KR20220157981A - 키랄 디아민 화합물 합성 방법 - Google Patents

키랄 디아민 화합물 합성 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20220157981A
KR20220157981A KR1020227033472A KR20227033472A KR20220157981A KR 20220157981 A KR20220157981 A KR 20220157981A KR 1020227033472 A KR1020227033472 A KR 1020227033472A KR 20227033472 A KR20227033472 A KR 20227033472A KR 20220157981 A KR20220157981 A KR 20220157981A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gly
transaminase
ala
val
glu
Prior art date
Application number
KR1020227033472A
Other languages
English (en)
Inventor
하오 홍
게이지 제임스
이 샤오
나 장
샹 리
샹쥔 지앙
통 자오
Original Assignee
아심켐 래보러토리즈 (톈진) 컴퍼니, 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아심켐 래보러토리즈 (톈진) 컴퍼니, 리미티드 filed Critical 아심켐 래보러토리즈 (톈진) 컴퍼니, 리미티드
Publication of KR20220157981A publication Critical patent/KR20220157981A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 키랄 디아민 화합물의 합성 방법을 제공한다. 상기 합성 방법은, 트랜스아미나제를 이용하여 식 I로 표시되는 기질을 키랄 디아민 화합물로 전화시키는 단계를 포함하되, 여기서, n = 1 ~ 10이고, R 그룹은 알킬, 시클로알킬, 헤테로 원자 함유 알킬, 헤테로 원자 함유 시클로알킬, 헤테로 원자 함유 아릴, 아미드계 화합물 잔기 또는 에테르계 화합물 잔기를 나타내며, 헤테로 원자는 O, S 및 N 중 적어도 하나이고; R1과 R2는 동일하거나 상이하며, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-C3 알킬 또는 아미노 보호기이고; 트랜스아미나제는 다수의 균종으로부터 유래된다. 이러한 트랜스아미나제는 다양한 식 I로 표시되는 기질에 대해 모두 높은 반응 선택성 및 활성을 갖는다. 상기 바이오효소를 이용하여 키랄 디아민 화합물의 합성에 대해 촉매 작용을 수행하면, 기질이 더 광범위할 뿐만 아니라, 경로가 짧고, 제품 수율이 높으며, 생산 비용을 크게 절감시키고, 유기 용매와 3가지 폐기물의 생성을 감소시킨다.
Figure pct00059

I

Description

키랄 디아민 화합물의 합성 방법
본 발명은 키랄 디아민 화합물의 합성 분야에 관한 것으로, 구체적으로, 키랄 디아민 화합물의 합성 방법에 관한 것이다.
키랄 디아민 화합물은 오르니틴, 라이신, 비타민 H, 약물 레바미솔 등과 같은 생물학적 활성을 갖는 많은 천연 산물 및 약물 분자에 널리 존재한다. 옥살리플라틴(Oxaliplatin) 분자에는 특정 항종양 활성을 갖는 디아민 화합물이 존재한다. 디아민 구조를 갖는 화합물도 유기 합성에 널리 적용되는데, 이는 합성 블록으로 사용되어 질소 헤테로고리를 효과적으로 구축할 수 있고, 리간드로 사용되어 금속과 복합되어 반응 활성이 높은 촉매를 생성할 수도 있으며, 디아민 화합물은 또한 액정 재료, 항공 우주 재료, 마이크로 전자 등 분야에 널리 적용된다. 키랄 디아민 화합물은 또한 알데히드의 거울상 이성질체를 분할하기 위한 키랄 분할 시약으로 사용될 수 있다. 따라서 키랄 디아민의 합성은 항상 화학자들의 주목을 받는 연구 대상이였다(Angew.Chem.Int.Ed.1998,37,2580).
현재, 키랄 디아민 화합물의 합성 방법에는 비대칭 스트레커(strecker) 반응(Chem.Rev.,2011,111, 6947), 비대칭 마이클(Michael) 첨가(CN 105367427 A), 아지리딘 비대칭 개환(CN 105753752 A) 등 방법이 있다. 그러나 이러한 방법은 기질의 적용 범위와 실용성에 있어 모두 다른 정도의 제한을 가지며, 이러한 방법으로 합성된 것은 모두 1,2-디아민계 화합물이다. 비대칭 마이클 첨가 및 아지리딘 비대칭 개환에는 일반적으로 고가의 금속 및 키랄 촉매가 필요한데, 이는 반응 시스템의 적용을 크게 제한한다. 또한, 반응에서 독성이 강한 아지드 화합물이나 시안화 시약이 사용되므로, 화학 경로의 3가지 폐기물의 생성량이 크고 처리하기 어렵다.
따라서, 기질의 적용 범위를 확장하기 위해 기존의 방법을 어떻게 개선할 것인가가 시급히 해결해야 하는 기술적 과제이다.
본 발명의 주요 목적은 기질에 대한 선행기술의 방법의 적용 범위가 제한되어 있는 문제를 해결하기 위한 키랄 디아민 화합물의 합성 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 구현하기 위해, 본 발명은 키랄 디아민 화합물의 합성 방법을 제공하되, 상기 합성 방법은, 트랜스아미나제를 이용하여 식 I로 표시되는 기질을 키랄 디아민 화합물로 전화시키는 단계를 포함하고;
Figure pct00001
식 I,
여기서, n = 1 ~ 10이고, R 그룹은 알킬, 시클로알킬, 헤테로 원자 함유 알킬, 헤테로 원자 함유 시클로알킬, 헤테로 원자 함유 아릴, 아미드계 화합물 잔기 또는 에테르계 화합물 잔기를 나타내되, 여기서, 헤테로 원자는 O, S 및 N 중 적어도 하나이며; R1과 R2는 동일하거나 상이하며, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-C3 알킬 또는 아미노 보호기이고; 트랜스아미나제는 Chromobacterium violaceum DSM30191(CVTA)(NCBI Reference Sequence:WP_011135573.1), Fonsecaea pedrosoi CBS 271.37(NCBI Reference Sequence:XP_013286281.1), Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae Ecl8(GenBank:CCN29541.1), Mycobacterium goodii(GenBank:AKS36000.1), Paracoccus denitrificans(NCBI Reference Sequence:WP_011746975.1), Penicillium brasilianum(GenBank:CEJ55334.1), Enterobacter sp.TL3(NCBI Reference Sequence:WP_014885677.1), Aspergillus terreus NIH2624(NCBI Reference Sequence:XP_001209325.1), Exophiala spinifera(NCBI Reference Sequence:XP_016233821.1), Deinococcus geothermalis(strain DSM 11300)(NCBI Reference Sequence:WP_011530545.1), Geomyces destructans 20631-21(GdTA)in E.coli(GenBank:ELR05573.1), Pseudomonas putida KT2440(NCBI Reference Sequence:WP_010954554.1), Lysinibacillus sphaericus(NCBI Reference Sequence:WP_024363741.1), Bacillus megaterium DSM 319(NCBI Reference Sequence:WP_013082219.1), Trichoderma harzianum(GenBank:KKP07030.1), Aspergillus fumigatus R-ATAs(AspFum)(NCBI Reference Sequence:XP_748821.1), Geobacillus thermodenitrificans subsp.thermodenitrificans DSM 465(NCBI Reference Sequence:WP_008879436.1), Cladophialophora bantiana CBS 173.52(NCBI Reference Sequence:XP_016617948.1), Bacillus megaterium(NCBI Reference Sequence:WP_016763026.1), Burkholderia thailandensis MSMB121(BtS-TA)(GenBank:AGK49399.1), Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae MGH 78578(NCBI Reference Sequence:WP_002920226.1), Geobacillus toebii(NCBI Reference Sequence:WP_062753894.1) 및 Talaromyces cellulolyticus(GenBank:GAM37533.1)로부터 유래된다.
또한, 트랜스아미나제는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
또한, 아미노 보호기는 tert-부톡시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, 포르밀, 트리플루오로아세틸, 벤질, 트리페닐메틸 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐 중 어느 하나로부터 선택된다.
또한, 기질은,
Figure pct00002
,
Figure pct00003
,
Figure pct00004
,
Figure pct00005
,
Figure pct00006
,
Figure pct00007
,
Figure pct00008
,
Figure pct00009
,
Figure pct00010
및
Figure pct00011
중 어느 하나로부터 선택된다.
또한, 합성 방법은, 인산 완충액과 아미노 도너를 혼합하여 제1 혼합액을 얻는 단계, 제1 혼합액에 식 I로 표시되는 기질을 첨가하여 제2 혼합액을 얻는 단계; 제2 혼합액에 트랜스아미나제를 첨가하여 반응 혼합액을 얻는 단계; 반응 혼합액으로부터 키랄 디아민 화합물을 분리하여 얻는 단계를 포함한다.
또한, 제1 혼합액에 기질을 첨가하는 단계 이전에, 합성 방법은, 제1 혼합액의 pH를 7.0 ~ 9.0으로 조절하는 단계를 더 포함하고; 바람직하게는, 제2 혼합액에 트랜스아미나제를 첨가하고, 트랜스아미나제가 첨가된 제2 혼합액의 pH를 7.0 ~ 9.0으로 조절하여 반응 혼합액을 얻는다.
또한, 반응 혼합액으로부터 키랄 디아민 화합물을 분리하여 얻는 단계는, 반응 혼합액의 산성도를 조절하여 트랜스아미나제를 변성시키되, 바람직하게는 반응 혼합액의 pH를 1 ~ 2로 조절하는 단계; 변성된 트랜스아미나제를 여과하고 제거하여 예비 여과액을 얻는 단계; 예비 여과액의 pH를 염기성으로 조절하여 염기성 여과액을 얻는 단계; 염기성 여과액을 추출하여 키랄 디아민 화합물을 얻는 단계를 포함하고; 바람직하게는, 염기성 여과액의 pH는 12 ~ 13이며; 바람직하게는, 추출은 여러 회 수행되고, 더 바람직하게는 2 ~ 5회 수행되며, 보다 더 바람직하게는, 추출에서 처음에 디클로로메탄을 사용하여 추출하고, 그 후 나머지 횟수에서는 디클로로메탄 또는 아세트산에틸을 사용하여 추출한다.
또한, 추출 이후에, 추출하여 얻은 유기상을 건조시키는 단계를 더 포함하고, 바람직하게는, 매 회 추출에서 얻은 유기상을 합하여 추출물을 얻으며; 추출물을 건조시켜 건조한 유기상 생성물을 얻고; 건조한 유기상 생성물을 온도 ＜ 45 ℃이고 압력 ≤ -0.08 Mpa인 조건에서 유분이 없을 때까지 농축하여 키랄 디아민 화합물을 얻는다.
또한, 트랜스아미나제와 기질의 질량비는 0.4 : 1 ~ 1.0 : 1이다.
또한, 기질의 농도는 60 g/L ~ 100 g/L이다.
또한, 아미노 도너는 이소프로필아민, 이소프로필아민의 염산염, 알라닌, 페네틸아민 또는 n-부틸아민으로부터 선택된다.
본 발명의 기술적 해결수단을 적용함으로써, 식 I로 표시되는 기질에 대해 특이성을 갖는 트랜스아미나제를 사용하여 이러한 기질에서 키랄 디아민 화합물로의 전화에 대해 효과적으로 촉매 작용할 수 있고, 상기 트랜스아미나제는 다양한 식 I로 표시되는 기질에 대해 모두 높은 반응 선택성 및 활성을 갖는다. 따라서, 상기 바이오효소를 이용하여 키랄 디아민 화합물의 합성에 대해 촉매 작용을 수행하면, 더 광범위한 기질(선행기술에서 반응하여 얻은 것은 모두 1,2-디아민계 화합물이고, 본 발명에서는 1,3-디아민, 1,4-디아민 등 화합물을 합성할 수도 있음)에 적용될 뿐만 아니라, 상기 합성 방법의 경로가 짧고, 제품 수율이 높으며, 생산 비용을 크게 절감시키고, 유기 용매와 3가지 폐기물의 생성을 감소시킨다.
본 발명의 일부분을 구성하는 도면은 본 발명을 더 잘 이해하도록 하기 위해 제공되는 것으로, 본 발명의 예시적인 실시예 및 이에 대한 설명은 본 발명을 해석하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하지 않는다.
도 1은 본 발명의 실시예 11에서 동일한 양의 기질의 전화율에 대한 상이한 효소량의 영향을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예 12에서 상이한 농도의 기질의 전화율에 대한 동일한 효소량의 영향을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예 13에서 동일한 반응에서의 기질의 전화율에 대한 상이한 아미노 도너의 영향을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예 14에서 상이한 유래의 트랜스아미나제가 동일한 기질에 대해 모두 전화 활성을 가짐을 나타낸다.
설명해야 할 것은, 모순되지 않은 경우, 본 발명의 실시예 및 실시예의 특징은 서로 조합될 수 있다. 아래, 실시예를 기반으로 본 발명을 상세하게 설명한다.
배경기술에서 언급한 바와 같이, 선행기술에는 기질에 대한 키랄 디아민 화합물의 합성 방법의 적용 범위가 제한되어 있는 문제가 존재한다. 이러한 상황을 개선하기 위해, 본 발명의 발명자들은 고효율 및 친환경 관점에서 기존의 합성 경로를 개선하려고 노력하였다. 연구 과정에서, 발명자들은 출원인이 스스로 개발한 트랜스아미나제가, PLP를 보조 효소로 하는 트랜스아미나제가 갖고 있는 케톤계 화합물에 대해 촉매 작용하는 일반적인 촉매 작용 활성을 갖고 있을 뿐만 아니라, 다양한 상이한 기질에 대해 촉매 작용하고, 이를 키랄 디아민 화합물로 전화시키는 활성도 갖고 있음을 발견하였다. 또한 추가 연구에 따르면, 상기 트랜스아미나제를 사용하여 키랄 디아민 화합물의 합성에 대해 촉매 작용을 수행하는 경우, 기질 유형이 광범위할 뿐만 아니라, 1단계 반응으로 목적 생성물을 얻을 수도 있는 것을 발견하였다. 상기 트랜스아미나제를 사용하여 생물 전화 반응을 진행하면 선택성이 높으므로, 목적 생성물의 ee값을 크게 향상시킨다. 또한, 바이오효소를 사용하여 반응에 대해 촉매 작용을 수행하면 기질의 사용량을 향상시키고, 생산 효율을 크게 향상시키며, 유기 용매와 3가지 폐기물의 생성을 감소시킬 수 있다.
출원인은 상기 연구 결과를 바탕으로 본 발명의 기술적 해결수단을 제기하였다. 본 발명의 전형적인 일 실시형태에서, 키랄 디아민 화합물의 합성 방법을 제공하되, 상기 합성 방법은, 트랜스아미나제를 이용하여 식 I로 표시되는 기질을 키랄 디아민 화합물로 전화시키는 단계를 포함하고;
Figure pct00012
여기서, n = 1 ~ 10이고, R 그룹은 알킬, 시클로알킬, 헤테로 원자 함유 알킬, 헤테로 원자 함유 시클로알킬, 헤테로 원자 함유 아릴, 아미드계 화합물 잔기 또는 에테르계 화합물 잔기를 나타내며, R1과 R2는 동일하거나 상이하고, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-C3 알킬 또는 아미노 보호기이며, 상기 트랜스아미나제는 Chromobacterium violaceum DSM30191(CVTA)(NCBI Reference Sequence:WP_011135573.1), Fonsecaea pedrosoi CBS 271.37(NCBI Reference Sequence:XP_013286281.1), Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae Ecl8(GenBank:CCN29541.1), Mycobacterium goodii(GenBank:AKS36000.1), Paracoccus denitrificans(NCBI Reference Sequence:WP_011746975.1), Penicillium brasilianum(GenBank:CEJ55334.1), Enterobacter sp.TL3(NCBI Reference Sequence:WP_014885677.1), Aspergillus terreus NIH2624(NCBI Reference Sequence:XP_001209325.1), Exophiala spinifera(NCBI Reference Sequence:XP_016233821.1), Deinococcus geothermalis(strain DSM 11300)(NCBI Reference Sequence:WP_011530545.1), Geomyces destructans 20631-21(GdTA)in E.coli(GenBank:ELR05573.1), Pseudomonas putida KT2440(NCBI Reference Sequence:WP_010954554.1), Lysinibacillus sphaericus(NCBI Reference Sequence:WP_024363741.1), Bacillus megaterium DSM 319(NCBI Reference Sequence:WP_013082219.1), Trichoderma harzianum(GenBank:KKP07030.1), Aspergillus fumigatus R-ATAs(AspFum)(NCBI Reference Sequence:XP_748821.1), Geobacillus thermodenitrificans subsp.thermodenitrificans DSM 465(NCBI Reference Sequence:WP_008879436.1), Cladophialophora bantiana CBS 173.52(NCBI Reference Sequence:XP_016617948.1), Bacillus megaterium(NCBI Reference Sequence:WP_016763026.1), Burkholderia thailandensis MSMB121(BtS-TA)(GenBank:AGK49399.1), Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae MGH 78578(NCBI Reference Sequence:WP_002920226.1), Geobacillus toebii(NCBI Reference Sequence:WP_062753894.1) 및 Talaromyces cellulolyticus(GenBank:GAM37533.1)로부터 유래된다.
바람직하게는, 상기 트랜스아미나제는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖되, 각각 다음과 같다.
Figure pct00013
상술한 바와 같이, 본 발명의 상기 트랜스아미나제는 식 I로 표시되는 기질에 대해 기질 특이성을 가지며, 이러한 기질에서 키랄 디아민 화합물로의 전화에 대해 효과적으로 촉매 작용할 수 있고, 상기 트랜스아미나제는 다양한 식 I로 표시되는 기질에 대해 모두 높은 반응 선택성 및 활성을 갖는다. 따라서, 상기 바이오효소를 이용하여 키랄 디아민 화합물의 합성에 대해 촉매 작용을 수행하면, 더 광범위한 기질(선행기술에서 반응하여 얻은 것은 모두 1,2-디아민계 화합물이고, 본 발명에서는 1,3-디아민, 1,4-디아민 등 화합물을 합성할 수도 있음)에 적용될 뿐만 아니라, 상기 합성 방법은 경로가 짧고, 제품 수율이 높으며, 생산 비용을 크게 절감시키고, 유기 용매와 3가지 폐기물의 생성을 감소시킨다.
상기 기질에서 “헤테로 원자 함유 알킬, 헤테로 원자 함유 시클로알킬, 헤테로 원자 함유 아릴” 중의 헤테로 원자는 O, S 및 N 중 적어도 하나일 수 있다.
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 상기 트랜스아미나제는 모두 ω-트랜스아미나제(ω-transaminase), Chromobacterium violaceum DSM30191(CVTA)로부터 유래된다.
상기 아미노 보호기는 tert-부톡시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, 포르밀, 트리플루오로아세틸, 벤질, 트리페닐메틸 또는 9-플루오레닐메톡시카르보닐을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
바람직한 일 실시예에서, 식 I로 표시되는 기질은,
Figure pct00014
,
Figure pct00015
,
Figure pct00016
,
Figure pct00017
,
Figure pct00018
,
Figure pct00019
,
Figure pct00020
,
Figure pct00021
,
Figure pct00022
및
Figure pct00023
중 어느 하나로부터 선택된다.
본 발명의 트랜스아미나제는 상기 식 I로 표시되는 기질에 대해 모두 촉매 작용 활성 및 입체 선택성을 갖는다.
본 발명의 트랜스아미나제를 사용하여 식 I로 표시되는 기질의 아미노기 전이 반응에 대해 촉매 작용을 수행하는 구체적인 단계는 기존의 아미노기 전이 반응과 유사하다. 바람직한 일 실시예에서, 상기 합성 방법은, 인산 완충액과 아미노 도너를 혼합하여 제1 혼합액을 얻는 단계; 제1 혼합액에 식 I로 표시되는 기질을 첨가하여 제2 혼합액을 얻는 단계; 제2 혼합액에 트랜스아미나제를 첨가하여 반응 혼합액을 얻는 단계; 반응 혼합액으로부터 키랄 디아민 화합물을 분리하여 얻는 단계를 포함한다.
상기 합성 방법은 상기 단계별 반응을 통해 반응 부피를 감소시켜 기질에 대한 트랜스아미나제의 촉매 작용 활성 및 효율을 향상시킴으로써, 높은 제품 수율을 얻고, 생산 효율을 향상시킨다.
바람직한 일 실시예에서, 제1 혼합액에 식 I로 표시되는 기질을 첨가하는 단계 이전에, 합성 방법은, 제1 혼합액의 pH를 7.0 ~ 9.0으로 조절하는 단계를 더 포함하고; 바람직하게는, 제2 혼합액에 트랜스아미나제를 첨가하고, 트랜스아미나제가 첨가된 제2 혼합액의 pH를 7.0 ~ 9.0으로 조절하여 반응 혼합액을 얻는다.
상기 바람직한 실시예에서, 제1 혼합액에 식 I로 표시되는 기질을 첨가하기 전에 제1 혼합액의 pH를 조절하는 것은, 효소를 첨가하기 전에 효소 반응에 가장 적합한 pH로 조절하여 효소가 첨가 과정에서 불활성화되는 것을 방지하기 위한 것이다. 제2 혼합액에 트랜스아미나제를 첨가한 후에도 시스템의 pH를 조절하는데, 그 작용은 반응이 가장 적합한 pH의 조건에서 진행되도록 확보하는 것이다. 상기 두 번의 pH 조절의 범위를 동일하게 유지하는 것이 좋은데, 예를 들어, 앞에서 7.8로 조절하였으면 트랜스아미나제를 첨가한 후에도 7.8로 조절하는 것이 좋다.
반응 후의 혼합액으로부터 목적 생성물을 분리하여 얻는 상기 단계는 공지된 분리, 정제 방법으로 수행될 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 반응 혼합액으로부터 키랄 디아민 화합물을 분리하여 얻는 단계는, 반응 혼합액의 산성도를 조절하여 트랜스아미나제를 변성시키되, 바람직하게는 반응 혼합액의 pH를 1 ~ 2로 조절하는 단계; 변성된 트랜스아미나제를 여과하고 제거하여 예비 여과액을 얻는 단계; 예비 여과액의 pH를 염기성으로 조절하여 염기성 여과액을 얻는 단계; 염기성 여과액을 추출하여 키랄 디아민 화합물을 얻는 단계를 포함하고; 바람직하게는, 염기성 여과액의 pH는 12 ~ 13이며; 바람직하게는, 추출 은 여러 회 수행되고, 더 바람직하게는 2 ~ 5회 수행되며, 보다 더 바람직하게는, 추출에서 처음에 디클로로메탄을 사용하여 추출하고, 그 후 나머지 횟수에서는 디클로로메탄 또는 아세트산에틸을 사용하여 추출한다.
다른 변성 방식(예를 들어, 고온, 알킬리 조절 또는 염석)에 비해, 산성도를 조절하는 방식으로 반응 후의 효소 단백질을 변성시키면, 변성이 비교적 철저하고, 대부분의 생성물이 산성 조건에서 안정적이며, 후속 조작이 산성 조건에서 시스템의 다른 불순물을 직접 추출할 수 있는 장점이 있다. 처음에 디클로로메탄을 사용하여 추출하는 목적은, 시스템 중 산성 조건으로 인해 추출될 수 있는 불순물을 제거하는 것이다. 다른 추출 용매(예를 들어, 아세트산에틸, 메틸 tert-부틸 에테르 또는 이소프로필 아세테이트)를 사용하여 추출하는 것에 비해 추출 효율이 높은 장점이 있다.
순도 및 수율을 더욱 향상시키기 위해, 바람직한 일 실시예에서, 추출 이후에, 추출하여 얻은 유기상을 건조시키는 단계를 더 포함하고, 바람직하게는, 매 회 추출에서 얻은 유기상을 합하여 추출물을 얻고; 추출물을 건조시켜 건조한 유기상 생성물을 얻으며; 건조한 유기상 생성물을 온도 ＜ 45 ℃이고 압력 ≤ -0.05 Mpa인 조건에서 유분이 없을 때까지 농축한다(건조시키는 목적은 제품의 수분 함량을 감소시키는 것이고, 압력 크기는 농축 속도에 영향을 미침).
바람직한 일 실시예에서, 트랜스아미나제와 식 I로 표시되는 기질의 질량비는 0.4 : 1 ~ 1.0 : 1이고, 상기 질량비에 따라 반응시키면, 기질의 전화 효율은 92 % 이상에 도달할 수있다.
바람직한 일 실시예에서, 식 I로 표시되는 기질의 농도는 60 g/L ~ 100 g/L이다. 상기 농도 범위에서, 바이오효소를 사용하여 반응시키면, 기질의 전화율이 95 % 이상으로 높게 도달하므로, 생산 효율을 향상시키고 유기 용매와 3가지 폐기물의 생성을 감소시키는데 도움된다.
바람직한 일 실시예에서, 아미노 도너는 이소프로필아민, 이소프로필아민의 염산염, 알라닌, 페네틸아민 또는 n-부틸아민으로부터 선택된다.
아래, 구체적인 실시예와 결부하여 본 발명의 유익한 효과를 더 설명한다. 설명해야 할 것은, 이하 실시예에서 실온은 10 ~ 25 ℃의 상온 온도 범위 내의 온도를 의미하고, 이하 실시예 1 내지 실시예 15에서 사용된 트랜스아미나제는 SEQ ID NO: 4로 표시되는 트랜스아미나제이다.
실시예 1
실온에서 250 mL의 4구 플라스크 내에 50 mL의 100 mmol/L의 인산염 완충액(5 vol), 24 mL의 5 mol/L의 이소프로필아민 염산염 용액(2.4 vol, 3 eq)을 넣고, pH = 7.5 ~ 8.0으로 조절하였다. 다음, 0.1 g의 인산피리독살(1 wt%), 10 g의
Figure pct00024
을 첨가하여 균일하게 교반한 다음, 10 mL(0.5 wt, 0.5 g/mL)의 트랜스아미나제 효소 용액을 첨가하여 pH = 7.5 ~ 8.0으로 조절하였다. 30 ℃로 승온시키고 교반하여 밤새 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 시스템의 산성도를 pH = 1로 조절하여 단백질을 변성시켰다. 여과 후 여과액을 50 mL의 디클로로메탄으로 추출하였다. 수상을 pH = 12로 조절한 다음, 50 mL의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기상을 합하고 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 유기상을 T ＜ 35 ℃, P ≤ -0.06 Mpa인 조건에서 유분이 없을 때까지 농축하였다. 이로써 목적 생성물
Figure pct00025
을 얻었다.
HPLC로 검출한 결과: 순도 ＞ 98 %, ee값 ＞ 99 %, 수율: 90 %.
실시예 2
실온에서 250 mL의 4구 플라스크 내에 60 mL의 100 mmol/L의 인산염 완충액(6 vol), 18 mL의 5 mol/L의 이소프로필아민 염산염 용액(1.8 vol, 3 eq)을 넣고, pH = 8.0 ~ 8.5로 조절하였다. 다음, 0.1 g의 인산피리독살(1 wt%), 10 g의
Figure pct00026
을첨가하여 균일하게 교반한 다음, 10 mL(0.5 wt, 0.5 g/mL)의 트랜스아미나제 효소 용액을 첨가하여 pH = 8.0 ~ 8.5로 조절하였다. 온도를 20 ℃로 조절하고 교반하여 밤새 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 시스템의 산성도를 pH = 2로 조절하여 단백질을 변성시켰다. 여과 후 여과액을 50 mL의 디클로로메탄으로 추출하였다. 수상을 pH = 13으로 조절한 다음, 50 mL의 아세트산에틸로 3회 추출하였다. 유기상을 합하고 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 유기상을 T ＜ 45 ℃, P ≤ -0.08 Mpa인 조건에서 유분이 없을 때까지 농축하였다. 이로써 목적 생성물
Figure pct00027
을 얻었다.
HPLC로 검출한 결과: 순도 ＞ 92 %, ee값 ＞ 99 %, 수율: 86 %.
실시예 3
실온에서 250 mL의 4구 플라스크 내에 70 mL의 100 mmol/L의 인산염 완충액(7 vol), 13 mL의 5 mol/L의 이소프로필아민 염산염 용액(1.3 vol, 3 eq)을 넣고, pH = 7.0 ~ 7.5로 조절하였다. 다음, 0.1 g의 인산피리독살(1 wt%), 10 g의
Figure pct00028
을 첨가하여 균일하게 교반한 다음, 10 mL(0.5 wt, 0.5 g/mL)의 트랜스아미나제 효소 용액을 첨가하고, 50 ℃로 승온시키고 교반하여 밤새 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 시스템의 산성도를 pH = 1로 조절하여 단백질을 변성시켰다. 여과 후 여과액을 50 mL의 디클로로메탄으로 추출하였다. 수상을 pH = 13으로 조절한 다음, 50 mL의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기상을 합하고 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 유기상을 T ＜ 35 ℃, P ≤ -0.06 Mpa인 조건에서 유분이 없을 때까지 농축하였다. 이로써 목적 생성물
Figure pct00029
을 얻었다.
HPLC로 검출한 결과: 순도: 97 % 초과, ee값 ＞ 99 %, 수율: 78 %.
실시예 4
실온에서 250 mL의 4구 플라스크 내에 50 mL의 100 mmol/L의 인산염 완충액(5 vol), 38 mL의 5 mol/L의 이소프로필아민 염산염 용액(3.8 vol, 3 eq)을 넣고, pH = 8.5 ~ 9.0으로 조절하였다. 다음, 0.1 g의 인산피리독살(1 wt%), 10 g의
Figure pct00030
을 첨가하여 균일하게 교반한 다음, 10 mL(0.5 wt, 0.5 g/mL)의 트랜스아미나제 효소 용액을 첨가하여 pH = 8.5 ~ 9.0으로 조절하였다. 온도를 10 ℃로 조절하고 교반하여 밤새 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 시스템의 산성도를 pH = 2로 조절하여 단백질을 변성시켰다. 여과 후 여과액을 50 mL의 디클로로메탄으로 추출하였다. 수상을 pH = 13으로 조절한 다음, 50 mL의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기상을 합하고 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 유기상을 T ＜ 35 ℃, P ≤ -0.06 Mpa인 조건에서 유분이 없을 때까지 농축하였다. 이로써 목적 생성물
Figure pct00031
을 얻었다.
HPLC로 검출한 결과: 순도 ＞ 95 %, ee값 ＞ 99 %, 수율: 79 %.
실시예 5
실온에서 250 mL의 4구 플라스크 내에 70 mL의 100 mmol/L의 인산염 완충액(7 vol), 17 mL의 5 mol/L의 이소프로필아민 염산염 용액(1.7 vol, 3 eq)을 넣고, pH = 7.5 ~ 8.0으로 조절하였다. 다음, 0.1 g의 인산피리독살(1 wt%), 10 g의
Figure pct00032
을 첨가하여 균일하게 교반한 다음, 10 mL(0.5 wt, 0.5 g/mL)의 트랜스아미나제 효소 용액을 첨가하여 pH = 7.5 ~ 8.0으로 조절하였다. 29 ℃로 승온시키고 교반하여 밤새 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 시스템의 산성도를 pH = 1로 조절하여 단백질을 변성시켰다. 여과 후 여과액을 50 mL의 디클로로메탄으로 추출하였다. 수상을 pH = 12로 조절한 다음, 50 mL의 아세트산에틸로 3회 추출하였다. 유기상을 합하고 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 유기상을 T ＜ 45 ℃, P ≤ -0.08 Mpa인 조건에서 유분이 없을 때까지 농축하였다. 이로써 목적 생성물
Figure pct00033
을 얻었다.
HPLC로 검출한 결과: 순도 ＞ 98 %, ee값 ＞ 99 %, 수율: 87 %.
실시예 6
실온에서 500 mL의 4구 플라스크 내에 140 mL의 100 mmol/L의 인산염 완충액(7 vol), 50 mL의 5 mol/L의 이소프로필아민 염산염 용액(1.7 vol, 3 eq)을 넣고, pH = 7.5 ~ 8.0으로 조절하였다. 다음, 0.2 g의 인산피리독살(1 wt%), 20 g의
Figure pct00034
을 첨가하여 균일하게 교반한 다음, 20 mL(0.5 wt, 0.5 g/mL)의 트랜스아미나제 효소 용액을 첨가하여 pH = 7.5 ~ 8.0으로 조절하였다. 32 ℃로 승온시키고 교반하여 밤새 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 시스템의 산성도를 pH = 1로 조절하여 단백질을 변성시켰다. 여과 후 여과액을 100 mL의 디클로로메탄으로 추출하였다. 수상을 pH = 12로 조절한 다음, 100 mL의 아세트산에틸로 3회 추출하였다. 유기상을 합하고 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 유기상을 T ＜ 45 ℃, P ≤ -0.08 Mpa인 조건에서 유분이 없을 때까지 농축하였다. 이로써 목적 생성물
Figure pct00035
을 얻었다.
HPLC로 검출한 결과: 순도 ＞ 97 %, ee값 ＞ 99 %, 수율: 84 %.
실시예 7
실온에서 500 mL의 4구 플라스크 내에 220 mL의 100 mmol/L의 인산염 완충액(11 vol), 50 mL의 5 mol/L의 이소프로필아민 염산염 용액(2.5 vol, 3 eq)을 넣고, pH = 7.5 ~ 8.0으로 조절하였다. 다음, 0.2 g의 인산피리독살(1 wt%), 20 g의
Figure pct00036
을 첨가하여 균일하게 교반한 다음, 40 mL(1.0 wt, 0.5 g/mL)의 트랜스아미나제 효소 용액을 첨가하여 pH = 7.5 ~ 8.0으로 조절하였다. 32 ℃로 승온시키고 교반하여 밤새 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 시스템의 산성도를 pH = 1로 조절하여 단백질을 변성시켰다. 여과 후 여과액을 100 mL의 디클로로메탄으로 추출하였다. 수상을 pH = 12로 조절한 다음, 100 mL의 아세트산에틸로 3회 추출하였다. 유기상을 합하고 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 유기상을 T ＜ 45 ℃, P ≤ -0.08 Mpa인 조건에서 유분이 없을 때까지 농축하였다. 이로써 목적 생성물
Figure pct00037
을 얻었다.
HPLC로 검출한 결과: 순도 ＞ 95 %, ee값 ＞ 99 %, 수율: 85 %.
실시예 8
실온에서 500 mL의 4구 플라스크 내에 180 mL의 100 mmol/L의 인산염 완충액(12 vol), 36 mL의 5 mol/L의 이소프로필아민 염산염 용액(2.4 vol, 3 eq)을 넣고, pH = 7.5 ~ 8.0으로 조절하였다. 다음, 0.15 g의 인산피리독살(1 wt%), 15 g의
Figure pct00038
을 첨가하여 균일하게 교반한 다음, 30 mL(1.0 wt, 0.5 g/mL)의 트랜스아미나제 효소 용액을 첨가하여 pH = 7.5 ~ 8.0으로 조절하였다. 35 ℃로 승온시키고 교반하여 밤새 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 시스템의 산성도를 pH = 1로 조절하여 단백질을 변성시켰다. 여과 후 여과액을 100 mL의 디클로로메탄으로 추출하였다. 수상을 pH = 12로 조절한 다음, 100 mL의 아세트산에틸로 3회 추출하였다. 유기상을 합하고 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 유기상을 T ＜ 45 ℃, P ≤ -0.08 Mpa인 조건에서 유분이 없을 때까지 농축하였다. 이로써 목적 생성물
Figure pct00039
을 얻었다.
HPLC로 검출한 결과: 순도 ＞ 96 %, ee값 ＞ 99 %, 수율: 91 %.
실시예 9
실온에서 500 mL의 4구 플라스크 내에 180 mL의 100 mmol/L의 인산염 완충액(12 vol), 26 mL의 5 mol/L의 이소프로필아민 염산염 용액(1.7 vol, 3 eq)을 넣고, pH = 7.5 ~ 8.0으로 조절하였다. 다음, 0.15 g의 인산피리독살(1 wt%), 15 g의
Figure pct00040
을 첨가하여 균일하게 교반한 다음, 30 mL(1.0 wt, 0.5 g/mL)의 트랜스아미나제 효소 용액을 첨가하여 pH = 7.5 ~ 8.0으로 조절하였다. 40 ℃로 승온시키고 교반하여 밤새 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 시스템의 산성도를 pH = 1로 조절하여 단백질을 변성시켰다. 여과 후 여과액을 100 mL의 디클로로메탄으로 추출하였다. 수상을 pH = 12로 조절한 다음, 100 mL의 아세트산에틸로 3회 추출하였다. 유기상을 합하고 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 유기상을 T ＜ 45 ℃, P ≤ -0.08 Mpa인 조건에서 유분이 없을 때까지 농축하였다. 이로써 목적 생성물
Figure pct00041
을 얻었다.
HPLC로 검출한 결과: 순도 ＞ 97 %, ee값 ＞ 99 %, 수율: 90 %.
실시예 10
실온에서 500 mL의 4구 플라스크 내에 110 mL의 100 mmol/L의 인산염 완충액(11 vol), 23 mL의 5 mol/L의 이소프로필아민 염산염 용액(2.3 vol, 3 eq)을 넣고, pH = 7.5 ~ 8.0으로 조절하였다. 다음, 0.1 g의 인산피리독살(1 wt%), 10 g의
Figure pct00042
을 첨가하여 균일하게 교반한 다음, 10 mL(0.5 wt, 0.5 g/mL)의 트랜스아미나제 효소 용액을 첨가하여 pH = 7.5 ~ 8.0으로 조절하였다. 40 ℃로 승온시키고 교반하여 밤새 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 시스템의 산성도를 pH = 2로 조절하여 단백질을 변성시켰다. 여과 후 여과액을 50 mL의 디클로로메탄으로 추출하였다. 수상을 pH = 12로 조절한 다음, 50 mL의 아세트산에틸로 3회 추출하였다. 유기상을 합하고 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 유기상을 T ＜ 45 ℃, P ≤ -0.08 Mpa인 조건에서 유분이 없을 때까지 농축하였다. 이로써 목적 생성물
Figure pct00043
을 얻었다.
HPLC로 검출한 결과: 순도 ＞ 95 %, ee값 ＞ 99 %, 수율: 83 %.
실시예 11
실시예 2를 예로 들어, 반응의 효소량을 최적화하는 구체적인 조작은 다음과 같다. 실온에서 10 mL의 바이알 내에 1.2 mL의 100 mmol/L의 인산염 완충액(6 vol), 0.36 mL의 5 mol/L의 이소프로필아민 염산염 용액(1.8 vol, 3 eq)을 넣고, pH = 8.0 ~ 8.5로 조절하였다. 다음, 0.002 g의 인산피리독살(1 wt%), 0.2 g의
Figure pct00044
을 첨가하여 균일하게 혼합하고, 0.04 mL, 0.08 mL, 0.12 mL, 0.16 mL, 0.2 mL, 0.24 mL, 0.28 mL, 0.32 mL, 0.36 mL, 0.4 mL, 0.44 mL, 0.48 mL, 0.52 mL, 0.56 mL, 0.6 mL의 트랜스아미나제 효소 용액(효소 용액의 농도는 0.5 g/mL이고, 대응되는 질량비는 각각 0.1 wt, 0.2 wt, 0.3 wt, 0.4 wt, 0.5 wt, 0.6 wt, 0.7 wt, 0.8 wt, 0.9 wt, 1.0 wt, 1.1 wt, 1.2 wt, 1.3 wt, 1.4 wt, 1.5 wt임)을 각각 첨가하여 pH = 8.0 ~ 8.5로 조절하였다. 쉐이커의 회전 속도는 170 rpm이고, 29 ℃로 승온시킨 조건에서 밤새 반응시켰다. 전화율 결과는 도 1에 도시된 바와 같이, 0.5 ~ 1.0 wt의 기질의 전화율이 99 %를 초과할 수 있고, 효소량을 계속 증가시켜도 유의적인 효과가 없음을 증명하였다.
실시예 12
실시예 2를 예로 들어, 반응의 기질의 농도를 최적화하는 구체적인 조작은 다음과 같다. 실온에서 10 ~ 50 mL의 바이알 내(반응 부피에 따라 적합한 쉐이크 플라스크를 선택함)에 0.58 mL, 0.66 mL, 0.78 mL, 0.9 mL, 1.06 mL, 1.24 mL, 1.44 mL, 1.74 mL, 2.1 mL, 2.56 mL, 3.24 mL, 4.24 mL, 5.84 mL, 9.24 mL의 100 mmol/L의 인산염 완충액(각각 2.9 vol, 3.3 vol, 3.9 vol, 4.5 vol, 5.3 vol, 6.2 vol, 7.2 vol, 8.7 vol, 10.5 vol, 12.8 vol, 16.2 vol, 21.2 vol, 29.2 vol, 46.2 vol임)을 각각 넣고, 0.36 mL의 5 mol/L의 이소프로필아민 염산염 용액(1.8 vol, 3 eq)을 첨가하여 pH = 8.0 ~ 8.5로 조절하였다. 다음, 0.002 g의 인산피리독살(1 wt%), 0.2 g(1 vol, 0.2 mL)의
Figure pct00045
을 첨가하여 균일하게 혼합하고, 0.2 mL(1 vol,0.5 wt, 효소 용액의 농도는 0.5 g/mL임)의 트랜스아미나제 효소 용액을 첨가하여 pH = 8.0 ~ 8.5로 조절하였다. 쉐이커의 회전 속도는 170 rpm이고, 29 ℃로 승온시킨 조건에서 밤새 반응시켰다. 도 2에 도시된 바와 같이, 60 ~ 100 g/L의 농도에서, 기질의 전화율이 99 %를 초과할 수 있음을 증명하였다. 기질의 농도를 계속 감소시키면 반응 부피를 증가시키고, 3가지 폐기물의 생성량을 증가시킬 수 있으며, 전화율이 더 이상 유의적으로 향상되는 효과가 없다.
실시예 13
실시예 2를 예로 들어, 반응의 아미노 도너를 최적화하는 구체적인 조작은 다음과 같다. 실온에서 10 mL의 바이알 내에 1.2 mL의 100 mmol/L의 인산염 완충액(6 vol)을 넣고, 3 eq의 아미노 도너의 시스템(아미노 도너는 각각 이소프로필아민, 이소프로필아민 염산염, 알라닌, 아닐린, n-부틸아민임)을 각각 사용하여 pH = 8.0 ~ 8.5로 조절하였다. 다음, 0.002 g의 인산피리독살(1 wt%), 0.2 g의
Figure pct00046
을 첨가하여 균일하게 혼합하고, 0.2 mL(0.5 wt, 효소 용액의 농도는 0.5 g/mL)의 트랜스아미나제 효소 용액을 첨가하여 pH = 8.0 ~ 8.5로 조절하였다. 쉐이커의 회전 속도는 170 rpm이고, 29 ℃로 승온시킨 조건에서 밤새 반응시켰다. 전화율 결과는 도 3에 도시된 바와 같이, 이소프로필아민, 이소프로필아민 염산염, 알라닌, n-부틸아민을 아미노 도너로 사용하면 기질의 전화율이 99 %를 초과할 수 있음을 증명하였다. 아닐린을 아미노 도너로 사용한 반응 조건에서 전화율은 89 %에 불과하다.
실시예 14
실시예 1의 기질을 예로 들어, Chromobacterium violaceum DSM30191(CVTA)(NCBI Reference Sequence:WP_011135573.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA1로 설정하고, Fonsecaea pedrosoi CBS 271.37(NCBI Reference Sequence:XP_013286281.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA2로 설정하며, Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae Ecl8(GenBank:CCN29541.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA3으로 설정하고, Mycobacterium goodii(GenBank:AKS36000.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA4로 설정하며, Paracoccus denitrificans(NCBI Reference Sequence:WP_011746975.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA5로 설정하고, Penicillium brasilianum(GenBank:CEJ55334.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA6으로 설정하며, Enterobacter sp.TL3(NCBI Reference Sequence:WP_014885677.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA7로 설정하고, Aspergillus terreusNIH2624(NCBI Reference Sequence:XP_001209325.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA8로 설정하며, Exophiala spinifera(NCBI Reference Sequence:XP_016233821.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA9로 설정하고，Deinococcus geothermalis(strain DSM 11300)(NCBI Reference Sequence:WP_011530545.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA10으로 설정하며, Geomyces destructans 20631-21(GdTA)in E.coli(GenBank:ELR05573.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA11로 설정하고, Pseudomonas putida KT2440(NCBI Reference Sequence:WP_010954554.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA12로 설정하며, Lysinibacillus sphaericus(NCBI Reference Sequence:WP_024363741.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA13으로 설정하고, Bacillus megaterium DSM 319(NCBI Reference Sequence:WP_013082219.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA14로 설정하며, Trichoderma harzianum(GenBank:KKP07030.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA15로 설정하고, Aspergillus fumigatus R-ATAs(AspFum)(NCBI Reference Sequence:XP_748821.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA16으로 설정하며, Geobacillus thermodenitrificans subsp.thermodenitrificans DSM 465(NCBI Reference Sequence:WP_008879436.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA17로 설정하고, Cladophialophora bantiana CBS 173.52(NCBI Reference Sequence:XP_016617948.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA18로 설정하며, Bacillus megaterium(NCBI Reference Sequence:WP_016763026.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA19로 설정하고, Burkholderia thailandensis MSMB121(BtS-TA)(GenBank:AGK49399.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA20으로 설정하며, Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae MGH78578(NCBI Reference Sequence:WP_002920226.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA21로 설정하고, Geobacillus toebii(NCBI Reference Sequence:WP_062753894.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA22로 설정하며, Talaromyces cellulolyticus(GenBank:GAM37533.1) 유래 트랜스아미나제의 번호를 TA23으로 설정하고，Chromobacterium violaceum DSM30191(CVTA)(NCBI Reference Sequence:WP_011135573.1) 유래 트랜스아미나제로 진화시켜 얻은 돌연변이체 TA1-V1(대응되는 서열은 SEQ ID NO：1임)，TA1-V2(대응되는 서열은 SEQ ID NO：2임), TA1-V3(대응되는 서열은 SEQ ID NO：3임)，TA1-V4(대응되는 서열은 SEQ ID NO：4임)에 대해 10 mg 레벨 스크리닝 반응을 진행하는 조작은 다음과 같다.
100 mmol/L의 인산염 완충액, 5 mol/L의 이소프로필아민 염산염 용액을 5 : 2의 부피비로 하여 50 mL의 용액을 조제한 다음, 0.005 g의 인산피리독살을 첨가하여 균일하게 교반하였다. 0.3 mL의 상기 용액을 각각 96웰 플레이트에 넣고, 10 mg의
Figure pct00047
을 첨가한 다음, 0.2 mL(10 wt, 효소 용액의 농도는 0.5 g/mL임)의 상기 효소 용액을 각각 첨가하며, 쉐이커의 회전 속도는 170 rpm이고, 30 ℃로 승온시킨 조건에서 밤새 반응시켰다.
스크리닝 결과는 도 4에 도시된 바와 같이, 모든 유래의 효소는 상기 기질에 대해 모두 촉매 작용 활성을 갖고, Chromobacterium violaceum DSM30191(CVTA) 유래 트랜스아미나제가 가장 우수하며, Chromobacterium violaceum DSM30191(CVTA) 유래 트랜스아미나제로 돌연변이시키면, 더 우수한 전화율을 갖는 4개의 돌연변이체를 얻었고 전화율이 모두 99 %를 초과함을 증명하였다.
이상의 설명으로부터 알 수 있는 바, 본 발명에 따른 실시예는 다음과 같은 기술적 효과를 구현한다.
1) 트랜스아미나제를 사용하여 상기 생물 전화 반응을 진행하면 1단계 반응으로 원하는 목적 화합물을 직접 얻을 수 있고, 기질의 유형이 광범위하게 적용되며, 본 발명의 화합물을 합성할 수 있을 뿐만 아니라, 1,3-디아민, 1,4-디아민 등 화합물을 합성할 수도 있다.
2) 트랜스아미나제를 사용하여 상기 생물 전화 반응을 진행하면 선택성이 매우 높고, 제품의 키랄 순도가 향상되어 제품의 ee값을 크게 향상시킨다.
3) 스스로 추출한 전술한 트랜스아미나제를 사용하면, 기질의 농도는 100 g/L에 도달할 수 있으므로, 생산 효율을 크게 향상시킨다.
4) 트랜스아미나제를 사용하여 생체 촉매 작용을 수행하면, 중금속 촉매, 아지드 화합물 및 시안화 시약을 사용할 필요없다. 따라서 녹색 화학을 구현한다.
5) 상기 트랜스아미나제는 촉매 작용 효율이 높고, 반응 부피가 작으며, 합성 경로가 짧고, 제품 수율이 높으므로, 3가지 폐기물을 크게 감소시키고, 생산 비용을 절감시킨다.
상술한 내용은 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐 본 발명을 제한하지 않으며, 당업자에게 있어서, 본 발명은 다양한 수정 및 변경이 이루어질 수 있다. 본 발명의 사상 및 원칙 내에서 진행된 임의의 수정, 등가적 대체, 개선 등은 모두 본 발명의 보호범위 내에 포함되어야 한다.
<110> Asymchem Laboratories (Tianjin) Co., Ltd. <120> Method for Synthesizing a Chiral Diamine Compound <130> PI-22-1110_CN <140> 10-2022-7033472 <141> 2022-09-26 <150> PCT/CN <151> 2020-02-26 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 459 <212> PRT <213> Chromobacterium violaceum <400> 1 Met Gln Lys Gln Arg Thr Cys Ser Gln Trp Arg Glu Leu Asp Ala Ala 1 5 10 15 His His Leu His Pro Phe Thr Asp Thr Ala Ser Leu Asn Gln Ala Gly 20 25 30 Ala Arg Val Met Thr Arg Gly Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Cys Glu 35 40 45 Gly Asn Lys Ile Ile Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val 50 55 60 Gly Tyr Gly Arg Lys Asp Phe Ala Glu Ala Ala Arg Arg Gln Met Glu 65 70 75 80 Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Phe Tyr Lys Thr Thr His Pro Ala Val 85 90 95 Val Glu Leu Ser Ser Leu Leu Ala Glu Val Thr Pro Ala Gly Phe Asp 100 105 110 Arg Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Met Ile 115 120 125 Arg Met Val Arg Arg Tyr Trp Asp Val Gln Gly Lys Pro Glu Lys Lys 130 135 140 Thr Leu Ile Gly Arg Trp Trp Gly Tyr His Gly Ser Thr Ile Gly Gly 145 150 155 160 Ala Ser Leu Gly Gly Phe Lys Tyr Met His Glu Gln Gly Asp Leu Pro 165 170 175 Ile Pro Gly Met Ala His Ile Glu Gln Pro Trp Trp Tyr Lys His Gly 180 185 190 Lys Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Val Val Ala Ala Arg Trp Leu 195 200 205 Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Gly Ala Asp Lys Val Ala Ala Phe Val 210 215 220 Gly Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro Pro Ala Thr 225 230 235 240 Tyr Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ile Cys Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu 245 250 255 Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe 260 265 270 Gly His Gln His Phe Gly Phe Gln Pro Asp Leu Phe Thr Ala Ala Lys 275 280 285 Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Ala Val Phe Val Gly Lys 290 295 300 Arg Val Ala Glu Gly Leu Ile Ala Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe 305 310 315 320 Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Cys Ala Ala Val Ala His Ala Asn Val 325 330 335 Ala Ala Leu Arg Asp Glu Gly Ile Val Gln Arg Val Lys Asp Asp Ile 340 345 350 Gly Pro Tyr Met Gln Lys Arg Trp Arg Glu Thr Phe Ser Arg Phe Glu 355 360 365 His Val Asp Asp Val Arg Gly Val Gly Met Leu Leu Ala Phe Thr Leu 370 375 380 Val Lys Asn Lys Ala Lys Arg Glu Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Ile 385 390 395 400 Gly Thr Leu Cys Arg Asp Ile Phe Phe Arg Asn Asn Leu Ile Met Asp 405 410 415 Ser Cys Gly Asp His Ile Val Cys Ala Pro Pro Leu Val Met Thr Arg 420 425 430 Ala Glu Val Asp Glu Met Leu Ala Val Ala Glu Arg Cys Leu Glu Glu 435 440 445 Phe Glu Gln Thr Leu Lys Ala Arg Gly Leu Ala 450 455 <210> 2 <211> 459 <212> PRT <213> Chromobacterium violaceum <400> 2 Met Gln Lys Gln Arg Thr Cys Ser Gln Trp Arg Glu Leu Asp Ala Ala 1 5 10 15 His His Leu His Pro Phe Thr Asp Thr Ala Ser Leu Asn Gln Ala Gly 20 25 30 Ala Arg Val Met Thr Arg Gly Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Cys Glu 35 40 45 Gly Asn Lys Ile Ile Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val 50 55 60 Gly Tyr Gly Arg Lys Asp Phe Ala Glu Ala Ala Arg Arg Gln Met Glu 65 70 75 80 Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Phe Tyr Lys Thr Thr His Pro Ala Val 85 90 95 Val Glu Leu Ser Ser Leu Leu Ala Glu Val Thr Pro Ala Gly Phe Asp 100 105 110 Arg Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Met Ile 115 120 125 Arg Met Val Arg Arg Tyr Trp Asp Val Gln Gly Lys Pro Glu Lys Lys 130 135 140 Thr Leu Ile Gly Arg Trp Trp Gly Tyr His Gly Ser Thr Ile Gly Gly 145 150 155 160 Ala Ser Leu Gly Gly Phe Lys Tyr Met His Glu Gln Gly Asp Leu Pro 165 170 175 Ile Pro Gly Met Ala His Ile Glu Gln Pro Trp Trp Tyr Lys His Gly 180 185 190 Lys Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Val Val Ala Ala Arg Trp Leu 195 200 205 Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Gly Ala Asp Lys Val Ala Ala Phe Val 210 215 220 Gly Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro Pro Ala Thr 225 230 235 240 Tyr Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ile Cys Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu 245 250 255 Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe 260 265 270 Gly His Gln His Phe Gly Phe Gln Pro Asp Leu Phe Thr Ala Ala Lys 275 280 285 Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Ala Val Phe Val Gly Lys 290 295 300 Arg Val Ala Glu Gly Leu Ile Ala Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe 305 310 315 320 Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Cys Ala Ala Val Ala His Ala Asn Val 325 330 335 Ala Ala Leu Arg Asp Glu Gly Ile Val Gln Arg Val Lys Asp Asp Ile 340 345 350 Gly Pro Tyr Met Gln Lys Arg Trp Arg Glu Thr Phe Ser Arg Phe Glu 355 360 365 His Val Asp Asp Val Arg Gly Val Gly Met Leu Leu Ala Phe Thr Leu 370 375 380 Val Lys Asn Lys Ala Lys Arg Glu Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Ile 385 390 395 400 Gly Thr Leu Cys Arg Asp Ile Phe Phe Arg Asn Asn Leu Ile Met Asp 405 410 415 Ser Cys Gly Asp His Ile Val Ala Ala Pro Pro Leu Val Met Thr Arg 420 425 430 Ala Glu Val Asp Glu Met Leu Ala Val Ala Glu Arg Cys Leu Glu Glu 435 440 445 Phe Glu Gln Thr Leu Lys Ala Arg Gly Leu Ala 450 455 <210> 3 <211> 459 <212> PRT <213> Chromobacterium violaceum <400> 3 Met Gln Lys Gln Arg Thr Cys Ser Gln Trp Arg Glu Leu Asp Ala Ala 1 5 10 15 His His Leu His Pro Phe Thr Asp Thr Ala Ser Leu Asn Gln Ala Gly 20 25 30 Ala Arg Val Met Thr Arg Gly Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Cys Glu 35 40 45 Gly Asn Lys Ile Ile Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val 50 55 60 Gly Tyr Gly Arg Lys Asp Phe Ala Glu Ala Ala Arg Arg Gln Met Glu 65 70 75 80 Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Phe Tyr Lys Thr Thr His Pro Ala Val 85 90 95 Val Glu Leu Ser Ser Leu Leu Ala Glu Val Thr Pro Ala Gly Phe Asp 100 105 110 Arg Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Met Ile 115 120 125 Arg Met Val Arg Arg Tyr Trp Asp Val Gln Gly Lys Pro Glu Lys Lys 130 135 140 Thr Leu Ile Gly Arg Trp Trp Gly Tyr His Gly Ser Thr Ile Gly Gly 145 150 155 160 Ala Ser Leu Gly Gly Phe Lys Tyr Met His Glu Gln Gly Asp Leu Pro 165 170 175 Ile Pro Gly Met Ala His Ile Glu Gln Pro Trp Trp Tyr Lys His Gly 180 185 190 Lys Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Val Val Ala Ala Arg Trp Leu 195 200 205 Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Gly Ala Asp Lys Val Ala Ala Phe Val 210 215 220 Gly Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro Pro Ala Thr 225 230 235 240 Tyr Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ile Cys Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu 245 250 255 Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe 260 265 270 Gly His Gln His Phe Gly Phe Gln Pro Asp Leu Phe Thr Ala Ala Lys 275 280 285 Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Ala Val Phe Val Gly Lys 290 295 300 Arg Val Ala Glu Gly Leu Ile Ala Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe 305 310 315 320 Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Cys Ala Ala Val Ala His Ala Asn Val 325 330 335 Ala Ala Leu Arg Asp Glu Gly Ile Val Gln Arg Val Lys Asp Asp Ile 340 345 350 Gly Pro Tyr Met Gln Lys Arg Trp Arg Glu Thr Phe Ser Arg Phe Glu 355 360 365 His Val Asp Asp Val Arg Gly Val Gly Met Leu Leu Ala Phe Thr Leu 370 375 380 Val Lys Asn Lys Ala Lys Arg Glu Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Ile 385 390 395 400 Gly Thr Leu Cys Arg Asp Ile Phe Gln Arg Asn Asn Leu Ile Met Asp 405 410 415 Ser Cys Gly Asp His Ile Val Ser Ala Pro Pro Leu Val Met Thr Arg 420 425 430 Ala Glu Val Asp Glu Met Leu Ala Val Ala Glu Arg Cys Leu Glu Glu 435 440 445 Phe Glu Gln Thr Leu Lys Ala Arg Gly Leu Ala 450 455 <210> 4 <211> 459 <212> PRT <213> Chromobacterium violaceum <400> 4 Met Gln Lys Gln Arg Thr Cys Ser Gln Trp Arg Glu Leu Asp Ala Ala 1 5 10 15 His His Leu His Pro Phe Thr Asp Thr Ala Ser Leu Asn Gln Ala Gly 20 25 30 Ala Arg Val Met Thr Arg Gly Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Cys Glu 35 40 45 Gly Asn Lys Ile Ile Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val 50 55 60 Gly Tyr Gly Arg Lys Asp Phe Ala Glu Ala Ala Arg Arg Gln Met Glu 65 70 75 80 Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Phe Tyr Lys Thr Thr His Pro Ala Val 85 90 95 Val Glu Leu Ser Ser Leu Leu Ala Glu Val Thr Pro Ala Gly Phe Asp 100 105 110 Arg Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Met Ile 115 120 125 Arg Met Val Arg Arg Tyr Trp Asp Val Gln Gly Lys Pro Glu Lys Lys 130 135 140 Thr Leu Ile Gly Arg Trp Trp Gly Tyr His Gly Ser Thr Ile Gly Gly 145 150 155 160 Ala Ser Leu Gly Gly Phe Lys Tyr Met His Glu Gln Gly Asp Leu Pro 165 170 175 Ile Pro Gly Met Ala His Ile Glu Gln Pro Trp Trp Tyr Lys His Gly 180 185 190 Lys Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Val Val Ala Ala Arg Trp Leu 195 200 205 Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Gly Ala Asp Lys Val Ala Ala Phe Val 210 215 220 Gly Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro Pro Ala Thr 225 230 235 240 Tyr Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ile Cys Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu 245 250 255 Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe 260 265 270 Gly His Gln His Phe Gly Phe Gln Pro Asp Leu Phe Thr Ala Ala Lys 275 280 285 Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Ala Val Phe Val Gly Lys 290 295 300 Arg Val Ala Glu Gly Leu Ile Ala Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe 305 310 315 320 Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Cys Ala Ala Val Ala His Ala Asn Val 325 330 335 Ala Ala Leu Arg Asp Glu Gly Ile Val Gln Arg Val Lys Asp Asp Ile 340 345 350 Gly Pro Tyr Met Gln Lys Arg Trp Arg Glu Thr Phe Ser Arg Phe Glu 355 360 365 His Val Asp Asp Val Arg Gly Val Gly Met Leu Leu Ala Phe Thr Leu 370 375 380 Val Lys Asn Lys Ala Lys Arg Glu Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Ile 385 390 395 400 Gly Thr Leu Cys Arg Asp Ile Phe His Arg Asn Asn Leu Ile Met Asp 405 410 415 Ser Cys Gly Asp His Ile Val Ser Ala Pro Pro Leu Val Met Thr Arg 420 425 430 Ala Glu Val Asp Glu Met Leu Ala Val Ala Glu Arg Cys Leu Glu Glu 435 440 445 Phe Glu Gln Thr Leu Lys Ala Arg Gly Leu Ala 450 455

Claims (17)

  1. 키랄 디아민 화합물의 합성 방법으로서,
    상기 합성 방법은,
    트랜스아미나제를 이용하여 식 I로 표시되는 기질을 상기 키랄 디아민 화합물로 전화시키는 단계를 포함하되,
    Figure pct00048
    식 I,
    상기 식 I 에서, n = 1 ~ 10이고,
    R 그룹은 알킬, 시클로알킬, 헤테로 원자 함유 알킬, 헤테로 원자 함유 시클로알킬, 헤테로 원자 함유 아릴, 아미드계 화합물 잔기 또는 에테르계 화합물 잔기를 나타내되, 상기 헤테로 원자는 O, S 및 N 중 적어도 하나이며;
    R1과 R2는 동일하거나 상이하며, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-C3 알킬 또는 아미노 보호기이고;
    상기 기질은,
    Figure pct00049
    ,
    Figure pct00050
    ,
    Figure pct00051
    ,
    Figure pct00052
    ,
    Figure pct00053
    ,
    Figure pct00054
    ,
    Figure pct00055
    ,
    Figure pct00056
    ,
    Figure pct00057
    및
    Figure pct00058
    중 어느 하나로부터 선택되며;
    상기 트랜스아미나제는 Chromobacterium violaceum DSM30191(CVTA), Fonsecaea pedrosoi CBS 271.37, Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae Ecl8, Mycobacterium goodii, Paracoccus denitrificans, Penicillium brasilianum, Enterobacter sp.TL3, Aspergillus terreus NIH2624, Exophiala spinifera, Deinococcus geothermalis(strain DSM 11300), Geomyces destructans 20631-21(GdTA)in E.coli, Pseudomonas putida KT2440, Lysinibacillus sphaericus, Bacillus megaterium DSM 319, Trichoderma harzianum, Aspergillus fumigatus R-ATAs(AspFum), Geobacillus thermodenitrificans subsp.thermodenitrificans DSM 465, Cladophialophora bantiana CBS 173.52, Bacillus megaterium, Burkholderia thailandensis MSMB121(BtS-TA), Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae MGH 78578, Geobacillus toebii 및 Talaromyces cellulolyticus로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 트랜스아미나제는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 아미노 보호기는 tert-부톡시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, 포르밀, 트리플루오로아세틸, 벤질, 트리페닐메틸 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐 중 어느 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 합성 방법은,
    인산 완충액과 아미노 도너를 혼합하여 제1 혼합액을 얻는 단계;
    상기 제1 혼합액에 상기 식 I로 표시되는 기질을 첨가하여 제2 혼합액을 얻는 단계;
    상기 제2 혼합액에 상기 트랜스아미나제를 첨가하여 반응 혼합액을 얻는 단계; 및
    상기 반응 혼합액으로부터 상기 키랄 디아민 화합물을 분리하여 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 제1 혼합액에 상기 기질을 첨가하는 단계 이전에, 상기 합성 방법은,
    상기 제1 혼합액의 pH를 7.0 ~ 9.0으로 조절하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 제2 혼합액에 상기 트랜스아미나제를 첨가하고, 상기 트랜스아미나제가 첨가된 상기 제2 혼합액의 pH를 7.0 ~ 9.0으로 조절하여 상기 반응 혼합액을 얻는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 반응 혼합액으로부터 상기 키랄 디아민 화합물을 분리하여 얻는 단계는,
    상기 반응 혼합액의 산성도를 조절하여 상기 트랜스아미나제를 변성시키는 단계;
    변성된 상기 트랜스아미나제를 여과하고 제거하여 예비 여과액을 얻는 단계;
    상기 예비 여과액의 pH를 염기성으로 조절하여 염기성 여과액을 얻는 단계; 및
    상기 염기성 여과액을 추출하여 상기 키랄 디아민 화합물을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 반응 혼합액의 pH를 1 ~ 2로 조절하는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  9. 청구항 7에 있어서,
    상기 염기성 여과액의 pH는 12 ~ 13인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  10. 청구항 7에 있어서,
    상기 추출은 여러 회 수행되는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  11. 청구항 7에 있어서,
    상기 추출은 2 ~ 5회 수행되는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  12. 청구항 7에 있어서,
    상기 추출에서 처음에 디클로로메탄을 사용하여 추출하고, 그 후 나머지 횟수에서는 디클로로메탄 또는 아세트산에틸을 사용하여 추출하는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  13. 청구항 7에 있어서,
    상기 추출 이후에, 추출하여 얻은 유기상을 건조시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  14. 청구항 7에 있어서,
    매 회 추출에서 얻은 유기상을 합하여 추출물을 얻고;
    상기 추출물을 건조시켜 건조한 유기상 생성물을 얻으며;
    상기 건조한 유기상 생성물을 온도 ＜ 45 ℃이고 압력 ≤ -0.08 Mpa인 조건에서 유분이 없을 때까지 농축하여 상기 키랄 디아민 화합물을 얻는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 트랜스아미나제와 상기 기질의 잘량비는 0.4 : 1 ~ 1.0 : 1인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  16. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기질의 농도는 60 g/L ~ 100 g/L인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  17. 청구항 4에 있어서,
    상기 아미노 도너는 이소프로필아민, 이소프로필아민의 염산염, 알라닌, 페네틸아민 또는 n-부틸아민으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
KR1020227033472A 2020-02-26 2020-03-31 키랄 디아민 화합물 합성 방법 KR20220157981A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010118060.9A CN110982856B (zh) 2020-02-26 2020-02-26 手性二胺化合物的合成方法
CN202010118060.9 2020-02-26
PCT/CN2020/082594 WO2021168987A1 (zh) 2020-02-26 2020-03-31 手性二胺化合物的合成方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220157981A true KR20220157981A (ko) 2022-11-29

Family

ID=70081406

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227033472A KR20220157981A (ko) 2020-02-26 2020-03-31 키랄 디아민 화합물 합성 방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230151396A1 (ko)
EP (1) EP4112733A4 (ko)
JP (1) JP7345070B2 (ko)
KR (1) KR20220157981A (ko)
CN (1) CN110982856B (ko)
WO (1) WO2021168987A1 (ko)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105367427B (zh) 2015-11-04 2018-03-13 北京大学深圳研究生院 手性1,2‑二胺类化合物及其制备方法和应用
CN105753752B (zh) 2016-04-15 2018-02-27 安徽师范大学 一种手性邻二胺类化合物的制备方法
CN108048419B (zh) * 2017-11-15 2020-10-23 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 转氨酶突变体及其应用
EP3733689B1 (en) 2018-02-05 2022-10-26 Asymchem Life Science (Tianjin) Co., Ltd Transaminase mutant and application thereof
CN108384767B (zh) * 2018-02-05 2020-08-14 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 转氨酶突变体及其应用
CN110616236B (zh) * 2019-10-14 2021-02-26 暨明医药科技（苏州）有限公司 一种(r)-n1,n1-二乙基-1,4-戊二胺的制备方法
CN110592042B (zh) * 2019-10-28 2021-04-23 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 转氨酶突变体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP4112733A1 (en) 2023-01-04
WO2021168987A1 (zh) 2021-09-02
JP7345070B2 (ja) 2023-09-14
EP4112733A4 (en) 2023-09-06
JP2023514862A (ja) 2023-04-11
CN110982856B (zh) 2020-06-23
CN110982856A (zh) 2020-04-10
US20230151396A1 (en) 2023-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2557176A1 (en) Enzymatic amination
WO2011100265A2 (en) Processes using amino acid dehydrogenases and ketoreductase-based cofactor regenerating system
CN107805648B (zh) 制备具有多个手性中心的胺化合物的方法
CA2283376A1 (en) Synthesis of optically active phenylalanine analogs through microbial transformations
US6987010B2 (en) Process for the enzymatic preparation of enantiomer-enriched β-amino acids
CN105441401B (zh) 一种单胺氧化酶及其在合成手性氮杂双环化合物中的应用
US10059969B1 (en) Process for the preparation of (S)-2-amino-non-8-enoic acid
UA64784C2 (en) Improvements in enzymatic synthesis of chiral amines
KR20220157981A (ko) 키랄 디아민 화합물 합성 방법
EP4116289A1 (en) Synthesis method for fluorine-containing chiral amine compound
EP0969095B1 (de) (S)-Hydroxynitrillyasen mit verbesserter Substanzakzeptanz und deren Verwendung
EP1257659B1 (en) Method and catalyst system for stereoselectively inverting a chiral center of a chemical compound
TWI693286B (zh) (±)-2-(二氟甲基)-1-(烷氧羰基)-環丙烷甲酸及(±)-2-(乙烯基)-1-(烷氧羰基)-環丙烷甲酸之酶催化製法
EP0218506A1 (fr) Procédé d&#39;insolubilisation d&#39;enzymes par fixation sur des complexes alumine-phosphates organiques et enzymes insolubilisées obtenues par ce procédé, nouveaux supports d&#39;enzymes et leur procédé de préparation et application desdits enzymes insolubilisées
JPS5991890A (ja) Ｌ−フエニルアラニンの製造方法
CN101809159B (zh) β-氨基酸的制造方法
WO2003042393A1 (en) Enzymatic preparation of mycophenolate mofetil
CN113881720B (zh) 一种转氨酶及使用其进行催化制备的方法
JP2721536B2 (ja) Ｄ―β―ヒドロキシアミノ酸を取得する方法
CN103842505B (zh) 新型酰胺酶
DE602004005947T2 (de) Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven Octahydro-1H-Indol-2-Carbonsäure
Sigmund et al. Enantioselective enzymatic aminolysis of a racemic 2-isoxazolylacetate alkyl ester
Ueji et al. Lyophilization of lipase together with ionic compounds generates highly enantioselective and solvent-sensitive lipase in organic solvents
CN114380695A (zh) 一种简单快速实现c-c键形成反应的新方法
CN116855468A (zh) 一种来源于分枝杆菌的r-转氨酶及其合成方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination