KR20200097762A - (r)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일) 우레아의 푸마레이트 염, 그의 제조 방법, 및 용도 - Google Patents
(r)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일) 우레아의 푸마레이트 염, 그의 제조 방법, 및 용도 Download PDFInfo
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Abstract
(R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일) 우레아의 푸마레이트 염, 및 그를 제조하는 방법, 및 그렐린 수준의 증가와 연관된 병태 및 장애, 예컨대 음식물 남용, 알콜 중독, 및 다른 장애 (예를 들어, 프라더-윌리 증후군)를 치료하는데 그를 사용하는 방법에 관한 다양한 실시양태가 제공된다. 또한, 결정질 HM04 유리 염기, HM04 푸마레이트 염의 다양한 결정질 형태, 및 그를 제조하는 방법에 관한 다양한 실시양태가 제공된다.
Description
본 출원은 2017년 12월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 62/597,236의 이익을 청구하며, 이 가출원은 임의의 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 개시내용은 그렐린 수준의 불균형과 연관된 질환, 예컨대 폭식, 알콜 중독, 및 다른 장애 (예를 들어, 프라더-윌리 증후군)의 치료에 유용한, 강력한 그렐린/성장 호르몬 분비촉진제 수용체 (GHS-R1a) 길항제인 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일) 우레아 (HM04 또는 H0900으로도 지칭됨)의 푸마레이트 염에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 결정질 HM04 유리 염기, HM04 푸마레이트 염의 다양한 결정질 형태, 및 그를 제조하는 방법에 관한 것이다.
위장관에서 그렐린 세포에 의해 생산되는 성장 호르몬-방출 펩티드인, 그렐린은 식욕을 자극함으로써 에너지 대사를 조절하는 뉴로펩티드로서 기능하는 것으로 이해된다. 그렐린/성장 호르몬 분비촉진제 수용체 (GHS-R1a)를 통한 그렐린 신호전달의 조정, 예를 들어 억제는 높은 그렐린 수준과 연관된 장애의 약리학적 치료를 위한 매력적인 표적이다. 그렐린 조정제를 사용하는 치료에 대한 잠재적 장애는 음식물 남용 (예컨대 폭식, 비만, 과식증 (또는 제어불가능한 식욕), 다이어트-후 체중 반등 (다이어트-후 과식증 포함)), 알콜 중독, 및 증가된 그렐린 수준과 연관된 유전 질환 (예를 들어, 프라더-윌리 증후군 (PWS))을 포함한다.
PWS는 대략적으로 10,000명의 출생 중 1명에서 발생하고, 부계 염색체 15번의 15q11.2 영역의 발현의 결실 또는 결함과 연관된다. PWS의 특징은 저신장, 근긴장도 저하 및 과식증을 포함한다. 성장 호르몬 대체법이 성장 결핍증 및 저긴장증을 치료하는데 빈번하게 사용된다. 그러나, 만족시킬 수 없는 식욕에 대한 치료법은 없으며, PWS 소아는 비만 및 제2형 당뇨병을 앓는 성인이 될 수 있다. 일반적으로 PWS에서 그렐린의 수준이 상승되지만; 그러나, PWS에서의 그렐린 신호전달 및 음식물 섭취와의 관계는 아직 불분명하다. 문헌 [Purtell L., et al., In adults with Prader-Willi syndrome, elevated ghrelin levels are more consistent with hyperphagia than high PYY and GLP-1 levels. Neuropeptides. 2011;45(4):301-7; Cummings D.E., et al., Elevated plasma ghrelin levels in Prader Willi syndrome. Nature Medicine. 2002;8(7):643-4; DelParigi A., et al., High circulating ghrelin: a potential cause for hyperphagia and obesity in Prader-Willi syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2002;87(12):5461-4]을 참조한다.
따라서, GHSR1a를 효과적으로 억제하고, 환자에게서 내약성을 가지며, 성장 호르몬의 다른 기능을 방해하지 않는 치료법을 찾는 것이 바람직하다. 하기 도시된 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일) 우레아 (HM04, H0900)와 같은 억제제를 포함한, GHSR1a 조정제가 미국 특허 번호 9,546,157에 보고되어 있다.
그러나, 그의 안정한 염 형태 및 결정질 형태는 상기 특허에 개시되지 않았다.
실시양태 1. (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아 푸마레이트 염.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 1:1 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아:푸마레이트 염인 염.
실시양태 3. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 염의 적어도 50%가 결정질 형태인 염.
실시양태 4. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 염의 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%가 결정질 형태인 염.
실시양태 5. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 형태 1, 형태 2, 형태 3, 및 형태 4로부터 선택된 적어도 1종의 결정질 형태를 포함하는 염.
실시양태 6. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD에 의해 결정 시 도 12의 XRPD 패턴과 실질적으로 유사한 XRPD 패턴을 갖는 형태 1을 포함하는 염.
실시양태 7. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD에 의해 결정 시 도 3의 XRPD 패턴과 실질적으로 유사한 XRPD 패턴을 특징으로 하는 형태 2를 포함하는 염.
실시양태 8. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD에 의해 결정 시 도 15의 XRPD 패턴과 실질적으로 유사한 XRPD 패턴을 특징으로 하는 형태 3을 포함하는 염.
실시양태 9. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD에 의해 결정 시 도 16의 XRPD 패턴과 실질적으로 유사한 XRPD 패턴을 특징으로 하는 형태 4를 포함하는 염.
실시양태 10. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 7.8 ± 0.2, 9.5 ± 0.2, 14.3 ± 0.2, 16.7 ± 0.2, 17.2 ± 0.2, 18.5 ± 0.2, 18.8 ± 0.2, 19.3 ± 0.2, 20.0 ± 0.2, 20.7 ± 0.2, 22.4 ± 0.2, 23.2 ± 0.2, 25.6 ± 0.2, 27.2 ± 0.2, 31.7 ± 0.2, 및 32.4 ± 0.2도 2 세타에서의 피크를 포함하는, Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD 패턴을 특징으로 하는 형태 1을 포함하는 염.
실시양태 11. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 7.2 ± 0.2, 9.4 ± 0.2, 9.7 ± 0.2, 10.8 ± 0.2, 14.3 ± 0.2, 15.1 ± 0.2, 16.2 ± 0.2, 17.9 ± 0.2, 18.7 ± 0.2, 18.9 ± 0.2, 19.6 ± 0.2, 21.5 ± 0.2, 22.7 ± 0.2, 23.7 ± 0.2, 24.3 ± 0.2, 25.1 ± 0.2, 27.4 ± 0.2, 28.7 ± 0.2, 및 34.9 ± 0.2도 2 세타에서의 피크를 포함하는, Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD 패턴을 특징으로 하는 형태 3을 포함하는 염.
실시양태 12. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 12.2 ± 0.2, 13.2 ± 0.2, 15.0 ± 0.2, 15.4 ± 0.2, 17.6 ± 0.2, 18.1 ± 0.2, 19.5 ± 0.2, 20.2 ± 0.2, 20.9 ± 0.2, 21.4 ± 0.2, 23.0 ± 0.2, 23.4 ± 0.2, 24.4 ± 0.2, 24.8 ± 0.2, 25.9 ± 0.2, 27.9 ± 0.2, 28.9 ± 0.2, 29.6 ± 0.2, 30.7 ± 0.2도 2 세타에서의 피크를 포함하는, Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD 패턴을 특징으로 하는 형태 4를 포함하는 염.
실시양태 13. Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD에 의해 결정 시 도 1a의 XRPD 패턴과 실질적으로 유사한 XRPD 패턴을 갖는 결정질 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아.
실시양태 14. 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 염 또는 실시양태 13의 결정질 화합물을 포함하는 약물 제품.
실시양태 15. 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 염 또는 실시양태 13의 결정질 화합물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
실시양태 16. (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아를 푸마르산과 조합하는 것을 포함하는, 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 염을 제조하는 방법.
실시양태 17. 실시양태 16에 있어서, (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아가 푸마르산과 조합될 때 고체 형태로 존재하는 것인 방법.
실시양태 18. 실시양태 16에 있어서, (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아가 푸마르산과 조합될 때 용액으로 존재하는 것인 방법.
실시양태 19. 실시양태 16 내지 18 중 어느 하나에 있어서, (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아가 푸마르산과 조합되기 전에 산/염기 추출에 적용되는 것인 방법.
실시양태 20. 실시양태 16 내지 18 중 어느 하나에 있어서, (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아가 푸마르산과 조합되기 전에 산/염기 추출에 적용되지 않는 것인 방법.
실시양태 21. 세포를 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 염, 실시양태 13의 결정질 화합물, 실시양태 14의 약물 제품, 또는 실시양태 15의 조성물에 노출시키는 것을 포함하는, 세포에서의 그렐린 신호전달 활성을 감소시키는 방법.
실시양태 22. 실시양태 21에 있어서, 세포가 시험관내에서 염, 결정질 화합물, 약물 제품, 또는 조성물에 노출되는 것인 방법.
실시양태 23. 실시양태 21 또는 실시양태 22에 있어서, 그렐린 신호전달 활성이 형광 영상화 플레이트 판독기 (FLIPR) 검정에 의해 검출된 바와 같은 세포내 칼슘 수준에 의해 측정되는 것인 방법.
실시양태 24. 실시양태 23에 있어서, 세포내 칼슘 수준이 감소되는 것인 방법.
실시양태 25. 대상체에게 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 염, 실시양태 13의 결정질 화합물, 실시양태 14의 약물 제품, 또는 실시양태 15의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서의 그렐린 신호전달 활성을 감소시키는 방법.
실시양태 26. 대상체에게 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 염, 실시양태 13의 결정질 화합물, 실시양태 14의 약물 제품, 또는 실시양태 15의 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 그렐린 수준의 증가와 연관된 병태 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법.
실시양태 27. 실시양태 26에 있어서, 병태 또는 장애가 음식물 남용, 알콜 중독, 및 프라더-윌리 증후군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 28. 실시양태 26 또는 실시양태 27에 있어서, 병태 또는 장애가 폭식, 비만, 다이어트-후 체중 반등, 및 과식증으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 29. 실시양태 25 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 염, 결정질 화합물, 약물 제품, 또는 조성물을 대상체에게 경구로 투여하는 것을 포함하는 방법.
실시양태 30. 실시양태 25 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 대상체의 순환 성장 호르몬 수준이 조정되는 것인 방법.
실시양태 31. 실시양태 25 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 대상체의 순환 성장 호르몬 수준이 감소되는 것인 방법.
실시양태 32. 실시양태 25 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 대상체의 음식물 섭취가 감소되는 것인 방법.
실시양태 33. 실시양태 25 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 대상체의 체중이 감소되는 것인 방법.
실시양태 34. 실시양태 25 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 대상체의 체중이 안정화되는 것인 방법.
추가의 목적 및 이점이 부분적으로 하기 상세한 설명에 제시될 것이며, 부분적으로 상세한 설명으로부터 명백할 것이거나, 또는 실시를 통해 알게 될 수 있다. 목적 및 이점은 첨부된 청구범위에 구체적으로 지시된 요소 및 조합에 의해 실현되고 달성될 것이다.
상기 일반적 설명 및 하기 상세한 설명은 모두 단지 예시적이고 설명적이며, 청구범위를 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 포함되며 그의 부분을 구성하는, 첨부 도면은 하나의 (여러) 실시양태(들)를 예시하고, 상세한 설명과 함께 본원에 기재된 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1a 및 도 1b (하단 패널)는 실시예 1A에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 유리 염기 결정질 형태 1의 대표 XRPD 프로파일을 제시한다.
도 1b (상단 패널)는 실시예 1B에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 유리 염기 결정질 형태 1의 대표 XRPD 프로파일을 제시한다.
도 1c는 실시예 2에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 1의 대표 XRPD 프로파일을 제시한다.
도 2는 실시예 3에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 1의 대표 XRPD 프로파일을 제시한다.
도 3은 실시예 3에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 2의 대표 XRPD 프로파일을 제시한다.
도 4a는 50:50의 비로 HM04 푸마레이트 염 형태 1 및 2를 아세토니트릴:물 (95:5) 중에서 48시간 동안 60℃에서 혼합한 후에 관찰된 XRPD 프로파일을 제시한다.
도 4b는 50:50의 비로 HM04 푸마레이트 염 형태 1 및 2를 에탄올 중에서 48시간 동안 60℃에서 혼합한 후에 관찰된 XRPD 프로파일을 제시한다.
도 5는 HM04 푸마레이트 염 형태 1의 스케일업 합성 방법의 개관을 제공하며, 이는 실시예 5에 더욱 상세히 기재되어 있다.
도 6은 실시예 5에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 1 (6시간 동안 60℃에서 건조시킨 후)의 대표 XRPD 프로파일을 제시한다.
도 7은 실시예 5에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 1 (15시간 동안 60℃에서 건조시킨 후)의 대표 XRPD 프로파일을 제시한다.
도 8은 실시예 5에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 1 (72시간 동안 60℃에서 건조시킨 후)의 대표 XRPD 프로파일을 제시한다.
도 9는 실시예 5에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 1 (18시간 동안 65℃에서 건조시킨 후)의 대표 XRPD 프로파일을 제시한다.
도 10은 HM04 푸마레이트 염 형태 1의 능률적 합성 방법의 개관을 제공하며, 이는 실시예 6에 더욱 상세히 기재되어 있다.
도 11은 실시예 6, 시행 1에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 1의 대표 XRPD 프로파일을 제공한다.
도 12는 실시예 6, 시행 2에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 1의 대표 XRPD 프로파일을 제공한다.
도 13은 시행 2의 방법에 의해 스케일업된, 실시예 6에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 1의 대표 XRPD 프로파일을 제공한다.
도 14는 실시예 6, 시행 3에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 1의 대표 XRPD 프로파일을 제공한다.
도 15는 실시예 7에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 3의 대표 XRPD 프로파일을 제공한다.
도 16은 실시예 8에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 4의 대표 XRPD 프로파일을 제공한다.
도 17은 3 mg/kg HM04 유리 염기 및 3 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준)을 경구로 투약받은 래트에서의 시간 경과에 따른 HM04의 혈장 농도 (ng/mL)의 비교를 제공한다.
도 18은 2 mg/kg HM04 유리 염기 및 2 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준)을 경구로 투약받은 개에서의 시간 경과에 따른 HM04의 혈장 농도 (ng/mL)의 비교를 제공한다.
도 19는 3, 10, 및 30 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준)을 경구로 투약한 후 시간 경과에 따른 래트에서의 HM04의 혈장 농도 (ng/mL)의 비교를 제공한다.
도 20은 3, 10, 및 30 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준)을 경구로 투약한 후 시간 경과에 따른 개에서의 HM04의 혈장 농도 (ng/mL)의 비교를 제공한다.
도 21a는 인간 GHSR1a 수용체를 발현하는 HEK293 세포를 사용한 길항제 형광 영상화 플레이트 판독기 (FLIPR) 검정에서의 HM04의 농도-반응 곡선을 제시한다.
도 21b는 인간 GHSR1a 수용체를 발현하는 HEK293 세포를 사용한 길항제 FLIPR 검정에서의 R011의 농도-반응 곡선을 제시한다.
도 21c는 인간 GHSR1a 수용체를 발현하는 HEK293 세포를 사용한 효능제 FLIPR 검정에서의 HM04의 농도-반응 곡선을 제시한다.
도 21d는 인간 GHSR1a 수용체를 발현하는 HEK293 세포를 사용한 효능제 FLIPR 검정에서의 R011의 농도-반응 곡선을 제시한다.
도 21e는 이노시톨 1 포스페이트 (IP-1) 역 효능제 검정에서의 HM04의 농도-반응 곡선을 제시한다.
도 21f는 이노시톨 1 포스페이트 (IP-1) 역 효능제 검정에서의 R011의 농도-반응 곡선을 제시한다.
도 22는 하기 4개의 처리 그룹에서 그렐린 주사 이후 0 및 15분의 시점에 래트에서 관찰된 평균 혈장 성장 호르몬 농도를 제시한다: 1) 1 ml/kg 염수 + 10 ml/kg 0.5% CMC p.o. (n=6); 2) 15 μg/kg 그렐린 i.v. + 10 ml/kg 0.5% CMC p.o. (n=6); 3) 15 μg/kg 그렐린 i.v.보다 2시간 전에 30 mg/kg HM04 푸마레이트 염 p.o. (n=6); 4) 15 μg/kg 그렐린 i.v.보다 30분 전에 10 mg/kg 그렐린 길항제 R011 i.p. (n=6).
도 23a는 1) 비히클 (n=6); 2) 10 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) (n=6); 3) 0.5 mg/kg 카베르골린 (n=6); 또는 4) 10 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) + 0.5 mg/kg 카베르골린 (n=6)의 단일 복강내 투여 후 1시간에 측정된 7-월령 Snord116+/- (Het) 마우스 및 7-월령 야생형 (WT) 한배새끼에서의 음식물 섭취를 제시한다. 마우스는 주사 전에 16시간 동안 공복 상태였고 주사 후에는 음식물에의 자유로운 접근이 허용되었다.
도 23b는 1) 비히클 (n=6); 2) 10 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) (n=6); 3) 0.5 mg/kg 카베르골린 (n=6); 또는 4) 10 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) + 0.5 mg/kg 카베르골린 (n=6)의 단일 복강내 투여 후 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 및 24시간에 측정된 7-월령 Snord116+/- (Het) 마우스 및 7-월령 야생형 (WT) 한배새끼에서의 음식물 섭취를 제시한다. 마우스는 주사 전에 16시간 동안 공복 상태였다.
도 24는 1) 비히클 (n=6) 또는 2) 10 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) (n=6)의 단일 복강내 투여 후 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 및 24시간에 측정된 3-월령 Snord116+/- (Het) 마우스 및 3-월령 야생형 (WT) 한배새끼에서의 음식물 섭취를 제시한다. 마우스는 주사 전에 16시간 동안 공복 상태였고 주사 후에는 음식물에의 자유로운 접근이 허용되었다.
도 25a는 1) 비히클 (Het n=4; WT n=6) 또는 2) 10 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) (Het n=4; WT n=6)의 단일 복강내 투여 후 1시간에 측정된 12-월령 Snord116+/- (Het) 마우스 및 12-월령 야생형 (WT) 한배새끼에서의 음식물 섭취를 제시한다. 마우스는 주사 전에 16시간 동안 공복 상태였고 주사 후에는 음식물에의 자유로운 접근이 허용되었다.
도 25b는 1) 비히클 (Het n=4; WT n=6) 또는 2) 10 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) (Het n=4; WT n=6)의 단일 복강내 투여 후 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 및 24시간에 측정된 12-월령 Snord116+/- (Het) 마우스 및 12-월령 야생형 (WT) 한배새끼에서의 음식물 섭취를 제시한다. 마우스는 주사 전에 16시간 동안 공복 상태였고 주사 후에는 음식물에의 자유로운 접근이 허용되었다.
도 26은 1) 비히클 (n=5) 또는 2) 30 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) (n=5)의 단일 복강내 투여 후 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 및 24시간에 측정된 7-월령 Snord116+/- (Het) 마우스 및 7-월령 야생형 (WT) 한배새끼에서의 음식물 섭취를 제시한다. 마우스는 주사 전에 16시간 동안 공복 상태였고 주사 후에는 음식물에의 자유로운 접근이 허용되었다.
도 27a는 1) 비히클 (n=10) 또는 2) 10 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) (n=10)의 연속 10일 07.00시의 복강내 투여 후에 매일 측정된 6-월령 Snord116+/- (Het) 마우스 및 6-월령 야생형 (WT) 한배새끼의 음식물 섭취를 제시하고, 도 27b는 그의 체중을 제시한다.
도 28a는 1) 비히클 (n=5) 또는 2) 30 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) (n=5)의 연속 5일 07.00시의 경구 투여 후에 매일 측정된 8-월령 Snord116+/- (Het) 마우스 및 8-월령 야생형 (WT) 한배새끼의 음식물 섭취를 제시하고, 도 28b는 그의 체중을 제시한다.
도 29a는 1) 비히클 (n=5) 또는 2) 30 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) (n=5)의 연속 5일 18.00시의 경구 투여 후에 매일 측정된 8-월령 Snord116+/- (Het) 마우스 및 8-월령 야생형 (WT) 한배새끼의 명주기 동안의 음식물 섭취를 제시하고, 도 29b는 그의 암주기 동안의 음식물 섭취를 제시한다.
도 1b (상단 패널)는 실시예 1B에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 유리 염기 결정질 형태 1의 대표 XRPD 프로파일을 제시한다.
도 1c는 실시예 2에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 1의 대표 XRPD 프로파일을 제시한다.
도 2는 실시예 3에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 1의 대표 XRPD 프로파일을 제시한다.
도 3은 실시예 3에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 2의 대표 XRPD 프로파일을 제시한다.
도 4a는 50:50의 비로 HM04 푸마레이트 염 형태 1 및 2를 아세토니트릴:물 (95:5) 중에서 48시간 동안 60℃에서 혼합한 후에 관찰된 XRPD 프로파일을 제시한다.
도 4b는 50:50의 비로 HM04 푸마레이트 염 형태 1 및 2를 에탄올 중에서 48시간 동안 60℃에서 혼합한 후에 관찰된 XRPD 프로파일을 제시한다.
도 5는 HM04 푸마레이트 염 형태 1의 스케일업 합성 방법의 개관을 제공하며, 이는 실시예 5에 더욱 상세히 기재되어 있다.
도 6은 실시예 5에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 1 (6시간 동안 60℃에서 건조시킨 후)의 대표 XRPD 프로파일을 제시한다.
도 7은 실시예 5에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 1 (15시간 동안 60℃에서 건조시킨 후)의 대표 XRPD 프로파일을 제시한다.
도 8은 실시예 5에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 1 (72시간 동안 60℃에서 건조시킨 후)의 대표 XRPD 프로파일을 제시한다.
도 9는 실시예 5에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 1 (18시간 동안 65℃에서 건조시킨 후)의 대표 XRPD 프로파일을 제시한다.
도 10은 HM04 푸마레이트 염 형태 1의 능률적 합성 방법의 개관을 제공하며, 이는 실시예 6에 더욱 상세히 기재되어 있다.
도 11은 실시예 6, 시행 1에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 1의 대표 XRPD 프로파일을 제공한다.
도 12는 실시예 6, 시행 2에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 1의 대표 XRPD 프로파일을 제공한다.
도 13은 시행 2의 방법에 의해 스케일업된, 실시예 6에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 1의 대표 XRPD 프로파일을 제공한다.
도 14는 실시예 6, 시행 3에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 1의 대표 XRPD 프로파일을 제공한다.
도 15는 실시예 7에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 3의 대표 XRPD 프로파일을 제공한다.
도 16은 실시예 8에 제시된 바와 같이 제조된 HM04 푸마레이트 염 결정질 형태 4의 대표 XRPD 프로파일을 제공한다.
도 17은 3 mg/kg HM04 유리 염기 및 3 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준)을 경구로 투약받은 래트에서의 시간 경과에 따른 HM04의 혈장 농도 (ng/mL)의 비교를 제공한다.
도 18은 2 mg/kg HM04 유리 염기 및 2 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준)을 경구로 투약받은 개에서의 시간 경과에 따른 HM04의 혈장 농도 (ng/mL)의 비교를 제공한다.
도 19는 3, 10, 및 30 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준)을 경구로 투약한 후 시간 경과에 따른 래트에서의 HM04의 혈장 농도 (ng/mL)의 비교를 제공한다.
도 20은 3, 10, 및 30 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준)을 경구로 투약한 후 시간 경과에 따른 개에서의 HM04의 혈장 농도 (ng/mL)의 비교를 제공한다.
도 21a는 인간 GHSR1a 수용체를 발현하는 HEK293 세포를 사용한 길항제 형광 영상화 플레이트 판독기 (FLIPR) 검정에서의 HM04의 농도-반응 곡선을 제시한다.
도 21b는 인간 GHSR1a 수용체를 발현하는 HEK293 세포를 사용한 길항제 FLIPR 검정에서의 R011의 농도-반응 곡선을 제시한다.
도 21c는 인간 GHSR1a 수용체를 발현하는 HEK293 세포를 사용한 효능제 FLIPR 검정에서의 HM04의 농도-반응 곡선을 제시한다.
도 21d는 인간 GHSR1a 수용체를 발현하는 HEK293 세포를 사용한 효능제 FLIPR 검정에서의 R011의 농도-반응 곡선을 제시한다.
도 21e는 이노시톨 1 포스페이트 (IP-1) 역 효능제 검정에서의 HM04의 농도-반응 곡선을 제시한다.
도 21f는 이노시톨 1 포스페이트 (IP-1) 역 효능제 검정에서의 R011의 농도-반응 곡선을 제시한다.
도 22는 하기 4개의 처리 그룹에서 그렐린 주사 이후 0 및 15분의 시점에 래트에서 관찰된 평균 혈장 성장 호르몬 농도를 제시한다: 1) 1 ml/kg 염수 + 10 ml/kg 0.5% CMC p.o. (n=6); 2) 15 μg/kg 그렐린 i.v. + 10 ml/kg 0.5% CMC p.o. (n=6); 3) 15 μg/kg 그렐린 i.v.보다 2시간 전에 30 mg/kg HM04 푸마레이트 염 p.o. (n=6); 4) 15 μg/kg 그렐린 i.v.보다 30분 전에 10 mg/kg 그렐린 길항제 R011 i.p. (n=6).
도 23a는 1) 비히클 (n=6); 2) 10 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) (n=6); 3) 0.5 mg/kg 카베르골린 (n=6); 또는 4) 10 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) + 0.5 mg/kg 카베르골린 (n=6)의 단일 복강내 투여 후 1시간에 측정된 7-월령 Snord116+/- (Het) 마우스 및 7-월령 야생형 (WT) 한배새끼에서의 음식물 섭취를 제시한다. 마우스는 주사 전에 16시간 동안 공복 상태였고 주사 후에는 음식물에의 자유로운 접근이 허용되었다.
도 23b는 1) 비히클 (n=6); 2) 10 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) (n=6); 3) 0.5 mg/kg 카베르골린 (n=6); 또는 4) 10 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) + 0.5 mg/kg 카베르골린 (n=6)의 단일 복강내 투여 후 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 및 24시간에 측정된 7-월령 Snord116+/- (Het) 마우스 및 7-월령 야생형 (WT) 한배새끼에서의 음식물 섭취를 제시한다. 마우스는 주사 전에 16시간 동안 공복 상태였다.
도 24는 1) 비히클 (n=6) 또는 2) 10 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) (n=6)의 단일 복강내 투여 후 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 및 24시간에 측정된 3-월령 Snord116+/- (Het) 마우스 및 3-월령 야생형 (WT) 한배새끼에서의 음식물 섭취를 제시한다. 마우스는 주사 전에 16시간 동안 공복 상태였고 주사 후에는 음식물에의 자유로운 접근이 허용되었다.
도 25a는 1) 비히클 (Het n=4; WT n=6) 또는 2) 10 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) (Het n=4; WT n=6)의 단일 복강내 투여 후 1시간에 측정된 12-월령 Snord116+/- (Het) 마우스 및 12-월령 야생형 (WT) 한배새끼에서의 음식물 섭취를 제시한다. 마우스는 주사 전에 16시간 동안 공복 상태였고 주사 후에는 음식물에의 자유로운 접근이 허용되었다.
도 25b는 1) 비히클 (Het n=4; WT n=6) 또는 2) 10 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) (Het n=4; WT n=6)의 단일 복강내 투여 후 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 및 24시간에 측정된 12-월령 Snord116+/- (Het) 마우스 및 12-월령 야생형 (WT) 한배새끼에서의 음식물 섭취를 제시한다. 마우스는 주사 전에 16시간 동안 공복 상태였고 주사 후에는 음식물에의 자유로운 접근이 허용되었다.
도 26은 1) 비히클 (n=5) 또는 2) 30 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) (n=5)의 단일 복강내 투여 후 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 및 24시간에 측정된 7-월령 Snord116+/- (Het) 마우스 및 7-월령 야생형 (WT) 한배새끼에서의 음식물 섭취를 제시한다. 마우스는 주사 전에 16시간 동안 공복 상태였고 주사 후에는 음식물에의 자유로운 접근이 허용되었다.
도 27a는 1) 비히클 (n=10) 또는 2) 10 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) (n=10)의 연속 10일 07.00시의 복강내 투여 후에 매일 측정된 6-월령 Snord116+/- (Het) 마우스 및 6-월령 야생형 (WT) 한배새끼의 음식물 섭취를 제시하고, 도 27b는 그의 체중을 제시한다.
도 28a는 1) 비히클 (n=5) 또는 2) 30 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) (n=5)의 연속 5일 07.00시의 경구 투여 후에 매일 측정된 8-월령 Snord116+/- (Het) 마우스 및 8-월령 야생형 (WT) 한배새끼의 음식물 섭취를 제시하고, 도 28b는 그의 체중을 제시한다.
도 29a는 1) 비히클 (n=5) 또는 2) 30 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준) (n=5)의 연속 5일 18.00시의 경구 투여 후에 매일 측정된 8-월령 Snord116+/- (Het) 마우스 및 8-월령 야생형 (WT) 한배새끼의 명주기 동안의 음식물 섭취를 제시하고, 도 29b는 그의 암주기 동안의 음식물 섭취를 제시한다.
상기에 요약되었으며 하기에 상세히 제시된 바와 같이, 본 개시내용은 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일) 우레아 푸마레이트 염, 그의 결정질 형태, 및 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일) 우레아 유리 염기의 결정질 형태에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 푸마레이트 염 및 그의 결정질 형태를 제조하는 방법, 및 GHSR1a의 억제를 위해 그를 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 세부사항이 하기 첨부된 상세한 설명에 제시되어 있다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 또는 그와 등가인 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 이제부터 예시적인 방법 및 물질이 기재된다. 본 개시내용의 다른 특색, 목적, 및 이점이 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수형을 또한 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 인용된 모든 특허 및 공개는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용의 한 측면은 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아 푸마레이트 염에 관한 것이다. 본 개시내용의 적어도 한 실시양태에서, 염은 1:1 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아:푸마레이트 염이다.
염은 다양한 형태 예컨대 오일 또는 고체로 존재할 수 있다. 고체는 무정형, 결정질, 또는 이들 둘 다의 혼합물일 수 있다. 본 개시내용의 적어도 한 실시양태에서, 염은 적어도 50%가 결정질 형태이다. 추가의 실시양태에서, 염은 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 및 100%가 결정질일 수 있다.
염이 적어도 부분적으로 결정질이라면, 결정질 형태는 형태 1, 형태 2, 형태 3, 및 형태 4로부터 선택될 수 있다.
적어도 한 실시양태에서, 염은 Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD에 의해 결정 시 도 12의 XRPD 패턴과 실질적으로 유사한 XRPD 패턴을 특징으로 하는 결정질 형태 1을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 염은 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 및 100%가 결정질 형태 1일 수 있다.
일부 실시양태에서, 형태 1은 7.8 ± 0.2, 9.5 ± 0.2, 14.3 ± 0.2, 16.7 ± 0.2, 17.2 ± 0.2, 18.5 ± 0.2, 18.8 ± 0.2, 19.3 ± 0.2, 20.0 ± 0.2, 20.7 ± 0.2, 22.4 ± 0.2, 23.2 ± 0.2, 25.6 ± 0.2, 27.2 ± 0.2, 31.7 ± 0.2, 및 32.4 ± 0.2도 2 세타에서의 피크를 포함하는, Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD 패턴을 특징으로 할 수 있다.
적어도 한 실시양태에서, 염은 Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD에 의해 결정 시 도 3의 XRPD 패턴과 실질적으로 유사한 XRPD 패턴을 특징으로 하는 결정질 형태 2를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 염은 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 및 100%가 결정질 형태 2일 수 있다.
적어도 한 실시양태에서, 염은 Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD에 의해 결정 시 도 15의 XRPD 패턴과 실질적으로 유사한 XRPD 패턴을 특징으로 하는 결정질 형태 3을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 염은 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 및 100%가 결정질 형태 3일 수 있다.
일부 실시양태에서, 형태 3은 7.2 ± 0.2, 9.4 ± 0.2, 9.7 ± 0.2, 10.8 ± 0.2, 14.3 ± 0.2, 15.1 ± 0.2, 16.2 ± 0.2, 17.9 ± 0.2, 18.7 ± 0.2, 18.9 ± 0.2, 19.6 ± 0.2, 21.5 ± 0.2, 22.7 ± 0.2, 23.7 ± 0.2, 24.3 ± 0.2, 25.1 ± 0.2, 27.4 ± 0.2, 28.7 ± 0.2, 및 34.9 ± 0.2도 2 세타에서의 피크를 포함하는, Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD 패턴을 특징으로 할 수 있다.
적어도 한 실시양태에서, 염은 Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD에 의해 결정 시 도 16의 XRPD 패턴과 실질적으로 유사한 XRPD 패턴을 특징으로 하는 결정질 형태 4를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 염은 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 및 100%가 결정질 형태 4일 수 있다.
일부 실시양태에서, 형태 4는 12.2 ± 0.2, 13.2 ± 0.2, 15.0 ± 0.2, 15.4 ± 0.2, 17.6 ± 0.2, 18.1 ± 0.2, 19.5 ± 0.2, 20.2 ± 0.2, 20.9 ± 0.2, 21.4 ± 0.2, 23.0 ± 0.2, 23.4 ± 0.2, 24.4 ± 0.2, 24.8 ± 0.2, 25.9 ± 0.2, 27.9 ± 0.2, 28.9 ± 0.2, 29.6 ± 0.2, 30.7 ± 0.2도 2 세타에서의 피크를 포함하는, Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD 패턴을 특징으로 할 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD에 의해 결정 시 도 1a의 XRPD 패턴과 실질적으로 유사한 XRPD 패턴을 특징으로 하는 결정질 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아 유리 염기에 관한 것이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 제약상 허용되는 담체 및 본원에 개시된 바와 같은 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아 푸마레이트 염 및 결정질 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아로부터 선택된 적어도 1종의 물질을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 제약상 허용되는 담체는 부형제, 희석제, 또는 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다.
조성물은 각각의 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제조될 수 있으며, 본 발명의 제약 조성물은 중량 또는 부피 기준으로 약 0.1% 내지 약 99%, 약 5% 내지 약 90%, 또는 약 1% 내지 약 20%의 개시된 화합물을 함유할 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 하기 실시예에 상술된 바와 같은, (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아 푸마레이트 염, 및 그의 결정질 형태를 제조하는 방법을 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 본원에 개시된 바와 같은 결정질 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아를 제조하는 방법을 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 세포를 본원에 개시된 바와 같은 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아 푸마레이트 염 및 결정질 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아로부터 선택된 적어도 1종의 물질에 노출시키는 것을 포함하는, 세포에서의 그렐린 신호전달 활성을 감소시키는 방법이다.
용어 "그렐린 신호전달 활성"은 그렐린이 그의 수용체 또는 수용체 복합체에 결합할 때 발생하는 하류 활성 중 어느 하나 또는 그의 조합을 지칭한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 세포를 본원에 개시된 바와 같은 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아 푸마레이트 염 및 결정질 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아로부터 선택된 적어도 1종의 물질에 노출시키는 것을 포함하는, 세포에서의 성장 호르몬의 방출을 억제하는 방법이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 세포를 본원에 개시된 바와 같은 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아 푸마레이트 염 및 결정질 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아로부터 선택된 적어도 1종의 물질에 노출시키는 것을 포함하는, GHSR1a를 억제하는 방법이다.
일부 실시양태에서, 세포는 시험관내에서 본원에 개시된 바와 같은 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아 푸마레이트 염 및 결정질 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아로부터 선택된 적어도 1종의 물질에 노출된다. 일부 실시양태에서, 세포는 생체내에서 본원에 개시된 바와 같은 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아 푸마레이트 염 및 결정질 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아로부터 선택된 적어도 1종의 물질에 노출된다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 대상체에게 본원에 개시된 바와 같은 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아 푸마레이트 염 및 결정질 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아로부터 선택된 적어도 1종의 물질을 투여하는 것을 포함하는, 그렐린 수준의 증가와 연관된 병태 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법이다. 비제한적 예로서, 증가된 그렐린 수준과 연관된 병태 또는 장애는 음식물 남용 장애, 예컨대 폭식, 비만, 과식증 (제어불가능한 식욕), 다이어트-후 체중 반등 (다이어트-후 과식증 포함), 알콜 중독, 및 유전 질환, 예컨대 프라더-윌리 증후군 등을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 대상체에게 본원에 개시된 바와 같은 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아 푸마레이트 염 및 결정질 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아로부터 선택된 적어도 1종의 물질을 투여하는 것을 포함하는, 순환 성장 호르몬의 증가와 연관된 병태 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법이다.
"감소시킨다" 또는 "억제한다"는 것은 참조와 비교하였을 때 활성, 기능 또는 양을 저하시키거나, 감소시키거나, 또는 저지시키는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, "감소시킨다" 또는 "억제한다"는 것이란 20% 이상의 전체 저하를 유발하는 능력을 의미한다. 일부 실시양태에서, "감소시킨다" 또는 "억제한다"는 것이란 50% 이상의 전체 저하를 유발하는 능력을 의미한다. 일부 실시양태에서, "감소시킨다" 또는 "억제한다"는 것이란 75%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 초과의 전체 저하를 유발하는 능력을 의미한다. 일부 실시양태에서, 상기 나타낸 양은 소정의 기간에 걸쳐서의 대조군 용량 (예컨대 위약)에 비해, 동일한 기간에 걸쳐서 억제되거나 또는 저하된 것이다. 본원에 사용된 "참조"는 비교 목적으로 사용되는 임의의 샘플, 표준, 또는 수준을 지칭한다. 참조는 건강한 또는 질환이 없는 샘플로부터 획득될 수 있다. 일부 예에서, 참조는 시험되거나 또는 치료될 대상체가 아닌, 하나 이상의 건강한 대상체로부터 획득된다.
용어 "실질적으로 감소된"은 수치 값과 참조 수치 값 사이의, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 상기 두 값 사이의 차이를 상기 값에 의해 측정된 생물학적 특징과 관련하여 통계적 유의성이 있는 것으로 간주할 정도로 충분히 큰 감소 정도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 감소된 수치 값은 참조 값과 비교하여 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 중 어느 하나보다 더 크게 감소된 것이다.
일부 실시양태에서, 세포 또는 대상체의 본원에 개시된 바와 같은 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아 푸마레이트 염 및 결정질 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아로부터 선택된 적어도 1종의 물질에 대한 노출은 그렐린 신호전달 활성의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 대상체에서의 그렐린 신호전달 활성은 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아 푸마레이트 염 또는 결정질 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아의 부재 하의 그렐린 신호전달 활성과 비교하여 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, 그렐린 신호전달 활성은 형광 영상화 플레이트 판독기 (FLIPR) 검정에 의해 검출되는 세포내 칼슘 수준에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아 푸마레이트 염 및 결정질 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아로부터 선택된 적어도 1종의 물질에 대한 노출은 세포내 칼슘 수준의 감소를 초래한다.
FLIPR 검정은 G-단백질 커플링된 수용체 (예를 들어, 특히 GHS-R1a) 활성화 및 세포내 칼슘 유동의 자극을 검출하는 기술을 지칭한다. 세포내 칼슘 수준은 칼슘-감수성 염료 및 형광 플레이트 판독기를 사용하여 측정될 수 있다. 추가의 설명을 위해서는, 문헌 [Arkin, Michelle R., et al. (2012). FLIPRTM Assays for GPCR and Ion Channel Targets. In Assay Guidance Manual [Internet] Sittampalam G.S., et al. (Eds)]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 그렐린 신호전달 활성은 순환 성장 호르몬 수준에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 대상체의 본원에 개시된 바와 같은 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아 푸마레이트 염 및 결정질 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아로부터 선택된 적어도 1종의 물질에 대한 노출은 순환 성장 호르몬 수준의 감소를 초래한다.
일부 실시양태에서, 그렐린 신호전달 활성은 음식물 섭취에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 대상체의 본원에 개시된 바와 같은 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아 푸마레이트 염 및 결정질 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아로부터 선택된 적어도 1종의 물질에 대한 노출은 음식물 섭취의 감소를 초래한다.
일부 실시양태에서, 그렐린 신호전달 활성은 체중에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 대상체의 본원에 개시된 바와 같은 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아 푸마레이트 염 및 결정질 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아로부터 선택된 적어도 1종의 물질에 대한 노출은 체중의 감소 또는 체중의 안정화를 초래한다.
"치료" 또는 "치료하는"은 유익한 또는 목적하는 임상 결과를 획득하기 위한 접근법이다. "치료" 또는 "치료하는"은 인간을 포함한, 포유동물에서의 질환에 대한 치료제의 임의의 투여 또는 적용을 포함한다. 본 개시내용의 목적상, 유익한 또는 목적하는 임상 결과는 하기 중 어느 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 1종 이상의 증상의 완화, 병태 정도의 약화, 병태 재발의 예방 또는 지연, 병태 진행의 지연 또는 둔화, 병태 상태의 호전, 병태 또는 병태 진행의 억제, 병태 발생의 저지, 및 병태의 관해 (부분 관해든 또는 완전 관해든). 병태의 병리학적 결과의 감소도 또한 "치료" 또는 "치료하는"에 포괄된다. 본원에 제공된 방법은 이들 측면의 치료 중 어느 하나 이상을 고려한다. 상기에 따라, 치료라는 용어는 병태 또는 장애의 모든 측면의 100 퍼센트 제거를 요구하지는 않는다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 순환 그렐린의 증가된 수준과 연관된 병태 또는 장애의 치료를 위해 본원에 개시된 바와 같은 조성물을 경구로 투여하는 것이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 순환 성장 호르몬의 증가된 수준과 연관된 질환 또는 장애의 치료를 위해 본원에 개시된 바와 같은 조성물을 경구로 투여하는 것이다.
본원에 개시된 바와 같은 염을 사용한 경구 투약을 위한 치료 유효량 및 투약 레지멘은 치료하려는 병태 또는 장애, 뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 가능하게는 성별, 및 다른 건강 인자를 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 것이며, 이는 치료 시에 결정될 수 있다. 치료 유효량은 1 mg 내지 500 mg의 범위일 수 있다. 경구 투여 조성물은, 비제한적 예로서, 본원에 개시된 바와 같은 활성 성분을 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500 mg 함유할 수 있다.
표 1. 하기 실시예 및 본원의 다른 곳에 사용된 약어 및 명칭은 하기를 포함한다:
실시예
실시예 1. 결정질 형태 1 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일) 우레아 (HM04) 유리 염기의 제조 및 특징화
실시예 1A: HM04 유리 염기 결정질 형태 1 시드의 제조
HM04 또는 H0900으로도 지칭되는, (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일) 우레아의 무정형 유리 염기의 제1의 15 mg 샘플을 아세토니트릴 중에 용해시키고, 무정형 유리 염기 HM04의 제2의 15 mg 샘플을 아세톤 중에 용해시켰다. 용액을 질소 유동 하에 데시케이터에서 천천히 증발하도록 하였다. 결정화도를 X선 분말 회절 (XRPD)에 의해 확인하였다. 아세토니트릴 용액 및 아세톤 용액으로부터 결정화된 유리 염기 HM04 샘플의 XRPD 프로파일 (형태 1)이 각각 도 1a 및 1b (하단 패널)에 제시되어 있다.
실시예 1B: HM04 유리 염기 결정질 형태 1의 스케일업
무정형 HM04 유리 염기의 샘플을 0.5 mL 아세톤 중에 용해시키고, 용액을 질소 유동 하에 데시케이터에서 천천히 증발하도록 하였다. 24시간 후에, 갈색 유성 잔류물이 수득되었으며, 여기에 아세톤 용액으로부터 결정화된 유리 염기 형태 1의 약간의 결정 (실시예 1A 참조)을 시딩하고, 스패튤라로 스크래칭하였다. 오일이 고체화되었고, 생성된 생성물을 24시간 동안 50℃의 진공 오븐에서 건조시켜 결정질 유리 염기를 95 mg의 수율로 수득하였다.
결정화도를 X선 분말 회절 (XRPD)에 의해 확인하였으며, 도 1b의 상단 패널을 참조한다. 동시 열 분석 (STA)에 의해 결정질 유리 염기가 수화 또는 용매화되지 않은 것으로 시사되었다. DSC에 의해 결정 시, 결정질 유리 염기는 대략 155℃의 추정 용융 개시를 가졌다. GVS 분석은 생성물이 70% 이하의 상대 습도 (RH)에서 대략 1.5% 및 80% 이하의 RH에서 대략 2%의 가역적 중량 증가가 일어나는 약간의 흡습성을 갖는 것으로 지시하였다. 결정질 유리 염기의 수용해도는 2 mg/mL 미만인 것으로 추정되었다.
실시예 2. HM04 푸마레이트 염 형태 1의 소규모 제조
HM04 무정형 유리 염기 (100 mg)를 아세토니트릴 (2 mL) 중에 현탁시켰다. 푸마르산 (27mg)을 첨가하고, 잔류 산을 추가의 아세토니트릴 (0.2 mL)로 반응 혼합물 중으로 세척해 넣고, 잘 혼합하였다. 혼합물을 완만하게 가온하고, 고체를 신속히 침전시켰다. 생성된 현탁액을 밤새 (18-24시간) 40℃ 내지 실온에서의 온도-사이클에 적용하였다. 생성물을 여과하고, 아세토니트릴 (0.2 mL)로 세척하고, 24시간 동안 50℃의 진공 오븐에서 건조시켜 86 mg의 푸마레이트 염 생성물을 수득하였다.
푸마레이트 염 생성물은 핵 자기 공명 (NMR) 분석에 의해 1:1 염인 것으로 제시되었다. 결정화도를 XRPD에 의해 확인하였고, 형태 1로서 지정하였다 (도 1c). STA는 용융 전에 중량 손실을 제시하지 않았으며, 이는 생성물이 수화 또는 용매화되지 않았음을 시사한다. DSC는 대략 172℃의 용융 개시에 상응하는 단일 흡열을 제시하였다. GVS는 푸마레이트 염이 70% 이하의 상대 습도 (RH)에서 대략 2.8% 및 80% 이하의 RH에서 대략 4.5%의 중량 증가가 일어나는 흡습성을 갖는 것으로 제시하였다. 푸마레이트 염의 추정 수용해도는 200 mg/mL 초과였다.
실시예 3. HM04 푸마레이트 염의 결정질 형태 (형태 1 및 2)
HM04 유리 염기 (1.5 mg)를 아세토니트릴 (6 mL) 중에 현탁시키고, 푸마르산 (0.4 g)을 첨가하였다. 혼합물을 완만하게 가온하고, 고체를 신속히 침전시켰다. 생성된 현탁액을 72시간에 걸쳐 40℃ 내지 주위 온도에서의 온도-사이클에 적용하였다. 추가의 아세토니트릴 (1 mL)을 첨가하고, 생성물을 여과하고, 아세토니트릴 (5 x 0.2 mL)로 세척하고, 일정한 중량까지 적어도 24시간 동안 50℃의 진공 오븐에서 건조시켜 1.6 g의 푸마레이트 염을 수득하였다. 이러한 결정질 HM04 푸마레이트 염은 XRPD 분석에 의해 형태 1로서 특징화되었다 (도 2).
도 3은 HM04 푸마레이트 염을 에탄올 중에 용해시키고, 용매를 질소 하에 실온에서 증발시킨 후에 수득된 HM04 푸마레이트 염 형태 2 샘플의 대표 XRPD 패턴을 제시한다.
HM04 푸마레이트 염 형태 2를, 150 mg의 출발 물질 (HM04 푸마레이트 염 형태 1)을 0.45 mL의 90/10 에탄올/물 혼합물 중에 가열 하에 용해시킴으로써 스케일업하였다. 용액을 96시간 동안 질소 유동 하에 데시케이터에서 증발시키고, 고체 생성물을 회수하였다. 소량의 형태 1과의 혼합물의 가능성을 배제할 수는 없지만, 형태 2 스케일업 생성물의 XRPD 패턴은 일반적으로 소규모 생성물과 일치하였다. NMR 분석은 생성물이 화학량론적 모노 염과 일치하는 것으로 제시하였다. STA 데이터는 70℃ 내지 150℃에서 대략 1.9%의 중량 손실을 제시하였으며, 이는 샘플이 아마도 수화물이었음을 시사한다. DSC 데이터는 용융에 상응하는, 대략 164.5℃에서 개시되는 광범위한 흡열을 제시하였다. GVS는 70% 이하의 RH에서 3.5%의 중량 증가 및 80% 이하의 RH에서 4.9%의 중량 증가를 제시하였다. GVS 후에 또는 샘플을 7일 동안 40℃/75% RH의 데시케이터에 넣어 둔 후에 XRPD 패턴에서의 변화가 관찰되지 않았다.
형태 1 출발 물질 및 형태 2 스케일업 물질을 대략 50:50의 비 (10mg:10mg)로 혼합함으로써 경쟁적 슬러리화 실험을 수행하였다. 혼합물을 48시간 동안 실온에서 100 μL의 상이한 용매 또는 용매 혼합물 중에서 진탕시켰다. 48시간 후에 각각의 슬러리로부터 고체의 샘플을 수집하였고, 용매(들)의 증발 이후, 하나의 형태로의 전환이 일어났는지를 결정하기 위해 XRPD에 의해 분석하였다. 슬러리화를 60℃에서 반복하였고, 샘플을 다시 48시간 후에 수집하였다. 실온 및 60℃에서의 연구의 결과가 하기 표 2에 제시되어 있다.
표 2.
실온에서의 아세토니트릴 중의 경쟁적 슬러리화는 형태 1로의 완전한 전환을 초래하였다. 에탄올 중의 슬러리화는 형태의 혼합물을 초래하였고, 주위 온도에서의 에탄올/물은 형태 2로의 전환을 초래하였다. 60℃에서의 아세토니트릴 중의 경쟁적 슬러리화는 형태 1로의 완전한 전환을 초래하였다. 60℃에서의 아세토니트릴/물 및 에탄올 중의 슬러리화에서는 미지정 XRPD 패턴이 관찰되었다 (각각 도 4a 및 4b). 경쟁적 슬러리화의 결과에 대한 추가의 조사는 수행하지 않았다.
실시예 4. 실시예 1-3에 대한 분석 방법
실시예 1-3에 기재된 생성물을 특징화하는데 사용되는 분석 방법이 하기 제시된다.
STA는 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) STA 600 TGA/DTA 분석기를 사용하여 수행하였다. 샘플 (5 mg)을 10℃/min의 속도로 25℃에서부터 300℃까지 가열하고, 그 시간 동안 중량에서의 변화를 모니터링하였다. 질소를 20 cm3/min의 유량으로 퍼징 기체로서 사용하였다.
DSC 분석을 위해서는, 5 mg의 샘플을 알루미늄 DSC 팬에 칭량하여 넣고, 알루미늄 뚜껑으로 비-밀폐식으로 실링하였다. 이어서, 샘플을 퍼킨-엘머 제이드 DSC에 로딩하고, 안정적인 열-유동 반응이 획득될 때까지 25℃에서 유지하였다. 이어서, 샘플을 10℃/min의 스캔 속도로 300℃까지 가열하고, 초래되는 열 유동 반응을 모니터링하였다. 20 cm3/min의 헬륨 퍼징을 사용하였다. 분석 전에, 기기를 인듐 표준을 사용하여 온도 및 열 유동을 검증하였다.
GVS 분석을 위해서는, 15-20 mg의 샘플을 이가솝 증기 수착 밸런스 (하이덴 애널리티컬 인스트루먼츠(Hiden Analytical Instruments))에 로딩하였다. 이어서, 샘플을 추가의 중량 변화가 기록되지 않을 때까지 0% 습도 환경을 유지함으로써 건조시켰다. 이어서, 샘플을 각각의 단계에서 평형이 달성될 때까지 (99% 단계 완료) 유지하면서, 샘플을 10% RH 증분으로 0에서부터 90% RH까지의 램핑 프로파일에 적용하였다. 평형에 도달하면, 장치 내의 % RH를 다음 단계로 올리고, 평형화 절차를 반복하였다. 수착 사이클의 완료 후에, 샘플을 동일한 절차를 사용하여 건조시켰다. 이어서, 수착/탈착 사이클 동안의 중량 변화를 모니터링하여, 샘플의 흡습성 성질이 결정되도록 하였다.
NMR 분석은 브루커 아반스(Bruker Avance) III 400 기기를 사용하여 DMSO-d6 중에서 실행하였다.
XRPD 분석은 XRPD 제로-백그라운드 단일 경사 절단 실리카 샘플 홀더에 샘플 (대략 2 mg)을 약하게 압축하여 수행하였다. 이어서, 샘플을 필립스 엑스-퍼트(Philips X-Pert) MPD 회절계에 로딩하였고, 하기 실험 조건을 사용하였다.
튜브 애노드: Cu
발생기 전압: 40 kV
튜브 전류: 40 mA
파장 알파1: 1.5406 Å
파장 알파2: 1.5444 Å
시작 각도 (2 세타): 4
종료 각도 (2 세타): 40
연속 스캔
실시예 5. HM04 푸마레이트 염 형태 1의 스케일업 합성
본 실시예에 제시된 바와 같은 HM04 푸마레이트 염 형태 1의 합성의 개관이 도 5에 제시되어 있다.
단계 1: 화합물 2A의 합성
2,2,6,6-테트라메틸피페리딘 (7.20 kg, 51.1 mol, 3.0 당량, KF=0.30%)을 온도 프로브 및 오버헤드 교반기가 장착된 100 L 반응기에 첨가하고, 질소 보호 하에 RT에서 혼합하였다. THF (50 L)를 반응기에 첨가하고 교반하였다. 용기를 질소로 3회 퍼징하고, 0℃로 냉각시켰다. 1시간에 걸쳐 온도를 약 0℃ 내지 약 5℃에서 유지하면서, n-BuLi (20.4 L, 3.0 당량; 2.5 M 헥산 용액)를 혼합물에 적가하였다. 용액의 색상이 황색으로 변하였다. 혼합물을 30분 동안 약 0℃ 내지 약 5℃에서 교반하였다. 혼합물을 약 -78℃ 내지 약 -70℃로 냉각시켜 용액 A를 형성하였다.
화합물 1 (3.25 kg, 17.0 mol., 1.0 당량, KF=0.03%)을 15 L의 THF 중에 용해시켜 용액 B를 형성하였다.
용액 B를 용액 A에 1시간에 걸쳐 약 -70℃ 내지 약 -78℃의 온도에서 적가한 다음, 30분 동안 교반하여 용액 C를 형성하였다. 트리-이소프로필 보레이트 ((i-PrO)3B) (3.52 kg, 18.7 mol., 1.1 당량)를 용액 C에 10분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 약 -70℃ 내지 약 -78℃의 온도에서 1시간 동안 교반하였다. HCl (40 L, 3M, 7.0 당량)을 30분에 걸쳐 첨가하여 반응물을 켄칭하였다. 온도의 10도 상승이 기록되었다.
생성된 수성 층을 분리하고, EtOAc (40 L)로 추출하였다. 수성 층을 분리하고, 다시 EtOAc (35 L, 30 L)로 2회 추출하였다. 유기 층을 합하여 약 160 L의 액체를 생성하였다. 합한 유기 층을 NaCl로 포화된, 50 L의 1M 수성 HCl 용액으로 2회 세척하였다. 유기 층을 50 L 회전증발기에서 약 8시간 동안 30-40 mmHg 하에 약 50℃ 내지 약 55℃의 온도에서 약 5 L로 농축시켰다.
잔류 EtOAc를 DME로 3회 (10 L x 3) 교환하였다. 유기 층을 50 L 회전증발기에서 약 6시간 동안 30-40 mmHg 하에 약 50℃ 내지 약 55℃의 온도에서 농축시켰다. 매번 약 5 L의 잔류물이 남았다. DME (20 L)를 잔류물에 첨가하여 14.2% 화합물 2A의 진갈색 용액 (25 kg의 용액 중 3.55 kg; 88.8% 수율; 97.4% 순도 (HPLC에 의한 AUC, 체류 시간 = 1.6분); 0.24% 잔류 에틸 아세테이트)을 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, DMSO): δ=8.55 (s, 2H), 7.36 (d, 1H), 7.69 (d, 1H). 화합물 2A의 제2 배치를 동일한 방법에 의해 제조하여 3.29 kg (95.4% 순도, 82.3% 수율, 0.11% 잔류 에틸 아세테이트)을 생성하였다.
단계 2: 화합물 3A의 합성
화합물 2A (20.5 kg 용액 중 2.91 kg)를 질소 하에 실온에서 100 L 반응기에 첨가하였다. DME (45 mL), 2-클로로피라진 (1.42 kg, 12.4 mol., 1.0 당량), 및 Pd(dppf)Cl2 (10% w/w, 291 g)를 순차적으로 첨가하고, 각각 질소 하에 실온에서 혼합하였다. 질소를 20분 동안 혼합물 중으로 버블링하고, 생성된 혼합물을 질소로 퍼징하고 충전하였다 (3회). 혼합물을 60분에 걸쳐 48-52℃로 가열하였다. 또 다른 반응기에서 K2CO3 (2.57 kg, 18.6 mol, 1.5 당량)을 22 L의 물에 실온에서 첨가한 다음, 10분에 걸쳐 화합물 2A 혼합물에 적가하였다. 혼합물을 16시간 동안 48-52℃에서 교반한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 이러한 절차를 2회 반복하였고, 모든 3개의 배치를 합하였다.
K2CO3 (1.0 kg)의 수용액을 22 L의 물 중에 용해시키고, 합한 혼합물에 첨가하여 pH를 9로 조정하였다. TBME (50 L)를 혼합물에 첨가하고, 여과하여 (PET 필터, 3-5 μm, 205g/m2) 약 50 g의 점착성 갈색 고체 물질 (촉매 유사체)을 제거하였다. 수성 층을 2회 분리하고, TBME (40 L, 40L)로 추출하였다.
수성 층을 상기 방법에 따라 제조된 제4 배치의 수성 층과 합하였다. 합한 수성 층의 pH를 HCl (2N, 48 L)을 사용하여 pH<3으로 조정하였다. 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반함에 따라 고체가 천천히 침전되었다. 혼합물을 30분에 걸쳐 여과하여 (PET 필터, 3-5 μm, 205g/m2) 20 kg의 습윤 생성물을 수득하였다. ACN (40 L)을 오버헤드 교반기가 장착된 100 L 반응기에 실온에서 첨가하였다. 20 kg의 습윤 생성물을 반응기에 첨가하고, 반응 혼합물을 환류까지 가열하고, 4시간 동안 환류에서 교반하였다. 반응 혼합물을 3시간에 걸쳐 실온으로 냉각시키고 (대략 15℃/시간), 여과하여 8.5 kg의 습윤 고체를 수득하였다. 습윤 고체를 15시간 동안 50-55℃에서 진공 (20-30 mmHg) 하에 건조시켜 연백색 고체로서 화합물 3A (6.1 kg; 97.4% 순도 (HPLC에 의한 AUC, 체류 시간 = 3.7분); 83.8% 수율)를 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, DMSO): δ=7.67 (d, 1H), 7.82 (d, 1H), 8.75 (d, 1H), 8.82 (t, 1H), 8.98 (d, 1H), 13.89 (bs, 1H).
단계 3: 화합물 6A의 합성
화합물 3A (6.1 kg, 22.7 mol, 1.0 당량)를 온도 프로브, 오버헤드 교반기 및 응축기가 장착된 100 L 반응기에 첨가하였다. 메탄올 (92 L)을 반응기에 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 0-10℃로 냉각시키고, 30분에 걸쳐 0-10℃에서 SOCl2 (5.4 kg, 45.3 mol, 2.0 당량)를 적가하였다. 반응 혼합물을 환류 (65℃)까지 가열하고, 환류에서 15시간 동안 교반하였다. 현탁액이 형성되었다. 약 30 L가 남을 때까지 대부분의 용매 및 SOCl2를 진공 증류 하에 제거하였다. 혼합물을 약 6시간 동안 50-55℃에서 진공 (30-40 mmHg) 하에 농축시켰다. 물 (10 L)을 잔류물에 -5 내지 15℃에서 첨가하였다. -5 내지 15℃에서 K2CO3의 수용액 (2L의 물 중에 용해된, 200 g)을 사용하여 pH를 8-9로 조정하였다. 생성된 수성 층을 이소프로필 아세테이트 (25 L, 25 L)로 2회 추출하였다. 합한 유기 층 (약 50 kg)을 20 L의 NaHCO3 수성 층으로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, 10 L의 NaHCO3의 수용액으로 세척하였다. 모든 수성 층을 합하였다 (55.8 kg). 유기 층을 실리카 패드 (30 cm)를 통해 여과하고, 화합물 6A가 실리카 겔로부터 여과될 때까지 (약 3시간) 패드를 추가의 이소프로필 아세테이트로 세척하였다. 유기 층을 약 5 L로 농축시켰다. THF (10 L)를 잔류물에 첨가하고, 약 3시간 동안 50-55℃에서 진공 (30-40 mmHg) 하에 약 5 L로 농축시켰다 (3회). 추가로 10 L의 THF를 잔류 농축물에 첨가하여, 화합물 6A의 농축 용액 (15.8 kg; 32.83%, 용액 중 5.19 kg 화합물 6A; 97.9% 순도 (HPLC에 의한 AUC, 체류 시간 = 8.5 min); 80.8% 수율)을 제공하였다. 1H-NMR (400 MHz, DMSO): δ=3.98 (s, 3H), 7.54 (d, 1H), 7.78 (d, 1H), 8.63 (d, 1H), 8.72 (t, 1H), 8.94 (d, 1H).
단계 4: 화합물 6B의 합성
THF (26 L)를 온도 프로브 및 오버헤드 교반기가 장착된 100 L 반응기에 질소 하에 첨가하였다. DIBAL-H (26 kg, 46 mol, 5.0 당량)를 첨가하고, 시스템을 질소로 3회 퍼징하고 충전하였다. 혼합물을 -78 내지 -70℃로 냉각시켜 용액 A를 형성하였다. 52 L의 THF 중 화합물 6A (2.6 kg, 9.2 mol, 1.0 당량)의 실온 용액을 질소 하에 30분에 걸쳐 -78 내지 -70℃에서 적가하였다. 혼합물을 약 5-6시간에 걸쳐 -30℃로 가온하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 -40 내지 -30℃에서 교반하였다. 혼합물을 42 L의 2N HCL에 35℃의 최대 온도에 도달하는 1시간에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 혼합물을 26 L의 이소프로필 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 30 L의 염수로 세척하였다. 이러한 절차를 반복하였고, 유기 층의 배치 둘 다를 합하여, 진공 하에 약 100 L로부터 약 5-10 L로 농축시켰다. 농축 동안 고체가 천천히 형성되었다. 혼합물을 5-15℃로 냉각시키고, 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 30분에 걸쳐 여과하였다 (30-50 μm). 고체를 6시간 동안 50℃에서 진공 하에 건조시켜 갈색 고체로서 화합물 6B (2.1 kg; 97.5% 순도 (HPLC에 의한 AUC, 체류 시간 = 8.6 min); 45.7% 수율)를 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, DMSO): δ = 4.65 (d, 2H), 5.68 (t, 1H), 7.62 (d, 1H), 7.68 (d, 1H), 8.72 (d, 1H), 8.80 (t, 1H), 8.94 (d, 1H).
단계 5: 화합물 7의 합성
DMSO (10 L)를 온도 프로브 및 오버헤드 교반기가 장착된 50 L 플라스크에 실온에서 질소 하에 첨가하였다. 화합물 6B (2.05 kg, 8.04 mol, 1.0 당량)를 실온에서 질소 하에 첨가하였다. Et3N (8 L)을 RT에서 질소 하에 첨가하고, 이어서 혼합물을 15-20℃로 냉각시켰다. 별도의 플라스크에서 SO3.피리딘 (5.1 kg, 32.08 mol, 4.0 당량)을 10 L의 DMSO 중에 5-15℃에서 용해시키고, 혼합물에 약 20℃에서 3.5시간에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 70 L의 빙수로 옮겼다. 현탁액 혼합물을 1시간 동안 0-10℃에서 교반하고, 1.5시간에 걸쳐 원심분리에 의해 여과하여 (PET, 3-5 μm, 205 g/m2) 갈색 고체로서 화합물 7을 수득하였다. 고체를 실온에서 35 L의 DCM 중에 용해시켰다. 생성된 DCM 층을 5 L의 염수로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, 40-45℃에서 진공 하에 농축 건조시켜 갈색 고체로서 화합물 7 (2.33 kg; 96.3% 순도 (HPLC에 의한 AUC, 체류 시간 = 9.2분); 93.5% 수율)을 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, DMSO): δ = 7.67 (d, 1H), 7.99 (d, 1H), 8.67 (d, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.99 (d, 1H), 10.56 (s, 1H).
단계 6: 화합물 8의 합성
THF (23 L)를 온도 프로브 및 오버헤드 교반기가 장착된 50 L 플라스크에 실온에서 질소 하에 첨가하였다. 화합물 7 (2.3 kg, 9.1 mol, 1.0 당량) 및 (S)-2-메틸프로판-2-술핀아미드 (1.21 kg, 10 mol, 1.1 당량)를 플라스크에 질소 하에 순차적으로 첨가하였다. Ti(OEt)4 (6.22 kg, 27.3 mol, 3.0 당량)를 플라스크에 질소 하에 30-35℃에서 1시간에 걸쳐 적가하였다. 시스템을 질소로 3회 퍼징한 다음, 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 이소프로필 아세테이트 (40 L)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 이어서, 전체 반응 혼합물을 천천히 RT에서 교반하면서 20 L의 염수에 충전하였다. 많은 고체가 형성되었고, 열 방출은 관찰되지 않았다. 고체 (약 18 kg)를 원심분리를 사용하여 여과한 다음, 고체를 다시 20분 동안 20 L의 이소프로필 아세테이트로 슬러리화하고, 다시 여과하였고, 그 생성물은 약간 줄어든 고체 (17.3 kg)였다. 이어서, 여과물을 합하고, 20 L의 염수로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, 회전증발기에서 약 4시간 동안 40-50℃에서 진공 (30-40 mmHg) 하에 농축시켜 용매를 제거하였고 갈색 오일 (화합물 8)을 수득하였다. 오일을 DMF 중에 용해시켜 흑색 용액 (7.36 kg; 40.1%; 용액 중 3.0 kg 화합물 8; 92.1% 순도 (HPLC에 의한 AUC, 체류 시간 = 9.7분); >100% 수율)을 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.30 (s, 9H), 7.59 (d, 1H), 8.11 (d, 1H), 8.64 (s, 1H), 8.73 (m, 1H), 8.97 (s, 1H), 9.10 (s, 1H).
단계 7: 화합물 11의 합성
DMF (26 L, 10 v/w)를 온도 프로브 및 오버헤드 교반기가 장착된 50 L 플라스크에 15℃에서 질소 하에 첨가하였다. 화합물 8 (2.9 kg, 8.1 mol, 1.0 당량을 함유하는, 7.3 kg의 DMF 용액) 및 TBAA (2.44 kg, 8.1 mol, 1.0 당량)를 플라스크에 질소 하에 순차적으로 첨가하였다. 혼합물을 0-10℃로 냉각시켰다. 이어서, TMSCF3 (2.88 kg, 20.3 mol, 2.5 당량)을 플라스크에 0-10℃에서 60 min에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 질소 보호 하에 0-5℃에서 교반하였다. 5-25℃에서 교반 하에 이소프로필 아세테이트 (60 L)를 혼합물에 첨가한 다음, 45 L의 NaHCO3을 첨가하였다. 유기 층을 분리하고, NaHCO3 (30 L x 3)으로 3회 세척하고, 60 kg으로부터 2.5 kg의 갈색 오일이 될 때까지 농축시켰다. 오일 생성물을 20 L의 TBME 중에 용해시키고, 2시간에 걸쳐 실리카 겔의 패드 (약 40 cm 높이, 30 cm 직경)를 통해 여과하여 TBME 용액 중 2.14 kg의 화합물 11을 수득하였다. 용액을 45-50℃에서 농축 건조시켜 흑색 오일로서 화합물 11 (1.85 kg; 85.2% 순도 (HPLC에 의한 AUC, 부분입체이성질체의 체류 시간 = 9.1분, 9.6분); 53.6% 수율)을 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.33 (s, 9H), 3.82-3.85 (d, 1H), 5.61-5.66 (m, 1H), 7.53-7.60 (m, 2H), 8.63-8.64 (d, 1H), 8.71-8.72 (m, 1H), 8.95 (s, 1H).
단계 8: 화합물 12 (유리 염기)의 합성
화합물 11 (1.8 kg, 4.23 mol, 1.0 당량, 조 물질)을 온도 프로브 및 오버헤드 교반기가 장착된 50 L 반응기에 25℃에서 질소 하에 첨가하였다. 무수 MeOH (18 L)를 첨가하여 화합물 11을 용해시켰다. 이어서, MeOH/HCl (18 L, 1 N)을 10분에 걸쳐 25-30℃에서 적가하고, 혼합물을 1시간 동안 25-30℃에서 교반하였다. 물 (15 L)을 반응물에 첨가하고, 혼합물을 회전증발기에서 약 4시간 동안 45-50℃에서 진공 (30-40 mmHg) 하에 농축시켜 용매를 제거하였다. 5 L의 K2CO3 용액을 사용하여 혼합물의 pH를 10으로 조정하였다. 이어서, 20 L의 EtOAc를 혼합물에 첨가하고, 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc (15 L x 2)로 2회 추출하였다. 유기 층을 합하고, 10 L의 염수로 세척하였다. 합한 유기 층은 40 kg의 EtOAc 용액 중 996 g의 화합물 12를 함유하였다 (84% 순도 (HPLC에 의한 AUC, 체류 시간 = 2.8분)). 유기 층을 회전증발기에서 약 3시간 동안 45-50℃에서 진공 (30-40 mmHg) 하에, EtOAc 용액 중 7.5 kg 부피의 화합물 12 (83% 순도 (HPLC에 의한 AUC, 체류 시간 = 2.7분))가 될 때까지 농축시켰다.
온도 프로브 및 오버헤드 교반기가 장착된 별도의 50 L 반응기에서, D-CSA를 첨가하고 (930 g, 4.0 mol, 1.26 kg 화합물 12에 대한 1.0 당량), 질소 하에 실온에서 교반하였다. EtOAc (10 L), 이어서 화합물 12 (1.26 kg, 3.9 mol, 1.0 당량)의 EtOAc 용액을 각각 순차적으로 반응기에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하면, 천천히 현탁액이 되었다. 혼합물을 원심분리에 의해 여과하고, EtOAc로 세척하여 회백색 고체로서 2.3 kg의 화합물 12 (96.0% 순도)를 생성하였다.
고체 생성물, 20 L의 EtOAc, 및 10 L의 10% 수성 K2CO3을 50 L 플라스크에 순차적으로 첨가하고, 고체가 남아있지 않을 때까지 (pH = 9-10) 실온에서 교반하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc (10 L x 2)로 2회 추출하였다. 유기 층을 합하고 (약 32 kg), 10 L의 염수로 세척하였다. 유기 층은 31.8 kg의 용액 중 716 g의 화합물 12를 함유하였다.
유기 층을 45-50℃에서 진공 하에 약 8 L로 농축시켰다. 활성탄 (200 g)을 유기 층에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 60-70℃에서 교반하고, 실온으로 냉각시키고, 30분에 걸쳐 부흐너 깔때기 및 여과지 (세공 크기: 30-50 μm)를 사용하여 여과하여 활성탄을 제거하였다. 혼합물을 회전증발기에서 약 3시간 동안 45-50℃에서 진공 (30-40 mmHg) 하에 농축시켜 황색 고체로서 710 g의 화합물 12 (99.4% 순도)를 수득하였다.
D-CSA (410 g, 1.77 mol, 680 g 화합물 12에 대한 1.0 당량), 3.4 L iPrOH, 및 68 mL의 물을 온도 프로브 및 오버헤드 교반기가 장착된 10 L 반응기에 순차적으로 첨가하고, 질소 하에 실온에서 교반하였다. 혼합물을 환류 (84℃)까지 가열하여 1시간 후에 용액 A를 형성하였다. 화합물 12 (680 g)를 3.4 L의 iPrOH 중에 용해시키고, 1 부분으로 용액 A에 첨가하였다. 투명한 용액이 형성되었고, 온도는 65℃로 저하되었다. 혼합물을 약 15분 동안 65℃에서 교반하였고, 그 후에 고체가 출현하였다. 혼합물을 2시간에 걸쳐 10℃로 냉각시키고, 추가로 30분 동안 10℃에서 교반하고, 30분에 걸쳐 부흐너 깔때기 및 여과지 (세공 크기: 30-50 μm)를 통해 여과하여 1.1 kg의 백색 고체를 수집하였다.
EtOAc (10 L), 1.1 kg의 백색 고체 생성물, 및 5 L의 10% K2CO3을 20 L 플라스크에 순차적으로 첨가하고, 5분 동안 혼합하였다. 고체는 용해되었다 (pH = 9-10). EtOAc 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc (각각 5 L)로 2회 추출하였다. 유기 층을 합하였고 (약 20 L), 5 L의 염수로 세척하고, 회전증발기에서 약 3시간 동안 45-55℃에서 진공 (30-40 mmHg) 하에, 대부분의 용액을 제거하고 잔류물 중량이 1 kg에 도달할 때까지 농축시켰다. 헵탄 (1 L)을 혼합물에 첨가하고, 30분 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 30분에 걸쳐 부흐너 깔때기 및 여과지 (세공 크기: 30-50 μm)를 사용하여 여과하여 백색 고체로서 419 g의 화합물 12 염기 (99.7% 순도)를 수득하였다. 여과물을 황색 고체로서 135 g의 화합물 12 (98.7% 순도)가 될 때까지 농축시켰다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.85 (bs, 2H), 5.17 (m, 1H), 7.56 (d, 1H), 7.68 (d, 1H), 8.62 (d, 1H), 8.70-8.71 (m, 1H), 8.93 (s, 1H). 합하면, 생성물은 40.7% 수율로 화합물 12를 생성하였다.
단계 9: 화합물 10의 합성
Pd/C (40 g, 5% w/w)를 10 L 오토클레이브 반응기에 질소 하에 실온에서 첨가하였다. THF (2 L), 2 L의 메틸아민 (27%-30% 알콜성 용액, 2.1 당량), 및 800 g의 화합물 10A (7 mol, 1.0 당량)를 반응기에 순차적으로 첨가하였다. 시스템을 수소로 3회 퍼징하였다. 혼합물을 밤새 70-75℃에서 수소 압력 (50 psi) 하에 교반한 다음, 10분에 걸쳐 부흐너 깔때기 및 여과지 (세공 크기: 30-50 μm)를 사용하여 여과하여 Pd/C를 제거하였다. 여과물을 회전증발기에서 약 3시간 동안 45-50℃에서 진공 (30-40 mmHg) 하에 농축시켜 933 g의 황색 오일을 수득하였다. 혼합물을 대기압 및 140-170℃에서 칼럼 없이 증류시키고 분획을 수집하여 무색 오일로서 763 g의 화합물 10 (98.6% 순도 (HPLC에 의한 AUC, 체류 시간 = 4.8분); 84.2% 수율; 8000 ppm 잔류 에탄올)을 수득하였다. 오일의 분획 (563 g)을 대기압 및 140-170℃에서 3 cm 칼럼을 사용하여 증류시키고 분획을 수집하여 510 g의 화합물 10 (75.8% 수율; 134 ppm 잔류 에탄올)을 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.82 (bs, 1H), 1.10-1.12 (q, 2H), 1.66 (d, 2H), 1.73-1.81 (t, 2H), 2.05 (s, 3H), 2.08-2.19 (m, 1H), 2.22 (s, 3H), 2.60 (d, 2H).
단계 10: HM04 푸마레이트 염의 합성
DCM (1L), 200 g CDI (1.23 mol, 2.0 당량), 및 35 g DABCO (0.31 mol, 0.5 당량)를 온도 프로브 및 오버헤드 교반기가 장착된 3 L 반응기에 순차적으로 첨가하고, 질소 하에 실온에서 교반하였다. 혼합물을 -10 내지 -5℃로 냉각시켰다. 화합물 12 (200 g)를 1 L의 DCM 중에 용해시키고, 혼합물에 1시간에 걸쳐 적가한 다음, 16시간 동안 -10 내지 -5℃에서 교반하였다. 화합물 10 (159 g, 1.24 mol, 2.0 당량)을 10분에 걸쳐 -10 내지 0℃에서 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 0 내지 5℃로 가온하고, 2시간 동안 유지하였다. 혼합물을 40-45℃에서 진공 하에 약 1 L로 농축시켰다. HCl (1 N의 1 L)을 잔류물에 첨가하고, 회전증발기에서 약 2시간 동안 45-50℃에서 진공 (30-40 mmHg) 하에 농축시켜 DCM을 제거하였다. 추가로 3 L의 1N HCl을 잔류물에 첨가하고, TBME (4 L, 2 L, 2 L)로 3회 추출하였다. 20% 수성 K2CO3 (약 1.5 L)을 사용하여 수성 층을 pH = 9-10으로 천천히 조정하고, DCM (2 L x 3)으로 추출하였다. 유기 층을 합하고 (약 4 L), 0.25 N KH2PO4 (1.2 L x 3)로 3회 세척하였다. pH가 중성이 되도록 유기 층을 2 L의 염수로 세척하고, 회전증발기에서 약 2시간 동안 45-50℃에서 진공 (30-40 mmHg) 하에 450 g (335 mL)으로 농축시켰다. MTBE (1.5 L)를 잔류물에 첨가하고, 500 mL의 액체가 수집될 때까지 증류시켰다. 이러한 단계를, 최종 증류 시에 330 mL의 액체를 수집하는 것을 제외하고는 500 mL의 TBME를 첨가하고 500 mL의 증류물을 수집하면서 4회 반복하였다. 약 1 내지 1.2 L의 잔류물이 플라스크에 남았다. 잔류물을 천천히 실온으로 냉각시키고, 밤새 실온에서 교반하였다. 혼합물을 여과하고, TBME (400 mL x 2)로 2회 세척하고, 건조시켜 담황색 고체로서 192 g의 HM04 유리 염기 (99.3% 순도 (HPLC에 의한 AUC, 체류 시간 = 11.0분))를 수득하였다. 벽 상의 생성물을 DCM 중에 용해시키고, 진공 하에 농축시켜 갈색 점착성 오일로서 22 g의 HM04 유리 염기 (97.6% 순도)를 수득하였다. 여과물을 진공 하에 농축시켜 22.5 g의 황색 고체 (94.0% 순도)를 수득하였다.
HM04 유리 염기 (187 g, 0.39 mol, 1.0 당량, 99.3% 순도) 및 1.9 L의 ACN을 온도 프로브 및 오버헤드 교반기가 장착된 3 L 플라스크에 순차적으로 첨가하고, 질소 하에 15℃에서 교반하여 담황색 현탁액을 수득하였다. 푸마르산 (45.6 g, 0.39 mol, 1.0 당량)을 플라스크에 첨가하였고, 1분 후에 백색 현탁액이 생성되었다. 반응 현탁액을 실온에서 밤새 교반하고, 여과하고 (15-20 μm, 회분<0.15), ACN (50 mL x 2)으로 2회 세척하고, 6시간 동안 진공 하에 50℃에서 건조시켜 담황색 고체로서 207 g의 HM04 푸마레이트 염 (99.4% 순도 (HPLC에 의한 AUC, 체류 시간 = 11.1분); 57.8% 수율; 3100 ppm 잔류 ACN)을 수득하였다. 여과물을 진공 하에 농축시켜 담황색 고체로서 20.1 g의 HM04 푸마레이트 염 (97.3% 순도)을 수득하였다.
생성물의 분획 (117 g)을 잔류 아세토니트릴 함량을 낮추기 위해 진공 오븐 (20-40 mmHg)에서 추가로 건조시켰다. 60℃에서 6시간, 15시간, 및 72시간 동안; 또한 65℃에서 18시간 동안 건조시킨 후에, 잔류 아세토니트릴 함량은 각각 3100 ppm, 2570 ppm, 1300 ppm, 및 256 ppm으로 측정되었다. 건조 공정 후에, 98 g의 HM04 푸마레이트 염을 단리하였다 (99.4% 순도 (HPLC에 의한 AUC, 체류 시간 = 11.0분)); 1H-NMR (400 MHz, DMSO): δ = 1.49-1.58 (m, 2H), 1.81-1.92 (m, 2H), 2.44-2.53 (m, 5H), 2.78 (s, 3H), 3.12 (m, 2H), 4.06-4.13 (m, 1H), 6.36-6.41 (m, 1H), 6.55 (s, 2H), 7.47 (d, 1H), 7.73 (d, 1H), 8.11 (d, 1H), 8.75 (d, 1H), 8.81-8.82 (m, 1H), 8.99 (d, 1H). 부분 배치를 건조시킨 후에 단리된 98g의 HM04 푸마레이트 염의 수율을 전체 배치로 외삽하여 단계 10에 대해 48%의 근사 수율을 계산하였다.
60℃에서 6시간, 15시간, 및 72시간 동안; 또한 65℃에서 18시간 동안 건조시킨 후에 수득된 HM04 푸마레이트 염 생성물의 XRPD 분석이 수행되었다 (각각 도 6-9 참조). XRPD 프로파일은 HM04 푸마레이트 염 생성물이 형태 1과 일치함을 제시하였다.
실시예 6. HM04 푸마레이트 염 형태 1의 능률적 합성
실시예 5의 단계 10을 사용하여 제조된 HM04 푸마레이트 염의 전체 수율은 대략 48%로 계산되었다. 전체 수율을 증가시키기 위해, HM04 유리 염기를 단리하는 단계를 제거한 능률적 합성이 조사되었다. 특히, 도 5에 제시된 실시예 5의 방법의 단계 10이 변화되었다. 실시예 5의 단계 9 다음부터 시작하는 능률적 합성의 개관이 도 10에 제시되어 있다.
능률적 HM04 푸마레이트 염 시행 1: DCM (121.4 g), CDI (20.0 g, 123 mmol, 2 당량) 및 DABCO (3.5 g, 31 mmol)를 불활성화된 1 L 반응기에 순차적으로 첨가하였다. 혼합물을 -10℃로 냉각시켰다. 별도로, DCM의 용액 (132.5 g) 및 화합물 12 (20.0 g, 62.1 mmol)를 용기에 충전하고, 용액이 수득될 때까지 교반하였다. 내부 온도를 -10 내지 -5℃에서 유지함으로써, 이 용액을 33분에 걸쳐 1 L 반응기에 적하하였다. 첨가가 종료되면, 용기를 DCM (7.0 g)으로 헹구고, 이를 이어서 반응 혼합물에 첨가하였다. 밤새 (19시간) 교반한 다음 양성 IPC 후에, 화합물 10 (15.9 g, 124 mmol, 2 당량)을 15분에 걸쳐 첨가하고, 용기를 DCM (9.0 g)으로 헹구었다. 0℃에서 가열하고, 1시간 교반한 다음, 양성 IPC에 이어 추가로 1.5시간 교반한 후에, 혼합물을 실온에서 가열하고, 물 (200.1 g)을 충전하였다. 수성 층을 분리하고, 유기 층을 1 N HCl (201, 200 g)로 2회 추출하였다. 생성물을 함유하는 합한 수성 층을 TBME (148 g)로 세척하였다. 유기 층의 제거 후에, 수성 층에 pH 9.61에 도달할 때까지 DCM (265.0 g) 및 50% K2CO3 용액 (약 240 ml)을 충전하였다.
한편, 물 (240 g) 중 KH2PO4 (8.2 g)의 용액을 제조하였다. 생성물을 함유하는 유기 층에 pH 7.12에 도달할 때까지 KH2PO4 용액 (142.2 g)을 충전하였다. 수성 층의 분리 후에, 유기 층을 물 (200 g)로 세척하였다. 수성 층의 분리 후에, 유기 층을 50℃에서 증발시켰다. ACN (314.4 g)을 첨가하고, 용매를 다시 진공 하에 70-75℃에서 증류시켰다. ACN (235.8 g)을 첨가하고, 용매를 다시 진공 하에 증류시켰다. ACN (141.5 g)을 첨가하고, 생성된 용액을 폴리시 여과하고, 필터를 ACN (16 g)으로 세척하였다. 60℃에서 가열한 후에, 푸마르산 (7.2 g, 62 mmol)을 용액에 첨가하여, 백색 침전물을 생성하였다. 1시간에 걸쳐 20℃로 냉각시킨 후에, 현탁액을 여과하고, TBME (2 x 30 g)로 2회 세척하였다. 질소 유동 하에 필터 상에서 건조시킨 후에, 70.7 g의 습윤 미정제 생성물을 수득하였다. 이를 1시간 동안 TBME (177.0 g)로 슬러리화하고, 여과하고, TBME (70 g)로 세척하였다. 질소 유동 하에 필터 상에서 건조시킨 후에, 33.0 g의 습윤 생성물을 수득하였다. 진공 하에 50℃에 가열하면 HM04 푸마레이트 염 (21.1 g; HPLC에 의한 99.8% 순도; 57% 수율)의 백색 분말로서 건조 생성물을 제공하였다. XRPD 분석에 의해 생성물이 형태 1인 것으로 확인되었다 (도 11 참조).
실시예 6, 7 및 8에 기재된 XRPD 분석은 엑스퍼트 프로 패널리티컬(X'Pert PRO PANalytical) 회절계 및 하기 실험 조건을 사용하여 수행하였다:
튜브 애노드: Cu
튜브 전압: 40 kV
튜브 전류: 40 mA
파장 알파1: 1.5406 Å
파장 알파2: 1.5444 Å
시작 각도 (2 세타): 3
종료 각도 (2 세타): 40
카운팅 시간: 12,700초
스캔 모드: 연속 스캔
능률적 HM04 푸마레이트 염 시행 2: 상기 기재된 능률적 방법을 HM04 푸마레이트 염의 우수한 결정화 특성을 활용하도록 추가로 최적화하였다. ACN 및 푸마르산의 첨가 후에 직접적인 유리 염기의 단리 및 HM04 푸마레이트 염 생성물의 단리를 스킵하는 것 이외에도, 본 시행에서는 유리 염기의 산/염기 추출 후처리 또한 생략하였다. 초과량의 푸마르산은 TBME 중에서의 슬러리화로 제거하였다.
DCM (120 g), CDI (20.1 g, 124 mmol, 2 당량) 및 DABCO (3.5 g, 31 mmol)를 불활성화된 1 L 반응기에 순차적으로 첨가하였다. 혼합물을 -10℃로 냉각시켰다. 별도로, DCM의 용액 (133.8 g) 및 화합물 12 (20.1 g, 62.4 mmol)를 용기에 충전하고, 용액이 수득될 때까지 교반하였다. 내부 온도를 -10 내지 -5℃에서 유지함으로써, 이 용액을 39분에 걸쳐 1 L 반응기에 적하하였다. 첨가가 종료되면, 용기를 DCM (7 g)으로 헹구고, 이를 이어서 반응 혼합물에 첨가하였다. 밤새 (18시간) 교반한 다음 양성 IPC 후에, 화합물 10 (15.9 g, 124 mmol, 2 당량)을 15분에 걸쳐 첨가하고, 용기를 DCM (7 g)으로 헹구었다. 0℃에서 가열하고, 1시간 교반한 다음, 양성 IPC 후에, 혼합물에 물 (200 g)을 충전하고, 실온에서 가열하였다.
한편, 물 (402 g) 중 KH2PO4 (13.8 g)의 용액을 제조하였다. 수성 층을 분리하고, 생성물을 함유하는 유기 층에 pH 7에 도달할 때까지 KH2PO4 용액을 충전하였다. 수성 층의 분리 후에, 유기 층을 물 (200 g)로 세척하였다. 수성 층의 분리 후에, 유기 층을 폴리시 여과하고, 필터를 ACN (64 g)으로 세척하였다. 푸마르산 (7.2 g, 62 mmol)을 용액에 첨가하여, 백색 침전물을 생성하였고, 이를 여과하고 ACN (2 x 31.5 g)으로 2회 세척하였다. 질소 유동 하에 필터 상에서 건조시킨 후에, 44.5 g의 습윤 미정제 생성물을 수득하였다. 이를 1시간 동안 TBME (266.8 g)로 슬러리화하고, 여과하고, TBME (2 x 30 g)로 2회 세척하였다. 질소 유동 하에 필터 상에서 건조시킨 후에, 45.0 g의 습윤 생성물을 수득하였다. 진공 하에 60℃에서 건조시키면 HM04 푸마레이트 염 (25.2 g; HPLC에 의한 99.6% 순도; 68% 수율)의 백색 분말로서 건조 생성물을 제공하였다. XRPD 분석에 의해 생성물이 형태 1인 것으로 확인되었다 (도 12 참조).
시행 2의 방법에 의한 HM 푸마레이트 염의 스케일업: DCM (418 g), CDI (70.5 g, 435 mmol, 2 당량) 및 DABCO (12.4 g, 111 mmol)를 불활성화된 2 L 반응기에 순차적으로 첨가하였다. 혼합물을 -10℃로 냉각시켰다. 별도로, DCM의 용액 (465 g) 및 화합물 12 (70.0 g, 217 mmol)를 용기에 충전하고, 용액이 수득될 때까지 교반하였다. 내부 온도를 -10 내지 -5℃에서 유지함으로써, 이 용액을 24분에 걸쳐 2 L 반응기에 적하하였다. 첨가가 종료되면, 용기를 DCM (25 g)으로 헹구고, 이를 이어서 반응 혼합물에 첨가하였다. 밤새 (20시간) 교반한 다음 양성 IPC 후에, 화합물 10 (55.7 g, 434 mmol, 2 당량)을 15분에 걸쳐 첨가하고, 용기를 DCM (24 g)으로 헹구었다. 0℃에서 가열하고, 1.5시간 교반한 다음, 양성 IPC 후에, 혼합물에 물 (700 g)을 충전하고, 실온에서 가열하였다.
한편, 물 (1401 g) 중 KH2PO4 (48.3 g)의 용액을 제조하였다. 수성 층을 분리하고, 생성물을 함유하는 유기 층에 pH 7.03에 도달할 때까지 KH2PO4 용액을 충전하였다. 수성 층의 분리 후에, 유기 층을 물 (700 g)로 세척하였다. 수성 층의 분리 후에, 유기 층을 폴리시 여과하고, 필터를 ACN (220.5 g)으로 세척하였다. 푸마르산 (25.3 g, 218 mmol)을 용액에 첨가하여, 백색 침전물을 생성하였고, 이를 여과하고, ACN (111 g)으로 세척하였다. 질소 유동 하에 필터 상에서 건조시킨 후에, 생성물을 80분 동안 TBME (933 g)로 슬러리화하고, 여과하고, TBME (2x104 g)로 2회 세척하였다. 질소 유동 하에 필터 상에서 건조시킨 후에, 80.8 g의 습윤 생성물을 수득하였다. 진공 하에 60℃에서 건조시키면 HM04 푸마레이트 염 (78.0 g; HPLC에 의한 99.5% 순도; 61% 수율)의 백색 분말로서 건조 생성물을 제공하였다. XRPD 분석에 의해 생성물이 형태 1인 것으로 확인되었다 (도 13 참조).
능률적 HM04 푸마레이트 염 시행 3: DCM (120 g), CDI (20.2 g, 125 mmol, 2 당량) 및 DABCO (3.5 g, 31 mmol)를 불활성화된 1 L 반응기에 순차적으로 첨가하였다. 혼합물을 -20℃로 냉각시켰다. 별도로, DCM의 용액 (133 g) 및 화합물 12 (20.0 g, 62.1 mmol)를 용기에 충전하고, 용액이 수득될 때까지 교반하였다. 내부 온도를 -20 내지 -15℃에서 유지함으로써, 이 용액을 35 min.에 걸쳐 1 L 반응기에 적하하였다. 첨가가 종료되면, 용기를 DCM (7.2 g)으로 헹구고, 이를 이어서 반응 혼합물에 첨가하였다. 밤새 (24시간) 교반한 다음 양성 IPC 후에, 화합물 10 (15.9 g, 124 mmol, 2 당량)을 10분에 걸쳐 첨가하고, 용기를 DCM (7.0 g)으로 헹구었다. 0℃에서 가열하고, 1시간 교반한 다음, 양성 IPC 후에, 혼합물에 물 (200 g)을 충전하고, 실온에서 가열하였다.
한편, 물 (402 g) 중 KH2PO4 (13.7 g)의 용액을 제조하였다. 수성 층을 분리하고, 생성물을 함유하는 유기 층에 pH 7에 도달할 때까지 KH2PO4 (311.1 g) 용액을 충전하였다. 수성 층의 분리 후에, 유기 층을 물 (200 g)로 세척하였다. 수성 층의 분리 후에, 유기 층을 폴리시 여과하고, 필터를 ACN (63 g)으로 세척하였다. 푸마르산 (7.2 g, 62 mmol)을 용액에 첨가하여, 백색 침전물을 생성하였고, 이를 여과하고, ACN (32 g)으로 세척하였다. 질소 유동 하에 필터 상에서 건조시킨 후에, 53.7 g의 습윤 미정제 생성물을 수득하였다. 이를 40분 동안 TBME (267.0 g)로 슬러리화하고, 여과하고, TBME (2 x 30 g)로 2회 세척하였다. 질소 유동 하에 필터 상에서 건조시킨 후에, 41.8 g의 습윤 생성물을 수득하였다. 진공 하에 60℃에서 건조시키면 HM04 푸마레이트 염 (28.1 g; HPLC에 의한 99.7% 순도; 76% 수율)의 백색 분말로서 건조 생성물을 제공하였다. XRPD 분석에 의해 생성물이 형태 1인 것으로 확인되었다 (도 14 참조).
실시예 7. HM04 푸마레이트 염 형태 3의 합성
불활성화된 1 L 반응기에서 HM04 유리 염기 (16.0 g, 33.6 mmol)를 ACN (251 g) 중에 용해시켰다. 60℃에서 가열한 후에, 푸마르산 (3.9 g, 33.6 mmol) 및 ACN (2.6 g)으로의 헹굼액을 용액에 첨가하여, 백색 침전물을 생성하였다. 2시간에 걸쳐 20℃로 냉각시킨 후에, 생성물을 여과하였다. 질소 유동 하에 필터 상에서 건조시킨 후에, 6.4 g의 습윤 생성물을 수득하였다. 진공 하에 60℃에서 건조시키면 HM04 푸마레이트 염의 백색 분말로서 건조 생성물을 제공하였다. 상이한 결정질 형태인, 형태 3을 XRPD 분석에 의해 확인하였다 (도 15 참조).
실시예 8. HM04 푸마레이트 염 형태 4의 합성
DCM (120 g), CDI (20.0 g, 123 mmol, 2 당량) 및 DABCO (3.5 g, 31 mmol)를 불활성화된 1 L 반응기에 순차적으로 첨가하였다. 혼합물을 -10℃로 냉각시켰다. 별도로, DCM의 용액 (133 g) 및 화합물 12 (20.0 g, 62.1 mmol)를 용기에 충전하고, 용액이 수득될 때까지 교반하였다. 내부 온도를 -10 내지 -5℃에서 유지함으로써, 이 용액을 35분에 걸쳐 1 L 반응기에 적하하였다. 첨가가 종료되면, 용기를 DCM (7.0 g)으로 헹구고, 이를 이어서 반응 혼합물에 첨가하였다. 밤새 (18.5시간) 교반한 다음 양성 IPC 후에, 화합물 10 (15.8 g, 123 mmol, 2 당량)을 10분에 걸쳐 첨가하고, 용기를 DCM (6.8 g)으로 헹구었다. 0℃에서 가열하고, 1시간 교반한 다음, 양성 IPC에 이어 추가로 20분 교반한 후에, 혼합물을 실온에서 가열하고, 물 (200 g)을 충전하였다. 수성 층을 분리하고, 유기 층을 1 N HCl (2 x 200 g)로 2회 추출하였다. 생성물을 함유하는 합한 수성 층을 TBME (148 g)로 세척하였다. 유기 층의 제거 후에, 수성 층에 pH 9.66에 도달할 때까지 DCM (265.0 g) 및 50% K2CO3 용액 (약 240 ml)을 충전하였다.
한편, 물 (240 g) 중 KH2PO4 (8.2 g)의 용액을 제조하였다. 생성물을 함유하는 유기 층에 pH 7.10에 도달할 때까지 KH2PO4 용액 (138.2 g)을 충전하였다. 수성 층의 분리 후에, 유기 층을 물 (200 g)로 세척하였다. 수성 층의 분리 후에, 유기 층을 40℃에서 증발시켰다. TBME (370 g)를 첨가하고, 10 부피가 남을 때까지 다시 진공 하에 65℃에서 증류시켰다 (218.5 g의 용매가 수집됨). 푸마르산 (7.2 g, 62 mmol)을 용액에 첨가하여, 백색 침전물을 생성하였다. 2시간에 걸쳐 20℃로 냉각시키고, 이 온도에서 15시간 후에, 현탁액을 여과하고, 모액을 1회 재순환시키고, 생성물을 TBME (33 g)로 세척하였다. 질소 유동 하에 필터 상에서 건조시킨 후에, 26.5 g의 습윤 생성물을 수득하였다. 진공 하에 50-60℃에서 건조시키면 HM04 푸마레이트 염 (22.3 g; HPLC에 의한 99.9% 순도; 61% 수율)의 백색 분말로서 건조 생성물을 제공하였다. 상이한 결정질 형태인, 형태 4가 XRPD 분석에 의해 확인되었다 (도 16 참조).
실시예 9. 래트 및 개에서의 HM04 유리 염기 및 HM04 푸마레이트 염의 경구 투여의 약동학의 비교
HM04 유리 염기 또는 HM04 푸마레이트 염을 사용하여 10% DMAC, 6% 솔루톨, 및 84% PBS의 용액 중에 제제화된 3 mg/kg HM04 (유리 염기의 중량 기준)의 단일 경구 투여로 투약받은 수컷 스프라그 돌리 래트의 혈장에서의 HM04의 약동학을 비교하였다. 혈액 샘플을 설정된 시간 간격으로 채혈하여, HM04의 혈장 농도를 LC-MS/MS에 의해 측정하였다. HM04 유리 염기 및 HM04 푸마레이트 염을 경구로 투약받은 래트에서의 시간 경과에 따른 HM04의 혈장 농도 (ng/mL)의 비교가 도 17에 제공되어 있다.
약동학 분석의 요약이 하기 표 3에 제공되어 있다. 3 mg/kg HM04 유리 염기에서의 생체이용률은 3 mg/kg HM04 유리 염기를 3 마리의 수컷 스프라그 돌리 래트에게 정맥내 투여한 이후 결정된 990.3 ± 24.6 ng*h/mL의 평균 AUC에 대한 경구 평균 AUC의 비로부터 계산되었다. 3 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준)에서의 생체이용률은 3 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준)을 3마리의 수컷 스프라그 돌리 래트에게 정맥내 투여한 이후 결정된 2103.3 ± 357.7 ng*h/mL의 평균 AUC에 대한 경구 평균 AUC의 비로부터 계산되었다.
표 3.
*N=1; 3마리 중 2마리의 동물에서의 농도가 정량 수준 미만이었다.
HM04 유리 염기 또는 HM04 푸마레이트 염을 사용하여 10% DMAC, 6% 솔루톨, 및 84% PBS의 용액 중에 제제화된 2 mg/kg HM04의 단일 경구 투여로 투약받은 수컷 비글 개의 혈장에서의 HM04의 약동학을 비교하였다. HM04 유리 염기 및 HM04 푸마레이트 염을 경구로 투약받은 개에서의 시간 경과에 따른 HM04의 혈장 농도 (ng/mL)의 비교가 도 18에 제공되어 있다.
약동학 분석의 요약이 하기 표 4에 제공되어 있다. 생체이용률은 정맥내 평균 AUC에 대한 경구 평균 AUC의 용량 정규화된 비 (AUCpo/AUCiv x 용량iv/용량po)로부터 계산되었다. 2 mg/kg HM04 유리 염기에서의 생체이용률은 1 mg/kg HM04 유리 염기를 3마리의 수컷 비글 개에게 정맥내 투여한 이후 결정된 782.1 ± 363.5 ng*h/mL의 평균 AUC에 대한 경구 평균 AUC의 용량 정규화된 비로부터 계산되었다. 2 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준)에서의 생체이용률은 1 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준)을 3마리의 수컷 비글 개에게 정맥내 투여한 이후 결정된 1126.1 ± 363.6 ng*h/mL의 평균 AUC에 대한 경구 평균 AUC의 용량 정규화된 비로부터 계산되었다.
표 4.
실시예 10. 래트 및 개에서의 HM04 푸마레이트 염의 단일 경구 전달의 약동학
6-주령 수컷 스프라그 돌리 래트 및 수컷 비글 개 (1-5년령)에게 HM04 푸마레이트 염을 단일 경구 투여한 후 혈장에서의 HM04의 약동학을 조사하였다. 5% 글루코스 용액 중 0.6 mg/mL, 2 mg/mL, 및 6 mg/mL HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준)의 시험 제제를 제조하였다. 3, 10, 및 30 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준)의 용량을 각각의 3종의 시험 제제의 5 mL/kg 용량 부피로 위관 영양법에 의해 투여하였다. 각각의 용량 그룹에 4마리의 동물이 포함되었다. 제제를 공복 상태에 있는 개에게 투여하였고, 투약 후 3시간에 음식물을 제공하였다.
시간 경과에 따른 래트에서의 HM04의 혈장 농도 (ng/mL)의 비교가 도 19에 제공되어 있으며, 약동학 분석의 요약이 하기 표 5에 제공되어 있다. 3 mg/kg에서의 생체이용률은 3 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준)을 4마리의 수컷 스프라그 돌리 래트에게 정맥내 투여한 이후 결정된 1760 ± 196 ng*h/mL의 평균 AUC (정맥내 3 mg/kg 평균 AUC (n=4))에 대한 경구 평균 AUC의 비로부터 계산되었다. 10 mg/kg에서의 생체이용률은 10 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준)을 4마리의 수컷 스프라그 돌리 래트에게 정맥내 투여한 이후 결정된 6170 ± 1770 ng*h/mL의 평균 AUC에 대한 경구 평균 AUC의 비로부터 계산되었다. 평균 경구 생체이용률과 연관된 표준 편차는 하기 식에 따라 계산되었다:
여기서 q = 평균 생체이용률이고; mx = 경구 용량-정규화된 평균 AUC이고, my = IV 용량-정규화된 평균 AUC이다.
표 5
최후 = 최후로 검출가능한 농도가 측정된 시간.
BLQ = 정량 한계 미만.
*N=1; 4마리 중 3마리의 동물에서의 농도가 정량 수준 미만이었다.
+ N=2; § N=3.
HM04에 대한 노출은 용량에 따라 증가하였으며, 30 mg/kg에서는 비례 증가를 초과하였다. 3, 10, 및 30 mg/kg을 래트에게 단일 경구 투여한 후에, HM04는 4시간 이내에 그의 Cmax를 달성하였다. 경구 투약 후에, 화합물은 3 및 10 mg/kg의 용량에서 약 40-50%의 생체이용률로 흡수되었다.
시간 경과에 따른 개에서의 HM04의 혈장 농도 (ng/mL)의 비교가 도 20에 제공되어 있으며, 약동학 분석의 요약이 하기 표 6에 제공되어 있다.
표 6
BLQ = 정량 한계 미만.
* 투약 전 농도가 결정되었다. 투약은 동일한 동물에서 적어도 4일의 간격을 두고 수행되었다.
** N=3; 3번 개는 이상치로서 통계에서 제외되었다.
3 mg/kg에서, HM04의 4개의 투약 전 농도 중 3개가 검출가능하였다 (범위 5.15 - 8.31 ng/mL). 샘플을 이중으로 재분석하였고 양성으로 확인되었다. 추가로, 경구 10 mg/kg에서, 2번 개는 검출가능한 투약 전 농도 (8.60 ng/mL)를 제시하였다. 이 농도가 이전 3 mg/kg 용량으로부터의 잔류 농도일 가능성은 낮은데, 그 이유는 상기 농도가 24시간에 정량 한계 미만이 되기 때문이다. 분석 방법의 정량 하한치 (2.5 ng/mL)에 근접한, 이들 값은 0 값으로 대체되어 계산에서 제외되었다.
HM04 푸마레이트 염의 단일 경구 투여의 경우에, HM04의 최대 농도는 투약 후 1시간 이내에 신속히 달성되었다. 2마리를 제외한 모든 개에서 투약 후 24시간까지 화합물의 검출가능한 농도가 측정되었다. 최대 농도의 달성 후에, HM04 혈장 수준은 정맥내 투여 후의 반감기 (범위 4-5시간)와 유사한 겉보기 최종 반감기 (범위 4-7시간)로 감소하였다. 3 내지 30 mg/kg의 경구 용량 범위에서, Cmax는 용량에 거의 비례하여 증가한 반면, AUC는 용량에 대한 정비례를 초과하여 증가하였다. HM04의 경구 생체이용률은 화합물의 낮은 클리어런스와 일치하여 높았다.
3 mg/kg에서의 경구 절대 생체이용률은 3 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준)을 동일한 4마리의 수컷 비글 개에게 정맥내 투여한 이후 결정된 개별 AUC∞ 값에 대한 개별 경구 AUC∞의 비로부터 계산되었다. 하기 개별 경구 및 IV AUC∞ 값이 결정되었다: 1번 개: 각각 4930 및 6190 ng*h/mL; 2번 개: 각각 1440 및 3100 ng*h/mL; 3번 개: 각각 1160 및 3210 ng*h/mL; 및 4번 개: 각각 1850 및 3070 ng*h/mL.
10 mg/kg에서의 경구 절대 생체이용률은 10 mg/kg HM04 푸마레이트 염 (유리 염기의 중량 기준)을 동일한 4마리의 수컷 비글 개에게 정맥내 투여한 이후 결정된 개별 AUC∞ 값에 대한 개별 경구 AUC∞의 비로부터 계산되었다. 하기 개별 경구 및 IV AUC∞ 값이 결정되었다: 1번 개: 각각 17500 및 22500 ng*h/mL; 2번 개: 각각 8780 및 13200 ng*h/mL; 3번 개: 각각 8470 및 15500 ng*h/mL; 및 4번 개: 각각 10900 및 14900 ng*h/mL.
혈장 HM04 농도는 96-웰 플레이트 포맷으로 단백질 침전 이후에 LC-MS/MS에 의해 측정하였다. 분석할 때 샘플을 주위 온도에서 해동시켰다. 래트 또는 개 K3EDTA 혈장의 25 μL의 분취물을 300 μL의 내부 표준 (25 ng/mL의 아세토니트릴 중 HM04-d8)과 섞었다. 5분 동안의 완만한 볼텍싱 혼합 및 4℃에서 15분 동안의 2010g에서의 원심분리 후에, 유기 상의 100 μL의 분취물을 P3-에볼루션 로봇 시스템 (퍼킨 엘머)을 사용하여, 새로운 96-웰 폴리프로필렌 플레이트로 옮겼다. 100 μL의 10 nM 포름산암모늄 pH 3.5로 희석한 이후에, 10 μL의 분취물을 LC-MS/MS 시스템에 주입하였다. LC-MS/MS 조건은 하기 표 7에 제공되어 있다.
표 7
실시예 11. 그렐린 수용체 (GHSR1a)와의 HM04의 길항제 활성
그렐린 수용체 GHSR1a에 대한 HM04의 결합 특성을 형광 영상화 플레이트 판독기 (FLIPR) 검정으로 이중으로 HM04 푸마레이트 염을 사용하여 연구하였다. HM04는 7.308 nM의 IC50 값으로 GHSR1a에 대해 유의한 길항제 활성을 제시하였다 (도 21a). 참조 GHSR1a 길항제 R011 (WO2005/048916, 실시예 30)으로 비교 시험을 또한 수행하였다. R011은 343 nM의 IC50 값으로 GHSR1a에 대해 길항제 활성을 제시하였다 (도 21b).
10 μM 이하의 농도에서 HM04 및 R011로 효능제 활성은 관찰되지 않았다 (도 21c 및 21d). 이노시톨 1 포스페이트 (IP-1) 역 효능제 활성 연구에서 HM04 및 R011은 둘 다 명백한 유의한 역 효능제 활성을 제시하지 않았다 (도 21e 및 21f). 시험관내 데이터는 HM04가 효능제 또는 명백한 역 효능제 활성을 갖지 않는 강력한 그렐린 길항제임을 시사한다.
화합물을 100% DMSO로 희석하여 30 mM 원액을 제조하였다. 시험 당일에, 원액으로부터 출발하여 연속 희석물을 제조하였다. FLIPR 검정을 위해서는: 1) 8 μl의 DMSO를 2 μl의 화합물 원액 (30 mM)에 첨가하여 10 μl의 6 mM 용액을 제조하고; 6 mM 용액의 1/2배 연속 희석물을 제조하여 10개 용량을 생성하고; 2) 검정 완충액 (DMSO 농도 2.5%)으로 원액을 1/40 희석함으로써 시험 용액을 수득하였다. IP-1 검정을 위해서는: 1) 29 μl의 DMSO를 1 μl의 화합물 원액 (30 mM)에 첨가하여 30 μl의 1 mM 용액을 제조하고; 1 mM 용액의 1/2배 연속 희석물을 제조하여 10개 용량을 생성하고; 2) 검정 완충액 (DMSO 최종 농도 1%)으로 원액을 1/100 희석함으로써 시험 용액을 수득하였다.
효능제 및 길항제 활성 연구를 위해, 인간 GHSR1a 수용체를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 (FLIPR) 검정에서 사용하였다. 시험 전날에, 세포를 30 μl의 완전 DMEM 배지가 들어있는 매트리겔(Matrigel)® 코팅된 384-웰 플레이트에 1.5 x 104개 세포/웰의 밀도로 시딩하고, 5% CO2 중 37℃에서 22-26시간 동안 인큐베이션하였다. 시험 당일에, 4x 로딩 염료를 각각의 웰에 첨가하였다 (384 웰 플레이트의 웰당 10 μl). 검정 플레이트를 암실에서 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 염료 함유량을 30초 동안 300 rpm에서 원심분리함으로써 제거하였다. 1mM 프로베네시드가 함유된 HBSS/Hepes (30 μl)를 플레이트메이트 매트릭스 (저속 설정, 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))로 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 FLIPR 테트라 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))에 위치시키고, 10 μl의 4x 작업 농도의 HM04 또는 R011을 FLIPR에 의해 첨가하였다 (효능제 모드). 형광 신호를 10분 동안 표준 설정에 따라 실온에서 FLIPR로 검출한 후에, 세포를 10 μl의 5x 작업 농도의 효능제 (FLIPR에 의해 첨가된 화합물)에 노출시켰다. 형광 신호를 후속 3분에 검출하였다 (길항제 모드).
역 효능제 활성 연구를 위해서는 시험 당일까지 상기 기재된 동일한 절차를 따랐다. 시험 당일에, 배지를 30초 동안 700 rpm에서 원심분리함으로써 제거하고, 20 μl/웰의 HM04 또는 R011을 함유하는 검정 완충액을 첨가하였다. 검정 플레이트를 암실에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. IP1-d2 (5 μl) 및 AB-Cryp (5 μl)를 멀티드롭 콤비를 사용하여 모든 웰에 순차적으로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 엔비전으로 620 nm 및 665 nm에서 판독하였다.
데이터는 상대 광 단위 (RLU)로 기록되었고, 그래프패드 소프트웨어 인크.(GraphPad Software Inc.)의 버전 6을 사용하여 분석되었다. HM04 및 R011에 대해 측정된 반수 최대 억제 농도 (IC50)는 비-선형 회귀 분석에 의해 계산되었다.
실시예 12. 래트에서의 그렐린-유도된 성장 호르몬 증가에 대한 HM04 푸마레이트 염의 효과
래트를 4개의 그룹으로 나누었다: 1) 1 ml/kg 염수 + 10 ml/kg 0.5% CMC p.o. (n=6); 2) 15 μg/kg 그렐린 i.v. + 10 ml/kg 0.5% CMC p.o. (n=6); 3) 15 μg/kg 그렐린 i.v.보다 2시간 전에 30 mg/kg HM04 푸마레이트 염 p.o. (n=6); 4) 15 μg/kg 그렐린 i.v.보다 30분 전에 10 mg/kg 그렐린 길항제 R011 i.p. (n=6). 혈액을 그렐린 주사 후 0 및 15분의 시점에 100 μl 샘플로서 수집하였다. 래트를 64.8 mg/kg 나트륨 펜토바르비탈로 마취시켰다. 혈액 수집을 위해 헤파린첨가된 염수 용액으로 채워진 카테터를 좌대퇴 동맥에 삽입하고, 연장 튜브, 1-mL 샘플링 시린지, 및 초과량의 혈액이 되돌아가도록 하는 3방 콕크를 장착하였다.
성장 호르몬 (GH)의 혈장 수준을 래트 GH ELISA (밀리포어(Millipore), 카탈로그 번호 EZRMGH-45K)를 사용하여 결정하였다. 측정은 이중으로 수행되었다. GH AUC 0-15 min을 사다리꼴 방법을 사용하여 계산하였다. 일원 및 이원 ANOVA 검정을 사용하여 그룹 간의 차이를 비교하였다. 모든 값은 평균 ± SEM으로 제시된다. 일원 ANOVA 후에 터키 사후 검정을 수행하며, 여기서 유의성은 < 0.05의 p 값 또는 < 0.01의 p 값에 의해 지시되었다.
염수의 주사는 혈장 GH의 약간의 증가를 초래하였다. 그렐린 자체는 주사로부터 15분 후에 GH의 강력한 증가를 유도하였다. 15 μg/kg 그렐린이 i.v. 투여된 후 평균 혈장 GH 농도는 90-120 ng/mL의 범위에 있었다. HM04 및 R011은 둘 다 그렐린-유도된 GH의 증가를 각각 35% 및 78%만큼 억제하였다. 그렐린 주사 이후 0 및 15분의 시점에 4개 그룹 각각에 대해 관찰된 평균 혈장 성장 호르몬 농도가 도 22에 제시되어 있다 (***p<0.01 vs 비히클; ### 그렐린 단독과 비교하여 p <0.05).
실시예 13. 프라더-윌리 마우스 모델에서의 HM04 푸마레이트 염의 효과
음식물 섭취 거동 및 글루코스 내성에 대한 HM04 푸마레이트 염의 효과를 프라더-윌리 증후군의 Snord116+/-(Het) 마우스 유전적 모델 (Het 마우스)에서 야생형 (WT) 한배새끼와 비교하여 조사하였다. D2R 효능제가 음식물 섭취를 저해하므로, FDA의 승인을 받은 D2R 효능제 카베르골린을 실험 대조군으로서 사용하였다. 상기 PWS 마우스 모델의 표현형 특징은 과식증, 출생후 성장 지연, 높은 그렐린, 및 낮은 성장 호르몬을 포함한다 (Ding F., et al. SnoRNA Snord116 (Pwcr1/MBII-85) deletion causes growth deficiency and hyperphagia in mice. PloS one. 2008;3(3):e1709). 이들 PWS 마우스는, 특히 명주기 동안에 WT 한배새끼보다 더 빈번하게 먹고, 음식물을 찾는 행위에 보다 더 적극적이다 (보다 많은 레벨 프레스) (데이터는 제시되지 않음).
10 mg/kg으로 복강내 (i.p.) 투약된 HM04는 3-, 7-, 또는 12-월령 WT 마우스에서 음식물 섭취를 감소시키지 않았다 (도 25-27 참조). HM04 (10 mg/kg, i.p.)는 3-월령 Het 마우스에서 투약 후 12 및 24시간에 음식물 섭취를 저해하였다 (도 26). HM04 (10 mg/kg, i.p.)는 12-월령 Het 마우스에서 투약 후 1시간에 음식물 섭취를 저해하였지만 (도 25a), 그 저해 수준이 유지되지는 않았다 (도 25b). 30 mg/kg으로 i.p. 투약된 HM04는 7-월령 Het 마우스에서 투약 후 최대 8시간 동안 음식물 섭취를 억제하였지만, WT 마우스에서는 그렇지 않았다 (도 26). HM04가 30 mg/kg으로 5일 동안 매일 07.00시에 8-월령 Het 마우스에게 경구로 투여되었을 때, 음식물 섭취는 체중에 영향을 미치지 않으면서 최대 2일까지 감소되었다 (도 30a 및 30b). HM04가 30 mg/kg으로 암주기 동안 18.00시에 8-월령 Het 마우스에게 경구로 투여되었을 때, 음식물 섭취는 제2일, 제3일, 제4일 및 제5일에 후속 명주기 동안 줄어들었고 제5일에 유의해졌다 (도 31a).
음식물 섭취에 대한 효과와 대조적으로, HM04는 Het 마우스에서 글루코스 내성에서의 개선을 제시하지 않은 반면, WT 마우스에서는 효과가 관찰되었다. 이들 결과는 HM04가 PWS와 연관된 과식증을 개선시킬 수 있지만, 그럼에도 불구하고 연령, 일주기 리듬, 에너지 상태, 및 대사와 관련된 인자가 약리학적 반응에 영향을 미칠 수 있다는 것을 시사한다.
급성 투여: 마우스 (3-, 7-, 및 12-월령)는 16시간 동안 공복 상태였고, 그 후에 하기 표 8에 따라 비히클 또는 HM04, 카베르골린, 또는 HM04 및 카베르골린을 함유하는 비히클의 단일 복강내 주사를 투여받았다.
표 8.
HM04는 주사용수 중에 용해시키고 카베르골린은 DMSO 중에 용해시켜, 5% DMSO/물 주사액을 제공하였다. 마우스는 이어서 음식물에의 자유로운 접근이 허용되었고, 누적 음식물 섭취를 투약 후 1, 2, 4, 8, 12, 및 24시간에 측정하였다. Het 마우스가 그의 WT 한배새끼 대조군보다 유의하게 더 작으므로, 음식물 섭취를 g 체중당 섭취량으로 표시하였다. 데이터를 유의성에 대해 이원 ANOVA, 본페로니 사후 검정 (그래프패드 프리즘, 프리즘 5.0, 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 분석하였다.
7-월령 코호트의 경우에는, 누적 음식물 섭취가 비히클-처리된 WT 마우스와 비교하여 비히클-처리된 Het 마우스에서 유의하게 상승하였다. 카베르골린은 이들 유전자형 둘 다에서 음식물 섭취를 억제하였다. 대조적으로, HM04 (10 mg/kg)는 WT 또는 Het 마우스에서 음식물 섭취를 억제하지 않았으며, 음식물 소비에 대한 카베르골린의 저해 효과를 증진시키지 못했다 (도 23a 및 23b).
3-월령 그룹의 경우에는, 누적 음식물 섭취가 처음 8시간 동안 비히클-처리된 마우스에서 유의하게 상이하지 않았다. 12 및 24시간에, Het 마우스는 WT 마우스보다 더 많은 음식물을 먹었다. HM04 (10 mg/kg)로의 처리는 Het 마우스에서 투약 후 12 및 24시간에 음식물 섭취를 유의하게 저해하였다 (도 24 참조). HM04는 WT 마우스에서는 음식물 섭취를 억제하지 못했다.
12-월령 마우스에서는, 음식물 섭취가 WT 마우스에서보다 비히클-처리된 Het 마우스에서 유의하게 더 많았다. HM04 (10 mg/kg)는 Het 마우스에서 투약 후 1시간에 음식물 섭취를 저해하였지만 (도 25a); 그러나, 억제 수준이 유지되지는 않았다 (도 25b).
비히클 또는 보다 고용량의 30 mg/kg의 HM04를 투여받은 7-월령 Het 및 WT 마우스 그룹을 또한 평가하였다. HM04 (30 mg/kg)는 WT 마우스에서는 음식물 섭취에 대해 어떤 뚜렷한 효과를 나타내지 않지만, Het 마우스에서는 최대 8시간 동안 음식물 섭취를 억제하였다 (도 26).
매일 투여: HM04가 매일 투여된다면 보다 더 효과적일 수 있는지를 시험하기 위해, 6-월령 마우스에게 비히클 또는 HM04 (10 mg/kg ip)를 함유하는 비히클을 10일 동안 07.00시에 1일 1회 주사하였고, 8-월령 마우스에게 비히클 또는 보다 고용량의 30 mg/kg의 HM04를 함유하는 비히클을 경구 위관영양법에 의해 5일 동안 07.00시 또는 18.00시에 매일 처리하였다. 하기 표 9에 요약이 제공되어 있다. 음식물 섭취 및 체중을 매일 측정하였다.
표 9.
6-월령 그룹에서는, 음식물 소비가 비히클-처리된 WT 및 Het 마우스에서 유의하게 상이하지 않았다. HM04 (10 mg/kg i.p.)로의 매일 처리는 WT 및 Het 마우스에서 음식물 섭취 (도 27a) 또는 체중 (도 27b)에 대해 어떤 뚜렷한 효과를 나타내지 않았다.
명주기 동안 07.00시에 처리된 8-월령 그룹에서는, 제2일까지 음식물 섭취의 유의한 저하가 관찰되었지만, 후속일에는 그렇지 않았다 (도 28a). 체중은 영향을 받지 않았다 (도 28b). HM04 WT 마우스에서는 음식물 섭취 또는 체중에서의 감소가 관찰되지 않았다 (도 28a 및 28b).
암주기 동안 18.00시에 처리된 8-월령 그룹의 경우에는, 음식물 섭취를 명주기 및 암주기 둘 다에서 측정하였다. 암주기가 시작될 때 마우스를 HM04로 처리하였음에도 불구하고, WT 또는 Het 마우스에서 암주기 동안에 음식물 소비의 저해가 관찰되지 않았다 (도 29b). 후속 명주기 (06.00-18.00) 동안에, 제2일, 제3일, 제4일, 및 제5일에 HM04-처리된 Het 마우스에서 음식물 섭취가 줄어들었지만, WT 마우스는 그렇지 않았고, 제5일에 유의해졌다 (도 29a).
상기 기술된 명세서는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 실시양태를 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 간주된다. 상기 상세한 설명 및 실시예는 특정 실시양태를 상술하며 본 발명자들에 의해 고려된 최적 방식을 기재한다. 그러나, 상기 내용이 본문에서 아무리 상세하게 나타날 수 있다 하더라도, 실시양태는 많은 방식으로 실시될 수 있으며 첨부된 청구범위 및 그의 임의의 등가물에 따라 해석되어야 한다는 것을 알 것이다.
본원에 사용된 약이라는 용어는, 명시적으로 지시되었든 또는 그렇지 않든, 예를 들어, 정수, 분수, 및 백분율을 포함한 수치 값을 지칭한다. 약이라는 용어는 일반적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자가 열거된 값과 등가인 것으로 (예를 들어, 동일한 기능 또는 결과를 갖는 것으로) 간주할 수치 값의 범위 (예를 들어, 열거된 범위의 +/-5-10%)를 지칭한다. 적어도 및 약과 같은 용어가 수치 값 또는 범위의 목록 앞에 있으면, 상기 용어는 목록에 제공된 값 또는 범위 모두를 수식한다. 일부 경우에, 약이라는 용어는 유효 숫자 자리에서 반올림한 수치 값을 포함할 수 있다.
Claims (34)
- (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아 푸마레이트 염.
- 제1항에 있어서, 1:1 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아:푸마레이트 염인 염.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 염의 적어도 50%가 결정질 형태인 염.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 염의 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%가 결정질 형태인 염.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 형태 1, 형태 2, 형태 3, 및 형태 4로부터 선택된 적어도 1종의 결정질 형태를 포함하는 염.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD에 의해 결정 시 도 12의 XRPD 패턴과 실질적으로 유사한 XRPD 패턴을 갖는 형태 1을 포함하는 염.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD에 의해 결정 시 도 3의 XRPD 패턴과 실질적으로 유사한 XRPD 패턴을 특징으로 하는 형태 2를 포함하는 염.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD에 의해 결정 시 도 15의 XRPD 패턴과 실질적으로 유사한 XRPD 패턴을 특징으로 하는 형태 3을 포함하는 염.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD에 의해 결정 시 도 16의 XRPD 패턴과 실질적으로 유사한 XRPD 패턴을 특징으로 하는 형태 4를 포함하는 염.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 7.8 ± 0.2, 9.5 ± 0.2, 14.3 ± 0.2, 16.7 ± 0.2, 17.2 ± 0.2, 18.5 ± 0.2, 18.8 ± 0.2, 19.3 ± 0.2, 20.0 ± 0.2, 20.7 ± 0.2, 22.4 ± 0.2, 23.2 ± 0.2, 25.6 ± 0.2, 27.2 ± 0.2, 31.7 ± 0.2, 및 32.4 ± 0.2도 2 세타에서의 피크를 포함하는, Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD 패턴을 특징으로 하는 형태 1을 포함하는 염.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 7.2 ± 0.2, 9.4 ± 0.2, 9.7 ± 0.2, 10.8 ± 0.2, 14.3 ± 0.2, 15.1 ± 0.2, 16.2 ± 0.2, 17.9 ± 0.2, 18.7 ± 0.2, 18.9 ± 0.2, 19.6 ± 0.2, 21.5 ± 0.2, 22.7 ± 0.2, 23.7 ± 0.2, 24.3 ± 0.2, 25.1 ± 0.2, 27.4 ± 0.2, 28.7 ± 0.2, 및 34.9 ± 0.2도 2 세타에서의 피크를 포함하는, Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD 패턴을 특징으로 하는 형태 3을 포함하는 염.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 12.2 ± 0.2, 13.2 ± 0.2, 15.0 ± 0.2, 15.4 ± 0.2, 17.6 ± 0.2, 18.1 ± 0.2, 19.5 ± 0.2, 20.2 ± 0.2, 20.9 ± 0.2, 21.4 ± 0.2, 23.0 ± 0.2, 23.4 ± 0.2, 24.4 ± 0.2, 24.8 ± 0.2, 25.9 ± 0.2, 27.9 ± 0.2, 28.9 ± 0.2, 29.6 ± 0.2, 30.7 ± 0.2도 2 세타에서의 피크를 포함하는, Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD 패턴을 특징으로 하는 형태 4를 포함하는 염.
- Cu K 알파 방사선을 사용한 XRPD에 의해 결정 시 도 1a의 XRPD 패턴과 실질적으로 유사한 XRPD 패턴을 갖는 결정질 (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 염 또는 제13항의 결정질 화합물을 포함하는 약물 제품.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 염 또는 제13항의 결정질 화합물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
- (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아를 푸마르산과 조합하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 염을 제조하는 방법.
- 제16항에 있어서, (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아가 푸마르산과 조합될 때 고체 형태로 존재하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아가 푸마르산과 조합될 때 용액으로 존재하는 것인 방법.
- 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아가 푸마르산과 조합되기 전에 산/염기 추출에 적용되는 것인 방법.
- 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, (R)-3-(1-(2,3-디클로로-4-(피라진-2-일)페닐)-2,2,2-트리플루오로에틸)-1-메틸-1-(1-메틸피페리딘-4-일)우레아가 푸마르산과 조합되기 전에 산/염기 추출에 적용되지 않는 것인 방법.
- 세포를 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 염, 제13항의 결정질 화합물, 제14항의 약물 제품, 또는 제15항의 조성물에 노출시키는 것을 포함하는, 세포에서의 그렐린 신호전달 활성을 감소시키는 방법.
- 제21항에 있어서, 세포가 시험관내에서 염, 결정질 화합물, 약물 제품, 또는 조성물에 노출되는 것인 방법.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, 그렐린 신호전달 활성이 형광 영상화 플레이트 판독기 (FLIPR) 검정에 의해 검출된 바와 같은 세포내 칼슘 수준에 의해 측정되는 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 세포내 칼슘 수준이 감소되는 것인 방법.
- 대상체에게 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 염, 제13항의 결정질 화합물, 제14항의 약물 제품, 또는 제15항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서의 그렐린 신호전달 활성을 감소시키는 방법.
- 대상체에게 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 염, 제13항의 결정질 화합물, 제14항의 약물 제품, 또는 제15항의 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 그렐린 수준의 증가와 연관된 병태 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법.
- 제26항에 있어서, 병태 또는 장애가 음식물 남용, 알콜 중독, 및 프라더-윌리 증후군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제26항 또는 제27항에 있어서, 병태 또는 장애가 폭식, 비만, 다이어트-후 체중 반등, 및 과식증으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 염, 결정질 화합물, 약물 제품, 또는 조성물을 대상체에게 경구로 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 순환 성장 호르몬 수준이 조정되는 것인 방법.
- 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 순환 성장 호르몬 수준이 감소되는 것인 방법.
- 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 음식물 섭취가 감소되는 것인 방법.
- 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 체중이 감소되는 것인 방법.
- 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 체중이 안정화되는 것인 방법.
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