene zk berechnet. In Schritt S18 wird dann das variable Vergrößerungselement entsprechend der Zielvergrößerungsabweichung ßk verstellt.
Dabei werden der durch die Schritte S13 und S14 gebildete
Verarbeitungszweig zur Verstellung des Korrektionsgliedes 18, der durch die Schritte S15 und S16 gebildete Verarbeitungszweig zur Verstellung der
Fokussiereinrichtung 22 sowie (optional) der durch die Schritte S17 und S18 gebildete Verarbeitungszweig zur Verstellung des variablen
Vergrößerungselementes parallel ausgeführt. Diese Verarbeitungszweige münden gemeinsam in den Schritt S19, in dem nach der erfolgten Einstellung der auf die Zielebene zk bezogenen Zielgrößen ck, zk und ßk ein Bild der
Zielebene zk aufgenommen wird. Die so erzeugten Volumenbilddaten werden in Schritt S20 gespeichert. In Schritt S21 erfolgt eine Abfrage, ob eine weitere Zielebene aufgenommen werden soll. Ist dies der Fall, so wird die
Laufvariable k um 1 erhöht (k=k+1 ) und der vorstehend erläuterte
Bildaufnahmeprozess erneut durchgeführt. Soll keine weitere Zielebene aufgenommen werden, so endet der Prozess. Es ist darauf hinzuweisen, dass die unter Bezugnahme auf die Figuren 5 und 6 erläuterten Abläufe nur beispielhaft zu verstehen sind. Es sind verschiedene Abwandlungen denkbar, z.B. eine Volumenbildaufnahme, bei der nur die Einstellung des Korrektionsgliedes 18 berücksichtigt wird, nicht jedoch eine Änderung der Objektschnittweite und eine Änderung der
Mikroskopvergrößerung infolge der Verstellung des Korrektionsgliedes 18. In diesem Fall können die beiden durch die Schritte S15, S16 bzw. S17, S18 gebildeten Verarbeitungszweige weggelassen werden. Es können jedoch auch zusätzliche, parallel ausgeführte Verarbeitungszweige vorgesehen werden, wie etwa die Einstellung eines auf die Zielebene bezogenen
Zielsteuerparameters, z.B. einer Beleuchtungslichtleistung, auf Grundlage vorher definierter, auf die Referenzebenen bezogener
Referenzsteuerparameter. In den Figuren 7 bis 10 sind verschiedene Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Mikroskops 10 gezeigt.
Das Mikroskop 10 nach Figur 7 umfasst neben den schon unter Bezugnahme auf die Figuren 1 und 4 angegebenen Mikroskopkomponenten ein aufrechtes Mikroskopstativ 30 sowie eine Dokumentationseinheit 32, die über eine Verbindungsleitung 34 mit der Steuereinheit 20 gekoppelt ist. Bei der Ausführungsform nach Figur 7 ist die Fokussiereinrichtung 22 (wie auch in dem Ausführungsbeispiel nach den Figuren 1 bis 4) durch den längs der optischen Achse motorisch verstellbaren Objekttisch 14 gegeben. In Figur 7 ist zudem ein Immersionsmedium 36 gezeigt, in das die Volumenprobe 16 eingebettet ist. Der Brechungsindex des Immersionsmediums 36 ist so gewählt, dass er möglichst gut an den Brechungsindex der Volumenprobe 16 angepasst ist. Die Ausführungsform nach Figur 8 ist gegenüber der in Figur 7 dargestellten Ausführungsform so abgewandelt, dass die Fokussiereinrichtung 22 nicht durch einen verstellbaren Objekttisch, sondern einen längs der optischen Achse bewegbaren Objektivrevolver gebildet ist, an dem das
Mikroskopobjektiv 12 gehalten ist.
Die Ausführungsform nach Figur 10 weist demgegenüber ein inverses Mikroskopstativ 38 auf. Die Fokussiereinrichtung 22 ist in dieser
Ausführungsform wiederum durch einen längs der optischen Achse verstellbaren Objektivrevolver 40 gebildet.
Die Ausführungsform nach Figur 10 ist schließlich gegenüber der in Figur 9 dargestellten Ausführungsform dadurch abgewandelt, dass die
Fokussiereinrichtung 22 wiederum durch den längs der optischen Achse verstellbaren Objekttisch 14 realisiert ist.
Auch die Ausführungsformen nach den Figuren 7 bis 10 sind lediglich beispielhaft zu verstehen. Insbesondere ist die Erfindung nicht auf einen bestimmten Mikroskoptyp beschränkt. Vielmehr ist sie in den
unterschiedlichsten Mikroskopieverfahren anwendbar, beispielsweise in der Weitfeld-Mikroskopie, in der Konfokal-Mikroskopie, der Multiphotonen- Mikroskopie oder der Lichtblatt-Mikroskopie.
Bezugszeichenliste
10 Mikroskop
12 Mikroskopobjektiv
14 Objekttisch
16 Volumenprobe
18 Korrektionsglied
20 Steuereinheit
22 Fokussiereinrichtung
24 Verbindungsleitung
26 Verbindungsleitung
28 Objektebene
30 aufrechtes Mikroskopstativ
32 Dokumentationseinheit
34 Verbindungsleitung
36 Immersionsmedium
38 inverses Mikroskopstativ
40 Objektivrevolver

Claims

Patentansprüche
Verfahren zum mikroskopischen Abbilden einer Volumenprobe (16), bei dem ein Mikroskopobjektiv (12) mit einem Korrektionsglied (18) nacheinander auf mindestens zwei Referenzebenen fokussiert wird, die sich innerhalb der Volumenprobe (16) längs der optischen Achse (O) des Mikroskopobjektivs (12) in unterschiedlichen Volumenprobentiefen befinden; für jede Referenzebene eine Referenzeinstellung des Korrektionsgliedes (18) ermittelt wird, bei der ein von der Volumenprobentiefe abhängiger Abbildungsfehler durch das Korrektionsglied (18) korrigiert ist; auf Grundlage der ermittelten Referenzeinstellungen für mindestens eine Zielebene in der Volumenprobe (16) eine Zieleinstellung für das Korrektionsglied (18) bestimmt wird, in welcher der in der Volumenprobentiefe der Zielebene auftretende Abbildungsfehler durch das Korrektionsglied (18) korrigiert ist; und zum Abbilden der Volumenprobe (16) das Mikroskopobjektiv (12) auf die Zielebene fokussiert und das Korrektionsglied (18) in die Zieleinstellung gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 1 , bei dem für jede Referenzebene eine durch das Korrektionsglied (18) in der jeweiligen Referenzeinstellung verursachte Abweichung der Objektschnittweite des Mikroskopobjektivs (12) gegenüber einer Sollschnittweite als Referenzschnittweitenabweichung ermittelt wird, auf Grundlage dieser Referenzschnittweitenabweichungen für die Zielebene eine Zielschnittweitenabweichung bestimmt wird, welche die durch das Korrektionsglied (18) in der Zieleinstellung verursachte Abweichung der Objektschnittweite gegenüber der Sollschnittweite angibt; und das Mikroskopobjektiv (12) unter Berücksichtigung der Zielschnittweitenabweichung auf die Zielebene fokussiert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem auf Grundlage der Referenzschnittweitenabweichungen eine Schnittweitenvorschrift ermittelt wird, welche die Abweichung der Objektschnittweite in Abhängigkeit der Einstellung des Korrektionsgliedes (18) angibt, und die Zielschnittweitenabweichung an Hand dieser Schnittweitenvorschrift insbesondere durch Interpolation bestimmt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem auf Grundlage der Referenzeinstellungen des Korrektionsgliedes (18) eine Korrektionsvorschrift ermittelt wird, welche die zur Korrektion des Abbildungsfehlers vorgesehene Einstellung des Korrektionsgliedes (18) in Abhängigkeit der Volumenprobentiefe angibt, und die Zieleinstellung des Korrektionsgliedes (18) an Hand dieser Korrektionsvorschrift insbesondere durch Interpolation bestimmt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem für jede Referenzebene eine durch das Korrektionsglied (18) in der jeweiligen Referenzeinstellung verursachte Abweichung der Vergrößerung des Mikroskopobjektivs (12) gegenüber einer Sollvergrößerung als Referenzvergrößerungsabweichung ermittelt wird, auf Grundlage dieser Referenzvergrößerungsabweichungen für die Zielebene eine Zielvergrößerungsabweichung bestimmt wird, welche die durch das Korrektionsglied (18) in der Zieleinstellung verursachte Abweichung der Vergrößerung gegenüber der Sollvergrößerung angibt; und ein variables Vergrößerungselement unter Berücksichtigung der Zielvergrößerungsabweichung verstellt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem für jede Referenzebene mindestens ein Referenzsteuerparameter, insbesondere eine Beleuchtungslichtleistung, festgelegt wird; und auf Grundlage dieser Referenzsteuerparameter für die Zielebene ein Zielsteuerparameter bestimmt und eingestellt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die mindestens zwei Referenzebenen mehrere längs der optischen Achse (O) äquidistante Ebenen umfassen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Mikroskopobjektiv (12) zum Fokussieren relativ zur Volumenprobe (16) längs der optischen Achse (O) bewegt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem ein abzubildender Volumenprobenbereich längs der optischen Achse (O) durch die Referenzebene, die sich in der geringsten Volumenprobentiefe befindet, und die Referenzebene, die sich in der größten Volumenprobentiefe befindet, begrenzt wird.
Mikroskop (10) zum Abbilden einer Volumenprobe (16), mit einem Mikroskopobjektiv (12); einem Korrektionsglied (18); einer Fokussiereinrichtung (22); und einer Steuereinheit (20); wobei die Steuereinheit (20) das Mikroskopobjektiv (12) mittels der Fokussiereinrichtung (22) nacheinander auf mindestens zwei Referenzebenen fokussiert, die sich innerhalb der Volumenprobe (16) längs der optischen Achse (O) des Mikroskopobjektivs (12) in unterschiedlichen Volumenprobentiefen befinden; die Steuereinheit (20) für jede Referenzebene eine Referenzeinstellung des Korrektionsgliedes (18) ermittelt, bei der ein von der Volumenprobentiefe abhängiger Abbildungsfehler durch das Korrektionsglied (18) korrigiert ist; die Steuereinheit (20) auf Grundlage der ermittelten Referenzeinstellungen für mindestens eine Zielebene in der Volumenprobe (18) eine Zieleinstellung für das Korrektionsglied (18) bestimmt, in welcher der in der Volumenprobentiefe der Zielebene auftretende Abbildungsfehler durch das Korrektionsglied (18) korrigiert ist; und die Steuereinheit (20) das Mikroskopobjektiv (12) mittels der Fokussiereinrichtung (22) zum Abbilden der Volumenprobe auf die Zielebene fokussiert und das Korrektionsglied (18) in die Zieleinstellung bringt.
Mikroskop (10) nach Anspruch 10, bei dem das Korrektionsglied (18) eine in dem Mikroskopobjektiv (12) enthaltene Linseneinheit und eine Antriebseinheit zum Bewegen der Linseneinheit längs der optischen Achse (O) aufweist.
Mikroskop (10) nach Anspruch 1 1 , bei dem die Antriebseinheit einen an einem Gehäuse des Mikroskopobjektivs (12) angeordneten, um die optische Achse (O) drehbaren Korrekturring umfasst, dessen
Drehbewegung in eine Verstellbewegung der Linseneinheit (60) längs der optischen Achse (O) umsetzbar ist.
Mikroskop (10) nach einem der Ansprüche 10 bis 12, bei dem die Fokussiereinrichtung (22) zum Verstellen des Mikroskopobjektivs (12) und/oder eines die Volumenprobe (16) tragenden Objekttisches motorisch verstellbar ist.
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