JP7101124B2 - 免疫凝集反応を用いた濃度測定における被験物質濃度の適正性の判定方法およびそのための処理部を有する試料分析装置 - Google Patents
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Description
これらの光学的測定においては、反応開始から特定時間後の濁度の変化速度と検体濃度との関係を示す検量線を用いて、測定された濁度の変化速度に基づいて被験物質の定量が行われている。これらの検量線では被験物質の濃度が高くなるに従い傾きが小さくなり、さらに高い濃度域では傾きが逆勾配の領域(プロゾーン領域)が生じる。
プロゾーン領域では検量線から2つの解が生じる為定量が行えない。そのため、試験対象がプロゾーン領域での高濃度物質を含んでいるかどうかを判定し、プロゾーン領域で被験物質を測定しているか否かを判定することが自動分析装置を用いた測定では重要である。
[1]反応液中の被験物質の濃度が免疫凝集反応を用いた濃度測定のために適正な範囲内のものであるか否かを判定する方法であって、
反応液中で生じた被験物質とその結合パートナーとの間の免疫凝集反応について、該反応の第1の期間における該反応液の散乱光強度、および、該反応の第2の期間における該反応液の散乱光強度に基づいて、該第1の期間における散乱光強度の変化速度と該第2の期間における散乱光強度の変化速度との間の変動に関する指標値を決定する工程、および、
該指標値と、予め設定された閾値とを比較することにより、該被験物質の濃度が適正な範囲内のものであるか否かを判定する工程
を含む、前記方法。
[2]該指標値が、該第1の期間における散乱光強度の変化速度と該第2の期間における散乱光強度の変化速度との比である、上記[1]に記載の方法。
[3]前記の散乱光強度として、散乱光強度の測定値と透過光強度の測定値との比が用いられる、上記[1]または[2]に記載の方法。
[4]該反応液が、該被験物質を含む湿性生体試料に由来する、上記[1]~[3]のいずれかに記載の方法。
[5]該湿性生体試料が、血液、唾液、尿、汗、リンパ液、および喀痰からなる群から選択されるものである、上記[4]に記載の方法。
[6]該被験物質が、蛋白質、ペプチド、脂質、核酸、多糖類、糖類、および抗体からなる群から選択されるものである、上記[1]~[5]のいずれかに記載の方法。
[7]該反応液が、該被験物質を含む検体試料と、該結合パートナーを担持した不溶性担体粒子を含む懸濁液とを混合することにより調製されたものである、上記[1]~[6]のいずれかに記載の方法。
[8]該不溶性担体粒子が、ラテックス、金属コロイド、シリカ、カーボン、および磁性体粒子からなる群から選択される1以上を含む、上記[7]に記載の方法。
[9]該適正な範囲の濃度が、プロゾーン現象を生じる濃度およびその付近の濃度のいずれでもない濃度である、上記[1]~[8]のいずれかに記載の方法。
[10]被験物質の濃度を測定し、該測定された濃度が所定の閾値濃度よりも低い場合に、該被験物質の濃度は適正な範囲内のものではないと判定する工程を更に含む、上記[1]~[9]のいずれかに記載の方法。
[11]試料分析装置であって、当該試料分析装置は、
散乱光強度を測定するための散乱光強度測定部と、
反応液中で生じた被験物質とその結合パートナーとの間の免疫凝集反応について、該反応の第1の期間における該反応液の散乱光強度、および、該反応の第2の期間における該反応液の散乱光強度に基づいて、該第1の期間における散乱光強度の変化速度と該第2の期間における散乱光強度の変化速度との間の変動に関する指標値を決定するための指標値決定部と、
該指標値と、予め設定された閾値とを比較することにより、該被験物質の濃度が免疫凝集反応を用いた濃度測定のために適正な範囲内のものであるか否かを判定するための第1判定部と
を有する、前記試料分析装置。
[12]該指標値が、該第1の期間における散乱光強度の変化速度と該第2の期間における散乱光強度の変化速度との比である、上記[11]に記載の試料分析装置。
[13]透過光強度を測定するための透過光強度測定部を更に有し、
前記の散乱光強度として、散乱光強度の測定値と透過光強度の測定値との比を用いる、上記[11]または[12]に記載の試料分析装置。
[14]該被験物質を含む湿性生体試料を分析するためのものである、上記[11]~[13]のいずれかに記載の試料分析装置。
[15]該湿性生体試料が、血液、唾液、尿、汗、リンパ液、および喀痰からなる群から選択されるものである、上記[14]に記載の試料分析装置。
[16]該第1判定部が、該被験物質の濃度が、プロゾーン現象を生じる濃度およびその付近の濃度のいずれでもない濃度であるか否かを判定するものである、上記[11]~[15]のいずれかに記載の試料分析装置。
[17]被験物質の濃度を測定するための濃度測定部を更に有する、上記[11]~[16]のいずれかに記載の試料分析装置。
[18]測定された該被験物質の濃度が所定の閾値濃度よりも低い場合に、該被験物質の濃度は適正な範囲内のものではないと判定するための第2判定部を更に有する、上記[17]に記載の試料分析装置。
本発明は、反応液中の被験物質の濃度が免疫凝集反応を用いた濃度測定のために適正な範囲内のものであるか否かを判定する方法を提供する。
本発明の判定方法は、
反応液中で生じた被験物質とその結合パートナーとの間の免疫凝集反応について、該反応の第1の期間における該反応液の散乱光強度、および、該反応の第2の期間における該反応液の散乱光強度に基づいて、該第1の期間における散乱光強度の変化速度と該第2の期間における散乱光強度の変化速度との間の変動に関する指標値を決定する工程、および、
該指標値と、予め設定された閾値とを比較することにより、該被験物質の濃度が適正な範囲内のものであるか否かを判定する工程
を含む。
第1の期間および第2の期間の選択は、決定される指標値の信頼性を著しく損なわない限り、任意の期間であってよい。第1の期間と第2の期間とは、一部分が重複していてもよい。一般に、反応開始直後(例えば、反応開始から5秒まで)は反応液がまだ十分に撹拌されていないため安定した信号が得られない可能性があるので、この期間は第1の期間または第2の期間として用いないことが好ましい。また、短時間での判定を可能とするという目的からは、具体的な反応系によっても異なるが、第1の期間および第2の期間は反応開始から例えば5分以内、好ましくは3分以内、より好ましくは2分以内、更に好ましくは1分以内の期間である。
一つの実施形態において、第1の期間および第2の期間の一方は、反応開始後に濁度が急速に変化する期間(反応の前期)であり、他方は、濁度が急速に変化する期間を過ぎて濁度の変化が緩やかになった後の期間(反応の後期)である。より詳細には、例えば、反応の前期は反応が平衡になるときの濁度の20%の濁度になる時点を含むものであってよく、反応の後期は、反応が平衡になるときの70%の濁度になる時点を含むものであってよい。実際には、これらの期間は、測定時間を任意に定め、測定期間から前期および後期を適宜定義することにより決定してもよい。対象とする反応系によっても異なるが、具体的には例えば、1測定の場合、反応開始から11~30秒を反応の前期、反応開始から41~60秒を反応の後期とすることができる。
散乱光強度(t)=S(t)/T(t);
(式中、S(t)は時点tにおいて測定された散乱光強度を示し、T(t)は時点tにおいて測定された透過光強度を示す。)
散乱光の信号は測定位置に入射する光量により変動するため、このように定義される散乱光強度を用いることにより、溶液中の測定位置における見かけの散乱光を減衰した透過光で補正することができる。
閾値は、複数の既知濃度の被験物質含有試料を用いて作成した検量線、および、これらの試料のそれぞれについて得られた上記指標値を用いて設定することができる。即ち、例えば、複数の既知濃度の被験物質含有試料を用いて作成した検量線から、プロゾーン現象が発生する濃度またはその手前の濃度を閾値濃度C0として設定でき、更に、該閾値濃度C0における指標値A0を、本発明の判定方法における測定方法と同一の条件下で求め、得られた指標値A0を上記閾値として設定することができる。検体試料について決定された指標値が、このようにして設定された閾値A0よりもよりも大きいのか、それとも小さいのかに応じて、検体試料中の被験物質濃度がプロゾーン領域またはその付近の濃度領域にあるのか否かを判定することができる。
本発明はまた、試料分析装置を提供する。本発明の試料分析装置は、上述の本発明の判定方法を実行するための処理部を有する装置である。従って、本発明の判定方法に関して上述した全ての実施形態、および好ましい態様等は本発明の試料分析装置についても同様に適用され得る。従って、当該装置による分析の対象とする試料および被験物質についても、上述の記載が適用され得る。
本発明の試料分析装置は、
散乱光強度を測定するための散乱光強度測定部と、
反応液中で生じた被験物質とその結合パートナーとの間の免疫凝集反応について、該反応の第1の期間における該反応液の散乱光強度、および、該反応の第2の期間における該反応液の散乱光強度に基づいて、該第1の期間における散乱光強度の変化速度と該第2の期間における散乱光強度の変化速度との間の変動に関する指標値を決定するための指標値決定部と、
該指標値と、予め設定された閾値とを比較することにより、該被験物質の濃度が免疫凝集反応を用いた濃度測定のために適正な範囲内のものであるか否かを判定するための第1判定部と
を有する。
本例の試料分析装置10は、散乱光強度測定部11、透過光強度測定部12、指標値決定部13、および第1判定部14を有して構成されている。本発明の判定方法に関して上述した通り、本発明による判定のために用いる散乱光強度として、散乱光強度の測定値を透過光強度の測定値にて補正したものを用いることができ、本例では、この目的のために、本発明の装置において必須の構成要素である散乱光強度測定部11、指標値決定部13、および第1判定部14に加えて、透過光強度測定部12を有している。但し、本発明の実施において、透過光強度による散乱光強度の補正は必ずしも必要ではなく、よって透過光強度測定部12は必須の構成要素ではない。
散乱光強度測定部11および透過光強度測定部12は、図2に例示的な概略のブロック図を示すように、一つの光学システムとして構成してもよい。図2に示す光学システムは、光源31、測定セル32、散乱光受光部33、透過光受光部34、および制御部35を有して構成されている。光源31は、ランプ、半導体レーザー、LED(発光ダイオード)等であってよく、単波長を照射できるという観点から半導体レーザーが好ましい。測定セル32には検体溶液が設置され、そこに光源31から光が照射される。その散乱光および透過光がそれぞれ散乱光受光部33および透過光受光部34により受光される。これらの受光部は、フォトダイオード等の受光素子により構成されたものであってよい。散乱光受光部33および透過光受光部34からのアナログ信号が制御部35に伝送され、制御部35はそれをデジタル信号に変換する。制御部35はまた、光源31、散乱光受光部33、および透過光受光部34を駆動するために、これらに電力を供給する。散乱光強度および透過光強度を計測するための上記の構成は、従来公知の光学測定装置と同様の構成を用いることができる。また、光の波長や散乱角度等の各種パラメータは、本発明の判定方法に関して上述した通りである。
本例の試料分析装置20は、散乱光強度測定部21、透過光強度測定部22、指標値決定部23、および第1判定部24に加えて、濃度測定部25および第2判定部26を有して構成されている。散乱光強度測定部21、透過光強度測定部22、指標値決定部23、および第1判定部24は、図1に示す試料分析装置10に関して説明した、それぞれ、散乱光強度測定部11、透過光強度測定部12、指標値決定部13、および第1判定部14と同様の構成であってよい。
濃度測定部25は、検体試料中の被験物質の濃度を測定するための機能部である。濃度測定のための方法は特に限定されず、例えば、透過光強度の測定値および/または散乱光強度の測定値と、予め作成された検量線を用いて自体公知の方法により濃度を測定することができる。よって、図3では、濃度測定部25と、透過光強度測定部22および散乱光強度測定部21とを破線で繋いでいる。
第2判定部26は、濃度測定部25により測定された被験物質の濃度が所定の閾値濃度よりも低い場合に、該被験物質の濃度は適正な範囲内のものではないと判定するための機能部である。本発明の判定方法に関して上述した通り、第2判定部による判定は第1判定部による判定よりも前に行うことが好ましい。試料分析装置20は、第2判定部により被験物質濃度は適正な範囲内ではないと判定した時には、それをユーザーに報告し、第1判定部による判定のための更なる処理(即ち、追加的な透過光および/または散乱光強度測定、指標値決定部および第1判定部による処理)を行わないように構成されていることが好ましい。
CRP測定手順
1.緩衝液を吸引し、測定セル内に吐出する。
2.次に溶血試薬を吸引し、測定セル内に吐出する。
3.検体を吸引し、測定セル内に吐出する。
4.ラテックス試薬を吸引し、測定セル内に吐出する。
5.測定セル内の溶液をよく撹拌する。
6.免疫反応が生じて、CRP測定を行う。吸光度の変化を1秒ごとに1分間測定する。そのときのデータは信号処理部を経て演算部に取り込まれる。
7.前記測定が終わると、CRPセルは希釈液で洗浄され、全ての測定が終わる。
8.測定によって得られたデータに基づいて、20秒から60秒までの吸光度の時間変化量を求め、予め既知濃度の血清より求めておいた検量線からCRP濃度を得る。
(横軸を吸光度の時間変化、縦軸を濃度として予め検量線を作っておく。)
たわみ値=Sp(40-59)/Sp(10-29)
Sp(10-29)は試薬反応開始後10秒から29秒までの平均単位時間変化量
Sp(40-59)は試薬反応開始後40秒から59秒までの平均単位時間変化量
濁度と散乱光は以下の関係で求めたものを用いた。
濁度=-log(Tt/T0)
T0:検出系ブランク時の透過光量
Tt:反応時間tにおける透過光量
散乱光=St/Tt
St:反応時間tにおける散乱光量
散乱光から計算したたたわみ値は、血清濃度8から16mg/dlにかけて急激に増加し、その後32mg/dLまで大きく増加する。その後、血清濃度によらず一定値を示すようになる。
プロゾーンを高精度に判定するためには、通常測定濃度では小さい値を示し、プロゾーンに近づくとその数値が大きく変化する性質をもつ指標がよい。測定ばらつきの影響を考慮すると、指標の変化幅が小さいほうが変化幅が大きい指標より低濃度で判定するようになる。図5中の16mg/dLから32mg/dLまでの数値変化量を吸光度の場合をΔRL、散乱光の場合をΔRSとすると、散乱光の数値の方が吸光度の数値より1.8倍同じ濃度変化量に対する変化量が大きい。この数値が大きいほど、測定ばらつきの影響が小さくなり、より高精度のプロゾーン判定が可能になる。プロゾーン判定の閾値を吸光度と散乱光とでDTとDSとすると、散乱光でのDSのほうがより吸光度のDTより閾値に対する変化量の余裕が大きく、より測定ばらつき影響が改善されていることがわかる。
11,21 散乱光強度測定部
12,22 透過光強度測定部
13,23 指標値決定部
14,24 第1判定部
25 濃度判定部
26 第2判定部
31 光源
32 測定セル
33 散乱光受光部
34 透過光受光部
35 制御部
Claims (18)
- 複数の既知濃度の被験物質と同等の物質を含有する試料について、免疫凝集反応の反応開始から経過した時間と、光学的測定値であって、濁度または吸光度である前記光学的測定値とから、該被験物質と同等の物質の各濃度での前記の反応開始から経過した時間と前記光学的測定値との関係を表す複数の反応曲線を作成し、続いて、該反応曲線に基づいて、(a)前記の被験物質と同等の物質の濃度と、(b)前記反応曲線から求めた反応開始後反応液の濁度が急速に変化する第1の期間における前記光学的測定値の変化速度との関係を表す濃度検量線を作成し、該濃度検量線を用いて被験物質の前記の第1の期間における光学的測定値の変化速度から被験物質の濃度を求める測定方法において、反応液中の被験物質の濃度が免疫凝集反応を用いた濃度測定のために適正な範囲内のものであるか否かを判定する方法であって、
反応液中で生じた被験物質とその結合パートナーとの間の免疫凝集反応について、該反応の第1の期間における該反応液の散乱光強度、および、該第1の期間の後に反応による反応液の濁度の変化が緩やかになる第2の期間における該反応液の散乱光強度に基づいて、該第1の期間における散乱光強度の変化速度と該第2の期間における散乱光強度の変化速度との間の変動に関する指標値を決定する工程を含み、該指標値は、該第1の期間における散乱光強度の変化速度と該第2の期間における散乱光強度の変化速度との比または差であり、かつ、
該指標値と、予め設定された閾値とを比較することにより、該被験物質の濃度が適正な範囲内のものであるか否かを判定する工程を含み、
該閾値は、前記濃度検量線を用いて、プロゾーン現象が発生する濃度、または、その手前の濃度を特定するとともに該濃度を閾値濃度として設定し、かつ、(a)前記の被験物質と同等の物質の濃度と、(c)複数の既知濃度の被験物質と同等の物質を含有する試料について、該反応の前記の第1の期間における該反応液の散乱光強度、および、該反応の前記の第2の期間における該反応液の散乱光強度に基づいて決定された、該第1の期間における散乱光強度の変化速度と該第2の期間における散乱光強度の変化速度との間の変動に関する指標値との関係を表す適正検量線を作成し、該適正検量線において前記閾値濃度における前記指標値を閾値とすることによって予め設定されたものであり、該指標値は、該第1の期間における散乱光強度の変化速度と該第2の期間における散乱光強度の変化速度との比または差である、
前記方法。 - 該指標値が、該第1の期間における散乱光強度の変化速度と該第2の期間における散乱光強度の変化速度との比である、請求項1に記載の方法。
- 前記の散乱光強度として、散乱光強度の測定値と透過光強度の測定値との比が用いられる、請求項1または2に記載の方法。
- 該反応液が、該被験物質を含む湿性生体試料に由来する、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 該湿性生体試料が、血液、唾液、尿、汗、リンパ液、および喀痰からなる群から選択されるものである、請求項4に記載の方法。
- 該被験物質が、蛋白質、ペプチド、脂質、核酸、多糖類、糖類、および抗体からなる群から選択されるものである、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 該反応液が、該被験物質を含む検体試料と、該結合パートナーを担持した不溶性担体粒子を含む懸濁液とを混合することにより調製されたものである、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 該不溶性担体粒子が、ラテックス、金属コロイド、シリカ、カーボン、および磁性体粒子からなる群から選択される1以上を含む、請求項7に記載の方法。
- 該適正な範囲の濃度が、プロゾーン現象を生じる濃度およびその付近の濃度のいずれでもない濃度である、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 被験物質の濃度を測定し、該測定された濃度が所定の閾値濃度よりも低い場合に、該被験物質の濃度は適正な範囲内のものではないと判定する工程を更に含む、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- 試料分析装置であって、当該試料分析装置は、
散乱光強度を測定するための散乱光強度測定部を有し、
指標値決定部を有し、該指標値決定部は、複数の既知濃度の被験物質と同等の物質を含有する試料について、免疫凝集反応の反応開始から経過した時間と、光学的測定値であって、濁度または吸光度である前記光学的測定値とから作成された、該被験物質と同等の物質の各濃度での前記の反応開始から経過した時間と前記光学的測定値との関係を表す複数の反応曲線に基づいて作成された、(a)前記の被験物質と同等の物質の濃度と、(b)前記反応曲線から求めた反応開始後反応液の濁度が急速に変化する第1の期間における前記光学的測定値の変化速度との関係を表す濃度検量線を用いて被験物質の前記の第1の期間における光学的測定値の変化速度から被験物質の濃度を求める際に、反応液中で生じた被験物質とその結合パートナーとの間の免疫凝集反応について、該反応の第1の期間における該反応液の散乱光強度、および、該第1の期間の後に反応による反応液の濁度の変化が緩やかになる第2の期間における該反応液の散乱光強度に基づいて、該第1の期間における散乱光強度の変化速度と該第2の期間における散乱光強度の変化速度との間の変動に関する指標値を決定するためのものであり、該指標値は、該第1の期間における散乱光強度の変化速度と該第2の期間における散乱光強度の変化速度との比または差であり、かつ、
該指標値と、予め設定された閾値とを比較することにより、該被験物質の濃度が免疫凝集反応を用いた濃度測定のために適正な範囲内のものであるか否かを判定するための第1判定部を有し、該閾値は、前記濃度検量線を用いて、プロゾーン現象が発生する濃度、または、その手前の濃度を特定するとともに該濃度を閾値濃度として設定し、かつ、(a)前記の被験物質と同等の物質の濃度と、(c)複数の既知濃度の被験物質と同等の物質を含有する試料について、該反応の前記の第1の期間における該反応液の散乱光強度、および、該反応の前記の第2の期間における該反応液の散乱光強度に基づいて決定された、該第1の期間における散乱光強度の変化速度と該第2の期間における散乱光強度の変化速度との間の変動に関する指標値との関係を表す適正検量線を作成し、該適正検量線において前記閾値濃度における前記指標値を閾値とすることによって予め設定されたものであり、該指標値は、該第1の期間における散乱光強度の変化速度と該第2の期間における散乱光強度の変化速度との比または差である、
前記試料分析装置。 - 該指標値が、該第1の期間における散乱光強度の変化速度と該第2の期間における散乱光強度の変化速度との比である、請求項11に記載の試料分析装置。
- 透過光強度を測定するための透過光強度測定部を更に有し、
前記の散乱光強度として、散乱光強度の測定値と透過光強度の測定値との比を用いる、請求項11または12に記載の試料分析装置。 - 該被験物質を含む湿性生体試料を分析するためのものである、請求項11~13のいずれか1項に記載の試料分析装置。
- 該湿性生体試料が、血液、唾液、尿、汗、リンパ液、および喀痰からなる群から選択されるものである、請求項14に記載の試料分析装置。
- 該第1判定部が、該被験物質の濃度が、プロゾーン現象を生じる濃度およびその付近の濃度のいずれでもない濃度であるか否かを判定するものである、請求項11~15のいずれか1項に記載の試料分析装置。
- 被験物質の濃度を測定するための濃度測定部を更に有する、請求項11~16のいずれか1項に記載の試料分析装置。
- 測定された該被験物質の濃度が所定の閾値濃度よりも低い場合に、該被験物質の濃度は適正な範囲内のものではないと判定するための第2判定部を更に有する、請求項17に記載の試料分析装置。
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