JP7323456B2 - 抗bmp10抗体及び該抗体を有効成分とする、高血圧および高血圧性疾患に対する治療剤 - Google Patents
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Description
(1)それぞれ配列番号29および31で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域(complementarity determining region;以下CDRと略記する)1および3、ならびに配列番号30で表されるアミノ酸配列もしくは配列番号30で表されるアミノ酸配列の16番目のセリンがアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列を含むCDR2を含む重鎖;ならびにそれぞれ配列番号32~34で表されるアミノ酸配列を含むCDR1~3を含む軽鎖を含むモノクローナル抗体または該抗体断片。
(2)配列番号71~87から選ばれるいずれか1つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(以下VLと略記する)ならびに/または配列番号70および88~98から選ばれるいずれか1つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(以下VHと略記する)を含む、請求項1に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
(3)以下の(a)~(w)から選ばれる、(1)または(2)に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
(a)配列番号94で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号73で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(b)配列番号95で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号73で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(c)配列番号91で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(d)配列番号98で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(e)配列番号89で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号77で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(f)配列番号97で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号77で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(g)配列番号97で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号78で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(h)配列番号98で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号78で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(i)配列番号91で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号79で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(j)配列番号95で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号79で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(k)配列番号98で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号79で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(l)配列番号89で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号81で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(m)配列番号91で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号81で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(n)配列番号95で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号81で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(o)配列番号97で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号81で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(p)配列番号98で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号81で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(q)配列番号94で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号85で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(r)配列番号95で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号85で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(s)配列番号97で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号85で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(t)配列番号98で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号85で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(u)配列番号94で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号87で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(v)配列番号97で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号87で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(w)配列番号98で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号87で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(4)BMP10の中和活性を有する、(1)~(3)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
(5)BMP9/BMP10ヘテロ2量体の中和活性を有する、(1)~(4)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
(6)遺伝子組換え抗体である、(1)~(5)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
(7)Fab、Fab’、F(ab’)2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)及びCDRを含むペプチドか
ら選ばれる抗体断片である(1)~(6)のいずれか1に記載の抗体断片。
(8)(1)~(7)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片をコードするDNA。
(9)(8)に記載のDNAを含有する組換えベクター。
(10)(9)に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
(11)(10)に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物から該抗体又は該抗体断片を採取することを特徴とする(1)~(7)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の製造方法。
(12)BMP10及びBMP9/BMP10ヘテロ2量体の少なくとも一方に対するアンタゴニストを含む、高血圧及び/又は高血圧性疾患の治療剤。
(13)BMP9アンタゴニストと同時または逐次に投与することを特徴とする、(12)に記載の治療剤。
(14)BMP10及びBMP9/BMP10ヘテロ2量体の少なくとも一方に対するアンタゴニストと同時または逐次に投与することを特徴とする、BMP9アンタゴニストを含む、高血圧及び/又は高血圧性疾患の治療剤。
(15)BMP10及びBMP9/BMP10ヘテロ2量体の少なくとも一方に対するアンタゴニストを含む、ヒトBMP10が関与する疾患の診断薬。
(16)BMP10及びBMP9/BMP10ヘテロ2量体の少なくとも一方に対するアンタゴニストを用いる、ヒトBMP10の免疫学的検出方法又は測定方法。
(17)BMP10及びBMP9/BMP10ヘテロ2量体の少なくとも一方に対するアンタゴニストと薬理学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
(18)高血圧および高血圧性疾患の治療用医薬組成物の製造のための、BMP10及びBMP9/BMP10ヘテロ2量体の少なくとも一方に対するアンタゴニストの使用。
本発明のBMP10アンタゴニストとは、BMP10およびBMP9/BMP10ヘテロ2量体の少なくとも一方とそれらの受容体タンパク質の結合を阻害することにより、受容体の活性化を阻害するものをいう。また本発明のBMP10アンタゴニストとは、BMP10およびBMP9/BMP10ヘテロ2量体の少なくとも一方の中和活性を持つものをいう。本発明のBMP10アンタゴニストとは、本発明の抗BMP10モノクローナル抗体または該抗体断片を含む。
本発明のBMP9アンタゴニストとはBMP9とその受容体タンパク質の結合を阻害することにより、受容体の活性化を阻害するものをいう。また本発明のBMP9アンタゴニストとは、BMP9の中和活性を持つものをいう。本発明のBMP9アンタゴニストとして、例えば抗BMP9抗体が挙げられる。
(A)それぞれ配列番号29~31で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域(complementarity determining region;以下CDRと略記する)1~3を含む重鎖;ならびにそれぞれ配列番号32~34で表されるアミノ酸配列を含むCDR1~3を含む軽鎖を含むモノクローナル抗体及びその抗体断片。
(B)それぞれ配列番号29および31で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域(complementarity determining region;以下CDRと略記する)1および3、ならびに配列番号30で表されるアミノ酸配列の16番目のセリンがアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列(配列番号99)を含むCDR2を含む重鎖;ならびにそれぞれ配列番号32~34で表されるアミノ酸配列を含むCDR1~3を含む軽鎖を含むモノクローナル抗体及びその抗体断片。
かつヒトBMP10および/またはBMP9/BMP10ヘテロダイマーのアミノ酸配列、又はその立体構造に結合する、ヒト以外の動物のモノクローナル抗体のVH及びVLのFRのうち、任意のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したV領域をコードするcDNAを構築する。次いで、ヒト抗体のCH及びCLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入して表面再構成法によるヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させる。
(a)配列番号70で表されるアミノ酸配列、又は配列番号70で表されるアミノ酸配列の14番目のPro、20番目のLeu、27番目のGly、29番目のVal、30番目のSer、37番目のIle、48番目のIle、67番目のVal、71番目のVal、76番目のAsn、78番目のPhe、82番目のLeu、85番目のVal、92番目のVal、94番目のTyr、及び109番目のThrから選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVH
(b)配列番号71で表されるアミノ酸配列、又は配列番号71で表されるアミノ酸配列中の7番目のPro、10番目のVal、12番目のGlu、14番目のPro、16番目のLys、19番目のThr、20番目のIle、41番目のPro、48番目のVal、75番目のSer、81番目のLeu、82番目のLys、88番目のAsp、及び90番目のTyrから選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVL
(A)VHのCDR1が配列番号29で表されるアミノ酸配列または、配列番号29で表されるアミノ酸配列中の4番目のValをAlaに置換する改変が導入されたアミノ酸配列を含み、VHのCDR2が配列番号30で表されるアミノ酸配列または、配列番号30で表されるアミノ酸配列中の16番目のSerをAspに置換する改変が導入されたアミノ酸配列を含み、VHのCDR3が配列番号31で表されるアミノ酸配列を含む、CDRのアミノ酸配列。
(1)配列番号70で表されるアミノ酸配列中の14番目のPro、20番目のLeu、27番目のGly、29番目のVal、30番目のSer、37番目のIle、48番目のIle、67番目のVal、71番目のVal、76番目のAsn、78番目のPhe、82番目のLeu、85番目のVal、92番目のVal、94番目のTyr、及び109番目のThrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(2)配列番号70で表されるアミノ酸配列中の20番目のLeu、27番目のGly、29番目のVal、30番目のSer、37番目のIle、48番目のIle、67番目のVal、71番目のVal、78番目のPhe、82番目のLeu、85番目のVal、94番目のTyr、及び109番目のThrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(3)配列番号70で表されるアミノ酸配列中の20番目のLeu、27番目のGly、30番目のSer、48番目のIle、67番目のVal、71番目のVal、78番目のPhe、82番目のLeu、92番目のVal、及び94番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(4)配列番号70で表されるアミノ酸配列中の27番目のGly、29番目のVal、30番目のSer、48番目のIle、67番目のVal、71番目のVal、92番目のVal、及び94番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(5)配列番号70で表されるアミノ酸配列中の20番目のLeu、27番目のGly、48番目のIle、71番目のVal、78番目のPhe、82番目のLeu、及び92番目のValが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(6)配列番号70で表されるアミノ酸配列中の27番目のGly、30番目のSer、48番目のIle、67番目のVal、71番目のVal、及び92番目のValが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(7)配列番号70で表されるアミノ酸配列中の48番目のIle、67番目のVal、71番目のVal、78番目のPhe、及び92番目のValが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(8)配列番号70で表されるアミノ酸配列中の27番目のGly、71番目のVal、78番目のPhe、及び92番目のValが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(9)配列番号70で表されるアミノ酸配列中の27番目のGly、48番目のIle、67番目のVal、及び92番目のValが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(10)配列番号70で表されるアミノ酸配列中の27番目のGly、71番目のVal、92番目のVal、及び94番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(11)配列番号70で表されるアミノ酸配列中の27番目のGly、71番目のVal、及び92番目のValが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(12)配列番号70で表されるアミノ酸配列中の71番目のVal、及び92番目のValが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(13)配列番号70で表されるアミノ酸配列を含むVH
(14)上記(1)~(13)で示されるVHに対し、そのCDRのアミノ酸配列を前記(A)に記載のCDRのアミノ酸配列に置き換えたアミノ酸配列を含むVH
(1)配列番号71で表されるアミノ酸配列中の7番目のPro、10番目のVal、12番目のGlu、14番目のPro、16番目のLys、19番目のThr、20番目のIle、41番目のPro、48番目のVal、75番目のSer、81番目のLeu、82番目のLys、88番目のAsp、及び90番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVL
(2)配列番号71で表されるアミノ酸配列中の7番目のPro、10番目のVal、12番目のGlu、14番目のPro、19番目のThr、20番目のIle、41番目のPro、48番目のVal、75番目のSer、及び88番目のAspが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVL
(3)配列番号71で表されるアミノ酸配列中の7番目のPro、12番目のGlu、19番目のThr、20番目のIle、48番目のVal、75番目のSer、81番目のLeu、88番目のAsp、及び90番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVL
(4)配列番号71で表されるアミノ酸配列中の7番目のPro、12番目のGlu、14番目のPro、16番目のLys、19番目のThr、41番目のPro、75番目のSer、及び88番目のAspが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVL
(5)配列番号71で表されるアミノ酸配列中の12番目のGlu、20番目のIle、41番目のPro、48番目のVal、75番目のSer、88番目のAsp、及び90番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVL
(6)配列番号71で表されるアミノ酸配列中の、12番目のGlu、16番目のLys、19番目のThr、41番目のPro、82番目のLys、及び88番目のAspが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVL
(7)配列番号71で表されるアミノ酸配列中の、16番目のLys、20番目のIle、41番目のPro、48番目のVal、88番目のAsp、及び90番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVL
(8)配列番号71で表されるアミノ酸配列中の、14番目のPro、20番目のIle、48番目のVal、75番目のSer、81番目のLeu、及び88番目のAspが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVL
(9)配列番号71で表されるアミノ酸配列中の、12番目のGlu、14番目のPro、20番目のIle、48番目のVal、82番目のLys、及び90番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVL
(10)配列番号71で表されるアミノ酸配列中の、19番目のThr、41番目のPro、48番目のVal、88番目のAsp、及び90番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVL
(11)配列番号71で表されるアミノ酸配列中の、12番目のGlu、14番目のPro、41番目のPro、75番目のSer、及び88番目のAspが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVL
(12)配列番号71で表されるアミノ酸配列中の、41番目のPro、75番目のSer、88番目のAsp、及び90番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVL
(13)配列番号71で表されるアミノ酸配列中の、19番目のThr、41番目のPro、48番目のVal、及び88番目のAspが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVL
(14)配列番号71で表されるアミノ酸配列中の、20番目のIle、48番目のVal、及び88番目のAspが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVL
(15)配列番号71のアミノ酸配列を含むVL
(a)配列番号23で表されるアミノ酸配列の11番目のLeu、14番目のLeu、19番目のSer、27番目のPhe、68番目のSer、71番目のArg、77番目のGln、79番目のPhe、83番目のAsn、85番目のLeu、及び107番目のHisから選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVH
(b)配列番号26で表されるアミノ酸配列中の3番目のVal、8番目のAsn、14番目のLeu、19番目のLys、75番目のPhe、80番目のAsn、83番目のIle、及び88番目のIleから選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVL
(c)配列番号70で表わされるアミノ酸配列の10番目のGly、13番目のLys、19番目のSer、20番目のLeu、27番目のGly、29番目のVal、30番目のSer、37番目のIle、48番目のIle、67番目のVal、68番目のThr、71番目のVal、77番目のGln、78番目のPhe、79番目のSer、82番目のLeu、83番目のSer、85番目のVal、86番目のThr、87番目のAla、88番目のAla、92番目のVal、94番目のTyr、及び109番目のThrから選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVH
VHのCDR1が配列番号29で表されるアミノ酸配列または、配列番号29で表されるアミノ酸配列中の4番目のValをAlaに置換する改変が導入されたアミノ酸配列を含み、VHのCDR2が配列番号30で表されるアミノ酸配列または、配列番号30で表されるアミノ酸配列中の16番目のSerをAspに置換する改変が導入されたアミノ酸配列を含み、VHのCDR3が配列番号31で表されるアミノ酸配列を含む抗体のVH。
また、本発明のヒト化抗体の具体例として、配列番号71~87から選ばれるいずれか1つのアミノ酸配列を含むVLならびに/または配列番号70および88~98から選ばれるいずれか1つのアミノ酸配列を含むVHを含むヒト化抗体が挙げられる。
さらに、本発明のヒト化抗体の具体例として、以下の(a)~(w)のヒト化抗体が挙げられる。
(a)配列番号94で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号73で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(b)配列番号95で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号73で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(c)配列番号91で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(d)配列番号98で表されるアミノ酸配列を含むVHをおよび配列番号75で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(e)配列番号89で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号77で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(f)配列番号97で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号77で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(g)配列番号97で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号78で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(h)配列番号98で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号78で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(i)配列番号91で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号79で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(j)配列番号95で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号79で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(k)配列番号98で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号79で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(l)配列番号89で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号81で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(m)配列番号91で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号81で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(n)配列番号95で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号81で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(o)配列番号97で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号81で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(p)配列番号98で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号81で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(q)配列番号94で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号85で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(r)配列番号95で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号85で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(s)配列番号97で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号85で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(t)配列番号98で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号85で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(u)配列番号94で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号87で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(v)配列番号97で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号87で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
(w)配列番号98で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号87で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、ヒト化抗体。
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、O-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
C群:アスパラギン、グルタミン
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2、4-ジアミノブタン酸、2、3-ジアミノプロピオン酸
E群:プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン
G群:フェニルアラニン、チロシン
本発明のBMP10アンタゴニストには、前述のように、本発明の抗BMP10モノクローナル抗体およびその抗体断片を含む。
(1)抗原の調製
抗原となるBMP10又はBMP10を発現した組織は、BMP10全長又はその部分長をコードするcDNAを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞などに導入することにより、得ることができる。また、BMP10を多量に発現しているヒト組織からBMP10を精製し、得ることが出来る。また、該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。さらに、Fmoc法、又はtBoc法などの化学合成法によりBMP10の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。
BMP10が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、又はダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
3~20週令のマウス、ラット又はハムスターなどの動物に、(1)で得られる抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、BMP9ノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、8-アザグアニン耐性マウス(Balb/C由来)骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology、18、1(1978)]、P3-NS1/1Ag41(NS-1)[European J.Immunology、6、511(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature、276、269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology、123、1548(1979)]、又はP3-X63-Ag8(X63)[Nature、256、495(1975)]などが用いられる。
(2)で得られる融合用抗体産生細胞と(3)で得られる骨髄腫細胞をMinimum Essential Medium(MEM)培地又はPBS(リン酸二ナトリウム1.83g、リン酸一カリウム0.21g、食塩7.65g、蒸留水1リットル、pH7.2)でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞:骨髄腫細胞=5~10:1になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。
プリスタン処理[2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン(Pristane)0.5mLを腹腔内投与し、2週間飼育する]した8~10週令のマウス又はヌードマウスに、(4)で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。10~21日でハイブリドーマは腹水がん化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、40~50%硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、DEAE-セファロースカラム、プロテインA-カラム又はゲル濾過カラムによる精製を行ない、IgG又はIgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
モノクローナル抗体の選択は以下に示す酵素免疫測定法によるバインディングアッセイ、及びBiacoreによるkinetics解析により行う。
抗原としては、(1)で得られるBMP10をコードするcDNAを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞などに導入して得られた遺伝子導入細胞、リコンビナント蛋白質、又はヒト組織から得た精製ポリペプチド又は部分ペプチドなどを用いる。抗原が部分ペプチドである場合には、BSA又はKLHなどのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製して、これを用いても良い。
Biacore T100を用い、抗原と被験物の間の結合におけるkineticsを測定し、その結果を機器付属の解析ソフトウエアで解析をする。抗マウスIgG抗体をセンサーチップCM5にアミンカップリング法により固定した後、ハイブリドーマ培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を流し、適当量結合させ、さらに濃度既知の複数濃度の抗原を流し、結合、解離を測定する。
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体及びヒト化抗体の作製方法を示す。
遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のCH及びCLをコードするDNAが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のCH及びCLをコードするDNAをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
非ヒト抗体のVH及びVLをコードするcDNAの取得及びアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。
(1)で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のCH又はCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のVH又はVLをコードするcDNAをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
ヒト型CDR移植抗体のVH又はVLをコードするcDNAは、以下のようにして構築することができる。
ヒト型CDR移植抗体は、非ヒト抗体のVH及びVLのCDRのみをヒト抗体のVH及びVLのFRに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する[BIO/TECHNOLOGY、9、266(1991)]。
(6)表面再構成法によるヒト化抗体のV領域をコードするcDNAの構築
表面再構成法によるヒト化抗体のVH又はVLをコードするcDNAは、以下のようにして構築することができる。
非ヒト抗体のVH又はVLのFRのアミノ酸配列のうち、抗原結合活性に影響が低いと考えられるアミノ酸残基をそれぞれ選択し、該アミノ酸残基をより抗原性が低いと考えられるアミノ酸残基に置換する。
こうして設計したVHまたはVLのアミノ酸配列を、抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度[A.L.F.DNA、US Dept.Health and Human Services(1991)]を考慮してDNA配列に変換し、表面再構成法によるヒト化抗体のVH又はVLのアミノ酸配列をコードするDNA配列をそれぞれ設計する。
設計したDNA配列に基づき、100塩基前後の長さからなる数本の合成DNAを合成し、それらを用いてPCR反応を行う。この場合、PCR反応での反応効率及び合成可能なDNAの長さから、好ましくはH鎖、L鎖とも6本の合成DNAを設計する。
また、両端に位置する合成DNAの5’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、(1)で得られるヒト化抗体発現用ベクターに容易に表面再構成法によるヒト化抗体のVH又はVLをコードするcDNAをクローニングすることができる。
又は、設計したDNA配列に基づき、1本のDNAとして合成された各H鎖、L鎖全長合成DNAを用いることで実施できる。
PCR反応後、増幅産物をpBluescript SK(-)(ストラタジーン社製)などのプラスミドにそれぞれクローニングし、(2)に記載の方法と同様の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト抗体のVH又はVLのアミノ酸配列をコードするDNA配列を有するプラスミドを取得する。
(1)で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のCH又はCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のVH又はVLをコードするcDNAをそれぞれクローニングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。
(3)及び(7)で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクター、又はそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
(3)及び(7)で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
精製した本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。
本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片は、高血圧および高血圧性疾患の治療に用いることができる。
1-1)免疫原の調製
免疫原としてヒトBMP10組換えタンパク質、またはヒトBMP10 mature2量体(R&Dシステムズ社製、Cat#2926-BP)を用いた。ヒトBMP10組換えタンパク質は、国際公開第2014/007198号の実施例20に記載された方法に従い調製した。この方法により調製されたヒトBMP10組換えタンパク質はmature体、N末プロペプチド体および全長体を含む。
アジュバントに、Sigma Adjuvant System(登録商標)(シグマアルドリッチ社製)、又はAlum+百日咳ワクチンアジュバント(ナカライテスク社製)を用いて、実施例1の1-1)で調製したヒトBMP10を抗原とする抗原懸濁液を添付文書に従い調製した後、WKY/NcrlCrljラットまたはSDラットに腹腔及び皮下または筋肉内経路で免疫した。免疫した抗原量は、ヒトBMP10組換えタンパク質は20μg/head、ヒトBMP10 mature2量体は10μg/headで行った。免疫は、最終ブーストを含めて計2回又は4回行った。脾臓は、最終投与の3~4日後に摘出した。
8-アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株p3-U1[P3X63Ag8U.1、ATCC:CRL-1597、European Journal of Immunology、6、511(1976)]をエス・クロン(S-Clone) クローニングメデューム CM-B(三光純薬社製)にゲンタマイシン(10μg/mL)を添加した培地(以下、無血清培地と表記する)で馴化培養し、細胞融合時に必要な細胞数(4×107個以上)を確保し、細胞融合に供した。
実施例1の1-2)で得られたマウス脾細胞またはリンパ球と実施例1の1-3)で得られた骨髄腫細胞を8:1になるよう混合し、遠心分離(1200rpm、5分間)した。得られた沈殿画分(細胞群)に対して、ポリエチレングリコール-1000(純正化学社製、Cat#69257-1210)、MEM培地、ジメチルスルホキシド(DMSO、Sigma Aldrich社製、Cat#D2650)の混液500μLを、穏やかに揺らしながら、徐々に加えた。次に、該細胞液にMEM培地5mLを穏やかに揺らしながら加え、更にMEM培地を45mL添加した。次に、上記の該細胞液を含むチューブを遠心分離(900rpm、5分間)した。
抗BMP10抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには、ELISA用プレートに、ヒトBMP10を固相化させた固相抗原ELISA系を用いた。具体的には、実施例1の1-1)で調製したヒトBMP10組み換え体、又はヒトBMP10 mature2量体(R&Dシステムズ社製、Cat#2926-BP)を、リン酸緩衝液(ナカライテスク社製)にて0.5μg/mLに調製したものを96ウェルのELISA用プレート(F96 MAXISORP NUNC-IMMNO PLATE、Thermo Fisher Scientific社製、Cat#442404)に50μL/ウェルで分注し、4℃にて一晩静置して吸着させた。
抗BMP10抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングとして、各種BMP蛋白質のシグナルを検出可能にした細胞(以下、BMPシグナル検出細胞)を用いた。BMPシグナル検出細胞は、特開2017-25011号公報の実施例5に記載されたId1-Luc/CHO細胞を用いた。
96ウェル蛍光・発光用プレート(コーニング社製、Cat#3916)に、ヒトBMP10 mature2量体を終濃度で3ng/mLになるように添加した。次いで、ハイブリドーマ培養上清を終濃度で50%になるように添加した。その後、Excell 325培地[Excell 325 PF CHO(SAFC社製、Cat#14340C-1000mL)、4mM L-グルタミン、1×Penicillin、1×Streptomycin(ナカライ社製、Cat#09367-34)、0.5μg/mL hygromycin]にて懸濁したId1-Luc/CHO細胞液を5×104個/ウェルになるように添加した。
上記のスクリーニングにて50%以上の中和活性を示したものを陽性と判断した。陽性と判断されたハイブリドーマは、無血清培地にて限界希釈し、96ウェルプレートに播種し単クローン化を行った。単クローン化は、1回目に陽性と判断したウェル由来のハイブリドーマに対して計1~2回行った。以上の操作により、18C1抗体、12H3抗体、11H10抗体を産生するハイブリドーマを単離した。
実施例1の1-8)で単離したハイブリドーマを、大フラスコボトル2本に播種した。培地には無血清培地を用いた。37℃にて6-8日間培養した後、細胞を含む培地を回収した。回収した培地を遠心分離し、得られた培養上清を0.22μmフィルターによりろ過した。
取得した抗BMP10抗体と既知抗体に関して、BMP10の中和活性の比較を実施例1の1-6)で作製したId1-Luc/CHO細胞を用いて行った。96ウェル蛍光・発光用プレート(コーニング社製、Cat#3916)に、ヒトBMP10mature2量体(R&Dシステムズ社製、Cat#2926-BP)を終濃度で3ng/mLになるように添加し、次いで既知抗体MAB2926(既知抗体とはMAB2926のことをいう)および実施例1の1-9)で精製した抗BMP10抗体18C1抗体、12H3抗体、11H10抗体、またはコントロール抗体(Purified Rat IgG1 λ Isotype control、BD社製、Cat#553993)を終濃度で3000ng/mLより3倍希釈で段階的に6濃度に調製し、添加した。
ヒトALK1発現レポーター細胞を用いた取得抗体と既知抗体のBMP10の中和活性比較
取得した抗BMP10抗体と既知抗体のBMP10に対する中和活性について、ヒトALK1を高発現させたヒトALK1発現レポーター細胞を用いて比較した。既知抗体には、MAB2926(R&Dシステムズ社)を用いた。
ヒトALK1発現レポーター細胞は、特開2017-25011号公報の実施例6に記載されたALK1/Id1-Luc/CHO細胞を用いた。
96ウェル蛍光・発光用プレート(コーニング社製、Cat#3916)に、ヒトBMP10 mature2量体(R&Dシステムズ社製、Cat#2926-BP)を終濃度で0.3ng/mLになるように添加した。次いで、抗BMP10抗体である18C1抗体、12H3抗体、11H10抗体、MAB2926、またはコントロール抗体(Purified Rat IgG1 λ Isotype control、BD社製、Cat#553993)を終濃度で3000ng/mLより3倍希釈で段階的に6濃度に調製し、添加した。
18C1抗体がBMP10を特異的に中和することを確認するため、実施例1の1-6)で作製したId1-Luc/CHO細胞を用いて、18C1抗体の各種BMPシグナルに対する阻害作用を検討した。
5-1)抗BMP10モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞からの総RNAの調製
実施例1に記載の18C1抗体、12H3抗体及び11H10抗体を産生するハイブリドーマ 1×106個より、Maxwell 16 LEV simplyRNA Tissue kit(プロメガ社製#AS1280)を用いて、それぞれのハイブリドーマの総RNAを調製した。
実施例5-1で取得した各ハイブリドーマの総RNA 1μgから、SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech社製、Cat#634924)を用いて、cDNAを作製した。得られたcDNAを鋳型として、キット添付のユニバーサルプライマーA mix(フォワードプライマーを含有する)と、ラットのIgG1、IgG2a重鎖定常領域をコードするリバースプライマーを組み合わせることで、VHのcDNA配列決定を行った。
実施例5-2で得られた18C1抗体、12H3抗体、11H10抗体のVHの全塩基配列を配列番号5、6、7に、該配列から推定された、シグナル配列を含んだVHの全アミノ酸配列を配列番号8、9、10に、VLの全塩基配列を配列番号11、12、13に、該配列から推定された、シグナル配列を含んだVLの全アミノ酸配列を配列番号14、15、16にそれぞれ示す。
18C1キメラ抗体の組換え発現には、ヒトλ型軽鎖定常領域およびヒトIgG4改変型重鎖定常領域を有するN5LG4PE(R409K)ベクターを、12H3および11H10キメラ抗体の組換え発現には、ヒトκ型軽鎖定常領域およびヒトIgG4改変型重鎖定常領域を有するN5KG4PE(R409K)ベクターを使用した。国際特許広報第WO2006033386で使用されているN5KG4PEベクター骨格において、ヒトIgG4重鎖定常領域の、EU-indexにおける409番目のArgをLysに置換する改変を導入したものを作製し、N5KG4PE(R409K)ベクターと命名した。またこのベクターにおいて、ヒトκ鎖定常領域部分をヒトλ定常領域に置換したものを、N5LG4PE(R409K)ベクターと命名した。VH、VLをコードするcDNAを、上記の抗体発現ベクターに挿入した。VHはSalI、NheIサイト間に、VLはBgIII、BlpI(λ型)またはBgIII、BsiWI(κ型)サイト間にそれぞれ挿入した。
実施例5-4で得られた抗BMP10キメラ抗体と、既知抗体であるMAB2926(R&Dシステムズ社)のヒトBMP10に対する結合活性を比較することを目的とし、ヒトBMP10 mature2量体(R&Dシステムズ社製、Cat#2926-BP)に対する結合活性を表面プラズモン共鳴法(SPR法)によるBiacoreT100(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を用いて測定した。
取得した抗体が競合する受容体の解析
6-1)ALK1-Fcの調製
ALK1-Fcは、国際公開第2010/126169号の実施例1に記載された方法に従い調製した。
BMP10はタイプIとタイプIIの2つの受容体に結合することでシグナルを伝達する。取得した抗BMP10抗体がどの受容体に競合するか解析するために、表面プラズモン共鳴法(SPR法)によるBiacoreT100(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を用いて測定した。
正常動物の血圧に対する取得抗体の作用の評価
SDラットを用いて18C1抗体の血圧に対する作用を評価した。6週齢の雄性SDラット(日本チャールズリバー社製)を購入し、実験に供した。飲水は滅菌水道水を、食餌は固形飼料FR-2(フナバシファーム社製)を自由摂取で与えた。馴化飼育の後、7週齢でテレメトリー送信機の埋め込み手術を施した。
自然発症高血圧ラットの血圧に対する18C1抗体の作用の評価
高血圧動物に対する取得抗体の降圧作用を調べるために、雄性自然発症高血圧ラット(SHR/Izm、日本エスエルシー社)を用いて18C1抗体の血圧に対する作用を評価した。
Dahl食塩感受性ラットに対する18C1抗体の作用の評価
Dahl食塩感受性ラット(以下Dahl-Sラット)に高食塩を与えて誘発される高血圧および心臓や腎臓の障害に対するBMP10抗体の作用を評価した。5週齢の雄性Dahl食塩感受性ラット(DIS/Eis:Slc)(日本エスエルシー社製)を購入し、実験に供した。
ヒト血清に対する抗BMP10抗体の中和活性の評価
ALK1のリガンドとして、BMP10以外にもBMP9が知られている。血中のBMP9,BMP10に対する中和活性を評価する目的で、ヒトALK1発現レポーター細胞に対してヒト血清で刺激した際の中和活性を比較した。
抗BMP9抗体10D5は、国際公開第2014/007198号の実施例7に記載された方法に従い調製した。
96ウェル蛍光・発光用プレート(コーニング社製、Cat#3916)に、ヒト血清(Human True A serum,pool of donors、Biopredic international社製、Cat#SER019)を終濃度で5%になるように添加した。
ヒト血中のBMP9/BMP10ヘテロ2量体の検出
実施例10で示唆されたBMP9/BMP10ヘテロ2量体を検出するため、抗BMP9抗体と抗BMP10抗体でサンドイッチELISAを行った。
サンドイッチELISAの検出抗体として用いるため、抗BMP10抗体である12H3抗体のビオチン化を行った。ビオチン化は同仁化学研究所社製のBiotin Labeling Kit-NH2キット(Cat#LK03)を用いて行った。方法は、製品記載の添付文書に則り行った。
抗BMP9抗体である10D5抗体、抗BMP10抗体である11H10抗体、またはコントロール抗体(Purified Mouse IgG1 κ Isotype control、BD社製、Cat#554121)を、炭酸―重炭酸バッファー(50mM NaHCO3 pH9.6、Sigma-Aldrich社 Cat#C3041)にて3μg/mlに希釈したものを固相化液として96ウェルのELISA用プレート(F96 MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE、Thermo Fisher Scientific社製、Cat#442404)に100μL/ウェル加え、4℃にて一晩静置して吸着させた。
18C1抗体のヒト化抗体の作製
(1)18C1ヒト化抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列の設計
以下に記載する方法で、18C1ヒト化抗体の各種VHおよびVLのアミノ酸配列を設計した。以降の記述では様々なVHおよびVLのアミノ酸配列を有する18C1ヒト化抗体の総称として、hz18C1抗体と記載する。18C1抗体のCDRのアミノ酸配列の移植に適した既知のヒト抗体のフレームワーク(以下、FRと記載する)のアミノ酸配列として、Kabatら[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]で報告されているヒトFRコンセンサス配列およびヒト抗体ジャームライン配列の中からhSGHIIおよびV1-22を選択し、これらのFRにCDRを移植することとした。
表3に示すヒト化抗体の可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を、動物細胞で高頻度に使用されるコドンを用いて設計した。
(2)で設計した塩基配列に対応する遺伝子断片を、シームレスクローニング法を用いて発現ベクターに導入して必要なプラスミドを作製した。但し、VL発現ベクターとしてはシグナル配列およびヒトλ鎖定常領域配列を有したpCI-OtCMV_hLベクターを、VH発現ベクターとしてはシグナル配列およびヒトγ鎖定常領域配列を有したpCI-OtCAG_hG4PE(R409K)ベクターを用いた。pCI-OtCAG_hG4PE(R409K)ベクターが有する定常領域配列は、ヒトIgG4の重鎖定常領域のEU-indexにおける228番目のSer残基をProに、235番目のLeu残基をGluに、および409番目のArg残基をLysにそれぞれ置換したIgG4変異体(以下、IgG4PE R409K(WO2006/033386) と記載する)の重鎖定常領域である。なおこれらのベクターは、Promega社 pCI ベクターを共通主骨格としてヒト抗体遺伝子を発現させるために必要な制限酵素サイトを導入し、全合成によって作製されたベクターである。完成したプラスミドは、NucleoBond Xtra Midi EFキット(タカラバイオ社)を用いて大量調製した。次に、目的のヒト化抗体を、Expi293 Expression System Kit(Life Technologies社)を使用して一過性に発現させた。プラスミドの導入の方法は添付書類に従った。
抗BMP10ヒト化抗体の結合活性評価
実施例5-3で得られたch18C1抗体と、実施例12で得られた抗BMP10ヒト化抗体のヒトBMP10に対する結合活性を比較することを目的とし、ヒトBMP10 mature2量体(R&Dシステムズ社製、Cat#2926-BP)に対する結合活性をBiacoreT100(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を用いて表面プラズモン共鳴法(SPR法)により測定した。
抗BMP10ヒト化抗体とch18C1抗体の中和活性比較
14-1)抗BMP10ヒト化抗体のBMP10ホモ2量体に対する中和活性評価
取得した抗BMP10ヒト化抗体とch18C1抗体に関して、BMP10に対する中和活性を実施例3の3-1)で作製したヒトALK1発現レポーター細胞を用いて比較した。
取得した抗BMP10ヒト化抗体とch18C1抗体に関して、ヒト血中BMP9/BMP10ヘテロ2量体に対する中和活性を、ヒトALK1発現レポーター細胞を用いて比較した。ヒトALK1発現レポーター細胞は実施例3の3-1)で作製した細胞を用いて行った。
正常動物の血圧に対するBMP9/BMP10ヘテロ2量体中和作用の評価
SDラットを用いてBMP9/BMP10ヘテロ2量体を中和した際の血圧に対する作用を評価した。6週齢の雄性SDラット(日本チャールズリバー社製)を購入し、実験に供した。飲水は滅菌水道水を、食餌は固形飼料FR-2(フナバシファーム社製)を自由摂取で与えた。馴化飼育の後、7週齢でテレメトリー送信機の埋め込み手術を施した。テレメトリー送信機の埋め込み手術方法および血圧波形の取得は、実施例7に従って行った。
正常動物の血圧に対するヒトBMP10ホモ2量体の作用の評価
16-1)ヒトBMP10組換えタンパク質の調製
ヒトBMP10ホモ2量体の血圧に対する作用を評価するために、ヒトBMP10組換えタンパク質を調製した。ヒトBMP10発現ベクターは国際公開第2014/007198号の実施例20に記載された方法に従い調製した。またヒトFurin発現プラスミドは、ヒトFurin全長cDNAを、pEAK8ベクター(Edge Biosystems社)にIn-Fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ社製)を用いて組み込むことにより作製した。
SDラットを用いてヒトBMP10組換えタンパク質を投与した際の血圧に対する作用を評価した。6週齢の雄性SDラット(日本チャールズリバー社製)を購入し、実験に供した。飲水は滅菌水道水を、食餌は固形飼料FR-2(フナバシファーム社製)を自由摂取で与えた。馴化飼育の後、7週齢でテレメトリー送信機の埋め込み手術を施した。
配列番号2:ラットIgG2aに特異的なプライマーRV1の塩基配列
配列番号3:ラットIg(κ)特異的なプライマーRV1の塩基配列
配列番号4:ラットIg(λ)特異的なプライマーRV1の塩基配列
配列番号5:18C1抗体のVH全塩基配列
配列番号6:12H3抗体のVH全塩基配列
配列番号7:11H10抗体のVH全塩基配列
配列番号8:18C1抗体のVH全アミノ酸配列(シグナル配列を含む)
配列番号9:12H3抗体のVH全アミノ酸配列(シグナル配列を含む)
配列番号10:11H10抗体のVH全アミノ酸配列(シグナル配列を含む)
配列番号11:18C1抗体のVL全塩基配列
配列番号12:12H3抗体のVL全塩基配列
配列番号13:11H10抗体のVL全塩基配列
配列番号14:18C1抗体のVL全アミノ酸配列(シグナル配列を含む)
配列番号15:12H3抗体のVL全アミノ酸配列(シグナル配列を含む)
配列番号16:11H10抗体のVL全アミノ酸配列(シグナル配列を含む)
配列番号17:18C1抗体のVH塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号18:12H3抗体のVH塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号19:11H10抗体のVH塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号20:18C1抗体のVL塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号21:12H3抗体のVL塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号22:11H10抗体のVL塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号23:18C1抗体のVHアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号24:12H3抗体のVHアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号25:11H10抗体のVHアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号26:18C1抗体のVLアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号27:12H3抗体のVLアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号28:11H10抗体のVLアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号29:18C1抗体VHのCDR1アミノ酸配列
配列番号30:18C1抗体VHのCDR2アミノ酸配列
配列番号31:18C1抗体VHのCDR3アミノ酸配列
配列番号32:18C1抗体VLのCDR1アミノ酸配列
配列番号33:18C1抗体VLのCDR2アミノ酸配列
配列番号34:18C1抗体VLのCDR3アミノ酸配列
配列番号35:12H3抗体VHのCDR1アミノ酸配列
配列番号36:12H3抗体VHのCDR2アミノ酸配列
配列番号37:12H3抗体VHのCDR3アミノ酸配列
配列番号38:12H3抗体VLのCDR1アミノ酸配列
配列番号39:12H3抗体VLのCDR2アミノ酸配列
配列番号40:12H3抗体VLのCDR3アミノ酸配列
配列番号41:11H10抗体VHのCDR1アミノ酸配列
配列番号42:11H10抗体VHのCDR2アミノ酸配列
配列番号43:11H10抗体VHのCDR3アミノ酸配列
配列番号44:11H10抗体VLのCDR1アミノ酸配列
配列番号45:11H10抗体VLのCDR2アミノ酸配列
配列番号46:11H10抗体VLのCDR3アミノ酸配列)
配列番号47:ヒトBMP10蛋白質のアミノ酸配列(シグナル配列を含む)
配列番号48:ヒトBMP10 mature領域のアミノ酸配列
配列番号49:ヒトBMP10蛋白質をコードする塩基配列(シグナル配列を含む)
配列番号50:ヒトBMP10 mature領域をコードする塩基配列
配列番号51:ヒトBMPRIIのアミノ酸配列
配列番号52:ヒトALK1のアミノ酸配列
配列番号53:18C1抗体の軽鎖の増幅に用いたプライマーFwdの塩基配列
配列番号54:18C1抗体の軽鎖の増幅に用いたプライマーRvの塩基配列
配列番号55:18C1抗体の重鎖の増幅に用いたプライマーFwdの塩基配列
配列番号56:18C1抗体の重鎖の増幅に用いたプライマーRvの塩基配列
配列番号57:12H3抗体の軽鎖の増幅に用いたプライマーFwdの塩基配列
配列番号58:12H3抗体の軽鎖の増幅に用いたプライマーRvの塩基配列
配列番号59:12H3抗体の重鎖の増幅に用いたプライマーFwdの塩基配列
配列番号60:12H3抗体の重鎖の増幅に用いたプライマーRvの塩基配列
配列番号61:11H10抗体の軽鎖の増幅に用いたプライマーFwdの塩基配列
配列番号62:11H10抗体の軽鎖の増幅に用いたプライマーRvの塩基配列
配列番号63:11H10抗体の重鎖の増幅に用いたプライマーFwdの塩基配列
配列番号64:11H10抗体の重鎖の増幅に用いたプライマーRvの塩基配列
配列番号65:ヒトBMP9 mature 領域のアミノ酸配列
配列番号66:ヒトBMP9蛋白質のアミノ酸配列(シグナル配列を含む)
配列番号67:ヒトBMP9蛋白質をコードする塩基配列(シグナル配列含む)
配列番号68:ヒトBMP9 mature領域をコードする塩基配列
配列番号69:ヒトEndoglinのアミノ酸配列
配列番号70:ヒト化18C1抗体HV0のアミノ酸配列
配列番号71:ヒト化18C1抗体LV0のアミノ酸配列
配列番号72:ヒト化18C1抗体VLres01のアミノ酸配列
配列番号73:ヒト化18C1抗体VLres02のアミノ酸配列
配列番号74:ヒト化18C1抗体VLres03のアミノ酸配列
配列番号75:ヒト化18C1抗体VLres04のアミノ酸配列
配列番号76:ヒト化18C1抗体VLres05のアミノ酸配列
配列番号77:ヒト化18C1抗体VLres06のアミノ酸配列
配列番号78:ヒト化18C1抗体VLres07のアミノ酸配列
配列番号79:ヒト化18C1抗体VLres08のアミノ酸配列
配列番号80:ヒト化18C1抗体VLres09のアミノ酸配列
配列番号81:ヒト化18C1抗体VLres10のアミノ酸配列
配列番号82:ヒト化18C1抗体VLres11のアミノ酸配列
配列番号83:ヒト化18C1抗体VLres12のアミノ酸配列
配列番号84:ヒト化18C1抗体VLres13のアミノ酸配列
配列番号85:ヒト化18C1抗体VLres14のアミノ酸配列
配列番号86:ヒト化18C1抗体VLres15のアミノ酸配列
配列番号87:ヒト化18C1抗体VLres16のアミノ酸配列
配列番号88:ヒト化18C1抗体HVmut01のアミノ酸配列
配列番号89:ヒト化18C1抗体HVmut02のアミノ酸配列
配列番号90:ヒト化18C1抗体HVmut03のアミノ酸配列
配列番号91:ヒト化18C1抗体HVmut04のアミノ酸配列
配列番号92:ヒト化18C1抗体HVmut05のアミノ酸配列
配列番号93:ヒト化18C1抗体HVmut06のアミノ酸配列
配列番号94:ヒト化18C1抗体HVmut07のアミノ酸配列
配列番号95:ヒト化18C1抗体HVmut08のアミノ酸配列
配列番号96:ヒト化18C1抗体HVmut09のアミノ酸配列
配列番号97:ヒト化18C1抗体HVmut10のアミノ酸配列
配列番号98:ヒト化18C1抗体VHres16のアミノ酸配列
配列番号99:ヒト化18C1抗体HVmut05~10のCDR2のアミノ酸配列
Claims (16)
- 以下の(a)~(w)から選ばれる、モノクローナル抗体または該抗体断片であって、
前記モノクローナル抗体はヒトBMP10に結合するモノクローナル抗体であり、
前記抗体断片はヒトBMP10に結合する抗体断片である、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(a)配列番号94で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号73で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(b)配列番号95で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号73で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(c)配列番号91で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(d)配列番号98で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号75で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(e)配列番号89で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号77で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(f)配列番号97で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号77で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(g)配列番号97で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号78で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(h)配列番号98で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号78で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(i)配列番号91で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号79で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(j)配列番号95で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号79で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(k)配列番号98で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号79で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(l)配列番号89で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号81で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(m)配列番号91で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号81で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(n)配列番号95で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号81で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(o)配列番号97で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号81で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(p)配列番号98で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号81で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(q)配列番号94で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号85で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(r)配列番号95で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号85で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(s)配列番号97で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号85で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(t)配列番号98で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号85で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(u)配列番号94で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号87で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(v)配列番号97で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号87で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
(w)配列番号98で表されるアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号87で表されるアミノ酸配列を含むVLを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。 - BMP10の中和活性を有する、請求項1に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
- BMP9/BMP10ヘテロ2量体の中和活性を有する、請求項1または2に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
- 遺伝子組換え抗体である、請求項1~3のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
- Fab、Fab’、F(ab’)2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(diabody)及びジスルフィド安定化V領域(dsFv)から選ばれる抗体断片である請求項1~4のいずれか1項に記載の抗体断片。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片をコードするDNA。
- 請求項6に記載のDNAを含有する組換えベクター。
- 請求項7に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
- 請求項8に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物から該抗体又は該抗体断片を採取することを特徴とする請求項1~5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の製造方法。
- BMP9/BMP10ヘテロ2量体に対するアンタゴニストを含む、高血圧及び/又は高血圧性疾患の治療剤であり、該BMP9/BMP10ヘテロ2量体に対するアンタゴニストがBMP9/BMP10ヘテロ2量体に対する中和活性を有する抗BMP10抗体である、治療剤。
- BMP9アンタゴニストと同時または逐次に投与することを特徴とする、BMP10及びBMP9/BMP10ヘテロ2量体の少なくとも一方に対するアンタゴニストを含む、高血圧及び/又は高血圧性疾患の治療剤であり、BMP10及びBMP9/BMP10ヘテロ2量体の少なくとも一方に対するアンタゴニストが抗BMP10抗体であり、該BMP9アンタゴニストが抗BMP9抗体である、治療剤。
- BMP10及びBMP9/BMP10ヘテロ2量体の少なくとも一方に対するアンタゴニストと同時または逐次に投与することを特徴とする、BMP9アンタゴニストを含む、高血圧及び/又は高血圧性疾患の治療剤であり、BMP10及びBMP9/BMP10ヘテロ2量体の少なくとも一方に対するアンタゴニストが抗BMP10抗体であり、該BMP9アンタゴニストが抗BMP9抗体である、治療剤。
- 請求項1~4のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を含む、ヒトBMP10が関与する疾患の診断薬。
- 請求項1~4のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いる、ヒトBMP10の免疫学的検出方法又は測定方法。
- 請求項1~4のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片と薬理学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 高血圧および高血圧性疾患の治療用医薬組成物の製造のための、BMP9/BMP10ヘテロ2量体に対するアンタゴニストの使用であり、該BMP9/BMP10ヘテロ2量体に対するアンタゴニストがBMP9/BMP10ヘテロ2量体に対する中和活性を有する抗BMP10抗体である、使用。
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