JP7345070B2 - キラルジアミン化合物の合成方法 - Google Patents

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Description

本発明はキラルジアミン化合物の合成分野に関し、具体的にはキラルジアミン化合物の合成方法に関する。
キラルジアミン化合物は、多くの生物学的活性を有する天然産物および薬物分子、例えばオルニチン、リジン、ビタミンＨ、薬物レバミゾールなどに広く存在する。オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）分子中にジアミン化合物が存在し、一定の抗腫瘍活性を有する。ジアミン構造を有する化合物も有機合成に広く応用され、それは合成ブロックとして、窒素複素環を有効に構築することができ、またリガンドとして金属と錯体を形成して高度な反応活性を有する触媒を生成することもでき、ジアミン化合物は、液晶材料、航空材料、マイクロ電子などの分野に広く応用される。キラルジアミン化合物は、また、キラル分割試薬としてアルデヒドの鏡像異性体を分割することもできる。このため、キラルジアミンの合成は、化学者の研究の焦点となってきた（非特許文献１）。
現在、キラルジアミン化合物の合成方法には、不斉Ｓｔｒｅｃｋｅｒ反応（非特許文献２）、不斉Ｍｉｃｈｅｌ付加（特許文献１）、アジリジン不斉開環（特許文献２）などの方法があるが、これらの方法は基質の適用範囲と実用性にはいずれも異なる程度の限界があり、これらの方法で構成されるのは、すべて１，２－ジアミン系化合物である。不斉Ｍｉｃｈｅｌ付加およびアジリジン不斉開環は、通常、高価な金属およびキラル触媒を必要とし、これは反応系の使用を大幅に制限する。また、反応には劇毒のアジド化合物やシアノ基化試薬が使用されており、化学経路の廃ガス、廃液、廃棄物の量は非常に多く、取り扱いが困難である。
そのため、従来の方法をどのように改善して、基質への適用範囲を拡げるかというのは、解決すべき技術問題になっている。
中国特許出願公開第１０５３６７４２７号明細書 中国特許出願公開第１０５７５３７５２号明細書
Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．１９９８，３７，２５８０ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，２０１１，１１１，６９４７
本発明の主な目的は、従来技術における方法が基質に対する適用範囲に限界があるという問題を解決するためのキラルジアミン化合物の合成方法を提供することである。
上記目的を達成するために、本発明は、キラルジアミン化合物の合成方法を提供し、該合成方法は、トランスアミナーゼを利用して式Ｉで表される基質をキラルジアミン化合物に変換することを含み、
Figure 0007345070000001
 式Ｉ
式中、ｎ＝１～１０であり、Ｒ基は、アルキル基、シクロアルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基、ヘテロ原子含有シクロアルキル基、ヘテロ原子含有アリール基、アミド類化合物残基またはエーテル類化合物残基であり、ここでは、ヘテロ原子は、Ｏ、ＳおよびＮの少なくとも１つであり、Ｒ１、Ｒ２は、同一または異なり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して水素、Ｃ１～Ｃ３アルキルまたはアミノ基保護基であり、トランスアミナーゼは、ＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｏｌａｃｅｕｍＤＳＭ３０１９１（ＣＶＴＡ）（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１１１３５５７３．１）、ＦｏｎｓｅｃａｅａｐｅｄｒｏｓｏｉＣＢＳ２７１．３７（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿０１３２８６２８１．１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｓｕｂｓｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＥｃｌ８（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＣＮ２９５４１．１）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｏｏｄｉｉ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＫＳ３６０００．１）、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１１７４６９７５．１）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｂｒａｓｉｌｉａｎｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＥＪ５５３３４．１）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．ＴＬ３（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１４８８５６７７．１）、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓＮＩＨ２６２４（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿００１２０９３２５．１）、Ｅｘｏｐｈｉａｌａｓｐｉｎｉｆｅｒａ（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿０１６２３３８２１．１）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ（ｓｔｒａｉｎＤＳＭ １１３００）（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１１５３０５４５．１）、Ｇｅｏｍｙｃｅｓｄｅｓｔｒｕｃｔａｎｓ２０６３１－２１（ＧｄＴＡ）ｉｎＥ．ｃｏｌｉ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＬＲ０５５７３．１）、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＫＴ２４４０（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１０９５４５５４．１）、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０２４３６３７４１．１）、ＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＤＳＭ３１９（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１３０８２２１９．１）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＫＰ０７０３０．１）、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓＲ－ＡＴＡｓ（ＡｓｐＦｕｍ）（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿７４８８２１．１）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓｓｕｂｓｐ．ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓＤＳＭ４６５（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿００８８７９４３６．１）、ＣｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａｂａｎｔｉａｎａＣＢＳ１７３．５２（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿０１６６１７９４８．１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１６７６３０２６．１）、ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓＭＳＭＢ１２１（ＢｔＳ－ＴＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＧＫ４９３９９．１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｓｕｂｓｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＭＧＨ７８５７８（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿００２９２０２２６．１）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｔｏｅｂｉｉ（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０６２７５３８９４．１）およびＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＡＭ３７５３３．１）に由来する。
さらに、トランスアミナーゼは配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列を有する。
さらに、アミノ基保護基は、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ホルミル基、トリフルオロアセチル基、ベンジル基、トリチル基および９－フルオレニルメトキシカルボニル基のうちから選択されるいずれか１つである。
さらに、基質は、
Figure 0007345070000002
 のうちから選択されるいずれか１つである。
さらに、合成方法は、リン酸緩衝液とアミノドナーを混合し、第１混合液を得て、第１混合液に式Ｉで表される基質を添加し、第２混合液を得ること、第２混合液にトランスアミナーゼを添加して、反応混合液を得ること、反応混合液からキラルジアミン化合物を分離して得ること、を含む。
さらに、第１混合液に基質を添加する前に、合成方法は、第１混合液のｐＨ値を７．０～９．０に調整することをさらに含み、好ましくは、第２混合液にトランスアミナーゼを添加し、かつトランスアミナーゼを添加した第２混合液のｐＨを７．０～９．０に調整して、反応混合液を得る。
さらに、反応混合液からキラルジアミン化合物を分離して得ることは、反応混合液の酸性度を調整してトランスアミナーゼを変性させることを含み、好ましくは、反応混合液のｐＨ値を１～２に調整し、変性後のトランスアミナーゼを濾過除去して予備濾液を得ること、予備濾液のｐＨ値をアルカリ性に調整して、アルカリ性濾液を得て、アルカリ性濾液を抽出して、キラルジアミン系化合物を得て、好ましくは、アルカリ性濾液のｐＨ値は、１２～１３であり、好ましくは、抽出は、複数回であり、より好ましくは、２～５回であり、より好ましくは、ジクロロメタンを用いて初回目の抽出を行い、その後、ジクロロメタンまたは酢酸エチルを用いて残りの回数の抽出を行う。
さらに、抽出後に抽出した有機相を乾燥するステップをさらに含み、好ましくは、毎回の抽出で得られた有機相を合わせて抽出物を得て、抽出物を乾燥して、乾燥した有機相生成物を得て、乾燥した有機相生成物を、温度＜４５℃、圧力≦－０．０８Ｍｐａの条件で留分なしまでに濃縮して、キラルジアミン系化合物を得る。
さらに、トランスアミナーゼと基質の質量比は０．４：１～１．０：１である。
さらに、基質の濃度は６０ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌである。
さらに、アミノドナーは、イソプロピルアミン、イソプロピルアミンの塩酸塩、アラニン、フェネチルアミンまたはｎ－ブチルアミンから選択される。
本発明の技術案を応用し、トランスアミナーゼを用いて式１に示される基質に特異性を有し、このような基質のキラルジアミン化合物への変換を効果的に触媒することができ、かつ、該トランスアミナーゼの複数種の式１に示される基質に対する反応選択性と活性はいずれも高い。したがって、該生物酵素を利用してキラルジアミン化合物を触媒合成することは、より広範な基質（従来技術反応で得られたものは、いずれも１，２－ジアミン系化合物であるが、本出願では１，３－ジアミン、１，４－ジアミンなどの化合物を合成することもできる。）に適用するだけでなく、この合成方法は、経路が短く、製品収率が高く、生産コストを大幅に削減させ、有機溶媒と廃ガス、廃液、廃棄物の生成を減少させる。
本出願の一部を構成する図面は、本発明のより深い理解を提供するために用いられ、本発明の概略的な実施例およびその説明は、本発明を解釈するために用いられ、本発明の不当な限定を構成するものではない。
本発明の実施例１１における異なる酵素量の同じ量の基質の変換率に対する影響を示す図である。 本発明の実施例１２における同じ酵素量の異なる濃度の基質の変換率に対する影響を示す図である。 本発明の実施例１３における異なるアミノドナーの同じ反応における基質の変換率に対する影響を示す図である。 本発明の実施例１４における異なる供給源のトランスアミナーゼが同じ基質に対していずれも変換活性を有することを示す。
なお、本出願における実施例および実施例における特徴は、矛盾することなく相互に組み合わせてもよい。以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
背景技術で述べたように、従来技術では、キラルジアミン化合物の合成方法が基質に対する適用範囲に限界があるという問題がある。この状況を改善するために、本出願の発明者らは、効率的で環境に優しいという観点から、従来の合成経路を改善しようと試みた。研究過程において、本発明者らは、出願者によって自ら開発されたトランスアミナーゼが、ＰＬＰを補酵素とするトランスアミナーゼが有する、ケトン系化合物を触媒する汎用触媒活性に加えて、さまざまな異なる基質を触媒し、それらをキラルジアミン化合物に変換する活性もある。さらなる研究により、該トランスアミナーゼを使用してキラルジアミン化合物を触媒合成すると、基質の種類が広いだけでなく、一段階反応で目的の生成物を得ることができることがわかった。該トランスアミナーゼを用いた生物学的変換反応の選択性が非常に高いため、目的生成物のｅｅ値が大幅に向上した。また、生物酵素触媒反応を採用して、基質の使用量を向上させ、生産効率を大幅に向上させることができ、有機溶剤と廃ガス、廃液、廃棄物の発生を減少させる。
上記の研究結果に基づいて、出願人は本出願の技術案を提出した。本出願の典型的な実施形態では、キラルジアミン化合物の合成方法を提供し、該合成方法は、トランスアミナーゼを利用して、式Ｉで表される基質を、キラルジアミン化合物に変換することを含み、
Figure 0007345070000003
 式中、ｎ＝１～１０であり、Ｒ基は、アルキル基、シクロアルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基、ヘテロ原子含有シクロアルキル基、ヘテロ原子含有アリール基、アミド類化合物残基またはエーテル類化合物残基であり、Ｒ１、Ｒ２は、同一または異なり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して水素、Ｃ１～Ｃ３アルキルまたはアミノ基保護基であり、該トランスアミナーゼは、ＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｏｌａｃｅｕｍＤＳＭ３０１９１（ＣＶＴＡ）（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１１１３５５７３．１）、ＦｏｎｓｅｃａｅａｐｅｄｒｏｓｏｉＣＢＳ２７１．３７（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿０１３２８６２８１．１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｓｕｂｓｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＥｃｌ８（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＣＮ２９５４１．１）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｏｏｄｉｉ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＫＳ３６０００．１）、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１１７４６９７５．１）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｂｒａｓｉｌｉａｎｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＥＪ５５３３４．１）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．ＴＬ３（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１４８８５６７７．１）、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓＮＩＨ２６２４（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿００１２０９３２５．１）、Ｅｘｏｐｈｉａｌａｓｐｉｎｉｆｅｒａ（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿０１６２３３８２１．１）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ（ｓｔｒａｉｎＤＳＭ１１３００）（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１１５３０５４５．１）、Ｇｅｏｍｙｃｅｓｄｅｓｔｒｕｃｔａｎｓ２０６３１－２１（ＧｄＴＡ）ｉｎＥ．ｃｏｌｉ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＬＲ０５５７３．１）、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＫＴ２４４０（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１０９５４５５４．１）、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０２４３６３７４１．１）、ＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＤＳＭ３１９（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１３０８２２１９．１）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＫＰ０７０３０．１）、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓＲ－ＡＴＡｓ（ＡｓｐＦｕｍ）（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿７４８８２１．１）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓｓｕｂｓｐ．ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓＤＳＭ４６５（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿００８８７９４３６．１）、ＣｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａｂａｎｔｉａｎａＣＢＳ１７３．５２（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿０１６６１７９４８．１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１６７６３０２６．１）、ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓＭＳＭＢ１２１（ＢｔＳ－ＴＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＧＫ４９３９９．１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｓｕｂｓｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＭＧＨ７８５７８（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿００２９２０２２６．１）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｔｏｅｂｉｉ（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０６２７５３８９４．１）とＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＡＭ３７５３３．１）に由来する。
好ましくは、該トランスアミナーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、それぞれは以下のとおりである：
ＭＱＫＱＲＴＣＳＱＷＲＥＬＤＡＡＨＨＬＨＰＦＴＤＴＡＳＬＮＱＡＧＡＲＶＭＴＲＧＥＧＶＹＬＷＤＣＥＧＮＫＩＩＤＧＭＡＧＬＷＣＶＮＶＧＹＧＲＫＤＦＡＥＡＡＲＲＱＭＥＥＬＰＦＹＮＴＦＦＫＴＴＨＰＡＶＶＥＬＳＳＬＬＡＥＶＴＰＡＧＦＤＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＳＶＤＴＭＩＲＭＶＲＲＹＷＤＶＱＧＫＰＥＫＫＴＬＩＧＲＷＮＧＹＨＧＳＴＩＧＧＡＳＬＧＧＭＫＹＭＨＥＱＧＤＬＰＩＰＧＭＡＨＩＥＱＰＷＷＹＫＨＧＫＤＭＴＰＤＥＦＧＶＶＡＡＲＷＬＥＥＫＩＬＥＩＧＡＤＫＶＡＡＦＶＧＥＰＩＱＧＡＧＧＶＩＶＰＰＡＴＹＷＰＥＩＥＲＩＣＲＫＹＤＶＬＬＶＡＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＥＷＦＧＨＱＨＦＧＦＱＰＤＬＦＴＡＡＫＧＬＳＳＧＹＬＰＩＧＡＶＦＶＧＫＲＶＡＥＧＬＩＡＧＧＤＦＮＨＧＦＴＹＳＧＨＰＶＣＡＡＶＡＨＡＮＶＡＡＬＲＤＥＧＩＶＱＲＶＫＤＤＩＧＰＹＭＱＫＲＷＲＥＴＦＳＲＦＥＨＶＤＤＶＲＧＶＧＭＶＬＡＦＴＬＶＫＮＫＡＫＲＥＬＦＰＤＦＧＥＩＧＴＬＣＲＤＩＦＦＲＮＮＬＩＭＴＡＣＧＤＨＩＶＳＡＰＰＬＶＭＴＲＡＥＶＤＥＭＬＡＶＡＥＲＣＬＥＥＦＥＱＴＬＫＡＲＧＬＡ（配列番号１）。
ＭＱＫＱＲＴＣＳＱＷＲＥＬＤＡＡＨＨＬＨＰＦＴＤＴＡＳＬＮＱＡＧＡＲＶＭＴＲＧＥＧＶＹＬＷＤＣＥＧＮＫＩＩＤＧＭＡＧＬＷＣＶＮＶＧＹＧＲＫＤＦＡＥＡＡＲＲＱＭＥＥＬＰＦＹＮＴＦＹＫＴＴＨＰＡＶＶＥＬＳＳＬＬＡＥＶＴＰＡＧＦＤＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＳＶＤＴＭＩＲＭＶＲＲＹＷＤＶＱＧＫＰＥＫＫＴＬＩＧＲＷＷＧＹＨＧＳＴＩＧＧＡＳＬＧＧＦＫＹＭＨＥＱＧＤＬＰＩＰＧＭＡＨＩＥＱＰＷＷＹＫＨＧＫＤＭＴＰＤＥＦＧＶＶＡＡＲＷＬＥＥＫＩＬＥＩＧＡＤＫＶＡＡＦＶＧＥＰＩＱＧＡＧＧＶＩＶＰＰＡＴＹＷＰＥＩＥＲＩＣＲＫＹＤＶＬＬＶＡＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＥＷＦＧＨＱＨＦＧＦＱＰＤＬＦＴＡＡＫＧＬＳＳＧＹＬＰＩＧＡＶＦＶＧＫＲＶＡＥＧＬＩＡＧＧＤＦＮＨＧＦＴＹＳＧＨＰＶＣＡＡＶＡＨＡＮＶＡＡＬＲＤＥＧＩＶＱＲＶＫＤＤＩＧＰＹＭＱＫＲＷＲＥＴＦＳＲＦＥＨＶＤＤＶＲＧＶＧＭＬＬＡＦＴＬＶＫＮＫＡＫＲＥＬＦＰＤＦＧＥＩＧＴＬＣＲＤＩＦＦＲＮＮＬＩＭＤＳＣＧＤＨＩＶＡＡＰＰＬＶＭＴＲＡＥＶＤＥＭＬＡＶＡＥＲＣＬＥＥＦＥＱＴＬＫＡＲＧＬＡ（配列番号２）。
ＭＱＫＱＲＴＣＳＱＷＲＥＬＤＡＡＨＨＬＨＰＦＴＤＴＡＳＬＮＱＡＧＡＲＶＭＴＲＧＥＧＶＹＬＷＤＣＥＧＮＫＩＩＤＧＭＡＧＬＷＣＶＮＶＧＹＧＲＫＤＦＡＥＡＡＲＲＱＭＥＥＬＰＦＹＮＴＦＹＫＴＴＨＰＡＶＶＥＬＳＳＬＬＡＥＶＴＰＡＧＦＤＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＳＶＤＴＭＩＲＭＶＲＲＹＷＤＶＱＧＫＰＥＫＫＴＬＩＧＲＷＷＧＹＨＧＳＴＩＧＧＡＳＬＧＧＦＫＹＭＨＥＱＧＤＬＰＩＰＧＭＡＨＩＥＱＰＷＷＹＫＨＧＫＤＭＴＰＤＥＦＧＶＶＡＡＲＷＬＥＥＫＩＬＥＩＧＡＤＫＶＡＡＦＶＧＥＰＩＱＧＡＧＧＶＩＶＰＰＡＴＹＷＰＥＩＥＲＩＣＲＫＹＤＶＬＬＶＡＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＥＷＦＧＨＱＨＦＧＦＱＰＤＬＦＴＡＡＫＧＬＳＳＧＹＬＰＩＧＡＶＦＶＧＫＲＶＡＥＧＬＩＡＧＧＤＦＮＨＧＦＴＹＳＧＨＰＶＣＡＡＶＡＨＡＮＶＡＡＬＲＤＥＧＩＶＱＲＶＫＤＤＩＧＰＹＭＱＫＲＷＲＥＴＦＳＲＦＥＨＶＤＤＶＲＧＶＧＭＬＬＡＦＴＬＶＫＮＫＡＫＲＥＬＦＰＤＦＧＥＩＧＴＬＣＲＤＩＦＱＲＮＮＬＩＭＤＳＣＧＤＨＩＶＳＡＰＰＬＶＭＴＲＡＥＶＤＥＭＬＡＶＡＥＲＣＬＥＥＦＥＱＴＬＫＡＲＧＬＡ（配列番号３）。
ＭＱＫＱＲＴＣＳＱＷＲＥＬＤＡＡＨＨＬＨＰＦＴＤＴＡＳＬＮＱＡＧＡＲＶＭＴＲＧＥＧＶＹＬＷＤＣＥＧＮＫＩＩＤＧＭＡＧＬＷＣＶＮＶＧＹＧＲＫＤＦＡＥＡＡＲＲＱＭＥＥＬＰＦＹＮＴＦＹＫＴＴＨＰＡＶＶＥＬＳＳＬＬＡＥＶＴＰＡＧＦＤＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＳＶＤＴＭＩＲＭＶＲＲＹＷＤＶＱＧＫＰＥＫＫＴＬＩＧＲＷＷＧＹＨＧＳＴＩＧＧＡＳＬＧＧＦＫＹＭＨＥＱＧＤＬＰＩＰＧＭＡＨＩＥＱＰＷＷＹＫＨＧＫＤＭＴＰＤＥＦＧＶＶＡＡＲＷＬＥＥＫＩＬＥＩＧＡＤＫＶＡＡＦＶＧＥＰＩＱＧＡＧＧＶＩＶＰＰＡＴＹＷＰＥＩＥＲＩＣＲＫＹＤＶＬＬＶＡＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＥＷＦＧＨＱＨＦＧＦＱＰＤＬＦＴＡＡＫＧＬＳＳＧＹＬＰＩＧＡＶＦＶＧＫＲＶＡＥＧＬＩＡＧＧＤＦＮＨＧＦＴＹＳＧＨＰＶＣＡＡＶＡＨＡＮＶＡＡＬＲＤＥＧＩＶＱＲＶＫＤＤＩＧＰＹＭＱＫＲＷＲＥＴＦＳＲＦＥＨＶＤＤＶＲＧＶＧＭＬＬＡＦＴＬＶＫＮＫＡＫＲＥＬＦＰＤＦＧＥＩＧＴＬＣＲＤＩＦＨＲＮＮＬＩＭＤＳＣＧＤＨＩＶＳＡＰＰＬＶＭＴＲＡＥＶＤＥＭＬＡＶＡＥＲＣＬＥＥＦＥＱＴＬＫＡＲＧＬＡ（配列番号４）。
以上に述べたように、本出願の上記トランスアミナーゼは、式１に示される基質に基質特異性を有し、このような基質のキラルジアミン化合物への変換を効果的に触媒することができ、かつ、該トランスアミナーゼの複数種の式１に示される基質に対する反応選択性と活性はいずれも高い。したがって、該生物酵素を利用してキラルジアミン化合物を触媒合成することは、より広範な基質（従来技術反応で得られたものは、いずれも１，２－ジアミン系化合物であるが、本出願では１，３－ジアミン、１，４－ジアミンなどの化合物を合成することもできる。）に適用するだけでなく、この合成方法は、経路が短く、製品収率が高く、生産コストを大幅に削減させ、有機溶媒と廃ガス、廃液、廃棄物の生成を減少させる。
上記基質中の「ヘテロ原子含有アルキル基、ヘテロ原子含有シクロアルキル基、ヘテロ原子含有アリール基」のうちのヘテロ原子は、Ｏ、ＳおよびＮのうちの少なくとも１つであってもよい。
上記の配列番号１、配列番号２、配列番号３と配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するトランスアミナーゼは、いずれもω－トランスアミナーゼ（ω－ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）であるＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｏｌａｃｅｕｍＤＳＭ３０１９１（ＣＶＴＡ）に由来する。
上記のアミノ基保護基は、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ホルミル基、トリフルオロアセチル基、ベンジル基、トリチル基または９－フルオレニルメトキシカルボニル基を含むがこれらに限定されない。
一つの好ましい実施例では、式Ｉで表される基質は、
Figure 0007345070000004
 のうちから選択されるいずれかである。
本出願のトランスアミナーゼは、上記の式Ｉに示される基質に対して触媒活性および立体選択性を有する。
本出願のトランスアミナーゼを用いて式Ｉに示される基質へのアミノ基転移反応を触媒する具体的なステップは、従来のアミノ基転移反応と類似している。一つの好ましい実施例では、上記合成方法は、リン酸緩衝液とアミノドナーを混合し、第１混合液を得て、第１混合液に式Ｉで表される基質を添加し、第２混合液を得ること、第２混合液にトランスアミナーゼを添加して、反応混合液を得ること、反応混合液からキラルジアミン化合物を分離して得ること、を含む。
該合成方法は、上記段階的な反応によって、反応体積を減少させ、トランスアミナーゼの基質に対する触媒活性と効率を高くし、したがって高い製品収率を得て、生産効率を向上させる。
一つの好ましい実施例では、合成方法は、第１混合液に式Ｉで表される基質を添加する前に、第１混合液のｐＨ値を７．０～９．０に調整することをさらに含み、好ましくは、第２混合液にトランスアミナーゼを添加し、かつトランスアミナーゼを添加した第２混合液のｐＨを７．０～９．０に調整して、反応混合液を得る。
上記好ましい実施例では、式Ｉに示される基質を第１混合液に添加する前に、第１混合液のｐＨ値を調整し、酵素を添加する前に酵素反応に最適なｐＨに調整することにより、酵素の添加中の不活性化が防止される。一方、第２混合液へのトランスアミナーゼの添加後もシステムのｐＨ値を調整し、その作用は反応が最適ｐＨで進行することを確保することである。上記２回のｐＨ値調整の範囲は、一致することが好ましく、例えば、前に７．８に調整され、トランスアミナーゼの添加後も同様に７．８に調整される。
上記の、反応後の混合液から目的生成物を分離して得るステップは、公知の分離、精製方法により行えばよい。一つの好ましい実施例では、反応混合液からキラルジアミン化合物を分離して得ることは、反応混合液の酸性度を調整してトランスアミナーゼを変性させることを含み、好ましくは、反応混合液のｐＨ値を１～２に調整し、変性後のトランスアミナーゼを濾過除去して予備濾液を得ること、予備濾液のｐＨ値をアルカリ性に調整して、アルカリ性濾液を得て、アルカリ性濾液を抽出して、キラルジアミン化合物を得て、好ましくは、アルカリ性濾液のｐＨ値は、１２～１３であり、好ましくは、抽出は、複数回であり、より好ましくは、２～５回であり、より好ましくは、ジクロロメタンを用いて初回目の抽出を行い、その後、ジクロロメタンまたは酢酸エチルを用いて残りの回数の抽出を行う。
酸性度を調整する手段を用いて反応後の酵素タンパク質を変性させることは、他の変性手段（例えば高温、塩基調整または塩析）と比較して、変性が徹底的であり、生成物の多くが酸性条件下で安定的であり、その後の操作が直接、酸性条件下でシステムの他の不純物を抽出することができるという利点を有する。ジクロロメタンを用いた初回目の抽出の目的は、システム中の酸性条件で抽出され得る不純物を除去することである。他の抽出溶媒（例えば酢酸エチル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、または酢酸イソプロピル）による抽出よりも抽出効率が高いという利点がある。
純度と収率をさらに向上させるために、１つの好ましい実施例において、抽出後に抽出した有機相を乾燥するステップをさらに含み、好ましくは、毎回の抽出で得られた有機相を合わせて抽出物を得て、抽出物を乾燥して、乾燥した有機相生成物を得て、乾燥した有機相生成物を、温度＜４５℃、圧力≦－０．０５Ｍｐａの条件で留分なしまでに濃縮する（乾燥の目的は、製品中の水分含有量を減少させることであり、圧力の大きさは、濃縮速度に影響を与える。）。
一つの好ましい実施例では、トランスアミナーゼと式Ｉで表される基質の質量比は０．４：１～１．０：１であり、該質量比で反応すると、基質に対する変換率は９２％以上に達することができる。
一つの好ましい実施例では、式Ｉで表される基質の濃度は、６０ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌである。この濃度範囲で、生物酵素を用いて反応を行い、基質の変換率が９５％以上に達するだけでなく、生産効率の向上に寄与し、有機溶剤と廃ガス、廃液、廃棄物の発生を減少させる。
一つの好ましい実施例では、アミノドナーは、イソプロピルアミン、イソプロピルアミンの塩酸塩、アラニン、フェネチルアミンまたはｎ－ブチルアミンから選択される。
以下、具体的な実施例に関連して本出願の有益な効果をさらに説明する。なお、以下の実施例における室温とは、１０～２５℃の常温範囲内の温度をいい、以下の実施例１～１５で用いたトランスアミナーゼは、配列番号４に示されるトランスアミナーゼである。
（実施例１）
室温で２５０ｍＬの四つ口フラスコに５０ｍＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（５ｖｏｌ）、２４ｍＬの５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２．４ｖｏｌ、３ｅｑ）を添加し、ｐＨ＝７．５～８．０に調整する。続いて０．１ｇのピリドキサールリン酸（１ｗｔ％）、１０ｇの
Figure 0007345070000005
 を添加し、均一になるまで撹拌し、続いてトランスアミナーゼ液１０ｍｌ（０．５ｗｔ、０．５ｇ／ｍｌ）を加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整する。温度を３０℃に上げ、撹拌して一晩反応させる。完全に反応した後、システムの酸性度をｐＨ＝１に調整し、タンパク質を変性させる。濾過後の濾液を５０ｍＬのジクロロメタンで抽出する。水相でｐＨ＝１２に調整してから、ジクロロメタン５０ｍｌで３回抽出する。有機相を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、有機相をＴ＜３５℃、Ｐ≦－０．０６Ｍｐａの条件で留分なしまでに濃縮する。目的生成物
Figure 0007345070000006
 を得る。
ＨＰＬＣで測定すると、純度＞９８％で、ｅｅ値＞９９％で、収率９０％である。
（実施例２）
室温で２５０ｍＬの四つ口フラスコに６０ｍＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（６ｖｏｌ）、１８ｍＬの５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（１．８ｖｏｌ、３ｅｑ）を添加し、ｐＨ＝８．０～８．５に調整する。続いて０．１ｇのピリドキサールリン酸（１ｗｔ％）、１０ｇの
Figure 0007345070000007
 を添加し、均一になるまで撹拌し、続いてトランスアミナーゼ液１０ｍｌ（０．５ｗｔ、０．５ｇ／ｍｌ）を加えて、ｐＨ＝８．０～８．５に調整する。温度を２０℃に調整し、撹拌して一晩反応させる。完全に反応した後、システムの酸性度をｐＨ＝２に調整し、タンパク質を変性させる。濾過後の濾液を５０ｍＬのジクロロメタンで抽出する。水相でｐＨ＝１３に調整してから、酢酸エチル５０ｍｌで３回抽出する。有機相を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、有機相をＴ＜４５℃、Ｐ≦－０．０８Ｍｐａの条件で留分なしまでに濃縮する。目的生成物
Figure 0007345070000008
 を得る。
ＨＰＬＣで測定すると、純度＞９２％で、ｅｅ値＞９９％で、収率８６％である。
（実施例３）
室温で２５０ｍＬの四つ口フラスコに７０ｍＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（７ｖｏｌ）、１３ｍＬの５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（１．３ｖｏｌ、３ｅｑ）を添加し、ｐＨ＝７．０～７．５に調整する。続いて０．１ｇのピリドキサールリン酸（１ｗｔ％）、１０ｇの
Figure 0007345070000009
 を添加し、均一になるまで撹拌し、続いてトランスアミナーゼ液１０ｍｌ（０．５ｗｔ、０．５ｇ／ｍｌ）を加えて、温度を５０℃に上げ、撹拌して一晩反応させる。完全に反応した後、システムの酸性度をｐＨ＝１に調整し、タンパク質を変性させる。濾過後の濾液を５０ｍＬのジクロロメタンで抽出する。水相でｐＨ＝１３に調整してから、ジクロロメタン５０ｍｌで３回抽出する。有機相を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、有機相をＴ＜３５℃、Ｐ≦－０．０６Ｍｐａの条件で留分なしまでに濃縮する。目的生成物
Figure 0007345070000010
 を得る。
ＨＰＬＣで測定すると、純度＞９７％で、ｅｅ値＞９９％で、収率７８％である。
（実施例４）
室温で２５０ｍＬの四つ口フラスコに５０ｍＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（５ｖｏｌ）、３８ｍＬの５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（３．８ｖｏｌ、３ｅｑ）を添加し、ｐＨ＝８．５～９．０に調整する。続いて０．１ｇのピリドキサールリン酸（１ｗｔ％）、１０ｇの
Figure 0007345070000011
 を添加し、均一になるまで撹拌し、続いてトランスアミナーゼ液１０ｍｌ（０．５ｗｔ、０．５ｇ／ｍｌ）を加えて、ｐＨ＝８．５～９．０に調整する。温度を１０℃に調整し、撹拌して一晩反応させる。完全に反応した後、システムの酸性度をｐＨ＝２に調整し、タンパク質を変性させる。濾過後の濾液を５０ｍＬのジクロロメタンで抽出する。水相でｐＨ＝１３に調整してから、ジクロロメタン５０ｍｌで３回抽出する。有機相を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、有機相をＴ＜３５℃、Ｐ≦－０．０６Ｍｐａの条件で留分なしまでに濃縮する。目的生成物
Figure 0007345070000012
 を得る。
ＨＰＬＣで測定すると、純度＞９５％で、ｅｅ値＞９９％で、収率：７９％である。
（実施例５）
室温で２５０ｍＬの四つ口フラスコに７０ｍＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（７ｖｏｌ）、１７ｍＬの５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（１．７ｖｏｌ、３ｅｑ）を添加し、ｐＨ＝７．５～８．０に調整する。続いて０．１ｇのピリドキサールリン酸（１ｗｔ％）、１０ｇの
Figure 0007345070000013
 を添加し、均一になるまで撹拌し、続いてトランスアミナーゼ液１０ｍｌ（０．５ｗｔ、０．５ｇ／ｍｌ）を加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整する。温度を２９℃に上げ、撹拌して一晩反応させる。完全に反応した後、システムの酸性度をｐＨ＝１に調整し、タンパク質を変性させる。濾過後の濾液を５０ｍＬのジクロロメタンで抽出する。水相でｐＨ＝１２に調整してから、酢酸エチル５０ｍｌで３回抽出する。有機相を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、有機相をＴ＜４５℃、Ｐ≦－０．０８Ｍｐａの条件で留分なしまでに濃縮する。目的生成物
Figure 0007345070000014
 を得る。
ＨＰＬＣで測定すると、純度は９８％で、ｅｅ値は９９％で、収率は８７％である。
（実施例６）
室温で５００ｍＬの四つ口フラスコに１４０ｍＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（７ｖｏｌ）、５０ｍＬの５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（１．７ｖｏｌ、３ｅｑ）を添加し、ｐＨ＝７．５～８．０に調整する。続いて０．２ｇのピリドキサールリン酸（１ｗｔ％）、２０ｇの
Figure 0007345070000015
 を添加し、均一になるまで撹拌し、続いてトランスアミナーゼ液２０ｍｌ（０．５ｗｔ、０．５ｇ／ｍｌ）を加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整する。温度を３２℃に上げ、撹拌して一晩反応させる。完全に反応した後、システムの酸性度をｐＨ＝１に調整し、タンパク質を変性させる。濾過後の濾液を１００ｍＬのジクロロメタンで抽出する。水相でｐＨ＝１２に調整してから、酢酸エチル１００ｍｌで３回抽出する。有機相を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、有機相をＴ＜４５℃、Ｐ≦－０．０８Ｍｐａの条件で留分なしまでに濃縮する。目的生成物
Figure 0007345070000016
 を得る。
ＨＰＬＣで測定すると、純度＞９７％で、ｅｅ値＞９９％で、収率：８４％である。
（実施例７）
室温で５００ｍＬの四つ口フラスコに２２０ｍＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（１１ｖｏｌ）、５０ｍＬの５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２．５ｖｏｌ、３ｅｑ）を添加し、ｐＨ＝７．５～８．０に調整する。さ続いて０．２ｇのピリドキサールリン酸（１ｗｔ％）、２０ｇの
Figure 0007345070000017
 を添加し、均一になるまで撹拌し、続いてトランスアミナーゼ液４０ｍｌ（１．０ｗｔ、０．５ｇ／ｍｌ）を加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整する。温度を３２℃に上げ、撹拌して一晩反応させる。完全に反応した後、システムの酸性度をｐＨ＝１に調整し、タンパク質を変性させる。濾過後の濾液を１００ｍＬのジクロロメタンで抽出する。水相でｐＨ＝１２に調整してから、酢酸エチル１００ｍｌで３回抽出する。有機相を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、有機相をＴ＜４５℃、Ｐ≦－０．０８Ｍｐａの条件で留分なしまでに濃縮する。目的生成物
Figure 0007345070000018
 を得る。
ＨＰＬＣで測定すると、純度＞９５％で、ｅｅ値＞９９％で、収率：８５％である。
（実施例８）
室温で５００ｍＬの四つ口フラスコに１８０ｍＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（１２ｖｏｌ）、３６ｍＬの５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２．４ｖｏｌ、３ｅｑ）を添加し、ｐＨ＝７．５～８．０に調整する。さらに０．１５ｇのピリドキサールリン酸（１ｗｔ％）、１５ｇの
Figure 0007345070000019
 を添加し、均一になるまで撹拌し、続いてトランスアミナーゼ液３０ｍｌ（１．０ｗｔ、０．５ｇ／ｍｌ）を加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整する。温度を３５℃に上げ、撹拌して一晩反応させる。完全に反応した後、システムの酸性度をｐＨ＝１に調整し、タンパク質を変性させる。濾過後の濾液を１００ｍＬのジクロロメタンで抽出する。水相でｐＨ＝１２に調整してから、酢酸エチル１００ｍｌで３回抽出する。有機相を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、有機相をＴ＜４５℃、Ｐ≦－０．０８Ｍｐａの条件で留分なしまでに濃縮する。目的生成物
Figure 0007345070000020
 を得る。
ＨＰＬＣで測定すると、純度＞９６％で、ｅｅ値＞９９％で、収率：９１％である。
（実施例９）
室温で５００ｍＬの四つ口フラスコに１８０ｍＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（１２ｖｏｌ）、２６ｍＬの５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（１．７ｖｏｌ、３ｅｑ）を添加し、ｐＨ＝７．５～８．０に調整する。さらに０．１５ｇのピリドキサールリン酸（１ｗｔ％）、１５ｇの
Figure 0007345070000021
 を添加し、均一になるまで撹拌し、続いてトランスアミナーゼ液３０ｍｌ（１．０ｗｔ、０．５ｇ／ｍｌ）を加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整する。温度を４０℃に上げ、撹拌して一晩反応させる。完全に反応した後、システムの酸性度をｐＨ＝１に調整し、タンパク質を変性させる。濾過後の濾液を１００ｍＬのジクロロメタンで抽出する。水相でｐＨ＝１２に調整してから、酢酸エチル１００ｍｌで３回抽出する。有機相を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、有機相をＴ＜４５℃、Ｐ≦－０．０８Ｍｐａの条件で留分なしまでに濃縮する。目的生成物
Figure 0007345070000022
 を得る。
ＨＰＬＣで測定すると、純度＞９７％で、ｅｅ値＞９９％で、収率：９０％である。
（実施例１０）
室温で５００ｍＬの四つ口フラスコに１１０ｍＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（１１ｖｏｌ）、２３ｍＬの５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（２．３ｖｏｌ、３ｅｑ）を添加し、ｐＨ＝７．５～８．０に調整する。続いて０．１ｇのピリドキサールリン酸（１ｗｔ％）、１０ｇの
Figure 0007345070000023
 を添加し、均一になるまで撹拌し、続いてトランスアミナーゼ液１０ｍｌ（０．５ｗｔ、０．５ｇ／ｍｌ）を加えて、ｐＨ＝７．５～８．０に調整する。温度を４０℃に上げ、撹拌して一晩反応させる。完全に反応した後、システムの酸性度をｐＨ＝２に調整し、タンパク質を変性させる。濾過後の濾液を５０ｍＬのジクロロメタンで抽出する。水相でｐＨ＝１２に調整してから、酢酸エチル５０ｍｌで３回抽出する。有機相を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、有機相をＴ＜４５℃、Ｐ≦－０．０８Ｍｐａの条件で留分なしまでに濃縮する。目的生成物
Figure 0007345070000024
 を得る。
ＨＰＬＣで測定すると、純度＞９５％で、ｅｅ値＞９９％で、収率：８３％である。
（実施例１１）
実施例２を例として、反応する酵素量を最適化する具体的操作は以下のとおりである：室温で１０ｍＬバイアル瓶に１．２ｍＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（６ｖｏｌ）、０．３６ｍｌの５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液（１．８ｖｏｌ、３ｅｑ）を添加し、ｐＨ＝８．０～８．５に調整する。さらに０．００２ｇのピリドキサールリン酸（１ｗｔ％）、０．２ｇの
Figure 0007345070000025
 を添加し、均一になるまで混合し、それぞれトランスアミナーゼ液０．０４ｍｌ、０．０８ｍｌ、０．１２ｍｌ、０．１６ｍｌ、０．２ｍｌ、０．２４ｍｌ、０．２８ｍｌ、０．３２ｍｌ、０．３６ｍｌ、０．４ｍｌ、０．４４ｍｌ、０．４８ｍｌ、０．５２ｍｌ、０．５６ｍｌ、０．６ｍｌ（酵素液の濃度は、０．５ｇ／ｍｌであり、対応する質量比は、それぞれ０．１ｗｔ、０．２ｗｔ、０．３ｗｔ、０．４ｗｔ、０．５ｗｔ、０．６ｗｔ、０．７ｗｔ、０．８ｗｔ、０．９ｗｔ、１．０ｗｔ、ｌ．ｌｗｔ、１．２ｗｔ、１．３ｗｔ、１．４ｗｔ、１．５ｗｔである。）を添加し、ｐＨ＝８．０～８．５に調整する。シェーカーの回転速度を１７０ｒｐｍにして、温度を２９℃に上げて一晩反応させる。変換率の結果は、図１に示すように、０．５～１．０ｗｔ基質の変換率が９９％を超え、酵素量が引き続き増大しても明らかな効果がないことを証明する。
（実施例１２）
実施例２を例として、反応する基質の濃度を最適化する具体的操作は以下のとおりである：室温で１０～５０ｍＬのバイアル瓶（反応体積に応じて適切な振盪瓶を選択する。）にそれぞれ０．５８ｍＬ、０．６６ｍｌ、０．７８ｍｌ、０．９ｍｌ、１．０６ｍｌ、１．２４ｍｌ、１．４４ｍｌ、１．７４ｍｌ、２．１ｍｌ、２．５６ｍｌ、３．２４ｍｌ、４．２４ｍｌ、５．８４ｍｌ、９．２４ｍｌの１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（それぞれ２．９ｖｏｌ、３．３ｖｏｌ、３．９ｖｏｌ、４．５ｖｏｌ、５．３ｖｏｌ、６．２ｖｏｌ、７．２ｖｏｌ、８．７ｖｏｌ、１０．５ｖｏｌ、１２．８ｖｏｌ、１６．２ｖｏｌ、２１．２ｖｏｌ、２９．２ｖｏｌ、４６．２ｖｏｌである。）、０．３６ｍｌの５ｍｏｌ／Ｌのイソプロピルアミン塩酸塩溶液（１．８ｖｏｌ，３ｅｑ）を添加し、ｐＨ＝８．０～８．５に調整する。さらに０．００２ｇのピリドキサールリン酸（１ｗｔ％）、０．２ｇの
Figure 0007345070000026
 （１ｖｏｌ，０．２ｍｌ）を添加し、均一になるまで混合し、トランスアミナーゼ酵素液０．２ｍｌ（１ｖｏｌ、０．５ｗｔ、酵素液濃度０．５ｇ／ｍｌ）を添加してｐＨ＝８．０～８．５を調整する。シェーカーの回転速度を１７０ｒｐｍにして、温度を２９℃に上げて一晩反応させる。図２に示すように、６０～１００ｇ／Ｌの濃度で、基質の変換率は９９％より大きいことを証明する。基質濃度を引き続き低下させると、反応容積が増加し、廃ガス、廃液、廃棄物量が増加し、かつ変換率はさらに明らかに向上させる効果がない。
（実施例１３）
実施例２を例として、反応するアミノドナーに対する最適化の具体的操作は以下のとおりである：室温で１０ｍＬバイアル瓶（反応体積に応じて適当な振盪瓶を選択する。）に１．２ｍｌの１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（６ｖｏｌ）を添加し、それぞれ３ｅｑのアミノドナーのシステム（アミノドナーは、それぞれイソプロピルアミン、イソプロピルアミン塩酸塩、アラニン、アニリン、ｎ－ブチルアミン）を使用し、ＰＨ＝８．０～８．５に調整する。続いて０．００２ｇのピリドキサールリン酸（１ｗｔ％）、０．２ｇの
Figure 0007345070000027
 を添加し、均一になるまで混合し、トランスアミナーゼ酵素液０．２ｍｌ（０．５ｗｔ、酵素液濃度０．５ｇ／ｍｌ）を添加してｐＨ＝８．０～８．５を調整する。シェーカーの回転速度を１７０ｒｐｍにして、温度を２９℃に上げて一晩反応させる。変換率の結果を図３に示し、イソプロピルアミン、イソプロピルアミン塩酸塩、アラニン、ｎ－ブチルアミンをアミノドナーとし、基質の変換率が９９％より大きいことを証明する。アミノドナーとしてのアニリンの変換率は、この反応条件下で８９％である。
（実施例１４）
実施例１の基質を例にとると、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍＤＳＭ３０１９１（ＣＶＴＡ）（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１１１３５５７３．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ１、ＦｏｎｓｅｃａｅａｐｅｄｒｏｓｏｉＣＢＳ２７１．３７（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿０１３２８６２８１．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ２、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｓｕｂｓｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＥｃｌ８（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＣＮ２９５４１．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ３、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｏｏｄｉｉ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＫＳ３６０００．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ４、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１１７４６９７５．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ５、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｂｒａｓｉｌｉａｎｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＥＪ５５３３４．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ６、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．ＴＬ３（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１４８８５６７７．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ７、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓＮＩＨ２６２４（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿００１２０９３２５．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ８、Ｅｘｏｐｈｉａｌａｓｐｉｎｉｆｅｒａ（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿０１６２３３８２１．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ９、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ（ｓｔｒａｉｎＤＳＭ１１３００）（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１１５３０５４５．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ１０、Ｇｅｏｍｙｃｅｓｄｅｓｔｒｕｃｔａｎｓ２０６３１－２１（ＧｄＴＡ）ｉｎＥ．ｃｏｌｉ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＬＲ０５５７３．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ１１、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＫＴ２４４０（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１０９５４５５４．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ１２、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０２４３６３７４１．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ１３、ＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＤＳＭ３１９（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１３０８２２１９．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ１４、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＫＰ０７０３０．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ１５、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓＲ－ＡＴＡｓ（ＡｓｐＦｕｍ）（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿７４８８２１．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ１６、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓｓｕｂｓｐ．ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓＤＳＭ４６５（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿００８８７９４３６．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ１７、ＣｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａｂａｎｔｉａｎａＣＢＳ１７３．５２（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿０１６６１７９４８．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ１８、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１６７６３０２６．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ１９、ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓＭＳＭＢ１２１（ＢｔＳ－ＴＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＧＫ４９３９９．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ２０、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｓｕｂｓｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＭＧＨ７８５７８（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿００２９２０２２６．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ２１、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｔｏｅｂｉｉ（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０６２７５３８９４．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ２２、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＡＭ３７５３３．１）に由来するトランスアミナーゼ番号ＴＡ２３、ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｏｌａｃｅｕｍＤＳＭ３０１９１（ＣＶＴＡ）（ＮＣＢＩｒｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１１１３５５７３．１）に由来するトランスアミナーゼが進化して得られた突然変異体ＴＡ１－Ｖ１（対応配列配列番号１）、ＴＡ１－Ｖ２（対応配列配列番号２）。ＴＡ１－Ｖ３（対応配列配列番号３）、ＴＡ１－Ｖ４（対応配列配列番号４）に対して、１０ｍｇレベルのスクリーニング反応を行い、操作は以下のとおりである：
１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸塩緩衝液、５ｍｏｌ／Ｌイソプロピルアミン塩酸塩溶液を体積比５：２になるように５０ｍｌ溶液を配合し、さらに０．００５ｇのピリドキサールリン酸を加え、撹拌して均一に混合する。上記の溶液０．３ｍｌを取って、それぞれ９６ウェルプレートに追加し、１０ｍｇの
Figure 0007345070000028
 を添加し、続いて上記の酵素液０．２ｍｌ（１０ｗｔ、酵素液濃度０．５ｇ／ｍｌ）をそれぞれ添加し、シェーカーの回転速度を１７０ｒｐｍにし、３０℃の条件で一晩反応させる。
スクリーニング結果は、図４に示すとおりである：すべての由来の酵素が該基質に対していずれも触媒活性があることを証明し、ＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｏｌａｃｅｕｍＤＳＭ３０１９１（ＣＶＴＡ）由来のトランスアミナーゼは一番優れており、また、ＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｏｌａｃｅｕｍＤＳＭ３０１９１（ＣＶＴＡ）由来のトランスアミナーゼで突然変異して得られた、よりよい変換率を有する４つの変異体ば、変換率がいずれも９９％を超える。
以上の説明から明らかなように、本発明の上述した実施例は、以下のような技術的効果を奏する。
１）トランスアミナーゼを用いてこの生物変換反応を行うと、一段階の反応で直接所望の目的化合物を得ることができ、基質の種類が広く適用され、特許に記載のものだけでなく、１，３－ジアミン、１，４－ジアミンなどの化合物でも、１，３－ジアミン、１，４－ジアミンなどの化合物も合成できる。
２）トランスアミナーゼを用いてこの生物変換反応を行う選択性が非常に高く、製品のキラル純度が大幅に向上し、製品のｅｅ値が大幅に向上する。
３）自己抽出した上記トランスアミナーゼを使用し、基質濃度は１００ｇ／Ｌに達することができ、生産効率を大幅に向上させる。
４）重金属触媒、アジド化合物およびシアノ基化試薬の使用を必要とせず、トランスアミナーゼを用いて生物学的触媒を行う。グリーン化学を実現する。
５）該トランスアミナーゼは、触媒効率が高く、反応体積が少なく、合成経路が短く、製品収率が高く、廃ガス、廃液、廃棄物を大幅に低下させ、生産コストを削減する。
以上説明したのは、本発明の任意の実施例に過ぎず、本発明を限定するためのものではなく、当業者にとって種々の変更および変更が可能である。本発明の精神および原理の範囲内で行われたいかなる修正、均等物の置換、改良なども本発明の範囲内に含まれるべきである。

Claims (17)

  1. キラルジアミン化合物の合成方法であって、
    トランスアミナーゼを利用して式Ｉで表される基質を前記キラルジアミン化合物に変換することを含み、
    Figure 0007345070000029
     式Ｉ
    式中、ｎ＝１～１０であり、
    Ｒ基はアルキル基、シクロアルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基、ヘテロ原子含有シクロアルキル基、ヘテロ原子含有アリール基、アミド類化合物残基またはエーテル類化合物残基であり、ここでは、前記ヘテロ原子はＯ、ＳおよびＮの少なくとも１つであり、
    Ｒ１、Ｒ２は同一または異なり、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して水素、Ｃ１～Ｃ３アルキルまたはアミノ基保護基であり、
    前記基質は、
    Figure 0007345070000030
     のうちから選択されるいずれか１つであり、
    前記トランスアミナーゼは、ＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｏｌａｃｅｕｍＤＳＭ３０１９１（ＣＶＴＡ）、ＦｏｎｓｅｃａｅａｐｅｄｒｏｓｏｉＣＢＳ ２７１．３７、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｓｕｂｓｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＥｃｌ８、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｏｏｄｉｉ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｂｒａｓｉｌｉａｎｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．ＴＬ３、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓＮＩＨ２６２４、Ｅｘｏｐｈｉａｌａｓｐｉｎｉｆｅｒａ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ（ｓｔｒａｉｎＤＳＭ１１３００）、Ｇｅｏｍｙｃｅｓｄｅｓｔｒｕｃｔａｎｓ２０６３１－２１（ＧｄＴＡ）ｉｎＥ．ｃｏｌｉ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＫＴ２４４０、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、ＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＤＳＭ３１９、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓＲ－ＡＴＡｓ（ＡｓｐＦｕｍ）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓｓｕｂｓｐ．ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓＤＳＭ４６５、ＣｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａｂａｎｔｉａｎａＣＢＳ１７３．５２、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓＭＳＭＢ１２１（ＢｔＳ－ＴＡ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｓｕｂｓｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＭＧＨ７８５７８、ＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｔｏｅｂｉｉとＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓに由来する、キラルジアミン化合物の合成方法。
  2. 前記トランスアミナーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の合成方法。
  3. 前記アミノ基保護基は、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ホルミル基、トリフルオロアセチル基、ベンジル基、トリチル基および９－フルオレニルメトキシカルボニル基のうちから選択されるいずれか１つである、請求項１に記載の合成方法。
  4. 前記合成方法は、
    リン酸緩衝液をアミノドナーと混合して第１混合液を得ること、
    前記第１混合液に前記式Ｉで表される基質を添加して、第２混合液を得ること、
    前記第２混合液に前記トランスアミナーゼを添加して、反応混合液を得ること、
    前記反応混合液から前記キラルジアミン化合物を分離して得ること、を含む、請求項１に記載の合成方法。
  5. 前記第１混合液に前記基質を添加する前に、前記合成方法は、前記第１混合液のｐＨ値を７．０～９．０に調整することをさらに含む、請求項４に記載の合成方法。
  6. 前記第２混合液に前記トランスアミナーゼを添加し、前記トランスアミナーゼを添加した前記第２混合液のｐＨを７．０～９．０に調整して、前記反応混合液を得る、請求項５に記載の合成方法。
  7. 前記反応混合液から前記キラルジアミン化合物を分離して得ることは、
    前記反応混合液の酸性度を調整して前記トランスアミナーゼを変性させること、
    変性した前記トランスアミナーゼを濾過して除去し、予備濾液を得ること、
    前記予備濾液のｐＨ値をアルカリ性に調整し、アルカリ性濾液を得ること、
    前記アルカリ性濾液を抽出して、前記キラルジアミン化合物を得ること、を含む、請求項６に記載の合成方法。
  8. 前記反応混合液のｐＨ値を１～２に調整する、請求項７に記載の合成方法。
  9. 前記アルカリ性濾液のｐＨ値は１２～１３である、請求項７に記載の合成方法。
  10. 前記抽出は複数回である、請求項７に記載の合成方法。
  11. 前記抽出は２～５回である、請求項７に記載の合成方法。
  12. ジクロロメタンを用いて初回目の抽出を行い、その後、ジクロロメタンまたは酢酸エチルを用いて残りの回数の抽出を行う、請求項７に記載の合成方法。
  13. 前記抽出の後に抽出した有機相を乾燥するステップをさらに含む、請求項７に記載の合成方法。
  14. 毎回の抽出で得られた有機相を合わせて抽出物を得て、
    前記抽出物を乾燥して、乾燥した有機相生成物を得て、
    前記乾燥した有機相生成物を、温度＜４５℃、圧力≦－０．０８Ｍｐａの条件で留分なしまでに濃縮して、前記キラルジアミン化合物を得る、請求項７に記載の合成方法。
  15. 前記トランスアミナーゼと前記基質の質量比は０．４：１～１．０：１である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の合成方法。
  16. 前記基質の濃度は６０ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の合成方法。
  17. 前記アミノドナーは、イソプロピルアミン、イソプロピルアミンの塩酸塩、アラニン、フェネチルアミンまたはｎ‐ブチルアミンから選択される、請求項４に記載の合成方法。

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