JP6952348B2 - 殺菌性ポリマー及びポリマーと細胞との複合体ならびにそれらの合成 - Google Patents

Description

本出願は、２０１５年７月２４日に出願されたオーストラリア仮特許出願第２０１５９０２９４３号の優先権を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、生物医学用途に有用なポリマーに関する。特に、本発明は、温度活性化、水溶性、機械的強度、生体適合性及び鎮痛／抗炎症特性のような所望の臨床特性を生起するために、それらの相対的な割合を調整可能な５つまでのモノマー単位を含む新規なポリマーに関する。このタイプの生体適合性ポリマーへ持続的な鎮痛／抗炎症特性を組み込むことは、当該技術分野の目標であり、注目に値するこれまでの欠点である。

以下、本発明をその好ましい実施形態を参照して説明するが、本発明の精神及び範囲は多くの他の形態で具体化され得ることが当業者には理解される。

本明細書に含まれている文書、行為、材料、装置、物品等について議論は、これらの事項の一部又は全部が先行技術の基礎の一部を構成するか、本出願の各請求項の優先権の日前に存在していた本開示に関連する分野における共通の一般的知識であると認めるものととらえられるべきではない。

ヒドロゲルは、組織工学、創傷治癒及び薬物送達の分野で実用化されていることが知られている。ヒドロゲルの生体内送達では、しかしながら、異物免疫応答及び慢性炎症が重篤な臨床合併症を引き起こすことがある。ヒドロゲル内に殺菌剤／抗炎症剤を物理的に添加することは、手術後の非常に早い段階での薬物のバースト放出による一時的な効果を生起するだけであり、一旦殺菌剤の最初のバーストが枯渇すると、手術部位で感染が起こりやすくなる。

したがって、本発明がより完全に評価され得る適切な出発点は、本出願人自身の先行する特許出願であるＰＣＴ／ＡＵ２０１２／００１５６６（ＷＯ２０１３／０９１００１）であり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる；対応する開示は、以下の文献刊行物、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３５（２０１４），ｐｐ．５４２５−５４３５（以下、全体を通じて「Ｐ１」）に記載されている。

Ｐ１は、可変な／調整可能なゲル化特性、好都合な機械的特性及び耐荷重用途のための構造安定性を有する、細胞適合性及び注射可能な天然由来のタンパク質ヒドロゲルを開発することを目的としている。熱反応性コポリマー、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ポリラクチド−２−ヒドロキシエチルメタクリレート−ｃｏ−オリゴ（エチレングリコール）モノメチルエーテルメタクリレート（「ＰＮＰＨＯ」）を、Ｎ−アクリロキシスクシンイミドモノマー成分を組み込むことによってスクシンイミドエステル基で官能化した。これらのエステル基は、水性媒体中で第１級アミン基を有する異なるタンパク質（例えば、α−エラスチン及びコラーゲン）にＰＮＰＨＯを共有結合させるために利用された。ＰＮＰＨＯとの共有結合形成によるエラスチンの取り込みは、ＰＮＰＨＯ含有ヒドロゲルの構造内での構造安定性、有利な機械的特性及び生細胞増殖を促進した。

Ｐ１で得られた結果は、エラスチン−ｃｏ−ＰＮＰＨＯ溶液が細かいゲージ針を介して注入され、架橋試薬が存在しない状態で、３７℃でその場でヒドロゲルに変換されたことを示している。ＰＮＰＨＯ含量及び組成を変えることによって、これらのヒドロゲルのゲル化時間を、外科的要件との適合性を確実にするために２分から１５分の範囲内で細かく調整することができる。さらに、これらのヒドロゲルは、以前に開発されたエラスチンベースのヒドロゲルよりも実質的に高い４０ｋＰａから１４５ｋＰａの範囲の圧縮率を示した。これらのヒドロゲルは生理学的環境において非常に安定であり、シミュレートされた環境で３０日間のインキュベーション後に１０重量％の質量損失の証拠を示した。

さらに、このクラスのヒドロゲルは、ＰＮＰＨＯコポリマーからのポリラクチドの切断の結果として、コポリマーの下限臨界溶液温度が３７℃以上に徐々に上昇するため生体内で生体吸収性であった。さらに、Ｐ１は、これらヒドロゲル中に封入された細胞の８０％以上が生存可能であり、少なくとも５日間にわたって封入された細胞の数が増加したことを実証している。これらの特有な特性は、広範囲の組織工学用途のための好ましい候補として、エラスチン−ｃｏ−ＰＮＨＰＯヒドロゲルを特徴づけている。

特許性の観点から、Ｐ１と本発明との本質的な相違点は、後者に殺菌性モノマー単位２−ヒドロキシ−５−Ｎ−メタクリルアミド安息香酸（５−ＨＭＡ）及び／又は２−ヒドロキシ−４−Ｎ−メタクリルアミド安息香酸（４−ＨＭＡ）が存在することである。Ｐ１は、他の４種のモノマーを含むポリマー（すなわち、「ＰＮＰＨＯ」）を開示している。しかし、重要なことは、Ｐ１は、５−ＨＭＡ、又は４−ＨＭＡ（又はそれらの組み合わせ；又は、実際に殺菌特性を付与する任意のモノマー）でＰＮＰＨＯポリマーを増強しようとするべきであるという教示が全くないことである。このように、Ｐ１は、当業者が、殺菌成分で増強されたＰＨＰＨＯポリマーを求めることに対する明らかな動機を与えるものではなく、最初の創傷治癒に対応する期間にわたって徐放性である殺菌成分に関するものである。

さらに、ヒドロゲルの体内送達により、異物免疫応答及び慢性炎症が重大な臨床的合併症につながる可能性があるという従来の如何なる知見も、当業者に本発明から逸脱するように仕向けるものと主張することができる。この目的のために、上記のように、ヒドロゲルへの殺菌薬／抗炎症薬の物理的添加は、手術後の非常に速い段階で、薬物のバースト放出による一時的な効果を生起するのみであることが知られている点で、殺菌成分を含むことは、いくらか反対の動機づけが与えられるものである。このことから、当業者は、手術の治癒期間にわたって殺菌特性を付与する成分が、所望されているものの、実質的に達成できないと推測する可能性が高いであろう。そのように、受け入れられている知識においては、単に問題が特定されるのみであり、当業者がどのようにそれに対処しなければならないかについての示唆を提供しないように見える。このように、ヒドロゲル担体内にふさわしい殺菌成分が存在しないことは、当該技術分野の既知の欠点として特定されている。

従来、サリチル酸は、３，５−ジ（アクリロキシメチル）サリチル酸及び３−メチル−Ｓ−アクリロキシメチルサリチル酸等の異なるモノマーと化学的に結合していた。しかしながら、天然及び合成ペプチドと結合する能力を有する注射可能なサリチル酸ベースの熱硬化性ヒドロゲルのクラスは決して提供されていなかった。このような特性は、生分解特性及び組織接着挙動と共に、そのような生体材料を未解決の臨床課題に対処するための適切な候補にする。

Ｐ１を越えて、ＷａｒｄとＧｅｏｒｇｉｏｕによる「生物医学的応用のための温度応答性ポリマー」（Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，２０１１，３：１２１５−４２）（Ｐ２）と題するレビュー論文は、２０１１年頃までの背景技術の教示に関連性があると考えられる。この文書は、異なる温度応答性ヒドロゲルの特性、化学構造及び用途をまとめたものである。Ｐ２で指摘されていることだが、いくつかのより顕著なヒドロゲルの主要な成分及び特性を表１に要約する。

さらに、出願時に出願人に知られている特許文献のいずれも、そのようなポリマーの商業的形態又は医学的用途を開示していないことはもちろん、殺菌剤／鎮痛剤含有ポリマーを開示又は教示していないようである。代表例は、以下を含む：ＵＳ８，７４１，３１７；ＵＳ２００５／０２３３００３；ＵＳ３，２９０，２７０；ＫＲ２０１４０９３３４９；ＣＮ２０１３１０１０３９９４；ＵＳ２０１２／０２８８５６４；ＵＳ２００９／０２２６５１９；ＵＳ２０１３／０２６１２１２；ＷＯ２０１４／１２６５３７；ＵＡ９２０２７；ＵＳ２００８／００４４４７６；ＵＳ２０１０／００４８４７３；ＵＳ２０１３／０２０９５３２；ＵＳ２０１２／０２５８０６８；ＵＳ２００８／０２９３８２７；ＵＳ２０１１／０２２３２３０；ＷＯ２００１／０３６０００；ＵＳ２００６／０１１５４５７；ＵＳ２０１２／０２２０６９１；ＵＳ２０１４／３０２１４４；ＷＯ２０１４／０４１２３１；及びＷＯ２０１４／１１６１８７。

最後に、出願人に知られている科学文献のいずれも、殺菌／鎮痛剤含有ポリマーを教示又は示唆していない。代表的サンプルには以下を含む：Ｅｌｖｉｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，１９９７，３８：４７４３−５０；Ｅｌｖｉｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｍａｔｅｒ．Ｍｅｄ．，２００１；１２：５３５−４２；Ｚｈｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００４，２５：１３３９−４８；Ｐａｒｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．，２００７，２４９−２５０：１４５−５０；Ｂｅｓｓａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１０，１４２：３１２−８；Ｃｈａｉｐｉｎｙｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，２００４，２２：４４６−５５；Ｎｉｃｏｄｅｍｕｓ＆Ｂｒｙａｎｔ，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．，２００８，４１：１５２８−３６；Ｅａｓｔｏｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，１９５５，６１：５８９−６００；Ｏｕｉｍｅｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，２０１５，１５：３４２−５０；ａｎｄ Ｇｕａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ．，２０１４，２０１４：１−９．

先行技術の欠点の少なくとも１つを克服又は改善すること、又は有用な代替物を提供することが、本発明の好ましい目的である。

また、本発明の特に好ましい形態の好ましい目的は、実現可能／持続可能な殺菌成分を含む生物医学的用途のためのポリマーを提供することである。上記のように、このタイプの既知のポリマーは、殺菌成分のバースト放出によって制限される。したがって、本発明の好ましい形態は、温度活性化、水溶性、機械的強度、生体適合性及び鎮痛性／抗炎症特性の所望の臨床特性を生起させるために、その相対的割合を「調整可能」なモノマー単位を含むポリマーを提供することを目的とする。各モノマーの相対的な割合は、その特定の用途に応じてポリマーの「調整可能性」を提供する。例えば、より顕著な殺菌効果が望まれる場合には、より多くの割合の殺菌成分がポリマー内に組み込まれる。以下に記載するように、本発明のポリマーの好ましい実施態様は、約５モル％の殺菌成分（５−ＨＭＡ、４−ＨＭＡ、又はそれらの組み合わせ）を含んでいてもよく、この量は求められる正確な臨床結果に応じて変えることができる。

本発明を特定の実施例を参照して説明するが、本発明は多くの他の形態で具体化されてもよいことを当業者は理解する。

第１の態様では、少なくとも３つのさらなるモノマー単位と組み合わせられる少なくとも１つの殺菌性／鎮痛性／抗炎症性モノマー単位を含むポリマーがここに提供され、前記３つのさらなるモノマー単位は、：温度活性化、水溶性、機械的強度、タンパク質／多糖結合能力、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される特性を生起する。

第２の態様では、第１の態様にしたがって定義されるポリマーの合成方法であって、所定のモル量の開始剤の、所定モル量の殺菌性／鎮痛性／抗炎症性モノマー単位；それぞれ所定のモル量の水溶性モノマー単位；機械的強度付与モノマー単位；タンパク質反応性モノマー単位；及び熱硬化性モノマー単位のうちの少なくとも３つとのフリーラジカル重合を含む方法が提供される。

第３の態様では、医療用途において、第１の態様にしたがって定義されたポリマーの使用がここに提供される。

第４の態様では、癌を含む医学的状態の治療における、第１の態様に記載のポリマーの使用がここに提供される。

第５の態様では、外科的シーリング、創傷の被覆形成、空洞の充填、又は生体内での組織発生足場の提供の方法がここに提供され、この方法は、そのような治療を必要とする対象に、第１の態様にしたがって定義された有効量のポリマーを投与することを含む。

第６の態様では、癌を含む医学的状態の治療方法であって、そのような処置を必要とする対象に有効量の第１の態様にしたがって定義されたポリマーを投与することを含む方法が提供される。実施形態において、癌は肺癌を含む。

第７に、本明細書においては、第１の態様にしたがって定義されるポリマー；生物学的適合性ヒドロゲルとポリマーとを組み合わせるための指示書；及び場合により注射器を含む、医療キットが提供される。

＜定義＞
本明細書に提供される定義に関して、別途明示的に述べられるか、又は文脈から明らかでない限り、定義される用語及び語句は提供された意味を含む。特に断らない限り、又は文脈から明らかでない限り、以下の用語及び語句は、用語又は語句が関連技術分野の当業者によって把握される意味を排除するものではない。本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるので、定義は具体的な実施形態の記述を補助するために提供され、特許請求の範囲に記載された発明を限定するものではない。文脈によって特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。

本明細書を通して、本発明の様々な態様及び構成要素は、範囲の形式で提示されうる。範囲の形式は便宜上含まれるものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではない。したがって、範囲の説明は、具体的に示されていない限り、その範囲内のすべての可能な下位範囲及び個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１から５のような範囲の記述は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から５、３から５等のような下位範囲、並びに引用された範囲内の個々の及び部分的な数値、例えば、１、２、３、４、５、５．５、６を具体的に開示しているものとみなされるべきである。これは、開示された範囲の幅にかかわらず適用される。特定の値が要求される場合、これらは明細書に示される。

文脈が明らかに他に必要としない限り、明細書及び特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の語は排他的又は消耗的な意味と反対の包括的な意味で構築される；例えば、「含むが、これに限定されない」という意味である。

本明細書を解釈する目的のために、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆もまた同様である。

本発明の好ましい実施形態を、添付の図面を参照して、単なる例示として、以下に説明する。

図１は、本発明のＰＡＳポリマーの模式図である。熱硬化性モノマーはＮＩＰＡＡｍ骨格として表され、水溶性ＯＥＧＭＡモノマーは「Ｅ」と示され、機械的強度を付与するＰＬＡ／ＨＥＭＡモノマーは「Ｌ」と示され、タンパク質反応性ＮＡＳモノマーは「Ｎ」と示され、殺菌性５−ＨＭＡモノマーは「Ｓ」と示される。他においても示されるように、５−ＨＭＡ成分は、４−ＨＭＡと容易に交換可能又は組み合わせ可能である。図中の各モノマーの数は、相対的な割合を表している。 図２は、ＰＡＳポリマーの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルであり、それぞれ割り当てられた共鳴が示されている。スペクトルにより、ポリマー中に５つのモノマー単位がすべて組み込まれていることを確認することができ、「ｏ」で示される殺菌性５−ＨＭＡ成分は、予想通り、約１．５ｐｐｍに表れている。 図３は、ヒドロゲル担体（ＰＡＳＧｅｌ）内に組み込まれた場合のＰＡＳの生物学的有効性を示す。生存細胞数が「０」日の約６．５×１０^３から「７」日の約９×１０^３に増加した予備的な細胞適合性試験の結果が示されている。１週間の間に約５０％増加した。 図４はまた、ヒドロゲル担体（ＰＡＳＧｅｌ）内に組み込まれた場合のＰＡＳの生物学的有効性を示す。「２１」日のＰＡＳＧｅｌ試料が約２×１０^８ＣＦＵのみに支持されている；これは元の（「１」日の）計数の約３分の１あるという、予備的な微生物コロニー計数試験の結果が示されている。 図５は、ＰＡＳＧｅｌが、圧縮及び引張強度（それぞれ３１１±４７ｋＰａ及び７８１±１１６ｋＰａ）並びに組織接着試験（９７０ｋＰａ）によって有利な機械的特性を生じることを示す。 図６は、ＰＡＳＧｅｌシステムが被験者の出血を防ぐことができるかどうかを決定するための実現可能性試験を実施するために使用される装置の概略図を示す。文字「ｈ」は、システム内の圧力を調整するための変数を表す。

ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド−ｃｏ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート／ポリラクチド−ｃｏ−オリゴ（エチレングリコール）モノメチルエーテルメタクリレート−ｃｏ−サリチル酸）ポリマーをベースとする同類のポリマーが本明細書に開示されており、以下「ＰＡＳ」と表示される。ＰＡＳポリマーは、アスピリンと比較して優れた鎮痛及び抗炎症特性を示すサリチル酸のメタクリル酸エステル誘導体（５−ＨＭＡ、４−ＨＭＡ、又はそれらの組み合わせ）を含む。

さらに、ＰＡＳの分子構造は、組織再生、創傷治癒、及び薬物送達のための生体材料の臨床的要件に取り組むことを意図して設計されている。これらの要件は、広く、（ａ）水溶性、（ｂ）タンパク質／ぺプチド反応性、（ｃ）生物学的に無害な架橋メカニズム；及び（ｄ）生分解性である。したがって、開示されたＰＡＳポリマーは、それが拡張される正確な臨床用途に応じて調整可能なそのような特性のブレンドを具体化する。

水溶性特性を高めるために、ＰＡＳは、その分子構造中に親水性のエチレングリコール（ＯＥＧＭＡ）セグメントを組み込む。ＰＡＳポリマーは、Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）セグメントにより水溶液中のタンパク質と結合することもできる。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）の形での熱応答性画分の存在は、任意の外部の化学物質（単数又は複数）／試薬（単数又は複数）の添加を必要とせずに、体温でヒドロゲル形成を誘導することができる。さらに、ＰＡＳポリマーは、ポリマーからのポリラクチド−ｃｏ−２−ヒドロキシエチルメチルアクリレート（ＰＬＡ／ＨＥＭＡ）の開裂により、生体吸収性である。最後に、鎮痛／殺菌成分がサリチル酸のメタクリル酸エステル誘導体（５−ＨＭＡ、４−ＨＭＡ、又はその組み合わせ）の形態で提供される。ＰＡＳポリマーの分子構造及び各セグメントの役割が図１に模式的に示されている。各モノマー単位それぞれの相対的な割合は、ＰＡＳポリマーが適用される臨床用途に応じて、ＰＡＳポリマーの、調整可能性とされるものを提供するものと評価される。

本出願人は、ＰＡＳポリマーがヒドロゲル担体に組み込まれた場合、１つ以上の特定の臨床的必要性（例えば、温度応答性、生体適合性、機械的特性等）に調整され得る物理化学的特性を有することを予期せずに見出した。特に、ＰＡＳポリマーは、顕著な鎮痛及び抗炎症特性を示すことが示されているサリチル酸のメタクリル酸エステル誘導体（５−ＨＭＡ、４−ＨＭＡ、又はそれらの組み合わせ）を含む。

したがって、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド−ｃｏ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート／ポリラクチド−ｃｏ−オリゴ（エチレングリコール）モノメチルエーテルメタクリレート−ｃｏ−サリチル酸）の合成が本明細書に開示され、以下、ＰＡＳと示される。このポリマーは、慢性炎症、低い宿主組織接着性、低い生物学的活性、及び細胞傷害性架橋機構のような既知の物質に関連する現在の欠点の多くに対処する可能性を秘めている。

その最も広い形態において、本開示はＰＡＳポリマーそれ自体に関する。ＰＡＳポリマーは、以下の所望の臨床特性、すなわち温度活性化、水溶性、機械的強度、生体適合性、及び鎮痛／抗炎症特性を生起するために、それらの相対的な比率を調整可能なモノマー単位を含む；各モノマーの相対的割合は、その特定の用途に応じてＰＡＳポリマーの調整可能性を提供する。

第１の態様では、少なくとも３つのさらなるモノマー単位と組み合わせて少なくとも１つの殺菌性／鎮痛性／抗炎症性モノマー単位を含むポリマーがここに提供され、この３つのさらなるモノマー単位は、温度活性化、水溶性、機械的強度、タンパク質／多糖結合能力、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される特性を生起する。

一実施形態では、殺菌性／鎮痛性／抗炎症性モノマー単位は、サリチル酸のメタクリル酸エステル誘導体（５−ＨＭＡ又は４−ＨＭＡ、又はそれらの組み合わせ）を含む。

一実施形態では、ポリマーは、約２モル％から約１０モル％の範囲、例えば：約２モル％、約３モル％、約４モル％、約５モル％、約６モル％、約７モル％、約８モル％、約９モル％、又は約１０モル％の量の５−ＨＭＡ又は４−ＨＭＡ、又はそれらの組み合わせを、おおよその相対モル比で含む。

一実施形態では、少なくとも３つのさらなるモノマー単位が、親水性エチレングリコール（ＯＥＧＭＡ）成分の形態の水溶性モノマー単位；ポリラクチド−ｃｏ−２−ヒドロキシ−エチルメチルアクリレート（ＰＬＡ／ＨＥＭＡ）の形態の機械的強度付与モノマー単位；Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）成分の形態のタンパク質／多糖反応性モノマー単位；及びＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）成分の形態の熱硬化性モノマー単位からなる群から選択される。

一実施形態では、上記少なくとも３つのモノマー単位のそれぞれの相対的な割合により、得られるポリマーが特定の臨床用途のために調整／最適化され、ここで、ある種の物理的／化学的／生物学的性質が他のものよりも好ましい。

一実施形態では、一定の殺菌性／鎮痛性／抗炎症特性が、慢性炎症が臨床的合併症をもたらし得る用途において好ましい。

一実施形態では、親水性エチレングリコール（ＯＥＧＭＡ）成分の形態の水溶性モノマー単位は、一定の水溶性をもたらし、それによってポリマーの調製における有機溶媒の使用を実質的に回避する。

一実施形態では、親水性エチレングリコール（ＯＥＧＭＡ）成分の形態の水溶性モノマー単位は、制御可能なゲル化時間を提供し、次いで、表層／外科用シーラントのための比較的早いゲル化、及び／又は深部組織再生のための比較的遅いゲル化を提供する。本明細書において、「速いゲル化」は、３７℃で１分未満のゲルの形成とみなされる。一実施形態では、親水性エチレングリコール（ＯＥＧＭＡ）成分は、速いゲル化時間を提供する。

一実施形態では、機械的強度を与えるモノマー単位は、制御可能な機械的強度、柔軟性及び弾性を与え、ポリマーを所与の用途の特定の要件に調整する。

一実施形態では、機械的強度を与えるモノマー単位は、ポリマーへの組織接着挙動を提供し、それによって、送達部位におけるポリマーの堆積物の保持を容易にする。

一実施形態では、ポリラクチド−ｃｏ−２−ヒドロキシ−エチルメチルアクリレート（ＰＬＡ／ＨＥＭＡ）の形態の機械的強度を付与するモノマー単位は、分解特性をもたらし、ここで、段階的なＰＬＡの開裂により、腎臓を介してヒドロゲルが生体吸収性となり；ヒドロゲルの周囲組織への移動及び漏出を防止するために、組織接着性を有する。ＰＬＡ単位の長さは、用途に応じて調整できる。一実施形態では、ＰＬＡ／ＨＥＭＡユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のＰＬＡ単位を含む。例えば、ＰＬＡ／ＨＥＭＡユニットは５つのＰＬＡユニットを含んでいてもよい。

一実施形態において、水溶性モノマー単位及び機械的強度を付与するモノマー単位の量は、制御可能な生体吸収挙動を提供する。

一実施形態では、Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）成分の形態のタンパク質反応性モノマー単位は、異なる生物学的に活性なペプチド及び多糖類のヒドロゲルへの結合によるペプチド反応性をもたらし、細胞シグナル伝達及び組織形成速度を促進する。

一実施形態では、ポリマーは、約１０モル％から約１５モル％の範囲の量、例えば、約１０モル％、約１１モル％、約１２モル％、約１３モル％、約１４モル％、又は約１５モル％のＮＡＳを、おおよその相対モル比で含む。

一実施形態では、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）成分の形態の熱硬化性モノマー単位は、約３７℃で、その場で構造形成を誘導することによる熱硬化特性をもたらす。

別の実施形態では、ポリマーは、約６０モル％から約８０モル％の範囲、例えば約６０モル％から約７０モルの範囲、又は約７０モル％から約８０モル％の範囲の量の相対モル比で、ＮＩＰＡＡｍをおおよその相対モル比で含む。例示的な値は、約６８モル％又は約７５モル％を含む。

一実施形態において、ポリマーは、０℃から３５℃で１０ｍｇ／ｍＬから７００ｍｇ／ｍＬの質量含有量を有する水溶液に溶解し、例えば、質量含有量は０℃から３５℃で、３５ｍｇ／ｍＬから４００ｍｇ／ｍＬであってもよい。

一実施形態では、ポリマーは、温度を３７℃以上に上昇させることによって、その場でミクロ又はマクロ構造体を形成する。

一実施形態では、ポリマーの生物学的有効性は、細胞適合性及び微生物コロニー計数の試験によって確認可能である。

一実施形態では、ポリマーは、約２００ｋＰａから約４００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する。例えば、圧縮弾性率は、約２００ｋＰａ、約２２０ｋＰａ、約２４０ｋＰａ、約２６０ｋＰａ、約２８０ｋＰａ、約３００ｋＰａ、約３２０ｋＰａ、約３４０ｋＰａ、約３６０ｋＰａ、約３８０ｋＰａ、又は約４００ｋＰａであってもよい。

別の実施形態では、ポリマーは、約５００ｋＰａから約８００ｋＰａの範囲の引張弾性率を有していてもよい。例えば、引張弾性率は、約５００ｋＰａ、約５２０ｋＰａ、約５４０ｋＰａ、約５６０ｋＰａ、約５８０ｋＰａ、約６００ｋＰａ、約６２０ｋＰａ、約６４０ｋＰａ、約６６０ｋＰａ、約６８０ｋＰａ、約７００ｋＰａ、約７２０ｋＰａ、約７４０ｋＰａ、約７６０ｋＰａ、約７８０ｋＰａ、又は約８００ｋＰａであってもよい。

一実施形態では、圧縮力及び引張り強度によるポリマーヒドロゲルの機械的特性は、それぞれ約３１１±４７ｋＰａ及び約７８１±１１６ｋＰａである。

別の実施形態では、ポリマーは、約９００ｋＰａから約１２００ｋＰａの範囲の接着せん断強度を有していてもよい。あるいは、接着せん断強度は、少なくとも約９００ｋＰａ、少なくとも約９２０ｋＰａ、少なくとも約９４０ｋＰａ、少なくとも約９６０ｋＰａ、少なくとも約９８０ｋＰａ、少なくとも約１０００ｋＰａ、少なくとも約１０２０ｋＰａ、少なくとも約１０４０ｋＰａ、少なくとも約１０６０ｋＰａ、少なくとも約１０８０ｋＰａ、少なくとも約１１００ｋＰａ、少なくとも約１１２０ｋＰａ、少なくとも約１１４０ｋＰａ、少なくとも約１１６０ｋＰａ、少なくとも約１１８０ｋＰａ、又は少なくとも約１２００ｋＰａであってもよい。

一実施形態では、ポリマーの組織接着試験は、少なくとも約９７０ｋＰａの接着せん断強度を有していてもよい。

一実施形態では、ポリマーは、添付の図面の図１に提供される構造によって概略的に表される。

一実施形態では、ポリマーは臨床的に有用である。例えば、ポリマーは、外科用シーラント、創傷治癒被覆剤、充填剤及び／又は生体内組織再生足場として使用することができる。

一実施形態では、ポリマーは、おおよその相対モル比で、約５モル％未満のＯＥＧＭＡを含み、それによって水溶性を生起する。別の実施形態において、ポリマーは、おおよその相対モル比で、約２モル％から約５モル％、例えば約２モル％、約３モル％、約４モル％又は約５モル％のＯＥＧＭＡを含む。

一実施形態では、ポリマーは、約２モル％から約１０モル％の範囲のＰＬＡ／ＨＥＭＡをおおよその相対モル比で含む。例えば、ＰＬＡは、以下の量で存在していてもよい：約２モル％のＰＬＡ／ＨＥＭＡ、約３モル％のＰＬＡ／ＨＥＭＡ、約４モル％のＰＬＡ／ＨＥＭＡ、約５モル％のＰＬＡ／ＨＥＭＡ、約６モル％のＰＬＡ／ＨＥＭＡ、約７モル％のＰＬＡ／ＨＥＭＡ、約８モル％のＰＬＡ／ＨＥＭＡ、約９モル％のＰＬＡ／ＨＥＭＡ、又は約１０モル％のＰＬＡ／ＨＥＭＡ。

一実施形態では、ポリマーは、おおよその相対モル比で、約８モル％を超えるＰＬＡ／ＨＥＭＡを含む。特に、一実施形態では、ポリマーは、約８モル％を超えるＰＬＡ／ＨＥＭＡを含み、一実施形態では、それにより、約３７℃でのヒドロゲル形成を生起する。例えば、ポリマーは、約８モル％を超えるＰＬＡ／ＨＥＭＡ、約９モル％を超えるＰＬＡ／ＨＥＭＡ、約１０モル％を超えるＰＬＡ／ＨＥＭＡ、約１１モル％を超えるＰＬＡ／ＨＥＭＡ、約１２モル％を超えるＰＬＡ／ＨＥＭＡ、約１３モル％を超えるＰＬＡ／ＨＥＭＡ、約１４モル％を超えるＰＬＡ／ＨＥＭＡ、又は約１５モル％を超えるＰＬＡ／ＨＥＭＡを含んでいてもよい。

一実施形態では、ポリマーは、おおよそのモル比で、ＮＩＰＡＡｍ（６８モル％）、ＮＡＳ（１４モル％）、ＰＬＡ／ＨＥＭＡ（８モル％）、ＯＥＧＭＡ（５モル％）、及び５−ＨＭＡ（５モル％）含む。別の実施形態では、４−ＨＭＡ（５モル％）を殺菌成分として適用した。別の実施形態では、５−ＨＭＡ（２．５モル％）と４−ＨＭＡ（２．５モル％）との組み合わせを殺菌成分として適用した。他の特性の中でも、これらの実施形態のポリマーは水溶性であり、約３７℃でヒドロゲルを形成する；それはまた、５−ＨＭＡ（又は４−ＨＭＡ、又はそれらの組み合わせ）成分による所望の抗菌／殺菌特性を生起する。

一実施形態では、ポリマーは、対象における異物免疫応答及び慢性炎症による臨床合併症なしに、手術部位へのポリマーの比較的安全かつ有効な生体内送達をもたらす。

一実施形態では、ポリマーは、サリチル酸のメタクリル酸エステル誘導体からの殺菌性／鎮痛性／抗炎症性作用のバースト放出を、約０日から約２７０日の間防止するか、又はそれにより手術部位における時間に基づく感染の発生率を低減する。

一実施形態では、約０日から約２７０日の期間は、好ましくは約１０日から約２６０日であり、より好ましくは約２０日から約２５０日であり、より好ましくは約３０日から約２４０日であり、より好ましくは約４０日から約２３０日であり、より好ましくは約５０日から約２２０日であり、より好ましくは約６０日から約２１０日であり、より好ましくは約７０日から約２００日であり、より好ましくは約８０日から約１９０日であり、より好ましくは約９０日から約１８０日であり、より好ましくは約１００日から約１７０日であり、より好ましくは約１１０日から約１６０日であり、より好ましくは約１１０日から約１５０日であり、より好ましくは約１２０日から約１４０日であり、より好ましくは約１３０日である。

約０日から約２７０日の期間についての定義には、以下の日数を含む：０日、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日、６０日、６１日、６２日、６３日、６４日、６５日、６６日、６７日、６８日、６９日、７０日、７１日、７２日、７３日、７４日、７５日、７６日、７７日、７８日、７９日、８０日、８１日、８２日、８３日、８４日、８５日、８６日、８７日、８８日、８９日、９０日、９１日、９２日、９３日、９４日、９５日、９６日、９７日、９８日、９９日、１００日、１０１日、１０２日、１０３日、１０４日、１０５日、１０６日、１０７日、１０８日、１０９日、１１０日、１１１日、１１２日、１１３日、１１４日、１１５日、１１６日、１１７日、１１８日、１１９日、１２０日、１２１日、１２２日、１２３日、１２４日、１２５日、１２６日、１２７日、１２８日、１２９日、１３０日、１３１日、１３２日、１３３日、１３４日、１３５日、１３６日、１３７日、１３８日、１３９日、１４０日、１４１日、１４２日、１４３日、１４４日、１４５日、１４６日、１４７日、１４８日、１４９日、１５０日、１５１日、１５２日、１５３日、１５４日、１５５日、１５６日、１５７日、１５８日、１５９日、１６０日、１６１日、１６２日、１６３日、１６４日、１６５日、１６６日、１６７日、１６８日、１６９日、１７０日、１７１日、１７２日、１７３日、１７４日、１７５日、１７６日、１７７日、１７８日、１７９日、１８０日、１８１日、１８２日、１８３日、１８４日、１８５日、１８６日、１８７日、１８８日、１８９日、１９０日、１９１日、１９２日、１９３日、１９４日、１９５日、１９６日、１９７日、１９８日、１９９日、２００日、２０１日、２０２日、２０３日、２０４日、２０５日、２０６日、２０７日、２０８日、２０９日、２１０日、２１１日、２１２日、２１３日、２１４日、２１５日、２１６日、２１７日、２１８日、２１９日、２２０日、２２１日、２２２日、２２３日、２２４日、２２５日、２２６日、２２７日、２２８日、２２９日、２３０日、２３１日、２３２日、２３３日、２３４日、２３５日、２３６日、２３７日、２３８日、２３９日、２４０日、２４１日、２４２日、２４３日、２４４日、２４５日、２４６日、２４７日、２４８日、２４９日、２５０日、２５１日、２５２日、２５３日、２５４日、２５５日、２５６日、２５７日、２５８日、２５９日、２６０日、２６１日、２６２日、２６３日、２６４日、２６５日、２６６日、２６７日、２６８日、２６９日、及び２７０日、並びに一部の日。

一実施形態では、ポリマーは、天然及び合成のペプチド又は多糖と結合する。

一実施形態では、ポリマーは、生物学的組織の修復を補助するために、１つ以上の細胞をさらに含むか、又はそれと適合性である。細胞は、線維芽細胞、内皮細胞、前駆細胞、又はそれらの混合物を含む再生細胞であってもよいが、これらに限定されない。

一実施形態では、１つ以上の細胞はポリマー全体にわたって比較的均一に分布する。

一実施形態では、ポリマー中の１つ以上の細胞の数は約１０^２細胞／ｍＬから約１０^８細胞／ｍＬである。別の実施形態では、ポリマー中の１以上の細胞の数は約１０^３細胞／ｍＬから約１０^５細胞／ｍＬである。

第２の態様では、第１の態様にしたがって定義されるポリマーの合成方法であって、所定のモル量の開始剤と、所定モル量の殺菌性／鎮痛性／抗炎症性モノマー単位と；それぞれ所定量の水溶性モノマー単位；機械的強度付与モノマー単位；タンパク質反応性モノマー単位；及び熱硬化性モノマー単位のうちの少なくとも３つとのフリーラジカル重合を含む。

一実施形態において、この方法は、ポリマーを約３２℃の水中で沈殿させて未反応モノマーを除去し、濾過して粗ＰＡＳポリマーを得る抽出工程をさらに含む。

一実施形態では、本方法は、沈殿したポリマーをエタノールに溶解し、約３２℃の水中に再沈殿させて精製ＰＡＳポリマーを提供する精製工程をさらに含む。

一実施形態では、使用前にポリマーを約４０℃の温度で約４８時間の間、減圧乾燥する。

一実施形態では、殺菌性／鎮痛性／抗炎症性モノマー単位は５−ＨＭＡ、４−ＨＭＡ、又はそれらの組み合わせであり、存在する場合、水溶性モノマー単位はＮＩＰＡＡｍであり；機械的強度付与モノマー単位はＮＡＳであり；タンパク質反応性モノマー単位はＰＬＡ／ＨＥＭＡであり；熱硬化性モノマー単位はＯＥＧＭＡである。

一実施形態では、５−ＨＭＡ、４−ＨＭＡ、及びそれらの組み合わせの所定モル量は、約５モル％であり；もし存在する場合、ＮＩＰＡＡｍの所定モル量は約６８モル％であり；ＮＡＳの所定のモル量は約１４モル％であり；ＰＬＡ／ＨＥＭＡの所定モル量は約８モル％であり；ＯＥＧＭＡの所定のモル量は約５モル％である。当業者はこれを代表例としてのみ認識するであろう；相対比率は、臨床的必要性に基づいて変更することができる。

第３の態様では、医療用途において、第１の態様にしたがって定義されたポリマーの使用がここに提供される。一実施形態では、医療用途は、外科用シーラント、創傷治癒用被覆剤、充填剤等としての用途を含むことができ、ポリマーは生体内での組織再生及び／又は試験管内での細胞増殖足場のために利用することができる。

第４の態様では、癌を含む医学的状態の治療における、第１の態様にしたがって定義されたポリマーの使用がここに提供される。一実施形態では、癌は肺癌を含むが、本明細書に開示されたポリマーは外科的シーラント特性を有し、出血しやすい任意の腫瘍除去処置への使用に適している。

第５の態様では、外科的シーリング、創傷の被覆の形成、空洞の充填の方法、又は生体内での組織発生足場を提供する方法がここに提供され、この方法は、そのような治療を必要とする対象に第１の態様にしたがって定義された有効量のポリマー投与することを含む。

第６の態様では、癌を含む医学的状態の治療方法であって、そのような処置を必要とする対象に有効量の、第一の態様にしたがって定義されたポリマーを投与することを含む方法が提供される。一実施形態において、癌は肺癌を含む。

さらに、第７に、本明細書においては医療キットが提供され、このキットは、第１の態様にしたがって定義されるポリマー；このポリマーと生物学的に適合するヒドロゲルとを組み合わせるための指示書；及び場合によりシリンジを含む。

本明細書において特定される本発明の各態様は、ＰＡＳポリマーそれ自体の特別な技術的特徴によって結び付けられている。したがって、本発明は、ＰＡＳポリマー、それらの商業的形態及びそれらの使用にある。

出願時点で出願人に知られている先行技術の情報に基づき、新規性は、ＰＡＳによって定義されるモノマー単位の特定の組合せを含むポリマーに存在する。

本発明のさらなる新規な態様には、以下のものが含まれる：ＰＡＳ（一般的かつ特異的な「調整」形態）の合成方法；医療用途（例えば、肺癌）におけるＰＡＳの使用；ＰＡＳを用いた（例えば肺癌の）医学的処置の方法；ＰＡＳ及び適合性ヒドロゲル（及び任意にシリンジ）を含む医療キット；及びヒドロゲル担体（すなわち、ＰＡＳＧｅｌ）内に組み込まれる場合のＰＡＳ。

出願人は、慢性炎症、低い宿主組織粘着性、低い生物学的活性、及び細胞傷害性架橋メカニズムのような、当技術分野における欠点を同定したため、ＰＡＳポリマーを求めていた。ＰＡＳポリマーは、それ自体が鎮痛及び抗炎症特性を示すサリチル酸のメタクリル酸エステル誘導体（５−ＨＭＡ、４−ＨＭＡ、又はそれらの組み合わせ）を含む。ＰＡＳは、親水性エチレングリコール（ＯＥＧＭＡ）セグメントの存在により水溶性である。このポリマーはまた、Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）セグメントを介して水溶液中のタンパク質と結合することができる。熱応答性画分（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ＮＩＰＡＡｍ）の存在は、さらなる試薬の添加を必要とせずに体温でヒドロゲル形成を誘導する。最後に、ＰＡＳポリマーは、ポリマーからのポリラクチド−−ｃｏ−２−ヒドロキシ−エチルメチルアクリレート（ＰＬＡ／ＨＥＭＡ）の開裂により生体吸収性である。

本発明のポリマー内に５つのモノマー単位がすべて存在することは、^１Ｈ ＮＭＲ（図２）によって確認されている。

ＰＡＳポリマーの生物学的及び物理的プロファイルが示される。例えば、ヒドロゲル担体（「ＰＡＳＧｅｌ」）内に組み込まれた場合のＰＡＳの生物学的有効性は、予備的な細胞適合性及び微生物コロニー計数試験によって示されている（それぞれ、図３及び図４）。さらに、ＰＡＳポリマーの圧縮強度及び引張強度（それぞれ３１１±４７ｋＰａ及び７８１±１１６ｋＰａ）並びに組織接着試験（図５）を分析することにより、有利な機械的特性が明らかになった。

ＰＡＳポリマー自体の好ましい形態は、ＮＩＰＡＡｍ（６８モル％）、ＮＡＳ（１４モル％）、ＰＬＡ／ＨＥＭＡ（８モル％）、ＯＥＧＭＡ（５モル％）、及び５−ＨＭＡ／４−ＨＭＡ（５モル％）を供給しながら、４，４’−アゾビス−４−シアノ吉草酸のような開始剤の存在下で合成されるＰＡＳであってもよい；この組成物は水溶性であり、３７℃でヒドロゲルを形成する。

既知の先行技術との直接的な差異は、サリチル酸が以前は３，５−ジ（アクリロイルオキシメチル）サリチル；３−メチル−Ｓ−アクリロイルオキシメチルサリチル酸（例えば、米国特許第３，２９０，２７０号参照）等の異なるモノマーと化学的に結合していた点にあり、これが、天然及び合成ペプチドと結合する能力を有する注射可能なサリチル酸ベースの熱硬化性ヒドロゲルのクラスが設計された最初のものである。これらの特性は、ＰＡＳＧｅｌの生分解特性及び組織接着挙動とともに、この生体材料を、現在満足されていない臨床上の課題に対処する適切な候補にする。

本出願人は、^１Ｈ ＮＭＲ分析を用いてＰＡＳポリマーの形成を確認した。また、試験管での試験により、サリチル酸の段階的な放出及びその生物学的活性が示された。また、出願人は、試験管内で、ＰＡＳＧｅｌの線維芽細胞との細胞適合性を確認した。物理的特徴付けの実験では、また、開発された材料の、創傷治癒及び組織工学のための適切な機械的性能を確認した。

マウスの皮下モデルを用いた生体内での細胞適合性試験が必要であり、短期間で実施される。この技術の有効性を保証するために、より複雑な動物モデル、例えば羊の肺出血も実施される。

＜ＰＡＳポリマー合成と分子特性解析＞
ＰＡＳポリマーの合成は、いくつかの予期せぬ課題を生じ、その各々は本出願人により本発明の方法で対処された。例えば、５−ＨＭＡモノマーの精製の間の、水とメタノールを使用することによるこのモノマーの再結晶化は、２つの溶媒の特定の体積比率（０．５：２、水：メタノール）を必要とし、これにより生成物の完全な溶解及び再結晶を確実にする。

第２に、ＰＡＳポリマーの合成中に、供給溶液中の開始剤（４，４’−アゾビス−４−シアノ吉草酸）のモル比を変えて、ＰＡＳポリマーの適切な重合度を保証した。最後に、ＰＡＳポリマーの合成の間に、５つの異なるモノマーが使用され、それぞれが互いの相溶性によって独特の課題を提示した。

５つのモノマーの供給量は、ある場合には、水溶性ポリマーを合成するように調整された。本出願人は、５モル％未満のＯＥＧＭＡで合成されたポリマーは水溶性ではないことを見出した。また、８モル％を超えるＯＥＧＭＡを含むＰＡＳポリマーは、３７℃でヒドロゲルに変換されなかった。したがって、ＰＡＳポリマーのこれらの製剤は、注射可能な生体材料の製造には適していなかった。複数の製剤を試験することにより、ＮＩＰＡＡｍ（６８モル％）、ＮＡＳ（１４モル％）、ＰＬＡ／ＨＥＭＡ（８モル％）、ＯＥＧＭＡ（５モル％）及び５−ＨＭＡ／４−ＨＭＡ（５モル％）を供給して合成されたＰＡＳは水溶性であり、３７℃でヒドロゲルを形成したことが実験的に見出された。ＰＡＳポリマーの組成を変更して、ＰＡＳＧｅｌの物理化学的特性を様々な生物学的用途のために調整するために、さらなる検討が必要である。

ＰＡＳ合成には市販のモノマー、例えばＮＩＰＡＡｍ、ＮＡＳ、ＯＥＧＭＡ、及び社内で予め合成したモノマーである、ＰＬＡ／ＨＥＭＡ、及び５−ＨＭＡを使用した。ＰＬＡ／ＨＥＭＡの合成方法はＤｉｊｋ−Ｗｏｌｔｈｕｌｓ，ｅｔ ａｌ．，［Ｔｓａｎｇａ，Ｂｏｓｃｈｂ ａｎｄ Ｄｉｊｋ−Ｗｏｌｔｈｕｌｓ；“Ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｂｌｅ ｄｅｘｔｒａｎｓ ｗｉｔｈ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｂｌｅ ｇｒｏｕｐｓ：ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅｄ ｄｅｘｔｒａｎ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｏｌｉｇｏｌａｃｔａｔｅ ｓｐａｃｅｒ”，Ｐｏｌｙｍｅｒ，３８，６２３５−６２４２，１９９７］により開発され、ＨＥＭＡ分子あたり６つの乳酸塩長を有するＰＬＡ／ＨＥＭＡの形成のために以前に最適化されていた［Ｆａｔｈｉ，Ｍｉｔｈｉｅｕｘ，Ｗｅｉ，Ｃｈｒｚａｎｏｗｓｋｉ，Ｖａｌｔｃｈｅｖ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ；“Ｅｌａｓｔｉｎ ｂａｓｅｄ ｃｅｌｌ−ｌａｄｅｎ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｗｉｔｈ ｔｕｎａｂｌｅ ｇｅｌａｔｉｏｎ，ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３５（２１），５４２５−５４３５，２０１４］。

＜５−ＨＭＡ（殺菌）モノマーの合成＞
ＰＡＳポリマーの合成に使用されるモノマーの１つである５−ＨＭＡの調製のための合成方法は、ＳａｎＲｏｍａｎ，ｅｔ ａｌ．［ａｎ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｔｕｄｙ ｉｓ ｓｈｏｗｎ ｉｎ Ｅｌｖｉｒａ ａｎｄ Ｓａｎ Ｒｏｍａｎ，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｉｓｏｍｅｒｉｃ ｍｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ４− ａｎｄ ５−ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄｓ”，Ｐｏｌｙｍｅｒ，３８，４７４３−４７５０，１９９７；ａｎｄ ａ ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ ｓｔｕｄｙ ｉｓ ｄｉｓｃｌｏｓｅｄ ｉｎ Ｅｌｖｉｒａ，Ｇａｌｌａｒｄｏ，Ｌａｃｒｏｉｘ，Ｓｃｈａｃｈｔ，Ｓａｎ Ｒｏｍａｎ，“Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｔｏ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｊ Ｍａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｍａｔｅｒ Ｍｅｄ，１２，５３５−５４２，２００１］に記載された方法から適合できる。

簡単に説明すると、５−ＨＭＡモノマーの合成方法は、最初にＥｌｖｉｒａ及びＳａｎＲｏｍａｎの引用文献に概説されている。その後、続く試験を通して、このモノマーを２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）で重合させた。本発明におけるＰＡＳポリマーの合成において、本出願人は、オリゴ（エチレングリコール）（ＯＥＧＭＡ）、Ｎ−アクリロキシスクシンイミドエステル（ＮＡＳ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）、及びポリラクチド（ＨＥＭＡ／ＰＬＡ）を５−ＨＭＡに結合した。得られる分子のそれぞれの及び全てのセグメントは、組織再生、薬物送達のための異なる臨床要求に対処し、手術用シーラントとしてＰＡＳＧｅｌを使用するために重要な役割を果たす。ＰＡＳＧｅｌの合成におけるこれらの様々なモノマーの機能を表２に要約する。

２−アミノ−５−ヒドロキシ安息香酸をメタクリロイルクロリドで選択的にアミド化することにより５−ＨＭＡを合成した。この目的のために、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中の５０％ｖ／ｖメタクリロイルクロリド溶液を、０．５ｍＬ／分の流速で、１０％ｗ／ｗの２−アミノ−５−ヒドロキシ安息香酸のＴＨＦ溶液に加えた。得られた溶液をコンデンサーを備えた窒素ブランケット下で３００ｒｐｍ及び４℃で６時間攪拌した。得られた官能化モノマー懸濁液を濾過して、懸濁した副生成物塩を除去した。

得られた透明な溶液をロータリーエバポレーターで４０℃、減圧下で乾燥させ、粘稠な褐色のペーストを生成させた。次いで、５−ＨＭＡモノマーペーストを水／メタノール溶液（４：１の体積比）に溶解し、４℃で水／メタノール溶液（１：２の体積比）で再結晶して未反応の２−アミノ−５−ヒドロキシ安息香酸、及びメタクリロイルクロライドを除去した。ベージュ色の結晶化モノマーを濾過により分離し、水／メタノールを用いて上記のように再結晶化プロセスを３回繰り返して、高度に精製した５−ＨＭＡモノマーを得た。

本明細書に開示されているように、４−ＨＭＡは、５−ＨＭＡの代わりに、又は５−ＨＭＡと組み合わせて使用することができる；Ｃ．Ｅｌｖｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ，３８（１８），４７４３−４７５０，１９９７に示されているように、殺菌効果はほぼ同じである。

＜ＰＡＳポリマーの合成＞
開始剤として０．３モル％の４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）を用いて７０℃、ＴＨＦ中でＮＩＰＡＡｍ（６８モル％）、ＮＡＳ（１４モル％）、ＰＬＡ／ＨＥＭＡ（８モル％）、ＯＥＧＭＡ（５モル％）及び５−ＨＭＡ（５モル％）のフリーラジカル重合によってＰＡＳポリマーを合成した。２４時間後、得られたポリマー溶液を３２℃の水中で沈殿させて、未反応モノマーを除去した。次いで、沈殿したポリマーをエタノールに溶解し、同じ条件下で水中に再沈殿させた。次いで、得られたポリマーを４０℃で４８時間減圧乾燥した。

図２では、ＰＡＳの５つの主要セグメントすべてに対応する結合が存在することにより、ポリマーの合成が成功したことが確認された。異なる量の供給モノマーを使用することにより、様々なＰＡＳポリマーを合成することができる。したがって、例示したＮＩＰＡＡｍ（６８モル％）、ＮＡＳ（１４モル％）、ＰＬＡ／ＨＥＭＡ（８モル％）、ＯＥＧＭＡ（５モル％）及び５−ＨＭＡ（５モル％）ポリマーは単に代表的なものである。特に、４−ＨＭＡ（５モル％）又は５−ＨＭＡ（例えば、２．５モル％）と４−ＨＭＡ（例えば、２．５モル％）との組み合わせを殺菌成分として適用することができる。

＜ペプチドヒドロゲルの形成及び細胞適合性＞
ＯＥＧＭＡ含量５モル％の合成ＰＡＳポリマーは水溶性であることが判明した。ポリマーのペプチド反応性を確認するために、ＧＲＧＤＳ（｛ＧＬＹ｝｛ＡＲＧ｝｛ＧＬＹ｝｛ＡＳＰ｝｛ＳＥＲ｝）合成ペプチドをモデルペプチドとして使用した。ＧＲＧＤＳは、細胞外マトリックス中の多くの接着タンパク質の細胞結合部位を模倣し、拡散した細胞を球状にして、剥離を引き起こす。ＧＲＧＤＳペプチドは、骨機能に関与することが最も報告されているインテグリンであるＶ３及びＩＩｂ３に対する中間的な親和性を有する。ＰＡＳ（１５０ｍｇ／ｍＬ）とＧＲＧＤＳ（１ｍｇ／ｍＬ）を混合し、４℃で８時間反応させた。次いで、得られたＰＡＳ−ｃｏ−ＧＲＧＤＳ（ＰＡＳＧｅｌ）溶液を、生理学的温度（例えば、３７℃）まで温度を上昇させてヒドロゲルに変換した。

ＰＡＳＧｅｌの細胞適合性特性を試験するために、線維芽細胞（ＧＭ３３４８）をＰＡＳＧｅｌヒドロゲルの構造内に７日間まで封入した。図３の結果は、生存細胞の数が培養後少なくとも７日間連続的に増加しているので、ヒドロゲルの細胞適合性が確認された。

ＰＡＳＧｅｌのユニークな生体分子構造は、（ａ）組織特異的細胞シグナル伝達を誘導するための、生物学的に活性なペプチドと、（ｂ）抗炎症性及び抗菌特性が証明されたサリチル酸の制御された二重送達を可能にする。ＧＲＧＤＳペプチドは分子構造ＰＡＳＧｅｌに化学的に結合していた。Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用して、ＰＡＳポリマーとペプチドとの間の共有結合の形成を確認した。この目的のために、ヒドロゲル形成後直ちに、ＰＡＳＧｅｌを温かいリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回完全に洗浄して構造ＰＡＳＧｅｌから未反応のＧＲＧＤＳを溶出させた。洗浄媒体中のペプチドの濃度をＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによって測定し、ＰＡＳＧｅｌ中の共有結合したＧＲＧＤＳの量を計算した。これらの結果は、ＧＲＧＤＳのほぼ９４％がＰＡＳＧｅｌの構造に共有結合していることを示した。生物学的に活性なサリチル酸を送達し、及び時間の経過に伴い放出するＰＡＳＧｅｌの能力もまた検討された。

化学結合の形成は、生体内での生物活性化合物の制御された送達を可能にするが、化合物の生物学的活性に破壊的に影響し得る。したがって、組み込まれたサリチル酸の活性は非常に重要である。この目的のために、本出願人は、ＰＡＳＧｅｌからの生理活性サリチル酸の段階的放出を確認するための指標として、組み込まれた５−ＨＭＡ／４−ＨＭＡの抗菌特性を評価した。

本出願人は、動的接触条件（ＡＳＴＭＥ ２１４９）下で標準試験方法をわずかに改変することによって、ＰＡＳＧｅｌの抗菌特性をＰＡＳＧｅｌ^ｎｅｇ（すなわち、ＰＡＳポリマーにサリチル酸を取り込まれていない）と比較した。手短に説明すれば、ＰＡＳＧｅｌ及びＰＡＳＧｅｌ^ｎｅｇヒドロゲルを無菌条件下で調製し、フィルター滅菌したＰＢＳ中で２１日間インキュベートした。予備的な結果は、この期間内のＰＡＳＧｅｌ及びＰＡＳＧｅｌ^ｎｅｇの全体的な分解速度がほぼ３０重量％であることを示した。異なる時点、例えば１日後、７日後及び２１日後のインキュベーション培地からのサンプルを使用して、これらのヒドロゲルの抗菌特性を経時的に分析した。

３つの大腸菌コロニーを接種ループで採取し、次いで、１日目、７日目、及び２１日目にＰＡＳＧｅｌ及びＰＡＳＧｅｌ^ｎｅｇの浸漬溶液３ｍＬに添加した。フィルター滅菌したＰＢＳも用いて、対照として３つのコロニーを増殖させた。次いで、微生物懸濁液を３７℃で５時間インキュベートした。連続希釈を行い、１０^−６及び１０^−７の希釈細菌懸濁液を栄養寒天プレートに１６時間接種し、次いでコロニー形成数（ＣＦＵ）を計算するためにコロニー数を数えた。

図４の微生物コロニー計数の結果は、１日及び７日間の浸漬後、対照群並びにＰＡＳＧｅｌ及びＰＡＳＧｅｌ^ｎｅｇ試料の洗浄媒体の間に有意差がないことを示した。しかしながら、２１日目の結果は、ＰＡＳＧｅｌ^ｎｅｇ試料及びＰＢＳ対照と比較して、ＰＡＳＧｅｌのコロニー数が３倍減少することが確認された。これらの結果は、ＰＡＳＧｅｌヒドロゲルの構造から切断されたサリチル酸の生物活性を確認するものである。さらに、経時的なサリチル酸の放出は、ＰＡＳＧｅｌヒドロゲルの構造内でのこの化合物の化学結合を示した。

＜組織接着＞
組織工学、薬物送達及び創傷被覆剤適用において、生体材料の組織接着性は、組織漏出等の臨床的合併症を防止するために非常に重要である。本出願人は、ＰＡＳＧｅｌのこの特性を評価するために、ブタ皮膚を用いたｅｘ ｖｉｖｏ ＡＳＴＭＤ３１６４−０３（２０１４）標準法を使用した。この分析のために、１００μＬのＰＡＳＧｅｌを用いて、０．５×０．５ｃｍ^２の領域を充填して、２枚のブタ皮膚を接着させた。

これらの２つの皮膚片を分離するように動かすための伸び力をインストロン５９４３で測定し、伸び力は７．５Ｎでプラトーに到達した。図５の結果は、ＰＡＳＧｅｌのせん断応力がほぼ１ＭＰａであることを示した。これらの結果は、ＰＡＳＧｅｌの高い組織接着特性を示した。

＜物理的特性＞
シミュレートされた生理学的条件では、ＰＡＳＧｅｌヒドロゲルがそれぞれ３１１±４７ｋＰａ及び７８１±１１６ｋＰａの圧縮及び引張り係数を示した。これらの機械的性能パラメータは、以前に開発された又は市販のヒドロゲルと比較して、最も重要である。例えば、軟骨修復のための臨床試験段階にあるＮｅｏｃａｒｔヒドロゲルは、１０ｋＰａ未満の圧縮弾性率を有する［Ａｈｍｅｄ ａｎｄ Ｈｉｎｃｋｅ，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｌｅｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ”Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ｂ Ｒｅｖ；１６，３０５−３２９，２０１０］、ＢｉｏＧｌｕｅ［ＣｒｙｏＬｉｆｅ：ＢｉｏＧｌｕｅ（Ｒ） Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ Ｃｏｎｔｒａｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ；ＦＤＡ Ｒｅｐ ２０１３］、ＰｒｏＧｅｌ［ＰｒｏＧｅｌ ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ Ｄａｔａ；ＦＤＡ Ｒｅｐ ２００８：１−２６］、及びＣｒｏｓｓｅａｌ［Ｃｒｏｓｓｅａｌ Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ Ｄａｔａ；ＦＤＡ Ｒｅｐ ２０１０］のような、外科的シーラントと比較して、ＰＡＳＧｅｌはより弾性的で機械的に堅牢である。これらの機械的性能の両方は、内外の創傷被覆及び組織再生にとって重要である。

＜ＰＡＳＧｅｌを使用して出血を予防する可能性＞
ＰＡＳＧｅｌが潜在的に、とりわけ以下のように使用されるかどうかを調べるための試験が行われた：
・内部出血シーラント；深部組織のための外科用シーラント；及び／又は
・欠陥部位の充填又は物理的封じ込めによって血液漏出を防止するために使用されることが意図される物理的凝固剤。

出血を防ぐためにＰＡＳＧｅｌを使用する可能性を決定するために使用した装置の概略図を図６に示す。本出願人は、この正の血圧及び血流に物理的に対処するためにＰＡＳＧｅｌを使用する可能性を確認するための装置を開発した。このモデルでは、内部欠陥部位の正の血圧は約３３ｍｍＨｇ（＝４５０ｍｍＨ_２Ｏ）であり、流速は３．７ｍｌ／分から５０．３ｍｌ／分であった（Ｔｏｎｄｅｖｏｌｄ＆Ｅｌｉａｓｅｎ，１９８２）。以下のパラメータを使用した：直径１ｃｍの配管、レイノルズ数は４２２９７（乱流）、流速を調整するためにバルブを使用し、「手術」の温度は約３４℃であった。

ＰＡＳポリマー（７５％のＮＩＰＡＡｍ、３モル％のＰＬＡ／ＨＥＭＡ、３の乳酸塩長、２モル％のＯＥＧＭＡ、１４モル％のＮＡＳ、及び６モル％のサリチル酸の製剤）をモデルペプチドであるＧＲＧＤＳと結合させることにより、ＰＡＳＧｅｌのモデル製剤を調整した。表３に示す結果は、最も厳しい条件（最高流速又は最高水圧のいずれか）において、試験したＰＡＳＧｅｌ製剤が血液凝固及び止血の自然形成のための十分な時間である、ほぼ５分間、血液の流れを物理的に止めることができることを示す。この結果は、創傷被覆剤及び外科用シーラント用に開発された生体材料の高い可能性を確認した。

潜在的な商業的適用に関して、本発明は、固有の抗炎症特性を有する在庫できる接着剤熱硬化性生体材料として訴求する。これらの特性は、つまり、外科用シーラント、創傷治癒被覆剤、充填剤及び生体内組織再生足場等の用途をもたらす。

本発明の他の商業形態は、直ちに使用できる液体（６カ月から１２カ月の貯蔵寿命で４℃で貯蔵する必要がある溶液形態のＰＡＳＧｅｌ）及び長持ちする粉末（凍結乾燥したポリマー粉末及び生理食塩水溶液が別々に提供される）を含んでいてもよい。キットは４℃で４時間、２つの部分を混合することにより、すぐに使用できる。このキットはより長い貯蔵寿命（例えば、２年）を有し、涼しい貯蔵条件の必要はない。

当業者であれば、本開示の広範な一般的な範囲から逸脱することなく、上述の実施形態に多くの変形及び／又は修正を行うことができることが理解できよう。したがって、本実施形態は、すべての点で例示的であり、限定的ではないとみなされるべきである。

Claims (12)

1. ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド−ｃｏ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート／ポリラクチド−ｃｏ−オリゴ（エチレングリコール）モノメチルエーテルメタクリレート−ｃｏ−サリチル酸）ポリマーをベースとするポリマーであって、
   ５−ＨＭＡ、４−ＨＭＡ、又はそれらの組み合わせから選択されるサリチル酸のメタクリル酸エステル誘導体を含む、少なくとも１つの殺菌性／鎮痛性／抗炎症性モノマー単位；
   おおよその相対モル比で、約５モル％未満の親水性エチレングリコール（ＯＥＧＭＡ）成分の形態の水溶性モノマー単位；
   ポリラクチド−ｃｏ−２−ヒドロキシ−エチルメチルアクリレート（ＰＬＡ／ＨＥＭＡ）の形態の機械的強度を付与するモノマー単位；
   Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）成分の形態のタンパク質／多糖類反応性モノマー単位；及び
   Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）成分の形態の熱硬化性モノマー単位；
   を含む、５元系のポリマー。
2. おおよその相対モル比で、ＮＩＰＡＡｍ（６８モル％）；ＮＡＳ（１４モル％）；ＰＬＡ／ＨＥＭＡ（８モル％）；ＯＥＧＭＡ（約５モル％未満）；並びに５−ＨＭＡ及び／又は４−ＨＭＡ（５モル％）を含む、請求項１に記載のポリマー。
3. 前記ポリマーが、天然及び合成のペプチド又は多糖類と結合することができる、請求項１または２に記載のポリマー。
4. 生物学的組織の修復を補助するための１以上の細胞を含む、ポリマーと細胞との複合体であって、
   前記ポリマーは請求項３に記載のポリマーであって、
   前記１以上の細胞が前記ポリマー全体にわたって比較的均一に分布し、
   ポリマー中の１以上の細胞の数が約１０ ^２ 細胞／ｍＬ〜約１０ ^８ 細胞／ｍＬ、好ましくは約１０ ^３ 細胞／ｍＬ〜約１０ ^５ 細胞／ｍＬである、ポリマーと細胞との複合体。
5. 一定のモル量の殺菌性／鎮痛性／抗炎症性モノマー単位と；それぞれ一定のモル量の水溶性モノマー単位；機械的強度を付与するモノマー単位；タンパク質反応性モノマー単位；及び熱硬化性モノマー単位のうちの少なくとも３種との、一定のモル量の開始剤のフリーラジカル重合を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のポリマーもしくはポリマーと細胞との複合体の合成方法。
6. 約３２℃で水中でポリマーを沈殿させて未反応モノマーを除去し、濾過する抽出工程をさらに含み、沈殿したポリマーをエタノールに溶解し、約３２℃で水中に再沈殿させる精製工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
7. 使用前にポリマーを約４０℃の温度で約４８時間、減圧下で乾燥させる、請求項６に記載の方法。
8. 請求項１〜４のいずれかに記載のポリマーもしくはポリマーと細胞との複合体からなる医薬。
9. 約０日〜約２７０日の期間にわたり、サリチル酸のメタクリル酸エステル誘導体からの殺菌性／鎮痛性／抗炎症性効果のバースト放出を防止するためのビヒクルを提供することによって、手術部位での時間ベースでの感染の発生率を減少させるために使用するための、請求項８に記載の医薬。
10. 外科用シーラント、創傷治癒被覆剤、充填剤、又は生体内組織再生又は試験管内細胞増殖足場を必要とする医学的状態の治療における使用のための、請求項８に記載の医薬。
11. 癌を含む医学的状態の治療における使用のための、請求項８に記載の医薬。
12. 肺癌の治療における使用のための、請求項８に記載の医薬。

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