JP7188141B2 - マニピュレーションシステム及びマニピュレーションシステムの駆動方法 - Google Patents

マニピュレーションシステム及びマニピュレーションシステムの駆動方法 Download PDF

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Description

本発明は、マニピュレーションシステム及びマニピュレーションシステムの駆動方法に関する。
バイオテクノロジ分野において、顕微鏡観察下で細胞や卵にＤＮＡ溶液や細胞を注入する等のように、微小な対象物に微細な操作を行うマイクロマニピュレーションシステムが知られている。微小対象物を保持するための保持用ピペットで微小対象物の位置を固定しつつ、操作用ピペットを微小対象物に突き刺してインジェクション操作が行われる。
特許文献１には、取得した撮像画像のデータから微小対象物の位置座標を検出し、検出結果に基づいて操作用ピペットの位置を決定する技術が開示されている。
特開２０１７－１２４４５２号公報
上記のような微小対象物は、操作用ピペットの先端が当接すると、微小対象物の当接部分に張力が生じ、当接部分が硬化する。このため、微小対象物を傷付けることなく、微小対象物内部の所定位置に、操作用ピペットを正確に突き刺すには、熟練の技術を必要としていた。
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の微小対象物への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に操作することができるマニピュレーションシステム及びマニピュレーションシステムの駆動方法を提供することを目的とする。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムは、微小対象物が載置される試料ステージと、前記微小対象物を保持するための第１ピペットを備える第１マニピュレータと、前記第１ピペットに保持された前記微小対象物を操作するための第２ピペットを備える第２マニピュレータと、前記第２ピペットを軸方向に移動させるための微動機構と、前記試料ステージ、前記第１ピペット、前記第２ピペット及び前記微動機構を制御し、前記第２ピペットの先端を前記微小対象物に押し当てた状態で、前記微動機構に前記第２ピペットを加振させ、且つ、加振後に前記微小対象物が穿孔されたか否かを判定するコントローラと、を備える。
これによれば、微動機構が第２ピペットを挿入方向に加振させることによって穿孔するため、第２ピペットの先端が単に突き刺しただけでは微小対象物に刺さらない太さのものであっても穿孔できる。また、微小対象物が確実に穿孔された状態で操作実行位置まで第２ピペットを挿入することができる。したがって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の微小対象物への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に操作することができる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムにおいて、前記微動機構は、圧電素子を含む。これによれば、所定の周期の周波数に基づいて圧電素子に直接電圧を印加することによって、第２ピペットを軸方向に振動させることができる。圧電素子に直接電圧を印加することによって、第２ピペットの振動をより好適に制御することができる。したがって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の微小対象物への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に穿孔することができる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムにおいて、前記コントローラは、前記第２ピペットの加振後に、前記第２ピペットを挿入方向に所定距離を移動させることによって前記微小対象物が穿孔されたか否かを判定する。これによれば、第２ピペットの先端における微小対象物の挙動を確認することによって、容易に微小対象物が穿孔されたか否かを判定することができる。したがって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の微小対象物への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に操作することができる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムにおいて、前記微小対象物は、細胞である。これによれば、微動機構が第２ピペットを挿入方向に加振させることによって穿孔するため、第２ピペットの先端が単に突き刺しただけでは細胞に刺さらない太さのものであっても穿孔できる。また、細胞が確実に穿孔された状態で操作実行位置まで第２ピペットを挿入することができる。したがって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の細胞への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に操作することができる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムにおいて、前記コントローラは、前記第２ピペットの先端を前記細胞の透明帯に押し当てた状態で、前記微動機構に前記第２ピペットを加振させ、且つ、加振後に前記透明帯が穿孔されたか否かを判定する。これによれば、微動機構が第２ピペットを挿入方向に加振させることによって穿孔するため、第２ピペットの先端が単に突き刺しただけでは透明帯に刺さらない太さのものであっても穿孔できる。また、透明帯が確実に穿孔された状態で操作実行位置まで第２ピペットを挿入することができる。したがって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の細胞への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に操作することができる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムにおいて、前記細胞を撮像する撮像部を備え、前記コントローラは、前記撮像部の画像データに基づいて前記第２ピペットの先端を前記透明帯に接触させる透明帯接触位置を決定する。これによれば、撮像された画像データに基づいて、透明帯接触位置を決定するため、操作者の熟練度及び技術によらず、効率よくかつ好適に透明帯を穿孔することができる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムにおいて、前記コントローラは、前記第２ピペットの先端を前記細胞の細胞膜に押し当てた状態で、前記微動機構に前記第２ピペットを加振させ、且つ、加振後に前記細胞膜が穿孔されたか否かを判定する。これによれば、微動機構が第２ピペットを挿入方向に加振させることによって穿孔するため、第２ピペットの先端が単に突き刺しただけでは細胞膜に刺さらない太さのものであっても穿孔できる。また、細胞膜が確実に穿孔された状態で操作実行位置まで第２ピペットを挿入することができる。したがって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の細胞への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に操作することができる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムにおいて、前記細胞を撮像する撮像部を備え、前記コントローラは、前記撮像部の画像データに基づいて前記第２ピペットの先端を前記細胞膜に接触させる細胞膜接触位置を決定する。これによれば、撮像された画像データに基づいて、細胞膜接触位置を決定するため、操作者の熟練度及び技術によらず、効率よくかつ好適に細胞膜を穿孔することができる。
本発明の一様態にかかるマニピュレーションシステムにおいて、前記コントローラは、前記第２ピペットの先端を前記細胞の核膜に押し当てた状態で、前記微動機構に前記第２ピペットを加振させ、且つ、加振後に前記核膜が穿孔されたか否かを判定する。これによれば、微動機構が第２ピペットを挿入方向に加振させることによって穿孔するため、第２ピペットの先端が単に突き刺しただけでは核膜に刺さらない太さのものであっても穿孔できる。また、核膜が確実に穿孔された状態で操作実行位置まで第２ピペットを挿入することができる。したがって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の細胞への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に操作することができる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムにおいて、前記コントローラは、前記第２ピペットの先端によって前記細胞の細胞膜を変形させて前記細胞の核膜に接触させた状態で、前記微動機構に前記第２ピペットを加振させ、且つ、加振後に前記細胞膜及び前記核膜が穿孔されたか否かを判定する。これによれば、微動機構が第２ピペットを挿入方向に加振させることによって穿孔するため、第２ピペットの先端が単に突き刺しただけでは細胞に刺さらない太さのものであっても穿孔できる。また、細胞が確実に穿孔された状態で操作実行位置まで第２ピペットを挿入することができる。また、細胞膜と核膜とを同時に穿孔することができる。したがって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の細胞への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に操作することができる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムにおいて、前記細胞を撮像する撮像部を備え、前記コントローラは、前記撮像部の画像データに基づいて前記第２ピペットの先端を前記核膜に接触させる核膜接触位置を決定する。これによれば、撮像された画像データに基づいて、核膜接触位置を決定するため、操作者の熟練度及び技術によらず、効率よくかつ好適に核膜を穿孔することができる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムにおいて、前記細胞を撮像する撮像部を備え、前記コントローラは、前記撮像部の画像データに基づいて前記細胞の核小体の位置を検出する。これによれば、撮像された画像データに基づいて、細胞の核小体の位置を検出するため、操作者の熟練度及び技術によらず、効率よくかつ好適に核小体を検出することができる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムにおいて、前記コントローラは、前記核小体の位置に基づいて所定の操作実行位置を決定する。これによれば、撮像された画像データから検出された核小体の位置に基づいて、操作実行位置を決定するため、操作者の熟練度及び技術によらず、効率よくかつ好適に細胞を操作することができる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムにおいて、前記操作実行位置は、前記核小体の外側である。これによれば、操作実行位置を核小体の外部に設定することによって、第２ピペットの挿入時に第２ピペットの先端が核小体に触れることなくインジェクション操作をすることが可能である。したがって、インジェクション操作において、細胞への損傷を抑制できる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムにおいて、前記操作実行位置は、前記核小体の中心からオフセットされた位置である。これによれば、第２ピペットの挿入時に第２ピペットの先端が核小体を損傷させることを抑制できる。したがって、インジェクション操作において、細胞への損傷を抑制できる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムにおいて、前記核小体の中心と前記操作実行位置との前記第２ピペットの挿入方向に直交する交差方向の距離は、前記核小体の半径より大きい。これによれば、操作実行位置を核小体の外部に設定できるので、第２ピペットの挿入時に第２ピペットの先端が核小体に触れることなくインジェクション操作をすることが可能である。したがって、インジェクション操作において、細胞への損傷を抑制できる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムにおいて、前記コントローラは、前記撮像部の画像データ及び前記操作実行位置に基づいて所定の挿入開始位置を決定する。これによれば、撮像された画像データに基づいて、挿入開始位置を決定するため、操作者の熟練度及び技術によらず、効率よくかつ好適に細胞を操作することができる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムの駆動方法は、細胞が載置される試料ステージと、前記細胞を保持するための第１ピペットを備える第１マニピュレータと、前記第１ピペットに保持された前記細胞を操作するための第２ピペットを備える第２マニピュレータと、前記第２ピペットを軸方向に移動させるための微動機構と、を備えるマニピュレーションシステムの駆動方法であって、前記第２ピペットの先端を前記細胞の所定の挿入開始位置に移動させるステップと、前記第２ピペットの先端を、前記細胞の透明帯に押し当てるステップと、前記微動機構によって前記第２ピペットを加振させるステップと、前記第２ピペットを加振させた後に前記透明帯が穿孔されたか否かを判定するステップと、前記第２ピペットの先端を、前記細胞の細胞膜に押し当てるステップと、前記微動機構によって前記第２ピペットを加振させるステップと、前記第２ピペットを加振させた後に前記細胞膜が穿孔されたか否かを判定するステップと、前記第２ピペットの先端を、前記細胞の核膜に押し当てるステップと、前記微動機構によって前記第２ピペットを加振させるステップと、前記第２ピペットを加振させた後に前記核膜が穿孔されたか否かを判定するステップと、を含む。
これによれば、微動機構が第２ピペットを挿入方向に加振させることによって穿孔するため、第２ピペットの先端が単に突き刺しただけでは透明帯、細胞膜及び核膜に刺さらない太さのものであっても穿孔できる。また、透明帯、細胞膜及び核膜を確実に穿孔されたか否かを確認することができる。すなわち、透明帯、細胞膜及び核膜が確実に穿孔された状態で操作実行位置まで第２ピペットを挿入することができる。したがって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の細胞への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に操作することができる。
本発明の一態様に係るマニピュレーションシステムの駆動方法は、細胞が載置される試料ステージと、前記細胞を保持するための第１ピペットを備える第１マニピュレータと、前記第１ピペットに保持された前記細胞を操作するための第２ピペットを備える第２マニピュレータと、前記第２ピペットを軸方向に移動させるための微動機構と、を備えるマニピュレーションシステムの駆動方法であって、前記第２ピペットの先端を前記細胞の所定の挿入開始位置に移動させるステップと、前記第２ピペットの先端を、前記細胞の透明帯に押し当てるステップと、前記微動機構によって前記第２ピペットを加振させるステップと、前記第２ピペットを加振させた後に前記透明帯が穿孔されたか否かを判定するステップと、前記第２ピペットの先端を、前記細胞の細胞膜に押し当てるステップと、前記第２ピペットの先端を、挿入方向に移動させることによって変形させた前記細胞膜を前記細胞の核膜に接触させるステップと、前記微動機構によって前記第２ピペットを加振させるステップと、前記第２ピペットを加振させた後に前記細胞膜及び前記核膜が穿孔されたか否かを判定するステップと、を含む。
これによれば、微動機構が第２ピペットを挿入方向に加振させることによって穿孔するため、第２ピペットの先端が単に突き刺しただけでは透明帯、細胞膜及び核膜に刺さらない太さのものであっても穿孔できる。また、透明帯、細胞膜及び核膜を確実に穿孔されたか否かを確認することができる。すなわち、透明帯、細胞膜及び核膜が確実に穿孔された状態で操作実行位置まで第２ピペットを挿入することができる。また、細胞膜と核膜とを同時に穿孔することができる。したがって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の細胞への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に操作することができる。
本発明によれば、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の微小対象物への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に操作することができる。
図１は、第１実施形態に係るマニピュレーションシステムの構成を模式的に示す図である。 図２は、微動機構の一例を示す断面図である。 図３は、マニピュレーションシステムの制御ブロック図である。 図４は、操作対象の細胞及び核の一例を示す模式図である。 図５は、第１実施形態のマニピュレーションシステムの動作の一例を示すフローチャート図である。 図６は、透明帯の穿孔動作の一例を示すフローチャート図である。 図７は、細胞膜の穿孔動作の一例を示すフローチャート図である。 図８は、核膜の穿孔動作の一例を示すフローチャート図である。 図９は、第１実施形態のマニピュレーションシステムの動作を説明するための説明図である。 図１０は、第２実施形態のマニピュレーションシステムの動作の一例を示すフローチャート図である。 図１１は、細胞膜及び核膜の穿孔動作の一例を示すフローチャート図である。 図１２は、第２実施形態のマニピュレーションシステムの動作を説明するための説明図である。
本発明を実施するための形態（実施形態）につき、図面を参照しつつ詳細に説明する。以下の実施形態に記載した内容により本発明が限定されるものではない。また、以下に記載した構成要素には、当業者が容易に想定できるもの、実質的に同一のものが含まれる。さらに、以下に記載した構成要素は適宜組み合わせることが可能である。
（第１実施形態）
図１は、実施形態に係るマニピュレ－ションシステムの構成を模式的に示す図である。マニピュレーションシステム１０は、顕微鏡観察下で微小対象物である試料を操作するためのシステムである。図１において、マニピュレーションシステム１０は、顕微鏡ユニット１２と、第１マニピュレータ１４と、第２マニピュレータ１６と、マニピュレーションシステム１０を制御するコントローラ（制御装置）４３とを備えている。顕微鏡ユニット１２の両側に第１マニピュレータ１４と第２マニピュレータ１６とが分かれて配置されている。
撮像部としての顕微鏡ユニット１２は、撮像素子を含むカメラ１８と、顕微鏡２０と、試料ステージ２２とを備えている。試料ステージ２２は、シャーレなどの試料保持部材１１を支持可能であり、試料保持部材１１の直上に顕微鏡２０が配置される。顕微鏡ユニット１２は、顕微鏡２０とカメラ１８とが一体構造となっており、試料保持部材１１に向けて光を照射する光源（図示は省略している）を備えている。なお、カメラ１８は、顕微鏡２０と別体に設けてもよい。
試料保持部材１１には、試料を含む溶液が収容される。溶液は、例えば、パラフィンオイル等である。試料保持部材１１の試料に光が照射され、試料保持部材１１の試料で反射した光が顕微鏡２０に入射すると、試料に関する光学像は、顕微鏡２０で拡大された後、カメラ１８で撮像される。カメラ１８で撮像された画像を基に試料の観察が可能となっている。
図１に示すように、第１マニピュレータ１４は、第１ピペット保持部材２４と、Ｘ－Ｙ軸テーブル２６と、Ｚ軸テーブル２８と、Ｘ－Ｙ軸テーブル２６を駆動する駆動装置３０と、Ｚ軸テーブル２８を駆動する駆動装置３２とを備える。第１マニピュレータ１４は、Ｘ軸－Ｙ軸－Ｚ軸の３軸構成のマニピュレータである。なお、本実施形態において、水平面内の一方向をＸ軸方向、水平面内においてＸ軸方向と交差する方向をＹ軸方向、Ｘ軸方向及びＹ軸方向のそれぞれと交差する方向（すなわち鉛直方向）をＺ軸方向とする。
Ｘ－Ｙ軸テーブル２６は、駆動装置３０の駆動により、Ｘ軸方向又はＹ軸方向に移動可能となっている。Ｚ軸テーブル２８は、Ｘ－Ｙ軸テーブル２６上に上下移動可能に配置され、駆動装置３２の駆動によりＺ軸方向に移動可能になっている。駆動装置３０、３２は、コントローラ４３に接続されている。
第１ピペット保持部材２４は、Ｚ軸テーブル２８に連結され、先端に毛細管チップである第１ピペット２５が取り付けられている。第１ピペット保持部材２４は、Ｘ－Ｙ軸テーブル２６とＺ軸テーブル２８の移動に従って３次元空間を移動領域として移動し、試料保持部材１１に収容された試料を、第１ピペット２５を介して保持することができる。すなわち、第１マニピュレータ１４は、微小対象物の保持に用いられる保持用マニピュレータであり、第１ピペット２５は、微小対象物の保持手段として用いられるホールディングピペットである。微小対象物は、例えば、第１ピペット保持部材２４及び第１ピペット２５と連通されているシリンジポンプ２９（図３参照）によって、第１ピペット２５の先端にて吸引保持される。
図１に示す第２マニピュレータ１６は、第２ピペット保持部材３４と、Ｘ－Ｙ軸テーブル３６と、Ｚ軸テーブル３８と、Ｘ－Ｙ軸テーブル３６を駆動する駆動装置４０と、Ｚ軸テーブル３８を駆動する駆動装置４２とを備える。第２マニピュレータ１６は、Ｘ軸－Ｙ軸－Ｚ軸の３軸構成のマニピュレータである。
Ｘ－Ｙ軸テーブル３６は、駆動装置４０の駆動により、Ｘ軸方向又はＹ軸方向に移動可能となっている。Ｚ軸テーブル３８は、Ｘ－Ｙ軸テーブル３６上に上下移動可能に配置され、駆動装置４２の駆動によりＺ軸方向に移動可能になっている。駆動装置４０、４２は、コントローラ４３に接続されている。
第２ピペット保持部材３４は、Ｚ軸テーブル３８に連結され、先端にガラス製の第２ピペット３５が取り付けられている。第２ピペット保持部材３４は、Ｘ－Ｙ軸テーブル３６とＺ軸テーブル３８の移動に従って３次元空間を移動領域として移動し、試料保持部材１１に収容された試料を人工操作することが可能である。すなわち、第２マニピュレータ１６は、微小対象物の操作（ＤＮＡ溶液の注入操作や穿孔操作など）に用いられる操作用マニピュレータであり、第２ピペット３５は、微小対象物のインジェクション操作手段として用いられるインジェクションピペットである。第２ピペット３５の先端は、微小対象物に押し当てた場合、微小対象物が穿孔されずに変形するサイズ及び形状とする。
Ｘ－Ｙ軸テーブル３６とＺ軸テーブル３８は、第２ピペット保持部材３４を、試料保持部材１１に収容された試料などの操作位置まで粗動駆動する粗動機構（３次元移動テーブル）として構成されている。また、Ｚ軸テーブル３８と第２ピペット保持部材３４との連結部には、ナノポジショナとして微動機構４４が備えられている。微動機構４４は、第２ピペット保持部材３４をその長手方向（軸方向）に移動可能に支持するとともに、第２ピペット保持部材３４をその長手方向（軸方向）に沿って微動駆動するように構成される。
図２は、微動機構の一例を示す断面図である。図２に示すように微動機構４４は、第２ピペット保持部材３４を駆動対象とする圧電アクチュエータ４４ａを備える。圧電アクチュエータ４４ａは、筒状のハウジング８７と、ハウジング８７の内部に設けられた転がり軸受８０、８２と、圧電素子９２とを含む。ハウジング８７の軸方向に第２ピペット保持部材３４が挿通される。転がり軸受８０、８２は、第２ピペット保持部材３４を回転可能に支持する。圧電素子９２は、印加される電圧に応じて第２ピペット保持部材３４の長手方向に沿って伸縮する。第２ピペット保持部材３４の先端側（図２左側）には第２ピペット３５（図１参照）が取り付けられ固定される。
第２ピペット保持部材３４は、転がり軸受８０、８２を介してハウジング８７に支持される。転がり軸受８０は、内輪８０ａと、外輪８０ｂと、内輪８０ａと外輪８０ｂとの間に設けられたボール８０ｃとを備える。転がり軸受８２は、内輪８２ａと、外輪８２ｂと、内輪８２ａと外輪８２ｂとの間に設けられたボール８２ｃとを備える。各外輪８０ｂ、８２ｂがハウジング８７の内周面に固定され、各内輪８０ａ、８２ａが中空部材８４を介して第２ピペット保持部材３４の外周面に固定される。このように、転がり軸受８０、８２は、第２ピペット保持部材３４を回転自在に支持するようになっている。
中空部材８４の軸方向の略中央部には、径方向外方に突出するフランジ部８４ａが設けられている。転がり軸受８０は、フランジ部８４ａに対して第２ピペット保持部材３４の軸方向の先端側に配置され、転がり軸受８２はフランジ部８４ａに対して後端側に配置される。内輪間座としてのフランジ部８４ａを挟んで転がり軸受８０の内輪８０ａと、転がり軸受８２の内輪８２ａとが配置される。第２ピペット保持部材３４の外周面にねじ加工が施されており、内輪８０ａの先端側及び内輪８２ａの後端側からロックナット８６及びロックナット８６が第２ピペット保持部材３４に螺合されて、転がり軸受８０、８２の軸方向の位置が固定される。
円環状のスペーサ９０は、転がり軸受８０、８２と同軸に外輪８２ｂの軸方向後端側に配置される。スペーサ９０の軸方向後端側には、円環状の圧電素子９２がスペーサ９０と略同軸に配置され、さらにその軸方向後端側にはハウジング８７の蓋８８が配置される。蓋８８は、圧電素子９２を軸方向に固定するためのもので、第２ピペット保持部材３４が挿通する孔部を有する。蓋８８は、例えば、ハウジング８７の側面に不図示のボルトにより締結されていてもよい。なお、圧電素子９２は、棒状又は角柱状としてスペーサ９０の周方向に略等配となるように並べても良く、第２ピペット保持部材３４を挿通する孔部を有した角筒としても良い。
圧電素子９２はスペーサ９０を介して転がり軸受８２と接している。圧電素子９２は、リード線（図示せず）を介して制御回路としてのコントローラ４３に接続されている。圧電素子９２は、コントローラ４３からの印加電圧に応答して第２ピペット保持部材３４の軸方向に沿って伸縮し、第２ピペット保持部材３４をその軸方向に沿って微動させるようになっている。第２ピペット保持部材３４が軸方向に沿って微動すると、この微動が第２ピペット３５（図１参照）に伝達され、第２ピペット３５の位置が微調整されることになる。また、圧電素子９２により第２ピペット保持部材３４が軸方向に振動すると、第２ピペット３５も軸方向に振動する。このように微動機構４４により、微小対象物への操作（ＤＮＡ溶液や細胞の注入操作や穿孔操作など）の際には、より正確な操作が可能となり、圧電素子９２による穿孔作用の向上を実現できる。
なお、上述の微動機構４４は、微小対象物の操作用の第２マニピュレータ１６に設けられるとしているが、図１に示すように微小対象物の固定用の第１マニピュレータ１４に微動機構４４と同様の微動機構５４を設けてもよく、省略することも可能である。
次に、コントローラ４３によるマニピュレーションシステム１０の制御について図３を参照して説明する。図３は、マニピュレーションシステムの制御ブロック図である。
コントローラ４３は、演算手段としてのＣＰＵ（中央演算処理装置）及び記憶手段としてのハードディスク、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）等のハードウェア資源を備える。コントローラ４３は、記憶部４６Ｂに格納された所定のプログラムに基づいて各種の演算を行い、演算結果に従って制御部４６Ａが各種の制御を行うように駆動信号を出力する。
制御部４６Ａは、顕微鏡ユニット１２の焦点合わせ機構８１、第１マニピュレータ１４の駆動装置３０、駆動装置３２、シリンジポンプ２９、第２マニピュレータ１６の駆動装置４０、駆動装置４２、圧電素子９２、注入ポンプ３９を制御し、必要に応じて設けられたドライバやアンプ等を介してそれぞれに駆動信号を出力する。制御部４６Ａは、駆動装置３０、３２、４０、４２にそれぞれ駆動信号Ｖｘｙ、Ｖｚ（図１参照）を供給する。駆動装置３０、３２、４０、４２は、駆動信号Ｖｘｙ、Ｖｚに基づいてＸ－Ｙ－Ｚ軸方向に駆動する。制御部４６Ａは、微動機構４４にナノポジショナ制御信号ＶＮ（図１参照）を供給して、微動機構４４の制御を行ってもよい。
コントローラ４３は、情報入力手段としてジョイスティック４７と、キーボード、マウス又はタッチパネル等の入力部４９とが接続されている。また、コントローラ４３は、液晶パネル等の表示部４５が接続される。表示部４５にはカメラ１８で取得した顕微鏡画像や各種制御用画面が表示されるようになっている。なお、入力部４９としてタッチパネルが用いられる場合には、表示部４５の表示画面にタッチパネルを重ねて用い、操作者が表示部４５の表示画像を確認しつつ入力操作を行うようにしてもよい。
ジョイスティック４７は公知のものを用いることができる。ジョイスティック４７は、基台と、基台から直立するハンドル部とを備えており、ハンドル部を傾斜させるように操作することで駆動装置３０、４０のＸ－Ｙ駆動を行うことができ、ハンドル部をねじることで駆動装置３２、４２のＺ駆動を行うことができる。ジョイスティック４７は、シリンジポンプ２９、圧電素子９２、注入ポンプ３９の各駆動を操作するためのボタン４７Ａを備えていてもよい。
図３に示すように、コントローラ４３は、さらに画像入力部４３Ａ、画像処理部４３Ｂ、画像出力部４３Ｃ及び位置検出部４３Ｄを備えている。顕微鏡２０を通してカメラ１８で撮像した画像信号Ｖｐｉｘ（図１参照）が画像入力部４３Ａに入力される。画像処理部４３Ｂは、画像入力部４３Ａから画像信号を受け取って、画像処理を行う。画像出力部４３Ｃは、画像処理部４３Ｂで画像処理された画像情報を表示部４５へ出力する。位置検出部４３Ｄは、カメラ１８で撮像された微小対象物である細胞等の位置や、第２ピペット３５によるインジェクション操作を行う操作対象である細胞の核等の位置を、画像処理後の画像情報に基づいて検出することができる。位置検出部４３Ｄは、画像情報に基づいてカメラ１８の撮像領域内における細胞等の有無を検出することができる。また、位置検出部４３Ｄは、第１ピペット２５及び第２ピペット３５の位置を検出してもよい。画像入力部４３Ａ、画像処理部４３Ｂ、画像出力部４３Ｃ及び位置検出部４３Ｄは、制御部４６Ａにより制御される。
制御部４６Ａは、位置検出部４３Ｄからの位置情報、及び細胞等の有無の情報に基づいて、第１マニピュレータ１４及び第２マニピュレータ１６を制御する。本実施形態において、制御部４６Ａは、第１マニピュレータ１４及び第２マニピュレータ１６を所定のシーケンスで自動的に駆動する。かかるシーケンス駆動は、記憶部４６Ｂにあらかじめ保存された所定のプログラムによるＣＰＵの演算結果に基づいて、制御部４６Ａが順次それぞれに駆動信号を出力することで行われる。
次に、図４を参照して、微小対象物である試料の操作対象の検出方法と、操作実行位置ＩＪ、第２ピペット３５の挿入開始位置Ｐ０、透明帯接触位置Ｐ１、細胞膜接触位置Ｐ２及び核膜接触位置Ｐ３の決定方法と、について説明する。図４は、操作対象の細胞及び核の一例を示す模式図である。図４は、図１におけるＺ軸方向に視た図である。本実施形態において、試料は細胞１００である。また、細胞１００は、前核期受精卵である。また、細胞１００への操作は、ＤＮＡ溶液のインジェクション操作である。また、本実施形態において、細胞１００への第２ピペット３５の挿入方向は、Ｘ軸方向に平行である。挿入方向に直交する交差方向は、Ｙ軸方向に平行である。なお、図１に示すように、第２ピペット３５は、所定の傾きをもって取り付けられている。このため、第２ピペット３５の先端位置は、挿入が開始されると、実際にはＺ軸方向（図４の紙面垂直方向）に若干移動する。以下の説明では、Ｚ軸方向の説明は省略し、Ｘ－Ｙ平面に沿う移動について説明する。
細胞１００は、試料保持部材１１（図１参照）に収容される。本実施形態において、試料保持部材１１は、未処理の細胞１００を載置する未処理細胞領域と、操作が成功した細胞１００を載置する成功細胞領域と、操作が失敗した細胞１００を載置する失敗細胞領域と、を含む。細胞１００は、透明帯１０２と、細胞膜１０４と、核１１０と、を含む。透明帯１０２は、細胞膜１０４を取り囲む糖タンパク質の層である。細胞膜１０４は、細胞１００の内外を隔てる生体膜である。透明帯１０２及び細胞膜１０４は、流動性を有する高弾性の物質である。高弾性とは、弾性限界が大きいことである。核１１０は、細胞膜１０４に覆われた細胞１００の内部に存在する。核１１０は、核膜１１２と核小体１１４とを有する。核膜１１２は、流動性を有する高弾性の物質である。核小体１１４は、核膜１１２に覆われた核１１０の内部に存在する。
細胞１００は、第１ピペット２５（図１参照）に保持された状態で、第２ピペット３５によってインジェクション操作される。ＤＮＡ溶液等のインジェクションにおいては、ＤＮＡ溶液等を、核膜１１２の内部に注入する必要がある。核膜１１２は、低コントラストかつ形状が不定であるため、エッジ抽出処理等の一般的な画像処理手段による検出が困難である。そこで、核膜１１２より高コントラストの核小体１１４を検出し、核小体１１４の位置に基づいて、インジェクションの操作実行位置ＩＪを決定する。
細胞１００の画像データは、図３に示すカメラ１８により撮像される。カメラ１８により撮像された細胞１００の画像データは、画像入力部４３Ａから画像信号として画像処理部４３Ｂに送られる。画像処理部４３Ｂは、細胞１００の画像データの画像処理を行う。画像処理部４３Ｂは、細胞１００及び核小体１１４の位置及び形状を検出するために、画像入力部４３Ａから受け取った画像信号について二値化処理とフィルタ処理を実行する。画像処理部４３Ｂは、画像信号をグレースケール化して、あらかじめ設定された所定の閾値に基づいて、このグレースケール画像をモノクロ画像に変換する。そして、画像処理部４３Ｂは、二値化処理とフィルタ処理により得られたモノクロ画像に基づいてエッジ抽出処理やパターンマッチングを行う。その処理結果に基づいて位置検出部４３Ｄは、細胞１００及び核小体１１４の位置及び形状を検出することができる。すなわち、コントローラ４３は、画像データに基づいて、細胞１００の半径Ｒ、細胞１００の中心Ｃ１、核小体１１４の半径ｒ、及び核小体１１４の中心Ｃ２を検出する。
コントローラ４３は、検出結果に基づいて、第１ピペット２５を移動させて、予め定められた原点（０，０）に細胞１００の中心Ｃ１を移動させる。コントローラ４３は、細胞１００の中心Ｃ１のＸ－Ｙ平面における座標を原点（０，０）と定義するようにしてもよい。コントローラ４３は、検出結果における細胞１００の中心Ｃ１及び核小体１１４の中心Ｃ２の位置に基づいて、核小体１１４の中心Ｃ２の座標（ｘ１，ｙ１）を算出する。本実施形態において、ｘ１＝０である。
インジェクションの操作実行位置ＩＪは、第２ピペット３５が細胞１００にインジェクション操作する際の、第２ピペット３５の先端の位置である。インジェクションの操作実行位置ＩＪの座標（ｘ２，ｙ２）は、核小体１１４の中心Ｃ２の座標（ｘ１，ｙ１）と、核小体１１４の半径ｒと、オフセット量αと、によって決定される。オフセット量αは、予め定められる任意の設定値である。操作実行位置ＩＪの座標（ｘ２，ｙ２）は、核小体１１４の中心Ｃ１の座標（ｘ１，ｙ１）に対して、細胞１００の中心Ｃ１に向かってＹ軸方向に（ｒ＋α）だけ移動した位置である。操作実行位置ＩＪのＸ座標ｘ２は、ｘ２＝ｘ１によって算出される。本実施形態において、ｘ２＝０である。操作実行位置ＩＪのＹ座標ｙ２は、ｙ１≧０である場合、ｙ２＝ｙ１－（ｒ＋α）によって算出される。操作実行位置ＩＪのＹ座標ｙ２は、ｙ１＜０である場合、ｙ２＝ｙ１＋（ｒ＋α）によって算出される。
第２ピペット３５の挿入開始位置Ｐ０は、細胞１００に対する第２ピペット３５の挿入動作が開始される位置である。第２ピペット３５は、操作実行位置ＩＪに向かって、かつ、Ｘ軸に対して平行に挿入される。図４に示すように、第２ピペット３５の挿入開始位置Ｐ０の座標（ｘ３，ｙ３）は、操作実行位置ＩＪの座標（ｘ２，ｙ２）と、初期距離Ｌ０と、によって決定される。初期距離Ｌ０は、細胞１００の中心Ｃ１と第２ピペット３５の先端の初期位置ＩＰとのＸ軸方向の距離である。初期距離Ｌ０は、細胞１００の半径Ｒよりも大きい。挿入開始位置Ｐ０のＹ座標ｙ３は、ｙ３＝ｙ２によって算出される。挿入開始位置Ｐ０のＸ座標ｘ３は、ｘ３＝－Ｌ０によって算出される。
透明帯接触位置Ｐ１は、第２ピペット３５の先端が透明帯１０２に接触する位置である。透明帯接触位置Ｐ１は、挿入開始位置Ｐ０と操作実行位置ＩＪとを結ぶ直線と、透明帯１０２の外形とが交差する位置である。透明帯接触位置Ｐ１の座標（ｘ４，ｙ４）は、顕微鏡ユニット１２の画像データに基づいて決定される。透明帯接触位置Ｐ１のＹ座標ｙ４は、ｙ４＝ｙ２である。
細胞膜接触位置Ｐ２は、第２ピペット３５の先端が細胞膜１０４に接触する位置である。細胞膜接触位置Ｐ２は、挿入開始位置Ｐ０と操作実行位置ＩＪとを結ぶ直線と、細胞膜１０４の外形とが交差する位置である。細胞膜接触位置Ｐ２の座標（ｘ５，ｙ５）は、顕微鏡ユニット１２の画像データに基づいて決定される。細胞膜接触位置Ｐ２のＹ座標ｙ５は、ｙ５＝ｙ２である。
核膜接触位置Ｐ３は、第２ピペット３５の先端が核膜１１２に接触する位置である。核膜接触位置Ｐ３は、挿入開始位置Ｐ０と操作実行位置ＩＪとを結ぶ直線と、核膜１１２の外形とが交差する位置である。核膜接触位置Ｐ３の座標（ｘ６，ｙ６）は、顕微鏡ユニット１２の画像データに基づいて決定される。核膜接触位置Ｐ３のＹ座標ｙ６は、ｙ６＝ｙ２である。
次に、マニピュレーションシステム１０の駆動方法について説明する。マニピュレーションシステム１０の動作を開始する前に、操作者は、まず、図１に示すカメラ１８の視野内に、第１ピペット２５及び第２ピペット３５を配置する。ここで、第１ピペット２５の先端の高さは試料保持部材１１の底面よりわずかに上の位置とする。操作者は、次に、顕微鏡２０の焦点合わせ機構８１（図３参照）を用いて、焦点を第１ピペット２５に合わせる。操作者は、焦点を第１ピペット２５に合わせた状態で、焦点が合うように第２ピペット３５の高さを調整する。操作者は、次に、試料保持部材１１内の細胞１００の周辺を、カメラ１８の視野と重なるように試料ステージ２２を移動させる。操作者は、さらに、細胞１００に第１ピペット２５の先端を近付けても細胞１００が動かないことを確認する。これは、図３に示すシリンジポンプ２９が平衡状態であることを確認するためである。以上の準備により、細胞１００は、第１ピペット２５及び第２ピペット３５の近傍に配置される。
図５は、第１実施形態のマニピュレーションシステムの動作の一例を示すフローチャート図である。図６は、透明帯の穿孔動作の一例を示すフローチャート図である。図７は、細胞膜の穿孔動作の一例を示すフローチャート図である。図８は、核膜の穿孔動作の一例を示すフローチャート図である。図９は、第１実施形態のマニピュレーションシステムの動作を説明する説明図である。マニピュレーションシステム１０は、試料保持部材１１に載置された複数の細胞１００に対し、１つの細胞１００ごとに操作を行い、複数の細胞１００について操作を繰り返し実行する。コントローラ４３は、複数の細胞１００に対する操作を自動で実行する。マニピュレーションシステム１０による自動操作は、例えば、ＰＣソフト上の開始ボタンを押すことでスタートする。
図５に示すように、まず、ステップＳＴ１０において、操作者は、マニピュレーションシステム１０が複数回の操作を実行した後、操作を終了する回数である操作終了回数Ｎｅを、図３に示す入力部４９を介してコントローラ４３の制御部４６Ａに設定する。１つの細胞１００ごとに操作を行うので、操作終了回数Ｎｅは、操作を行う細胞１００の個数である。制御部４６Ａに操作終了回数Ｎｅが入力されると、ステップＳＴ１２において、制御部４６Ａは、実行した操作回数のカウンタ値である操作実行回数ＮをＮ＝０としてコントローラ４３の記憶部４６Ｂに記憶させる。
次に、コントローラ４３の画像処理部４３Ｂは、顕微鏡２０を通してカメラ１８が撮像した画像データの画像処理を行う。コントローラ４３の位置検出部４３Ｄは、画像処理によって、カメラ１８の画面上における第１ピペット２５の先端中央の位置座標及び第２ピペット３５の先端中央の位置座標を検出する。ステップＳＴ１４において、制御部４６Ａは、第１マニピュレータ１４を駆動して、検出結果に基づいて、第１ピペット２５を所定の位置へ移動させる。所定の位置とは、第１ピペット２５の先端中央が操作対象の細胞１００に対向する位置である。
次に、ステップＳＴ１６において、制御部４６Ａは、第１マニピュレータ１４のシリンジポンプ２９（図３参照）を駆動させ、第１ピペット２５の吸引を実行させる。シリンジポンプ２９が駆動すると、第１ピペット２５の内部は陰圧となり、第１ピペット２５の開口に向かって試料保持部材１１の溶液の流れが発生する。細胞１００は、溶液とともに吸引されて、第１ピペット２５の先端に吸着し、保持される。ここで、細胞１００が保持されたかを確認するために、第１ピペット２５の先端近傍に細胞１００があるか、画像処理によって検出して判断するようにしてもよい。
次に、ステップＳＴ１８において、画像処理部４３Ｂは、細胞１００の画像データを取得する。ステップＳＴ２０において、位置検出部４３Ｄは、取得した画像データに基づいて、細胞１００及び核小体１１４の位置及び形状を画像処理シーケンスにより検出する。ステップＳＴ２２において、位置検出部４３Ｄは、核小体１１４が検出されたか否かを判断する。ステップＳＴ２２において、核小体１１４が検出されないと判断された場合（ステップＳＴ２２；Ｎｏ）、ステップＳＴ２０に戻り、画像処理部４３Ｂは、再び細胞１００及び核小体１１４の位置及び形状を画像シーケンスにより再度検出する。ステップＳＴ２２において、核小体１１４が検出されないと判断した場合、ステップＳＴ１８に戻って、画像処理部４３Ｂが細胞１００の画像データを再度取得してもよい。ステップＳＴ１８において、画像データを再度取得する前に、制御部４６Ａは、第１ピペット２５による細胞１００の保持を一時解除して細胞１００の姿勢を変更させるようにしてもよい。
ステップＳＴ２２において、核小体１１４が検出されたと判断された場合（ステップＳＴ２２；Ｙｅｓ）、制御部４６Ａは、核小体１１４の中心Ｃ２の座標（ｘ１，ｙ１）を算出する。本実施形態において、ｘ１＝０である。次に、ステップＳＴ２４において、制御部４６Ａは、核小体１１４の中心Ｃ２のＹ座標ｙ１が細胞１００の中心Ｃ１のＹ座標０以上か否かを判断する。ステップＳＴ２４において、核小体１１４の中心Ｃ２のＹ座標ｙ１が細胞１００の中心Ｃ１のＹ座標０以上であると判断された場合、ステップＳＴ２６において、操作実行位置ＩＪのＹ座標ｙ２は、ｙ２＝ｙ１－（ｒ＋α）によって算出される。ステップＳＴ２４において、核小体１１４の中心Ｃ２のＹ座標ｙ１が細胞１００の中心Ｃ１のＹ座標０より小さいと判断された場合、ステップＳＴ２８において、操作実行位置ＩＪのＹ座標ｙ２は、ｙ２＝ｙ１＋（ｒ＋α）によって算出される。
ステップＳＴ２６及びステップＳＴ２８によって操作実行位置ＩＪのＹ座標ｙ２を算出した後、ステップＳＴ３０において、制御部４６Ａは、操作実行位置ＩＪ及び挿入開始位置Ｐ０を決定する。具体的には、制御部４６Ａは、操作実行位置ＩＪの座標（ｘ２，ｙ２）及び挿入開始位置Ｐ０の座標（ｘ３，ｙ３）を算出し、第２ピペット３５の移動経路を設定する。制御部４６Ａは、第２ピペット３５の移動経路と細胞１００の画像データとから、透明帯接触位置Ｐ１（ｘ４，ｙ４）、細胞膜接触位置Ｐ２（ｘ５，ｙ５）及び核膜接触位置Ｐ３（ｘ６，ｙ６）を決定する。
次に、ステップＳＴ３２において、制御部４６Ａは、第２ピペット３５の先端を挿入開始位置Ｐ０に移動させる。第２ピペット３５の初期位置ＩＰと、挿入開始位置Ｐ０とは、Ｘ座標が同一なので、第２ピペット３５は、Ｙ軸方向に平行に移動する。第２ピペット３５の先端は、操作実行位置ＩＪに対向する。
次に、ステップＳＴ４０において、第２ピペット３５は、透明帯１０２を穿孔する。図６に示すように、ステップＳＴ４０－２において、制御部４６Ａは、第２ピペット３５の先端を透明帯接触位置Ｐ１に移動させる。第２ピペット３５の挿入開始位置Ｐ０と、透明帯接触位置Ｐ１とは、Ｙ座標が同一なので、第２ピペット３５は、Ｘ軸方向に平行に移動する。第２ピペット３５の先端は、操作実行位置ＩＪに向かって透明帯１０２に僅かに押し当てられる。透明帯１０２は、高弾性であるため、第２ピペット３５の先端が押し当てられることによって、穿孔されず、微小に変形する。
ステップＳＴ４０－４において、画像処理部４３Ｂは、細胞１００の画像データを取得する。ステップＳＴ４０－６において、位置検出部４３Ｄは、取得した画像データに基づいて、透明帯１０２と第２ピペット３５の先端との接触位置を画像処理シーケンスにより検出する。制御部４６Ａは、透明帯１０２と第２ピペット３５の先端との接触位置の座標を記憶部４６Ｂに記憶させる。ステップＳＴ４０－６において、透明帯１０２と第２ピペット３５の先端との接触位置が検出されなかった場合、画像処理部４３Ｂは、再び透明帯１０２と第２ピペット３５の先端との接触位置を画像シーケンスにより再度検出してもよい。
ステップＳＴ４０－８において、位置検出部４３Ｄは、透明帯１０２と第２ピペット３５の先端とが接触しているか否かを判断する。ステップＳＴ４０－８において、透明帯１０２と第２ピペット３５の先端とが接触していないと判断された場合（ステップＳＴ４０－８；Ｎｏ）、ステップＳＴ４０－１０に移行する。ステップＳＴ４０－８において、透明帯１０２と第２ピペット３５の先端とが接触していると判断された場合（ステップＳＴ４０－８；Ｙｅｓ）、ステップＳＴ４０－１２に移行する。
ステップＳＴ４０－１０において、制御部４６Ａは、第２ピペット３５の先端を、透明帯１０２に接触するように移動させる。制御部４６Ａは、予め設定された所定のプログラムに従って第２ピペット３５を移動させる。第２ピペット３５を移動させた後、ステップＳＴ４０－４に戻り、画像処理部４３Ｂが細胞１００の画像データを再度取得する。
ステップＳＴ４０－４からステップＳＴ４０－１０は、省略してもよい。すなわち、ステップＳＴ４０－２において、第２ピペット３５の先端が透明帯接触位置Ｐ１に移動したことによって、透明帯１０２と第２ピペット３５の先端とが接触したと見做してもよい。この場合、ステップＳＴ３０において、透明帯接触位置Ｐ１を決定した後、制御部４６Ａは、透明帯接触位置Ｐ１を、透明帯１０２と第２ピペット３５の先端との接触位置の座標として記憶部４６Ｂに記憶させておく。
ステップＳＴ４０－１２において、制御部４６Ａは、微動機構４４を駆動する。制御部４６Ａは、微動機構４４に第２ピペット３５を加振させる。第２ピペット３５の振動によって、透明帯１０２と第２ピペット３５の先端との接触位置において、透明帯１０２が穿孔される。制御部４６Ａは、予め定められた所定回数又は所定時間、微動機構４４に第２ピペット３５を加振させる。
微動機構４４による第２ピペット３５への加振を終えた後、ステップＳＴ４０－１４において、制御部４６Ａは、第２ピペット３５をＸ軸方向に僅かに前進移動させる。ステップＳＴ４０－１６において、画像処理部４３Ｂは、細胞１００の画像データを取得する。ステップＳＴ４０－１８において、位置検出部４３Ｄは、取得した画像データに基づいて、透明帯１０２の穿孔位置を画像処理シーケンスにより検出する。穿孔位置は、透明帯１０２の外形と第２ピペット３５とが交差する位置である。制御部４６Ａは、透明帯１０２の穿孔位置の座標を記憶部４６Ｂに記憶させる。ステップＳＴ４０－１８において、透明帯１０２の穿孔位置が検出されなかった場合、画像処理部４３Ｂは、再び透明帯１０２の穿孔位置を画像シーケンスにより再度検出してもよい。
ステップＳＴ４０－２０において、制御部４６Ａは、透明帯１０２の穿孔操作が成功したか否かを判断する。制御部４６Ａは、ステップＳＴ４０－１８において検出した透明帯１０２の穿孔位置の座標と第２ピペット３５の先端の座標とを比較する。制御部４６Ａは、第２ピペット３５の先端の座標が穿孔位置の座標より細胞１００の内側にない場合、穿孔操作が失敗したと判断し、穿孔操作の失敗情報を記憶部４６Ｂに記憶させる。制御部４６Ａは、第２ピペット３５の先端の座標が穿孔位置の座標より細胞１００の内側にある場合、穿孔操作が成功したと判断し、穿孔操作の成功情報を記憶部４６Ｂに記憶させる。ステップＳＴ４０－２０において、透明帯１０２の穿孔操作が失敗したと判断された場合（ステップＳＴ４０－２０；Ｎｏ）、ステップＳＴ４０－１０に移行する。ステップＳＴ４０－２０において、透明帯１０２の穿孔操作が成功したと判断された場合（ステップＳＴ４０－２０；Ｙｅｓ）、ステップＳＴ４０を終了し、ステップＳＴ５０に移行する。
次に、ステップＳＴ５０において、第２ピペット３５は、細胞膜１０４を穿孔する。図７に示すように、ステップＳＴ５０－２において、制御部４６Ａは、第２ピペット３５の先端を細胞膜接触位置Ｐ２に移動させる。透明帯接触位置Ｐ１と、細胞膜接触位置Ｐ２とは、Ｙ座標が同一なので、第２ピペット３５は、Ｘ軸方向に平行に移動する。第２ピペット３５の先端は、操作実行位置ＩＪに向かって細胞膜１０４に僅かに押し当てられる。細胞膜１０４は、高弾性であるため、第２ピペット３５の先端が押し当てられることによって、穿孔されず、微小に変形する。
ステップＳＴ５０－４において、画像処理部４３Ｂは、細胞１００の画像データを取得する。ステップＳＴ５０－６において、位置検出部４３Ｄは、取得した画像データに基づいて、細胞膜１０４と第２ピペット３５の先端との接触位置を画像処理シーケンスにより検出する。制御部４６Ａは、細胞膜１０４と第２ピペット３５の先端との接触位置の座標を記憶部４６Ｂに記憶させる。ステップＳＴ５０－６において、細胞膜１０４と第２ピペット３５の先端との接触位置が検出されなかった場合、画像処理部４３Ｂは、再び細胞膜１０４と第２ピペット３５の先端との接触位置を画像シーケンスにより再度検出してもよい。
ステップＳＴ５０－８において、位置検出部４３Ｄは、細胞膜１０４と第２ピペット３５の先端とが接触しているか否かを判断する。ステップＳＴ５０－８において、細胞膜１０４と第２ピペット３５の先端とが接触していないと判断された場合（ステップＳＴ５０－８；Ｎｏ）、ステップＳＴ５０－１０に移行する。ステップＳＴ５０－８において、細胞膜１０４と第２ピペット３５の先端とが接触していると判断された場合（ステップＳＴ５０－８；Ｙｅｓ）、ステップＳＴ５０－１２に移行する。
ステップＳＴ５０－１０において、制御部４６Ａは、第２ピペット３５の先端を、細胞膜１０４に接触するように移動させる。制御部４６Ａは、予め設定された所定のプログラムに従って第２ピペット３５を移動させる。第２ピペット３５を移動させた後、ステップＳＴ５０－４に戻り、画像処理部４３Ｂが細胞１００の画像データを再度取得する。
ステップＳＴ５０－４からステップＳＴ５０－１０は、省略してもよい。すなわち、ステップＳＴ５０－２において、第２ピペット３５の先端が細胞膜接触位置Ｐ２に移動したことによって、細胞膜１０４と第２ピペット３５の先端とが接触したと見做してもよい。この場合、ステップＳＴ３０において、細胞膜接触位置Ｐ２を決定した後、制御部４６Ａは、細胞膜接触位置Ｐ２を、細胞膜１０４と第２ピペット３５の先端との接触位置の座標として記憶部４６Ｂに記憶させておく。
ステップＳＴ５０－１２において、制御部４６Ａは、微動機構４４を駆動する。制御部４６Ａは、微動機構４４に第２ピペット３５を加振させる。第２ピペット３５の振動によって、細胞膜１０４と第２ピペット３５の先端との接触位置において、細胞膜１０４が穿孔される。制御部４６Ａは、予め定められた所定回数又は所定時間、微動機構４４に第２ピペット３５を加振させる。
微動機構４４による第２ピペット３５への加振を終えた後、ステップＳＴ５０－１４において、制御部４６Ａは、第２ピペット３５をＸ軸方向に僅かに前進移動させる。ステップＳＴ５０－１６において、画像処理部４３Ｂは、細胞１００の画像データを取得する。ステップＳＴ５０－１８において、位置検出部４３Ｄは、取得した画像データに基づいて、細胞膜１０４の穿孔位置を画像処理シーケンスにより検出する。穿孔位置は、細胞膜１０４の外形と第２ピペット３５とが交差する位置である。制御部４６Ａは、細胞膜１０４の穿孔位置の座標を記憶部４６Ｂに記憶させる。ステップＳＴ５０－１８において、細胞膜１０４の穿孔位置が検出されなかった場合、画像処理部４３Ｂは、再び細胞膜１０４の穿孔位置を画像シーケンスにより再度検出してもよい。
ステップＳＴ５０－２０において、制御部４６Ａは、細胞膜１０４の穿孔操作が成功したか否かを判断する。制御部４６Ａは、ステップＳＴ５０－１８において検出した細胞膜１０４の穿孔位置の座標と第２ピペット３５の先端の座標とを比較する。制御部４６Ａは、第２ピペット３５の先端の座標が穿孔位置の座標より細胞１００の内側にない場合、穿孔操作が失敗したと判断し、穿孔操作の失敗情報を記憶部４６Ｂに記憶させる。制御部４６Ａは、第２ピペット３５の先端の座標が穿孔位置の座標より細胞１００の内側にある場合、穿孔操作が成功したと判断し、穿孔操作の成功情報を記憶部４６Ｂに記憶させる。ステップＳＴ５０－２０において、細胞膜１０４の穿孔操作が失敗したと判断された場合（ステップＳＴ５０－２０；Ｎｏ）、ステップＳＴ５０－１０に移行する。ステップＳＴ５０－２０において、細胞膜１０４の穿孔操作が成功したと判断された場合（ステップＳＴ５０－２０；Ｙｅｓ）、ステップＳＴ５０を終了し、ステップＳＴ６０に移行する。
次に、ステップＳＴ６０において、第２ピペット３５は、核膜１１２を穿孔する。図８に示すように、ステップＳＴ６０－２において、制御部４６Ａは、第２ピペット３５の先端を核膜接触位置Ｐ３に移動させる。細胞膜接触位置Ｐ２と、核膜接触位置Ｐ３とは、Ｙ座標が同一なので、第２ピペット３５は、Ｘ軸方向に平行に移動する。第２ピペット３５の先端は、操作実行位置ＩＪに向かって核膜１１２に僅かに押し当てられる。核膜１１２は、高弾性であるため、第２ピペット３５の先端が押し当てられることによって、穿孔されず、微小に変形する。
ステップＳＴ６０－４において、画像処理部４３Ｂは、細胞１００の画像データを取得する。ステップＳＴ６０－６において、位置検出部４３Ｄは、取得した画像データに基づいて、核膜１１２と第２ピペット３５の先端との接触位置を画像処理シーケンスにより検出する。制御部４６Ａは、核膜１１２と第２ピペット３５の先端との接触位置の座標を記憶部４６Ｂに記憶させる。ステップＳＴ６０－６において、核膜１１２と第２ピペット３５の先端との接触位置が検出されなかった場合、画像処理部４３Ｂは、再び核膜１１２と第２ピペット３５の先端との接触位置を画像シーケンスにより再度検出してもよい。
ステップＳＴ６０－８において、位置検出部４３Ｄは、核膜１１２と第２ピペット３５の先端とが接触しているか否かを判断する。ステップＳＴ６０－８において、核膜１１２と第２ピペット３５の先端とが接触していないと判断された場合（ステップＳＴ６０－８；Ｎｏ）、ステップＳＴ６０－１０に移行する。ステップＳＴ６０－８において、核膜１１２と第２ピペット３５の先端とが接触していると判断された場合（ステップＳＴ６０－８；Ｙｅｓ）、ステップＳＴ６０－１２に移行する。
ステップＳＴ６０－１０において、制御部４６Ａは、第２ピペット３５の先端を、核膜１１２に接触するように移動させる。制御部４６Ａは、予め設定された所定のプログラムに従って第２ピペット３５を移動させる。第２ピペット３５を移動させた後、ステップＳＴ６０－４に戻り、画像処理部４３Ｂが細胞１００の画像データを再度取得する。
ステップＳＴ６０－４からステップＳＴ６０－１０は、省略してもよい。すなわち、ステップＳＴ６０－２において、第２ピペット３５の先端が核膜接触位置Ｐ３に移動したことによって、核膜１１２と第２ピペット３５の先端とが接触したと見做してもよい。この場合、ステップＳＴ３０において、核膜接触位置Ｐ３を決定した後、制御部４６Ａは、核膜接触位置Ｐ３を、核膜１１２と第２ピペット３５の先端との接触位置の座標として記憶部４６Ｂに記憶させておく。
ステップＳＴ６０－１２において、制御部４６Ａは、微動機構４４を駆動する。制御部４６Ａは、微動機構４４に第２ピペット３５を加振させる。第２ピペット３５の振動によって、核膜１１２と第２ピペット３５の先端との接触位置において、核膜１１２が穿孔される。制御部４６Ａは、予め定められた所定回数又は所定時間、微動機構４４に第２ピペット３５を加振させる。
微動機構４４による第２ピペット３５への加振を終えた後、ステップＳＴ６０－１４において、制御部４６Ａは、第２ピペット３５をＸ軸方向に僅かに前進移動させる。ステップＳＴ６０－１６において、画像処理部４３Ｂは、細胞１００の画像データを取得する。ステップＳＴ６０－１８において、位置検出部４３Ｄは、取得した画像データに基づいて、核膜１１２の穿孔位置を画像処理シーケンスにより検出する。穿孔位置は、核膜１１２の外形と第２ピペット３５とが交差する位置である。制御部４６Ａは、核膜１１２の穿孔位置の座標を記憶部４６Ｂに記憶させる。ステップＳＴ６０－１８において、核膜１１２の穿孔位置が検出されなかった場合、画像処理部４３Ｂは、再び核膜１１２の穿孔位置を画像シーケンスにより再度検出してもよい。
ステップＳＴ６０－２０において、制御部４６Ａは、核膜１１２の穿孔操作が成功したか否かを判断する。制御部４６Ａは、ステップＳＴ６０－１８において検出した核膜１１２の穿孔位置の座標と第２ピペット３５の先端の座標とを比較する。制御部４６Ａは、第２ピペット３５の先端の座標が穿孔位置の座標より核１１０の内側にない場合、穿孔操作が失敗したと判断し、穿孔操作の失敗情報を記憶部４６Ｂに記憶させる。制御部４６Ａは、第２ピペット３５の先端の座標が穿孔位置の座標より核１１０の内側にある場合、穿孔操作が成功したと判断し、穿孔操作の成功情報を記憶部４６Ｂに記憶させる。ステップＳＴ６０－２０において、核膜１１２の穿孔操作が失敗したと判断された場合（ステップＳＴ６０－２０；Ｎｏ）、ステップＳＴ６０－１０に移行する。ステップＳＴ６０－２０において、核膜１１２の穿孔操作が成功したと判断された場合（ステップＳＴ６０－２０；Ｙｅｓ）、ステップＳＴ６０を終了し、ステップＳＴ８０に移行する。
次に、ステップＳＴ８０において、制御部４６Ａは、第２マニピュレータ１６の注入ポンプ３９（図３参照）を駆動させ、細胞１００に対するＤＮＡ溶液等のインジェクション操作を実行させる。制御部４６Ａは、例えば、予め設定された時間、注入ポンプ３９を駆動させてインジェクション操作を実行させてもよい。画像処理部４３Ｂは、インジェクション操作中に画像処理を実行し、核膜１１２の膨らみを検出して、ＤＮＡ溶液等のインジェクションが完了したか判断してもよい。インジェクション操作を実行した後、ステップＳＴ８２において、制御部４６Ａは、第２ピペット３５を初期位置ＩＰに移動させる。具体的には、第２ピペット３５は、Ｘ軸方向に移動して細胞１００から引き抜かれた後、Ｙ軸方向に移動して初期位置ＩＰに戻る。
次に、ステップＳＴ８４において、制御部４６Ａは、インジェクション操作が成功したか否かを判断する。ステップＳＴ８４において、インジェクションが成功したと判断された場合（ステップＳＴ８４；Ｙｅｓ）、ステップＳＴ８６に移行する。ステップＳＴ８６において、制御部４６Ａは、試料ステージ２２を駆動し、インジェクション操作後の細胞１００を、試料保持部材１１（図１参照）の成功細胞領域に移動させる。制御部４６Ａは、第１マニピュレータ１４のシリンジポンプ２９を停止させ、第１ピペット２５の吸引を停止させる。これにより、第１ピペット２５の内部が陽圧となり、第１ピペット２５は、細胞１００の保持を解除する。細胞１００は、成功細胞領域に載置される。制御部４６Ａは、再度試料ステージ２２を駆動し、未処理の細胞１００が配置される試料保持部材１１の未処理細胞領域の近傍に第１ピペット２５の先端を移動させる。ステップＳＴ８４において、インジェクションが失敗したと判断された場合（ステップＳＴ８４；Ｎｏ）、ステップＳＴ８８に移行する。ステップＳＴ８８において、制御部４６Ａは、試料ステージ２２を駆動し、インジェクション操作後の細胞１００を、試料保持部材１１の失敗細胞領域に移動させる。制御部４６Ａは、第１マニピュレータ１４のシリンジポンプ２９を停止させ、第１ピペット２５の吸引を停止させる。これにより、第１ピペット２５の内部が陽圧となり、第１ピペット２５は、細胞１００の保持を解除する。細胞１００は、成功細胞領域に載置される。制御部４６Ａは、再度試料ステージ２２を駆動し、未処理の細胞１００が配置される未処理細胞領域の近傍に第１ピペット２５の先端を移動させる。
ステップＳＴ８６及びステップＳＴ８８の後、ステップＳＴ９０において、制御部４６Ａは、操作実行回数Ｎのカウンタ値を１つ増やして、Ｎ＝Ｎ＋１としてコントローラ４３の記憶部４６Ｂに記憶させる。ステップＳＴ９２において、制御部４６Ａは、操作実行回数Ｎが操作終了回数Ｎｅに達したか否かを判断する。ステップＳＴ９２において、操作実行回数Ｎが操作終了回数Ｎｅよりも小さいと判断された場合（ステップＳＴ９２；Ｎｏ）、ステップＳＴ１４に戻って別の細胞１００に対する保持操作、細胞１００及び核小体１１４の検出操作、核膜１１２内へのインジェクション操作、細胞１００の載置操作を繰り返し実行する。ステップＳＴ９２において、操作実行回数Ｎが操作終了回数Ｎｅ以上と判断された場合（ステップＳＴ９２；Ｙｅｓ）、予め設定された個数の細胞１００に対する操作が終了し、一連の操作を終了する。
カメラ１８の撮像画像は、焦点位置におけるＸ－Ｙ平面を撮像したものであるので、第２ピペット３５の先端と核小体１１４とのＺ方向の位置が重ならない可能性がある。この場合、第２ピペット３５の先端が核小体１１４の近傍に差し込まれず、インジェクションは失敗することが想定される。本実施形態においては、インジェクションが失敗した場合（ステップＳＴ８４；Ｎｏ）、保持中の細胞１００を失敗細胞領域に移動させて、失敗した細胞１００への操作を中止するが、例えば、未処理細胞領域に移動させて、ステップＳＴ１４に戻ってもよい。例えば、ステップＳＴ１６において、同じ細胞１００の姿勢を変更して保持してもよいし、違う細胞１００を保持してもよい。インジェクションを失敗した細胞１００について、操作者が判断してもよいし、予め設定した条件に基づいて制御部４６Ａが判断してもよい。
以上説明したように、本実施形態のマニピュレーションシステム１０は、微小対象物が載置される試料ステージ２２と、微小対象物を保持するための第１ピペット２５を備える第１マニピュレータ１４と、第１ピペット２５に保持された微小対象物を操作するための第２ピペット３５を備える第２マニピュレータ１６と、第２ピペット３５を軸方向に移動させるための微動機構４４と、試料ステージ２２、第１ピペット２５、第２ピペット３５及び微動機構４４を制御し、第２ピペット３５の先端を微小対象物に押し当てた状態で、微動機構４４に第２ピペット３５を加振させ、且つ、加振後に微小対象物が穿孔されたか否かを判定するコントローラ４３と、を備える。
これによれば、微動機構４４が第２ピペット３５を挿入方向に加振させることによって穿孔するため、第２ピペット３５の先端が単に突き刺しただけでは微小対象物に刺さらない太さのものであっても穿孔できる。また、微小対象物が確実に穿孔された状態で操作実行位置ＩＪまで第２ピペット３５を挿入することができる。したがって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の微小対象物への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に操作することができる。
本実施形態のマニピュレーションシステム１０において、微動機構４４は、圧電素子９２を含む。このようなマニピュレーションシステム１０によれば、所定の周期の周波数に基づいて圧電素子９２に直接電圧を印加することによって、第２ピペット３５を軸方向に振動させることができる。圧電素子９２に直接電圧を印加することによって、第２ピペット３５の振動をより好適に制御することができる。したがって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の微小対象物への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に穿孔することができる。
本実施形態のマニピュレーションシステム１０において、コントローラ４３は、第２ピペット３５の加振後に、第２ピペット３５を挿入方向に所定距離を移動させることによって微小対象物が穿孔されたか否かを判定する。このようなマニピュレーションシステム１０によれば、第２ピペット３５の先端における微小対象物の挙動を確認することによって、容易に微小対象物が穿孔されたか否かを判定することができる。したがって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の微小対象物への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に操作することができる。
本実施形態のマニピュレーションシステム１０において、微小対象物は、細胞１００である。このようなマニピュレーションシステム１０によれば、微動機構４４が第２ピペット３５を挿入方向に加振させることによって穿孔するため、第２ピペット３５の先端が単に突き刺しただけでは細胞１００に刺さらない太さのものであっても穿孔できる。また、細胞１００が確実に穿孔された状態で操作実行位置ＩＪまで第２ピペット３５を挿入することができる。したがって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の細胞１００への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に操作することができる。
本実施形態のマニピュレーションシステム１０において、コントローラ４３は、第２ピペット３５の先端を細胞１００の透明帯１０２に押し当てた状態で、微動機構４４に第２ピペット３５を加振させ、且つ、加振後に透明帯１０２が穿孔されたか否かを判定する。このようなマニピュレーションシステム１０によれば、微動機構４４が第２ピペット３５を挿入方向に加振させることによって穿孔するため、第２ピペット３５の先端が単に突き刺しただけでは透明帯１０２に刺さらない太さのものであっても穿孔できる。また、透明帯１０２が確実に穿孔された状態で操作実行位置ＩＪまで第２ピペット３５を挿入することができる。したがって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の細胞１００への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に操作することができる。
本実施形態のマニピュレーションシステム１０は、細胞１００を撮像する撮像部（顕微鏡ユニット１２）を備える。本実施形態のマニピュレーションシステム１０において、コントローラ４３は、撮像部の画像データに基づいて第２ピペット３５の先端を透明帯１０２に接触させる透明帯接触位置Ｐ１を決定する。このようなマニピュレーションシステム１０によれば、撮像された画像データに基づいて、透明帯接触位置Ｐ１を決定するため、操作者の熟練度及び技術によらず、効率よくかつ好適に透明帯１０２を穿孔することができる。
本実施形態のマニピュレーションシステム１０において、コントローラ４３は、第２ピペット３５の先端を細胞１００の細胞膜１０４に押し当てた状態で、微動機構４４に第２ピペット３５を加振させ、且つ、加振後に細胞膜１０４が穿孔されたか否かを判定する。このようなマニピュレーションシステム１０によれば、微動機構４４が第２ピペット３５を挿入方向に加振させることによって穿孔するため、第２ピペット３５の先端が単に突き刺しただけでは細胞膜１０４に刺さらない太さのものであっても穿孔できる。また、細胞膜１０４が確実に穿孔された状態で操作実行位置ＩＪまで第２ピペット３５を挿入することができる。したがって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の細胞１００への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に操作することができる。
本実施形態のマニピュレーションシステム１０は、細胞１００を撮像する撮像部（顕微鏡ユニット１２）を備える。本実施形態のマニピュレーションシステム１０において、コントローラ４３は、撮像部の画像データに基づいて第２ピペット３５の先端を細胞膜１０４に接触させる細胞膜接触位置Ｐ２を決定する。このようなマニピュレーションシステム１０によれば、撮像された画像データに基づいて、細胞膜接触位置Ｐ２を決定するため、操作者の熟練度及び技術によらず、効率よくかつ好適に細胞膜１０４を穿孔することができる。
本実施形態のマニピュレーションシステム１０において、コントローラ４３は、第２ピペット３５の先端を細胞１００の核膜１１２に押し当てた状態で、微動機構４４に第２ピペット３５を加振させ、且つ、加振後に核膜１１２が穿孔されたか否かを判定する。このようなマニピュレーションシステム１０によれば、微動機構４４が第２ピペット３５を挿入方向に加振させることによって穿孔するため、第２ピペット３５の先端が単に突き刺しただけでは核膜１１２に刺さらない太さのものであっても穿孔できる。また、核膜１１２が確実に穿孔された状態で操作実行位置ＩＪまで第２ピペット３５を挿入することができる。したがって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の細胞１００への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に操作することができる。
本実施形態のマニピュレーションシステム１０は、細胞１００を撮像する撮像部（顕微鏡ユニット１２）を備える。本実施形態のマニピュレーションシステム１０において、コントローラ４３は、撮像部の画像データに基づいて第２ピペット３５の先端を核膜１１２に接触させる核膜接触位置Ｐ３を決定する。このようなマニピュレーションシステム１０によれば、撮像された画像データに基づいて、核膜接触位置Ｐ３を決定するため、操作者の熟練度及び技術によらず、効率よくかつ好適に核膜１１２を穿孔することができる。
本実施形態のマニピュレーションシステム１０は、細胞１００を撮像する撮像部（顕微鏡ユニット１２）を備える。本実施形態のマニピュレーションシステム１０において、コントローラ４３は、撮像部の画像データに基づいて細胞１００の核小体１１４の位置を検出する。このようなマニピュレーションシステム１０によれば、撮像された画像データに基づいて、細胞１００の核小体１１４の位置を検出するため、操作者の熟練度及び技術によらず、効率よくかつ好適に核小体１１４を検出することができる。
本実施形態のマニピュレーションシステム１０において、コントローラ４３は、核小体１１４の位置に基づいて所定の操作実行位置ＩＪを決定する。このようなマニピュレーションシステム１０によれば、撮像された画像データから検出された核小体１１４の位置に基づいて、操作実行位置ＩＪを決定するため、操作者の熟練度及び技術によらず、効率よくかつ好適に細胞１００を操作することができる。
本実施形態のマニピュレーションシステム１０において、操作実行位置ＩＪは、核小体１１４の外側である。このようなマニピュレーションシステム１０によれば、操作実行位置ＩＪを核小体１１４の外部に設定することによって、第２ピペット３５の挿入時に第２ピペット３５の先端が核小体１１４に触れることなくインジェクション操作をすることが可能である。したがって、インジェクション操作において、細胞１００への損傷を抑制できる。
本実施形態のマニピュレーションシステム１０において、操作実行位置ＩＪは、核小体１１４の中心Ｃ２からオフセットされた位置である。このようなマニピュレーションシステム１０によれば、第２ピペット３５の挿入時に第２ピペット３５の先端が核小体１１４を損傷させることを抑制できる。したがって、インジェクション操作において、細胞１００への損傷を抑制できる。
本実施形態のマニピュレーションシステム１０において、核小体１１４の中心Ｃ２と操作実行位置ＩＪとの第２ピペット３５の挿入方向に直交する交差方向の距離は、核小体１１４の半径ｒより大きい。このようなマニピュレーションシステム１０によれば、操作実行位置ＩＪを核小体１１４の外部に設定できるので、第２ピペット３５の挿入時に第２ピペット３５の先端が核小体１１４に触れることなくインジェクション操作をすることが可能である。したがって、インジェクション操作において、細胞１００への損傷を抑制できる。
本実施形態のマニピュレーションシステム１０において、コントローラ４３は、撮像部の画像データ及び操作実行位置ＩＪに基づいて所定の挿入開始位置Ｐ０を決定する。このようなマニピュレーションシステム１０によれば、撮像された画像データに基づいて、挿入開始位置Ｐ０を決定するため、操作者の熟練度及び技術によらず、効率よくかつ好適に細胞１００を操作することができる。
本実施形態のマニピュレーションシステム１０の駆動方法は、細胞１００が載置される試料ステージ２２と、細胞１００を保持するための第１ピペット２５を備える第１マニピュレータ１４と、第１ピペット２５に保持された細胞１００を操作するための第２ピペット３５を備える第２マニピュレータ１６と、第２ピペット３５を軸方向に移動させるための微動機構４４と、を備えるマニピュレーションシステム１０の駆動方法であって、第２ピペット３５の先端を細胞１００の所定の挿入開始位置Ｐ０に移動させるステップＳＴ３２と、第２ピペット３５の先端を、細胞１００の透明帯１０２に押し当てるステップＳＴ４０－２と、微動機構４４によって第２ピペット３５を加振させるステップＳＴ４０－１２と、第２ピペット３５を加振させた後に透明帯１０２が穿孔されたか否かを判定するステップＳＴ４０－２０と、第２ピペット３５の先端を、細胞１００の細胞膜１０４に押し当てるステップＳＴ５０－２と、微動機構４４によって第２ピペット３５を加振させるステップＳＴ５０－１２と、第２ピペット３５を加振させた後に細胞膜１０４が穿孔されたか否かを判定するステップＳＴ５０－２０と、第２ピペット３５の先端を、細胞１００の核膜１１２に押し当てるステップＳＴ６０－２と、微動機構４４によって第２ピペット３５を加振させるステップＳＴ６０－１２と、第２ピペット３５を加振させた後に核膜１１２が穿孔されたか否かを判定するステップＳＴ６０－２０と、を含む。
これによれば、微動機構４４が第２ピペット３５を挿入方向に加振させることによって穿孔するため、第２ピペット３５の先端が単に突き刺しただけでは透明帯１０２、細胞膜１０４及び核膜１１２に刺さらない太さのものであっても穿孔できる。また、透明帯１０２、細胞膜１０４及び核膜１１２を確実に穿孔されたか否かを確認することができる。すなわち、透明帯１０２、細胞膜１０４及び核膜１１２が確実に穿孔された状態で操作実行位置ＩＪまで第２ピペット３５を挿入することができる。したがって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の細胞１００への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に操作することができる。
（第２実施形態）
次に、第２実施形態のマニピュレーションシステム１０の他の駆動方法について説明する。図１０は、第２実施形態のマニピュレーションシステムの動作の一例を示すフローチャート図である。図１１は、細胞膜及び核膜の穿孔動作の一例を示すフローチャート図である。図１２は、第２実施形態のマニピュレーションシステムの動作を説明するための説明図である。第２実施形態のマニピュレーションシステム１０の動作において、第１実施形態のマニピュレーションシステム１０と同一の動作については説明を省略し、異なる動作について説明する。第２実施形態のマニピュレーションシステム１０の動作は、第１実施形態のマニピュレーションシステム１０の動作と比較して、ステップＳＴ５０、ステップＳＴ６０の代わりに、ステップＳＴ７０を含み、ステップＳＴ４０を終了すると、ステップＳＴ７０に移行する。
ステップＳＴ７０において、第２ピペット３５は、細胞膜１０４及び核膜１１２を穿孔する。図１１に示すように、ステップＳＴ７０－２において、制御部４６Ａは、第２ピペット３５の先端を細胞膜接触位置Ｐ２に移動させる。透明帯接触位置Ｐ１と、細胞膜接触位置Ｐ２とは、Ｙ座標が同一なので、第２ピペット３５は、Ｘ軸方向に平行に移動する。第２ピペット３５の先端は、操作実行位置ＩＪに向かって細胞膜１０４に僅かに押し当てられる。細胞膜１０４は、高弾性であるため、第２ピペット３５の先端が押し当てられることによって、穿孔されず、微小に変形する。
次に、ステップＳＴ７０－４において、制御部４６Ａは、第２ピペット３５の先端を核膜接触位置Ｐ３に移動させる。細胞膜接触位置Ｐ２と、核膜接触位置Ｐ３とは、Ｙ座標が同一なので、第２ピペット３５は、Ｘ軸方向に平行に移動する。細胞膜１０４は、高弾性であるため、第２ピペット３５の先端に押し込まれることによって、穿孔されず、変形する。第２ピペット３５の先端は、操作実行位置ＩＪに向かって細胞膜１０４を介して核膜１１２に僅かに押し当てられる。核膜１１２は、高弾性であるため、第２ピペット３５の先端が押し当てられることによって、穿孔されず、微小に変形する。
ステップＳＴ７０－６において、画像処理部４３Ｂは、細胞１００の画像データを取得する。ステップＳＴ７０－８において、位置検出部４３Ｄは、取得した画像データに基づいて、核膜１１２と第２ピペット３５の先端との接触位置を画像処理シーケンスにより検出する。制御部４６Ａは、核膜１１２と第２ピペット３５の先端との接触位置の座標を記憶部４６Ｂに記憶させる。ステップＳＴ７０－８において、核膜１１２と第２ピペット３５の先端との接触位置が検出されなかった場合、画像処理部４３Ｂは、再び核膜１１２と第２ピペット３５の先端との接触位置を画像シーケンスにより再度検出してもよい。
ステップＳＴ７０－１０において、位置検出部４３Ｄは、核膜１１２と第２ピペット３５の先端とが細胞膜１０４を介して接触しているか否かを判断する。ステップＳＴ７０－１０において、核膜１１２と第２ピペット３５の先端とが接触していないと判断された場合（ステップＳＴ７０－１０；Ｎｏ）、ステップＳＴ７０－１２に移行する。ステップＳＴ７０－１０において、核膜１１２と第２ピペット３５の先端とが接触していると判断された場合（ステップＳＴ７０－１０；Ｙｅｓ）、ステップＳＴ７０－１４に移行する。
ステップＳＴ７０－１２において、制御部４６Ａは、第２ピペット３５の先端を、細胞膜１０４を介して核膜１１２に接触するように移動させる。制御部４６Ａは、予め設定された所定のプログラムに従って第２ピペット３５を移動させる。第２ピペット３５を移動させた後、ステップＳＴ７０－６に戻り、画像処理部４３Ｂが細胞１００の画像データを再度取得する。
ステップＳＴ７０－６からステップＳＴ７０－１２は、省略してもよい。すなわち、ステップＳＴ７０－４において、第２ピペット３５の先端が核膜接触位置Ｐ３に移動したことによって、核膜１１２と第２ピペット３５の先端とが接触したと見做してもよい。この場合、ステップＳＴ３０において、核膜接触位置Ｐ３を決定した後、制御部４６Ａは、核膜接触位置Ｐ３を、核膜１１２と第２ピペット３５の先端との接触位置の座標として記憶部４６Ｂに記憶させておく。
ステップＳＴ７０－１４において、制御部４６Ａは、微動機構４４を駆動する。制御部４６Ａは、微動機構４４に第２ピペット３５を加振させる。第２ピペット３５の振動によって、細胞膜１０４及び核膜１１２と第２ピペット３５の先端との接触位置において、細胞膜１０４及び核膜１１２が穿孔される。制御部４６Ａは、予め定められた所定回数又は所定時間、微動機構４４に第２ピペット３５を加振させる。
微動機構４４による第２ピペット３５への加振を終えた後、ステップＳＴ７０－１６において、制御部４６Ａは、第２ピペット３５をＸ軸方向に僅かに前進移動させる。ステップＳＴ７０－１８において、画像処理部４３Ｂは、細胞１００の画像データを取得する。ステップＳＴ７０－２０において、位置検出部４３Ｄは、取得した画像データに基づいて、核膜１１２の穿孔位置を画像処理シーケンスにより検出する。穿孔位置は、核膜１１２の外形と第２ピペット３５とが交差する位置である。制御部４６Ａは、核膜１１２の穿孔位置の座標を記憶部４６Ｂに記憶させる。ステップＳＴ７０－２０において、核膜１１２の穿孔位置が検出されなかった場合、画像処理部４３Ｂは、再び核膜１１２の穿孔位置を画像シーケンスにより再度検出してもよい。
ステップＳＴ７０－２２において、制御部４６Ａは、細胞膜１０４及び核膜１１２の穿孔操作が成功したか否かを判断する。制御部４６Ａは、ステップＳＴ７０－２０において検出した核膜１１２の穿孔位置の座標と第２ピペット３５の先端の座標とを比較する。制御部４６Ａは、第２ピペット３５の先端の座標が穿孔位置の座標より核１１０の内側にない場合、穿孔操作が失敗したと判断し、穿孔操作の失敗情報を記憶部４６Ｂに記憶させる。制御部４６Ａは、第２ピペット３５の先端の座標が穿孔位置の座標より核１１０の内側にある場合、穿孔操作が成功したと判断し、穿孔操作の成功情報を記憶部４６Ｂに記憶させる。ステップＳＴ７０－２２において、細胞膜１０４及び核膜１１２の穿孔操作が失敗したと判断された場合（ステップＳＴ７０－２２；Ｎｏ）、ステップＳＴ７０－１２に移行する。ステップＳＴ７０－２２において、細胞膜１０４及び核膜１１２の穿孔操作が成功したと判断された場合（ステップＳＴ７０－２２；Ｙｅｓ）、ステップＳＴ７０を終了し、ステップＳＴ８０に移行する。
以上説明したように、本実施形態のマニピュレーションシステム１０は、コントローラ４３は、第２ピペット３５の先端によって細胞１００の細胞膜１０４を変形させて細胞１００の核膜１１２に接触させた状態で、微動機構４４に第２ピペット３５を加振させ、且つ、加振後に細胞膜１０４及び核膜１１２が穿孔されたか否かを判定する。このようなマニピュレーションシステム１０によれば、微動機構４４が第２ピペット３５を挿入方向に加振させることによって穿孔するため、第２ピペット３５の先端が単に突き刺しただけでは細胞１００に刺さらない太さのものであっても穿孔できる。また、細胞１００が確実に穿孔された状態で操作実行位置ＩＪまで第２ピペット３５を挿入することができる。また、細胞膜１０４と核膜１１２とを同時に穿孔することができる。したがって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の細胞１００への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に操作することができる。
本実施形態のマニピュレーションシステム１０の駆動方法は、細胞１００が載置される試料ステージ２２と、細胞１００を保持するための第１ピペット２５を備える第１マニピュレータ１４と、第１ピペット２５に保持された細胞１００を操作するための第２ピペット３５を備える第２マニピュレータ１６と、第２ピペット３５を軸方向に移動させるための微動機構４４と、備えるマニピュレーションシステム１０の駆動方法であって、第２ピペット３５の先端を細胞１００の所定の挿入開始位置Ｐ０に移動させるステップＳＴ３２と、第２ピペット３５の先端を、細胞１００の透明帯１０２に押し当てるステップＳＴ４０－２と、微動機構４４によって第２ピペット３５を加振させるステップＳＴ４０－１２と、第２ピペット３５を加振させた後に透明帯１０２が穿孔されたか否かを判定するステップＳＴ４０－２０と、第２ピペット３５の先端を、細胞１００の細胞膜１０４に押し当てるステップＳＴ７０－２と、第２ピペット３５の先端を、挿入方向に移動させることによって変形させた細胞膜１０４を細胞１００の核膜１１２に接触させるステップＳＴ７０－４と、微動機構４４によって第２ピペット３５を加振させるステップＳＴ７０－１４と、第２ピペット３５を加振させた後に細胞膜１０４及び核膜１１２が穿孔されたか否かを判定するステップＳＴ７０－２２と、を含む。
これによれば、微動機構４４が第２ピペット３５を挿入方向に加振させることによって穿孔するため、第２ピペット３５の先端が単に突き刺しただけでは透明帯１０２、細胞膜１０４及び核膜１１２に刺さらない太さのものであっても穿孔できる。また、透明帯１０２、細胞膜１０４及び核膜１１２を確実に穿孔されたか否かを確認することができる。すなわち、透明帯１０２、細胞膜１０４及び核膜１１２が確実に穿孔された状態で操作実行位置ＩＪまで第２ピペット３５を挿入することができる。また、細胞膜１０４と核膜１１２とを同時に穿孔することができる。したがって、操作者の熟練度及び技術によらず、操作時の細胞１００への損傷を抑制しつつ、効率よくかつ好適に操作することができる。
本実施形態のマニピュレーションシステム１０及びマニピュレーションシステム１０の駆動方法は適宜変更してもよい。例えば、第１ピペット２５、第２ピペット３５等の形状等は、微小対象物の種類や、微小対象物に対する操作に応じて適宜変更することが好ましい。微小対象物の保持操作、所定の操作対象位置の検出操作、インジェクション操作、微小対象物の載置操作の各操作において、適宜手順の一部を省略してもよく、また、手順を置換して実行してもよい。
１０ マニピュレーションシステム
１１ 試料保持部材
１２ 顕微鏡ユニット
１４ 第１マニピュレータ
１６ 第２マニピュレータ
１８ カメラ
２０ 顕微鏡
２２ 試料ステージ
２４ 第１ピペット保持部材
２５ 第１ピペット
２６ Ｘ－Ｙ軸テーブル
２８ Ｚ軸テーブル
２９ シリンジポンプ
３０、３２ 駆動装置
３４ 第２ピペット保持部材
３５ 第２ピペット
３６ Ｘ－Ｙ軸テーブル
３８ Ｚ軸テーブル
３９ 注入ポンプ
４０、４２ 駆動装置
４３ コントローラ（制御装置）
４３Ａ 画像入力部
４３Ｂ 画像処理部
４３Ｃ 画像出力部
４３Ｄ 位置検出部
４４、５４ 微動機構
４４ａ 圧電アクチュエータ
４５ 表示部
４６Ａ 制御部
４６Ｂ 記憶部
４７ ジョイスティック
４７Ａ ボタン
４９ 入力部
８０、８２ 転がり軸受
８０ａ、８２ａ 内輪
８０ｂ、８２ｂ 外輪
８０ｃ、８２ｃ ボール
８１ 焦点合わせ機構
８４ 中空部材
８４ａ フランジ部
８６ ロックナット
８７ ハウジング
８８ 蓋
９０ スペーサ
９２ 圧電素子
１００ 細胞
１０２ 透明帯
１０４ 細胞膜
１１０ 核
１１２ 核膜
１１４ 核小体
Ｃ１、Ｃ２ 中心
Ｒ、ｒ 半径
ＩＰ 初期位置
Ｐ０ 挿入開始位置
Ｐ１ 透明帯接触位置
Ｐ２ 細胞膜接触位置
Ｐ３ 核膜接触位置
ＩＪ 操作実行位置
Ｌ０ 初期距離
α オフセット量

Claims (19)

  1. 微小対象物が載置される試料ステージと、
    前記微小対象物を保持するための第１ピペットを備える第１マニピュレータと、
    前記第１ピペットに保持された前記微小対象物を操作するための第２ピペットを備える第２マニピュレータと、
    前記第２ピペットを軸方向に移動させるための微動機構と、
    前記試料ステージ、前記第１ピペット、前記第２ピペット及び前記微動機構を制御するコントローラと、を備え、
    前記コントローラは、
    前記第２ピペットの先端を前記微小対象物の所定の接触位置に押し当てた状態で、前記微動機構に前記第２ピペットを加振させ、加振後に前記第２ピペットを挿入方向に所定距離移動させ、移動後の前記第２ピペットの先端の座標と、前記微小対象物の外形と前記第２ピペットとが交差する穿孔位置の座標と、を比較することによって、前記微小対象物が穿孔されたか否かを判定するマニピュレーションシステム。
  2. 前記微小対象物を撮像する撮像部を備え、
    前記コントローラは、
    前記撮像部の画像データに基づいて前記第２ピペットの先端の座標と前記接触位置の座標とを検出する請求項１に記載のマニピュレーションシステム。
  3. 前記微動機構は、圧電素子を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のマニピュレーションシステム。
  4. 前記微小対象物は、細胞である請求項１から３のいずれか一項に記載のマニピュレーションシステム。
  5. 前記コントローラは、前記第２ピペットの先端を前記細胞の透明帯に押し当てた状態で、前記微動機構に前記第２ピペットを加振させ、且つ、加振後に前記第２ピペットを挿入方向に所定距離移動させ、移動後の前記第２ピペットの先端の座標と、前記透明帯の外形と前記第２ピペットとが交差する穿孔位置の座標と、を比較することによって、前記透明帯が穿孔されたか否かを判定する請求項４に記載のマニピュレーションシステム。
  6. 前記細胞を撮像する撮像部を備え、
    前記コントローラは、前記撮像部の画像データに基づいて前記第２ピペットの先端を前記透明帯に接触させる透明帯接触位置を決定する請求項５に記載のマニピュレーションシステム。
  7. 前記コントローラは、前記第２ピペットの先端を前記細胞の細胞膜に押し当てた状態で、前記微動機構に前記第２ピペットを加振させ、且つ、加振後に前記第２ピペットを挿入方向に所定距離移動させ、移動後の前記第２ピペットの先端の座標と、前記細胞膜の外形と前記第２ピペットとが交差する穿孔位置の座標と、を比較することによって、前記細胞膜が穿孔されたか否かを判定する請求項４から６のいずれか一項に記載のマニピュレーションシステム。
  8. 前記細胞を撮像する撮像部を備え、
    前記コントローラは、前記撮像部の画像データに基づいて前記第２ピペットの先端を前記細胞膜に接触させる細胞膜接触位置を決定する請求項７に記載のマニピュレーションシステム。
  9. 前記コントローラは、前記第２ピペットの先端を前記細胞の核膜に押し当てた状態で、前記微動機構に前記第２ピペットを加振させ、且つ、加振後に前記第２ピペットを挿入方向に所定距離移動させ、移動後の前記第２ピペットの先端の座標と、前記核膜の外形と前記第２ピペットとが交差する穿孔位置の座標と、を比較することによって、前記核膜が穿孔されたか否かを判定する請求項４から８のいずれか一項に記載のマニピュレーションシステム。
  10. 前記コントローラは、前記第２ピペットの先端によって前記細胞の細胞膜を変形させて前記細胞の核膜に接触させた状態で、前記微動機構に前記第２ピペットを加振させ、且つ、加振後に前記第２ピペットを挿入方向に所定距離移動させ、移動後の前記第２ピペットの先端の座標と、前記核膜の外形と前記第２ピペットとが交差する穿孔位置の座標と、を比較することによって、前記細胞膜及び前記核膜が穿孔されたか否かを判定する請求項４から６のいずれか一項に記載のマニピュレーションシステム。
  11. 前記細胞を撮像する撮像部を備え、
    前記コントローラは、前記撮像部の画像データに基づいて前記第２ピペットの先端を前記核膜に接触させる核膜接触位置を決定する請求項９又は１０に記載のマニピュレーションシステム。
  12. 前記細胞を撮像する撮像部を備え、
    前記コントローラは、前記撮像部の画像データに基づいて前記細胞の核小体の位置を検出する請求項４から１１のいずれか一項に記載のマニピュレーションシステム。
  13. 前記コントローラは、前記核小体の位置に基づいて所定の操作実行位置を決定する請求項１２に記載のマニピュレーションシステム。
  14. 前記操作実行位置は、前記核小体の外側である請求項１３に記載のマニピュレーションシステム。
  15. 前記操作実行位置は、前記核小体の中心からオフセットされた位置である請求項１３又は１４に記載のマニピュレーションシステム。
  16. 前記核小体の中心と前記操作実行位置との前記第２ピペットの挿入方向に直交する交差方向の距離は、前記核小体の半径より大きい請求項１３から１５のいずれか一項に記載のマニピュレーションシステム。
  17. 前記コントローラは、前記撮像部の画像データ及び前記操作実行位置に基づいて所定の挿入開始位置を決定する請求項１３から１６のいずれか一項に記載のマニピュレーションシステム。
  18. 細胞が載置される試料ステージと、
    前記細胞を保持するための第１ピペットを備える第１マニピュレータと、
    前記第１ピペットに保持された前記細胞を操作するための第２ピペットを備える第２マニピュレータと、
    前記第２ピペットを軸方向に移動させるための微動機構と、
    を備えるマニピュレーションシステムの駆動方法であって、
    前記第２ピペットの先端を前記細胞の所定の挿入開始位置に移動させるステップと、
    前記第２ピペットの先端を、前記細胞の透明帯に押し当てるステップと、
    前記微動機構によって前記第２ピペットを加振させるステップと、
    前記第２ピペットを加振させた後に前記第２ピペットを挿入方向に所定距離移動させるステップと、
    前記第２ピペットの先端の座標と、前記透明帯の外形と前記第２ピペットとが交差する穿孔位置の座標と、を比較することによって、前記透明帯が穿孔されたか否かを判定するステップと、
    前記第２ピペットの先端を、前記細胞の細胞膜に押し当てるステップと、
    前記微動機構によって前記第２ピペットを加振させるステップと、
    前記第２ピペットを加振させた後に前記第２ピペットを挿入方向に所定距離移動させるステップと、
    前記第２ピペットの先端の座標と、前記細胞膜の外形と前記第２ピペットとが交差する穿孔位置の座標と、を比較することによって、前記細胞膜が穿孔されたか否かを判定するステップと、
    前記第２ピペットの先端を、前記細胞の核膜に押し当てるステップと、
    前記微動機構によって前記第２ピペットを加振させるステップと、
    前記第２ピペットを加振させた後に前記第２ピペットを挿入方向に所定距離移動させるステップと、
    前記第２ピペットの先端の座標と、前記核膜の外形と前記第２ピペットとが交差する穿孔位置の座標と、を比較することによって、前記核膜が穿孔されたか否かを判定するステップと、を含むマニピュレーションシステムの駆動方法。
  19. 細胞が載置される試料ステージと、
    前記細胞を保持するための第１ピペットを備える第１マニピュレータと、
    前記第１ピペットに保持された前記細胞を操作するための第２ピペットを備える第２マニピュレータと、
    前記第２ピペットを軸方向に移動させるための微動機構と、
    を備えるマニピュレーションシステムの駆動方法であって、
    前記第２ピペットの先端を前記細胞の所定の挿入開始位置に移動させるステップと、
    前記第２ピペットの先端を、前記細胞の透明帯に押し当てるステップと、
    前記微動機構によって前記第２ピペットを加振させるステップと、
    前記第２ピペットを加振させた後に前記第２ピペットを挿入方向に所定距離移動させるステップと、
    前記第２ピペットの先端の座標と、前記透明帯の外形と前記第２ピペットとが交差する穿孔位置の座標と、を比較することによって、前記透明帯が穿孔されたか否かを判定するステップと、
    前記第２ピペットの先端を、前記細胞の細胞膜に押し当てるステップと、
    前記第２ピペットの先端を、挿入方向に移動させることによって変形させた前記細胞膜を前記細胞の核膜に接触させるステップと、
    前記微動機構によって前記第２ピペットを加振させるステップと、
    前記第２ピペットを加振させた後に前記第２ピペットを挿入方向に所定距離移動させるステップと、
    前記第２ピペットの先端の座標と、前記核膜の外形と前記第２ピペットとが交差する穿孔位置の座標と、を比較することによって、前記細胞膜及び前記核膜が穿孔されたか否かを判定するステップと、を含むマニピュレーションシステムの駆動方法。
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