JP7307417B2 - Ｔｄｐ－４３の発現量を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその用途 - Google Patents
Ｔｄｐ－４３の発現量を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその用途 Download PDFInfo
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Description
本発明は、TAR DNA-binding protein 43(TDP-43)の発現量を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその用途に関する。
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、大脳皮質運動野や脊髄の運動神経が変性・脱落する進行性の神経変性疾患であり、筋力低下・運動障害、構音障害、嚥下障害、呼吸筋麻痺障害などの症状により、多くは発症から5年以内で死亡することが知られている。病理組織学的には、変性しつつある下位運動ニューロンの中にブニナ小体、脊髄前角神経にユビキチン陽性封入体が認められる。日本における患者数は、約9,200人と見積もられている。また、前頭側頭型認知症(FTD)は、大脳・前頭側頭葉の神経細胞の変性により認知症を呈する神経変性疾患である。変性型認知症ではアルツハイマー病、レビー小体型に次いで多く、認知症以外に人格変化、行動異常、失語症などをきたす。2006年にNeumannら及びAraiらによって、ALS及びFTDで認められるユビキチン陽性封入体の構成タンパク質がTDP-43であることが見出され、TDP-43のALS/FTD発症に関与するメカニズムが注目されている(非特許文献１、２)。さらに、遺伝性ALS/FTD家系においてTDP-43遺伝子の変異が発見され、ALSとFTDには遺伝学的及び病理学的に共通の分子基盤が存在することから、ALSとFTDは同一スペクトラムにある疾患と考えられている(非特許文献３)。
TDP-43は、414アミノ酸で構成される43 kDaのタンパク質で、N末にRNA結合領域と核移行シグナル、C末にglycine rich domainを持つ。局在は主に核で、発現は全身の組織でみられる。TDP-43は、RNA結合タンパク質であり、転写・翻訳制御、スプライシング制御など多様なRNA制御に関する機能が報告されている。TDP-43が神経変性を引き起こす機構として、毒性機能獲得説と機能喪失説の両方が考えられている。毒性機能獲得説を支持する所見として、TDP-43遺伝子変異によるALSが優性遺伝であること、疾患関連変異型TDP-43に毒性がみられること、一方で、疾患関連変異型TDP-43でも機能は保たれていることが挙げられる。機能喪失説を支持する知見として、ユビキチン陽性TDP-43陽性の細胞質内封入体を形成した運動神経細胞では、核内のTDP-43が消失しており、核内におけるTDP-43の機能が失われていると考えられる。また、神経特異的コンディショナルノックアウトマウスでALSの病理学的変化の特徴が認められている。
マウスにおいてヒトTDP-43を過剰発現させると、野生型TDP-43であるにも関わらず、神経毒性を示す。一方で、ヘテロノックアウトマウスにおけるTDP-43の発現量は、野生型マウスとほぼ同じである。これらの結果から、TDP-43量を厳密に制御する機構が存在すると考えられる。そのTDP-43発現量の制御機構の一つとして、TDP-43自身による自己調節能が報告されている。TDP-43は、TDP-43 mRNAの3’側の非翻訳領域に存在するTDP-43結合領域(TDPBR)に結合し、自己スプライシングを誘導する。自己スプライシングを受けたmRNAバリアントは、分解され、TDP-43タンパク質の翻訳の鋳型にはならない。このように、TDP-43タンパク質量が増加するとmRNA量が減少し、TDP-43タンパク質量が減少するとmRNAが増加するというフィードバック機構が存在することで、自己mRNA量を一定量に調節していると考えられている。
TDP-43の発現量を低下させるsiRNAについては、いくつかの報告があるが(例えば、非特許文献４～７)、既報のsiRNAは、標的配列が多種あり、どの標的配列がTDP-43の発現量を低下させる配列として最適なのかは明確ではなく、また、ヒトTDP-43に作用してその発現量を低下させるアンチセンスオリゴヌクレオチドは報告されていない。
Neumann M. et al., Science, 2006; 314(5796): 130-133.
Arai T. et al., Biochem Biophys Res Commu. 2006; 35(3): 602-611.
Ling S.C. et al., Neuron, 2013; 79(3): 416-438.
Iguchi Y. et al., J Biol Chem, 2009; 284(33): 22059-22066.
Koyama A. et al., Nucleic Acids Res., 2016; 44(12): 5820-5836.
Aulas A. et al., Mol Neurodegener. 2012; 7: 54
Yu Z. et al., J Biol Chem. 2012; 287(27): 22560-22572.
従って、本発明は、TDP-43の発現量を調節し得るアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)、並びにTDP-43の異常凝集及び／又は異常局在が関与する疾患の治療及び／又は予防に有効なASOを含有する医薬を提供することを課題とする。
本発明者らは、既報のsiRNA標的配列に加え、その周辺配列を含む領域の配列に基づいた様々なアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)を作製し、培養細胞を用いて内在性TDP-43の発現を調節できるASOをスクリーニングした。その結果、特定の配列を有するASOは、TDP-43のmRNA量及びタンパク質量を顕著に減少させることを見出した。さらに、本発明者らは、ASOは標的遺伝子の発現の抑制に用いることができるとの従来の発想を転換し、上記TDP-43結合領域を標的とすることで、自己スプライシングを抑制し、TDP-43の発現量を亢進できるのではないかとの着想を得た。この着想を基に研究を進めた結果、TDP-43結合領域の特定の配列を有するASOは、TDP-43のmRNA量及びタンパク質量を顕著に増加させることを見出した。本発明は、そのような知見を基にして完成に至ったものである。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］配列番号２～４のいずれかで表されるヌクレオチド配列中の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、TDP-43 mRNAを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［２］１０～３０個のヌクレオチドからなる、［１］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［３］前記相補的なヌクレオチド配列が配列番号４５～６３のいずれかで表されるヌクレオチド配列(但し、チミンはウラシルであってもよい)である、［１］又は［２］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［４］糖－リン酸骨格の１種以上の修飾を含む、［１］～［３］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［５］2'－O, 4'－C－エチレン架橋核酸及びデオキシリボヌクレオチドを含む、［４］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［６］ギャップマー型である、［５］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［７］配列番号１１、２２～２９及び３５～４４のいずれかで表されるヌクレオチド配列からなる、［１］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［８］配列番号５で表されるヌクレオチド配列中の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、TDP-43 mRNAを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［９］１０～３０個のヌクレオチドからなる、［８］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［１０］糖－リン酸骨格の１種以上の修飾を含む、［８］又は［９］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［１１］2’－O，4’－C－エチレン架橋核酸及び2'－O－メチル修飾核酸を含む、［１０］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［１２］シトシンヌクレオチド及びチミンヌクレオチドが2'－O, 4'－C－エチレン架橋核酸であり、アデニンヌクレオチド及びグアニンヌクレオチドが2’-O-メチル修飾核酸である、［１０］又は［１１］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［１３］配列番号８４、８５又は８７で表されるヌクレオチド配列からなる、［８］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［１４］［１］～［１３］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる、TDP-43の発現調節剤。
［１５］［１］～［１３］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる、TDP-43タンパク質症の治療及び／又は予防剤。
［１６］前記TDP-43タンパク質症が筋委縮性側索硬化症又は前頭側頭型認知症である、［１５］に記載の剤。
［１７］哺乳動物に対し、［１］～［１３］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする、該哺乳動物におけるTDP-43タンパク質症の治療及び／又は予防方法。
［１８］TDP-43タンパク質症の治療及び／又は予防における使用のための、［１］～［１３］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［１９］［８］～［１３］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる、TDP-43の自己調節能の機構解析用試薬。
［１］配列番号２～４のいずれかで表されるヌクレオチド配列中の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、TDP-43 mRNAを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［２］１０～３０個のヌクレオチドからなる、［１］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［３］前記相補的なヌクレオチド配列が配列番号４５～６３のいずれかで表されるヌクレオチド配列(但し、チミンはウラシルであってもよい)である、［１］又は［２］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［４］糖－リン酸骨格の１種以上の修飾を含む、［１］～［３］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［５］2'－O, 4'－C－エチレン架橋核酸及びデオキシリボヌクレオチドを含む、［４］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［６］ギャップマー型である、［５］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［７］配列番号１１、２２～２９及び３５～４４のいずれかで表されるヌクレオチド配列からなる、［１］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［８］配列番号５で表されるヌクレオチド配列中の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、TDP-43 mRNAを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［９］１０～３０個のヌクレオチドからなる、［８］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
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［１１］2’－O，4’－C－エチレン架橋核酸及び2'－O－メチル修飾核酸を含む、［１０］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［１２］シトシンヌクレオチド及びチミンヌクレオチドが2'－O, 4'－C－エチレン架橋核酸であり、アデニンヌクレオチド及びグアニンヌクレオチドが2’-O-メチル修飾核酸である、［１０］又は［１１］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
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［１６］前記TDP-43タンパク質症が筋委縮性側索硬化症又は前頭側頭型認知症である、［１５］に記載の剤。
［１７］哺乳動物に対し、［１］～［１３］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする、該哺乳動物におけるTDP-43タンパク質症の治療及び／又は予防方法。
［１８］TDP-43タンパク質症の治療及び／又は予防における使用のための、［１］～［１３］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［１９］［８］～［１３］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる、TDP-43の自己調節能の機構解析用試薬。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)によれば、TDP-43、特にヒトTDP-43のmRNA及びタンパク質の発現量を効果的に低下させることができる一方で、該TDP-43のmRNA及びタンパク質の発現量を増加させることもできる。このため、本発明のASOは、TDP-43の異常凝集及び／又は異常局在が関与する疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症や前頭側頭型認知症の治療薬として用いることができる。また、本発明のASOは、TDP-43 mRNAのTDPBRに作用することで、TDP-43発現の自己調節機能を標的としたASOであり、この点においても革新的である。さらに、修飾核酸を含む本発明のASOは、生体に投与後、長期間(２週間以上又は３ヶ月以上)安定して機能し得る。
１．TDP-43の発現量を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチド
＜１－１．TDP-43の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド＞
本発明は、TDP-43 mRNAの一部の領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、TDP-43の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド(以下「本発明の抑制型ASO」と略記する場合がある)を提供する。本明細書において、「TDP-43の発現」とは、特にことわらない限り、少なくとも「機能的なTDP-43タンパク質の産生」を含む意味で用いられるが、好ましくは、さらに「TDP-43 mRNAの発現」、即ち、TDP-43 mRNAの量をも含む意味で用いられる。
＜１－１．TDP-43の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド＞
本発明は、TDP-43 mRNAの一部の領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、TDP-43の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド(以下「本発明の抑制型ASO」と略記する場合がある)を提供する。本明細書において、「TDP-43の発現」とは、特にことわらない限り、少なくとも「機能的なTDP-43タンパク質の産生」を含む意味で用いられるが、好ましくは、さらに「TDP-43 mRNAの発現」、即ち、TDP-43 mRNAの量をも含む意味で用いられる。
本発明において「抑制型ASO」とは、TDP-43 mRNA(本発明において、mRNAにはmRNA前駆体が包含される)の標的配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドであり、当該ASOが標的とするRNAと二本鎖を形成することによりmRNAの働き(転写後編集、翻訳など)を抑制するオリゴヌクレオチドを意味する。
本発明の抑制型ASOが標的とするTDP-43 mRNAのヌクレオチド配列としては、本発明の抑制型ASOがTDP-43 mRNAの発現を抑制し得る限り特に制限されないが、例えば、配列番号1(5'- AUCAUUAAAGGAAUCAGCGUUCAUAUAUCCAAUGCC -3')、配列番号2(5'- GAUCAUUAAAGGAAUCAGCGUUCAUAUAUCCAAUGCCG -3')、配列番号3(5’ -AUGUCUGAAUAUAUUCGGGUAACCGAAGAUGAGAACGAUGAGCCCAUUGAA- 3’)及び配列番号4(5’-CUUGUCUCCCCUCAUACACAAAAGUACAAUAUGAAGCCUUCAUUUAAUCUCUGCAGUUCA- 3’)のいずれかで表される配列が挙げられ、中でも、これらの配列中、連続する少なくとも10個(例：10、15、16、17、18、19、20個又はそれ以上)のヌクレオチドの部分配列であることが好ましい。以下では、特にことわらない限り、ヌクレオチド配列は左から右に、5’から3’の方向に記載する。
＜１－２．TDP-43の発現を亢進するアンチセンスオリゴヌクレオチド＞
本発明は、TDP-43 mRNAの一部の領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、TDP-43の発現を亢進するアンチセンスオリゴヌクレオチド(以下「本発明の亢進型ASO」と略記する場合がある)を提供する。以下では、本発明の抑制型ASOと亢進型ASOをまとめて、「本発明のASO」と略記する場合がある。
本発明は、TDP-43 mRNAの一部の領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、TDP-43の発現を亢進するアンチセンスオリゴヌクレオチド(以下「本発明の亢進型ASO」と略記する場合がある)を提供する。以下では、本発明の抑制型ASOと亢進型ASOをまとめて、「本発明のASO」と略記する場合がある。
本発明において「亢進型ASO」とは、TDP-43 mRNAのTDP-43結合領域(TDPBR)に対して相補的なオリゴヌクレオチドであり、かつRNase H、Ago2及び他の酵素による標的TDP-43 mRNAの分解を引き起こさずにTDP-43の発現量を亢進するオリゴヌクレオチドを意味する。ここで、標的TDP-43 mRNAの分解を引き起こさないとは、標的TDP-43 mRNAの分解を全く引き起こさないことだけでなく、標的TDP-43 mRNAの分解を引き起こす場合であっても、亢進型ASOの非存在下に比べてTDP-43 mRNAの分解が抑制され、その結果、前記酵素の分解作用によるmRNA量の減少よりもTDP-43 mRNAの転写量が上回り、実質的にTDP-43の発現量が亢進することも包含される。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明の亢進型ASOは、標的とするRNAと二本鎖を形成することにより、TDP-43タンパク質のTDPBRへの結合を阻害し、その結果自己スプライシングの誘導が抑制されることで、TDP-43の発現が亢進されるものと推察される。
本発明のASOが標的とするTDP-43 mRNAの配列は、例えば、Homo sapiens TAR DNA binding protein (TARDBP), mRNA (NCBI Reference Sequence:NM_007375.3)、Homo sapiens TAR DNA binding protein, mRNA (cDNA clone IMAGE:3506121) (GenBank:BC001487.2)、Homo sapiens TAR DNA binding protein, mRNA (cDNA clone IMAGE:3506121) (GenBank: BC001487.2)などを参照して設定することができる。非ヒト哺乳動物のTDP-43 mRNAを標的とする場合も、同様に公知の配列を参照して標的配列を設定することができる。また、本明細書では、特にことわらない限り、ヒトTDP-43 mRNAのヌクレオチド配列に基づいて、ASOが標的とするヌクレオチド配列やヌクレオチドの長さ等を記載するが、非ヒト哺乳動物オルソログにおける対応するヌクレオチド配列やヌクレオチドの長さ等も、当該記載内容に包含されるものである。
本発明の亢進型ASOが標的とするTDP-43 mRNAのヌクレオチド配列としては、本発明の亢進型ASOがTDP-43の発現を亢進し得る限り特に制限されないが、例えば、配列番号5(UGCUUUGCAGGAGGACUUGAAG)で表される配列が挙げられ、中でも、該配列中、連続する少なくとも10個(例：10、15、16、17、18、19、20個又はそれ以上)のヌクレオチドからなる配列であることが好ましい。
本発明において「相補的である」とは、標的配列に対して完全相補的な(即ち、ミスマッチなくハイブリダイズする)配列のみならず、哺乳動物細胞の生理的条件下で標的配列とハブリダイズし得る限り、1ないし数個(例：2、3、4又は5個)のミスマッチを含む配列をも含む意味で用いられる。例えば、TDP-43 mRNA中の標的配列に対して完全相補的な配列と、80%以上(例：85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上)、最も好ましくは100%の同一性を有する配列が挙げられる。また、個々の塩基における相補性は、対象となる塩基とワトソン・クリック型塩基対を形成することに限定されるものではなく、フーグスティーン型塩基対やゆらぎ塩基対(Wobble base pair)を形成することも含む。
本発明のASOの長さは、配列番号1～4のいずれかで示される配列の全部もしくは一部と相補的な配列を含む限り特に限定されないが、典型的には10～50ヌクレオチド長であり、好ましくは10～30ヌクレオチド長であり、より好ましくは15～30ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは18～20ヌクレオチド長である。
本発明のASOの構成単位としては、例えば、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドが挙げられる。これらのヌクレオチドは、修飾されていても(修飾されたヌクレオチド残基を「修飾ヌクレオチド残基」と称する場合がある)、非修飾であってもよい(非修飾のヌクレオチド残基を「非修飾ヌクレオチド残基」と称する場合がある)。本発明の抑制型ASOは、例えば、修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性が向上し、安定性の改善が可能である。一方で亢進型ASOの場合は、標的TDP-43 mRNAの分解が生じないようにするため、修飾ヌクレオチド残基を含むことが重要となる。本発明の亢進型ASOにおいて、修飾ヌクレオチド残基の割合は、RNase H等による分解を引き起こさない限り限定されないが、全ヌクレオチド残基の３分の１以上が修飾ヌクレオチド残基であることが好ましい。また、本発明のASOは、非修飾ヌクレオチド残基や修飾ヌクレオチド残基とは異なる分子で構成されるリンカー領域を含んでいてもよい。
本発明のASOは、例えば、標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等が挙げられる。前記標識物質は、例えば、ピレン、TAMRA、フルオレセイン、Cy3色素、Cy5色素等の蛍光団が挙げられ、前記色素は、例えば、Alexa488等のAlexa色素等が挙げられる。前記同位体は、例えば、安定同位体及び放射性同位体が挙げられ、好ましくは安定同位体である。前記安定同位体は、例えば、被ばくの危険性が少なく、専用の施設も不要であることから取り扱い性に優れ、また、コストも低減できる。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、2H、13C、15N、17O、18O、33S、34S及び36Sが挙げられる。
前記ヌクレオチド残基は、構成要素として、糖、塩基及びリン酸を含む。リボヌクレオチドは、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)及びウラシル(U)(チミン(T)に置き換えることもできる)を有し、デオキシリボヌクレオチド残基は、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン(dA)、グアニン(dG)、シトシン(dC)及びチミン(dT)(ウラシル(dU)に置き換えることもできる)を有する。以下では、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミンを有するヌクレオチドをそれぞれ、アデニンヌクレオチド、グアニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド、ウラシルヌクレオチド、チミンヌクレオチドと称する場合がある。
前記非修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一又は実質的に同一であり、好ましくは、人体において天然に存在するものと同一又は実質的に同一である。
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。本発明において、「修飾」には、例えば、前記構成要素の置換、付加及び／又は欠失、前記構成要素における原子及び／又は官能基の置換、付加及び／又は欠失が挙げられる。前記修飾ヌクレオチド残基としては、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等が挙げられる。前記天然由来の修飾ヌクレオチド残基としては、例えば、リンバックら(Limbach et al.,1994,Summary:the modified nucleosides of RNA,Nucleic Acids Res．22:2183～2196)を参照できる。また、前記修飾ヌクレオチド残基としては、例えば、前記ヌクレオチドの代替物の残基が挙げられる。
前記ヌクレオチド残基の修飾は、例えば、糖－リン酸骨格(該骨格には、塩基も含まれる)(以下、糖リン酸骨格)の修飾が挙げられる。
前記糖リン酸骨格において、糖がリボースの場合、例えば、リボース残基を修飾できる。前記リボース残基は、例えば、2’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、2’位炭素に結合する水酸基をメチル基で修飾、あるいは該水酸基を水素又はフルオロ等のハロゲンに置換できる。また、前記2’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボースに置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。以下では、前記のように糖の2’位炭素に結合する水酸基をメチル基で修飾した核酸を2'－O－メチル修飾核酸と称することがある。また、本発明において、「核酸」にはヌクレオチドなどの核酸モノマーが包含される。
前記糖リン酸骨格は、例えば、非リボース残基(非デオキシリボース残基も包含されるものとする)及び／又は非リン酸を有する非リボースリン酸骨格に置換してもよく、このような置換も糖リン酸骨格の修飾に包含される。前記非リボースリン酸骨格は、例えば、前記糖リン酸骨格の非荷電体が挙げられる。前記非リボースリン酸骨格に置換された、前記ヌクレオチドの代替物は、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等が挙げられる。前記代替物は、この他に、例えば、人工核酸が挙げられる。具体例として、例えば、PNA(ペプチド核酸)、架橋構造型人工核酸(BNA：Bridged Nucleic Acid)などが挙げられる。BNAとしては、例えば、ロックト人工核酸(LNA：Locked Nucleic Acid)、2’－O，4’－C－エチレン架橋核酸(ENA：2’－O，4’－C－Ethylenebridged Nucleic Acid)などが挙げられる。以下に、本発明に用いることができるLNA及びENAを含むBNAの具体的な構造(ヌクレオシド部分)を、国際公開第2016/006697号公報に記載の図を引用して示す。
式中、Rは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数1から7のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数2から7のアルケニル基、ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール基、ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表す。好ましくは、Rは、水素原子、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基であり、より好ましくは、Rは、水素原子またはメチル基である。式中、Baseは塩基を表す。
また、これらのうち、A型(RNAタイプ)構造を効率よく安定化する以外の余剰の修飾が無いという観点からは、好ましくは、以下のヌクレオシド構造を有するENAである。
これらの人工核酸は、例えば、特開2002-241393、特開2000-297097等を参照して合成することができる。
前記糖リン酸骨格において、例えば、リン酸基を修飾できる。前記糖リン酸骨格において、糖残基に最も隣接するリン酸基は、αリン酸基と呼ばれる。前記αリン酸基は、負に荷電し、その電荷は、糖残基に非結合の2つの酸素原子にわたって、均一に分布している。前記αリン酸基における4つの酸素原子のうち、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と非結合である2つの酸素原子は、以下、「非結合(non-linking)酸素」ともいう。他方、前記ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と結合している2つの酸素原子は、以下、「結合(linking)酸素」という。前記αリン酸基は、例えば、非荷電となる修飾、又は、前記非結合酸素における電荷分布が非対称型となる修飾を行うことが好ましい。
前記リン酸基は、例えば、前記非結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、S(硫黄)、Se(セレン)、B(ホウ素)、C(炭素)、H(水素)、N(窒素)及びOR(Rは、アルキル基又はアリール基)のいずれかの原子で置換でき、好ましくは、Sで置換される。前記非結合酸素は、例えば、両方が置換されていることが好ましく、より好ましくは、両方がSで置換される。前記修飾リン酸基は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキル又はアリールホスホネート、及びホスホトリエステル等が挙げられる。
前記リン酸基は、例えば、前記リン非含有のリンカーに置換してもよい。前記リンカーは、例えば、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、及びメチレンオキシメチルイミノなどを含み、好ましくは、メチレンカルボニルアミノ基及びメチレンメチルイミノ基を含む。
あるいは、前記リン酸基は、リン酸非含有のリンカーに置換してもよい。このようなリンカーとしては、例えば、“Med. Chem. Commun., 2014, 5, 1454-1471”に記載されたもの(以下に図を引用して示す)が挙げられる。
本発明のASOは、例えば、3’末端及び5’末端の少なくとも一方のヌクレオチド残基が修飾されてもよい。前記修飾は、例えば、3’末端及び5’末端のいずれか一方でもよいし、両方でもよい。前記修飾は、例えば、前述のとおりであり、好ましくは、末端のリン酸基に行うことが好ましい。前記リン酸基は、例えば、全体を修飾してもよいし、前記リン酸基における1つ以上の原子を修飾してもよい。前者の場合、例えば、リン酸基全体の置換でもよいし、欠失でもよい。
前記末端のヌクレオチド残基の修飾は、例えば、他の分子の付加が挙げられる。前記他の分子は、例えば、前述のような標識物質、保護基等の機能性分子が挙げられる。前記保護基は、例えば、S(硫黄)、Si(ケイ素)、B(ホウ素)、エステル含有基等が挙げられる。前記標識物質等の機能性分子は、例えば、本発明のASOの検出等に利用できる。
前記他の分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のリン酸基に付加してもよいし、スペーサーを介して、前記リン酸基又は前記糖残基に付加してもよい。前記スペーサーの末端原子は、例えば、前記リン酸基の前記結合酸素、又は、糖残基のO、N、SもしくはCに、付加又は置換できる。前記糖残基の結合部位は、例えば、3’位のCもしくは5’位のC、又はこれらに結合する原子が好ましい。前記スペーサーは、例えば、前記PNA等のヌクレオチド代替物の末端原子に、付加又は置換することもできる。
前記スペーサーは、特に制限されず、例えば、-(CH2)n-、-(CH2)nN-、-(CH2)nO-、-(CH2)nS-、O(CH2CH2O)nCH2CH2OH、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、及びモルホリノ等、ならびに、ビオチン試薬及びフルオレセイン試薬等を含んでもよい。前記式において、nは、正の整数であり、n＝3又は6が好ましい。
前記末端に付加する分子は、これらの他に、例えば、色素、インターカレート剤(例えば、アクリジン)、架橋剤(例えば、ソラレン、マイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフィリン、サッフィリン)、多環式芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA)、親油性担体(例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1，3-ビス-O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1，3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-(オレオイル)リトコール酸、O3-(オレオイル)コール酸、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン)及びペプチド複合体(例えば、アンテナペディアペプチド、Tatペプチド)、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、PEG(例えば、PEG-40K)、MPEG、［MPEG］2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送／吸収促進剤(例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ(例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のEu3+複合体)等が挙げられる。
本発明のASOは、前記5’末端が、例えば、リン酸基又はリン酸基アナログで修飾されてもよい。前記リン酸基は、例えば、5’一リン酸((HO)2(O)P-O-5’)、5’二リン酸((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)、5’三リン酸((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)、5’－グアノシンキャップ(7-メチル化又は非メチル化、7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)、5’－アデノシンキャップ(Appp)、任意の修飾又は非修飾ヌクレオチドキャップ構造(N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)、5’一チオリン酸(ホスホロチオエート：(HO)2(S)P-O-5’)、5’一ジチオリン酸(ホスホロジチオエート：(HO)(HS)(S)P-O-5’)、5’-ホスホロチオール酸((HO)2(O)P-S-5’)、硫黄置換の一リン酸、二リン酸及び三リン酸(例えば、5’-α-チオ三リン酸、5’-γ-チオ三リン酸等)、5’-ホスホルアミデート((HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’)、5’－アルキルホスホン酸(例えば、RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2、Rはアルキル(例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等))、5’-アルキルエーテルホスホン酸(例えば、RP(OH)(O)-O-5’、Rはアルキルエーテル(例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等))等が挙げられる。
前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されず、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基として、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ、ユニバーサル塩基などが使用できる。
前記塩基としては、例えば、アデニン及びグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシル及びチミン等のピリミジン塩基が挙げられる。前記塩基としては、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン(nubularine)、イソグアニシン(isoguanisine)、ツベルシジン(tubercidine)等が挙げられる。前記塩基は、例えば、2-アミノアデニン、6-メチル化プリン等のアルキル誘導体；2-プロピル化プリン等のアルキル誘導体；5-ハロウラシル及び5-ハロシトシン；5-プロピニルウラシル及び5-プロピニルシトシン；6-アゾウラシル、6-アゾシトシン及び6-アゾチミン；5-ウラシル(プソイドウラシル)、4-チオウラシル、5-ハロウラシル、5-(2-アミノプロピル)ウラシル、5-アミノアリルウラシル；8-ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化及び他の8-置換プリン；5-トリフルオロメチル化及び他の5-置換ピリミジン；7-メチルグアニン；5-置換ピリミジン；6-アザピリミジン；N-2、N-6、及びO-6置換プリン(2-アミノプロピルアデニンを含む)；5-プロピニルウラシル及び5-プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；3-デアザ－5-アザシトシン；2-アミノプリン；5-アルキルウラシル；7-アルキルグアニン；5-アルキルシトシン；7-デアザアデニン；N6，N6-ジメチルアデニン；2，6-ジアミノプリン；5-アミノ－アリル－ウラシル；N3-メチルウラシル；置換1，2，4-トリアゾール；2-ピリジノン；5-ニトロインドール；3-ニトロピロール；5-メトキシウラシル；ウラシル－5-オキシ酢酸；5-メトキシカルボニルメチルウラシル；5-メチル-2-チオウラシル；5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウラシル；5-メチルアミノメチル-2-チオウラシル；3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウラシル；3-メチルシトシン；5-メチルシトシン；N4-アセチルシトシン；2-チオシトシン；N6-メチルアデニン；N6-イソペンチルアデニン；2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン；N-メチルグアニン；O-アルキル化塩基等が挙げられる。また、プリン及びピリミジンは、例えば、米国特許第3,687,808号、「Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering」、858～859頁、クロシュビッツ ジェー アイ(Kroschwitz J.I.)編、John Wiley & Sons、1990、及びイングリッシュら(Englischら)、Angewandte Chemie、International Edition、1991、30巻、p.613に開示されるものが含まれる。ユニバーサル塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル及びチミンなどと塩基対を形成し得るヌクレオチド塩基類似体を意味する。前記ユニバーサル塩基としては、例えば、Ｃ－フェニル、Ｃ－ナフチル及び他の芳香族の誘導体、イノシン、アゾールカルボザミド(carbozamide)、ニトロアゾール誘導体(３－ニトロピロール、４－ニトロインドール、５－ニトロインドール、及び６－ニトロインドール等)(Loakes，2001，Nucleic Acids Res．29：2437)や、国際公開第2007/026485号公報に記載の塩基などが挙げられるが、これらに限定されない。
前記修飾ヌクレオチド残基は、これらの他に、例えば、塩基を欠失する残基、すなわち、無塩基の糖リン酸骨格を含んでもよい。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、国際公開第2004/080406号に記載された残基が使用できる。
別の態様において、本発明は、2’－O，4’－C－エチレン架橋核酸及び2'－O－メチル修飾核酸を含むASO(特に、亢進型ASO)を提供する。中でも、シトシンヌクレオチド及びチミンヌクレオチドが2’－O，4’－C－エチレン架橋核酸であり、アデニンヌクレオチド及びグアニンヌクレオチドが2'－O－メチル修飾核酸であるASOが提供される。このようなASOにおいて、2’－O，4’－C－エチレン架橋ヌクレオチド残基の個数：2’-O-メチル修飾ヌクレオチド残基の個数の比は、1：4～4：1であることが好ましく、2：3～3：2であることがより好ましい。
ヌクレオチド残基が修飾された抑制型ASOとしては、例えば、下述の実施例において高い抑制効果が示されたASO(OG#06、OG#17～24)が有する修飾オリゴヌクレオチド(それぞれ配列番号11、22～29で表す)及びこれらの標的配列を1塩基分ずらした配列に相補的な修飾オリゴヌクレオチド(それぞれ配列番号35～44で表す)を含むASO、並びにこれらの修飾オリゴヌクレオチドの一部のヌクレオチド残基が非修飾であるオリゴヌクレオチドを含むASOなどが挙げられる。非修飾の抑制型ASOとしては、例えば、該修飾オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド残基が非修飾であるオリゴヌクレオチド(それぞれ配列番号45～63で表す。該ヌクレオチド配列は、配列の型としてDNAで表わされるが、一部又は全てのデオキシリボース残基がリボース残基で置換されたオリゴヌクレオチド、及び／又は一部又は全てのチミンがウラシルで置換されたオリゴヌクレオチドも、配列番号45～63のいずれかで表される配列に包含される。)を含むASOなどが挙げられる。好ましい実施態様において、本発明の抑制型ASOは、配列番号11、22～29及び35～44及び45～63のいずれかで表されるオリゴヌクレオチド配列からなるASOである。また、ヌクレオチド残基が修飾された亢進型ASOとしては、例えば、下述の実施例において高い亢進効果が示されたASO(ok#19、20、22)が有する修飾オリゴヌクレオチド(それぞれ配列番号84、85、87で表す)を含むASO、該修飾オリゴヌクレオチドの一部のヌクレオチド残基が非修飾であるオリゴヌクレオチドを含むASOなどが挙げられる。好ましい実施態様において、本発明の亢進型ASOは、配列番号84、85及び87のいずれかで表されるオリゴヌクレオチド配列からなるASOである。
また、本発明の抑制型ASOは、ギャップマー型ASOであってもよい。本発明において「ギャップマー型ASO」とは、リボヌクレアーゼH切断を支持する複数(例：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)のデオキシリボヌクレオチドを有する内部領域が、１個以上(例：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)の修飾されたヌクレオチドを有する外部領域間に配置されるキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。好適なギャップマー型ASOとして、内部領域に10個のデオキシリボヌクレオチドを有し、その外部領域にそれぞれ5個の修飾ヌクレオチドを有するASOが挙げられる。修飾については、前述した通りである。また、ギャップマー型ASOは、生体安定性を改善するため、ヌクレオチドのリン酸基の一部(例えば、全リン酸残基の50%以上、60%以上、70%以上、80%以上若しくは90%以上)又は全部が硫黄化されたホスホロチオエート(S化)オリゴヌクレオチドであることが好ましい。
本発明のASOの合成方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等が挙げられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、PCRカセットによる方法が挙げられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法及びH-ホスホネート法等が挙げられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、RNA Phosphoramidites(2’-O-TBDMSi、商品名、三千里製薬)、ACEアミダイト及びTOMアミダイト、CEEアミダイト、CEMアミダイト、TEMアミダイト等が挙げられる。
本発明のASOが非修飾リボヌクレオチド残基のみで構成される場合、本発明のASOは、該ASOの前駆体として、該ASOを発現可能な状態でコードする核酸等(ベクターの形態を含む、以下同じ)で提供されてもよい。該発現ベクターは、本発明のASOをコードするDNAを標的細胞内で機能的なプロモーターの調節下に含むことを特徴とし、その他の構成は何ら制限されない。該発現ベクターを、自体公知の遺伝子導入法を用いて、標的細胞に導入することにより、該細胞内でのTDP-43の発現を抑制することができる。
前記プロモーターは、標的細胞(TDP-43を発現する細胞)内で機能し得るものであれば特に制限はなく、例えば、pol I系プロモーター、pol II系プロモーター、pol III系プロモーターなどを使用することができるが、好ましくは、pol III系プロモーターである。具体的には、SV40由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスLTR等のウイルスプロモーター、β－アクチン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成タンパク質遺伝子プロモーター、並びにU6プロモーター、H1プロモーター、tRNAプロモーターなどのプロモーターなどが挙げられる。上記発現ベクターは、好ましくは本発明のASOをコードする核酸の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子(テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等)をさらに含有することもできる。
本発明において発現ベクターに使用されるベクターの種類は特に制限されないが、ヒトへの投与に好適なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルスベクター、プラスミドベクターなどが挙げられる。このうち、アデノウイルスは、遺伝子導入効率が極めて高く、非分裂細胞にも導入可能である等の利点を有する。治療効果の持続性の観点から、比較的遺伝子導入効率が高く、非分裂細胞にも導入可能で、且つ逆位末端繰り返し配列(ITR)を介して染色体に組み込まれ得るアデノ随伴ウイルスの使用もまた好ましい。
２.本発明のASOを含有してなる発現調節剤
本発明のASOは、前述のように、TDP-43の発現を抑制又は亢進することができる。従って、本発明のASOは、抑制型ASOを含有するTDP-43の発現抑制剤、及び亢進型ASOを含有するTDP-43の発現亢進剤として用いることができ、以下では、これらをまとめて「本発明の発現調節剤」と称する。本発明の発現調節剤に含まれるASOは、ASO分子の形態であってもよく、上述したようにASOをコードする核酸等の形態でもあってもよく、これらの形態が混合していてもよい。本発明の発現調節剤は、例えば、TDP-43の厳密な発現量調節機構がどのようなメカニズムで破綻し、その結果TDP-43が細胞質内凝集体を形成し、神経変性を引き起こすのかという発症機構の解明に用いることができる。
本発明のASOは、前述のように、TDP-43の発現を抑制又は亢進することができる。従って、本発明のASOは、抑制型ASOを含有するTDP-43の発現抑制剤、及び亢進型ASOを含有するTDP-43の発現亢進剤として用いることができ、以下では、これらをまとめて「本発明の発現調節剤」と称する。本発明の発現調節剤に含まれるASOは、ASO分子の形態であってもよく、上述したようにASOをコードする核酸等の形態でもあってもよく、これらの形態が混合していてもよい。本発明の発現調節剤は、例えば、TDP-43の厳密な発現量調節機構がどのようなメカニズムで破綻し、その結果TDP-43が細胞質内凝集体を形成し、神経変性を引き起こすのかという発症機構の解明に用いることができる。
本発明の発現調節剤は、例えば、前記TDP-43遺伝子が存在する対象に、前記ASOを単独で、あるいは薬理学上許容される担体とともに投与することができる。前記投与工程は、例えば、前記投与対象に前記ASOを接触させることにより行うことができる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物の細胞、組織又は器官が挙げられる。前記投与は、例えば、in vivoでもin vitroでもよい。
本発明のASOの標的細胞内への導入を促進するために、本発明の発現調節剤は更に核酸導入用試薬を含んでいてもよい。該核酸導入用試薬として、アテロコラーゲン；リポソーム；ナノパーティクル；リポフェクチン、リプフェクタミン(lipofectamine)、DOGS(トランスフェクタム)、DOPE、DOTAP、DDAB、DHDEAB、HDEAB、ポリブレン、あるいはポリ(エチレンイミン)(PEI)等の陽イオン性脂質等を用いることができる。
３．本発明のASOを含有してなる医薬
本発明のASOは、TDP-43の発現量を調節することができるため、該ASOを含有する医薬(以下「本発明の医薬」と略記する)は、TDP-43の発現量を調節することで、TDP-43の異常凝集及び／又は異常局在が関与する疾患の治療及び／又は予防に用いることができる。このような疾患として、TDP-43陽性の封入体を伴うTDP-43タンパク質症などが挙げられる。前記TDP-43タンパク質症としては、例えば、TDP-43陽性の封入体を伴う、筋委縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症(例：FTLD-TDP-43、FTLD-tau)、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、ダウン症候群、海馬硬化症、家族性英国型認知症、パーキンソニズム(例：ペリー症候群)、ポリグルタミン病(例：ハンチントン病、脊髄小脳変性症3型)、ミオパチー(例：孤発性封入体筋炎、封入体ミオパシー、眼咽頭型筋ジストロフィー、遠位型ミオパチー、筋原線維ミオパチー)、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、嗜銀顆粒性疾患などが挙げられる(例えば、 Clotilde Lagier-Tourenne et al., Human Molecular Genetics, 2010, Vol. 19, Review Issue 1; Arai, Neuropathology, 2014, Vol.34, 578-588.)。
本発明のASOは、TDP-43の発現量を調節することができるため、該ASOを含有する医薬(以下「本発明の医薬」と略記する)は、TDP-43の発現量を調節することで、TDP-43の異常凝集及び／又は異常局在が関与する疾患の治療及び／又は予防に用いることができる。このような疾患として、TDP-43陽性の封入体を伴うTDP-43タンパク質症などが挙げられる。前記TDP-43タンパク質症としては、例えば、TDP-43陽性の封入体を伴う、筋委縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症(例：FTLD-TDP-43、FTLD-tau)、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、ダウン症候群、海馬硬化症、家族性英国型認知症、パーキンソニズム(例：ペリー症候群)、ポリグルタミン病(例：ハンチントン病、脊髄小脳変性症3型)、ミオパチー(例：孤発性封入体筋炎、封入体ミオパシー、眼咽頭型筋ジストロフィー、遠位型ミオパチー、筋原線維ミオパチー)、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、嗜銀顆粒性疾患などが挙げられる(例えば、 Clotilde Lagier-Tourenne et al., Human Molecular Genetics, 2010, Vol. 19, Review Issue 1; Arai, Neuropathology, 2014, Vol.34, 578-588.)。
本発明の医薬は、有効量の本発明のASOを単独で用いてもよいし、任意の担体、例えば医薬上許容される担体とともに、医薬組成物として製剤化してもよい。本発明の医薬に含まれるASOは、ASO分子の形態であってもよく、上述したようにASOをコードする核酸等の形態でもあってもよく、これらの形態が混合していてもよい。
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリド等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
本発明のASOの標的細胞内への導入を促進するために、本発明の医薬は更に核酸導入用試薬を含んでいてもよい。該核酸導入用試薬としては、上述したものと同様のものを用いることができる。
また、本発明の医薬は、本発明のASOがリポソームに封入されてなる医薬組成物であってもよい。リポソームは、１以上の脂質二重層により包囲された内相を有する微細閉鎖小胞であり、通常は水溶性物質を内相に、脂溶性物質を脂質二重層内に保持することができる。本明細書において「封入」という場合には、本発明のASOはリポソーム内相に保持されてもよいし、脂質二重層内に保持されてもよい。本発明に用いられるリポソームは単層膜であっても多層膜であってもよく、また、粒子径は、例えば10～1000nm、好ましくは50～300nmの範囲で適宜選択できる。標的組織への送達性を考慮すると、粒子径は、例えば200nm以下、好ましくは100nm以下であり得る。
オリゴヌクレオチドのような水溶性化合物のリポソームへの封入法としては、リピドフィルム法(ボルテックス法)、逆相蒸発法、界面活性剤除去法、凍結融解法、リモートローディング法等が挙げられるが、これらに限定されず、任意の公知の方法を適宜選択することができる。
本発明の医薬は、経口的に又は非経口的に、哺乳動物(例：ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル)に対して投与することが可能であるが、非経口的に投与するのが望ましい。
非経口的な投与(例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など)に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。非経口的な投与に好適な別の製剤としては、噴霧剤等を挙げることが出来る。
医薬組成物中の本発明のASOの含有量は、例えば、医薬組成物全体の約0.1ないし100重量%である。
本発明の医薬の投与量は、投与の目的、投与方法、対象疾患の種類、重篤度、投与対象の状況(性別、年齢、体重など)によって異なるが、例えば、成人に全身投与する場合、通常、本発明のASOの一回投与量として2 nmol/kg以上50 nmol/kg以下、局所投与する場合、1 pmol/kg以上10 nmol/kg以下が望ましい。かかる投与量を1～10回、より好ましくは5～10回投与することが望ましい。また、本発明のASOは長期間安定して体内に存在し得るが、高い効果を維持する観点からは、一定の間隔で追加投与することが好ましい。この間隔は、特に制限されないが、例えば、１日毎、３日毎、１週間毎、２週間毎、１ヶ月毎、３ヶ月毎、６ヶ月毎などが挙げられる。
本発明の医薬は、例えば、他の筋委縮性側索硬化症又は前頭側頭型認知症の治療薬、例えば既に上市されているこれらの疾患に対する治療薬と組み合わせて用いることができる。該治療薬としては、例えば、グルタミン酸作用抑制剤(例、riluzole等)、神経栄養因子(例、インスリン様増殖因子-1、5-HT1A受容体アゴニスト(例、ザリプロデン)等)などが挙げられる。これらの併用薬剤は、本発明の医薬とともに製剤化して単一の製剤として投与することもできるし、あるいは、本発明の医薬とは別個に製剤化して、本発明の医薬と同一もしくは別ルートで、同時もしくは時間差をおいて投与することもできる。また、これらの併用薬剤の投与量は、該薬剤を単独投与する場合に通常用いられる量であってよく、あるいは通常用いられる量より減量することもできる。
有効量の本発明のASO又は本発明の医薬を哺乳動物(治療または予防の対象とする動物)に投与する治療及び／又は予防方法も、本発明に含まれる。有効量、投与量、哺乳動物の具体例やその他の事項については、３．で記載した通りである。
４．TDP-43の自己調節能の機構解析用ASO
後述の実施例で示す通り、本発明の一実施態様において、長期間安定すると考えられる本発明の亢進型ASOを導入した場合に、TDP-43の発現量を一過的に増減し、その後その増減効果が消失した。よって、いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、前記ASOの導入により、一度破綻したTDP-43の自己調節能が回復したことが考えられる。従って、本発明の亢進型ASO又は該ASOを含有してなるTDP-43の自己調節能の機構解析用試薬(以下「本発明の試薬」と略記する)は、TDP-43の自己調節能の機構の解析に用いることができる。具体的には、本発明の亢進型ASOを導入してから特定の時間間隔(例：24時間、48時間、72時間)で細胞を回収し、各細胞から抽出したタンパク質又はmRNAを用いて、プロテオーム解析やマイクロアレイ解析を行うことで、各経過時間において変化したタンパク質やmRNAを、TDP-43の自己調節の機構に関与する因子の候補として同定することができる。あるいは、本発明の亢進型ASOを投与した細胞に、被検物質をさらに投与した後、TDP-43の発現量の一過的な増減がみられない場合に、該被験物質をTDP-43の自己調節の機構に関与する物質の候補として同定することができる。
後述の実施例で示す通り、本発明の一実施態様において、長期間安定すると考えられる本発明の亢進型ASOを導入した場合に、TDP-43の発現量を一過的に増減し、その後その増減効果が消失した。よって、いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、前記ASOの導入により、一度破綻したTDP-43の自己調節能が回復したことが考えられる。従って、本発明の亢進型ASO又は該ASOを含有してなるTDP-43の自己調節能の機構解析用試薬(以下「本発明の試薬」と略記する)は、TDP-43の自己調節能の機構の解析に用いることができる。具体的には、本発明の亢進型ASOを導入してから特定の時間間隔(例：24時間、48時間、72時間)で細胞を回収し、各細胞から抽出したタンパク質又はmRNAを用いて、プロテオーム解析やマイクロアレイ解析を行うことで、各経過時間において変化したタンパク質やmRNAを、TDP-43の自己調節の機構に関与する因子の候補として同定することができる。あるいは、本発明の亢進型ASOを投与した細胞に、被検物質をさらに投与した後、TDP-43の発現量の一過的な増減がみられない場合に、該被験物質をTDP-43の自己調節の機構に関与する物質の候補として同定することができる。
かかるASOは、必要に応じて、例えば、上記１．で記載した標識物質、保護基等の機能性分子蛍光色素に結合した形態で提供され得る。また、本発明のASOをコードする核酸等の形態で提供され得る。本発明の試薬が、２種以上のASOを含む場合(例えば、複数種類の亢進型ASOを用いる場合、あるいは１種以上の亢進型ASOとコントロールとして用いるASOとを含む場合など)、該試薬は、各ASOを別個の試薬中に含むキットとして提供され得る。かかるキットには、本発明のASOに他に、例えば、細胞を培養するために必要な試薬類(例えば、基礎培地、培地添加物など)、核酸導入用試薬類、あるいはTDP-43の発現を検出又は測定するための抗体、プローブ、PCRプライマー、アレイなどのその他の試薬類をさらに含んでもよく、当該試薬類としては、上記１～３．で例示された物質が同様に挙げられる。
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
後述の実施例では、以下のようにして実験を行った。
＜ASOのデザイン＞
TDP-43 のmRNA 配列は以下の配列を参照した。
1) Homo sapiens TAR DNA binding protein (TARDBP), mRNA (NCBI Reference Sequence:NM_007375.3) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_007375.3)
2) Homo sapiens TAR DNA binding protein, mRNA (cDNA clone IMAGE:3506121) (GenBank:BC001487.2) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/BC001487.2)
表１に示されるヌクレオチド配列からなる種々のGapmer ASOをデザインし、作製した。OG#07 は、Homo sapiens TAR DNA binding protein, mRNA (cDNA clone IMAGE:3506121) (GenBank: BC001487.2)の配列をもとにデザインしたが、それ以外は、Homo sapiens TAR DNA binding protein (TARDBP), mRNA (NCBI Reference Sequence: NM_007375.3)の配列をもとにデザインした。コントロールASO OG#C1の配列(配列番号96:CCTATaggactatccAGGAA)(大文字はENAであり、小文字はDNAである)は、Jiang et al., Neuron, 2016; Volpicelli-Daley et al., J Neurosci., 2016; d'Ydewalle et al., Neuron, 2017; Becker et al., Nature, 2017を参照した。Gapmer ASOとしてDNA (10塩基)の両端に架橋型核酸ENA(2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids) (5 塩基)を付加した計20塩基の混成核酸を作製した(表1)。併せて、OG#06、l7～24のいずれかの標的配列を1塩基分ずらした配列に相補的なASOを設計した(表１)。
＜ASOのデザイン＞
TDP-43 のmRNA 配列は以下の配列を参照した。
1) Homo sapiens TAR DNA binding protein (TARDBP), mRNA (NCBI Reference Sequence:NM_007375.3) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_007375.3)
2) Homo sapiens TAR DNA binding protein, mRNA (cDNA clone IMAGE:3506121) (GenBank:BC001487.2) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/BC001487.2)
表１に示されるヌクレオチド配列からなる種々のGapmer ASOをデザインし、作製した。OG#07 は、Homo sapiens TAR DNA binding protein, mRNA (cDNA clone IMAGE:3506121) (GenBank: BC001487.2)の配列をもとにデザインしたが、それ以外は、Homo sapiens TAR DNA binding protein (TARDBP), mRNA (NCBI Reference Sequence: NM_007375.3)の配列をもとにデザインした。コントロールASO OG#C1の配列(配列番号96:CCTATaggactatccAGGAA)(大文字はENAであり、小文字はDNAである)は、Jiang et al., Neuron, 2016; Volpicelli-Daley et al., J Neurosci., 2016; d'Ydewalle et al., Neuron, 2017; Becker et al., Nature, 2017を参照した。Gapmer ASOとしてDNA (10塩基)の両端に架橋型核酸ENA(2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids) (5 塩基)を付加した計20塩基の混成核酸を作製した(表1)。併せて、OG#06、l7～24のいずれかの標的配列を1塩基分ずらした配列に相補的なASOを設計した(表１)。
Blocker ASOは、試験管内においてTDP-43が結合することが示されたCLIP34ntとCLIP6を標的配列としてデザインした(Bhardwaj A, Myers MP, Buratti E, Baralle FE. Nucleic Acids Res. 2013; 1(9)：5062-5074.)。TDP-43 mRNAのCLIP34ntとその周辺配列を含む42塩基(配列番号64：AAAGGAGAGAGCGCGUGCAGAGACUUGGUGGUGCAUAAUGGA, 下線はCLIP34nt)を標的配列として、ok#01からok#12の12種のASOを作製し、CLIP6とその周辺配列を含む34 塩基(配列番号65：GAGCUUGUGGUGUGCUUUGCAGGAGGACUUGAAG, 下線はCLIP6)を標的配列として、ok#13からok#22の10種のASOを作製した。コントロールASO ok#C2の配列(配列番号97:CTCagTaaCaTTgaCaCCaC)(大文字はENAであり、小文字は2' O－メチル修飾核酸(2’OMe)である)は、Staropoli et al., Genomics, 2015; Kapeli et al., Nat Commun., 2016を参照した。シトシン塩基(C)とチミン塩基(T)を持つ核酸に対してENAを用い、アデニン塩基(A)とグアニン塩基(G)を持つ核酸に対して2’OMeを用いた20塩基の混成核酸を作製した(表２)。
＜培養細胞を用いたASOのスクリーニング方法＞
HEK293細胞にASOを処理し、内在性TDP-43のタンパク質量をウエスタンブロット、mRNA量をqRT-PCRで評価した。
HEK293細胞にASOを処理し、内在性TDP-43のタンパク質量をウエスタンブロット、mRNA量をqRT-PCRで評価した。
HEK293細胞に対して、Lipofectamine 3000 (L3000015, Thermo)を用いてASOをトランスフェクションした。トランスフェクションの4時間後に培地を交換し、さらに44時間後(投与後48時間)に培養した細胞をRIPAバッファー (08714-04, Nacalai)に溶解させることでタンパク質を抽出した。RNAは、ASO処理24時間もしくは48時間後の細胞をTRIzol(10296028, Thermo)に溶解させた後、フェノール・クロロホルム抽出法で抽出した。ASO無処理を比較対照とした。
ウエスタンブロットでは、TDP-43 タンパク質量の評価にTDP-43 Antibody (10782-2-AP, Proteintech)、Actin タンパク質の評価にAnti-beta-Actin, Clone AC-15 (A5441, Sigma-Aldrich)を用いた。
mRNA量の評価では、抽出したmRNAをQuantiTect Reverse Transcription Kit (205313, Qiagen)を利用してcDNA に逆転写し、得られたcDNAを鋳型にしてqRT-PCRを行った。qRT-PCR は、TDP-43 mRNAに対して、プライマーTDP43Fex2_2; GGGAAATCTGGTGTATGTTGTC：配列番号88, TDP43Rex3; TTTCAGGTCCTGTTCGGTTG：配列番号89、GAPDH mRNAに対して、プライマーGAPDH_qF; AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC：配列番号90, GAPDH_qR; GGGGTCATTGATGGCAACAATA：配列番号91を使用し、酵素SYBR(登録商標)Premix Ex TaqTM II (RR820S, Takara)を使用して行った。
＜生体内(野生型マウス)でのASOの評価方法＞
野生型マウスの脳室にハミルトンシリンジを用いてASOを投与し、投与2週間後のマウスから脳と脊髄を摘出し、TDP-43のタンパク質量をウエスタンブロットにより、mRNA量をqRT-PCRにより評価した。生理的食塩水を投与したものを比較対照とした。
野生型マウスの脳室にハミルトンシリンジを用いてASOを投与し、投与2週間後のマウスから脳と脊髄を摘出し、TDP-43のタンパク質量をウエスタンブロットにより、mRNA量をqRT-PCRにより評価した。生理的食塩水を投与したものを比較対照とした。
ウエスタンブロットでは、脳、脊髄からRIPA buffer を用いて抽出したTDP-43タンパク質量の評価を行った。マウス、ヒトTDP-43 を認識するTDP-43 Antibody (10782-2-AP, Proteintech)、Actinを認識するAnti-beta-Actin, Clone AC-15(A5441, Sigma-Aldrich)を用いた。
mRNA量の評価では、TRIzol処理とフェノール・クロロホルム抽出法で、抽出したmRNAをcDNAに逆転写し、得られたcDNAを鋳型にしてqRT-PCRを行った。
qRT-PCRは、マウスTDP-43 mRNAに対して、プライマーmTDP43ex4.1-F;GGCGATGGTGTGACTGTAAAC：配列番号92, mTDP43ex5-R; AACTGCTGAAGCTCTTCAGC：配列番号93、マウスGAPDH mRNAに対して、プライマー mGAPDH-F; AAGGTCATCCCAGAGCTGAA：配列番号94, mGAPDH-R; CTGCTTCACCACCTTCTTGA：配列番号95を使用し、酵素SYBR(登録商標) Premix Ex TaqTM II (RR820S, Takara)を使用して行った。
＜生体内(ヒトTDP-43発現マウス)でのASOの評価方法＞
ヒトTDP-43A315T BAC Tg マウス(Swarup V, Phaneuf D, Bareil C, Robertson J, Rouleau GA, Kriz J, Julien JP. Brain. 2011; 134(Pt 9): 2610--2626.)の脳室にハミルトンシリンジを用いてASOを投与し、投与2週間もしくは3ヶ月後のマウスから大脳皮質、海馬、脊髄を摘出し、ヒトTDP-43のタンパク質量をウエスタンブロットにより、ヒトTDP-43 mRNA量をqRT-PCRにより評価した。コントロールASOを投与したものを比較対照とした。
ヒトTDP-43A315T BAC Tg マウス(Swarup V, Phaneuf D, Bareil C, Robertson J, Rouleau GA, Kriz J, Julien JP. Brain. 2011; 134(Pt 9): 2610--2626.)の脳室にハミルトンシリンジを用いてASOを投与し、投与2週間もしくは3ヶ月後のマウスから大脳皮質、海馬、脊髄を摘出し、ヒトTDP-43のタンパク質量をウエスタンブロットにより、ヒトTDP-43 mRNA量をqRT-PCRにより評価した。コントロールASOを投与したものを比較対照とした。
ウエスタンブロットでは、大脳皮質、海馬、脊髄からRIPA buffer を用いて抽出したTDP-43タンパク質量の評価を行った。ヒトTDP-43を認識するhuman TDP-43 Antibody (H00023435-M01, Abnova)、Actinを認識するAnti-beta-Actin, Clone AC-15(A5441, Sigma-Aldrich)を用いた。
ヒトTDP-43 mRNA量の評価では、TRIzol処理とフェノール・クロロホルム抽出法で、抽出したmRNAをcDNAに逆転写し、得られたcDNAを鋳型にしてqRT-PCRを行った。
qRT-PCRは、ヒトTDP-43 mRNAに対して、プライマーTDP43Fex2_2; GGGAAATCTGGTGTATGTTGTC：配列番号88、TDP43Rex3; TTTCAGGTCCTGTTCGGTTG：配列番号89、分解型ヒトTDP-43 mRNAに対して、プライマーTDP43qFdelta6; AAAGAAGTGGAAGATTTGGTGTTC：配列番号98, TDP43qRdelta7A; TCTTTGCATTCAGGGCGTC：配列番号99、翻訳型ヒトTDP-43 mRNAに対して、プライマーTDP43qF4; TGTCACAGTGTTTGGTTCTTTTG：配列番号100, TDP43qR4; AGCGGATAAAAATGGGACAC：配列番号101、マウスGAPDH mRNAに対して、プライマー mGAPDH-F; AAGGTCATCCCAGAGCTGAA：配列番号94, mGAPDH-R; CTGCTTCACCACCTTCTTGA：配列番号95を使用し、酵素SYBR(登録商標) Premix Ex TaqTM II (RR820S, Takara)を使用して行った。
実施例１ 抑制型ASOのin vitroでの検証
抑制型ASO(Gapmer ASO OG#O1-11)(11種)をそれぞれHEK293細胞に対し、100 nM、48時間処理した。その結果、ASO無処理と比較して、TDP-43タンパク質量がOG#01処理で45%、OG#06処理で65%、OG#09処理で25%程度低下した(図1)。
抑制型ASO(Gapmer ASO OG#O1-11)(11種)をそれぞれHEK293細胞に対し、100 nM、48時間処理した。その結果、ASO無処理と比較して、TDP-43タンパク質量がOG#01処理で45%、OG#06処理で65%、OG#09処理で25%程度低下した(図1)。
続いて最も効果的であったGapmer ASO OG#06の処理濃度を変えて検討したところ、OG#06処理では濃度に依存してTDP-43のタンパク質量が減少した(50 nM処理で50%、100, 150, 200 nM処理では70%の低下がみられた)(図2A, B)。また、mRNAの減少も確認された(50nM処理で60%、100, 150, 200 nMでは75%の低下がみられた)(図2C)。
次に、GapmerASO OG#06の周辺配列を標的とするASOを検討したところ、OG#17, 18, 19, 20, 06, 21, 22, 23, 24のlOO nM、48時間処理で、ASO無処理と比較して50%程度もしくはそれ以上のTDP-43のタンパク質量の減少がみられた(図3)。
以上の結果から、Gapmer ASO OG#17, 18, 19, 20, 06, 21, 22, 23又は24のASOが特に効果的であり、これらのASOが標的とする36塩基の配列(AUCAUUAAAGGAAUCAGCGUUCAUAUAUCCAAUGCC：配列番号1)及び両末端にさらに１塩基を有する(GAUCAUUAAAGGAAUCAGCGUUCAUAUAUCCAAUGCCG：配列番号2)を、TDP-43の発現量を効果的に抑制し得る標的配列として同定した。さらに、OG#01の標的配列を含む51塩基の配列(OG#01の標的配列とその前25塩基、後6塩基を含む)(AUGUCUGAAUAUAUUCGGGUAACCGAAGAUGAGAACGAUGAGCCCAUUGAA：配列番号3)、OG#09の標的配列を含む60塩基の配列(OG#09の標的配列とその前後20塩基を含む)(CUUGUCUCCCCUCAUACACAAAAGUACAAUAUGAAGCCUUCAUUUAAUCUCUGCAGUUCA：配列番号4)もまた、TDP-43の発現量を効果的に抑制し得る標的配列であると考えられる。
実施例２ 野生型マウスを用いた抑制型ASOのin vivoでの検証
本発明のASOが個体でも有効であるかを検証した。標的配列がヒトとマウスで同じであるGapmer ASO OG#09を、生後１日目の野生型マウスの脳室に10 μg投与し、2週間後に解析した。その結果、OG#09投与では、生理的食塩水を投与したマウスと比べてTDP-43タンパク質量が60%、mRNA量が70%程度減少した(図4)。
本発明のASOが個体でも有効であるかを検証した。標的配列がヒトとマウスで同じであるGapmer ASO OG#09を、生後１日目の野生型マウスの脳室に10 μg投与し、2週間後に解析した。その結果、OG#09投与では、生理的食塩水を投与したマウスと比べてTDP-43タンパク質量が60%、mRNA量が70%程度減少した(図4)。
この結果は、実施例１の培養細胞における結果と高く相関しているため、Gapmer ASO OG#09以外のASO(例えば、Gapmer ASO OG#01, #17, 18, 19, 20, 06, 21, 22, 23又は24のASO)も、同様に個体に対しても効果があると考えられる。
実施例３ 亢進型ASOのin vitroでの検討
亢進型ASO(Blocker ASO ok#01-20)(20種)をそれぞれHEK293細胞に対し、200 nM、48時間処理した。その結果、Blocker ASO ok#19処理でTDP-43タンパク質量がASO無処理と比べて2倍増加した(図5)。
亢進型ASO(Blocker ASO ok#01-20)(20種)をそれぞれHEK293細胞に対し、200 nM、48時間処理した。その結果、Blocker ASO ok#19処理でTDP-43タンパク質量がASO無処理と比べて2倍増加した(図5)。
Blocker ASO ok#19の処理濃度を変えて検討したところ、ok#19では処理濃度に依存してTDP-43のタンパク質量が増加した(図6A, B)。また、ok#19の200 nM、24時間処理でTDP-43 mRNAの増加も確認された(図6C)。
次に、Blocker ASO ok#19の周辺の塩基を含むASOを検討したところ、200 nM、48時間処理においてASO無処理と比べてok#19で2倍、ok#22で2.5倍、ok#20で1.5倍程度のTDP-43タンパク質の増加が認められた(図7)。
以上の結果から、Blocker ASO ok#19, 22又は20のASOが特に効果的であり、これらのASOが標的とする22塩基の配列(UGCUUUGCAGGAGGACUUGAAG：配列番号5)を、TDP-43の発現量を効果的に亢進し得る標的配列として同定した。
実施例４ ヒトTDP-43発現マウスを用いた抑制型ASOのin vivoでの検証
本発明のASOが個体でも有効であるかを検証した。Gapmer ASO OG#20を、生後6週目のヒトTDP-43 A315T BAC Tg マウスの脳室に200 μg投与し、2週間後に解析した。その結果、OG#20投与では、コントロールASOを投与したマウスと比べてヒトTDP-43タンパク質量が大脳皮質で71%、海馬で38%、脊髄で47%減少した。このとき、ヒトTDP-43 mRNA量は、大脳皮質で57%、海馬で51%、脊髄で36%減少した。また、OG#20 200 μg投与3ヶ月後に解析した結果、コントロールASOを投与したマウスと比べてヒトTDP-43タンパク質量が大脳皮質で35%、海馬で30%、脊髄で26%減少した(図８)。
本発明のASOが個体でも有効であるかを検証した。Gapmer ASO OG#20を、生後6週目のヒトTDP-43 A315T BAC Tg マウスの脳室に200 μg投与し、2週間後に解析した。その結果、OG#20投与では、コントロールASOを投与したマウスと比べてヒトTDP-43タンパク質量が大脳皮質で71%、海馬で38%、脊髄で47%減少した。このとき、ヒトTDP-43 mRNA量は、大脳皮質で57%、海馬で51%、脊髄で36%減少した。また、OG#20 200 μg投与3ヶ月後に解析した結果、コントロールASOを投与したマウスと比べてヒトTDP-43タンパク質量が大脳皮質で35%、海馬で30%、脊髄で26%減少した(図８)。
この結果も、実施例１の培養細胞における結果と高く相関しているため、Gapmer ASO OG#20以外のASO(例えば、Gapmer ASO OG#01, 09, l7, 18, 19, 06, 21, 22, 23又は24のASO)も、同様に個体に対しても効果があると考えられる。
実施例５ 亢進型ASOのin vivoでの検証
本発明のASOが個体でも有効であるかを検証した。Blocker ASO ok#22を、生後6週目のヒトTDP-43 A315T BAC Tg マウスの脳室に200 μg投与し、2週間後に解析した。その結果、ok#22投与では、コントロールASOを投与したマウスと比べてヒトTDP-43タンパク質量が大脳皮質で200%、海馬で180%、脊髄で160%に上昇した。また、ヒトTDP-43 mRNA量は、分解型mRNAが大脳皮質で44%、海馬で45%、脊髄で39%減少し、翻訳型mRNAが大脳皮質で140%、海馬で140%、脊髄で150%に上昇した。一方で、ok#22 200 μg投与3ヶ月後の解析では、ヒトTDP-43タンパク質量の増加はみられなかった(図8)。
本発明のASOが個体でも有効であるかを検証した。Blocker ASO ok#22を、生後6週目のヒトTDP-43 A315T BAC Tg マウスの脳室に200 μg投与し、2週間後に解析した。その結果、ok#22投与では、コントロールASOを投与したマウスと比べてヒトTDP-43タンパク質量が大脳皮質で200%、海馬で180%、脊髄で160%に上昇した。また、ヒトTDP-43 mRNA量は、分解型mRNAが大脳皮質で44%、海馬で45%、脊髄で39%減少し、翻訳型mRNAが大脳皮質で140%、海馬で140%、脊髄で150%に上昇した。一方で、ok#22 200 μg投与3ヶ月後の解析では、ヒトTDP-43タンパク質量の増加はみられなかった(図8)。
この結果は、実施例３の培養細胞における結果と高く相関しているため、Blocker ASO ok#22以外のASO(例えば、Blocker ASO ok#19 又は20のASO)も、同様に個体に対しても効果があると考えられる。
実施例６ 亢進型ASOによるTDP-43の発現量の経時的な変化の検証
亢進型ASO(Blocker ASO ok#22)をHEK293細胞に対し、300 nMで処理し、24時間後、48時間後及び72時間後に細胞を回収し、タンパク質量(図１０A, B)及びmRNA量(図１０C, D)を測定した。mRNAは、非分解型mRNA(即ち、翻訳型mRNA、あるいは核内に維持されるmRNA(左グラフ)と分解型mRNA(右グラフ)とをそれぞれ測定した。TDP-43タンパク質量については、48時間後、72時間後に増加がみられた。TDP-43 mRNA量については、分解型TDP-43 mRNA量は24時間後に減少したが、一方で非分解型TDP-43 mRNA量は24時間後に増加した。これらmRNA量の変動は一過性であり、48時間後にはみられなくなった。
亢進型ASO(Blocker ASO ok#22)をHEK293細胞に対し、300 nMで処理し、24時間後、48時間後及び72時間後に細胞を回収し、タンパク質量(図１０A, B)及びmRNA量(図１０C, D)を測定した。mRNAは、非分解型mRNA(即ち、翻訳型mRNA、あるいは核内に維持されるmRNA(左グラフ)と分解型mRNA(右グラフ)とをそれぞれ測定した。TDP-43タンパク質量については、48時間後、72時間後に増加がみられた。TDP-43 mRNA量については、分解型TDP-43 mRNA量は24時間後に減少したが、一方で非分解型TDP-43 mRNA量は24時間後に増加した。これらmRNA量の変動は一過性であり、48時間後にはみられなくなった。
本出願は、日本で出願された特願２０１７－１３４８９０(出願日：２０１７年７月１０日)を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
本発明の抑制型ASOは、細胞あるいは個体への投与により、TDP-43の発現が低下するモデルを提供し得る。さらに、ALS/FTD に対して、TDP-43 の発現量を減少させて、TDP-43の細胞質内での凝集・蓄積、ならびに神経変性を抑制し得るため、治療薬の開発に大きく貢献する。一方、本発明の亢進型ASOは、細胞あるいは個体に投与することで、内在のTDP-43の発現が上昇するモデルを提供しうる。また、Blocker ASOの投与により、TDP-43の発現量を増加させることでALS/FTDにおけるTDP-43の機能喪失を補うことができ、神経変性を抑制し得る。
Claims (7)
- 配列番号２で表されるヌクレオチド配列中の連続する少なくとも２０個のヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列からなり、TDP-43 mRNAを標的としTDP-43の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、１０ヌクレオチド以上のデオキシリボヌクレオチドからなる内部領域と、５ヌクレオチド以上の架橋型人工核酸からなる外部領域とからなる、２０～３０ヌクレオチドのギャップマー型核酸である、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 前記相補的なヌクレオチド配列が配列番号４５～６３のいずれかで表されるヌクレオチド配列(但し、チミンはウラシルであってもよい)である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 架橋型人工核酸が2'－O, 4'－C－エチレン架橋核酸を含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 配列番号１１、２２～２９及び３５～４４のいずれかで表されるヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 請求項１～４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる、TDP-43の発現抑制剤。
- 請求項１～４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる、TDP-43タンパク質症の治療及び／又は予防剤。
- 前記TDP-43タンパク質症が筋委縮性側索硬化症又は前頭側頭型認知症である、請求項６に記載の剤。
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