JP2004348104A - 観察器具及びそれを用いた観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞等の透明な微小物体を、特殊観察法に必要とされるような特殊な変調素子を用いることなく、かつ簡便に観察する。
【解決手段】対物レンズを有する光学系を介して落射照明光により照明して観察対象物を観察する観察方法において用いられる観察対象物収納用の観察器具であって、観察時に落射照明を反射する反射面を有する観察器具。反射面は、対物レンズに対向する面または対向する面の反対面に設けられている。観察器具には、液体を保持できる容器を有し、上記観察器具を用いて、細胞等を培養液とともに観察する。
【選択図】図１

Description

【０００１】
【技術分野】
本発明は物体の観察技術、特に細胞等の透明な微小物体の観察技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、細胞等の微小透明物体の観察には、透過観察顕微鏡を用いていた。そして、無染色の生きた細胞の内部構造や形態を高コントラストで観察するためには、位相差顕微鏡、レリーフ位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、偏光顕微鏡など、位相差リングを持つ特殊なコンデンサーや微分干渉プリズムなどと共に特殊なレンズを備えた顕微鏡を使用することが必要であった。
【０００３】
具体的には、培養液中の細胞など、透明な微小物体を顕微鏡観察する方法として、位相差法や偏斜照明法、微分干渉法等に代表される特殊観察法が広く用いられている（特許文献１等参照）。特殊観察法の光学系の構成は、図１６に示すように、照明光を発生するための光源７１３と、光源７１３から発した照明光の進行方向をそろえるためのコリメートレンズ７４１と、進行方向がそろった照明光の進行方向を垂直方向に偏向するための反射鏡７４２と、照明光を集光するための窓レンズ７４３と、集光した照明光を観察する物体を含む標本７０８に照射するためのコンデンサレンズ７４４と、標本７０８を拡大投影する為の対物レンズ７０６と、標本７０８の像を像面７４５上に結像する為の結像レンズ７４６と、標本７０８の観察位置を調整する為のステージ７１７とからなる通常の透過明視野観察の構成に対して、コンデンサレンズ７４４の入射瞳位置に照明変調素子７４７を、対物レンズ７０６の射出瞳位置に結像変調素子７４８を加えたものである。照明変調素子７４７にリングスリットを、結像変調素子７４８に位相板を用いたものが、位相差法であり、照明変調素子７４７に偏心開口を用いたものが、偏斜照明法であり、照明変調素子７４７と結像照明素子７４８両方に、偏光板と微分干渉プリズムを用いたものが、微分干渉法である。特殊観察法を用いることにより、周りの媒質と屈折率が異なれば、透明な物体でも明暗のコントラストをつけて観察することができるようになる。このような特殊観察法は特に、本来透明であり、そのままではなかなか見えにくい生体組織を、コントラスト良く観察する為に有効である。
【特許文献１】
特開平７−２２５３４１号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これら特殊観察方法では、前述の通りコンデンサレンズ７４４や対物レンズ７０６の瞳位置に、特殊な変調素子を配置しなければならない。これら特殊な変調素子は、非常に高価であると同時に、たとえば対物レンズ７０６の倍率変換時にその変調素子も切り替える必要が生じる等、使用面でも不便なことが多い。
【０００５】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、透明な微小物体を、特殊観察法に必要とされるような特殊な変調素子を用いることなく、かつ簡便に観察することを可能とする技術を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の観察器具は、ミラー（反射面）を有する観察対象物収納部を備えた観察器具である。また、対物レンズを有する光学系を介して落射照明光により照明して観察対象物を観察する観察方法において用いられる観察対象物収納用の観察器具であって、観察時に前記落射照明光を反射する反射面が設けられている。
【０００７】
前記反射面は、観察時に前記対物レンズに対向することになる面に設けられていてもよく、前記対物レンズに対抗することになる面の反対面に設けられてもよい。
【０００８】
また、前記観察対象物が通過する流路が形成されていてもよい。また、前記観察対象物を収納する収納部に、観察対象物を含む液体を注入する口と、流出させる口とを備えていてもよい。
【０００９】
また、本発明の観察方法は、対物レンズを有する光学系を介して落射照明光により照明して観察対象物を観察する観察方法であって、前記観察対象物を収納する観察器具には、観察時に前記落射照明光を反射する反射面が設けられており、前記観察器具に観察対象物を収納し、前記観察対象物を観察することを特徴とする。
【００１０】
前記反射面は、観察時に前記対物レンズに対向することになる面に設けられていてもよく、前記対物レンズに対抗することになる面の反対面に設けられていてもよい。
【００１１】
また、前記観察対象物は、微小透明体であってもよい。
【００１２】
また、前記観察器具は、液体を保持できる容器を有し、前記容器に、観察対象物を内包する液体とともに収納するようにしてもよい。ここで、前記観察対象物は、細胞であり、前記液体は、培養液であってもよい。
【００１３】
また、前記観察対象物と前記反射面との距離が、前記光学系の焦点深度の半分以下になるように、前記観察対象物を前記観察器具に収納するようにしてもよい。
【００１４】
具体的には、前記観察対象物と前記反射面との距離ｄが下記式（１）
ｄ≦Ｗ／（２ＮＡ^２） …（１）
（式中、ｄは観察対象物と反射面との距離を表し、Ｗは観察に用いる光の波長を表し、ＮＡは光学系の開口数を表す。）
を満たすように、前記観察対象物を前記観察器具に収納するようにしてもよい。
【００１５】
さらに、前記観察対象物に対する照明光の開口数が、対物レンズの開口数より小さくなるように、前記観察対象物を前記観察器具に収納するようにしてもよい。
【００１６】
具体的には、前記観察対象物と前記反射面との距離ｄが下記式（２）
ｄ＞Ｆ／（４ｔａｎ（ｓｉｎ^−１ＮＡ）） …（２）
（式中、ｄは観察対象物と反射面との距離を表し、Ｆは光学系の視野径を表し、ＮＡは光学系の開口数を表す。）
を満たすように、前記観察対象物を前記観察器具に収納するようにしてもよい。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の一実施形態について、図面を参照して説明する。まず、本発明を適用した第１実施形態にかかる観察器具について説明する。
【００１８】
本発明の観察器具は、顕微鏡を用いて細胞等を反射光で観察乃至検出するための器具であり、細胞等を収納する部分、即ち観察対象物収納部を備えるものである。そして、少なくとも、この観察器具が観察する波長域の光を反射する面、即ち、ミラー面（反射面）を形成する面を有する。
【００１９】
本発明に関わる観察器具の構造の一例を図１〜図６に示す。なお、図中、矢印Ｘは、対物レンズにより、Ｘ方向から観察対象物を観察することを示す。
【００２０】
図１（Ａ）に示す観察器具において、１はガラス、プラスチック、金属、シリコンウエハ等から構成される構造体であり、２が細胞等の観察対象物を収納する窪みである。収納部２の底面３には、観察する波長域の光を反射するミラーが設けられている。反射面を構成するミラーとしては、ガラス、プラスチック、金属等に銀メッキやクロムメッキ等の金属メッキを施し、或いは金属箔を接着してミラー面を形成したものが挙げられる。また、金属、シリコンウエハ等の、それ自身が鏡面加工可能な物質で構造体１を構成し、窪みを設ける加工の際に、そのまま底面がミラーを形成するもの、窪みを設けた後、窪みの底面をミラー加工するもの等を挙げることができる。ここで、少なくとも底面３がミラーでればよく、構造体の表面全体がミラーであっても良い。
【００２１】
シリコンウエハで図１（Ａ）の構造体１を構成する場合は、シリコンウエハを例えば、機械研磨、化学エッチング等の常法により加工して、細胞を収納する窪みを形成することにより作製することができる。例えば、図１（Ａ）の場合は、３のミラーは、シリコンウエハの底面が鏡面状態を呈することにより形成されるている。なお、前述した窪みの形成工程によっては底面が十分な鏡面状態を呈し得ない場合には、必要に応じて、更に、窪みの底面を鏡面仕上げとする加工を施しても良い。
【００２２】
大きさは、通常の顕微鏡で使用できるサイズであれば足りる。収納部の深さは、例えば、細胞の顆粒構造を詳細に観察するためには、細胞がほぼ一層に並ぶ深さであることが望ましい。例えば、収納部は深さが１〜１００μｍ、円形の場合は径１〜５ｍｍあれば充分であるが、これに限られることなく、必要に応じて適宜のサイズを選ぶことができる。
【００２３】
なお、構造体１の材質としては、それ自体が鏡面（反射面）加工が可能なもの、めっき等により反射面を形成可能なものであればよい。例えば、ガラス、石英等の無機化合物；ポリスチレン、メタクリル樹脂、ポリプロピレン、ポリエチレン、塩化ビニル、ポリフェニレンエーテル、ポリフェニレンスルフィド等のプラスチック；ステンレススチール、アルミニウム、青銅等の金属や合金；セラミックス等の非金属無機材料を用いることができる。
【００２４】
図１（Ｂ）に示す観察器具は、例えばガラス、プラスチック等で構造体１を構成し、収納部２を設ける。さらに、収納部２の底面４に、表面が平滑で、かつ高反射率の材料の反射層を形成する。例えば、シリコンウエハの箔乃至膜を接着したり、銀メッキ等を施す。
【００２５】
図１（Ｃ）に示す観察器具は、対物レンズに対向することになる面の反対面４１に反射面を設けたことを特徴とする。構造体１は、観察する波長域の光を透過する材質で構成される。例えば、ガラス、石英等の無機化合物、ポリスチレン、メタクリル樹脂、ポリプロピレン、ポリエチレン、塩化ビニル、ポリフェニレンエーテル、ポリフェニレンスルフィド等のプラスチック等で構成される。この観察器具によれば、収納部を洗浄する場合等においても反射面を傷つけることがなく、反射面の維持が容易である
４１の反射面は、構造体１の材質に合わせて、めっき加工することにより形成できる。めっきは、表面が平滑となり、かつ反射率の高い材料、例えば銀等の金属のめっきが挙げられる。
【００２６】
図２（Ａ）に示す観察器具は、光を透過する構造体１と、構造体４０のとの間に反射面が設けてある。この観察器具は、構造体１の収納部２の反対面に、反射面が形成された構造体４０をはり合わせて作成できる。この観察器具は、構造体１と構造体４０との加工を別に行い、最後に結合させて作成されるで作成が容易である。構造体１と構造体４０は、例えば、バルサム、光硬化型合成樹脂接着剤等の光学接着剤等で接着してもよい。また、接着剤等を使用しないで、観察時に構造体１と構造体４０を重ねて合わせて用いるようにしてもよい。重ね合わせて用いる場合は、クリップ等の固定器具で、構造体１と構造体４０を重ねて挟持し固定して用いることができる。
【００２７】
図２（Ｂ）に示す観察器具は、図２（Ａ）に示す観察器具に類似するが、光を透過する構造体４０の対物レンズに対向することになる面と反対の面４３に反射面を設けている点が異なる。構造体１は、光を透過する材質で構成される。この観察器具によれば、構造体４０の厚さを調節することで、容易に、観察対象物の位置と反射面との距離を調節することができる。
【００２８】
本実施形態の観察器具を、細胞の観察に使用するには、収納部に細胞を培養液と共に入れ、図３（Ａ１）に示すようにカバーグラス（図３の５）で覆い、対物レンズに可視光を導入する照明装置を用い、通常の顕微鏡で観察乃至検出するか、又は対物レンズに結合させたＣＣＤカメラを用いてモニターする。可視光を導入する照明装置としては、例えばユニバーサル照明装置として市販されている日本光学製「ニコンＥＰＩ−Ｕ」などを使用することができる。
【００２９】
なお、図３（Ａ１）ではカバーグラス５が構造体１の上部に設置された場合を示しているが、図３（Ａ２）に示すように、全体を上下逆向きにして、下方から観察するという使用の仕方もできる。
【００３０】
また、図３（Ｂ）（Ｃ）のような観察器具であってもよい。図３（Ｂ）の観察器具は、観察対象物を収納部２の窪みに入れた後、対物レンズに対向する面４４に反射面を有する構造体４０で収納部２をカバーできるように構成されている。
【００３１】
また、図３（Ｃ）の細胞観察器具は、光を透過する構造体４０の対物レンズに対向する面の反対面４５にミラー面が設けられている。この観察器具によれば、構造体４０の厚さを調節することで、観察対象物の位置と反射面との距離を容易に変化させることができる。
【００３２】
また、本実施形態の観察器具は、図４（Ａ）に示すように、観察対象物を注入する注入口６を設け、カバーグラス５の上に構造体１を載せて使用することができる。この場合、観察は下方向から行う。例えば、細胞を培養液とともに、注入口６から注入することができて、観察操作が簡便となる。
【００３３】
また、本実施形態の観察器具を用いて観察する場合、観察対象物、例えば、細胞はガラス面に接着している必要はなく、浮遊状態、例えば液体中を流れている状態の細胞を観察することもできる。即ち、図４（Ｂ）（Ｃ）に示すように、構造体１に液体が通過できるように、穴７、８を設け、一方の穴から細胞を含む液体を流し、流れの中における細胞の状態を観察することもできる。この目的のためには、図６に示すように、細胞収納部９を有する透明なチューブ１２の内壁１１に反射面を形成させたものであっても良い。
【００３４】
上記説明した観察器具は、必要に応じて、収納部に、図５に示すように、目盛りを刻んで、細胞等の算定ができるようにすることもできる。この場合でも、本実施形態の観察器具によれば、微小透明物体をコントラストよく観察できるので、算定が容易となる。
【００３５】
本実施形態の細胞観察器具を用いると、通常の光学顕微鏡を用いて肉眼により観察する場合、又は通常のレンズとＣＣＤカメラを用いたモニターにより観察する場合において、細胞、例えば好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、リンパ球等の血液細胞やその他の動物細胞、或いは植物のプロトプラスト等を、顆粒成分まで含めて鮮明な映像として細胞を観察することができ、従来のように、位相差顕微鏡の如き特殊な装置を使用する必要がない。
【００３６】
次に、本発明を適用した第２実施形態として、上記で説明した細胞観察器具を用いた観察方法について、さらに詳しく説明する。
【００３７】
本発明の観察方法は、細胞等の微小透明物体をコントラスト良く観察できることを特徴とする。ここで、本発明にかかる観察方法について説明する前に、本発明の観察方法によって微小透明物体をコントラスト良く観察できることに関する原理について簡単に説明する。
【００３８】
従来の透過観察顕微鏡において、観察対象物の像のコントラストのつきかたは、図１７に示すようになる。すなわち、媒質１０１中にある観察対象物１０２を照明光の入射波面１０３が透過すると、媒質１０１と物体１０２の屈折率が異なることにより、観察対象物１０２を射出した射出波面１０４は変形を受ける。射出波面の微小要素１０５は、それぞれの波面に垂直な方向に進行する。従って、変形を受けた射出波面の微小要素１０５は、入射波面１０４の進行方向とは異なる方向に進行する。対物レンズ１０６は、開口数で示されるある一定の角度範囲の波面で物体像を形成する。観察対象物１０２の周辺部分などによって強く変形を受けた射出波面の微小要素１０５の一部が、対物レンズ１０６の開口数で示される角度範囲から外れて進行すると、像の一部に影が発生し、観察対象物１０２がコントラストを伴って結像することになる。但し、例えば培養液中の細胞など、物体１０２と媒質１０１の屈折率に差があまりない場合は、変形を受けた射出波面の微小要素１０５も対物レンズ１０６の開口数で示される角度範囲内で進行するため、物体像に明暗のコントラストがほとんどつかない。従って、通常の透過観察顕微鏡では、培養液中の細胞の像は観察しづらかった。
【００３９】
これに対し、本発明の観察方法において、観察対象物の像のコントラストのつき方は、図１０に示すようになる。すなわち、反射面２０７に近接した物体２０２を落射照明で観察することにより、入射波面２０３は観察対象物２０２を一度透過した後反射面２０７により反射され、更にもう一度観察対象物２０２を透過する。入射波面２０３が観察対象物２０２を二度透過することにより形成された射出波面２０４は、従来の透過観察顕微鏡における場合の２倍の変形を受けることになる。従来の透過観察顕微鏡においては、射出波面の微小要素２０５の一部は対物レンズ２０６の開口数で示される角度範囲内で進行していたが、本発明の観察方法によれば、その範囲から外れて進行するようになり、観察対象物の像上に影を形成する。したがって、従来の透過観察顕微鏡よりも像に明暗のコントラストがつきやすくなる。そして、通常の透過観察顕微鏡では観察しづらかった培養液中の細胞でも、コントラスト良くはっきりと観察することが可能となる。
【００４０】
以下に、本発明の第２の実施形態について、図面を参照して説明する。
【００４１】
図７は、本発明の一実施形態が適用された観察装置の概略図である。図示するように、本実施形態の観察装置は、落射観察顕微鏡３１１と、底面にミラーコーティング３０７の施された培養皿３１２とを有する。
【００４２】
落射観察顕微鏡３１１は、鏡筒３１５と、ステージ３１７と、光源部３１３と、落射投光管３１４と対物レンズ３０６と、これらを一体に支持する鏡基３１６とから構成される。ステージ３１７は、その上面に培養皿３１２を設置できるようになっている。ステージ３１７は、合焦ノブ３１８を回動することにより、上下方向に変移可能に鏡基３１６と連結されている。
【００４３】
図８に、落射観察顕微鏡３１１の光学系の構成を示す。図８に示すように、光学系は、照明光を発生するための光源８１３と、光源８１３から発した照明光の進行方向をそろえるためのコリメートレンズ８４１と、進行方向がそろった照明光の進行方向を鉛直方向に偏向するための半透鏡８４２と、照明光を観察する物体を含む標本８０８上に集光するとともに標本８０８を拡大投影する為の対物レンズ８０６と、標本８０８の像を像面８４５に結像する為の結像レンズ８４６と、標本８０８を一度透過した照明光を反射して戻す為の反射面８０７をもつミラー８４９とから構成される。
【００４４】
結像レンズ８４６は鏡筒３１５に格納されている。光源８１３は光源部３１３に、コリメートレンズ８４１及び半透鏡８４２は落射投光管３１４に格納されている。
【００４５】
以上のように構成される観察装置を用いて、観察対象物を観察する場合、以下のようにする。
【００４６】
図９に示すように、観察器具の収容部に、培養液３０１とともに観察対象物（例えば細胞３０２）を入れる。培養皿３１２をステージ３１７の上面に設置する。光源３１３からの照明光の明るさを、適宜調節する。合焦ノブ３１８を回動させることによりステージ３１７を上下方向に変移させて、焦点をあわて観察する。
【００４７】
本実施形態の観察方法においては、観察対象物と前記反射面との距離ｄが下記式（１）を満たすのが好ましい。
【００４８】
ｄ≦Ｗ／（２ＮＡ^２） …（１）
（式中、ｄは観察対象物と反射面との距離を表し、Ｗは観察に用いる光の波長を表し、ＮＡは光学系の開口数を表す。）
観察対象物と反射面との距離ｄは、媒質の密度を調節することで調整できる。例えば、観察対象物が媒質よりも密度が高ければ、重力作用により自動的に観察対象物は培養皿３１２の底部に沈殿し、そこにある反射面と近接することとなる。
【００４９】
なお、上記式を満たすことで、コントラスト良く観察できることに関する原理については、以下のように説明することができる。上記式を満たす場合、観察対象物は、観察する光学系の焦点深度の約半分以内の距離で、反射面に近接して設置されることになる。そして、一度観察対象物を透過した入射波面が、ほぼ形を崩さずに再び観察対象物を通過することになる。これにより、特に観察対象物の端において射出波面がはっきりと折れ曲がるようになる。したがって、観察対象物の像をコントラスト良く観察できる。以下に、より詳しく、シミュレーションを用いて説明する。
【００５０】
図１１は、細胞３０２を、直径４μｍ、高さ２μｍの回転楕円体であるとして、細胞３０２の屈折率を１．４とし、培養液３０１の屈折率を１．３３とした計算モデルを用いた場合の、結像シミュレーションを行った結果を示す。なお、図１１は結像のスケッチ図である。ここで、５２１は中心線、５２２は中心線上の強度分布、５２３は細胞３０２の結像である。観察に用いる光の波長は、５５０ｎｍとした。本シミュレーションにおいては、落射照明光が往復２回細胞３０２を透過することにより、図１１（ｂ）に示したとおり、細胞３０２の輪郭を明暗のはっきりとしたコントラストで観察することができる。一方、同じ条件の細胞３０２を、従来の透過観察方法により観察した場合の結像シミュレーションを行った結果は、図１１（ｃ）に示したとおり、細胞３０２の輪郭がはっきりとしない。
【００５１】
但し、細胞３０２とミラーコーティング３０７の距離が離れると、細胞像のコントラストが低下する。本実施例における、観察光学系の焦点深度Δは、以下の式で求まる。
【００５２】
Δ＝Ｗ／ＮＡ^２＝０．５５μｍ／０．４５２＝２．７μｍ
（式中、Ｗは使用する光の波長を表し、ＮＡは落射観察顕微鏡３１１に装着されている対物レンズ３０６の開口数を表す。）
すなわち、焦点深度Δの半分は約１．４μｍである。図１２（ｂ）〜（ｆ）に、図１２（ａ）に示すように、細胞３０２とミラーコーティング３０７の間の距離ｄを変えた計算モデルを用いた結像シミュレーションの結果を示す。距離ｄは、（ｂ）１μｍ、（ｃ）１．２μｍ、（ｄ）１．４μｍ、（ｅ）１．６μｍ、（ｆ）１．８μｍである。図に示すように、距離ｄが１μｍから離れるに従って、細胞３０２の輪郭のコントラストが低下し、距離ｄが１．４μｍを越えるとほとんど見えなくなることを示している。
【００５３】
以上より、細胞３０２とミラーコーティング３０７の間隔は、焦点深度Δの約半分以下であることが好ましいことが分かる。
【００５４】
また、本実施形態の一例においては、観察対象物と反射面との距離ｄが、以下の式（２）を満たすのが好ましい。
【００５５】
ｄ＞Ｆ／（４ｔａｎ（ｓｉｎ^−１ＮＡ）） …（２）
（式中、ｄは観察対象物と反射面との距離を表し、Ｆは観察対象物を観察する光学系の視野径を表し、ＮＡは観察対象物を観察する光学系の開口数を表す。）
図３（Ａ２）のように観察器具を用いる場合は、観察対象物は、重力によってカバーグラス５上に位置することになるので、収納部２の窪みの深さａを加工により調節することで、観察対象物と反射面との距離ｄを調節できる。
【００５６】
また、図１（Ｃ）の観察器具等の場合は、収納部の窪みの深さを加工により調節し、窪みの底面と反射面との距離を調節することにより、観察対象物と反射面との距離を調節できる。図２（Ｂ）の観察器具等の場合は、構造体４０の厚さを調節することで、観察対象物と反射面との距離を調節できる。
【００５７】
また、観察対象物と反射面との距離ｄは、媒質の密度を調節することで調整できる。例えば、観察対象物が媒質よりも密度が小さければ、自動的に観察対象物は培養皿３１２の底部から離れ、そこにある反射面と一定の距離をとることとなる。
【００５８】
なお、上記数式２を満たすことで、コントラスト良く観察できる原理については、以下のように説明することができる。上記数式２を満たすと、反射面が、観察対象物よりある程度遠ざかることになる。実質的に照明光の開口数が低下することになる。したがって、物体をコントラスト良く観察できる。
【００５９】
より具体的には、図１３に示すように、対物レンズ１００６の焦点位置にある物体１００２を、物体１００２から距離ｄ離れた位置に反射面１００７を持つミラー１０４９を配置して、落射照明で観察する場合を考える。対物レンズ１００６より直接物体１００２近傍を照明する照野１００９は、対物レンズ１００６またはそれを含む観察光学系の仕様により、直径Ｆに制限されている。対物レンズ１００６から射出し、物体１００２近傍を一度透過して、反射面１００７で反射し、再び物体１００２を照明する照明光は、反射面１００７の鏡像作用により、あたかも照野１００９の鏡像１００９’が光源面となって物体１００２を照明しているように見える。この場合、物体１００２から見た照明光の最大の角度θｉ＿ｍａｘは、次の式で与えられる。
【００６０】
ｔａｎθｉ＿ｍａｘ＝Ｆ／（４ｄ） …（３）
したがって、物体１００２に対する実質的な照明光の開口数ｓｉｎθｉ＿ｍａｘは、
ｓｉｎθｉ＿ｍａｘ＝ｓｉｎ（ｔａｎ^−１Ｆ／（４ｄ）） …（４）
の式で与えられる。これが、対物レンズ１００６の開口数ＮＡよりも小さい条件
ＮＡ＞ｓｉｎθｉ＿ｍａｘ …数式５
つまり、
ｄ＞Ｆ／（４ｔａｎ（ｓｉｎ^−１ＮＡ）） …（２）
ならば、実質的な照明光の開口数は、対物レンズの開口数ＮＡよりも小さいことになり、物体１００２の観察像のコントラストが向上することとなる。
【００６１】
照明光の開口数が、対物レンズの開口数よりも小さい場合に、物体の観察像のコントラストが向上する様子を計算したシミュレーション例を、図１４を用いて説明する。図１４（ａ）は、直径５μｍ、厚さ２μｍの回転楕円体の形状をした細胞１１０２が、培養液１１０１の中にある計算モデルを示す。細胞の屈折率を１．４、培養液の屈折率を１．３３とした。照明光の波長は５５０ｎｍとした。対物レンズの開口数は０．４５であるとした。図１４（ｂ）〜（ｆ）は、照明光の開口数が対物レンズの開口数の、（ｂ）１００％，（ｃ）８０％，（ｄ）６０％，（ｅ）４０％，（ｆ）２０％であるときの、計算例を示す。照明光の開口数が、対物レンズの開口数よりも小さくなるにつれ、物体像のコントラストが向上していることが分かる。
【００６２】
次に本発明を適用した第３の実施形態である微小流路観察装置について説明する。第３実施形態にかかる微小流路観察装置は、観察対象物収容部に特徴があり、細胞の移動の観察に適している。
【００６３】
観察対象物収容部は、図１５に示すように、微小流路６１２を有する。微小流路６１２は、シリコン基板６３１に構築されている。本実施形態では、観察対象物を不図示の倒立型落射照明顕微鏡により下方から観察する。図１５中、６０６は、対物レンズを示す。
【００６４】
微小流路６１２には、入口６３２が１つと、出口６３３が３つ設けられている。入口６３２と出口６３３は、微小流路６１２内部でつながっている。微小流路６１２は、半導体製造技術を用いて、シリコン基板上に酸化シリコン６３４によるパターン形成を行い、そのパターンを覆うようにガラス板６３５で蓋をすることにより製造される。
【００６５】
なお、酸化シリコン６３４の膜厚は、細胞６０２の厚さとほぼ同じに形成されている。したがって、細胞６０２が微小流路６１２を通過する際は、細胞６０２はシリコン基盤の表面６０７にほぼ接した状態となり、細胞６０２の輪郭が常にコントラスト良く観察されるようになっている。
【００６６】
なお、この微小流路６１２の入口６３２に接して、細胞溜めの部分を形成し、微小流路６１２に流す細胞６０２を一時的に溜めておくようにしてもよい。その場合、細胞溜め部分のシリコン基盤に深く穴をあけることにより、その部分で反射面として作用するシリコン基盤の表面が、ガラス板６３５から遠く離れるようにしておく。このようにすると、この細胞溜めの部分においては、実質的な照明光の開口数が低くなるので、細胞溜めの中にある細胞６０２をコントラスト良く観察することができる。
【００６７】
また、微小流路６１２には、図に示すように、電圧制御装置６５０、可変電圧発生装置６６０および二つの電極６６５からなる電界発生装置が取り付けてある。二つの電極６６５は、微小流路６１２の側面に取り付けられており、電気的に接続された可変電圧装置６６０で発生した電圧を微小流路６１２側面に印加することにより、微小流路内部に電界を発生させる。可変電圧発生装置６６０は、電気的に電圧制御装置を接続しており、図示されてていない倒立型落射顕微鏡による細胞６０２の観察方法に基づいて、可変電圧発生装置６６０で発生させる電圧を制御し、細胞６０２の進行方向を三つある出口６３３のうちどれかに向かうように振り分ける。複数の細胞６０２が、入口６３２より順に微小流路６１２内に流入し、対物レンズ６０６を通して落射観察される。シリコン基盤の表面６０７が反射面として作用し、微小流路６１２内の細胞６０２は、コントラスト良く観察することができる。この観察された情報に基づいて、電界発生装置は微小流路６１２内の電界強度を切替える。微小流路６１２内の細胞６０２は、内部の電界強度によって進行方向を制御され、３つある出口６３３に仕分けして排出される。
【００６８】
このように、本実施例の微小流路観察装置を用いれば、細胞６０２の観察手段として落射照明顕微鏡を用いた為に、微小流路６１２をシリコン基板６３１上に構築することができる。シリコン基板６３１上の微小流路は、半導体製造技術を用いることができるので、従来のガラス基板上に微小流路を構築する場合に比較して、安価で大量に生産することができる。更に、従来の特殊顕微鏡を用いた観察方法に比較して、透過照明装置が不要となり、微小流路６１２を保持するステージが簡略化されるなど、観察装置全体を小型化するとともに、安価で構築することが可能となる。
【００６９】
なお、上記第３の実施形態においても、第２の実施形態で説明したように、観察対象物と反射面（鏡面）との距離が、式（１）及び式（２）を満たすようにするのが好ましい。
【００７０】
以上、本発明の実施形態について説明した。
【００７１】
上記実施形態においては、従来は非常に観察しづらい微小透明物体をコントラスト良く観察することができる。
【００７２】
また、上記実施形態によれば、透過照明の為の光学系が必要ないため、観察装置全体の小型化が図れるという利点がある。また、物体の移動が困難な場合でも観察装置全体の移動により、容易に物体観察部位の調整ができるという利点がある。
【００７３】
上記実施形態によれば、容器内に反射面を設けたことにより、物体が反射面に近接する状態を容易に実現できる。また、シャーレの底面に反射面を設けて、そのシャーレの中に観察する物体を含む媒質を注入した場合、物質が媒質よりも密度が高ければ、重力作用により自動的に物質はシャーレの底部に沈殿し、そこにある反射面と近接することとなる。
【００７４】
なお、本発明は、上記の実施態様に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々の変形が可能である。
【００７５】
【実施例】
図１８に、図３（Ａ２）で示す観察器具を用いて、下方から細胞を観察し撮影した場合の写真を示す。構造体１は、シリコンウエハで構成されており、カバーグラス５と反射面との距離ａが、５μｍである観察器具を使用した。また、撮影条件は以下の通りである。
【００７６】
撮影機器：ＣＣＤデジタルビデオカメラＣＬ−２１１ Ｈ （Ｗａｔｅｃ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏ．， Ｌａｓ Ｖｅｇａｓ， Ｎｅｖ）
照明装置：ＥＰＩ−Ｕ （Ｎｉｋｏｎ， Ｋａｗａｓａｋｉ， Ｊａｐａｎ）
対物レンズ：×２０
培養液：ＲＰＭＩ １６４０緩衝液に２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び０．１％ウシ血清アルブミンを加えたものを使用
細胞：好酸球
ヒト血液中の顆粒球分画に対して、抗ＣＤ１６抗体が結合した磁気ビーズによるネガティブ・セレクションにより精製した好酸球を使用した。なお磁気ビーズにはＤｙｎａｌ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ （Ｄｙｎａｌ Ａ． Ｓ．， Ｏｓｌｏ， Ｎｏｒｗａｙ） を用い、製品に付属の使用方法に従って操作した。
【００７７】
図１８に示すように、微小な透明物体である好酸球細胞および細胞内顆粒が、コントラストよく観察できたことが分かる。
【００７８】
【発明の効果】
本発明によれば、細胞等の透明な微小物体を、特殊な光学手段なしで、コントラスト良く観察することができる。
【００７９】
すなわち、本発明の細胞観察器具を用いると、通常の光学顕微鏡又は通常レンズとＣＣＤカメラを用いたモニターにより、細胞、例えば好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、リンパ球等の血液細胞やその他の動物細胞、或いは植物のプロトプラスト等において、顆粒成分まで含めて鮮明な映像として細胞を観察することができ、従来のように、位相差顕微鏡の如き特殊な装置を使用する必要がない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１（Ａ）〜（Ｃ）は第１の実施形態にかかる観察器具の断面図である。
【図２】図２（Ａ）（Ｂ）はミラー面を有する構造体４０を有する観察器具の断面図である。
【図３】図３（Ａ１）〜（Ｃ）は収納部を覆うカバーを有する観察器具の断面図である。
【図４】図４は第１の実施形態にかかる観察器具の他の使用例であり、（Ａ）はカバーグラス上に構造体１を載せた場合の断面図である。（Ｂ）は、液体が通過できる穴を設けた場合を示す概念図の断面図である。（Ｃ）は、（Ｂ）の観察器具の斜視図である。
【図５】図５は収納部に目盛りを刻んだ観察器具の一例の上面図である。
【図６】図６（Ａ）は全体がチューブの形をした観察器具の断面図である。（Ｂ）は（Ａ）の点線ＡＢ方向の断面図である。
【図７】図７は第２実施形態の観察装置の構成を表す図である。
【図８】図８本発明の観察法の光学系の構成を表す図である
【図９】図９は培養皿と培養細胞を表す図である。
【図１０】図１０は本発明による物体のコントラストのつき方を示した図である。
【図１１】図１１（ａ）は、第２実施形態における結像シミュレーションの計算モデルを表す図である。図１１（ｂ）及び（ｃ）は、結像シミュレーションの計算結果を表す図である。
【図１２】図１２（ａ）は第２実施形態における結像シミュレーションの計算モデルを表す図である。図１２（ｂ）〜（ｆ）は、細胞３０２とミラーコーティング３０７の距離が１．０μｍ、１．２μｍ、１．４μｍ、１．６μｍ及び１．８μｍであるときの結像シミュレーションの計算結果を表す図である。
【図１３】図１３は反射面による照明光の開口数の低下を表す図である。
【図１４】図１４（ａ）は照明光の開口数が対物レンズの開口数よりも小さい場合の物体像のシミュレーション例に用いた計算モデルを示す図である。図１４（ｂ）〜（ｆ）は、照明光の開口数が、対物レンズの開口数の１００％、８０％、６０％、４０％及び２０％である場合の結像シミュレーションの計算結果を表す図である。
【図１５】図１５は第３実施形態の微小流路観察装置の構成を表す図である。
【図１６】図１６は従来の特殊観察法の光学系の構成を表す図である
【図１７】図１７は従来の透過観察顕微鏡における物体のコントラストのつきかたを表す図である。
【図１８】図１８は、図３（Ａ２）に示す観察器具を用いて、好酸球細胞を観察したときに撮影した写真である。
【符号の説明】
１…ガラス等の構造体、プラスチックス、金属、シリコンウエハ等で形成された構造体
２…細胞収納部、３…ミラーを形成する面、４…金属メッキ、金属やシリコンウエハの箔等のミラー、５…カバーグラス、６…細胞注入口、７，８…液体が通過できる穴、９…チューブで構成される細胞収納部、１０…透明な中部の内面、１１…ミラーが形成されているチューブの内面、１２…チューブ、１５…目盛り、４０…ガラス等の構造体、４１〜４５…反射面が形成されている面
１０１，２０１…媒質、１０２，２０２，１００２…物体、１０３，２０３…入射波面、１０４，２０４…射出波面、１０５，２０５…射出波面の微小要素、１０６，２０６，３０６，６０６，７０６，８０６，１００６…対物レンズ、２０７，８０７，１００７…反射面、３０１，１１０１…培養液、３０２，６０２，１１０２…細胞、３０７…ミラーコーティング、３１１…落射観察顕微鏡、３１２…培養皿、３１３，７１３，８１３…光源、３１４…落射投光管、３１５…鏡筒、３１６…鏡基、３１７，７１７…ステージ、３１８…合焦ノブ、５２１…中心線、５２２…中心線上の強度分布、５２３…細胞の結像、５２４…中心線、５２５…中心線上の強度分布、５２６…細胞の結像、６０７…シリコン基盤の表面、６１２…微小流路、６３１…シリコン基盤、６３２…入口、６３３…出口、６３４…酸化シリコン、６３５…ガラス板、７０８，８０８…標本

Claims (16)

1. ミラーを有する観察対象物収納部を備えた観察器具。
2. 対物レンズを有する光学系を介して落射照明光により照明して観察対象物を観察する観察方法において用いられる観察対象物収納用の観察器具であって、
   観察時に前記落射照明光を反射する反射面が設けられていることを特徴とする観察器具。
3. 請求項２に記載の観察器具であって、
   前記反射面は、観察時に対物レンズに対向することになる面に設けられていることを特徴とする観察器具。
4. 請求項２に記載の観察器具であって、
   前記反射面は、観察時に対物レンズに対向することになる面の反対面に設けられていることを特徴とする観察器具。
5. 請求項２〜４のいずれか一項に記載の観察器具であって、
   前記観察対象物が通過する流路が設けられていることを特徴とする観察器具。
6. 請求項２〜５のいずれか一項に記載の観察器具であって、
   前記観察対象物を収納する収納部に、観察対象物を含む液体を注入する口と、流出させる口とを備えていることを特徴とする観察器具。
7. 対物レンズを有する光学系を介して落射照明光により照明して観察対象物を観察する観察方法であって、
   前記観察対象物を収納する観察器具には、観察時に前記落射照明光を反射する反射面が設けられており、
   前記観察器具に観察対象物を収納し、前記観察対象物を観察する、ことを特徴とする観察方法。
8. 請求項７に記載の観察方法であって、
   前記反射面は、観察時に対物レンズに対向することになる面に設けられていることを特徴とする観察方法。
9. 請求項７に記載の観察方法であって、
   前記反射面は、観察時に対物レンズに対向することになる面の反対面に設けられている
   ことを特徴とする観察方法。
10. 請求項７〜９のいずれか一項に記載の観察方法であって
    前記観察対象物は、微小透明体であることを特徴とする観察方法。
11. 請求項７〜１０のいずれか一項に記載の観察方法であって、
    前記観察器具は、液体を保持できる容器を有し、
    前記容器に、観察対象物を内包する液体とともに収納する、
    ことを特徴とする観察方法。
12. 請求項１１に記載の観察方法であって、
    前記観察対象物は、細胞であり、
    前記液体は、培養液である、ことを特徴とする観察方法。
13. 請求項７〜１２のいずれか一項に記載の観察方法であって、
    前記観察対象物と前記反射面との距離が、前記光学系の焦点深度の半分以下になるように、前記観察対象物を前記観察器具に収納することを特徴とする観察方法。
14. 請求項７〜１３のいずれか一項に記載の観察方法であって、
    前記観察対象物と前記反射面との距離ｄが下記式（１）
    ｄ≦Ｗ／（２ＮＡ^２） …（１）
    （式中、ｄは観察対象物と反射面との距離を表し、Ｗは観察に用いる光の波長を表し、ＮＡは光学系の開口数を表す。）
    を満たすように、前記観察対象物を前記観察器具に収納する、
    ことを特徴とする観察方法。
15. 請求項７〜１４のいずれか一項に記載の観察方法であって、
    前記観察対象物に対する照明光の開口数が、対物レンズの開口数より小さくなるように、前記観察対象物を前記観察器具に収納する、
    ことを特徴とする観察方法。
16. 請求項７〜１５のいずれか一項に記載の観察方法であって、
    前記観察対象物と前記反射面との距離ｄが下記式（２）
    ｄ＞Ｆ／（４ｔａｎ（ｓｉｎ^−１ＮＡ）） …（２）
    （式中、ｄは観察対象物と反射面との距離を表し、Ｆは光学系の視野径を表し、ＮＡは光学系の開口数を表す。）
    を満たすように、前記観察対象物を前記観察器具に収納する、
    ことを特徴とする観察方法。

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