JP6989007B2 - マニピュレーションシステム及びマニピュレーションシステムの駆動方法 - Google Patents

Description

本発明は、マニピュレーションシステム及びマニピュレーションシステムの駆動方法に関する。

バイオテクノロジ分野において、微小な対象物に微細な操作を行うマイクロマニピュレーションシステムが知られている。マニピュレーションシステムは、顕微鏡観察下で、微小対象物を保持するための保持用ピペットで微小対象物の位置を固定しつつ、操作用ピペットを微小対象物の操作対象の位置に突き刺してインジェクション操作が行われる。これにより、マニピュレーションシステムは、細胞や卵にＤＮＡ溶液や細胞を注入する等の操作を行う。

下記特許文献１には、細胞（標本）へのインジェクションを自動で行うマニピュレーションシステムが記載されている。また、下記特許文献２には、微小対象物に対して電場を作用させることで、微小対象物の位置を変化させる位置決め装置が記載されている。

特許第４８３８５２０号公報 特開２００１−２３９５００号公報

インジェクション操作を行う場合、操作者の高い技術が必要であり、微小対象物の損傷や、操作者の感覚に依存した操作のバラツキが生じる可能性がある。これらの操作を自動制御で行う場合、微小対象物の操作対象位置を検出することが困難であり、操作対象位置に操作用ピペットを突き刺すことが困難な場合がある。

特許文献１のマイクロマニピュレータシステムは、微小対象物の操作対象位置の検出及び操作対象位置の位置決めは行っていない。また、特許文献２の位置決め装置は、電場を発生させる電極や制御装置を別途設ける必要があり、作業スペースを確保することが困難となる可能性がある。

本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであって、簡易な構成で微小対象物の操作対象位置を検出することができるマニピュレーションシステム及びマニピュレーションシステムの駆動方法を提供する。

上記の目的を達成するため、本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムは、微小対象物が載置される試料ステージと、前記微小対象物を保持するための第１ピペットを備える第１マニピュレータと、前記第１ピペットに保持された前記微小対象物を操作するための第２ピペットを備える第２マニピュレータと、前記微小対象物を撮像する撮像部と、前記試料ステージ、前記第１ピペット、前記第２ピペット及び前記撮像部を制御する制御部と、を備え、前記制御部は、前記試料ステージに垂直な方向から見たときに、前記微小対象物と重なり、かつ、前記第２ピペットの延在方向と直交する方向で前記微小対象物の中心から離れた位置で、前記第２ピペットを前記微小対象物の上側から前記試料ステージに近づく方向に移動させる。

これによれば、第２ピペットが高さ方向に移動して微小対象物に接触することで、微小対象物が回転する。このため、マニピュレーションシステムは、操作対象位置が検出されない場合においても、微小対象物を回転操作することで操作対象位置を変化させて、操作対象位置の検出が可能となる。また、第２ピペットにより回転操作を行うことができるため、マニピュレーションシステムは、微小対象物の回転操作のための専用機器が不要である。したがって、マニピュレーションシステムは、簡易な構成で微小対象物の操作対象位置を検出することができる。

マニピュレーションシステムの望ましい態様として、前記第２ピペットの先端は、前記試料ステージに垂直な方向から見たときに、前記微小対象物の外周よりも外側に配置されて、前記第２ピペットの軸部が前記微小対象物に接触する。これによれば、微小対象物の回転操作の際に、第２ピペットの先端が微小対象物に接触しない。このため、マニピュレーションシステムは、微小対象物の損傷や、第２ピペットの損傷を抑制することができる。

マニピュレーションシステムの望ましい態様として、前記制御部は、前記撮像部の画像データに基づいて前記微小対象物の操作対象位置を検出し、前記第２ピペットを前記操作対象位置に移動させて、前記微小対象物に対する操作を前記第２ピペットに実行させる。これによれば、制御部が、画像データに基づいて操作対象位置を検出するため、操作者の熟練度によらず、操作対象位置を検出することができる。また、操作対象位置の検出と、微小対象物に対する操作が制御部により自動で行われるため、マニピュレーションシステムは、効率よくかつ好適に微小対象物を操作することができる。

マニピュレーションシステムの望ましい態様として、前記制御部は、前記第１ピペットを高さ方向に操作し、異なる高さ位置ごとに撮像された前記微小対象物の複数の画像データに基づいて、前記微小対象物の操作対象位置を検出する。これによれば、マニピュレーションシステムは、精度よく操作対象位置を検出することができる。

本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムの駆動方法は、微小対象物が載置される試料ステージと、前記微小対象物を保持するための第１ピペットを備える第１マニピュレータと、前記第１ピペットに保持された前記微小対象物を操作するための第２ピペットを備える第２マニピュレータと、前記微小対象物を撮像する撮像部と、前記試料ステージ、前記第１ピペット、前記第２ピペット及び前記撮像部を制御する制御部と、を備えるマニピュレーションシステムの駆動方法であって、前記第１ピペットに保持された前記微小対象物の操作対象位置を、前記撮像部の画像データに基づいて前記制御部が検出する検出ステップと、前記検出ステップで前記操作対象位置が検出されない場合に、前記制御部は、前記試料ステージに垂直な方向から見たときに、前記微小対象物と重なり、かつ、前記第２ピペットの延在方向と直交する方向で前記微小対象物の中心から離れた位置で、前記第２ピペットを前記微小対象物の上側から前記試料ステージに近づく方向に移動させる回転ステップと、を含む。

これによれば、第２ピペットが高さ方向に移動して微小対象物に接触することで、微小対象物が回転する。このため、マニピュレーションシステムの駆動方法は、操作対象位置が検出されない場合においても、微小対象物を回転操作することで操作対象位置を変化させ、操作対象位置の検出が可能となる。また、第２ピペットにより回転操作を行うことができるため、マニピュレーションシステムの駆動方法は、回転操作のための専用機器が不要である。したがって、マニピュレーションシステムの駆動方法は、簡易な構成で微小対象物の操作対象位置を検出することができる。

本発明によれば、簡易な構成で微小対象物の操作対象位置を検出することができる。

図１は、実施形態に係るマニピュレーションシステムの構成を模式的に示す図である。 図２は、微動機構の一例を示す断面図である。 図３は、マニピュレーションシステムの制御ブロック図である。 図４は、実施形態のマニピュレーションシステムの駆動方法を示すフローチャート図である。 図５は、画像処理により検出された細胞及び核の模式図である。 図６は、マニピュレーションシステムによる細胞の核の位置の検出操作を示す模式図である。 図７は、マニピュレーションシステムによる細胞の回転操作を示すフローチャート図である。 図８は、マニピュレーションシステムによる細胞の回転操作を説明するための説明図である。 図９は、マニピュレーションシステムによる細胞の回転操作を説明するための説明図である。 図１０は、マニピュレーションシステムによる細胞の回転操作の変形例を説明するための説明図である。

以下、本発明につき図面を参照しつつ詳細に説明する。なお、下記の発明を実施するための形態（以下、実施形態という）により本発明が限定されるものではない。また、下記実施形態における構成要素には、当業者が容易に想定できるもの、実質的に同一のもの、いわゆる均等の範囲のものが含まれる。さらに、下記実施形態で開示した構成要素は適宜組み合わせることが可能である。

（実施形態）
図１は、実施形態に係るマニピュレーションシステムの構成を模式的に示す図である。マニピュレーションシステム１０は、顕微鏡観察下で微小対象物（例えば細胞や卵など）である試料を操作するためのシステムである。図１に示すように、マニピュレーションシステム１０は、顕微鏡ユニット１２と、第１マニピュレータ１４と、第２マニピュレータ１６と、マニピュレーションシステム１０を制御するコントローラ４３とを備えている。顕微鏡ユニット１２の両側に第１マニピュレータ１４と第２マニピュレータ１６とが分かれて配置されている。

顕微鏡ユニット１２は、撮像素子を含むカメラ１８と、顕微鏡２０と、試料ステージ２２とを備えている。試料ステージ２２は、シャーレなどの試料保持部材１１を支持可能であり、試料保持部材１１の直上に顕微鏡２０が配置される。顕微鏡ユニット１２は、顕微鏡２０とカメラ１８とが一体構造となっており、試料保持部材１１に向けて光を照射する光源（図示は省略している）を備えている。なお、カメラ１８は、顕微鏡２０と別体に設けてもよい。

試料保持部材１１には、試料を含む溶液が収容される。試料保持部材１１の試料に光が照射され、試料保持部材１１の試料で反射した光が顕微鏡２０に入射する。試料に関する光学像は、顕微鏡２０で拡大された後、カメラ１８で撮像される。顕微鏡ユニット１２は、カメラ１８で撮像された画像を基に試料の観察が可能となっている。

図１に示すように、第１マニピュレータ１４は、第１ピペット保持部材２４と、Ｘ−Ｙ軸テーブル２６と、Ｚ軸テーブル２８と、Ｘ−Ｙ軸テーブル２６を駆動する駆動装置３０と、Ｚ軸テーブル２８を駆動する駆動装置３２とを備える。第１マニピュレータ１４は、Ｘ軸−Ｙ軸−Ｚ軸の３軸構成のマニピュレータである。

なお、本実施形態において、水平面内の一方向をＸ軸方向、水平面内においてＸ軸方向と交差する方向をＹ軸方向、Ｘ軸方向及びＹ軸方向のそれぞれと交差する方向（すなわち鉛直方向）をＺ軸方向とする。試料ステージ２２の表面は、ＸＹ平面と平行であり、Ｚ軸方向と直交する。

Ｘ−Ｙ軸テーブル２６は、駆動装置３０の駆動により、Ｘ軸方向又はＹ軸方向に移動可能となっている。Ｚ軸テーブル２８は、Ｘ−Ｙ軸テーブル２６上に上下移動可能に配置され、駆動装置３２の駆動によりＺ軸方向に移動可能になっている。駆動装置３０、３２は、コントローラ４３に接続されている。

第１ピペット保持部材２４は、Ｚ軸テーブル２８に連結され、先端に毛細管チップである第１ピペット２５が取り付けられている。第１ピペット保持部材２４は、Ｘ−Ｙ軸テーブル２６とＺ軸テーブル２８の移動に従って３次元空間を移動領域として移動できる。第１ピペット保持部材２４は、試料保持部材１１に収容された試料を、第１ピペット２５を介して保持することができる。すなわち、第１マニピュレータ１４は、微小対象物の保持に用いられる保持用マニピュレータであり、第１ピペット２５は、微小対象物の保持手段として用いられるホールディングピペットである。

第２マニピュレータ１６は、第２ピペット保持部材３４と、Ｘ−Ｙ軸テーブル３６と、Ｚ軸テーブル３８と、Ｘ−Ｙ軸テーブル３６を駆動する駆動装置４０と、Ｚ軸テーブル３８を駆動する駆動装置４２とを備える。第２マニピュレータ１６は、Ｘ軸−Ｙ軸−Ｚ軸の３軸構成のマニピュレータである。

Ｘ−Ｙ軸テーブル３６は、駆動装置４０の駆動により、Ｘ軸方向又はＹ軸方向に移動可能となっている。Ｚ軸テーブル３８は、Ｘ−Ｙ軸テーブル３６上に上下移動可能に配置され、駆動装置４２の駆動によりＺ軸方向に移動可能になっている。駆動装置４０、４２は、コントローラ４３に接続されている。

第２ピペット保持部材３４は、Ｚ軸テーブル３８に連結され、先端にガラス製の第２ピペット３５が取り付けられている。第２ピペット保持部材３４は、Ｘ−Ｙ軸テーブル３６とＺ軸テーブル３８の移動に従って３次元空間を移動領域として移動できる。第２ピペット保持部材３４は、試料保持部材１１に収容された試料を人工操作することが可能である。すなわち、第２マニピュレータ１６は、微小対象物の操作（ＤＮＡ溶液の注入操作や穿孔操作など）に用いられる操作用マニピュレータであり、第２ピペット３５は、微小対象物のインジェクション操作手段として用いられるインジェクションピペットである。

Ｘ−Ｙ軸テーブル３６とＺ軸テーブル３８は、第２ピペット保持部材３４を、試料保持部材１１に収容された試料などの操作位置まで粗動駆動する粗動機構（３次元移動テーブル）として構成されている。また、Ｚ軸テーブル３８と第２ピペット保持部材３４との連結部には、ナノポジショナとして微動機構４４が備えられている。微動機構４４は、第２ピペット保持部材３４をその長手方向（軸方向）に移動可能に支持するとともに、第２ピペット保持部材３４をその長手方向（軸方向）に沿って微動駆動するように構成される。

図２は、微動機構の一例を示す断面図である。図２に示すように微動機構４４は、第２ピペット保持部材３４を駆動対象とする圧電アクチュエータ４４ａを備える。圧電アクチュエータ４４ａは、筒状のハウジング８７と、ハウジング８７の内部に設けられた転がり軸受８０、８２と、圧電素子９２とを含む。ハウジング８７の軸方向に第２ピペット保持部材３４が挿通される。転がり軸受８０、８２は、第２ピペット保持部材３４を回転可能に支持する。圧電素子９２は、印加される電圧に応じて第２ピペット保持部材３４の長手方向に沿って伸縮する。第２ピペット保持部材３４の先端側（図２左側）には第２ピペット３５（図１参照）が取り付けられ固定される。

第２ピペット保持部材３４は、転がり軸受８０、８２を介してハウジング８７に支持される。転がり軸受８０は、内輪８０ａと、外輪８０ｂと、内輪８０ａと外輪８０ｂとの間に設けられたボール８０ｃとを備える。転がり軸受８２は、内輪８２ａと、外輪８２ｂと、内輪８２ａと外輪８２ｂとの間に設けられたボール８２ｃとを備える。各外輪８０ｂ、８２ｂがハウジング８７の内周面に固定され、各内輪８０ａ、８２ａが中空部材８４を介して第２ピペット保持部材３４の外周面に固定される。このように、転がり軸受８０、８２は、第２ピペット保持部材３４を回転自在に支持するようになっている。

中空部材８４の軸方向の略中央部には、径方向外方に突出するフランジ部８４ａが設けられている。転がり軸受８０は、フランジ部８４ａに対して第２ピペット保持部材３４の先端側に配置され、転がり軸受８２はフランジ部８４ａに対して後端側に配置される。内輪間座としてのフランジ部８４ａを挟んで転がり軸受８０の内輪８０ａと、転がり軸受８２の内輪８２ａとが配置される。第２ピペット保持部材３４の外周面にねじ加工が施されており、内輪８０ａの先端側、及び内輪８２ａの後端側からロックナット８６、８６が第２ピペット保持部材３４に螺合される。これにより、転がり軸受８０、８２の軸方向の位置が固定される。

円環状のスペーサ９０は、転がり軸受８０、８２と同軸に外輪８２ｂの軸方向後端側に配置される。スペーサ９０の軸方向後端側には、円環状の圧電素子９２がスペーサ９０と略同軸に配置される。さらに圧電素子９２の軸方向後端側にはハウジング８７の蓋８８が配置される。蓋８８は、圧電素子９２を軸方向に固定するためのもので、第２ピペット保持部材３４が挿通する孔部を有する。蓋８８は、例えば、ハウジング８７の側面に不図示のボルトにより締結されていてもよい。なお、圧電素子９２は、棒状又は角柱状としてスペーサ９０の周方向に略等配となるように並べても良く、第２ピペット保持部材３４を挿通する孔部を有した角筒としても良い。

圧電素子９２はスペーサ９０を介して転がり軸受８２と接している。圧電素子９２は、リード線（図示せず）を介してコントローラ４３に接続されている。圧電素子９２は、コントローラ４３からの印加電圧に応答して軸方向に沿って伸縮し、第２ピペット保持部材３４をその軸方向に沿って微動させるようになっている。第２ピペット保持部材３４が軸方向に沿って微動すると、この微動が第２ピペット３５（図１参照）に伝達され、第２ピペット３５の位置が微調整されることになる。また、圧電素子９２により第２ピペット保持部材３４が軸方向に振動すると、第２ピペット３５も軸方向に振動する。このように微動機構４４により、微小対象物への操作（ＤＮＡ溶液や細胞の注入操作や穿孔操作など）の際には、より正確な操作が可能となり、圧電素子９２による穿孔作用の向上を実現できる。

なお、上述の微動機構４４は、微小対象物の操作用の第２マニピュレータ１６に設けられるとしているが、微小対象物の固定用の第１マニピュレータ１４に設けてもよく、省略することも可能である。

次に、コントローラ４３によるマニピュレーションシステム１０の制御について図３を参照して説明する。図３は、マニピュレーションシステムの制御ブロック図である。

コントローラ４３は、演算手段としてのＣＰＵ（Central Processing Unit）及び記憶手段としてのハードディスク、ＲＡＭ（Random Access Memory）、ＲＯＭ（Read Only Memory）等のハードウェア資源を備える。コントローラ４３は、記憶部４６Ｂに格納された所定のプログラムに基づいて各種の演算を行い、演算結果に従って制御部４６Ａが各種の制御を行うように駆動信号を出力する。

制御部４６Ａは、顕微鏡ユニット１２の焦点合わせ機構８１、第１マニピュレータ１４の駆動装置３０、駆動装置３２、シリンジポンプ２９、第２マニピュレータ１６の駆動装置４０、駆動装置４２、圧電素子９２、注入ポンプ３９を制御する制御回路である。制御部４６Ａは、必要に応じて設けられたドライバやアンプ等を介して、顕微鏡ユニット１２、第１マニピュレータ１４及び第２マニピュレータ１６のそれぞれに駆動信号を出力する。制御部４６Ａは、駆動装置３０、３２、４０、４２にそれぞれ駆動信号Ｖ_ｘｙ、Ｖ_ｚ（図１参照）を供給する。駆動装置３０、３２、４０、４２は、駆動信号Ｖ_ｘｙ、Ｖ_ｚに基づいてＸ−Ｙ−Ｚ軸方向に駆動する。制御部４６Ａは、微動機構４４にナノポジショナ制御信号Ｖ_Ｎ（図１参照）を供給して、微動機構４４の制御を行ってもよい。

コントローラ４３は、情報入力手段としてジョイスティック４７と、入力部４９とが接続されている。入力部４９は、例えばキーボードやタッチパネル、マウス等である。また、コントローラ４３は、液晶パネル等の表示部４５が接続される。表示部４５にはカメラ１８で取得した顕微鏡画像や各種制御用画面が表示されるようになっている。なお、入力部４９としてタッチパネルが用いられる場合には、表示部４５の表示画面にタッチパネルを重ねて用い、操作者が表示部４５の表示画像を確認しつつ入力操作を行うようにしてもよい。

ジョイスティック４７は公知のものを用いることができる。ジョイスティック４７は、例えば、基台と、基台から直立するハンドル部とを備えている。ジョイスティック４７は、ハンドル部を傾斜させるように操作することで駆動装置３０、４０のＸ−Ｙ駆動を行うことができ、ハンドル部をねじることで駆動装置３２、４２のＺ駆動を行うことができる。ジョイスティック４７は、シリンジポンプ２９、圧電素子９２、注入ポンプ３９の各駆動を操作するためのボタン４７Ａを備えていてもよい。

コントローラ４３は、さらに画像入力部４３Ａ、画像処理部４３Ｂ、画像出力部４３Ｃ及び位置検出部４３Ｄを備えている。顕微鏡２０を通してカメラ１８で撮像した画像信号Ｖ_ＰＩＸ（図１参照）が画像入力部４３Ａに入力される。画像処理部４３Ｂは、画像入力部４３Ａから画像信号を受け取って、画像処理を行う。画像出力部４３Ｃは、画像処理部４３Ｂで画像処理された画像情報を表示部４５へ出力する。位置検出部４３Ｄは、微小対象物である細胞１００等の位置や、細胞１００の核１００Ａ等の位置を、画像処理後の画像情報に基づいて検出することができる。細胞１００の核１００Ａは、第２ピペット３５によるインジェクション操作を行う操作対象である。位置検出部４３Ｄは、画像情報に基づいてカメラ１８の撮像領域内における細胞１００等の有無を検出することができる。また、位置検出部４３Ｄは、第１ピペット２５及び第２ピペット３５の位置を検出してもよい。画像入力部４３Ａ、画像処理部４３Ｂ、画像出力部４３Ｃ及び位置検出部４３Ｄは、制御部４６Ａにより制御される。

画像処理部４３Ｂは、例えば細胞１００の位置や細胞１００の核１００Ａの位置を検出するために、画像入力部４３Ａから受け取った画像信号について二値化処理とフィルタ処理を実行する。画像処理部４３Ｂは、画像信号をグレースケール化して、あらかじめ設定された所定の閾値に基づいて、このグレースケール画像をモノクロ画像に変換する。そして、画像処理部４３Ｂは、二値化処理とフィルタ処理により得られたモノクロ画像に基づいてエッジ抽出処理やパターンマッチングを行う。その処理結果に基づいて位置検出部４３Ｄは、細胞１００の位置や細胞１００の核１００Ａの位置を検出することができる。

制御部４６Ａは、位置検出部４３Ｄからの位置情報、及び細胞等の有無の情報に基づいて、第１マニピュレータ１４及び第２マニピュレータ１６を制御する。本実施形態において、制御部４６Ａは、第１マニピュレータ１４及び第２マニピュレータ１６を所定のシーケンスで自動的に駆動する。かかるシーケンス駆動は、記憶部４６Ｂにあらかじめ保存された所定のプログラムによるＣＰＵの演算結果に基づいて、制御部４６Ａが順次それぞれに駆動信号を出力することで行われる。

次にマニピュレーションシステム１０の駆動方法について説明する。図４は、実施形態のマニピュレーションシステムの駆動方法を示すフローチャート図である。図５は、画像処理により検出された細胞及び核の模式図である。図６は、マニピュレーションシステムによる細胞の核の位置の検出操作を示す模式図である。

本実施形態のマニピュレーションシステム１０は、試料保持部材１１に載置された複数の細胞１００に対して、１つの細胞１００ごとに操作を行い、複数の細胞１００について操作を繰り返し実行することができる。コントローラ４３は、複数の細胞１００に対する操作を自動で実行する。以下の説明では、１つの細胞１００に対する操作を説明する。ここで細胞１００は卵細胞である。

まず、操作者は、シャーレ等の試料保持部材１１を用意し、操作対象の細胞１００を試料保持部材１１の所定の位置に載置する。図１に示すように、第１ピペット２５と第２ピペット３５とは、間隔を有して対向して配置されている。細胞１００は、第１ピペット２５及び第２ピペット３５の近傍に配置される。

制御部４６Ａは、シリンジポンプ２９（図３参照）を駆動させ、第１ピペット２５の吸引を実行させる。これにより、第１ピペット２５の内部が陰圧となり、第１ピペット２５の開口２５ａに向かって試料保持部材１１の培養液の流れが発生する。細胞１００は、培養液とともに吸引されて、第１ピペット２５の開口２５ａ（図６参照）に保持される。

制御部４６Ａは、第１ピペット２５に保持された細胞１００をカメラ１８の撮像領域ＩＡ（図８参照）に移動させる。そして、制御部４６Ａは、顕微鏡ユニット１２によって細胞１００を撮像し、細胞１００の画像データを取得する（ステップＳＴ１１）。

次に、制御部４６Ａは、第１ピペット２５のＺ軸方向の移動回数ｎを比較する（ステップＳＴ１２）。ここで、移動回数ｎは、第１ピペット２５を高さピッチｈ１（図６参照）ずつ移動させて、核１００Ａの高さ位置ＨＰ０、ＨＰ１、ＨＰ２、ＨＰ３、ＨＰ４を変更した回数である。移動回数ｎは、記憶部４６Ｂに記憶される。

移動回数ｎが移動終了回数Ｎｅよりも小さい場合（ステップＳＴ１２、ｎ＜Ｎｅ）、制御部４６Ａは、移動回数ｎがｎ＝０であるかどうかを判断する（ステップＳＴ１３）。移動終了回数Ｎｅは、あらかじめ設定された第１ピペット２５のＺ軸方向の移動回数である。移動終了回数Ｎｅは、入力部４９から入力されて記憶部４６Ｂに記憶される。例えば、図６では移動終了回数Ｎｅは、Ｎｅ＝５である。移動終了回数Ｎｅは、４以下でもよく、６以上でもよい。移動終了回数Ｎｅは、例えば、細胞１００の大きさ、高さピッチｈ１、画像処理速度等に応じて変更できる。

移動回数ｎがｎ＝０である場合（ステップＳＴ１３、Ｙｅｓ）、制御部４６Ａは、移動回数ｎをｎ＝１に更新する（ステップＳＴ１３−１）。そして、制御部４６Ａは、細胞１００の核１００Ａを画像処理により検出する（ステップＳＴ１４）。卵細胞は半透明なので、図５左図に示すように、焦点が合っている高さ（焦点位置ＳＦ）で、細胞１００をスライスしたような画像データが得られる。この画像データについて、画像処理部４３Ｂが画像処理を行う。画像処理部４３Ｂは上述した二値化処理とフィルタ処理を実行する。これにより、図５右図に示すように、画像処理部４３Ｂは、核１００Ａと対応する位置の色が周囲と異なるモノクロ画像を出力し、エッジ抽出処理やパターンマッチングを行う。

制御部４６Ａは、画像処理の結果に基づいて核１００Ａが検出されたかどうかを判断する（ステップＳＴ１５）。核１００Ａが検出された場合（ステップＳＴ１５、Ｙｅｓ）、位置検出部４３Ｄは、図５右図に示す画像処理結果から、核１００Ａと対応する同等の大きさで、円形に近く、かつ周囲と色が異なる領域を検出する。これにより、位置検出部４３Ｄは、細胞１００の核１００Ａの位置を検出することができる。検出された核１００Ａの位置は、記憶部４６Ｂに記憶される。

制御部４６Ａは、第２ピペット３５により、核１００Ａの位置へのインジェクション操作を実行する（ステップＳＴ１６）。その後、制御部４６Ａは、第１ピペット２５及び第２ピペット３５を初期位置へ移動させて（ステップＳＴ１７）、核１００Ａの位置の検出及びインジェクション操作を終了する。

核１００Ａが検出されない場合（ステップＳＴ１５、Ｎｏ）、制御部４６Ａは、移動回数ｎの比較ステップ（ステップＳＴ１２、ステップＳＴ１３）を繰り返し実行する。移動回数ｎが移動終了回数Ｎｅよりも小さく（ステップＳＴ１２、ｎ＜Ｎｅ）、且つ、移動回数ｎがｎ＝０ではない場合（ステップＳＴ１３、Ｎｏ）、制御部４６Ａは、第１ピペット２５を高さ方向に操作する（ステップＳＴ２１）。

図６に示すように、制御部４６Ａは、第１ピペット２５を高さピッチｈ１ずつ移動させて、核１００Ａの高さ位置ＨＰ０、ＨＰ１、ＨＰ２、ＨＰ３、ＨＰ４を変更する。例えば、制御部４６Ａは、第１ピペット２５を、高さ位置ＨＰ０から高さ位置ＨＰ１にＺ軸方向に移動させる。なお、本明細書において、第１ピペット２５の高さ位置は、開口２５ａの中心を通る仮想線が、第１ピペット２５の端面と交差する位置の、Ｚ軸方向の高さである。制御部４６Ａは、第１ピペット２５の高さ位置を順次変更することで、核１００Ａの位置が顕微鏡２０の焦点位置ＳＦに一致するように、細胞１００を操作する。なお、高さ位置ＨＰ０、ＨＰ１、ＨＰ２、ＨＰ３、ＨＰ４の移動の順番、高さピッチｈ１は適宜調整可能である。

制御部４６Ａは、第１ピペット２５を高さピッチｈ１だけ移動させた後、移動回数ｎをｎ＝ｎ＋１に更新する（ステップＳＴ２２）。そして、核１００Ａの高さ位置ＨＰ０、ＨＰ１、ＨＰ２、ＨＰ３、ＨＰ４ごとに、上述した画像処理及び核１００Ａの検出処理（ステップＳＴ１４、ＳＴ１５）を繰り返し実行する。移動終了回数Ｎｅまでに核１００Ａが検出された場合、制御部４６Ａは、第２ピペット３５により、核１００Ａの位置へのインジェクション操作を実行する（ステップＳＴ１５）。この場合、図６に示すように、第２ピペット３５の高さ位置を核１００Ａの高さ位置に移動させることで、良好にインジェクション操作を実行できる。

移動回数ｎが移動終了回数Ｎｅに達した場合（ステップＳＴ１２、ｎ＝Ｎｅ）、制御部４６Ａは、細胞１００の回転操作を実行する（ステップＳＴ３０）。図７は、マニピュレーションシステムによる細胞の回転操作を示すフローチャート図である。図８及び図９は、マニピュレーションシステムによる細胞の回転操作を説明するための説明図である。なお、図８は、カメラ１８の撮像領域ＩＡをＺ軸方向から見たときの説明図である。また、図９は、第１ピペット２５に保持された細胞１００をＸ軸方向から見たときの説明図である。

図７及び図８に示すように、制御部４６Ａは、第１ピペット２５を移動させて、細胞１００を初期位置に移動させる（ステップＳＴ３０−１）。このときの第２ピペット３５の先端３５ａの位置は（Ｘ０、Ｙ０、Ｚ０）である。次に、制御部４６Ａは、第２ピペット３５を移動させる（ステップＳＴ３０−２）。図８に示すように、第２ピペット３５は、Ｘ軸方向に延在する。制御部４６Ａは、Ｚ軸方向から見たときに、細胞１００と重なる位置であって、細胞１００の中心１００ＣからＹ軸方向に離れた位置に第２ピペット３５を移動させる。距離Ｌ（図９参照）は、このときの第２ピペット３５の軸部３５ｂと、細胞１００の中心１００ＣとのＹ軸方向の距離である。また、第２ピペット３５の先端３５ａは、Ｚ軸方向から見たときに、細胞１００の外周よりも外側に配置され、第２ピペット３５の軸部３５ｂが細胞１００と重なる位置に配置される。このときの第２ピペット３５の先端５３ａの位置は（Ｘ１、Ｙ１、Ｚ１）である。

次に、制御部４６Ａは、シリンジポンプ２９を制御して、第１ピペット２５による吸引を弱める（ステップＳＴ３０−３）。これにより、細胞１００は第１ピペット２５から離れる方向にわずかに移動する。又は、細胞１００は回転できるように第１ピペット２５の開口２５ａに接していてもよい。このとき、図９に示すように、第２ピペット３５は、細胞１００と接しない位置に設けられる。

制御部４６Ａは、第２ピペット３５を細胞１００の上側から試料ステージ２２に近づく方向に移動させる。これにより、細胞１００が第２ピペット３５の軸部３５ｂに接触して回転する（ステップＳＴ３０−４）。具体的には、図９に示すように、第２ピペット３５が下側に移動することで、細胞１００の位置１００Ｄで接する（ステップＳＴ３０−４−１）。ここで、Ｘ軸方向から見たときに、細胞１００の中心１００Ｃと、位置１００Ｄとを結ぶ仮想線を、仮想線Ａ２とする。

第２ピペット３５が、さらに下側に移動することで、細胞１００の位置１００Ｄには、下側に向かう力が加えられる。このとき、第１ピペット２５により、細胞１００には、開口２５ａの中心に向かう吸引力が加えられる。このため、細胞１００は、中心１００Ｃを通り、Ｘ軸方向に平行な方向を中心軸として回転しつつ、第２ピペット３５によりＹ軸方向に押し出されるように移動する（ステップＳＴ３０−４−２）。

第２ピペット３５がさらに下側に移動し、細胞１００から離れると、細胞１００の回転が終了する（ステップＳＴ３０−４−３）。このときの第２ピペット３５の先端５３ａの位置は（Ｘ１、Ｙ１、Ｚ２）である。そして、第１ピペット２５の吸引により、細胞１００の中心１００Ｃは、開口２５ａの中心に一致するように移動する。ここで、Ｘ軸方向から見たときに、細胞１００の中心１００Ｃと、第２ピペット３５が細胞１００から離れた場合における位置１００Ｄとを結ぶ仮想線を、仮想線Ａ３とする。細胞１００の回転角度θは、仮想線Ａ２と仮想線Ａ３とがなす角度とする。細胞１００の回転により、核１００Ａも、中心１００Ｃを通り、Ｘ軸方向に平行な方向を中心軸として回転角度θだけ回転する。本実施形態のマニピュレーションシステム１０において、細胞１００の回転角度θは、第２ピペット３５を細胞１００に接触させる位置１００Ｄ（距離Ｌ）によって調整できる。細胞１００の半径をＲとしたとき、回転角度θだけ回転させる場合、距離ＬはＬ＝Ｒｃｏｓ（θ／２）となる。

細胞１００の回転操作を行った後、制御部４６Ａは、シリンジポンプ２９の吸引を再開し、第１ピペット２５の内部を陰圧にして吸引する（ステップＳＴ３０−５）。これにより第１ピペット２５に細胞１００が保持される。その後、第２ピペット３５を初期状態の位置（Ｘ０、Ｙ０、Ｚ０）に移動させる（ステップＳＴ３０−６）。

その後、図４に示すように、制御部４６Ａは、移動回数ｎをｎ＝０にリセットする（ステップＳＴ３１）。そして、制御部４６Ａは、上述した画像処理、核１００Ａの位置座標の取得及び第１ピペット２５の高さ位置の操作を、核１００Ａが検出されるまで繰り返し実行する。

マニピュレーションシステム１０は、これら一連の動作を制御部４６Ａが自動で行う。このため、マニピュレーションシステム１０は、操作者の熟練度や技術によらず、効率よく細胞１００を操作することができる。

以上説明したように、マニピュレーションシステム１０は、試料ステージ２２と、第１マニピュレータ１４と、第２マニピュレータ１６と、撮像部（顕微鏡ユニット１２）と、制御部４６Ａと、を有する。試料ステージ２２は、微小対象物（細胞１００）が載置される。第１マニピュレータ１４は、微小対象物を保持するための第１ピペット２５を備える。第２マニピュレータ１６は、第１ピペット２５に保持された微小対象物を操作するための第２ピペット３５を備える。撮像部は、微小対象物を撮像する。制御部４６Ａは、試料ステージ２２、第１ピペット２５、第２ピペット３５及び撮像部を制御する。制御部４６Ａは、試料ステージ２２に垂直な方向から見たときに、微小対象物と重なり、かつ、第２ピペット３５の延在方向と直交する方向で微小対象物の中心から離れた位置で、第２ピペット３５を微小対象物の上側から試料ステージ２２に近づく方向に移動させる。

これによれば、第２ピペット３５が高さ方向に移動して微小対象物に接触することで、微小対象物が回転する。このため、マニピュレーションシステム１０は、操作対象位置（核１００Ａの位置）が検出されない場合においても、微小対象物を回転操作することで操作対象位置を変化させて、操作対象位置の検出が可能となる。また、第２ピペット３５により回転操作を行うことができるため、マニピュレーションシステム１０は、微小対象物の回転操作のための専用機器が不要である。したがって、マニピュレーションシステム１０は、簡易な構成で微小対象物の操作対象位置を検出することができる。

また、マニピュレーションシステム１０において、第２ピペット３５の先端３５ａは、試料ステージ２２に垂直な方向から見たときに、微小対象物の外周よりも外側に配置されて、第２ピペット３５の軸部３５ｂが微小対象物に接触する。これによれば、微小対象物の回転操作の際に、第２ピペット３５の先端３５ａが微小対象物に接触しない。このため、マニピュレーションシステム１０は、微小対象物の損傷や、第２ピペット３５の損傷を抑制することができる。

また、マニピュレーションシステム１０において、制御部４６Ａは、撮像部の画像データに基づいて微小対象物の操作対象位置を検出し、第２ピペット３５を操作対象位置に移動させて、微小対象物に対する操作を第２ピペット３５に実行させる。これによれば、制御部４６Ａが、画像データに基づいて操作対象位置を検出するため、操作者の熟練度によらず、操作対象位置を検出することができる。また、操作対象位置の検出と、微小対象物に対する操作が制御部４６Ａにより自動で行われるため、マニピュレーションシステム１０は、効率よくかつ好適に微小対象物を操作することができる。

また、マニピュレーションシステム１０において、制御部４６Ａは、第１ピペット２５を高さ方向に操作し、異なる高さ位置ごとに撮像された微小対象物の複数の画像データに基づいて、操作対象位置を検出する。これによれば、マニピュレーションシステム１０は、精度よく操作対象位置を検出することができる。

また、マニピュレーションシステム１０の駆動方法は、第１ピペット２５に保持された微小対象物（細胞１００）の操作対象位置（核１００Ａの位置）を、撮像部（顕微鏡ユニット１２）の画像データに基づいて制御部４６Ａが検出する検出ステップ（ステップＳＴ１４）と、検出ステップで操作対象位置が検出されない場合に、制御部４６Ａは、試料ステージ２２に垂直な方向から見たときに、微小対象物と重なり、かつ、第２ピペット３５の延在方向（Ｘ軸方向）と直交する方向（Ｙ軸方向）で微小対象物の中心１００Ｃから離れた位置で、第２ピペット３５を微小対象物の上側から試料ステージ２２に近づく方向に移動させる回転ステップ（ステップＳＴ３０）と、を含む。

（変形例）
図１０は、マニピュレーションシステムによる細胞の回転操作の変形例を説明するための説明図である。図８、図９では、Ｘ軸方向に平行な方向を中心軸として、細胞１００を回転操作する場合を示したが、Ｚ軸方向に平行な方向を中心軸として、細胞１００を回転操作することもできる。

図１０に示すように、制御部４６Ａは、第１ピペット２５を移動させて、細胞１００を初期位置に移動させる（ステップＳＴ３０Ａ−１）。この際、第２ピペット３５も初期状態の位置に戻す。次に、制御部４６Ａは、第２ピペット３５を移動させる（ステップＳＴ３０Ａ−２）。これにより、第２ピペット３５の先端３５ａが座標（ＩＸ０、ＩＹ０）から座標（ＩＸ３、ＩＹ３）に位置する。座標（ＩＸ３、ＩＹ３）は、細胞１００の中心１００Ｃを通るＹ軸に平行な直線と、中心１００Ｃと第２ピペット３５の先端３５ａとを結ぶ直線とのなす角度θが４５°以下となる領域に位置する。

次に、制御部４６Ａは、シリンジポンプ２９を停止し、第１ピペット２５による吸引を停止させる（ステップＳＴ３０Ａ−３）。制御部４６Ａは、第１ピペット２５の内部がわずかに陽圧になるように駆動してもよい。これにより、細胞１００は第１ピペット２５から離れる方向にわずかに移動する。細胞１００が移動する際に、第２ピペット３５の先端３５ａと接触することにより、細胞１００が回転する（ステップＳＴ３０Ａ−４）。この操作により細胞１００をＸＹ平面内で回転させることが可能となる。つまり、細胞１００は、Ｚ軸方向に平行な方向を中心軸として回転する。このような操作によれば、細胞１００の移動に伴って回転するため、第２ピペット３５を操作して細胞１００を回転させる場合と比較して、細胞１００の損傷を抑制することができる。

細胞１００の回転操作を行った後、制御部４６Ａは、シリンジポンプ２９の吸引を再開し、第１ピペット２５の内部を陰圧にして吸引する（ステップＳＴ３０Ａ−５）。これにより第１ピペット２５に細胞１００が保持される。その後、第２ピペット３５を初期状態の位置（ＩＸ０、ＩＹ０）に移動させる（ステップＳＴ３０Ａ−６）。その後、制御部４６Ａは、図４に示した画像処理、核１００Ａの位置座標の取得及び第１ピペット２５の高さ位置の操作を、核１００Ａが検出されるまで繰り返し実行する。

なお、本実施形態及び変形例のマニピュレーションシステム１０及びマニピュレーションシステム１０の駆動方法は適宜変更してもよい。例えば、第１ピペット２５、第２ピペット３５等の形状等は、微小対象物の種類や、微小対象物に対する操作に応じて適宜変更することが好ましい。細胞保持操作、核検出操作、インジェクション操作、細胞載置操作の各操作において、適宜手順の一部を省略してもよく、また、手順を置換して実行してもよい。

１０ マニピュレーションシステム
１１ 試料保持部材
１２ 顕微鏡ユニット
１４ 第１マニピュレータ
１６ 第２マニピュレータ
１８ カメラ
２０ 顕微鏡
２２ 試料ステージ
２４ 第１ピペット保持部材
２５ 第１ピペット
２６、３６ Ｘ−Ｙ軸テーブル
２８、３８ Ｚ軸テーブル
３０、３２、４０、４２ 駆動装置
３４ 第２ピペット保持部材
３５ 第２ピペット
３５ａ 先端
３５ｂ 軸部
４３ コントローラ
４４ 微動機構
４６Ａ 制御部
１００ 細胞
１００Ａ 核
１００Ｃ 中心

Claims (4)

1. 微小対象物が載置される試料ステージと、
   前記微小対象物を保持するための第１ピペットを備える第１マニピュレータと、
   前記第１ピペットに保持された前記微小対象物を操作するための第２ピペットを備える第２マニピュレータと、
   前記試料ステージに垂直な方向で、前記微小対象物を上側から撮像する撮像部と、
   前記試料ステージ、前記第１ピペット、前記第２ピペット及び前記撮像部を制御する制御部と、を備え、
   前記制御部は、前記試料ステージに垂直な方向から見たときに、前記微小対象物と重なり、かつ、前記第２ピペットの延在方向と直交する方向で前記微小対象物の中心から離れた位置で、前記第２ピペットを前記微小対象物の上側から前記試料ステージに近づく方向に移動させ、
   前記第２ピペットの先端は、前記試料ステージに垂直な方向から見たときに、前記微小対象物の外周よりも外側に配置されて、前記第２ピペットの軸部が前記微小対象物に接触する、
   マニピュレーションシステム。
2. 前記制御部は、前記撮像部の画像データに基づいて前記微小対象物の操作対象位置を検出し、前記第２ピペットを前記操作対象位置に移動させて、前記微小対象物に対する操作を前記第２ピペットに実行させる、
   請求項１に記載のマニピュレーションシステム。
3. 前記制御部は、前記第１ピペットを高さ方向に操作し、異なる高さ位置ごとに撮像された前記微小対象物の複数の画像データに基づいて、前記微小対象物の操作対象位置を検出する、
   請求項１又は請求項２に記載のマニピュレーションシステム。
4. 微小対象物が載置される試料ステージと、
   前記微小対象物を保持するための第１ピペットを備える第１マニピュレータと、
   前記第１ピペットに保持された前記微小対象物を操作するための第２ピペットを備える第２マニピュレータと、
   前記試料ステージに垂直な方向で、前記微小対象物を上側から撮像する撮像部と、
   前記試料ステージ、前記第１ピペット、前記第２ピペット及び前記撮像部を制御する制御部と、を備えるマニピュレーションシステムの駆動方法であって、
   前記第１ピペットに保持された前記微小対象物の操作対象位置を、前記撮像部の画像データに基づいて前記制御部が検出する検出ステップと、
   前記検出ステップで前記操作対象位置が検出されない場合に、前記制御部は、前記試料ステージに垂直な方向から見たときに、前記微小対象物と重なり、かつ、前記第２ピペットの延在方向と直交する方向で前記微小対象物の中心から離れた位置で、前記第２ピペットを前記微小対象物の上側から前記試料ステージに近づく方向に移動させる回転ステップと、を含み、
   前記回転ステップにおいて、前記第２ピペットの先端は、前記試料ステージに垂直な方向から見たときに、前記微小対象物の外周よりも外側に配置されて、前記第２ピペットの軸部が前記微小対象物に接触する、
   マニピュレーションシステムの駆動方法。

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