JP6953511B2 - 生物学的材料を処理するためのバイオリアクター及び方法 - Google Patents

生物学的材料を処理するためのバイオリアクター及び方法 Download PDF

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Description

この発明は、バイオリアクターにおける又はバイオリアクターに関する改良、及び改良されたバイオリアクターを使用して生物学的材料を処理するための方法に関する。
組織を、その後患者へ移植するために、バイオリアクターを使用してインビトロで処理することが知られている。例えば、気管、血管、食道若しくは腸などの管状組織又はこのような組織の少なくとも一部を形成するために、一般にバイオリアクターが使用されている。このような構造体は、典型的には、足場から形成され、この足場は人工足場であってもよいが、一般には脱細胞化された等価組織型の形態である。バイオリアクターは、形成された足場の１又はそれ以上の表面上又はその中に、１又はそれ以上の細胞型を播種し増殖させるために使用される。このことは、典型的には足場に液体生物学的媒体を注ぐことによって、一般的には、足場を媒体に浸すことによって、達成される。
公知のバイオリアクターは、典型的には、ハウジング内に中心軸を有し、その上に管状の足場を取り付けることができる。次いで、バイオリアクターのハウジング内に液体培地を導入し、この液体培地内に足場の少なくとも一部を沈める。管状足場全体が液体培地内に確実に浸されるようにするために、この足場は典型的にはこの中心軸の周りを回転する。例示的な装置は、米国特許第8,507,263号に示されている。この文献に例示されているバイオリアクターは、中心軸を画定する中央シャフトを含み、足場を沈めるために、このシャフトは更に液体培地をハウジングの内部に供給するように動作可能である。
しかし、この種のバイオリアクターは多くの欠点を抱えている。足場を液体培地に浸すことによって、足場の表面上の細胞型の分化を防ぐことができる。例えば、ある場合には、管状足場の内面上に成長した細胞型が、同じ足場の外面上に成長したものとは異なる種類であることが必要である。このことは、足場の内部が外面と同じ媒体であふれているため、足場を浸す既知のバイオリアクターでは容易に達成することができない。これに対し、米国特許第8,507,263号は、内側チャンバと外側チャンバを画定するために足場を使用して、これら２つのチャンバに異なる流体を供給することによって対処しようとしている。しかし、一般に足場の内部空間が足場の外側と流体連通するために足場は多孔質であって、そのため、このような場合に２つの異なる流体タイプが必然的に混合することになる。
液浸漬型のバイオリアクターの別の欠点は、液体培地が一旦バイオリアクターハウジングに導入されると、それを再度酸素で処理することができず、及び／又はそれをリサイクル及び／又は再度酸素で処理する前にかなりの期間バイオリアクター内に保持されてしまうことである。培地中に含まれる細胞にとって、長期間再度酸素の処理無しでいることは、有害であり得る。
従って、足場（又は足場の少なくとも一部）を１つの又は複数の媒体内に沈めること無しに、１つの又は複数の媒体を足場の１又はそれ以上の表面に注ぐバイオリアクターを提供することは有利であろう。
また、播種し成長させるプロセス中に、１つの又は複数の液体培地を再度酸素で処理することができるバイオリアクターを提供することも有利であろう。
また、その中で、組織足場の内側表面及び外側表面に異なる細胞型を播種することができ、これら異なる細胞型の分離を実質的に保持することができる、バイオリアクターを提供することも有利であろう。
従って、本発明の１又は複数の実施態様の目的は、従来技術に関連するこのような問題を克服するか又は少なくとも部分的に軽減することである。
本発明の第１の態様によれば、ハウジング、第１の流体ディスペンサー及び第２の流体ディスペンサーを含むバイオリアクターであって、該バイオリアクターは、取り付けられた足場をハウジング内に受け入れるように構成され、第１及び第２の流体ディスペンサーは、第１及び第２の流体を、それぞれ取り付けられた足場の少なくとも２つの異なる領域に注ぐように配置される、バイオリアクターが提供される。
このバイオリアクターは、このハウジング内から流体を除去するための流体出口を含んでもよい。
ハウジング内から流体を除去するための出口を設けることによって、取り付けられた足場が、その表面に供給される流体内に沈められる、又は少なくとも部分的に沈められるのを防ぐ。取り付けられた足場が流体であふれることは、足場上で細胞が分化することを妨げる。本発明のバイオリアクターの流体出口は、使用中に流体がハウジング内に集まり、取り付けられた足場に流体があふれるのを防ぐ。
２つの異なる流体ディスペンサーを提供することによって、１つの足場の異なる表面又は領域に、特に足場の内側表面及び外側表面に、異なる媒体を提供することが可能である。これにより、各領域において異なる増殖及び／又は最適な増殖条件を可能にするために、異なる領域に、異なる細胞型、増殖因子及びその他の成分を注ぐことが可能になる。
この第１及び第２の流体ディスペンサーは、取り付けられた足場の同じ表面の異なる部分に流体を注ぐように配置されてもよい。他の実施態様では、この第１及び第２の流体ディスペンサーは、取り付けられた足場の異なる表面に流体を注ぐように配置されてもよい。
この第１及び第２の流体ディスペンサーは、そこから流体が分配される１又はそれ以上の流体開口部を含んでもよい。この第１及び第２の流体ディスペンサーは、第１及び第２のシャフト又は導管を含んでもよい。
いくつかの実施態様において、この第１の流体ディスペンサーは、第１の流体を取り付けられた足場の内面に注ぐように配置されていてもよい。いくつかの実施態様において、この第２の流体ディスペンサーは、第２の流体を取り付けられた足場の外面に注ぐように配置されていてもよい。現在好ましい実施態様において、この第１の流体ディスペンサーは、第１の流体を取り付けられた足場の内面に注ぐように配置され、かつこの第２の流体ディスペンサーは、第２の流体を取り付けられた足場の外面に注ぐように配置される。
本発明のバイオリアクターは、取り付けられた足場の内面に第１の流体を注ぐための第１の流体ディスペンサーと、取り付けられた足場の外面に第２の流体を注ぐための第２の流体ディスペンサーとを提供することによって、各面に注ぐ液体を独立に選択する手段を提供する。例えば、多くの場合、足場の内側表面と外側表面上で増殖させる細胞型が異なることが望ましいことがある。
いくつかの実施態様において、このバイオリアクターは、流体出口を通して除去された流体をリサイクルするように動作可能であってもよい。例えば、いくつかの実施態様において、このバイオリアクターは、取り付けられた足場の１又はそれ以上の領域又は表面に流体を再度注ぐために、除去された流体を第１及び／又は第２の流体ディスペンサーに向けるための１又はそれ以上のパイプラインを有してもよい。バイオリアクターから除去された流体をリサイクルすることは、無駄を減らし、その結果バイオリアクターの効率を改善する。
いくつかの実施態様において、このバイオリアクターは、１又はそれ以上の酸素供給装置を有してもよく、又はこのバイオリアクターをそれに接続するための手段を有してもよい。この酸素供給装置又は各酸素供給装置は、使用時に、第１の流体ディスペンサー及び第２の流体ディスペンサーを通して、取り付けられた足場のある領域表面に注がれる前に、第１及び／又は第２の流体に酸素供給するために動作可能であってもよい。いくつかの実施態様において、このバイオリアクターは、使用時に流体出口を通して除去された流体を再度酸素で処理するために動作可能な１又はそれ以上の酸素供給装置を含んでもよく、又はこのバイオリアクターをそれに接続する手段を含んでもよい。このような実施態様において、このバイオリアクターは、流体出口と第１及び／又は第２の流体ディスペンサーとの間の１又はそれ以上のパイプラインのうちの少なくとも１つのパイプライン内に、１又はそれ以上の酸素供給装置を有してもよく、又はバイオリアクターをそれに接続するための手段を含んでもよい。
いくつかの実施態様において、このバイオリアクターは、その中に第１の流体が収容されている第１のリザーバーを含んでもよく、又はバイオリアクターをそれに接続するための手段を含んでもよい。このような実施態様において、このバイオリアクターは、第１の流体を第１のリザーバーから第１の流体ディスペンサーへ供給するために、１又はそれ以上のパイプラインを含んでもよく、又はこのバイオリアクターをそれに接続するための手段を含んでもよい。このバイオリアクターは、更に、加圧下で第１の流体を第１の流体ディスペンサーに供給するための第１のポンプを含んでもよく、又はこのバイオリアクターをそれに接続するための手段を含んでもよい。
いくつかの実施態様において、このバイオリアクターは、その中に第２の流体が収容されている第２のリザーバーを含んでもよく、又はバイオリアクターをそれに接続するための手段を含んでもよい。このような実施態様において、このバイオリアクターは、第２の流体を第２のリザーバーから第２の流体ディスペンサーへ供給するために１又はそれ以上のパイプラインを含んでもよく、又はこのバイオリアクターをそれに接続するための手段を含んでもよい。その代替として、このバイオリアクターは、第２の流体が流体出口から第２の流体ディスペンサーへ供給されるようにのみ構成されてもよい。このような実施態様において、このバイオリアクターは、使用時に、流体出口を通して除去された流体を再酸素化して第２の流体を形成するように動作可能な、流体出口と作動可能な第２の流体ディスペンサーとの間に１又はそれ以上の酸素供給装置を含んでもよく、又はこのバイオリアクターをそれに接続するための手段を含んでもよい。このバイオリアクターは更に、加圧下で第２の流体を、第２のリザーバー又は流体出口から、第２の流体ディスペンサーへ供給するための第２のポンプを含んでもよく、又はこのバイオリアクターをそれに接続するための手段を含んでもよい。
更なる実施態様において、第１の流体と第２の流体は同じであってもよい。このような実施態様において、バイオリアクターは、単一のリザーバーを含んでもよく、又はこのバイオリアクターをそれに接続するための手段を含んでもよい。バイオリアクターは、この単一のリザーバーから第１の流体ディスペンサーに流体を供給するための１又はそれ以上のパイプラインを含んでもよく、又はこのバイオリアクターをそれに接続するための手段を含んでもよく、かつバイオリアクターは、この単一リザーバーから第２の流体ディスペンサーに流体を供給するための１又はそれ以上のパイプラインを含んでもよく、又はこのバイオリアクターをそれに接続するための手段を含んでもよい。
第１及び／又は第２の流体ディスペンサーは、その中に１又はそれ以上の穴を有する貫通穴があけられたシャフト又は導管を含んでもよい。この１又はそれ以上の穴は、使用時に第１又は第２の流体を供給することができる、シャフト又は導管を貫通する穴と流体連通することが好ましい。この第１及び／又は第２のシャフト又は導管は、シャフト又は導管内の前記１又はそれ以上の穴を通して、取り付けられた足場の１又はそれ以上の領域又は表面に第１又は第２の流体を注ぐように動作可能であってもよい。
このバイオリアクターは、使用時に、その上に足場を取り付けることができる支持構造体を含んでもよい。この支持構造体は、少なくとも部分的にバイオリアクターのハウジング内に設けられることが好ましい。この支持構造体は、その上に足場を回転可能に取り付けることができるように構成されてもよい。いくつかの実施態様において、使用時に、この支持構造体は、この支持構造体の回転が同時に取り付けられた足場の回転を引き起こすように、それ自体が回転可能であってもよい。
好ましい実施態様において、このバイオリアクターは、管状足場を受け入れるように構成され、この管状足場は、取り付けられたときに、管状足場の中央を通る軸の周りを回転可能である。このような実施態様において、バイオリアクターの第１の流体ディスペンサー（これは第１のシャフト又は導管であってもよい）は、取り付けられた足場の回転軸と平行に提供されてもよい。好ましい実施態様において、バイオリアクターの第１の流体ディスペンサー（これは第１のシャフト又は導管であってもよい）は、取り付けられた足場の回転軸に沿って提供される。このような実施態様において、足場は、バイオリアクター内に取り付けられると、第１の流体ディスペンサーと同軸であり、それを取り囲む。このようにして、このバイオリアクターは、取り付けられた足場の内面に第１の流体を注ぐための手段を提供する。使用時に、管状足場を中心軸の周りに３６０°に渡って完全に回転させることによって、この管状足場の内面全体を、第１の流体ディスペンサーからの第１の流体でコーティングすることができる。
いくつかの実施態様において、第１の流体ディスペンサーは支持構造体の一部を形成してもよく、この支持構造体は第１の流体ディスペンサーを含んでもよく、この第１の流体ディスペンサーは第１のシャフト又は導管であってもよい。このような実施態様において、この支持構造体、従って取り付けられた足場に沿った第１の流体ディスペンサーは、使用時に中心軸の周りに回転可能であってもよい。好ましくは、この中心軸は第１の流体ディスペンサーによって規定される。
この足場、中心軸及び／又は第１の流体ディスペンサーは、例えば、１分あたり１回転、２分あたり１回転、２．５分あたり１回転、又は５分あたり1回転のように、３０秒あたり１回転から３０分あたり１回転の間で回転するように構成されてもよい。
ハウジングの内部、第１及び第２の流体ディスペンサー、管状足場ならびに第１及び第２の流体は、すべて独立して、２０℃から４５℃の間、特に、例えば、３７℃前後のように３０℃から４０℃の間の温度に維持されていてもよい。
ハウジング内の雰囲気は、例えば、使用されている生物学的材料に応じて、通常又は低酸素雰囲気を維持するために、必要に応じて、ＣＯ２、酸素及び窒素のレベルを変えるように制御されていてもよい。
第２の流体ディスペンサーは、第１の流体ディスペンサーから空間的に離れていてもよく、バイオリアクターのハウジング内に取り付けられたときに、足場の位置の真上に配置されてもよい。この方法において、重力の下で、第２の流体は取り付けられた足場の外面に注がれてもよい。例えば、第２の流体は、使用時に、第２の流体ディスペンサー内の１又はそれ以上の穴を通して、取り付けられた足場の外面上に滴下され又は噴霧されてもよい。管状足場をバイオリアクターのハウジング内に回転可能に取り付けされている実施態様において、第２の流体ディスペンサーは、使用時に、足場を中心軸の周りに３６０°に渡って回転させることによって、取り付けられた足場の外面全体をコーティングするように動作可能であってもよい。
バイオリアクターのハウジングは、対向する両端面を有する細長いプリズムの形態であってもよい。バイオリアクターのハウジングは、好ましくは、円筒形であり、円形の対向する両端面を有する。このハウジングは、その中に第１及び第２の流体ディスペンサーが少なくとも部分的に配置されているキャビティを含む。このキャビティは任意の形状から成ってもよいが、好ましくは、ハウジング自体に対して相補的である。例えば、いくつかの実施態様において、ハウジングは、その中に円筒形のキャビティを有する円筒形の形状から成る。
第１及び／又は第２の流体ディスペンサーは、ハウジング内の開口部を通るように設けられ、及び/又はそれを通って延びてもよい。この方法において、バイオリアクターは、第１及び／又は第２の流体ディスペンサーが少なくとも部分的にハウジング内に位置するように構成される。あるいは、第１及び／又は第２の流体ディスペンサーは、ハウジング内の開口部において、そこへ流体を供給するために１又はそれ以上のパイプラインに接続されてもよい。このような実施態様において、第１及び／又は第２の流体ディスペンサーは、完全にハウジング内に配置され、ハウジング内の開口部において流体源に接続可能であってもよい。バイオリアクターは、ハウジングの内部からの液体又は流体の望ましくない漏れを防ぐために開口部の周りに液漏れのないこと、好ましくは液漏れのないようなシールを確実にするために、開口部の周りに１又はそれ以上のＯリングシールを備えてもよい。好ましい実施態様において、第１及び／又は第２の流体ディスペンサーは、ハウジングの少なくとも１つの端面内の開口部において、それに流体を供給するために、１又はそれ以上のパイプラインを通して設けられ又はそれに接続される。いくつかの実施態様において、第１の流体ディスペンサーは、ハウジングの第１の端面の第１の開口部において、それに流体を供給するために、１又はそれ以上のパイプラインを通して設けられ又はそれに接続される。追加的又は代替的に、第２の流体ディスペンサーは、ハウジングの第２の端面の第２の開口部において、それに流体を供給するために１又はそれ以上のパイプラインを通して設けられ又はそれに接続される。
本発明の第２の態様によれば、ハウジング、第１のシャフト、及び該第１のシャフトの上方に配置された第２のシャフトを含むバイオリアクターであって、該バイオリアクターは、ハウジング内に第１のシャフトと同軸で回転可能に取り付けられた足場を受け入れるように構成され、該第１のシャフトは、取り付けられた足場の内面上の第１の領域に第１の流体を注ぐように配置され、かつ該第２のシャフトは、取り付けられた足場の外面上の第２の領域に第２の流体を注ぐように配置され、該バイオリアクターは更にハウジング内から流体を除去するための流体出口を含む、バイオリアクターが提供される。
本発明の第２の態様のバイオリアクターは、望まれるように又は適切であるように、本発明の第１の態様に従ったバイオリアクターの特徴のいずれか又は全てを含んでもよい。
本発明の第３の態様によれば、ハウジング内に取り付けられた足場を含む、本発明の第１又は第２の態様のバイオリアクターが提供される。
この足場は管状の足場であってもよい。
いくつかの実施態様において、組織は組織足場を含み、この組織足場は少なくとも生物学的組織の一部又はある臓器の一部を含んでもよい。この生物学的組織／臓器切片は脱細胞化されていてもよい。他の実施態様において、この足場は、その上で及び／又はその中で細胞又は組織の成長を可能にするように適合した、及び/又は生物学的組織を模倣するように適合した、合成足場を含んでもよい。
適切な組織又は器官切片は、間質組織、結合組織又は支持組織から選択されてもよく、これらは軟骨組織、線維軟骨組織又は石灰化軟骨組織であってもよく、これらは、例えば、腸、気管、食道、血管、胃、尿道、膀胱、肺、肝臓、脾臓、腎臓、喉頭、滑膜、腱、骨−腱、例えば、骨靭帯又は靭帯であってもよい。あるいは、組織は真皮組織であってもよい。
細胞材料を組織から実質的に除去して組織足場を形成するために、組織足場は、任意の適切な方法に従って脱細胞化された任意の適切な組織を含んでもよい。この脱細胞化は、例えば、国際公開WO2014/202958公報に記載の方法を用いて実施することができる。
あるいは、脱細胞化は、生物学的組織を浸透圧ショックに供することを含む脱細胞化プロセスに供することによって達成されてもよい。この脱細胞化プロセスは、細胞溶解を促進するために、組織を低張液及び高張液に順次（任意の順序で）接触させる段階を含んでもよい。
生物学的組織を低張液及び高張液に浸漬してもよい。生物学的組織の低張液及び高張液による接触又は浸漬は、少なくとも１回、好ましくは少なくとも２回、３回又は４回繰り返されてもよい。この高張液は塩化ナトリウムを含んでもよい。この高張液は、更にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び／又はTris−ＨＣｌを含んでもよい。この高張液は、約１ＭのＮａＣｌなどの、０．５Ｍ〜２ＭのＮａＣｌを含んでもよい。このＥＤＴＡは、２０ｍＭから５０ｍＭの間又は約２５ｍＭのような、１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度で存在してもよい。このTris−ＨＣｌは、例えば２５ｍＭ〜７５ｍＭの間、又は約５０ｍＭのような、２０ｍＭ〜１００ｍＭの間の濃度で存在してもよい。この高張液は、１Ｍ塩化ナトリウム、及び必要に応じて２５ｍＭ ＥＤＴＡ及び５０ｍＭ Tris−ＨＣｌを含んでもよい。また。低張液は、高張液について上記に記載したような濃度で存在し得るＥＤＴＡ及び／又はTris−ＨＣｌを含んでもよい。
組織を浸透圧ショックに供する段階を含む脱細胞化プロセスは、また、組織を１又はそれ以上のヌクレアーゼと接触させる段階を含んでもよい。このヌクレアーゼは、組織を低張液及び高張液と接触させた後に、組織と接触させてもよい。このヌクレアーゼは、DNase、RNase、又はDNaseとRNaseとの組み合わせであってもよい。この脱細胞化プロセスは、また、各工程の後に、組織を洗浄する段階を含んでもよく、この洗浄段階はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)などの生理食塩水中で行うことが好ましい。
本発明の第４の態様によれば、生物学的材料を処理する方法であって、（ａ）バイオリアクターのハウジング内に足場を取り付ける段階、（ｂ）第１の流体ディスペンサーから、第１の流体を、該取り付けられた足場の第１の領域上に注ぐ段階、及び（ｃ）第２の流体ディスペンサーから、第２の流体を、該取り付けられた足場の第２の領域上に注ぐ段階、から成り、該第１の流体、該第２の流体及び該足場のうち少なくとも一つが生物学的材料を含む、方法が提供される。
本発明の第５の態様によれば、本発明の第１の態様によるバイオリアクターを使用して、生物学的材料を処理する方法であって、（ａ）該バイオリアクターのハウジング内に足場を取り付ける段階、（ｂ）該バイオリアクターの第１の流体ディスペンサーから、第１の流体を、該取り付けられた足場の第１の領域上に注ぐ段階、及び（ｃ）該バイオリアクターの第２の流体ディスペンサーから、第２の流体を、該取り付けられた足場の第２の領域上に注ぐ段階、から成り、該第１の流体、該第２の流体及び該足場のうち少なくとも一つが生物学的材料を含む、方法が提供される。
本発明の第４又は第５の態様のいくつかの実施態様において、少なくとも足場は生物学的材料を含み、好ましい実施態様において、少なくとも足場ならびに第１及び第２の流体の一方又は両方は生物学的材料を含む。
本発明の第４又は第５の態様の方法は、足場上で生物学的組織を成長させる段階を含んでもよく、この段階は細胞及び／又は組織の成長材料を足場に注ぐ段階を含んでもよい。この細胞及び／又は組織の成長材料は、第１及び／又は第２の流体内に存在してもよい。
本発明の第４又は第５の態様の方法において、第１及び第２の領域は足場の同じ表面上に位置してもよいが、好ましい実施態様においては、第１及び第２の領域は足場の異なる表面上に配置される。第１の領域又は第２の領域の内の一方は、好ましくは足場の内面であり、その他方は、好ましくは足場の外面である。
本発明の第４又は第５の態様の方法は、生物学的組織足場を含む生物学的材料を処理する段階を含んでもよく、この段階は任意の形態を取り得る。この方法は、管状足場上で生物学的材料を処理する段階を含むことが好ましい。
いくつかの実施態様において、本発明の第４又は第５の態様の方法は、反応器のハウジング内に足場を取り付ける前に、足場を形成する段階を含んでもよい。このような実施態様において、この方法は、例えば、生物学的組織の切片又は臓器の切片から足場を形成する段階を含んでもよい。この方法は、更に、組織／臓器を脱細胞化する工程を含んでもよい。
適切な組織又は器官切片は、間質組織、結合組織又は支持組織から選択されてもよく、これらは軟骨組織、線維軟骨組織又は石灰化軟骨組織であってもよく、これらは、例えば、腸、気管、食道、血管、胃、尿道、膀胱、肺、肝臓、脾臓、腎臓、喉頭、滑膜、腱、骨−腱、例えば、骨靭帯又は靭帯であってもよい。あるいは、組織は真皮組織であってもよい。
細胞材料を組織から実質的に除去して組織足場を形成するために、組織足場は、任意の適切な方法に従って脱細胞化された任意の適切な組織を含んでもよい。この脱細胞化は、例えば、国際公開WO2014/202958公報に記載の方法を用いて実施することができる。
あるいは、脱細胞化は、生物学的組織を浸透圧ショックに供することを含む脱細胞化プロセスに供することによって達成されてもよい。この脱細胞化プロセスは、細胞溶解を促進するために、組織を低張液及び高張液に順次（任意の順序で）接触させる段階を含んでもよい。
生物学的組織を低張液及び高張液に浸漬してもよい。生物学的組織の低張液及び高張液による接触又は浸漬は、少なくとも１回、好ましくは少なくとも２回、３回又は４回繰り返されてもよい。この高張液は塩化ナトリウムを含んでもよい。この高張液は、更にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び／又はTris−ＨＣｌを含んでもよい。この高張液は、約１ＭのＮａＣｌなどの、０．５Ｍ〜２ＭのＮａＣｌを含んでもよい。このＥＤＴＡは、２０ｍＭから５０ｍＭの間又は約２５ｍＭのような、１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度で存在してもよい。このTris−ＨＣｌは、例えば２５ｍＭ〜７５ｍＭの間、又は約５０ｍＭのような、２０ｍＭ〜１００ｍＭの間の濃度で存在してもよい。この高張液は、１Ｍ塩化ナトリウム、及び必要に応じて２５ｍＭ ＥＤＴＡ及び５０ｍＭ Tris−ＨＣｌを含んでもよい。また。低張液は、高張液について上記に記載したような濃度で存在し得るＥＤＴＡ及び／又はTris−ＨＣｌを含んでもよい。
組織を浸透圧ショックに供する段階を含む脱細胞化プロセスは、また、組織を１又はそれ以上のヌクレアーゼと接触させる段階を含んでもよい。このヌクレアーゼは、組織を低張液及び高張液と接触させた後に、組織と接触させてもよい。このヌクレアーゼは、DNase、RNase、又はDNaseとRNaseとの組み合わせであってもよい。この脱細胞化プロセスは、また、各工程の後に、組織を洗浄する段階を含んでもよく、この洗浄段階はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)などの生理食塩水中で行うことが好ましい。
いくつかの実施態様において、本発明の第４又は第５の態様の方法は、第１及び／又は第２の流体がその表面又はその領域に注がれている間に、取り付けられた足場を回転させる段階を含んでもよい。この取り付けられた足場を、足場の中心を通る軸を中心に回転させてもよい。この方法が管状足場上で生物学的材料を処理又は成長させる段階を含む実施態様において、足場がその周りで回転する軸は、管状構造の長さに沿った軸から成ってもよい。第１又は第２の流体ディスペンサーの一方は、取り付けられた足場内に配置されてもよく、その他方は、取り付けられた足場の外側に配置されてもよい。
いくつかの実施態様において、本発明の第４又は第５の態様の方法は、バイオリアクターのハウジング内から流体を除去する段階を含んでもよい。このような実施態様において、流体は流体出口を通して除去されてもよい。この方法は、ハウジング内から流体を周期的に除去するために、流体出口を断続的に開く段階を含んでもよい。あるいは、本発明の第４又は第５の態様の方法は、バイオリアクターのハウジング内から流体が絶えず排出されるように、流体出口を常に開いたままにする段階を含んでもよい。
本発明の第４又は第５の態様の方法は、バイオリアクターのハウジングから排出された流体をリサイクルする段階を含んでもよい。例えば、いくつかの実施態様において、除去された流体を、取り付けられた足場の表面又は領に注ぐために、バイオリアクターの第１及び／又は第２の流体ディスペンサーへ向けてもよい。この方法は、除去された流体が、流体出口を通して除去された後であって、第１及び／又は第２の流体ディスペンサーに向けられる前に、更に、この除去された流体を再度酸素で処理する段階を含んでもよい。このような実施態様において、この方法は、ハウジングから除去された流体が第１及び／又は第２の流体ディスペンサーに向けられる前に、それを酸素供給装置に向ける段階を含んでもよい。
この足場、中心軸及び／又は第１の流体ディスペンサーは、例えば、１分あたり１回転、２分あたり１回転、２．５分あたり１回転、又は５分あたり1回転のように、３０秒あたり１回転から３０分あたり１回転の間で回転するように構成されてもよい。
ハウジングの内部、第１及び第２の流体ディスペンサー、管状足場ならびに第１及び第２の流体は、すべて独立して、２０℃から４５℃の間、特に、例えば、３７℃前後のように３０℃から４０℃の間の温度に維持されていてもよい。
ハウジング内の雰囲気は、例えば、使用されている生物学的材料に応じて、通常又は低酸素雰囲気を維持するために、必要に応じて、ＣＯ２、酸素及び窒素のレベルを変えるように制御されていてもよい。
第１及び／又は第２の流体は、細胞を含んでもよく、この細胞は、例えば、幹細胞、上皮細胞などから選択されてもよい。第１及び第２の流体ディスペンサーから分配される流体は複数の細胞増殖培地を含んでもよい。この複数の細胞増殖培地は、独立して、当該分野で知られているような、増殖因子や細胞増殖材料を含んでもよい。この細胞増殖培地は、一般に、培地中に分配される如何なる細胞にも適合するように選択される。例えば、気管支細胞が分配されて、第１の流体ディスペンサーが気管支上皮細胞を分配する場合、第１の流体ディスペンサーから分配される流体は、Lonzaによって供給される気管支上皮細胞増殖培地を含んでもよく、第２の流体ディスペンサーが骨髄間葉系幹細胞（BM−MSC）を分配する場合、この第２の流体ディスペンサーから分配される流体は、例えば、Dulbeccoの改良イーグル培地を含んでもよい。
第１及び第２の流体ディスペンサーは、流体を同じ速度で、又は、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは100％までの異なる速度で分配してもよい。第１及び第２の流体ディスペンサーは、０．１ｍｌ／分〜１０００ｍｌ／分の間の速度で流体を分配してもよく、例えば、１ｍｌ／分〜１００ｍｌ／分、又は５ｍｌ／分〜２５ｍｌ／分の間の速度で流体を分配してもよい。
この方法は、段階ｂ）及びｃ）において、最初に足場に細胞を含まない第１及び第２の流体を注ぐ段階（例えば、３０秒、６０秒、１２０秒、５分、１０分、又は３０分までの間）、それに続いて、細胞を含む第１及び／又は第２の流体をこれに注ぐ段階を含んでもよい。細胞を含む流体と細胞を含まない流体とを使用する場合、これらの段階ｂ）及びｃ）を通して、足場を回転してもよい。
本発明をより明確に理解することができるように、その実施態様を、添付の図面を参照しながら、例示のみを目的として説明する。
本発明によるバイオリアクターの一部の側面断面図である。 図１に示すバイオリアクターの一部の更なる側面断面図である。 本発明によるバイオリアクターのある実施態様を含む動作設定の概略図である。 本発明によるバイオリアクターのある実施態様を含む更なる動作設定の概略図である。
図１及び図２は、本発明によるバイオリアクター１０の例示的実施態様を示す。このバイオリアクター１０は、その中に円筒形のキャビティ１４を有し、実質的に円筒形であるハウジング１２を含む。このキャビティ１４内には、第１のシャフト１６の形態の第１の流体ディスペンサー、及びシャフト１８の形態の第２の流体ディスペンサーが配置されている。この第１のシャフト１６は、ハウジング１２のキャビティ１４内のほぼ中央に配置されており、一方、第２のシャフト１８は、ハウジング１２の上端の近くに配置されている（図に示されている向きで）。以下で説明するように、これらのシャフト１６、１８は、使用時に、キャビティ１４内に取り付けられた足場３８の表面上に流体を注ぐように動作可能である。このバイオリアクター１０は、更に、使用時にハウジング１２のキャビティ１４内から流体を除去するために使用されてもよい流体出口２０を含み、それは以下で詳細に説明される。
バイオリアクター１０は、また、円筒形ブロック２２の形態の支持構造体を含む。これらの円筒形ブロック２２は、第１のシャフト１６に取り付けられ、第１のシャフト１６の長さに沿ってその両端方向に離れて配置される。図に示す実施態様において、これらのブロック２２は、足場３８（具体的には、特に実質的に円筒形の管状足場である）をハウジング１２のキャビティ１４内に取り付けるために使用される。好ましくは、これらのブロック２２は、第１のシャフト１６の長さによって画定される軸を中心に回転可能である。このようにして、これらブロック２２に取り付けられた場合、管状足場３８もまたこの軸の周りに回転可能であってもよい。ハウジング１２のキャビティ１４内に取り付けられた場合の、管状足場３８の位置を図２に示す。
この管状足場３８は、生物学的組織足場であり、実質的に全ての細胞材料を除去するために脱細胞化されている。生物学的組織の種類は限定されず、例えば、気管、食道、腸又は血管であってもよい。
第１のシャフト１６は、その大部分が、ハウジング１２のキャビティ１４内に配置されている。しかし、第１のシャフト１６の一部は、ハウジング１２の第１の端面２４の開口部を通ってハウジング１２から突出している。ハウジング１２内から突出する第１のシャフト１６の端は流体コネクタ２８を備え、それは流体を第１のシャフト１６内に導入し又はそこから除去するための入口及び出口の両方として機能する。第１のシャフト１６の周り及びハウジング１２の第１の端面２４で液漏れの無いシールを確実にするために、Ｏリングシール３６ａ、３６ｂが提供される。これにより、ハウジング１２のキャビティ１４内からの望ましくない流体の漏れが防止される。
同様に、第２のシャフト１８は、その大部分が、ハウジング１２のキャビティ１４内に配置されている。しかし、第２のシャフト１８の一部は、ハウジング１２の第２の端面２６の開口部を通ってハウジング１２から突出している。ハウジング１２内から突出する第２のシャフト１８の端は流体コネクタ３０を備え、それは第２のシャフト１８に導入される流体のための入口として機能する。第２のシャフト１８の周り及びハウジング１２の第２の端面２６で液漏れの無いシールを確実にするために、Ｏリングシール３６ｃ、３６ｄが提供される。この場合も、これにより、ハウジング１２のキャビティ１４内からの望ましくない流体の漏れが防止される。
第１及び第２のシャフト１６、１８の各々は、中空で穴が貫通しており、それらの長さに沿って一連の穴３２、３４を有する。以下に詳細に記載されるように、これらの穴３２、３４は、シャフト１６、１８内の流体を、シャフト１６、１８内から、ハウジング１２のキャビティ１４内に取り付けられた足場３８の表面上に分配することを可能にする。第１のシャフト１６内の複数の穴３２は、２つのブロック２２の間のシャフト１６の長さに沿って設けられている。同様に、第２のシャフト１８内の複数の穴３４は、シャフト１８の長さに沿って設けられているが、シャフト１８に沿って、第１のシャフト１６内の複数の穴３２と同じ長さにのみ設けられている。図に示す方向では、第２のシャフト１８内の複数の穴３４は、第２のシャフトの長さに沿って、第１のシャフト１６の複数の穴３２を含む長さの真上に設けられている。
図２に示すように、足場３８はハウジングのキャビティ１４内に取り付けられた状態で、第１のシャフト１６は、流体がシャフト１６の中の穴３２を通って足場３８の内面３７に注がれてもよいように、管状足場３８の中央に配置される。図に示された実施態様において、第１の流体３３は、第１のシャフト１６の複数の穴３２を通って足場３８の内面３７に注がれる。第２のシャフト１８は、流体がシャフト１８の複数の穴３４を通って足場の外面３９に注がれるように、管状足場３８の真上に（図に示される向きで）配置される。図に示された実施形態において、第２の流体３５は第２のシャフト１８の複数の穴３４を通って足場３８の外面３９に注がれる。
第１及び第２の流体３３、３５は、増殖培地及び細胞、例えば、それぞれ適切な増殖培地中の上皮細胞及び幹細胞、を含んでもよい。
図３及び図４は、本発明によるバイオリアクター１０の一実施態様を組み込んだ動作設定を示す。特に、これらの図は、第１及び第２の流体３３、３５が、取り付けられた足場３８の表面に注ぐために、各シャフト１６、１８内にどのように提供されるかを示す。
図３に示すように、バイオリアクター１０は、第１のシャフト１６の端部にある流体コネクタ２８において、パイプライン５０及び５２を介して第１のポンプ４１に接続される。パイプライン５０は、流体をポンプ４１から流体コネクタ２８へ供給するように動作可能であり、一方、パイプライン５２は、流体を流体コネクタ２８からポンプ４１へ戻すように動作可能である。図の構成は、更に、流体リザーバー４２を含み、これはパイプライン４８を介してポンプ４１に流体的に接続されている。
同様に、流体コネクタ３０を介して加圧下で第２の流体３５を第２のシャフト１８に供給するための第２のポンプ４６も設けられている。この第２のポンプ４６はパイプライン６６及び６８を介してバイオリアクター１０の流体コネクタ３０に流体接続される。特に、パイプライン６６は、流体をポンプ４６から流体コネクタ３０へ供給するように動作可能であり、一方、パイプライン６８は、流体を流体コネクタ３０からポンプ４６へ戻すように動作可能である。図の構成は、更に、第２の流体リザーバー６２を含み、これはパイプライン６４を介してポンプ４６に流体的に接続されている。
バイオリアクター１０のハウジング１２内から過剰の流体を排出するために、廃液管７０が流体出口２０に流体接続されて設けられている。
図４に示す構成は、第２のポンプ４６がリザーバーから流体を供給されないという点で図３に示す構成とは異なる。そうではなくて、第２のポンプ４６には、ハウジング１２のキャビティ１４内から流体出口２０を通して流体を除去することによって得られた流体が供給される。図に示す実施態様において、このバイオリアクター１０は、更に、第２のポンプ４６と流体出口２０との間に設けられた酸素供給装置４４を含む。特に、この酸素供給装置４４は、パイプライン５４を介して出口２０に、そしてパイプライン５６を介して第２のポンプ４６に流体的に接続されている。後で記載するように、この設定において、この酸素供給器４４は、使用時に、流体が、取り付けられた足場３８の更なる表面へ注がれるために、第２の流体３５として再利用され得るように、ハウジング１２のキャビティ１４内から除去された流体を再度酸素化するように動作可能である。
以下、バイオリアクター１０の操作上の使用方法を、図１〜４を参照して記載する。
バイオリアクター１０は、そのハウジング１２内に取り付けられた足場３８の表面上で生物学的材料を成長させるために使用される。これを達成するために、第１及び第２の流体３３、３５をそれぞれ内面及び外面３７、３９上に注ぐ。これらの流体３３、３５は、ハウジング１２内に突出する各シャフト１６、１８を介して注がれる。これら流体３３、３５は、典型的には、複数の細胞を含む生物学的培地を含み、これらの細胞は、全て同じ細胞型であってもよく、又は２若しくはそれ以上の異なる細胞型であってもよい。これら第１及び第２の流体３３、３５は異なる生物学的培地を含むことが好ましい。しかし、第１及び第２の流体３３、３５が同じ培地を含んでもよいことを理解されたい。
図に示すバイオリアクター１０において、第１の流体３３は、第１のシャフト１６を介して取り付けられた足場３８の内面３７に注がれる。図に示されるように、この足場３８は、ハウジング１２内で第１のシャフト１６の周りに同軸に取り付けられ、第１のシャフト１６内に含まれている第１の流体３３が、第１のシャフト１６内の複数の穴３２を通って足場３８の内面３７上に滴下するような位置に、取り付けられる。第１の流体３３が第１のシャフト１６の穴３２を通って滴下する間、足場３８は、ブロック２２（場合によってはシャフト１６も）の回転により、第１のシャフト１６によって画定される軸の周りを回転する。この足場３８の回転により、足場３８が回転する際に第１のシャフト１６の穴３２の真下に位置する内面３７の部分が連続的に変化するので、この軸を中心とした足場３８が３６０°の全回転する際に、第１の流体３３を足場３８の内面３７全体に注ぐことが可能になる。
同様に、同時に、第２の流体３５が取り付けられた足場３８の外面３９に注がれる。これを達成するために、足場３８は、第２のシャフト１８内に含まれる第２の流体３５が、第２のシャフト１８内の複数の穴３４を通って足場３８の外面３９上に滴下するように、第２のシャフト１８の真下に（図に示される向きで）取り付けられる。上記で議論されたように、足場３８は、ブロック２２（場合によってはシャフト１６も）の回転により、第１のシャフト１６によって画定される軸の周りを回転する。また、この足場３８の回転により、足場３８が回転する際に第２のシャフト１８の穴３４の真下に位置する外面３９の部分が連続的に変化するので、この軸を中心とした足場３８が３６０°の全回転する際に、第２の流体３５を取り付けられた足場３８の外面３９全体に注ぐことが可能になる。
（第１及び／又は第２のシャフト１６、１８のいずれかから生じ得る）過剰な流体４０は、足場３８の下でキャビティ１４の底部に集まる。この過剰な流体４０は、流体出口２０を通ってキャビティ１４内から除去される。
図３に示す構成において、除去された過剰な流体４０は廃棄物管７０を通して排出され、再使用されない。しかし、図４に示される代替の設定においては、この除去された過剰な流体４０は、取り付けられた足場の外面３９に注ぐための第２の流体３５として使用するためにリサイクルされる。特に、この過剰な流体４０は、流体出口２０を通って流体４０が除去された後これに続いて酸素供給装置４４に向けられる。この酸素供給装置４４は、流体を再度酸素で処理するように動作可能である。第２のシャフト１８は圧力下にある。この酸素供給装置４４は、流体を再度酸素で処理するように動作可能であり、この流体は次に第２のポンプ４６を通って圧力下で第２のシャフト１８に供給される。次に、この流体は上記のように足場３８の外面３９に注がれる。
図４において、ハウジング１２内から流体出口２０を通って除去された流体４０は、第２のシャフト１８に戻るように向けられる。しかし、本発明はこの意味に限定されないことを理解されたい。この除去された流体４０は、そうではなく、足場３８の内面３７に注ぐために第１のシャフト１６に向けられてもよい。更なる実施形態において、この除去された流体４０は、足場３８の内面３７及び外面３９の両方に注がれるために、第１及び第２のシャフト１６、１８の両方に向けられてもよい。図３に示す構成を使用する実施形態のような、より更なる実施形態において、この除去された流体４０は、上述のように、ハウジング１２内から単に排出され、再使用されないこともある。
いくつかの実施形態において、バイオリアクター１０は、図３に示されるように、足場３８に注ぐための第２の流体の供給源として第２の流体貯蔵器に接続されてもよい。このような実施形態では、ハウジング１２内から回収された流体４０は、第１及び／又は第２の流体３３、３５を補充するために使用されてもよい。
いくつかの実施態様において、このバイオリアクター１０は、１又はそれ以上の追加の酸素供給装置を含んでもよい。例えば、いくつかの実施態様において、このバイオリアクター１０は、流体コネクタ２８と第１のポンプ４１との間にパイプライン５２に沿って酸素供給装置を備えてもよい。そうすることにより、パイプライン５２を通って第１のシャフト１６から除去された流体は、取り付けられた足場３８の表面へ注ぐために第１のシャフト１６にポンプで戻される前に再度酸素で処理されることができる。
上記の実施態様は例示のためのみとして記載されている。添付の特許請求の範囲に定義されている本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変形が可能である。
１０ バイオリアクター
１２ ハウジング
１４ キャビティ
１６、１８ （貫通穴があけられた）シャフト
３２、３４ 一連の穴
３８ 足場

Claims (17)

  1. ハウジング、第１の流体ディスペンサー及び第２の流体ディスペンサーを含むバイオリアクターであって、該第２の流体ディスペンサーは、該第１の流体ディスペンサーから空間的に離れていて、該バイオリアクターは、取り付けられた足場をハウジング内に受け入れるように構成され、第１及び第２の流体ディスペンサーは、第１及び第２の流体を、それぞれ取り付けられた足場の少なくとも２つの異なる領域に注ぐように配置され、該第１の流体ディスペンサーは、取り付けられた足場の回転軸に沿って提供され、該取り付けられた足場は、該第１の流体ディスペンサーと同軸であり、それを取り囲み、該第２の流体ディスペンサーは該足場の位置の真上に配置される、バイオリアクター。
  2. 前記ハウジング内から流体を除去するための流体出口を含む、請求項１に記載のバイオリアクター。
  3. 前記第１及び第２の流体ディスペンサーが、取り付けられた足場の異なる表面に流体を注ぐように配置されている、請求項１又は２に記載のバイオリアクター。
  4. 前記第１の流体ディスペンサーが、前記第１の流体を取り付けられた足場の内面に注ぐように配置されている、請求項３に記載のバイオリアクター。
  5. 前記第２の流体ディスペンサーが、前記第２の流体を取り付けられた足場の外面に注ぐように配置されている、請求項３又は４に記載のバイオリアクター。
  6. 前記第１及び／又は第２の流体ディスペンサーが、その中に１又はそれ以上の穴を有する貫通穴があけられたシャフト又は導管を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のバイオリアクター。
  7. 前記第１及び／又は第２のシャフト又は導管が、該シャフト又は導管内の前記１又はそれ以上の穴を通して、前記第１又は第２の流体を、取り付けられた足場の１又はそれ以上の表面上に注ぐように動作可能である、請求項６に記載のバイオリアクター。
  8. 使用時に、その上に足場を取り付けることができる支持構造体を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のバイオリアクター。
  9. 前記支持構造体が、その上に足場が回転可能に取り付けられるように構成されている、請求項８に記載のバイオリアクター。
  10. 管状足場を受け入れるように構成され、取り付けられたときに、該管状足場が管状足場の中心を通る軸の周りを回転可能である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のバイオリアクター。
  11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載のバイオリアクターを使用して、生物学的材料を処理する方法であって、
    （ａ）該バイオリアクターのハウジング内に足場を取り付ける段階、
    （ｂ）該バイオリアクターの第１の流体ディスペンサーから、第１の流体を、該取り付けられた足場の第１の領域上に注ぐ段階、及び
    （ｃ）該バイオリアクターの第２の流体ディスペンサーから、第２の流体を、該取り付けられた足場の第２の領域上に注ぐ段階、
    から成り、該第１の流体、該第２の流体及び該足場のうち少なくとも一つが生物学的材料を含む、方法。
  12. 前記取り付けられた足場の第１及び第２の領域が前記足場の異なる表面上に配置されている、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記第１の領域が前記足場の内面であり、前記第２の領域が前記足場の外面である、請求項１２に記載の方法。
  14. 管状足場上で生物学的材料を処理する段階を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記第１及び／又は第２の流体がその表面又は領域に注がれている間に、前記取り付けられた足場を回転させる段階を含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記第１及び第２の流体ディスペンサーのうちの一つが、前記取り付けられた足場内に配置されている、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記第１及び第２の流体ディスペンサーのうちの一つが、前記取り付けられた足場の外側に配置されている、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
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