JP7171728B2 - （ｒ）－３－（１－（２，３－ジクロロ－４－（ピラジン－２－イル）フェニル）－２，２，２－トリフルオロエチル）－１－メチル－１－（１－メチルピペリジン－４－イル）ウレアのフマル酸塩、その調製方法及び使用 - Google Patents

（ｒ）－３－（１－（２，３－ジクロロ－４－（ピラジン－２－イル）フェニル）－２，２，２－トリフルオロエチル）－１－メチル－１－（１－メチルピペリジン－４－イル）ウレアのフマル酸塩、その調製方法及び使用 Download PDF

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Description

この出願は、２０１７年１２月１１日に出願された米国仮出願第６２/５９７，２３６号の利益を主張し、あらゆる目的でその全体を参照により本明細書に取り込む。
分野
本開示は、(R)-3-(1-(2,3-ジクロロ-4-(ピラジン-2-イル)フェニル)-2,2,2-トリフルオロエチル)-1-メチル-1-(1-メチルピペリジン-4-イル)ウレア(ＨＭ０４又はＨ０９００とも呼ぶ)のフマル酸塩であって、過食症、アルコール依存症及びその他の障害（例えば、プラダーウィリー症候群）などのグレリンレベルの不均衡に関連する疾患の治療に有用である強力なグレリン/成長ホルモン分泌促進物質受容体（GHS-R1a）拮抗薬に関する。本開示はまた、結晶性ＨＭ０４遊離塩基、ＨＭ０４フマル酸塩の様々な結晶形態及びそれを製造する方法に関する。
背景
胃腸管中でのグレリン作動性細胞により産生される成長ホルモン放出ペプチドであるグレリンは、食欲を刺激することによりエネルギー代謝を調節する神経ペプチドとして機能すると理解されている。グレリン/成長ホルモン分泌促進物質受容体（GHS-R1a）を介した、グレリンシグナル伝達の調節、例えば、阻害は、高いグレリンレベルに関連する疾患の薬理学的治療の魅力的なターゲットである。グレリンモジュレータを使用した治療の潜在的な障害としては、食物乱用（過食、肥満、食欲亢進（又は制御不能な食欲）など）、ダイエット後の体重リバウンド（ダイエット後の食欲亢進を含む）、アルコール依存症、及びグレリンレベルの増加に関連する遺伝病（例えば、プラダーウィリー症候群（ＰＷＳ））が挙げられる。
ＰＷＳは、約１０，０００件の誕生あたりに１件発生し、父方の染色体１５の領域１５ｑ１１．２の枯渇又は発現の欠如に関連している。ＰＷＳの特徴としては、低身長、低筋緊張及び食欲亢進が挙げられる。成長ホルモン補充は、成長不全及び低張の治療に頻繁に使用される。しかしながら、強欲な食欲の治療法はなく、ＰＷＳの子供は肥満及び２型糖尿病に苦しむ大人に成熟する可能性がある。グレリンのレベルは、一般に、ＰＷＳで上昇するが、ＰＷＳにおけるグレリンシグナル伝達と食物摂取との関係は不明なままである。Purtell L.らを参照されたい。プラダーウィリー症候群の成人では、高いグレリンレベルは、高いＰＹＹ及びＧＬＰ-１レベルよりも過食症と一貫している。Neuropeptides. 2011;45(4):301-7; Cummings D.E.ら, Elevated plasma ghrelin levels in Prader Willi syndrome. Nature Medicine. 2002;8(7):643-4; DelParigi A.ら, High circulating ghrelin: a potential cause for hyperphagia and obesity in Prader-Willi syndrome。The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2002;87(12):5461-4。
したがって、ＧＨＳＲ１ａを効果的に阻害し、患者に許容可能であり、成長ホルモンの他の機能を妨害しない治療法を見出すことが望ましい。下記の（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレア（ＨＭ０４、Ｈ０９００）などの阻害剤を含むＧＨＳＲ１ａモジュレータは米国特許第９，５４６，１５７号明細書に報告されている。
Figure 0007171728000001
しかしながら、安定な塩の形態及びその結晶形態はそこには開示されていない。
概要
実施形態１．
（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアフマル酸塩。
実施形態２．
前記塩は１：１の（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレア：フマル酸の塩である、実施形態１記載の塩。
実施形態３．
前記塩は少なくとも５０％が結晶形態である、先行の実施形態のいずれか１項記載の塩。
実施形態４．
前記塩は少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が結晶形態である、先行の実施形態のいずれか１項記載の塩。
実施形態５．
形態１、形態２、形態３及び形態４から選ばれる少なくとも１つの結晶形態を含む、先行の実施形態のいずれか１項記載の塩。
実施形態６．
ＣｕＫα線を使用するＸＲＰＤによって決定される図１２のＸＲＰＤパターンと実質的に同様のＸＲＰＤパターンを有する形態１を含む、先行の実施形態のいずれか１項記載の塩。
実施形態７．
ＣｕＫα線を使用するＸＲＰＤによって決定される図３のＸＲＰＤパターンと実質的に同様のＸＲＰＤパターンを特徴とする形態２を含む、実施形態１～５のいずれか１項記載の塩。
実施形態８．
ＣｕＫα線を使用するＸＲＰＤによって決定される図１５のＸＲＰＤパターンと実質的に同様のＸＲＰＤパターンを特徴とする形態３を含む、実施形態１～５のいずれか１項記載の塩。
実施形態９．
ＣｕＫα線を使用するＸＲＰＤによって決定される図１６のＸＲＰＤパターンと実質的に同様のＸＲＰＤパターンを特徴とする形態４を含む、実施形態１～５のいずれか１項記載の塩。
実施形態１０．
７．８±０．２、９．５±０．２、１４．３±０．２、１６．７±０．２、１７．２±０．２、１８．５±０．２、１８．８±０．２、１９．３±０．２、２０．０±０．２、２０．７±０．２、２２．４±０．２、２３．２±０．２、２５．６±０．２、２７．２±０．２、３１．７±０．２及び３２．４±０．２度の２θにピークを含む、ＣｕＫα線を使用する、ＸＲＰＤパターンを特徴とする形態１を含む、実施形態１～５のいずれか１項記載の塩。
実施形態１１．
７．２±０．２、９．４±０．２、９．７±０．２、１０．８±０．２、１４．３±０．２、１５．１±０．２、１６．２±０．２、１７．９±０．２、１８．７±０．２、１８．９±０．２、１９．６±０．２、２１．５±０．２、２２．７±０．２、２３．７±０．２、２４．３±０．２、２５．１±０．２、２７．４±０．２、２８．７±０．２及び３４．９±０．２度の２θにピークを含む、ＣｕＫα線を使用するＸＲＰＤパターンを特徴とする形態３を含む、実施形態１～５のいずれか１項記載の塩。
実施形態１２．
１２．２±０．２、１３．２±０．２、１５．０±０．２、１５．４±０．２、１７．６±０．２、１８．１±０．２、１９．５±０．２、２０．２±０．２、２０．９±０．２、２１．４±０．２、２３．０±０．２、２３．４±０．２、２４．４±０．２、２４．８±０．２、２５．９±０．２、２７．９±０．２、２８．９±０．２、２９．６±０．２及び３０．７±０．２度の２θにピークを含む、ＣｕＫα線を使用するＸＲＰＤパターンを特徴とする形態４を含む、実施形態１～５のいずれか１項記載の塩。
実施形態１３．
ＣｕＫα線を使用するＸＲＰＤによって決定される図１ＡのＸＲＰＤパターンと実質的に同様のＸＲＰＤパターンを有する結晶性（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレア。
実施形態１４．
実施形態１～１２のいずれか１項記載の塩又は実施形態１３記載の結晶性化合物を含む医薬品。
実施形態１５．
実施形態１～１２のいずれか１項記載の塩又は実施形態１３記載の結晶性化合物及び医薬上許容される担体を含む組成物。
実施形態１６．
（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアをフマル酸と化合させることを含む、実施形態１～１２のいずれか１項記載の塩を調製する方法。
実施形態１７．
フマル酸と化合させるときに、（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアは固体形態である、実施形態１６記載の方法。
実施形態１８．
フマル酸と化合させるときに、（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアは溶液中である、実施形態１６記載の方法。
実施形態１９．
フマル酸と化合させる前に、（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアは酸/塩基抽出を受ける、実施形態１６～１８のいずれか１項記載の方法。
実施形態２０．
フマル酸と化合させる前に、（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアは酸/塩基抽出を受けない、実施形態１６～１８のいずれか１項記載の方法。
実施形態２１．
実施形態１～１２のいずれか１項記載の塩、実施形態１３記載の結晶性化合物、実施形態１４記載の医薬品又は実施形態１５記載の組成物に細胞を曝露することを含む、細胞におけるグレリンシグナル伝達活性を低下させる方法。
実施形態２２．
前記細胞はインビトロで前記塩、結晶性化合物、医薬品又は組成物に曝露される、実施形態２１記載の方法。
実施形態２３．
前記グレリンシグナル伝達活性は、蛍光画像形成プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）アッセイによって検出される細胞内カルシウムのレベルによって測定される、実施形態２１又は実施形態２２記載の方法。
実施形態２４．
前記細胞内カルシウムのレベルは低減される、実施形態２３記載の方法。
実施形態２５．
実施形態１～１２のいずれか１項記載の塩、実施形態１３記載の結晶性化合物、実施形態１４記載の医薬品又は実施形態１５記載の組成物を対象に投与することを含む、対象におけるグレリンシグナル伝達活性を低下させる方法。
実施形態２６．
グレリンレベルの増加に関連する状態又は障害を有する対象を治療する方法であって、実施形態１～１２のいずれか１項記載の塩、実施形態１３記載の結晶性化合物、実施形態１４記載の医薬品又は実施形態１５記載の組成物の治療有効量を対象に投与することを含む方法。
実施形態２７．
前記状態又は障害は食物乱用、アルコール依存症及びプラダーウィリー症候群から選ばれる、実施形態２６記載の方法。
実施形態２８．
前記状態又は障害は過食症、肥満、ダイエット後の体重リバウンド及び食欲亢進から選ばれる、実施形態２６又は実施形態２７記載の方法。
実施形態２９．
前記対象に前記塩、結晶性化合物、医薬品又は組成物を経口投与することを含む、実施形態２５～２８のいずれか１項記載の方法。
実施形態３０．
前記対象の成長ホルモンの循環レベルは調節される、実施形態２５～２９のいずれか１項記載の方法。
実施形態３１．
前記対象の成長ホルモンの循環レベルは低減される、実施形態２５～３０のいずれか１項記載の方法。
実施形態３２．
前記対象の食物摂取量は低減される、実施形態２５～３１のいずれか１項記載の方法。
実施形態３３．
前記対象の体重は低減される、実施形態２５～３２のいずれか１項記載の方法。
実施形態３４．
前記対象の体重は安定している、実施形態２５～３２のいずれか１項記載の方法。
追加の目的及び利点は、一部は以下の記載に示され、一部はその記載から明らかであるか、又は実践によって知ることができる。目的及び利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘されている要素及び組み合わせによって実現及び達成される。
上記の一般的な記載及び以下の詳細な説明の両方は例示及び説明のみであり、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
本明細書に取り込まれ、その一部を構成する添付の図面は、１つ（幾つか）の実施形態を示し、記載とともに、本明細書で記載される原理を説明するのに役立つ。
図面の簡単な説明
図１Ａ及び図１Ｂ（下のパネル）は例１Ａに示されるように調製されたＨＭ０４遊離塩基結晶形態１の代表的なＸＲＰＤプロファイルを示す。
図１Ｂ（上のパネル）は、例１Ｂに示されるように調製されたＨＭ０４遊離塩基結晶形態１の代表的なＸＲＰＤプロファイルを示す。
図１Ｃは、例２に示されるように調製されたＨＭ０４フマル酸塩結晶形態１の代表的なＸＲＰＤプロファイルを示す。
図２は、例３に示されるように調製されたＨＭ０４フマル酸塩結晶形態１の代表的なＸＲＰＤプロファイルを示す。
図３は、例３に示されるように調製されたＨＭ０４フマル酸塩結晶形態２の代表的なＸＲＰＤプロファイルを示す。
図４Ａは、ＨＭ０４フマル酸塩形態１及び２を、アセトニトリル：水（９５：５）で５０：５０の比率で６０℃で４８時間混合した後に観察されたＸＲＰＤプロファイルを示す。
図４Ｂは、ＨＭ０４フマル酸塩形態１及び２をエタノール中で５０：５０の比率で６０℃で４８時間混合した後に観察されたＸＲＰＤプロファイルを示す。
図５は、ＨＭ０４フマル酸塩形態１のスケールアップされた合成方法の概要を提供し、例５にさらに詳細に記載されている。
図６は、例５に示されるように調製されたＨＭ０４フマル酸塩結晶形態１の代表的なＸＲＰＤプロファイルを示す（６０℃で６時間乾燥後）。
図７は、例５に示されるように調製されたＨＭ０４フマル酸塩結晶形態１の代表的なＸＲＰＤプロファイルを示す（６０℃で１５時間乾燥後）。
図８は、例５に示されるように調製されたＨＭ０４フマル酸塩結晶形態１の代表的なＸＲＰＤプロファイルを示す（６０℃で７２時間乾燥後）。
図９は、例５に示されるように調製されたＨＭ０４フマル酸塩結晶形態１の代表的なＸＲＰＤプロファイルを示す（６５℃で１８時間乾燥後）。
図１０は、ＨＭ０４フマル酸塩形態１の合理化された合成方法の概要を提供し、例６でさらに詳細に記載されている。
図１１は、例６、試験１に示されるように調製されたＨＭ０４フマル酸塩結晶形態１の代表的なＸＲＰＤプロファイルを提供する。
図１２は、例６、試験２に示されるように調製されたＨＭ０４フマル酸塩結晶形態１の代表的なＸＲＰＤプロファイルを提供する。
図１３は、試験２の方法によりスケールアップされた、例６に示されるように調製されたＨＭ０４フマル酸塩結晶形態１の代表的なＸＲＰＤプロファイルを提供する。
図１４は、例６、試験３に示されるように調製されたＨＭ０４フマル酸塩結晶形態１の代表的なＸＲＰＤプロファイルを提供する。
図１５は、例７に示されるように調製されたＨＭ０４フマル酸塩結晶形態３の代表的なＸＲＰＤプロファイルを提供する。
図１６は、例８に示されるように調製されたＨＭ０４フマル酸塩結晶形態４の代表的なＸＲＰＤプロファイルを提供する。
図１７は、３ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４遊離塩基及び３ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）が経口投与されたラットにおける、経時的なＨＭ０４の血漿中濃度（ｎｇ/ｍＬ）の比較を提供する。
図１８は、２ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４遊離塩基及び２ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）が経口投与されたイヌにおける、経時的なＨＭ０４の血漿中濃度（ｎｇ/ｍＬ）の比較を提供する。
図１９は、３、１０及び３０ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）が経口投与された後の、経時的なラットにおけるＨＭ０４の血漿中濃度（ｎｇ/ｍＬ）の比較を提供する。
図２０は、３、１０及び３０ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）が経口投与された後の、経時的なイヌにおけるＨＭ０４の血漿中濃度（ｎｇ/ｍＬ）の比較を提供する。
図２１Ａは、ヒトＧＨＳＲ１ａ受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞を使用する拮抗薬蛍光画像形成プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）アッセイにおけるＨＭ０４の濃度反応曲線を示す。
図２１Ｂは、ヒトＧＨＳＲ１ａ受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞を使用する拮抗薬ＦＬＩＰＲアッセイにおけるＲ０１１の濃度応答曲線を示す。
図２１Ｃは、ヒトＧＨＳＲ１ａ受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞を使用する作動薬ＦＬＩＰＲアッセイにおけるＨＭ０４の濃度応答曲線を示す。
図２１Ｄは、ヒトＧＨＳＲ１ａ受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞を使用する作動薬ＦＬＩＰＲアッセイにおけるＲ０１１の濃度応答曲線を示す。
図２１Ｅは、イノシトール1リン酸（ＩＰ-１）逆作動薬アッセイにおけるＨＭ０４の濃度応答曲線を示す。
図２１Ｆは、イノシトール１リン酸（ＩＰ－１）逆作動薬アッセイにおけるＲ０１１の濃度応答曲線を示す。
図２２は、以下の４つの治療群におけるグレリン注射の０分後及び１５分後の時点でラットにおいて観察された平均血漿成長ホルモン濃度を示す：１）１ｍｌ/ｋｇの生理食塩水+１０ｍｌ/ｋｇの０．５％ＣＭＣ経口（ｎ=６）、２）１５μｇ/ｋｇのグレリン静脈内＋１０ｍｌ/ｋｇの０．５％ＣＭＣ経口（ｎ＝６）、３）３０ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩経口、２時間後に、１５μｇ/ｋｇグレリン静脈内（ｎ＝６）、４）１０ｍｇ/ｋｇのグレリン拮抗薬Ｒ０１１腹腔内、３０分後に、１５μｇ/ｋｇのグレリン静脈内（ｎ＝６）。
図２３Ａは、１）ビヒクル（ｎ＝６）、２）１０ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）（ｎ＝６）、３）０．５ｍｇ/ｋｇカベルゴリン（ｎ＝６）、又は４）１０ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）＋０．５ｍｇ/ｋｇのカベルゴリン（ｎ＝６）の単回腹腔内投与の１時間後に測定された７ヶ月齢のＳｎｏｒｄ１１６＋／－（Ｈｅｔ）マウス及び７ヶ月齢の野生型（ＷＴ）同腹子における摂食量を示す。マウスを注射前に１６時間絶食させ、注射後は自由に餌を与えた。
図２３Ｂは、７か月齢のＳｎｏｒｄ１１６＋/－（Ｈｅｔ）マウス及び７か月齢の野生型（ＷＴ）同腹子における摂食量を、１）ビヒクル（ｎ＝６）、２）１０ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）（ｎ＝６）、３）０．５ｍｇ/ｋｇのカベルゴリン（ｎ＝６）又は４）１０ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）＋０．５ｍｇ/ｋｇのカベルゴリン（ｎ＝６）の単回腹腔内投与の１時間後、２時間後、４時間後、８時間後、１２時間後及び２４時間後に測定したものを示す。マウスを注射前に１６時間絶食させた。
図２４は、３か月齢のＳｎｏｒｄ１１６＋/－（Ｈｅｔ）マウス及び３か月齢の野生型（ＷＴ）同腹子における摂食量を、１）ビヒクル（ｎ＝６）又は２）１０ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）（ｎ＝６）の単回腹腔内投与の１時間後、２時間後、４時間後、８時間後、１２時間後及び２４時間後に測定したものを示す。マウスを注射前に１６時間絶食させ、注射後は自由に餌を与えた。
図２５Ａは、１２か月齢のＳｎｏｒｄ１１６＋/－（Ｈｅｔ）マウス及び１２か月齢の野生型（ＷＴ）同腹子における摂食量を、１）ビヒクル（Ｈｅｔ ｎ＝４; ＷＴ ｎ＝６）又は２）１０ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）（Ｈｅｔ ｎ＝４; ＷＴ ｎ＝６）の単回腹腔内投与の１時間後に測定されたものを示す。マウスを注射前に１６時間絶食させ、注射後は自由に餌を与えた。
図２５Ｂは、１２か月齢のＳｎｏｒｄ１１６＋/－（Ｈｅｔ）マウス及び１２か月齢の野生型（ＷＴ）同腹子における摂食量を、１）ビヒクル（Ｈｅｔ ｎ＝４; ＷＴ ｎ＝６）又は2）１０ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）（Ｈｅｔ ｎ＝４; ＷＴ ｎ＝６）の単回腹腔内投与の１時間後、２時間後、４時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後に測定したものを示す。マウスを注射前に１６時間絶食させ、注射後は自由に餌を与えた。
図２６は、７か月齢のＳｎｏｒｄ１１６＋/－（Ｈｅｔ）マウス及び７か月齢の野生型（ＷＴ）同腹子における摂食量を、１）ビヒクル（ｎ＝５）３０ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）（ｎ＝５）の単回腹腔内投与の１時間後、２時間後、４時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後に測定したものを示す。マウスを注射前に１６時間絶食させ、注射後は自由に餌を与えた。
図２７Ａは１）ビヒクル（ｎ＝１０）又は２）１０ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）（ｎ＝１０）の０７．００時での連続１０日の腹腔内投与の後に毎日測定した６か月齢のＳｎｏｒｄ１１６＋/－（Ｈｅｔ）マウス及び６か月齢の野生型（ＷＴ）同腹子における摂食量を示し、図２７Ｂは体重を示す。
図２８Ａは１）ビヒクル（ｎ＝５）又は２）３０ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）（ｎ＝５）の０７．００時での連続５日の経口投与の後に毎日測定した８か月齢のＳｎｏｒｄ１１６＋/－（Ｈｅｔ）マウス及び８か月齢の野生型（ＷＴ）同腹子における摂食量を示し、図２８Ｂは体重を示す。
図２９Ａは１）ビヒクル（ｎ＝５）又は２）３０ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）（ｎ＝５）の１８．００時での連続５日の経口投与の後に毎日測定した８か月齢のＳｎｏｒｄ１１６＋/－（Ｈｅｔ）マウス及び８か月齢の野生型（ＷＴ）の同腹子における明サイクル中の摂食量を示し、図２９Ｂは暗サイクル中の摂食量を示す。
実施形態の説明
上記で要約し、以下で詳細に示すように、本開示は、（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアフマル酸塩、その結晶形態及び（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレア遊離塩基に関する。本開示はまた、フマル酸塩及びその結晶形態を製造する方法、ならびにＧＨＳＲ１ａの阻害のためにそれを使用する方法に関する。
本開示の詳細は、以下の付随する記載に示されている。本明細書に記載されているものと同様又は同等の方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができるが、例示的な方法及び材料はここで記載されている。本開示の他の特徴、目的及び利点は、記載及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。本明細書及び添付の特許請求の範囲において、文脈が明らかに異なることを指示しない限り、単数形は複数形も含む。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で引用されたすべての特許及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本開示の１つの態様は、（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアフマル酸塩に関する。本開示の少なくとも１つの実施形態において、塩は１：１である（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレア：フマル酸塩である。
塩は、油又は固体などの様々な形態を取ることができる。固体は、非晶性、結晶性又は両方の混合物であることができる。本開示の少なくとも１つの実施形態において、塩は結晶形態が少なくとも５０％である。さらなる実施形態において、塩は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、１００％結晶性であることができる。
もし塩が少なくとも部分的に結晶性であるならば、結晶形態は、形態１、形態２、形態３及び形態４から選択できる。
少なくとも１つの実施形態において、塩は、ＣｕＫα線を使用してＸＲＰＤにより決定される図１２のＸＲＰＤパターンと実質的に同様のＸＲＰＤパターンを特徴とする結晶形態１を含む。さらなる実施形態において、塩は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％及び１００％の結晶形態１であることができる。
幾つかの実施形態において、形態１は、７．８±０．２、９．５±０．２、１４．３±０．２、１６．７±０．２、１７．２±０．２、１８．５±０．２、１８．８±０．２、１９．３±０．２、２０．０±０．２、２０．７±０．２、２２．４±０．２、２３．２±０．２、２５．６±０．２、２７．２±０．２、３１．７±０．２及び３２．４±０．２度の２θにピークを含むＣｕＫα線を使用するＸＲＰＤパターンを特徴とすることができる。
少なくとも１つの実施形態において、塩は、ＣｕＫα線を使用するＸＲＰＤによって決定される図３のＸＲＰＤパターンと実質的に同様のＸＲＰＤパターンを特徴とする結晶形態２を含む。さらなる実施形態において、塩は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％及び１００％の結晶形態２であることができる。
少なくとも１つの実施形態において、塩は、ＣｕＫα線を使用するＸＲＰＤによって決定される図１５のＸＲＰＤパターンと実質的に同様のＸＲＰＤパターンを特徴とする結晶形３を含む。さらなる実施形態において、塩は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％及び１００％の結晶形態３であることができる。
幾つかの実施形態において、形態３は、７．２±０．２、９．４±０．２、９．７±０．２、１０．８±０．２、１４．３±０．２、１５．１±０．２、１６．２±０．２、１７．９±０．２、１８．７±０．２、１８．９±０．２、１９．６±０．２、２１．５±０．２、２２．７±０．２、２３．７±０．２、２４．３±０．２、２５．１±０．２、２７．４±０．２、２８．７±０．２及び３４．９±０．２度の２θにピークを含むＣｕＫα線を使用するＸＲＰＤパターンを特徴とすることができる。
少なくとも１つの実施形態において、塩は、ＣｕＫα線を使用するＸＲＰＤによって決定される図１６のＸＲＰＤパターンと実質的に同様のＸＲＰＤパターンを特徴とする結晶形態４を含む。さらなる実施形態において、塩は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％及び１００％の結晶形態４であることができる。
幾つかの実施形態において、形態４は、１２．２±０．２、１３．２±０．２、１５．０±０．２、１５．４±０．２、１７．６±０．２、１８．１±０．２、１９．５±０．２、２０．２±０．２、２０．９±０．２、２１．４±０．２、２３．０±０．２、２３．４±０．２、２４．４±０．２、２４．８±０．２、２５．９±０．２、２７．９±０．２、２８．９±０．２、２９．６±０．２及び３０．７±０．２度の２θにピークを含むＣｕＫα線を使用するＸＲＰＤパターンを特徴とすることができる。
本開示の別の態様は、ＣｕＫα線を使用するＸＲＰＤにより決定される図１ＡのＸＲＰＤパターンと実質的に同様のＸＲＰＤパターンを特徴とする結晶性（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレア遊離塩基に関する。
本開示の別の態様は、医薬上許容される担体、及び、（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアフマル酸塩及び結晶性（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアから選ばれる、本明細書に開示されるとおりの少なくとも１つの物質を含む、医薬組成物に関する。医薬上許容される担体は、賦形剤、希釈剤又は界面活性剤をさらに含むことができる。
組成物は、それぞれ従来の混合、造粒又はコーティング方法に従って調製することができ、本発明の医薬組成物は、約０．１％～約９９％、約５％～約９０％又は約１％～約２０％の開示された化合物を質量又は体積基準で含むことができる。
本開示の別の態様は、（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアフマル酸塩及びその結晶形態を製造する方法であって、以下の実施例に詳述されるとおりである方法を含む。
本開示の別の態様は、本明細書に開示されるとおりの結晶性（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアを製造する方法を含む。
本開示の別の態様は、細胞を本明細書に開示されるとおりの（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアフマル酸塩及び結晶性（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアから選ばれる少なくとも１つの物質に曝露することを含む、細胞におけるグレリンシグナル伝達活性を低下させる方法である。
「グレリンシグナル伝達活性」という用語は、グレリンがその受容体又は受容体複合体に結合するときに起こる下流活性のいずれか１つ又は組み合わせを指す。
本開示の別の態様は、細胞を本明細書に開示されるとおりの（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアフマル酸塩及び結晶性（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアから選ばれる少なくとも１つの物質に曝露することを含む、細胞における成長ホルモンの放出を阻害する方法である。
本開示の別の態様は、細胞を本明細書に開示されるとおりの（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアフマル酸塩及び結晶性（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアから選ばれる少なくとも１つの物質に曝露することを含む、ＧＨＲＳ１ａを阻害する方法である。
幾つかの実施形態において、細胞は、インビトロで、本明細書に開示されるとおりの（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアフマル酸塩及び結晶性（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアから選ばれる少なくとも１つの物質に曝露される。幾つかの実施形態において、細胞は、インビボで、本明細書に開示されるとおりの（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアフマル酸塩及び結晶性（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアから選ばれる少なくとも１つの物質に曝露される。
本開示の別の態様は、グレリンレベルの増加に関連する状態又は障害を有する対象を治療する方法であって、前記対象に、本明細書に開示されるとおりの（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアフマル酸塩及び結晶性（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアから選ばれる少なくとも１つの物質を投与することを含む、方法である。非限定的な例として、グレリンレベルの増加に関連する状態又は障害としては、過食症、肥満、食欲亢進（制御不能な食欲）、ダイエット後の体重リバウンド（ダイエット後の食欲亢進を含む）などの食物乱用障害、アルコール依存症及びプラダーウィリー症候群などの遺伝病などが挙げられる。
本開示の別の態様は、成長ホルモンの循環増加に関連する状態又は障害を有する対象を治療する方法であって、前記対象に、本明細書に開示されるとおりの（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアフマル酸塩及び結晶性（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアから選ばれる少なくとも１つの物質を投与することを含む、方法である。
「低減する」又は「阻害する」とは、参照基準と比較して、活動、機能又は量を減少、低減又は阻止することを意味する。幾つかの実施形態において、「低減」又は「阻害」とは、２０％以上の全体としての減少を引き起こす能力を意味する。幾つかの実施形態におおいて、「低減」又は「阻害」とは、５０％以上の全体としての減少を引き起こす能力を意味する。幾つかの実施形態において、「低減」又は「阻害」とは、７５％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の全体としての減少を引き起こす能力を意味する。幾つかの実施形態において、上記の量は、同じ期間にわたる対照投与（プラセボなど）と比較して、ある期間にわたって阻害又は減少される。本明細書で使用されるときに、「参照基準」は、比較の目的で使用される任意のサンプル、標準又はレベルを指す。参照基準は、健康なサンプル又は病気にかかっていないサンプルから取得できる。幾つかの例において、参照基準は、試験又は治療されている対象ではない１人又は複数の健康な対象から得られる。
「実質的に低減した」という用語は、２つの値の差が前記２つの値により測定される生物学的特徴の関係で統計的に有意であると当業者が考えられるような、ある数値と参照基準数値との間の十分に高い程度の低減を表す。幾つかの実施形態において、実質的に低減した数値は、参照基準値と比較して約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％のいずれか１つよりも大きく低減している。
幾つかの実施形態において、細胞又は対象を本明細書に開示されるとおりの（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアフマル酸塩及び結晶性（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアから選ばれる少なくとも１つの物質に曝露することにより、グレリンシグナル伝達活性の低減がもたらされる。幾つかの実施形態において、細胞又は対象におけるグレリンシグナル伝達活性は、（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアフマル酸塩又は結晶性（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアの非存在下におけるグレリンシグナル伝達活性と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％低減される。
幾つかの実施形態において、グレリンシグナル伝達活性は、蛍光画像形成プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）アッセイによって検出される細胞内カルシウムのレベルによって測定される。幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるとおりの（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアフマル酸塩及び結晶性（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアから選ばれる少なくとも１つの物質に曝露することにより、細胞内カルシウムのレベルの低減がもたらされる。
ＦＬＩＰＲアッセイとは、Ｇタンパク質共役受容体（とりわけ、ＧＨＳ－Ｒ１ａ）の活性化及び細胞内カルシウムフラックスの刺激を検出する技術を指す。細胞内カルシウムレベルは、カルシウム感受性色素及び蛍光プレートリーダーを使用して測定できる。さらなる詳細については、Arkin、Michelle R.ら（2012）、GPCR及びイオンチャネルターゲット用のＦＬＩＰＲ（商標）アッセイ、Assay Guidance Manual [Internet] Sittampalam G.S., ら(Eds)を参照されたい。
幾つかの実施形態において、グレリンシグナル伝達活性は、成長ホルモンの循環レベルによって測定される。幾つかの実施形態において、対象を本明細書に開示されるとおりの（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアフマル酸塩及び結晶性（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアから選ばれる少なくとも１つの物質に曝露することにより、成長ホルモンの循環レベルの低減がもたらされる。
幾つかの実施形態において、グレリンシグナル伝達活性は摂食量によって測定される。幾つかの実施形態において、対象を本明細書に開示されるとおりの（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアフマル酸塩及び結晶性（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアから選ばれる少なくとも１つの物質に曝露することにより、摂食量の低減がもたらされる。
幾つかの実施形態において、グレリンシグナル伝達活性は体重によって測定される。幾つかの実施形態において、対象を本明細書に開示されるとおりの（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアフマル酸塩及び結晶性（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアから選ばれる少なくとも１つの物質に曝露することにより、体重の減少又は体重の安定化がもたらされる。
「治療」又は「治療すること」は、有益な又は所望の臨床結果を得るためのアプローチである。「治療」又は「治療すること」は、ヒトを含む哺乳動物における疾患の治療薬の投与又は適用を網羅する。この開示の目的のために、有益な又は望ましい臨床結果としては、限定するわけではないが、１つ以上の症状の緩和、状態の程度の低減、状態の再発の防止又は遅延、状態の進行の遅延又は鈍化、状態の改善、状態又状態の進行の阻止、状態の進展の阻害、及び状態の寛解（部分的又は全体的）が挙げられる。「治療」又は「治療すること」には、状態の病理学的結果の低減も含まれる。本明細書で提供される方法は、これらの治療の態様のいずれか１つ以上が考えられる。上記に沿って、治療という用語は、状態又は障害のすべての態様の１００パーセントの除去を必要としない。
本開示の別の態様は、増加したグレリンの循環レベルに関連する状態又は障害の治療のために、本明細書に開示されるとおりの組成物を経口投与することである。
本開示の別の態様は、増加した成長ホルモンの循環レベルに関連する疾患又は障害の治療のために、本明細書に開示されるとおりの組成物を経口投与することである。
本明細書に開示されるとおりの塩を使用する経口投与のための治療有効量及び投与計画は、治療される状態又は障害、ならびに患者の年齢、体重、場合によっては性別、及び他の健康要因を含む様々な要因に応じて変化し、それは治療時に決定されうる。治療有効量は１ｍｇ～５００ｍｇの範囲であることができる。経口投与組成物は、非限定的な例として、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００ｍｇの本明細書に開示されるとおりの活性成分を含むことができる。
Figure 0007171728000002
Figure 0007171728000003
例
例１．結晶形態１（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレア（ＨＭ０４）遊離塩基の調製及び特性評価
例１Ａ：ＨＭ０４遊離塩基結晶形態１シードの調製
（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレア（ＨＭ０４又はＨ０９００とも呼ばれる）の非晶性遊離塩基の第一の１５ｍｇのサンプルをアセトニトリル中に溶解し、非晶性遊離塩基ＨＭ０４の第二の１５ｍｇのサンプルをアセトン中に溶解した。窒素流下でデシケータ内で溶液をゆっくりと蒸発させた。結晶化度は、Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）によって確認された。アセトニトリル溶液及びアセトン溶液から結晶化した遊離塩基ＨＭ０４サンプルのＸＲＰＤプロファイル（形態１）を、それぞれ図１Ａ及び１Ｂ（下のパネル）に示す。
例１Ｂ：ＨＭ０４遊離塩基結晶形態１のスケールアップ
非晶性ＨＭ０４遊離塩基のサンプルを０．５ｍＬのアセトン中に溶解し、窒素流下でデシケータ内で溶液をゆっくりと蒸発させた。２４時間後に、褐色の油状残留物が得られ、アセトン溶液から結晶化した遊離塩基形態１の数個の結晶（例１Ａを参照されたい）をシードとして加え、へらで引っ掻いた。油を固化させ、得られた生成物を真空オーブン中で５０℃で２４時間乾燥させて、９５ｍｇの収量の結晶性遊離塩基を得た。
結晶化度をＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）によって確認した。図１Ｂの上のパネルを参照されたい。同時熱分析（ＳＴＡ）により、結晶性遊離塩基は水和又は溶媒和されていないことが示唆された。結晶性遊離塩基は、ＤＳＣによって測定して、推定融解開始が約１５５℃であった。ＧＶＳ分析は、製品がわずかに吸湿性であり、７０％までの相対湿度（ＲＨ）で約１．５％及び８０％までのＲＨで約２％の可逆的な重量増加であることが示された。結晶性遊離塩基の水溶解度は２ｍｇ/ｍＬ未満であると推定された。
例２．ＨＭ０４フマル酸塩形態１の小規模調製
ＨＭ０４非晶性遊離塩基（１００ｍｇ）をアセトニトリル（２ｍＬ）中に懸濁した。フマル酸（２７ｍｇ）を加え、残留酸を追加のアセトニトリル（０．２ｍＬ）とともに反応混合物中に洗い流し、よく混合した。混合物を穏やかに温め、固体が急速に沈殿した。得られた懸濁液を４０℃と室温の間で一晩（１８～２４時間）温度サイクルした。生成物をろ過し、アセトニトリル（０．２ｍＬ）で洗浄し、５０℃の真空オーブン中で２４時間乾燥して、８６ｍｇのフマル酸塩生成物を得た。
フマル酸塩生成物は核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析により１：１塩であることが示された。結晶性はＸＲＰＤによって確認され、形態１として指定された（図１Ｃ）。ＳＴＡは溶融前に重量損失を示さず、製品が水和又は溶媒和されていないことを示唆した。ＤＳＣは、約１７２℃の溶融開始に対応する単一の吸熱を示した。ＧＶＳは、フマル酸塩が吸湿性であり、７０％までの相対湿度（ＲＨ）で約２．８％及び８０％までのＲＨで約４．５％の重量増加であることが示された。フマル酸塩の推定水溶解度は２００ｍｇ/ｍＬ以上であった。
例３．ＨＭ０４フマル酸塩の結晶形態（形態１及び２）
ＨＭ０４遊離塩基（１．５ｍｇ）をアセトニトリル（６ｍＬ）中に懸濁させ、フマル酸（０．４ｇ）を加えた。混合物を穏やかに温め、固体が急速に沈殿した。得られた懸濁液を、７２時間にわたって４０℃と周囲温度の間で温度サイクルした。さらにアセトニトリル（１ｍＬ）を加え、生成物をろ過し、アセトニトリル（５ｘ０．２ｍＬ）で洗浄し、真空オーブン中で５０℃にて少なくとも２４時間乾燥させて一定の重量にし、１．６ｇのフマル酸塩を得た。この結晶性ＨＭ０４フマル酸塩は、ＸＲＰＤ分析によって形態１として特性化された（図２）。
図３は、ＨＭ０４フマル酸塩をエタノールに溶解し、窒素下にて室温で溶媒を蒸発させた後に得られたＨＭ０４フマル酸塩形態２サンプルの代表的なＸＲＰＤパターンを示している。
ＨＭ０４フマル酸塩形態２は、１５０ｍｇの出発材料（ＨＭ０４フマル酸塩形態１）を加熱下で０．４５ｍＬの９０/１０エタノール/水混合物中に溶解することによりスケールアップされた。溶液をデシケータ内で窒素流下で９６時間蒸発させ、固体生成物を回収した。形態２のスケールアップされた生成物のＸＲＰＤパターンは、少量の形態１との混合の可能性を除外することはできないが、一般に、より小さいスケールの生成物と一致していた。ＮＭＲ分析は、生成物が化学量論的モノ塩と一致することを示した。ＳＴＡデータは、７０℃～１５０℃で約１．９％の重量損失を示し、それはサンプルがおそらく水和物であることを示唆した。ＤＳＣデータは、約１６４．５℃で開始する幅広い吸熱を示し、これは溶融物に対応している。ＧＶＳは、７０％ＲＨまで３．５％の重量増加及び８０％ＲＨまで４．９％の重量増加を示した。ＸＲＰＤパターンの変化は、ＧＶＳの後、又は、サンプルが４０℃/７５％ＲＨのデシケータ内に7日間置かれた後に観察されなかった。
形態１出発材料及び形態２スケールアップ材料を約５０：５０の比率（１０ｍｇ：１０ｍｇ）で混合することにより、競合スラリー実験を行った。混合物を１００μＬの異なる溶媒又は溶媒混合物中で室温にて４８時間振盪した。溶媒の蒸発後に、４８時間後に各スラリーから固体のサンプルを採取し、ＸＲＰＤで分析して、１つの形態への転化が起こったかどうかを決定した。スラリーを６０℃で繰り返し、４８時間後に再びサンプルを採取した。室温及び６０℃での研究結果を以下の表２に示す。
Figure 0007171728000004
室温でのアセトニトリル中の競合スラリーにより、形態１への完全な転化をもたらした。エタノールでのスラリーにより、周囲温度でのエタノール/水により、形態の混合物をもたらし、形態２への転化をもたらした。６０℃でのアセトニトリル中の競合スラリーにより、形態１への完全な転化をもたらした。アセトニトリル/水中及びエタノール中のスラリーで、割り当てられていないＸＲＰＤパターンを６０℃にて観察した（それぞれ図４Ａ及び４Ｂ）。競合スラリーの結果のさらなる調査は行わなかった。
例４．例１～３の分析方法
例１～３に記載された生成物を特性化するために使用される分析方法を以下に示す。
ＳＴＡは、Perkin-Elmer STA 600 TGA/DTAアナライザを使用して実施された。サンプル（５ｍｇ）を１０℃/分の速度で２５℃から３００℃に加熱し、その間、重量の変化を監視した。パージガスとして窒素を２０ｃｍ３/分の流量で使用した。
ＤＳＣ分析のために、５ｍｇのサンプルをアルミニウムＤＳＣパンに計量し、アルミニウム蓋で非気密的にシールした。次に、サンプルをPerkin-Elmer Jade DSCにロードし、安定した熱流応答が得られるまで２５℃で保持した。次に、サンプルをスキャン速度１０℃/分で３００℃に加熱し、得られた熱流応答を監視した。２０ｃｍ３/分のヘリウムパージを使用した。分析の前に、装置はインジウム標準を使用して検証された温度及び熱流であった。
ＧＶＳ分析では、１５～２０ｍｇのサンプルをIgaSorp蒸気収着天びん（Hiden Analytical Instruments）に装填した。次に、さらなる重量の変化が記録されなくなるまで湿度０％の環境を維持することにより、サンプルを乾燥させた。次いで、サンプルを１０％ＲＨ増分で０から９０％ＲＨの傾斜プロファイルにかけ、平衡が達成されるまで（９９％工程完了）、各工程でサンプルを維持した。平衡に達したら、装置内の％ＲＨを次の工程に傾斜させ、平衡手順を繰り返した。収着サイクルの完了後に、同じ手順を使用してサンプルを乾燥させた。次に、収着/脱着サイクル中の重量変化をモニタリングし、サンプルの吸湿性を決定できるようにした。
ＮＭＲ分析は、Bruker Avance III 400機器を使用してＤＭＳＯ-ｄ6中で行った。
ＸＲＰＤ分析は、サンプル（約２ｍｇ）をＸＲＰＤゼロバックグラウンドの単一の斜め切断したシリカサンプルホルダで軽く圧縮することにより行った。次に、サンプルをPhilips X-Pert MPD回折計に装填し、次の実験条件を使用した。
チューブアノード：Ｃｕ
発電機電力：４０ｋＶ
管電流：４０ｍＡ
波長α１：１．５４０６Å
波長α２：１．５４４４Å
開始角度（２θ）：４
終了角度（２θ）：４０
連続スキャン
例５．ＨＭ０４フマル酸塩形態１のスケールアップ合成
この例に示されているＨＭ０４フマル酸塩形態１の合成の概要を図５に示す。
Figure 0007171728000005
2,2,6,6-テトラメチルピペリジン（７．２０ｋｇ、５１．１モル、３．０当量、ＫＦ＝０．３０％）を、温度プローブ及びオーバーヘッドスターラを備えた１００Ｌ反応器中に加え、窒素保護下にＲＴで混合した。ＴＨＦ（５０Ｌ）を反応器に加え、撹拌した。容器を窒素で３回パージし、０℃に冷却した。ｎ-ＢｕＬｉ（２０．４Ｌ、３．０当量、２．５Ｍヘキサン溶液）を混合物に滴下して加え、温度を約０℃～約５℃に1時間以上維持した。溶液の色が黄色に変わった。混合物を約０℃～約５℃で３０分間撹拌した。混合物を約－７８℃～約－７０℃に冷却して、溶液Ａを形成した。
化合物１（３．２５ｋｇ、１７．０モル、１．０当量、ＫＦ＝０．０３％）を１５ＬのＴＨＦ中に溶解して、溶液Ｂを形成した。
溶液Ｂを溶液Ａに約７０℃～約－７８℃の温度で１時間かけて滴下して加え、次いで、３０分間撹拌して溶液Ｃを形成した。ホウ酸トリイソプロピル（（ｉ－ＰｒＯ）３Ｂ）（３．５２ｋｇ、１８．７モル、１．１当量）を溶液Ｃに１０分かけて滴下して加えた。反応混合物を約－７０℃～約－７８℃の温度で１時間撹拌した。ＨＣｌ（４０Ｌ、３Ｍ、７．０当量）を３０分かけて加えて、反応をクエンチした。温度の１０度上昇を記録した。
得られた水層を分離し、ＥｔＯＡｃ（４０Ｌ）で抽出した。水層を分離し、ＥｔＯＡｃ（３５Ｌ、３０Ｌ）で再び２回抽出した。有機層を合わせて、約１６０Ｌの液体を得た。合わせた有機層を、５０Ｌの、ＮａＣｌで飽和した１Ｍ ＨＣｌ水溶液で２回洗浄した。有機層を、約５０℃～約５５℃の温度で、３０～４０ｍｍＨｇで約８時間、５０Ｌロータベーパ中で約５Ｌに濃縮した。
残留ＥｔＯＡｃをＤＭＥで３回交換した（１０Ｌ×３）。有機層を、５０Ｌのロータベーパ中で、約５０℃～約５５℃の温度で、３０～４０ｍｍＨｇ下に約６時間濃縮した。毎回約５Ｌの残留物が残った。残留物にＤＭＥ（２０Ｌ）を添加して、１４．２％の化合物２Ａの濃褐色溶液を得た（２５ｋｇの溶液に３．５５ｋｇ、収率８８．８％、純度９７．４％（ＨＰＬＣによるＡＵＣ、保持時間＝１．６分）、残留酢酸エチル０．２４％）。1H-NMR（400 MHz、DMSO）：δ= 8.55（s,2H）,7.36（d,1H）,7.69（d,1H）。同じ方法で化合物２Ａの第二のバッチを調製し、３．２９ｋｇ（純度９５．４％、収率８２．３％、残留酢酸エチル０．１１％）を生成した。
Figure 0007171728000006
化合物２Ａ（２０．５ｋｇ溶液中２．９１ｋｇ）を、窒素下で室温にて１００Ｌ反応器中に加えた。ＤＭＥ（４５ｍＬ）、2-クロロピラジン（１．４２ｋｇ、１２．４モル、１．０当量）及びＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（１０％ｗ/ｗ、２９１ｇ）を順次に加え、それぞれを窒素下にて室温で混合した。窒素を混合物中に２０分間バブリングし、得られた混合物を窒素でパージしそして充填した（３回）。混合物を６０分かけて４８～５２℃に加熱した。Ｋ２ＣＯ３（２．５７ｋｇ、１８．６モル、１．５当量）を、室温で別の反応器内の２２Ｌの水に添加し、次いで１０分かけて化合物２Ａ混合物に滴下して加えた。混合物を４８～５２℃で１６時間撹拌し、次いで、室温に冷却した。この手順を２回繰り返し、３つすべてのバッチを合わせた。
Ｋ２ＣＯ３の水溶液（１．０ｋｇ）を２２Ｌの水に溶解し、合わせた混合物に添加してｐＨを9に調整した。ＴＢＭＥ（５０Ｌ）を混合物に添加し、ろ過し（ＰＥＴフィルタ、３～５μｍ、２０５ｇ/ｍ２）、約５０ｇの粘着性のある褐色固体材料（触媒類似物）を除去した。水層を２回分離し、ＴＢＭＥ（４０Ｌ、４０Ｌ）で抽出した。
水層を、上記の方法に従って調製した第四のバッチの水層と合わせた。合わせた水層のｐＨを、ＨＣｌ（２Ｎ、４８Ｌ）でｐＨ＜３に調整した。混合物を室温で1時間撹拌すると、固体がゆっくりと沈殿した。混合物を３０分かけてろ過し（ＰＥＴフィルタ、３～５μｍ、２０５ｇ／ｍ２）、２０ｋｇの湿潤生成物を得た。ＡＣＮ（４０Ｌ）を、室温でオーバーヘッドスターラを備えた１００Ｌ反応器に加えた。湿潤生成物２０ｋｇを反応器に加え、反応混合物を加熱して還流させ、還流下に４時間撹拌した。反応混合物を３時間かけて室温に冷却し（約１５℃／時間）、ろ過して８．５ｋｇの湿潤固体を得た。湿潤固体を真空下（２０～３０ｍｍＨｇ）で５０～５５℃で１５時間乾燥させて、化合物３Ａを青白い色の固体（６．１ｋｇ、純度９７．４％（ＨＰＬＣによるＡＵＣ、保持時間＝３．７分）、８３．８％収率）として得た。 1H-NMR（400 MHz,DMSO）：δ= 7.67（d,1H）,7.82（d,1H）,8.75（d,1H）,8.82（t,1H）,8.98（d,1H）,13.89（bs,1H）。
Figure 0007171728000007
化合物３Ａ（６．１ｋｇ、２２．７モル、１．０当量）を、温度プローブ、オーバーヘッドスターラ及び凝縮器を備えた１００Ｌ反応器に加えた。メタノール（９２Ｌ）を室温で反応器に加えた。混合物を０～１０℃に冷却し、ＳＯＣｌ２（５．４ｋｇ、４５．３モル、２．０当量）を０～１０℃で３０分かけて滴下して加えた。反応混合物を加熱して還流させ（６５℃）、還流で１５時間撹拌した。懸濁液が形成された。溶媒とＳＯＣｌ２の大部分は、約３０Ｌが残るまで真空蒸留で除去された。混合物を真空（３０～４０ｍｍＨｇ）下で５０～５５℃にて約６時間濃縮した。残留物に水（１０Ｌ）を－５～１５℃で加えた。－５～１５℃でＫ２ＣＯ３の水溶液（２００ｇ、２Ｌの水に溶解）を使用してｐＨを８～９に調整した。得られた水層を酢酸イソプロピル（２５Ｌ、２５Ｌ）で２回抽出した。有機層を合わせたもの（約５０ｋｇ）を２０ＬのＮａＨＣＯ３水性層で洗浄した。有機層を分離し、１０ＬのＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。すべての水層を合わせた（５５．８ｋｇ）。有機層をシリカパッド（３０ｃｍ）でろ過し、化合物６Ａがシリカゲルからろ過されるまで（約３時間）、パッドを追加の酢酸イソプロピルで洗浄した。有機層を約５Ｌに濃縮した。残留物にＴＨＦ（１０Ｌ）を加え、真空（３０～４０ｍｍＨｇ）下で５０～５５℃で約３時間かけて約５Ｌ（３回）に濃縮した。残留濃縮物にさらに１０ＬのＴＨＦを加え、化合物６Ａの濃縮溶液（１５．８ｋｇ、３２．８３％、溶液中の化合物６Ａ５．１９ｋｇ、９７．９％純度（ＨＰＬＣによるＡＵＣ、保持時間＝８．５分）、８０．８％収率）を得た。1H-NMR（400 MHz,DMSO）：δ= 3.98（s,3H）,7.54（d,1H）,7.78（d,1H）,8.63(d,1H),8.72(t,1H),8.94(d,1H)。
Figure 0007171728000008
ＴＨＦ（２６Ｌ）を、窒素下で温度プローブ及びオーバーヘッドスターラを備えた１００Ｌ反応器に加えた。ＤＩＢＡＬ-Ｈ（２６ｋｇ、４６モル、５．０当量）を添加し、システムを窒素で３回パージして満たした。混合物を－７８～－７０℃に冷却して溶液Ａを形成した。５２ＬのＴＨＦ中の化合物６Ａ（２．６ｋｇ、９．２モル、１．０当量）の室温溶液を－７８～－７０℃にて窒素下で３０分かけて滴下して加えた。混合物を約５～６時間かけて－３０℃に温めた。反応混合物を－４０～－３０℃で３０分間撹拌した。混合物を４２Ｌの２Ｎ ＨＣＬに１時間かけてゆっくりと添加し、最高温度は３５℃に達した。混合物を２６Ｌの酢酸イソプロピルで抽出した。有機層を分離し、３０Ｌのブラインで洗浄した。この手順を繰り返し、有機層の両方のバッチを合わせ、真空下で約１００Ｌから約５～１０Ｌに濃縮した。濃縮中にゆっくりと固体が形成された。混合物を５～１５℃に冷却し、１時間撹拌した。混合物を３０分かけてろ過した（３０～５０μｍ）。固体を５０℃で６時間真空乾燥して、化合物６Ｂを褐色固体として得た（２．１ｋｇ、純度９７．５％（ＨＰＬＣによるＡＵＣ、保持時間＝８．６分）、収率４５．７％）。 1H-NMR（400 MHz,DMSO）：δ= 4.65（d,2H）,5.68（t,1H）,7.62（d,1H）,7.68（d,1H）,8.72（d,1H）,8.80（t,1H）,8.94（d,1H）。
Figure 0007171728000009
ＤＭＳＯ（１０Ｌ）を、室温にて窒素下で温度プローブ及びオーバーヘッドスターラを備えた５０Ｌフラスコに加えた。化合物６Ｂ（２．０５ｋｇ、８．０４モル、１．０当量）を窒素下で室温で添加した。Ｅｔ３Ｎ（８Ｌ）を窒素下にＲＴにて加え、次いで、混合物を１５～２０℃に冷却した。ＳＯ３ピリジン（５．１ｋｇ、３２．０８モル、４．０当量）を別のフラスコで５～１５℃で１０ＬのＤＭＳＯに溶解し、約２０℃で３．５時間かけて滴下して混合物に加えた。反応混合物を７０Ｌの氷水に移した。懸濁液混合物を０～１０℃で１時間撹拌し、１．５時間にわたって遠心分離することによりろ過して（ＰＥＴ、３～５μｍ、２０５ｇ／ｍ２）、化合物７を褐色固体として得た。固体を室温で３５ＬのＤＣＭに溶解した。得られたＤＣＭ層を５Ｌのブラインで洗浄した。有機層を分離し、真空下で４０～４５℃で乾燥するまで濃縮して、化合物7を褐色固体として得た（２．３３ｋｇ、純度９６．３％（ＡＵＣによるＨＰＬＣ、保持時間＝９．２分）、収率９３．５％）。1H-NMR（400 MHz,DMSO）：δ= 7.67（d,1H）,7.99（d,1H）,8.67（d,1H）,8.75（s,1H）,8.99（d,1H）,10.56（s,1H）。
Figure 0007171728000010
ＴＨＦ（２３Ｌ）を、窒素下に室温で温度プローブ及びオーバーヘッドスターラを備えた５０Ｌフラスコに加えた。化合物７（２．３ｋｇ、９．１モル、１．０当量）及び（S）-2-メチルプロパン-2-スルフィンアミド（１．２１ｋｇ、１０モル、１．１当量）を窒素下でフラスコに順次に加えた。Ｔｉ（ＯＥｔ）４（６．２２ｋｇ、２７．３モル、３．０当量）を、窒素下で３０～３５℃で１時間かけてフラスコに滴下して加えた。系を窒素で３回パージし、次に混合物を室温で２時間攪拌した。酢酸イソプロピル（４０Ｌ）を反応混合物に加えた。次に、室温でゆっくり攪拌しながら、反応混合物全体をブライン２０Ｌに投入した。大量の固体が形成され、熱の放出は観察されなかった。固体（約１８ｋｇ）を遠心分離機を使用してろ過し、次に２０Ｌの酢酸イソプロピルで再度２０分間スラリー化し、再度ろ過した結果、わずかに少ない固体（１７．３ｋｇ）が得られた。次にろ液を合わせ、２０Ｌのブラインで洗浄した。有機層を分離し、真空下（３０～４０ｍｍＨｇ）でロータベーパ内で４０～５０℃で約４時間濃縮して溶媒を除去し、褐色の油（化合物8）を得た。油をＤＭＦに溶解して、黒色溶液（７．３６ｋｇ、４０．１％、溶液中の化合物８、３．０ｋｇ、純度９２．１％（ＨＰＬＣによるＡＵＣ、保持時間＝９．７分）、収率＞１００％）を得た。1H-NMR（400 MHz,CDCl3）：δ= 1.30（s,9H）,7.59（d,1H）,8.11（d,1H）,8.64（s,1H）,8.73（m,1H）,8.97（s,1H）,9.10（s,1H）。
Figure 0007171728000011
ＤＭＦ（２６Ｌ、１０ｖ/ｗ）を、１５℃にて窒素下で温度プローブ及びオーバーヘッドスターラを備えた５０Ｌフラスコに加えた。窒素下でフラスコに化合物８（７．３ｋｇのＤＭＦ溶液で、２．９ｋｇ、８．１モル、１．０当量を含む）及びＴＢＡＡ（２．４４ｋｇ、８．１モル、１．０当量）を順次に加えた。混合物を０～１０℃に冷却した。次に、ＴＭＳＣＦ３（２．８８ｋｇ、２０．３モル、２．５当量）を０～１０℃で６０分かけてフラスコに加えた。反応混合物を窒素保護下で０～５℃で３時間撹拌した。酢酸イソプロピル（６０Ｌ）を混合物に加え、次いで、５～２５℃で攪拌しながら４５ＬのＮａＨＣＯ３を加えた。有機層を分離し、ＮａＨＣＯ３で３回洗浄し（３０Ｌｘ３）、６０ｋｇ～２．５ｋｇの褐色油に濃縮した。油生成物を２０ＬのＴＢＭＥに溶解し、シリカゲルのパッド（高さ約４０ｃｍ、直径３０ｃｍ）で２時間ろ過して、ＴＢＭＥ溶液中に２．１４ｋｇの化合物１１を得た。溶液を４５～５０℃で乾燥するまで濃縮して、化合物１１を黒色油として得た（１．８５ｋｇ、純度８５．２％（ＨＰＬＣによるＡＵＣ、保持時間＝９．１分、ジアステレオ異性体の場合９．６分）、収率５３．６％）。1H-NMR（400 MHz,CDCl3）：δ= 1.33（s,9H）,3.82-3.85（d,1H）,5.61-5.66（m,1H）,7.53-7.60（m,2H）,8.63-8.64（d,1H）,8.71～8.72（m,1H）,8.95（s,1H）。
Figure 0007171728000012
化合物１１（１．８ｋｇ、４．２３モル、１．０当量、粗製）を、２５℃にて窒素下で温度プローブ及びオーバーヘッドスターラを備えた５０Ｌ反応器に加えた。無水ＭｅＯＨ（１８Ｌ）を添加して化合物１１を溶解した。次に、ＭｅＯＨ/ＨＣｌ（１８Ｌ、１Ｎ）を２５～３０℃で１０分間かけて滴下して加え、混合物を２５～３０℃で１時間撹拌した。水（１５Ｌ）を反応物に添加し、混合物を真空下（３０～４０ｍｍＨｇ）で４５～５０℃のロータベーパで約４時間濃縮して、溶媒を除去した。混合物のｐＨを５ＬのＫ２ＣＯ３溶液で１０に調整した。次に、２０ＬのＥｔＯＡｃを混合物に加え、有機層を分離し、水層をＥｔＯＡｃで２回抽出した（１５Ｌ×２）。有機層を合わせ、そして１０Ｌのブラインで洗浄した。合わせた有機層は、４０ｋｇのＥｔＯＡｃ溶液に９９６ｇの化合物１２を含んでいた（８４％の純度（ＨＰＬＣによるＡＵＣ、保持時間＝２．８分）。有機層を真空下（３０～４０ｍｍＨｇ）で４５～５０℃で約３時間濃縮して、ＥｔＯＡｃ溶液中７．５ｋｇの量の化合物１２（８３％純度（ＨＰＬＣによるＡＵＣ、保持時間＝２．７分））とした。
温度プローブ及びオーバーヘッドスターラを備えた別の５０Ｌ反応器に、Ｄ-ＣＳＡ（９３０ｇ、４．０モル、１．０当量から１．２６ｋｇの化合物１２）を加え、窒素下に室温で攪拌した。ＥｔＯＡｃ（１０Ｌ）、次いで化合物１２のＥｔＯＡｃ溶液（１．２６ｋｇ、３．９モル、１．０当量）をそれぞれ順次に反応器に加えた。混合物を室温で１時間撹拌し、ゆっくりと懸濁液になった。混合物を遠心分離機でろ過し、ＥｔＯＡｃで洗浄して、２．３ｋｇの化合物１２をオフホワイト固体（純度９６．０％）として生成した。
固体生成物、２０ＬのＥｔＯＡｃ及び１０Ｌの１０％Ｋ２ＣＯ３水溶液を５０Ｌフラスコに順次に加え、固体がなくなるまで（ｐＨ＝９～１０）室温で撹拌した。有機層を分離し、水層をＥｔＯＡｃで２回抽出した（１０Ｌ×２）。有機層を合わせ（約３２ｋｇ）、１０Ｌのブラインで洗浄した。有機層は３１．８ｋｇの溶液中に７１６ｇの化合物１２を含んでいた。
有機層を真空下にて４５～５０℃で約８Ｌに濃縮した。活性炭（２００ｇ）を有機層に加え、混合物を６０～７０℃で１時間撹拌し、室温まで冷却し、ブフナー漏斗及びろ紙（孔径：３０～５０μｍ）を使用して３０分間ろ過し、活性炭を除去した。混合物を真空下（３０～４０ｍｍＨｇ）でロータベーパ中で４５～５０℃で約３時間濃縮して、７１０ｇの化合物１２を黄色の固体（９９．４％純度）として得た。
Ｄ-ＣＳＡ（４１０ｇ、１．７７モル、１．０当量から６８０ｇの化合物１２）、３．４ＬのｉＰｒＯＨ及び６８ ｍＬの水を、温度プローブ及びオーバーヘッドスターラを備えた１０Ｌの反応器に順次に加え、室温で窒素下に撹拌した。混合物を加熱して還流させ（８４℃）、１時間後に溶液Ａを形成した。化合物１２（６８０ｇ）を３．４ＬのｉＰｒＯＨ中に溶解し、１回で溶液Ａに加えた。透明な溶液が形成され、温度は６５℃に低下した。混合物を６５℃で約１５分間撹拌した後に、固体が現れた。混合物を２時間かけて１０℃に冷却し、１０℃でさらに３０分間撹拌し、ブフナー漏斗及びろ紙（孔径：３０～５０μｍ）で３０分かけてろ過し、１．１ｋｇの白色固体を回収した。
ＥｔＯＡｃ（１０Ｌ）、１．１ｋｇの白色固体生成物及び５Ｌの１０％Ｋ２ＣＯ３を２０Ｌフラスコに順次に加え、５分間混合した。固体が溶解した（ｐＨ＝９～１０）。ＥｔＯＡｃ層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（各５Ｌ）で２回抽出した。有機層を合わせ（約２０Ｌ）、５Ｌのブラインで洗浄し、真空下（３０～４０ｍｍＨｇ）にロータベーパで４５～５５℃で約３時間濃縮して、ほとんどの溶液を除去し、残留重量は１ｋｇに達した。ヘプタン（１Ｌ）を混合物に加え、室温で３０分間攪拌した。混合物をブフナー漏斗及びろ紙（孔径：３０～５０μｍ）を使用して３０分にわたってろ過して、白色固体（９９．７％純度）として４１９ｇの化合物１２塩基を得た。ろ液を黄色の固体（純度９８．７％）として１３５ｇの化合物１２に濃縮した。1H-NMR（400 MHz,CDCl3）：δ= 1.85（bs,2H）,5.17（m,1H）,7.56（d,1H）,7.68（d,1H）,8.62（d,1H）,8.70-8.71 （m,1H）,8.93（s,1H）。生成物を組み合わせると、化合物１２の収率は４０．７％になった。
工程９：化合物１０の合成
Figure 0007171728000013
Ｐｄ/Ｃ（４０ｇ、５％ｗ/ｗ）を、窒素下にて室温で１０Ｌオートクレーブ反応器に加えた。ＴＨＦ（２Ｌ）、２Ｌのメチルアミン（２７％～３０％アルコール溶液、２．１当量）及び８００ｇの化合物１０Ａ（７モル、１．０当量）を順次に反応器に加えた。システムを水素で３回パージした。混合物を水素圧（５０ｐｓｉ）で７０～７５℃で一晩撹拌し、ブフナー漏斗及びろ紙（孔径：３０～５０μｍ）を使用して１０分間ろ過し、Ｐｄ/Ｃを除去した。ろ液を真空下（３０～４０ｍｍＨｇ）でロータベーパにて４５～５０℃で約３時間濃縮して、９３３ｇの黄色の油を得た。混合物をカラムなしで大気圧で蒸留し、１４０～１７０℃画分を収集して、７６３ｇの化合物１０を無色の油として得た（９８．６％純度（ＨＰＬＣによるＡＵＣ、保持時間＝４．８分）、８４．２％収率、８０００ ｐｐｍ残留エタノール）。油の一部（５６３ｇ）を３ｃｍカラムを使用して大気圧で蒸留し、１４０～１７０℃画分を収集して、５１０ｇの化合物１０（７５．８％収率、１３４ｐｐｍ残留エタノール）を得た。1H-NMR（400 MHz,CDCl3）：δ= 0.82（bs,1H）,1.10-1.12（q,2H）,1.66（d,2H）,1.73-1.81（t,2H）,2.05（s,3H）,2.08-2.19（m,1H）,2.22（s,3H）,2.60（d,2H）。
Figure 0007171728000014
ＤＣＭ（１Ｌ）、２００ｇのＣＤＩ（１．２３モル、２．０当量）及び３５ｇのＤＡＢＣＯ（０．３１モル、０．５当量）を、温度プローブ及びオーバーヘッドスターラを備えた３Ｌ反応器に順次に加え、窒素下に室温で攪拌した。混合物を－１０～－５℃に冷却した。化合物１２（２００ｇ）を１ＬのＤＣＭに溶解し、混合物に１時間かけて滴下して加え、次いで－１０～－５℃で１６時間撹拌した。化合物１０（１５９ｇ、１．２４モル、２．０当量）を－１０～０℃で１０分かけて加えた。次に、混合物を０～５℃に温め、２時間保持した。混合物を４０～４５℃の真空下で約１Ｌに濃縮した。残留物にＨＣｌ（１Ｎの１Ｌ）を加え、４５～５０℃の真空下（３０～４０ｍｍＨｇ）でロータベーパで約２時間濃縮し、ＤＣＭを削除した。さらに３Ｌの１Ｎ ＨＣｌを残留物に加え、ＴＢＭＥ（４Ｌ、２Ｌ、２Ｌ）で３回抽出した。水層を２０％Ｋ２ＣＯ３水溶液（約１．５Ｌ）でゆっくりｐＨ＝９～１０に調整し、ＤＣＭ（２Ｌｘ３）で抽出した。有機層を合わせ（約４Ｌ）、０．２５Ｎ ＫＨ２ＰＯ４（１．２Ｌｘ３）で３回洗浄した。有機層を２Ｌのブラインで洗浄してｐＨを中性にし、４５～５０℃で約２時間真空下（３０～４０ｍｍＨｇ）でロータベーパ内で４５０ｇ（３３５ｍＬ）に濃縮した。ＭＴＢＥ（１．５Ｌ）を残留物に加え、５００ｍＬの液体が回収されるまで蒸留した。この工程を５００ｍＬのＴＢＭＥの添加及び５００ｍＬの留出液の回収で４回繰り返したが、最終蒸留で３３０ｍＬの液体を回収した。フラスコには約１～１．２Ｌの残留物が残っていた。残留物をゆっくりと室温に冷却し、室温で一晩攪拌した。混合物をろ過し、ＴＢＭＥ（４００ｍＬｘ２）で２回洗浄し、乾燥して１９２ｇのＨＭ０４遊離塩基の淡黄色固体（９９．３％純度（ＨＰＬＣによるＡＵＣ、保持時間＝１１．０分）を得た。壁上の生成物をＤＣＭ中に溶解し、真空下で濃縮して、２２ｇのＨＭ０４遊離塩基を褐色粘着性油として得た（純度９７．６％）。ろ液を真空下で濃縮して、２２．５ｇの黄色の固体（純度９４．０％）を得た。
ＨＭ０４遊離塩基（１８７ｇ、０．３９モル、１．０当量、９９．３％純度）及び１．９ＬのＡＣＮを、温度プローブ及びオーバーヘッドスターラを備えた３Ｌフラスコに順次に加え、窒素下で１５℃で攪拌して、淡黄色の懸濁液を得た。フマル酸（４５．６ｇ、０．３９モル、１．０当量）をフラスコに加え、１分後に白色の懸濁液を生成した。反応懸濁液を室温で一晩撹拌し、ろ過し（１５～２０μｍ、灰分＜０．１５）、ＡＣＮ（５０ｍＬｘ２）で2回洗浄し、５０℃で６時間真空下に乾燥して、２０７ｇのＨＭ０４フマル酸塩を淡黄色固体として得た（純度９９．４％（ＨＰＬＣによるＡＵＣ、保持時間＝１１．１分）、収率５７．８％、残留ＡＣＮ ３１００ｐｐｍ）。ろ液を真空下で濃縮して、淡黄色の固体（純度９７．３％）としてＨＭ０４フマル酸塩２０．１ｇを得た。
生成物の一部（１１７ｇ）を真空オーブン（２０～４０ｍｍＨｇ）でさらに乾燥させて、残留アセトニトリルの含有量を下げた。６０℃で６時間、１５時間、７２時間、そして６５℃で１８時間乾燥した後に、残留アセトニトリル含有量はそれぞれ３１００ｐｐｍ、２５７０ｐｐｍ、１３００ｐｐｍ及び２５６ｐｐｍと測定された。乾燥プロセスの後に、９８ｇのＨＭ０４フマル酸塩が単離された（９９．４％の純度（ＨＰＬＣによるＡＵＣ、保持時間＝１１．０分））。1H-NMR (400 MHz, DMSO): δ = 1.49-1.58 (m, 2H), 1.81-1.92 (m, 2H), 2.44-2.53 (m, 5H), 2.78 (s, 3H), 3.12 (m, 2H), 4.06-4.13 (m, 1H), 6.36-6.41 (m, 1H), 6.55 (s, 2H), 7.47 (d, 1H), 7.73 (d, 1H), 8.11 (d, 1H), 8.75 (d, 1H), 8.81-8.82 (m, 1H), 8.99 (d, 1H)。部分バッチの乾燥後に単離されたＨＭ０４フマル酸塩９８ｇの収量をバッチ全体に外挿して、工程１０の概算収量４８％を計算した。
６０℃で６時間、１５時間、７２時間、そして６５℃で１８時間乾燥した後にＨＭ０４フマル酸塩生成物のＸＲＰＤ分析を行った（それぞれ図６～９を参照されたい）。ＸＲＰＤプロファイルは、ＨＭ０４フマル酸塩生成物が形態１と一致することを示した。
例６．ＨＭ０４フマル酸塩形態１の合理化された合成
例５の工程１０を使用して生成されたＨＭ０４フマル酸塩の全収率は約４８％と計算された。全体の収量を増やすために、ＨＭ０４遊離塩基を分離する工程を省略した合理化された合成を調査した。特に、図５に示す例５の方法の工程１０は変更された。例５の工程９から始まる合理化された合成の概要を図１０に示す。
合理化されたＨＭ０４フマル酸塩試験1：
ＤＣＭ（１２１．４ｇ）、ＣＤＩ（２０．０ｇ、１２３ミリモル、２当量）及びＤＡＢＣＯ（３．５g、３１ミリモル）を、不活性化された１Ｌ反応器に順次に加えた。混合物を－１０℃に冷却した。別に、ＤＣＭ（１３２．５ｇ）及び化合物１２（２０．０ｇ、６２．１ミリモル）の溶液を容器に入れ、溶液が得られるまで撹拌した。この溶液を、内部温度を－１０～－５℃に維持することにより、３３分かけて１Ｌ反応器に滴下した。添加の最後に、容器をＤＣＭ（７．０ｇ）でリンスし、次いで、それを反応混合物に添加した。一晩（１９時間）攪拌し、正のＩＰＣを行った後に、化合物１０（１５．９ｇ、１２４ミリモル、２当量）を１５分かけて加え、容器をＤＣＭ（９．０ｇ）ですすいだ。０℃で加熱した後に、１時間の攪拌、正のＩＰＣ、さらに１．５時間の攪拌の後に、混合物を室温で加熱し、水（２００．１ｇ）を入れた。水層を分離し、有機層を１Ｎ ＨＣｌ（２０１、２００ｇ）で２回抽出した。生成物を含む合わせた水層をＴＢＭＥ（１４８ｇ）で洗浄した。有機層を除去した後に、水層にＤＣＭ（２６５．０ｇ）及び５０％Ｋ２ＣＯ３溶液（約２４０ｍｌ）をｐＨ９．６１に達するまで入れた。
一方、ＫＨ２ＰＯ４（８．２ｇ）の水（２４０ｇ）中の溶液を調製した。生成物を含む有機層に、ＫＨ２ＰＯ４溶液をｐＨ７．１２（１４２．２ｇ）に達するまで入れた。水層を分離した後に、有機層を水（２００ｇ）で洗浄した。水層を分離した後に、有機層を５０℃で蒸発させた。ＡＣＮ（３１４．４ｇ）を添加し、溶媒を７０～７５℃で真空蒸留した。ＡＣＮ（２３５．８ｇ）を加え、溶媒を再び真空下で蒸留した。ＡＣＮ（１４１．５ｇ）を加え、得られた溶液をポリッシュろ過し、ＡＣＮ（１６ｇ）でフィルタ洗浄した。６０℃に加熱した後に、フマル酸（７．２ｇ、６２ミリモル）を溶液に加えると、白い沈殿物が生じた。１時間かけて２０℃に冷却した後に、懸濁液をろ過し、ＴＢＭＥ（２ｘ３０ｇ）で２回洗浄した。窒素流を用いてフィルタ上で乾燥させた後に、７０．７ｇの湿潤粗生成物を得た。これをＴＢＭＥ（１７７．０ｇ）で１時間スラリー化し、ろ過し、ＴＢＭＥ（７０ｇ）で洗浄した。窒素流下でフィルタ上で乾燥させた後に、３３．０ｇの湿潤生成物を得た。真空下で５０℃にて加熱すると、乾燥生成物がＨＭ０４フマル酸塩の白色粉末として得られた（２１．１ｇ、ＨＰＬＣによる純度９９．８％、収率５７％）。ＸＲＰＤ分析により、製品が形態１であることを確認した（図１１を参照されたい）。
例６、７及び８に記載されているＸＲＰＤ分析は、X’Pert PRO PANalytical回折計及び以下の実験条件を使用して行った。
チューブアノード：Ｃｕ
管電圧：４０ｋＶ
管電流：４０ｍＡ
波長α１：１．５４０６Å
波長α２：１．５４４４Å
開始角度（２θ）：３
終了角度（２θ）：４０
計数時間：１２，７００秒
スキャンモード：連続スキャン
合理化されたＨＭ０４フマル酸塩試験2：上記の合理化された方法は、ＨＭ０４フマル酸塩の良好な結晶化特性を利用するためにさらに最適化された。遊離塩基を分離することならびにＡＣＮ及びフマル酸の添加直後にＨＭ０４フマル酸塩生成物を分離することを省略することに加えて、この試験では、遊離塩基の酸/塩基抽出処理も省略した。過剰のフマル酸をＴＢＭＥ中のスラリーとともに除去した。
ＤＣＭ（１２０ｇ）、ＣＤＩ（２０．１ｇ、１２４ミリモル、２当量）及びＤＡＢＣＯ（３．５ｇ、３１ミリモル）を、不活性化された１Ｌ反応器に順次に加えた。混合物を－１０℃に冷却した。別に、ＤＣＭ（１３３．８ｇ）及び化合物１２（２０．１ｇ、６２．４ミリモル）の溶液を容器に入れ、溶液が得られるまで撹拌した。この溶液を、内部温度を－１０～－５℃に保つことにより、３９分間で１Ｌ反応器に滴下した。添加の最後に、容器をＤＣＭ（７ｇ）で洗浄し、それを次に反応混合物に添加した。一晩（１８時間）攪拌し、正のIPCを行った後に、化合物１０（１５．９ｇ、１２４ミリモル、２当量）を１５分かけて加え、容器をＤＣＭ（７ｇ）ですすいだ。０℃で加熱し、１時間攪拌し、正のＩＰＣを行った後に、混合物に水（２００ｇ）を入れ、室温で加熱した。
一方、水（４０２ｇ）中のＫＨ２ＰＯ４（１３．８ｇ）の溶液は調製された。水層を分離し、生成物を含有する有機層を、ｐＨ７に達するまでＫＨ２ＰＯ４溶液を装填した。水層を分離した後に、有機層を水（２００ｇ）で洗浄した。水層を分離した後に、有機層をポリッシュろ過し、ＡＣＮ（６４ｇ）でフィルタ洗浄した。フマル酸（７．２ｇ、６２ミリモル）を溶液に添加し、白色沈殿物が生じ、これをろ過して、ＡＣＮ（２ｘ３１．５ｇ）で２回洗浄した。窒素流でフィルタ上で乾燥させた後に、４４．５ｇの湿潤した粗製生成物が得られた。これをＴＢＭＥ（２６６．８ｇ）で１時間スラリー化し、ろ過し、ＴＢＭＥ（２ｘ３０ｇ）で２回洗浄した。窒素流下でフィルタ上で乾燥させた後に、４５．０ｇの湿潤生成物が得られた。真空下で６０℃で乾燥して、ＨＭ０４フマル酸塩の白色粉末として乾燥生成物を得た（２５．２ｇ、ＨＰＬＣによる純度９９．６％、収率６８％）。ＸＲＰＤ分析により、生成物は形態１であることが確認された（図１２を参照されたい）。
試験２の方法によるＨＭフマル酸塩のスケールアップ：ＤＣＭ（４１８ｇ）、ＣＤＩ（７０．５ｇ、４３５ミリモル、２当量）及びＤＡＢＣＯ（１２．４ｇ、１１１ミリモル）を、不活性化された２Ｌ反応器に連続的に加えた。混合物を－１０℃に冷却した。別に、ＤＣＭ（４６５ｇ）及び化合物１２（７０．０ｇ、２１７ミリモル）の溶液を容器に入れ、溶液が得られるまで撹拌した。この溶液を、内部温度を－１０～－５℃に保つことにより、２Ｌ反応器に２４分かけて滴下した。添加の最後に、容器をＤＣＭ（２５ｇ）でリンスし、それを次に反応混合物に添加した。一晩（２０時間）攪拌し、正のＩＰＣを行った後に、化合物１０（５５．７ｇ、４３４ミリモル、２当量）を１５分かけて加え、容器をＤＣＭ（２４ｇ）ですすいだ。０℃で加熱し、１．５時間攪拌し、正のＩＰＣを行った後に、混合物に水（７００ｇ）を入れ、室温で加熱した。
一方、ＫＨ２ＰＯ４（４８．３ｇ）の水（１４０１ｇ）中の溶液を調製した。水層を分離し、生成物を含む有機層を、ｐＨ７．０３に達するまでＫＨ２ＰＯ４溶液を装填した。水層を分離した後に、有機層を水（７００ｇ）で洗浄した。水層を分離した後に、有機層をポリッシュろ過し、ＡＣＮ（２２０．５ｇ）でフィルタ洗浄した。フマル酸（２５．３ｇ、２１８ミリモル）を溶液に加え、白色沈殿物を生じさせ、これをろ過し、ＡＣＮ（１１１ｇ）で洗浄した。窒素流でフィルタ上で乾燥させた後に、生成物をＴＢＭＥ（９３３ｇ）で８０分間スラリー化し、ろ過し、ＴＢＭＥ（２ｘ１０４ｇ）で２回洗浄した。窒素流下でフィルタ上で乾燥させた後に、８０．８ｇの湿潤生成物を得た。真空下で６０℃で乾燥して、乾燥生成物をＨＭ０４フマル酸塩の白色粉末として得た（７８．０ｇ、ＨＰＬＣによる純度９９．５％、収率６１％）。ＸＲＰＤ分析により、生成物は形態１であることを確認した（図１３を参照されたい）。
合理化されたＨＭ０４フマル酸塩試験3：ＤＣＭ（１２０ｇ）、ＣＤＩ（２０．２ｇ、１２５ミリモル、２当量）及びＤＡＢＣＯ（３．５ｇ、３１ミリモル）を順次に不活性化された１Ｌ反応器に加えた。混合物を－２０℃に冷却した。別に、ＤＣＭ（１３３ｇ）及び化合物１２（２０．０ｇ、６２．１ミリモル）の溶液を容器に入れ、溶液が得られるまで撹拌した。この溶液を内部温度を－２０～－１５℃に保つことにより１Ｌ反応器に３５分かけて滴下した。添加の最後に、容器をＤＣＭ（７．２ｇ）ですすぎ、次いで、これを反応混合物に加えた。一晩（２４時間）攪拌し、正のＩＰＣを行った後に、化合物１０（１５．９ｇ、１２４ミリモル、２当量）を１０分かけて加え、容器をＤＣＭ（７．０ｇ）ですすいだ。０℃で加熱し、１時間攪拌し、正のＩＰＣを行った後に、混合物に水（２００ｇ）を入れ、室温で加熱した。
一方、ＫＨ２ＰＯ４（１３．７ｇ）の水（４０２ｇ）中の溶液を調製した。水層を分離し、生成物を含む有機層を、ｐＨ７に達するまでＫＨ２ＰＯ４（３１１．１ｇ）溶液で装填した。水層を分離した後に、有機層を水（２００ｇ）で洗浄した。水層を分離した後に、有機層をポリッシュろ過し、ＡＣＮ（６３ｇ）でフィルタ洗浄した。フマル酸（７．２ｇ、６２ミリモル）を溶液に加え、白色沈殿物を生じさせ、それをろ過し、ＡＣＮ（３２ｇ）で洗浄した。窒素流を用いてフィルタ上で乾燥させた後に、５３．７ｇの湿潤した粗製生成物を得た。これをＴＢＭＥ（２６７．０ｇ）で４０分間スラリー化し、ろ過し、ＴＢＭＥ（２ｘ３０ｇ）で２回洗浄した。窒素流下でフィルタ上で乾燥させた後に、４１．８ｇの湿潤生成物を得た。真空下に６０℃で乾燥して、乾燥生成物をＨＭ０４フマル酸塩の白色粉末として得た（２８．１ｇ、ＨＰＬＣによる純度９９．７％、収率７６％）。ＸＲＰＤ分析により、生成物は形態１であることを確認した（図１４を参照されたい）。
例７．ＨＭ０４フマル酸塩形態３の合成
ＨＭ０４遊離塩基（１６．０ｇ、３３．６ミリモル）を、不活性化された１Ｌ反応器内でＡＣＮ（２５１ｇ）に溶解した。６０℃で加熱した後に、フマル酸（３．９ｇ、３３．６ミリモル）及びＡＣＮ（２．６ｇ）を含むリンスを溶液に加え、白色沈殿物を生じさせた。２時間かけて２０℃に冷却した後に、生成物をろ過した。窒素流でフィルタ上で乾燥した後に、６．４ｇの湿潤生成物を得た。真空下で６０℃で乾燥して、乾燥生成物をＨＭ０４フマル酸塩の白色粉末として得た。ＸＲＰＤ分析により、異なる結晶形態である形態３を同定した（図１５を参照されたい）。
例８．ＨＭ０４フマル酸塩形態４の合成
ＤＣＭ（１２０ｇ）、ＣＤＩ（２０．０ｇ、１２３ミリモル、２当量）及びＤＡＢＣＯ（３．５ｇ、３１ミリモル）を、不活性化された１Ｌ反応器に順次に加えた。混合物を－１０℃に冷却した。別に、ＤＣＭ（１３３ｇ）及び化合物１２（２０．０ｇ、６２．１ミリモル）の溶液を容器に入れ、溶液が得られるまで撹拌した。この溶液を、内部温度を－10～－５℃に保つことにより、３５分かけて１Ｌ反応器に滴下した。添加の最後に、容器をＤＣＭ（７．０ｇ）ですすぎ、次にそれを反応混合物に添加した。一晩（１８．５時間）攪拌し、正のＩＰＣを行った後に、化合物１０（１５．８ｇ、１２３ミリモル、２当量）を１０分かけて加え、容器をＤＣＭ（６．８ｇ）ですすいだ。０℃での加熱、１時間の攪拌、正のＩＰＣ及びさらに２０分の攪拌の後に、混合物を室温で加熱し、水（２００ｇ）を入れた。水層を分離し、有機層を１Ｎ ＨＣｌ（２ｘ２００ ｇ）で２回抽出した。生成物を含む合わせた水層をＴＢＭＥ（１４８ｇ）で洗浄した。有機層を除去した後に、ｐＨ９．６６に達するまで水層にＤＣＭ（２６５．０ｇ）及び５０％Ｋ２ＣＯ３溶液（約２４０ｍｌ）を入れた。
一方、ＫＨ２ＰＯ４（８．２ｇ）の水（２４０ｇ）中の溶液を調製した。生成物を含む有機層に、ｐＨ７．１０に達するまでＫＨ２ＰＯ４溶液（１３８．２ｇ）を入れた。水層を分離した後に、有機層を水（２００ｇ）で洗浄した。水層を分離した後に、有機層を４０℃で蒸発させた。ＴＢＭＥ（３７０ｇ）を添加し、１０体積（溶媒２１８．５ｇを収集）が残るまで、真空下に６５℃で再度蒸留した。フマル酸（７．２ｇ、６２ミリモル）を溶液に添加すると、白い沈殿物が生じた。２時間かけて２０℃に冷却しそしてこの温度に１５時間の後に、懸濁液をろ過し、母液を１回再循環させ、生成物をＴＢＭＥ（３３ｇ）で洗浄した。窒素流でフィルタ上で乾燥した後に、湿潤生成物２６．５ｇを得た。真空下で５０～６０℃で乾燥して、ＨＭ０４フマル酸塩の白色粉末として乾燥生成物を得た（２２．３ｇ、ＨＰＬＣによる純度９９．９％、収率６１％）。ＸＲＰＤ分析により、異なる結晶形態である形態４は同定された（図１６を参照されたい）。
例９.ラット及びイヌにおけるＨＭ０４遊離塩基及びＨＭ０４フマル酸塩の経口投与の薬物動態の比較
ＨＭ０４遊離塩基又はＨＭ０４フマル酸塩のいずれかを使用した１０％ＤＭＡＣ、６％Ｓｏｌｕｔｏｌ及び８４％ＰＢＳの溶液内で調合された３ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４（遊離塩基の重量に基づく）の単回経口投与で投与されたオスのスプラーグドーリーラットの血漿中のＨＭ０４の薬物動態を比較した。所定の時間間隔で血液サンプルを採取し、ＨＭ０４の血漿中濃度をＬＣ ＭＳ/ＭＳにより測定した。ＨＭ０４遊離塩基及びＨＭ０４フマル酸塩を経口投与したラットにおける経時的なＨＭ０４の血漿中濃度（ｎｇ/ｍＬ）の比較を図１７に示す。
薬物動態分析の要約を以下の表３に提供する。３ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４遊離塩基のバイオアベイラビリティは、３匹のオスのスプラーグドーリーラットへの３ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４遊離塩基の静脈内投与後に決定された、９９０．３±２４．６ｎｇ＊ｈ/ｍＬの平均ＡＵＣに対する経口平均ＡＵＣの比率から計算された。３ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩でのバイオアベイラビリティ（遊離塩基の重量に基づく）は、３ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）の３匹のオスのスプラーグドーリーラットへの静脈内投与後に決定された、２１０３．３±３５７．７ｎｇ＊ｈ/ｍＬの平均ＡＵＣに対する経口平均ＡＵＣの比率から計算された。
Figure 0007171728000015
ＨＭ０４遊離塩基又はＨＭ０４フマル酸塩のいずれかを使用した１０％ＤＭＡＣ、６％Ｓｏｌｕｔｏｌ及び８４％ＰＢＳの溶液中で調合された２ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４の単回経口投与で投与されたオスのビーグル犬の血漿中のＨＭ０４の薬物動態を比較した。ＨＭ０４遊離塩基及びＨＭ０４フマル酸塩を経口投与したイヌにおける、経時的なＨＭ０４の血漿中濃度（ｎｇ/ｍＬ）の比較を図１８に示す。
薬物動態分析の概要を以下の表４に示す。バイオアベイラビリティは、経口平均ＡＵＣの静脈内平均ＡＵＣに対する用量正規化比（ＡＵＣpo/ＡＵＣivｘDoseiv/Dosepo）から計算された。２ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４遊離塩基でのバイオアベイラビリティは、３匹のオスのビーグル犬に１ｍｇ／ｋｇのＨＭ０４遊離塩基の静脈内投与後に決定された、７８２．１±３６３．５ｎｇ＊ｈ/ｍＬの平均ＡＵＣに対する経口平均ＡＵＣの用量正規化比から計算された。２ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩でのバイオアベイラビリティ（遊離塩基の重量に基づく）は、３匹のオスのビーグル犬に１ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）を静脈内投与した後に決定された、１１２６．１±３６３．６ｎｇ＊ｈ/ｍＬの平均ＡＵＣに対する経口平均ＡＵＣの用量正規化比から計算された。
Figure 0007171728000016
例１０．ラット及びイヌにおけるＨＭ０４フマル酸塩の単回経口送達の薬物動態
６週齢のオスのスプラーグドーリーラット及びオスのビーグル犬（１～５歳）にＨＭ０４フマル酸塩を単回経口投与した後の血漿中のＨＭ０４の薬物動態を調査した。０．６ｍｇ/ｍＬ、２ｍｇ/ｍＬ及び６ｍｇ/ｍＬのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）の試験製剤を５％グルコース溶液中で調製した。３、１０、及び３０ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）の用量を、３つの試験製剤のそれぞれの５ｍＬ/ｋｇ投与量として胃管栄養法により投与した。４匹の動物は各投与群にあった。製剤は、絶食状態のイヌに投与され、投与後３時間に食物を提供した。
経時的なラットにおけるＨＭ０４の血漿中濃度（ｎｇ/ｍＬ）の比較を図１９に示し、薬物動態分析の概要を以下の表５に示す。３ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）の４匹のオスのスプラーグドーリーラットへの静脈内投与後に決定された１７６０±１９６ｎｇ＊ｈ/ｍＬの平均ＡＵＣ（静脈内３ｍｇ/ｋｇ平均ＡＵＣ（ｎ＝４））に対する経口平均ＡＵＣの比率から、３ｍｇ/ｋｇでのバイオアベイラビリティを計算した。１０ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）の４匹のオスのスプラーグドーリーラットへの静脈内投与後に決定された６１７０±１７７０ｎｇ＊ｈ/ｍＬの平均ＡＵＣに対する経口平均ＡＵＣの比率から、１０ｍｇ/ｋｇでのバイオアベイラビリティを計算した。平均経口バイオアベイラビリティに関連する標準偏差は、次の式に従って計算された。
Figure 0007171728000017
ここで、ｑ＝平均バイオアベイラビリティであり、ｍｘ＝経口投与量正規化平均ＡＵＣであり、ｍｙ＝ＩＶ投与量正規化平均ＡＵＣである。
Figure 0007171728000018
ＨＭ０４への暴露は用量とともに増加し、３０ｍｇ/ｋｇで比例増加を超えた。ラットへの３、１０及び３０ｍｇ/ｋｇの単回経口投与後に、ＨＭ０４は４時間以内にそのCmaxに達した。経口投与後に、３及び１０ｍｇ/ｋｇの用量で約４０～５０％のバイオアベイラビリティで化合物は吸収された。
経時的なイヌのＨＭ０４の血漿中濃度（ｎｇ/ｍＬ）の比較を図２０に提供し、薬物動態分析の概要を以下の表６に示す。
Figure 0007171728000019
 BLQ =定量限界未満である。
*投与前濃度を測定した。投与は同じ動物で少なくとも４日間隔で行われた。
**N = 3、イヌ３は異常値として統計から除外された。
３ｍｇ/ｋｇでは、ＨＭ０４の４つの投与前濃度のうち３つは検出可能であった（範囲５．１５～８．３１ｎｇ/ｍＬ）。サンプルを２連で再分析し、陽性と確認した。さらに、１０ｍｇ/ｋｇの経口投与で、イヌ２は検出可能な投与前濃度（８．６０ｎｇ/ｍＬ）を示した。この濃度は２４時間での定量限界を下回っていたため、この濃度は以前の３ｍｇ/ｋｇ用量からの残留濃度である可能性は低い。これらの値は、分析方法の定量化の下限（２．５ｎｇ/ｍＬ）に近く、ゼロ値に置き換えられて計算から除外された。
ＨＭ０４フマル酸塩の単回経口投与では、ＨＭ０４の最大濃度は投与後１時間以内に急速に達した。検出可能な化合物濃度は、２匹を除くすべてのイヌで投与後２４時間まで測定された。最大濃度に達した後に、ＨＭ０４血漿中レベルは低下し、見かけの終末半減期（範囲４～７時間）は、静脈内投与後（範囲４～５時間）の半減期と同様であった。３～３０ｍｇ/ｋｇの経口用量範囲では、Cmaxは用量にほぼ比例して増加したが、ＡＵＣは用量に正比例する場合よりも増加した。ＨＭ０４の経口バイオアベイラビリティは、化合物のクリアランスが低いことと一致して高かった。
３ｍｇ/ｋｇの経口絶対バイオアベイラビリティは、同じ４匹のオスのビーグル犬への３ｍｇ/ｋｇＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）の静脈内投与後に決定された個々のＡＵＣ∞値に対する個々の経口ＡＵＣ∞の比から計算した。以下の個々の経口及び静脈内ＡＵＣ∞値を決定した：イヌ１：それぞれ４９３０及び６１９０ｎｇ＊ｈ/ｍＬ；イヌ２：それぞれ１４４０及び３１００ｎｇ＊ｈ/ｍＬ;イヌ３：それぞれ１１６０及び３２１０ｎｇ＊ｈ/ｍＬ;イヌ４：それぞれ１８５０及び３０７０ｎｇ＊ｈ/ｍＬ。
同じ４匹のオスのビーグル犬への１０ｍｇ/ｋｇのＨＭ０４フマル酸塩（遊離塩基の重量に基づく）の静脈内投与後に決定された個々のAUC∞値に対する個々の経口ＡＵＣ∞の比から、１０ｍｇ/ｋｇでの経口絶対バイオアベイラビリティを計算した。以下の個々の経口及び静脈内ＡＵＣ∞値は決定された。イヌ１：それぞれ１７５００及び２２５００ｎｇ＊ｈ/ｍＬ。イヌ２：それぞれ８７８０及び１３２００ｎｇ＊ｈ/ｍＬ;イヌ３：それぞれ８４７０及び１５５００ｎｇ＊ｈ/ｍＬ;イヌ４：それぞれ１０９００及び１４９００ｎｇ＊ｈ/ｍＬ。
血漿中ＨＭ０４濃度は、９６ウェルプレート形式でのタンパク質沈殿後にＬＣ－ＭＳ/ＭＳで測定した。分析時に、サンプルを周囲温度で解凍した。２５μＬのラット又はイヌＫ３ＥＤＴＡ血漿のアリコートを、３００μＬの内部標準（アセトニトリル中２５ｎｇ/ｍＬのＨＭ０４－ｄ８）とともにスパイクした。５分間穏やかにボルテックス混合し、４℃で２０１０ｇで１５分間遠心分離した後に、P3-Evolutionロボットシステム（Perkin Elmer）を使用して、１００μＬの有機相のアリコートを新しい９６ウェルポリプロピレンプレートに移した。１００μＬの１０ｎＭギ酸アンモニウムｐＨ３．５で希釈した後に、１０μＬのアリコートをＬＣ－ＭＳ/ＭＳシステムに注入した。ＬＣ－ＭＳ/ＭＳ条件を以下の表７に提供する。
Figure 0007171728000020
例１１.グレリン受容体（ＧＨＳＲ１ａ）を用いたＨＭ０４の拮抗薬作用
ＨＭ０４のグレリン受容体ＧＨＳＲ１ａへの結合特性を、蛍光画像形成プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）アッセイでＨＭ０４フマル酸塩を２回使用して調べた。ＨＭ０４は、ＧＨＳＲ１ａに対して有意な拮抗薬活性を示し、ＩＣ５０値は７．３０８ｎＭであった（図２１Ａ）。比較試験は、参照基準ＧＨＳＲ１ａ拮抗薬Ｒ０１１（ＷＯ２００５/０４８９１６、例３０）でも行われた。Ｒ０１１はＧＨＳＲ１ａに対して拮抗薬活性を示し、ＩＣ５０値は３４３ｎＭであった（図２１Ｂ）。
１０μＭまでの濃度のＨＭ０４及びＲ０１１では作動薬活性は観察されなかった（図２１Ｃ及び２１Ｄ）。ＨＭ０４及びＲ０１１はどちらも、イノシトール1リン酸（ＩＰ-１）逆作動薬活性試験で、明らかな有意な逆作動薬活性を示さなかった（図２１Ｅ及び２１Ｆ）。インビトロデータは、ＨＭ０４が作動薬又は明確な逆作動薬活性のない強力なグレリン拮抗薬であることを示唆している。
化合物を１００％ＤＭＳＯで希釈して３０ｍＭ原料を作製した。試験日に、原料溶液から出発して連続希釈液を調製した。ＦＬＩＰＲアッセイでは、１）８μＬのＤＭＳＯを２μＬの化合物原料溶液（３０ｍＭ）に加えて、１０μＬの６ ｍＭ溶液を生成し、６ｍＭ溶液の１／２倍連続希釈液を作成して、１０用量を生成し、２）試験溶液は、原料溶液をアッセイ緩衝液で１／４０に希釈することにより得られた（ＤＭＳＯ濃度２．５％）。ＩＰ-１アッセイでは、１）２９μＬのＤＭＳＯを１μＬの化合物原料溶液（３０ｍＭ）に加えて、３０μＬの１ｍＭ溶液を生成し、１ｍＭ溶液の１／２連続希釈液を作成して、１０用量を生成し、２）試験溶液は、原料溶液をアッセイ緩衝液で１／１００に希釈することにより得られた（ＤＭＳＯ最終濃度１％）。
作動薬及び拮抗薬活性の研究のために、ヒトＧＨＳＲ１ａ受容体を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞を（ＦＬＩＰＲ）アッセイで使用した。試験の前日に１回、細胞を１．５ｘ１０４細胞/ウェルの密度で、完全なＤＭＥＭ培地３０μＬが入ったMatrigel（登録商標）コーティング３８４ウェルプレートに播種し、３７℃で５％ＣＯ２中にて２２～２６時間インキュベートした。試験日に、４ｘ装填色素を各ウェルに加えた（３８４ウェルプレートで、ウェルあたり１０μｌ）。アッセイプレートを３７℃の暗所で３０分間インキュベートした。３００ｒｐｍで３０秒間遠心分離することにより、染料の内容物を除去した。１ｍＭプロベネシドを含むＨＢＳＳ/Ｈｅｐｅｓ（３０μl）を、PlateMate Matrix（低速設定、Thermo Fisher Scientific）で添加した。次に、プレートをＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）に入れ、１０μｌの4×作業濃度のＨＭ０４又はＲ０１１をＦＬＩＰＲ（作動薬モード）で加えた。蛍光信号は、標準設定に従って室温でＦＬＩＰＲを使用して１０分間検知させ、次いで、細胞を１０μｌの５ｘ作動濃度の作動薬（ＦＬＩＰＲによって添加された化合物）に曝露した。その後の３分間で蛍光シグナルが検出された（拮抗薬モード）。
逆作動薬活性試験について、上記と同じ手順を試験当日まで続けた。試験日に、７００ｒｐｍで３０秒間遠心分離することにより培地を除去し、ＨＭ０４又はＲ０１１を含む２０μｌ/ウェルのアッセイ緩衝液を加えた。アッセイプレートを３７℃で暗所で１時間インキュベートした。マルチドロップCombiを使用して、ＩＰ１－ｄ２（５μＬ）及びＡＢ－Ｃｒｙｐ（５μｌ）をすべてのウェルに順次に加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、EnVisionで６２０ｎｍ及び６６５ｎｍで読み取った。
データは相対光単位（ＲＬＵ）として報告し、GraphPad Software Inc.バージョン6を使用して分析した。ＨＭ０４及びＲ０１１について測定した半値抑制濃度（ＩＣ５０）は非線形回帰分析によって計算された。
例１２.ラットにおけるグレリン誘発成長ホルモン増加に及ぼすＨＭ０４フマル酸塩の効果
ラットを４つの群に分けた：１）１ｍｌ/ｋｇ生理食塩水＋１０ｍｌ/ｋｇ０．５％ＣＭＣ経口投与（ｎ＝６）、２）１５μｇ/ｋｇグレリン静脈内＋１０ｍｌ/ｋｇ０．５％ＣＭＣ経口投与（ｎ＝６）、３）３０ｍｇ/ｋｇＨＭ０４フマル酸塩経口投与、２時間後に、１５μｇ/ｋｇグレリン静脈内（ｎ＝６）、４）１０ｍｇ/ｋｇグレリン拮抗薬Ｒ０１１腹腔内、３０分後に、１５μｇ/ｋｇグレリン静脈内（ｎ＝６）。血液は、グレリン注射後の時間０及び１５分に、１００μｌのサンプルとして収集した。ラットを６４．８ｍｇ/ｋｇのペントバルビタールナトリウムで麻酔した。ヘパリン化生理食塩水溶液を満たしたカテーテルを、採血のために左大腿動脈に挿入し、延長チューブ、１ｍＬサンプリングシリンジ及び過剰な血液を戻すことを可能にする３ウェイコックが装着されていた。
成長ホルモン（ＧＨ）の血漿中レベルは、ラットGH ELISA（Millipore,カタログ番号EZRMGH-45K）を使用して決定した。測定は２回行った。台形法を使用して、GH AUC 0～15分を計算した。一元配置及び二元配置分散分析検定を使用して、グループ間の差異を比較した。すべての値は平均±ＳＥＭとして表される。一元配置分散分析を行った後に、トルコ事後検定を行い、p値＜０．０５又はｐ値＜０．０１で有意性が示された。
生理食塩水の注射は、血漿ＧＨのわずかな増加をもたらした。グレリン自体は、注射から１５分後にＧＨの強力な増加を誘発した。１５μｇ/ｋｇのグレリンを静脈内投与した後の平均血漿ＧＨ濃度は、９０～１２０ｎｇ/ｍＬの範囲であった。ＨＭ０４及びＲ０１１の両方は、グレリンによって誘発されるＧＨの増加をそれぞれ３５％及び７８％抑制した。グレリン注射の０分及び１５分後の時点で４つの群のそれぞれについて観察された平均血漿中成長ホルモン濃度を図２２に示す（***ｐ＜０．０１ vsビヒクル、###ｐ＜０．０５（グレリンのみと比較））。
例１３．プラダーウィリーマウスモデルにおけるＨＭ０４フマル酸塩の効果
摂食行動及び耐糖能に及ぼすＨＭ０４フマル酸塩の効果を、野生型（ＷＴ）同腹子と比較したプラダーウィリー症候群（Hetマウス）のSnord116+/-（Het）マウス遺伝モデルで調査した。Ｄ２Ｒ作動薬は食物摂取を抑制するため、ＦＤＡ承認のＤ２Ｒ作動薬であるカベルゴリンを実験対照として使用した。このＰＷＳマウスモデルの表現型の特徴としては、過食症、出生後の成長遅延、高グレリン及び低成長ホルモンが挙げられる。Ding F.らのSnoRNA Snord116（Pwcr1/MBII-85）の削除は、マウスの成長不全及び過食を引き起こす。PloS one. 2008; 3（3）：e1709。これらのＰＷＳマウスは、特に明サイクル中にＷＴの同腹子よりも頻繁に摂食し、また、食物を求めて働く意欲が高まる（より高レベルのプレス）（データは示していない）。
１０ｍｇ/ｋｇ腹腔内（i.p.）で投与されたＨＭ０４は、３、７又は１２ヶ月齢のＷＴマウスの摂食量を減少させなかった（図２５～２７を参照）。ＨＭ０４（１０ｍｇ/ｋｇ、腹腔内）は、３ヶ月齢のHetマウスの投与後１２及び２４時間で食物摂取を抑制した（図２６）。ＨＭ０４（１０ｍｇ/ｋｇ、腹腔内）は、１２ヶ月齢のHetマウスの投与後１時間における摂食量を抑制したが（図２５Ａ）、その抑制レベルは維持されなかった（図２５Ｂ）。３０ｍｇ/ｋｇ、腹腔内で投与されたＨＭ０４は、７か月齢のＨｅｔマウスでは投与後８時間まで食物摂取を抑制したが、ＷＴマウスでは抑制しなかった（図２６）。ＨＭ０４を３０ｍｇ/ｋｇで、8か月齢のＨｅｔマウスに毎日０７．００時に５日間経口投与したところ、体重に影響を与えることなく、食物摂取量を最大２日間減少させた（図３０Ａ及び３０Ｂ）。８ヶ月齢のＨｅｔマウスに対して、暗サイクル中に１８．００時にＨＭ０４を３０ｍｇ/ｋｇで経口投与したときに、２、３、４及び５日目の後続の明サイクル中の食物摂取量は低く、５日目に有意に達した（図３１Ａ）。
食物摂取の効果とは対照的に、ＨＭ０４はＨｅｔマウスにおける耐糖能の改善を示さなかったが、ＷＴマウスでは効果が観察された。これらの結果は、年齢、概日リズム、エネルギー状態及び代謝に関連する要因が薬物動態的応答に影響を与える可能性があるけれども、ＨＭ０４がＰＷＳに関連する過食症を改善する可能性があることを示唆している。
急性投与：マウス（３、７及び１２か月齢）を１６時間絶食させ、次いで、ビヒクル又は下記の表８によるHM04、カベルゴリン又はHM04及びカベルゴリンを含むビヒクルを単回腹腔内注射で投与した。
Figure 0007171728000021
ＨＭ０４を注射用の水に溶解し、カベルゴリンをＤＭＳＯ中に溶解して、注射用の５％ＤＭＳＯ/水溶液を提供した。その後、マウスに自由に食物を摂取させ、投与後１、２、４、８、１２及び２４時間で累積食物摂取量を測定した。ＨｅｔマウスはＷＴ同腹子対照よりも有意に小さいので、摂食量は体重１gあたりの摂取量として表した。二元配置分散分析検定、Bonferroni事後検定（Graphpad Prism,Prism 5.0,San Diego,CA）を使用して、データの有意性を分析した。
７か月齢の群では、ビヒクルで処理したＷＴマウスと比較して、ビヒクルで処理したＨｅｔマウスにおける累積摂食量は有意に向上した。カベルゴリンは両方の遺伝子型で摂食を抑制した。対照的に、ＨＭ０４（１０ｍｇ/ｋｇ）は、ＷＴ又はＨｅｔマウスのいずれでも食物摂取を抑制せず、食物消費に対するカベルゴリンの抑制効果を高めることができなかった（図２３Ａ及び２３Ｂ）。
３か月齢の群では、累積的な食物摂取量は、最初の８時間のビヒクル処理マウスでは有意差はなかった。１２時間後及び２４時間後では、ＨｅｔマウスはＷＴマウスよりも多くの食物を消費していた。ＨＭ０４（１０ｍｇ/ｋｇ）による処理は、Ｈｅｔマウスの投与後１２及び２４時間で食物摂取を有意に抑制した（図２４を参照されたい）。ＨＭ０４は、ＷＴマウスにおける食物摂取を阻害できなかった。
１２か月齢のマウスにおいて、ビヒクル処理したＨｅｔマウスの方がＷＴマウスよりも食物摂取量が有意に多かった。ＨＭ０４（１０ｍｇ/ｋｇ）は、投与後１時間のＨｅｔマウスにおける摂食を抑制したが（図２５Ａ）、しかし、その抑制レベルは維持されなかった（図２５Ｂ）。
３０ｍｇ/ｋｇの高用量でビヒクル又はＨＭ０４を投与した７か月齢のＨｅｔ及びＷＴマウスの群も評価された。ＨＭ０４（３０ｍｇ/ｋｇ）は、ＷＴマウスにおける食物摂取には明らかな影響を与えなかったが、Ｈｅｔマウスでは最大８時間、食物摂取を抑制した（図２６）。
毎日の投与：ＨＭ０４を毎日投与した方が効果的かどうかをテストするために、6か月齢のマウスに１日１回０７．００時に１０日間、ビヒクル又はＨＭ０４を含むビヒクル（１０ｍｇ/ｋｇ腹腔内）を注射し、8か月齢のマウスに、毎日０７．００時又は１８．００時に５日間、ビヒクル又は３０ｍｇ/ｋｇの高用量のＨＭ０４を含むビヒクルを強制経口投与した。以下の表９に要約を示す。食物摂取量及び体重を毎日測定した。
Figure 0007171728000022
生後6か月齢の群では、食物消費は、ビヒクル処理されたＷＴマウス及びＨｅｔマウスで有意差はなかった。ＨＭ０４（１０ｍｇ/ｋｇ腹腔内）による毎日の治療は、ＷＴ及びＨｅｔマウスにおける食物摂取（図２７Ａ）又は体重（図２７Ｂ）に対して明らかな影響を与えなかった。
明サイクルの間の０７．００時に処理された８か月齢の群では、食物摂取量の有意な減少は２日目まで観察されたが、翌日以降には観察されなかった（図２８Ａ）。体重は影響を受けなかった（図２８Ｂ）。ＨＭ０４ ＷＴマウスでは食物摂取量又は体重の減少は観察されなかった（図２８Ａ及び２８Ｂ）。
暗サイクルの間の１８．００時に処理された8か月齢の群では、食物摂取量を明サイクル及び暗サイクルの両方で測定した。暗サイクルの初めにマウスをＨＭ０４で処理したにもかかわらず、ＷＴマウス又はＨｅｔマウスのいずれにおいても、暗サイクル中に食物消費の抑制は観察されなかった（図２９Ｂ）。次の明サイクル（０６．００～１８．００）の間に、２、３、４及び５日目にはＨＭ０４処理のＨｅｔマウスで食物摂取量は低下したが、ＷＴマウスでは低下せず、５日目に有意に達した（図２９Ａ）。
上述の明細書は、当業者が実施形態を実施できるようにするのに十分であると考えられる。上述の記載及び実施例は、特定の実施形態を詳述し、発明者らによって企図された最良の形態を記載している。しかしながら、上述の内容がいかに詳細にテキストに現れても、実施形態は多くの方法で実施されることができ、添付の特許請求の範囲及びその均等形態に従って解釈されるべきであることが理解される。
本明細書で使用するときに、約という用語は、明示的に示されているかどうかにかかわらず、例えば、整数、分数及び百分率を含む数値を指す。約という用語は、当業者が列挙された値と同等であると考える（例えば、同じ機能又は結果を有する）数値の範囲（例えば、列挙された範囲の＋/－５～１０％）を指す。少なくとも及び約などの用語が数値又は範囲のリストの前にあるときに、その用語は、リストに提供されているすべての値又は範囲を修飾する。幾つかの場合において、約という用語には、最も近い有効数字に端数処理された数値が含まれることができる。

Claims (33)

  1. （R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアフマル酸塩。
  2. 前記塩は１：１の（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレア：フマル酸の塩である、請求項１記載の塩。
  3. 前記塩は少なくとも５０％が結晶形態である、請求項１又は２のいずれか１項記載の塩。
  4. 前記塩は少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が結晶形態である、請求項１～３のいずれか１項記載の塩。
  5. ＣｕＫα線を使用するＸＲＰＤによって決定される図１２のＸＲＰＤパターンを特徴とする形態１を含む、請求項１～４のいずれか１項記載の塩。
    Figure 0007171728000023
  6. ＣｕＫα線を使用するＸＲＰＤによって決定される図３のＸＲＰＤパターンを特徴とする形態２を含む、請求項１～４のいずれか１項記載の塩。
    Figure 0007171728000024
  7. ＣｕＫα線を使用するＸＲＰＤによって決定される図１５のＸＲＰＤパターンを特徴とする形態３を含む、請求項１～４のいずれか１項記載の塩。
    Figure 0007171728000025
  8. ＣｕＫα線を使用するＸＲＰＤによって決定される図１６のＸＲＰＤパターンを特徴とする形態４を含む、請求項１～４のいずれか１項記載の塩。
    Figure 0007171728000026
  9. ７．８±０．２、９．５±０．２、１４．３±０．２、１６．７±０．２、１７．２±０．２、１８．５±０．２、１８．８±０．２、１９．３±０．２、２０．０±０．２、２０．７±０．２、２２．４±０．２、２３．２±０．２、２５．６±０．２、２７．２±０．２、３１．７±０．２及び３２．４±０．２度の２θにピークを含む、ＣｕＫα線を使用する、ＸＲＰＤパターンを特徴とする形態１を含む、請求項１～４のいずれか１項記載の塩。
  10. ７．２±０．２、９．４±０．２、９．７±０．２、１０．８±０．２、１４．３±０．２、１５．１±０．２、１６．２±０．２、１７．９±０．２、１８．７±０．２、１８．９±０．２、１９．６±０．２、２１．５±０．２、２２．７±０．２、２３．７±０．２、２４．３±０．２、２５．１±０．２、２７．４±０．２、２８．７±０．２及び３４．９±０．２度の２θにピークを含む、ＣｕＫα線を使用するＸＲＰＤパターンを特徴とする形態３を含む、請求項１～４のいずれか１項記載の塩。
  11. １２．２±０．２、１３．２±０．２、１５．０±０．２、１５．４±０．２、１７．６±０．２、１８．１±０．２、１９．５±０．２、２０．２±０．２、２０．９±０．２、２１．４±０．２、２３．０±０．２、２３．４±０．２、２４．４±０．２、２４．８±０．２、２５．９±０．２、２７．９±０．２、２８．９±０．２、２９．６±０．２及び３０．７±０．２度の２θにピークを含む、ＣｕＫα線を使用するＸＲＰＤパターンを特徴とする形態４を含む、請求項１～４のいずれか１項記載の塩。
  12. ＣｕＫα線を使用するＸＲＰＤによって決定される図１ＡのＸＲＰＤパターンを特徴とする結晶性化合物である（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレア。
    Figure 0007171728000027
  13. 請求項１～１１のいずれか１項記載の塩又は請求項１２記載の結晶性化合物を含む医薬品。
  14. 請求項１～１１のいずれか１項記載の塩又は請求項１２記載の結晶性化合物及び医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
  15. （R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアをフマル酸と混合させることを含む、請求項１～１１のいずれか１項記載の塩を調製する方法。
  16. フマル酸と混合させるときに、（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアは固体形態である、請求項１５記載の方法。
  17. フマル酸と混合させるときに、（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアは溶液中である、請求項１５記載の方法。
  18. フマル酸と混合させる前に、（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアは酸/塩基抽出される、請求項１５～１７のいずれか１項記載の方法。
  19. フマル酸と混合させる前に、（R）-3-（1-（2,3-ジクロロ-4-（ピラジン-2-イル）フェニル）-2,2,2-トリフルオロエチル）-1-メチル-1-（1-メチルピペリジン-4-イル）ウレアは酸/塩基抽出されない、請求項１５～１７のいずれか１項記載の方法。
  20. 細胞におけるグレリンシグナル伝達活性を低下させるための、請求項１～１１のいずれか１項記載の塩又は請求項１２記載の結晶性化合物を含む医薬組成物。
  21. 前記細胞がインビトロで前記塩又は結晶性化合物に曝露される、請求項２０記載の医薬組成物。
  22. 前記グレリンシグナル伝達活性は、蛍光画像形成プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）アッセイによって検出される細胞内カルシウムのレベルによって測定される、請求項２０又は請求項２１記載の医薬組成物。
  23. 前記細胞内カルシウムのレベルは低減される、請求項２２記載の医薬組成物。
  24. 対象におけるグレリンシグナル伝達活性を低下させるための、請求項１～１１のいずれか１項記載の塩又は請求項１２記載の結晶性化合物を含む医薬組成物。
  25. グレリンレベルの増加に関連する状態又は障害を有する対象を治療するための、請求項１～１１のいずれか１項記載の塩又は請求項１２記載の結晶性化合物を含む医薬組成物。
  26. 前記状態又は障害は食物乱用、アルコール依存症及びプラダーウィリー症候群から選ばれる、請求項２５記載の医薬組成物。
  27. 前記状態又は障害は過食症、肥満、ダイエット後の体重リバウンド及び食欲亢進から選ばれる、請求項２５又は請求項２６記載の医薬組成物。
  28. 前記対象に経口投与される、請求項２４～２７のいずれか１項記載の医薬組成物。
  29. 前記対象の成長ホルモンの循環レベルは調節される、請求項２４～２８のいずれか１項記載の医薬組成物。
  30. 前記対象の成長ホルモンの循環レベルは低減される、請求項２４～２９のいずれか１項記載の医薬組成物。
  31. 前記対象の食物摂取量は低減される、請求項２４～３０のいずれか１項記載の医薬組成物。
  32. 前記対象の体重は低減される、請求項２４～３１のいずれか１項記載の医薬組成物。
  33. 前記対象の体重は安定している、請求項２４～３１のいずれか１項記載の医薬組成物。
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