JP6814788B2 - Ｃｄ２７４／ｐｄ−ｌ１遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法 - Google Patents

Description

関連出願への相互参照
本願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２０１０年４月６日出願の米国特許仮出願第６１／３２１，２６３号の利益を主張し、当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

発明の分野
本発明は、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現の特異的阻害に関する。

発明の背景
ＣＤ２７４またはＰＤ−Ｌ１は、マウス染色体１９上およびヒト染色体９上のＣＤ２７４遺伝子によりコードされる２９０アミノ酸のＩ型膜貫通タンパク質である。ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現は、例えば、ウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＨＴＬＶ等を含む）、バクテリア（例えば、ヘリコバクター・ピロリ(Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ)等を含む）、および寄生虫（例えば、マンソン住血吸虫(Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ)を含む）による慢性感染症に関与する免疫応答の回避に関係があるとされている。

ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現はまた、抗腫瘍免疫活性の抑制にも関係があるとされている。腫瘍は、宿主Ｔ細胞により認識され得る抗原を発現するが、腫瘍の免疫クリアランスはまれである。この失敗の一部は、腫瘍微環境による免疫抑制によるものである。多くの腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１の発現が、この抑制環境の構成要素であり、他の免疫抑制シグナルと協調して役割を果たす場合がある。ＰＤ−Ｌ１の発現は、乳房、肺、結腸、卵巣、黒色腫、膀胱、肝臓、唾液腺、胃、神経膠腫、甲状腺、胸腺上皮、頭部、および頸部を含む、多種多様の固形腫瘍における原位置で示されている（Ｂｒｏｗｎ ＪＡ ｅｔ ａｌ．，２００３．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７−６６、Ｄｏｎｇ Ｈ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７９３−８００、Ｈａｍａｎｉｓｈｉ Ｊ，ｅｔ ａｌ．２００７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０４：３３６０−６５、Ｓｔｒｏｍｅ ＳＥ ｅｔ ａｌ．２００３．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：６５０１−５、Ｉｎｍａｎ ＢＡ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｃａｎｃｅｒ １０９：１４９９−５０５、Ｋｏｎｉｓｈｉ Ｊ ｅｔ ａｌ．２００４．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：５０９４−１００、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｊ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６：１１７３−８２、Ｎｏｍｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：２１５１−５７、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＲＨ ｅｔ ａｌ．２００４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：１７１７４−７９、Ｗｕ Ｃ，Ｚｈｕ Ｙ，Ｊｉａｎｇ Ｊ，Ｚｈａｏ Ｊ，Ｚｈａｎｇ ＸＧ，Ｘｕ Ｎ．２００６．Ａｃｔａ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．１０８：１９−２４）。加えて、ＰＤ−１の発現は、腫瘍浸潤リンパ球上で上方調節され、腫瘍の免疫抑制の一因にもなり得る（Ｂｌａｎｋ Ｃ ｅｔ ａｌ．２００３．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：４５７４−８１）。卵巣癌では、ＰＤ−Ｌ１の発現は、上皮内と逆相関するが、ＣＤ８ Ｔ細胞を浸潤する間質とは逆相関せず、ＰＤ−Ｌ１が、ＣＤ８ Ｔ細胞の腫瘍内遊走を阻害することを示唆している（Ｈａｍａｎｉｓｈｉ Ｊ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０４：３３６０−６５）。ＰＤ−Ｌ１ｍＲＮＡの翻訳は、腫瘍形成の共通事象である、ＰＴＥＮの欠損およびその後のＡｋｔの活性化により亢進する（Ｐａｒｓａ ＡＴ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３：８４−８８）。最も重要なこととして、疾病の予後への腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１の発現に関連する研究は、ＰＤ−Ｌ１の発現が、腎臓、卵巣、膀胱、乳房、胃、および膵臓癌において、望ましくない予後と強く相関することを示している（Ｈａｍａｎｉｓｈｉ Ｊ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０４：３３６０−６５、Ｉｎｍａｎ ＢＡ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｃａｎｃｅｒ １０９：１４９９−５０５、Ｋｏｎｉｓｈｉ Ｊ ｅｔ ａｌ．２００４．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：５０９４−１００、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｊ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６：１１７３−８２、Ｎｏｍｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：２１５１−５７、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＲＨ ｅｔ ａｌ．２００４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：１７１７４−７９、Ｗｕ Ｃ，Ｚｈｕ Ｙ，Ｊｉａｎｇ Ｊ，Ｚｈａｏ Ｊ，Ｚｈａｎｇ ＸＧ，Ｘｕ Ｎ．２００６．Ａｃｔａ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．１０８：１９−２４）。加えて、これらの研究は、腫瘍における高レベルのＰＤ−Ｌ１の発現が、腫瘍の病期の進行を促進し、より深い組織構造に浸潤し得ることを示唆している。

ＰＤ−１経路はまた、血液学的悪性腫瘍においても役割を果たす場合がある。ＰＤ−Ｌ１は、複数の骨髄腫細胞に発現するが、正常な形質細胞には発現しない（Ｌｉｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｂｌｏｏｄ １１０：２９６−３０４）。ＰＤ−Ｌ１は、幾つかの一次Ｔ細胞リンパ腫、特に、未分化大細胞Ｔリンパ腫に発現される（Ｂｒｏｗｎ ＪＡ ｅｔ ａｌ．，２００３．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７−６６）。ＰＤ−１は、血管免疫芽球性リンパ腫のＴ細胞に高度に発現し、ＰＤ−Ｌ１は、関連した濾胞樹状細胞ネットワークに発現する（Ｄｏｒｆｍａｎ ＤＭ ｅｔ ａｌ．２００６．Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．３０：８０２−１０）。結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫において、リンパ球および／または組織球性（Ｌ＆Ｈ）細胞と関連するＴ細胞は、ＰＤ−１を発現する。ＰＤ−１の連結反応により誘発された遺伝子の読み出しを用いたマイクロアレイ解析は、腫瘍関連のＴ細胞が、ホジキンリンパ腫において原位置においてＰＤ−１シグナルに応答することを示唆している（Ｃｈｅｍｎｉｔｚ ＪＭ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｂｌｏｏｄ １１０：３２２６−３３）。ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１は、ＨＴＬＶ−１媒介性成人Ｔ細胞白血病およびリンパ腫において、ＣＤ４ Ｔ細胞上に発現する（Ｓｈｉｍａｕｃｈｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １２１：２５８５−９０）。これらの腫瘍細胞は、ＴＣＲシグナルに対して低応答性である。

動物モデルにおける研究は、腫瘍上でのＰＤ−Ｌ１が、Ｔ細胞の活性化および腫瘍細胞の溶解を阻害し、場合によっては、腫瘍特異的なＴ細胞死の増加をもたらすことを示す（Ｄｏｎｇ Ｈ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７９３−８００、Ｈｉｒａｎｏ Ｆ ｅｔ ａｌ．２００５．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：１０８９−９６）。また、腫瘍関連ＡＰＣは、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ経路を利用して、抗腫瘍Ｔ細胞応答を制御することもできる。腫瘍関連の脊髄性ＤＣの集団におけるＰＤ−Ｌ１の発現は、腫瘍環境因子により上方調節される（Ｃｕｒｉｅｌ ＴＪ ｅｔ ａｌ．２００３．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：５６２−６７）。Ｂ１６黒色腫の腫瘍を排出させるリンパ節における形質細胞様樹状細胞（ＤＣ）は、調整性Ｔ細胞の抑制活性を強く活性化するＩＤＯを発現する。ＩＤＯ処置された調整性Ｔ細胞の抑制活性は、ＩＤＯを発現するＤＣと接触する細胞を必要とした（Ｓｈａｒｍａ ＭＤ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１７：２５７０−８２）。

例えば、細胞または哺乳動物において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の媒介による切断をもたらす組成物および方法が、本明細書に記載される。また、腫瘍もしくは血液学的悪性腫瘍（例えば、卵巣癌もしくは黒色腫）、または感染症（例えば、ウイルス性肝炎）等の、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現により引き起こされる病態および疾患を治療するための、組成物および方法も記載される。

本明細書で使用される、「ｉＲＮＡ」という用語は、その用語が本明細書で定義される際、ＲＮＡを含有する剤を指し、これは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路によりＲＮＡ転写物の標的切断を媒介する。一実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、細胞または哺乳動物において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現の阻害をもたらす。あるいは、別の実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、細胞または哺乳動物において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現を活性化する。

本明細書で特徴となる組成物のｉＲＮＡは、３０ヌクレオチド長またはそれ未満、一般に、１９〜２４ヌクレオチド長でありＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を有するｄｓＲＮＡを包含する。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの領域を含む。

一実施形態において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を阻害するためのｉＲＮＡは、互いに相補的である少なくとも２つの配列を含む。ｉＲＮＡは、第１の配列を有するセンス鎖と、第２の配列を有するアンチセンス鎖とを含む。アンチセンス鎖は、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、相補性領域は、３０ヌクレオチド長またはそれ未満および少なくとも１５ヌクレオチド長である。一般に、ｉＲＮＡは、１９〜２４、例えば、１９〜２１ヌクレオチド長である。幾つかの実施形態において、ｉＲＮＡは、約１５〜約２５ヌクレオチド長であり、他の実施形態において、ｉＲＮＡは、約２５〜約３０ヌクレオチド長である。ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞との接触の際、ｉＲＮＡは、本明細書に記載される方法によりアッセイされるときなどに、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、または少なくとも４０％もしくはそれ以上阻害する。一実施形態において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１ｉＲＮＡは、安定な核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）において製剤化される。

一実施形態において、本明細書で特徴となるｉＲＮＡは、表２、表３、および表５のセンス配列からなる群から選択されるｄｓＲＮＡの第１の配列と、表２、表３、および表５の対応するアンチセンス配列からなる群から選択される第２の配列とを含む。本明細書で特徴となるｉＲＮＡ分子は、天然に存在するヌクレオチドを含むことができるか、または２'−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５'−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体に結合される末端ヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むことができる。または、修飾ヌクレオチドは、２'−デオキシ−２'−フルオロ修飾ヌクレオチド、２'−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２'−アミノ−修飾ヌクレオチド、２'−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基の群から選択され得る。一般に、そのような修飾配列は、表２、表３、および表５のセンス配列からなる群から選択される該ｉＲＮＡの第１の配列と、表２、表３、および表５の対応するアンチセンス配列からなる群から選択される第２の配列とに基づいている。

一実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、野生型ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１ＲＮＡ転写物を標的とし、別の実施形態において、該ｉＲＮＡは、突然変異体転写物（例えば、対立遺伝子変異体を担持するＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１ＲＮＡ）を標的とする。例えば、本発明のｉＲＮＡは、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）等の多型変異体を標的とすることができる。別の実施形態において、該ｉＲＮＡは、野生型および突然変異体ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１転写物の両方を標的とする。さらに別の実施形態において、該ｉＲＮＡは、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の転写物変異体を標的とする。

一実施形態において、本発明で特徴となるｉＲＮＡは、５'または３'非翻訳領域等のＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１ＲＮＡ転写物の非コード領域を標的とする。

一態様において、本発明の実施形態は、本発明で特徴となるｉＲＮＡのうちの少なくとも１つを含有する細胞を提供する。該細胞は、一般に、ヒト細胞等の哺乳動物細胞である。幾つかの実施形態において、該細胞は、癌または腫瘍細胞である。幾つかの実施形態において、該細胞は、免疫細胞である。

別の態様において、本発明の実施形態は、生物、一般に、ヒト対象における、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を阻害するための薬学的組成物を提供する。該組成物は、典型的には、本明細書に記載されるｉＲＮＡのうちの１つまたはそれ以上、および薬学的に許容される担体または送達ビヒクルを含む。一実施形態において、該組成物は、骨髄腫等の癌または悪性腫瘍を治療するために使用される。一実施形態において、該組成物は、ウイルス性肝炎感染等の感染症を治療するために使用される。

別の実施形態において、該薬学的組成物は、例えば、多くとも４週間ごとに１回、多くとも３週間ごとに１回、多くとも２週間ごとに１回、多くとも１週間ごとに１回、本明細書に記載される用量レジメンの投与用に製剤化される。別の実施形態において、該薬学的組成物の投与は、対象の残存する生存期間を含む、１ヶ月もしくはそれ以上の間、例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、もしくは６ヶ月、１年、もしくは５年、１０年もしくはそれ以上の１間維持することができる。

別の実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡを含有する組成物、例えば、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１を標的とするｄｓＲＮＡは、癌、または癌の症状を治療することが知られている剤等の非ｉＲＮＡ治療剤と共に投与される。別の実施形態において、例えば、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１を標的とするｄｓＲＮＡ等の本発明で特徴となるｉＲＮＡを含有する組成物は、免疫療法等の非ｉＲＮＡ治療レジメンと共に投与される。例えば、本発明で特徴となるｉＲＮＡは、腫瘍または他の悪性腫瘍の治療のために腫瘍ペプチド抗原ワクチン接種と共に投与することができる。別例において、本発明で特徴となるｉＲＮＡは、ＣＤ４細胞等の細胞集団の減少に伴って投与することができる。

別の実施形態において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１のｉＲＮＡは、患者に投与され、次いで、非ｉＲＮＡ剤または治療レジメンが、患者に投与される（または逆もまた同様）。別の実施形態において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１のｉＲＮＡおよび非ｉＲＮＡ治療剤または治療レジメンは、同時に投与される。一実施形態において、該治療剤は、例えば、黒色腫特異的なＴ細胞応答を増加させる黒色腫ペプチド等の腫瘍ペプチド抗原である。別の実施形態において、該治療レジメンは、患者からのＣＤ４細胞の減少を含む。

別の態様において、以下のステップを実施することにより、細胞におけるＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を阻害するための方法が、本明細書において提供される：
（ａ）二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を、該細胞に導入するステップであって、該ｄｓＲＮＡが互いに相補的である少なくとも２つの配列を含み、該ｄｓＲＮＡが、第１の配列を有するセンス鎖と第２の配列を有するアンチセンス鎖とを有し、該アンチセンス鎖が、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補的である相補性領域を有し、該相補性領域が、３０ヌクレオチド長またはそれ未満、すなわち、１５〜３０ヌクレオチド長、一般に、１９〜２４ヌクレオチド長であり、かつ、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞と接触すると、ｄｓＲＮＡが、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％またはそれ以上阻害するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で産生された細胞を、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を達成するために十分な時間維持し、それにより、細胞におけるＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を阻害するステップ。

別の態様において、本発明は、細胞または哺乳動物におけるＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を活性化するのに有用な方法および組成物を提供する。

別の態様において、本発明は、以下のステップを実施することにより、細胞におけるＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を調節するための方法を提供する：
（ａ）二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を、該細胞に導入するステップであって、該ｄｓＲＮＡが互いに相補的である少なくとも２つの配列を含み、該ｄｓＲＮＡが、第１の配列を有するセンス鎖と、第２の配列を有するアンチセンス鎖とを有し、該アンチセンス鎖が、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補的である相補性領域を有し、該相補性領域が、３０ヌクレオチド長またはそれ未満、すなわち、１５〜３０ヌクレオチド長、一般に、１９〜２４ヌクレオチド長であり、かつ、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞と接触すると、ｄｓＲＮＡが、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％またはそれ以上阻害するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で産生された細胞を、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を達成するかまたは該転写物の増加した発現を得るために十分な時間維持し、それにより、細胞におけるＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を調節するステップ。

一実施形態において、該方法は、抗原提示細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、骨髄樹状細胞、Ｂ細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、またはこれらの任意の組み合わせにおいて、遺伝子発現を阻害するための方法である。

別の実施形態において、該方法は、腫瘍細胞またはリンパ腫細胞における遺伝子発現を阻害するための方法である。

他の態様において、本発明は、腫瘍または他の悪性腫瘍等のＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現により媒介される病理過程を治療する、予防する、逆転させる、または管理するための方法を提供する。一実施形態において、該方法は、本発明で特徴となる治療上または予防上有効量のｉＲＮＡのうちの１つまたはそれ以上を、そのような治療、予防、逆転、または管理を必要とする患者に投与するステップを含む。一実施形態において、該患者は、腫瘍または血液学的悪性腫瘍を有する。別の実施形態において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１を標的とするｉＲＮＡの投与は、高い全身腫瘍組織量、転移の発生、または腫瘍もしくはリンパ腫細胞の増殖等の、患者におけるＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１媒介性障害の重度の少なくとも１つの症状を軽減または緩和する。

一態様において、本発明は、細胞におけるＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を阻害するためのベクターを提供する。一実施形態において、該ベクターは、本明細書に記載されるｉＲＮＡの少なくとも１本の鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合される少なくとも１つの調整配列を含む。別のそのような態様において、本発明は、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１ｍＲＮＡを切断のための標的とするｄｓＲＮＡをコードするベクターを提供し、該ｄｓＲＮＡは、１本の鎖の上に該ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１ｍＲＮＡに対する相補性領域を含み、該相補性領域は、３０塩基対長またはそれ未満の該ｄｓＲＮＡの二重鎖領域を供給する。

別の態様において、本発明は、細胞におけるＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を阻害するためのベクターを含有する細胞を提供する。該ベクターは、本明細書に記載されるｉＲＮＡのうちの１つの少なくとも１本の鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合される調整配列を含む。

さらに別の態様において、本発明は、病理的疾患に関与する第２の遺伝子を標的とし、例えば、腫瘍もしくは血液学的悪性腫瘍等の疾患を治療するのに有用である、第２のｉＲＮＡと組み合わせて、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１ｉＲＮＡを含有する組成物を提供する。例えば、該第２の遺伝子は、ＰＤ−１、すなわち、ＰＤＣＤ１をコードする遺伝子であり得る。

[本発明1001]
ＣＤ274／ＰＤ−Ｌ1の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、該ｄｓＲＮＡが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：415のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、かつ該アンチセンス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：416の対応するアンチセンスヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡ。
[本発明1002]
ＣＤ274／ＰＤ−Ｌ1の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、該ｄｓＲＮＡが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖が、ＣＤ274／ＰＤ−Ｌ1のＲＮＡ転写物に対する相補性領域を含み、該アンチセンス鎖が、表2、表3、または表5に列記されるアンチセンス配列のうちの1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡ。
[本発明1003]
少なくとも1個の修飾ヌクレオチドを含む、本発明1001または1002のｄｓＲＮＡ。
[本発明1004]
前記修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも1つが、2'−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、5'−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合される末端ヌクレオチドからなる群から選択される、本発明1003のｄｓＲＮＡ。
[本発明1005]
前記修飾ヌクレオチドが、2'−デオキシ−2'−フルオロ修飾ヌクレオチド、2'−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2'−アミノ−修飾ヌクレオチド、2'−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基からなる群から選択される、本発明1003のｄｓＲＮＡ。
[本発明1006]
前記相補性領域が、少なくとも17ヌクレオチド長である、本発明1002〜1005のいずれかのｄｓＲＮＡ。
[本発明1007]
前記相補性領域が、19〜21ヌクレオチド長である、本発明1002〜1005のいずれかのｄｓＲＮＡ。
[本発明1008]
前記相補性領域が、19ヌクレオチド長である、本発明1007のｄｓＲＮＡ。
[本発明1009]
それぞれの鎖が、30ヌクレオチド長以下である、本発明1001〜1008のいずれかのｄｓＲＮＡ。
[本発明1010]
少なくとも1本の鎖が、少なくとも1個のヌクレオチドの3'オーバーハングを含む、本発明1001〜1009のいずれかのｄｓＲＮＡ。
[本発明1011]
少なくとも1本の鎖が、少なくとも2個のヌクレオチドの3'オーバーハングを含む、本発明1001〜1010のいずれかのｄｓＲＮＡ。
[本発明1012]
リガンドをさらに含む、本発明1001〜1011のいずれかのｄｓＲＮＡ。
[本発明1013]
前記リガンドが、前記ｄｓＲＮＡの前記センス鎖の3'端に結合される、本発明1012のｄｓＲＮＡ。
[本発明1014]
前記相補性領域が、表2、表3、または表5のアンチセンス配列のうちの1つからなる、本発明1002〜1013のいずれかのｄｓＲＮＡ。
[本発明1015]
前記センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：415からなり、かつ前記アンチセンス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：416からなる、本発明1002〜1013のいずれかのｄｓＲＮＡ。
[本発明1016]
前記センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：371からなり、かつ前記アンチセンス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：372からなる、本発明1002〜1013のいずれかのｄｓＲＮＡ。
[本発明1017]
表2、表3、または表5から選択されるセンス鎖配列からなるセンス鎖と、表2、表3、または表5から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖とを含む、本発明1001〜1016のいずれかのｄｓＲＮＡ。
[本発明1018]
本発明1001〜1017のいずれかのｄｓＲＮＡを含有する、細胞。
[本発明1019]
本発明1001〜1017のいずれかのｄｓＲＮＡを含む、ＣＤ274／ＰＤ−Ｌ1遺伝子の発現を阻害するための薬学的組成物。
[本発明1020]
脂質製剤をさらに含む、本発明1019の薬学的組成物。
[本発明1021]
前記脂質製剤が、ＳＮＡＬＰ製剤またはＸＴＣ製剤である、本発明1020の薬学的組成物。
[本発明1022]
細胞におけるＣＤ274／ＰＤ−Ｌ1の発現を阻害する方法であって、
（ａ）本発明1001〜1017のいずれかのｄｓＲＮＡを、該細胞に導入するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で産生された細胞を、ＣＤ274／ＰＤ−Ｌ1遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を達成するために十分な時間維持し、それにより、該細胞における該ＣＤ274／ＰＤ−Ｌ1遺伝子の発現を阻害するステップと
を含む、方法。
[本発明1023]
前記ＣＤ274／ＰＤ−Ｌ1の発現を少なくとも30％阻害する、本発明1022の方法。
[本発明1024]
ＣＤ274／ＰＤ−Ｌ1の発現により媒介される障害を治療する方法であって、治療上有効量の、本発明1001〜1017のいずれかのｄｓＲＮＡまたは本発明1019〜1021のいずれかの薬学的組成物を、そのような治療を必要とするヒトに投与するステップを含む、方法。
[本発明1025]
前記ヒトが、癌または血液学的悪性腫瘍を患っている、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記ヒトが、感染症を患っている、本発明1024の方法。
[本発明1027]
前記感染症が、ウイルス性、細菌性、真菌性、または寄生虫性の疾患である、本発明1026の方法。
[本発明1028]
ウイルス性、細菌性、真菌性、または寄生虫性の前記疾患が、慢性感染症である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
前記ｄｓＲＮＡを対象の体重1ｋｇ当たり0．01ｍｇ〜5ｍｇの濃度で投与する、本発明1024〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
ＣＤ274／ＰＤ−Ｌ1ｍＲＮＡを切断のための標的とするｄｓＲＮＡをコードするベクターであって、該ｄｓＲＮＡが、1本の鎖の上に該ＣＤ274／ＰＤ−Ｌ1ｍＲＮＡに対する相補性領域を含み、該相補性領域が、30塩基対長またはそれ未満の該ｄｓＲＮＡの二重鎖領域を供給する、ベクター。
[本発明1031]
前記相補性領域が、少なくとも15ヌクレオチド長である、本発明1030のベクター。
[本発明1032]
前記相補性領域が、19〜21ヌクレオチド長である、本発明1030のベクター。
[本発明1033]
本発明1030〜1032のいずれかのベクターを含む、細胞。

本発明の様々な実施形態の詳細は、以下の説明に説明される。本発明の他の特長、目的、利点は、説明および図面から、および特許請求の範囲から明らかとなる。

ヒトＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１ｍＲＮＡの配列（参照配列ＮＭ＿０１４１４３．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６９）である。 マウスＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１ｍＲＮＡの配列（参照配列ＮＭ＿０２１８９３．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７０）である。 図２−１の続きを示す図である。 ラットＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１ｍＲＮＡのイソ型１の配列（参照配列ＸＭ＿００１０７９５７２．１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７１）である。 ラットＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１ｍＲＮＡのイソ型２の配列（参照配列ＸＭ＿５７４６５２．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７２）である。 図５Ａおよび５Ｂは、０．１ｎＭおよび１０ｎＭの濃度を比較している、表５の様々な阻害二重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７７〜９２４）を用いた代表的な実験的な発現データを示す。

ｉＲＮＡが、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子を標的とする場合、細胞または哺乳動物におけるＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を阻害するためにｉＲＮＡ、およびそれらを使用する方法が、本明細書に記載される。また、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現により引き起こされるまたは調節される、哺乳動物における癌または感染症等の病態および疾患を治療するための、組成物および方法も提供される。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる過程を通じてｍＲＮＡの配列に特異的な分解を導く。一実施形態において、該ｉＲＮＡは、ｉＲＮＡが、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子を標的とする場合、細胞または哺乳動物におけるＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を活性化する。

ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１
ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１は、７つのエクソンを含み、これらの第１のエクソンは、非コードであり、５'ＵＴＲを含有する。次の３つのエクソンは、それぞれ、シグナル配列、ＩｇＶ様ドメイン、およびＩｇＣ様ドメインを含有する。膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、次の２つのエクソン（エクソン５および６）内に含有される。最後のエクソンは、細胞内ドメインの残基に加えて３'ＵＴＲを含有する。ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の細胞内ドメインは、短く、わずか約３０ａａであり、全ての報告された種において、高度に保存される。ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の細胞内尾部に対して公知の機能がない。ヒトにおいて、エクソン２にコードされるＩｇＶ様ドメインを欠失する配列からなるＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の１つの報告されたスプライス変異体がある。このスプライス変異体の機能はまだ報告されていないが、この変異体がＰＤ−１に結合することができるはずはない。マウスＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１に対するスプライス変異体は、１つも特定されていない。その公知のリガンドのうちの１つのＰＤ−１へのＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の結合界面は、そのＩｇＶ様ドメインによるものである（Ｋｅｉｒ ＭＥ ｅｔ ａｌ．，２００８．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：６７７−７０４）。

ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１は、マウスＴおよびＢ細胞、ＤＣ、マクロファージ、間充織幹細胞、および骨髄由来肥満細胞に構成的に発現されることが示されている。ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現はまた、広範囲の非造血細胞に見出され、活性化した後、多くの細胞型において上方調節される。ＩＦＮ−γ刺激によって、ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、骨髄ＤＣ、Ｂ細胞、上皮細胞、および血管内皮細胞上に発現される（Ｆｌｉｅｓ ＤＢ ａｎｄ Ｃｈｅｎ Ｌ ２００７：Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３０（３）：２５１−６０）。ＰＤ−Ｌ１は、マクロファージに顕著に発現される。マウスにおいて、（Ｉ型ヘルパーＴ細胞またはＬＰＳおよびインターフェロンγの組み合わせにより誘発された）古典的に活性化されたマクロファージは、ＰＤ−Ｌ１を非常に上方調節することが示されている（Ｌｏｋｅ Ｐ ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ ＪＰ，２００３：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（９）：５３３６−４１）。あるいは、ＩＬ−４により活性化されたマクロファージ（代替のマクロファージ）は、ＰＤ−Ｌ１をわずかに上方調節する一方、ＰＤ−Ｌ２を非常に上方調節する。ＳＴＡＴ１が、ＬＰＳまたはインターフェロンγによるマクロファージにおけるＰＤ−Ｌ１の上方調節に主に関与するが、これらのマウスにおける活性化前に、その構成的発現には全く関与しないことが、ＳＴＡＴ１欠損ノックアウトマウスにより示されている。Ｉ型およびＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）は両方とも、ＰＤ−Ｌ１を上方調節する。ヒトＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１プロモーターの分析は、構成的および誘導的なＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現は両方とも、転写開始部位の２００〜３２０ｂｐ上流にある２つのＩＦＮ制限因子１（ＩＲＦ−１）結合部位に依存し、これらのＩＲＦ−１結合部位はまた、マウスにも見出されることを示す。幾つかの研究では、薬理学的阻害剤を用いることにより、どのシグナル経路がＰＤ−Ｌ１の発現に必要であるか検査されている。細胞株におけるＰＤ−Ｌ１の発現は、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６、およびＭＥＫが阻害されるとき、低下する。ＪＡＫ２もまた、ＰＤ−Ｌ１の誘発にも関係があるとされている。ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）の欠失または阻害、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）を修飾する細胞ホスファターゼ、およびＡｋｔシグナル伝達は、癌における転写後のＰＤ−Ｌ１の発現を増加させる（Ｋｅｉｒ ＭＥ ｅｔ ａｌ．，２００８．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：６７７−７０４）。

ＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ−１またはＢ７−１（ＣＤ８０）に関与し、ＴＣＲまたはＢＣＲシグナル伝達を修飾することにより、免疫応答に影響を及ぼすことができるが、ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞にシグナルを送達する、すなわち、ＰＤ−Ｌ１を通じて逆にシグナル伝達することもできる。表面プラズモン共鳴研究は、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との間の相互作用に対して１．７μＭの親和性および０．５μＭの親和性がある、ＰＤ−Ｌ１とＢ７−１の両方の間に特異的かつ独特な相互作用を示す。化学的架橋研究は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１のように、ＰＤ−Ｌ１およびＢ７−１もまた、それらのＩｇＶ様ドメインを通して相互に作用することもできることを示す。ＰＤ−Ｌ１：Ｂ７−１接合部分は、推定ＰＤ−Ｌ１：ＰＤ−１接合部分と少なくとも部分的に重なる。Ｂ７−１：ＰＤ−Ｌ１の相互作用は、阻害シグナルをＴ細胞に誘導することができる。Ｂ７−１によるＣＤ４ Ｔ細胞上のＰＤ−Ｌ１の連結反応、またはＰＤ−Ｌ１によるＣＤ４ Ｔ細胞上でのＢ７−１の連結反応は、機能的に有意な阻害シグナルを送達する。ＰＤ−Ｌ１およびＢ７−１の両方が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＤＣおよびマクロファージ上に発現するため、これらの細胞型におけるＢ７−１とＰＤ−Ｌ１との間の双方向相互作用に対する可能性がある。加えて、非造血細胞におけるＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞上のＢ７−１およびＰＤ−１と相互作用して、細胞を調節することができる（Ｋｅｉｒ ＭＥ ｅｔ ａｌ．，２００８．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：６７７−７０４）。

ＰＤ−１およびそのリガンドは、急性および慢性感染症を引き起こす微生物に対する免疫防御を調節するのに重要な役割を有する。ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ経路は、効果的な抗菌性免疫防御と免疫媒介性組織損傷との間の微妙な均衡を調整する、感染の結果の主な決定要因であると考えられる。

慢性感染症を引き起こす多くの微生物は、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ経路を利用して、免疫応答を回避し、持続感染を確立すると考えられる。慢性ウイルス感染症のリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ)（ＬＣＭＶ）モデルにおける研究は、まず、慢性感染の間、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ経路が果たす役割を示した（Ｂａｒｂｅｒ ＤＬ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｎａｔｕｒｅ ４３９：６８２−８７）。慢性感染症を引き起こすウイルスは、ウイルス特異的なＴ細胞を機能しない状態にし、それにより、抗ウイルス性Ｔ細胞応答を発現停止させることができる（Ｗｈｅｒｒｙ ＥＪ ａｎｄ Ａｈｍｅｄ Ｒ．２００４．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：５５３５−４５）。ＣＤ８ Ｔ細胞の機能的な異常調節または枯渇は、慢性感染の間、効果のないウイルス制御の重要な理由であり、マウスにおける慢性ＬＣＭＶ感染症、ならびにヒトにおけるＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＨＴＬＶ感染症、ならびに霊長類におけるＳＩＶ感染症の特徴である。

ヒトにおける慢性ウイルス感染症において、幾つかのグループは、ＰＤ−１の発現が、ＨＩＶ特異的な（Ｐｅｔｒｏｖａｓ Ｃ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３：２２８１−９２、Ｄａｙ ＣＬ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｎａｔｕｒｅ ４４３：３５０−５４、Ｔｒａｕｔｍａｎｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１２：１１９８−２０２）、ＨＢＶ特異的な（Ｂｏｅｔｔｌｅｒ Ｔ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：３５３２−４０、Ｂｏｎｉ Ｃ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：４２１５−２５）、およびＨＣＶ特異的な、Ｔ細胞（Ｕｒｂａｎｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１１３９８−４０３）上で高いことを示している。ＰＤ−Ｌ１はまた、慢性ＨＢＶ感染症を患っている患者における末梢血ＣＤ１４＋単球および脊髄ＤＣ上で（Ｃｈｅｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８：６６３４−４１、Ｇｅｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｊ．Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．１３：７２５−３３）、ならびにＨＩＶ患者におけるＣＤ１４＋細胞およびＴ細胞上で（Ｔｒａｂａｔｔｏｎｉ Ｄ ｅｔ ａｌ．２００３．Ｂｌｏｏｄ１０１：２５１４−２０）上方調節される。インビトロでのＰＤ−１：ＰＤ−Ｌの相互作用の遮断は、ＨＩＶ特異的な、ＨＢＶ特異的な（Ｂｏｎｉ Ｃ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：４２１５−２５）、ＨＣＶ特異的な、およびＳＩＶ特異的な（Ｖｅｌｕ Ｖ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：５８１９−２８）ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞の枯渇を覆し、増殖およびサイトカイン産生を回復させる（Ｐｅｔｒｏｖａｓ Ｃ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３：２２８１−９２、Ｄａｙ ＣＬ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｎａｔｕｒｅ ４４３：３５０−５４、Ｔｒａｕｔｍａｎｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１２：１１９８−２０２、Ｕｒｂａｎｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１１３９８−４０３）。最近の研究は、ＨＣＶコアのヌクレオカプシドタンパク質が、健常なドナーのＴ細胞上でのＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の発現を上方に調節することができ、ＰＤ−１の上方調節が、補体レセプターＣ１ＱＢＰとＨＣＶコアの相互作用により媒介されることを示している（Ｙａｏ ＺＱ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：２７６−８７）。

ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ経路はまた、細菌感染症の慢性化に重要な役割を果たすこともできる。ヘリコバクター・ピロリは、慢性胃炎および胃十二指腸潰瘍を引き起こし、胃癌の進行の危険因子である。ヘリコバクター・ピロリ感染の間、Ｔ細胞応答は、感染を一掃するのは不十分であり、これは、持続感染に至る。胃上皮細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現し、ヘリコバクター・ピロリ感染の間、重要なＡＰＣ（抗原提示細胞）機能を有すると考えられる。インビトロまたはインビボでヘリコバクター・ピロリに曝露した後、ＰＤ−Ｌ１はまた、ヒト胃上皮細胞上において上方調節される。抗ＰＤ−Ｌ１遮断抗体は、ヘリコバクター・ピロリに曝露した胃上皮細胞およびＣＤ４ Ｔ細胞の培養において、Ｔ細胞増殖およびＩＬ−２の産生を亢進させ、このことは、ＰＤ−Ｌ１が、ヘリコバクター・ピロリ感染の間、Ｔ細胞応答を阻害するのに重要な役割を果たし得ることを示唆している（Ｄａｓ Ｓ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６：３０００−９）。ＰＤ−Ｌ１は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｈｉＦｏｘＰ３^＋細胞集団の著しい増加を示す、ヘリコバクター・ピロリに感染した個人からの胃粘膜の生検において上方調節される。ヘリコバクター・ピロリに曝露した胃上皮細胞と共に培養された無処置のＴ細胞は、発達して機能的なＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｈｉＦｏｘＰ３^＋調節性Ｔ細胞になることができる（Ｂｅｓｗｉｃｋ ＥＪ，ｅｔ ａｌ．２００７．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．７５：４３３４−４１）。

寄生虫はまた、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ経路を利用して、強力な抑制機能を有するマクロファージも誘発する。マウスにおけるタエニア・クラッシケプス(Taenia crassiceps)感染の間、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、活性化マクロファージ上で上方調節され、高率のＣＤ４ Ｔ細胞は、ＰＤ−１を発現する。ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、またはＰＤ−１の封鎖は、タエニア感染したマウスからのマクロファージによりインビトロのＴ細胞増殖の抑制を著しく低下させた（Ｔｅｒｒａｚａｓ ＬＩ ｅｔ ａｌ．２００５．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．３５：１３４９−５８）。同様に、マウスにおけるマンソン住血吸虫感染の間、マクロファージは、高レベルのＰＤ−Ｌ１およびより低レベルのＰＤ−Ｌ２を発現する。抗ＰＤ−Ｌ１は、インビトロでのＴ細胞増殖を抑制するこれらのマクロファージの能力を完全に取り消したのに対して、抗ＰＤ−Ｌ２は効果がなかった。感染したマウスからのマクロファージ上におけるＰＤ−Ｌ１の発現は、感染してから１２週間後減少し、これは、Ｔ細胞アネルギーの中止と相互に関連がある（Ｓｍｉｔｈ Ｐ ｅｔ ａｌ．２００４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：１２４０−４８）。したがって、新たな主題は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２が、寄生虫感染の間、マクロファージの抑制機能を媒介することである。

ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、寄生原虫のメキシコリーシュマニアに対して免疫応答における異なる役割を有する。Ｃｄ２７４−／−１２９Ｓｖマウスは、メキシコリーシュマニアへの耐性を示す一方、Ｐｄｃｄ１ｌｇ２−／−マウスは、寄生虫負荷が増加する増悪疾患を発症した。Ｃｄ２７４−／−マウスは、減少したＴｈ２応答を示し、これは、Ｃｄ２７４−／−マウスの増大した耐性を説明することができる。Ｐｄｃｄ１ｌｇ２−／−マウスは、メキシコリーシュマニアに特異的なＩｇＭおよびＩｇＧ２ａの著しい増加を示し、これは、Ｐｄｃｄ１ｌｇ２−／−マウスにおいて観察された増悪疾患の一因となり得る。増加した寄生虫に特異的なＩｇＧの産生は、マクロファージ上でのＦｃγＲの連結反応による治癒反応を抑制し得る。

研究は、免疫病理を制限するのにＰＤ−Ｌ１が果たす役割を示す。ＬＣＭＶクローン１３による感染後、ＷＴマウスは、慢性感染症を発症する一方、Ｃｄ２７４−／−マウスは死亡する（Ｂａｒｂｅｒ ＤＬ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｎａｔｕｒｅ ４３９：６８２−８７）。骨髄キメラ研究は、エフェクターＴ細胞応答および免疫病理を制限するのに非骨髄由来細胞上のＰＤ−Ｌ１が果たす重要な役割を示す。

血管内皮細胞上のＰＤ−Ｌ１の発現は、内皮細胞上のＰＤ−Ｌ１が、血管壁に接触するＴ細胞の活性化を調節すること、Ｔ細胞の組織への溢出を調節すること、および／または免疫病理の有害な結果を制限することができるという仮説をもたらす。Ｃｄ２７４−／−Ｐｄｃｄ１ｌｇ２−／−マウスは、大幅に増加したアテローム性動脈硬化症の負荷を生じ、これは、ＰＤ−Ｌ１がまた、血管内皮およびＴ細胞が病因にとって重要である炎症性疾患において重要な役割も果たし得ることを示唆している（Ｇｏｔｓｍａｎ Ｉ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１７：２９７４−８２）。

二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる高度に保存された調節機序で、遺伝子発現を遮断することが示されている。ＷＯ９９／３２６１９（Ｆｉｒｅら）は、線虫における遺伝子の発現を阻害するための、少なくとも２５ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡの使用を開示している。また、ｄｓＲＮＡは、植物（例えば、ＷＯ９９／５３０５０、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、およびＷＯ９９／６１６３１、Ｈｅｉｆｅｔｚらを参照）、ショウジョウバエ（例えば、Ｙａｎｇ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（２０００）１０：１１９１−１２００を参照）、ならびに哺乳動物（ＷＯ００／４４８９５、Ｌｉｍｍｅｒ、およびＤＥ１０１ ００ ５８６．５、Ｋｒｅｕｔｚｅｒらを参照）を含む、他の生物において標的ＲＮＡを分解することが示されている。この天然機構は、現在、遺伝子の異常または望ましくない調節により生じる障害を治療するために新規のクラスの薬剤の開発において焦点となっている。

本明細書に記載される組成物のｉＲＮＡは、３０ヌクレオチド長またはそれ未満、すなわち、１５〜３０ヌクレオチド長、一般に、１９〜２４ヌクレオチド長である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、この領域は、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である。これらのｉＲＮＡの使用は、哺乳動物における、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現に関連する病理学に関係があるとされている遺伝子のｍＲＮＡの標的化分解を可能にする。特に、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１のｉＲＮＡの非常に低い投薬量は、特異的かつ効率的にＲＮＡｉを媒介することができ、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現の著しい阻害をもたらす。細胞に基づくアッセイ法を用いて、本発明者らは、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１を標的とするｉＲＮＡが、ＲＮＡｉを特異的かつ効率的に媒介することができ、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現の著しい阻害をもたらすことを実証している。したがって、これらのｉＲＮＡを含む方法および組成物は、癌、血液学的悪性腫瘍、または感染症、例えば、乳癌またはＢ型肝炎の治療において等、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１を下方調節することにより媒介され得る病理過程を治療するのに有用である。以下の詳細な説明は、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を阻害するための、ｉＲＮＡを含有する組成物の作製方法および使用方法、ならびにこの遺伝子の発現により引き起こされるもしくは調節される疾患および障害を治療するための、組成物および方法を開示する。

本発明で特徴となる薬学的組成物の実施形態は、薬学的に許容される担体と共に、３０ヌクレオチド長またはそれ未満、一般に、１９〜２４ヌクレオチド長であり、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である領域を含むアンチセンス鎖を有するｉＲＮＡを含む。また、本発明で特徴となる組成物の実施形態は、３０ヌクレオチド長またはそれ未満、一般に、１９〜２４ヌクレオチド長であり、かつＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である相補性領域を有するアンチセンス鎖を有するｉＲＮＡも含む。

したがって、幾つかの態様において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１のｉＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含有する薬学的組成物、該組成物を使用してＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を阻害する方法、ならびに該薬学的組成物を使用してＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現により引き起こされる疾患を治療する方法が、本発明で特徴となる。

Ｉ．定義
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される、特定の用語および語句の意味を以下に提供する。本明細書の他の部分の用語の用法と、本項で提供されるその定義との間に明らかな相違がある場合、本項の定義が優先される。

「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」、および「Ｕ」のそれぞれは、一般に、塩基としてそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルを含有するヌクレオチドを表す。しかしながら、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、以下でさらに詳述する修飾ヌクレオチド、または代替の置換部分も指すことができることが理解されよう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルが、かかる置換部分を担持するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対特性を実質的に変化させることなく、他の部分により置換可能であることを十分認識している。例えば、限定されないが、ヌクレオチドの塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対を形成することができる。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明で特徴となるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドと置換することができる。別例において、アデニンおよびシトシンは、オリゴヌクレオチド中のどこでも、標的ｍＲＮＡとＧ−Ｕゆらぎ塩基対を形成するために、それぞれ、グアニンおよびウラシルと置き換えることができる。そのような置換部分を含む配列は、本発明で特徴となる組成物および方法に適している。

本明細書で使用される、「プログラム死リガンド−１」（「ＰＤ−Ｌ１」）または「分化抗原群(ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ) ２７４」（「ＣＤ２７４」）とは、細胞内に発現した特定のポリペプチドを指す。また、ＰＤ−Ｌ１は、ＣＤ２７４、Ｂ７−Ｈ１、ＰＤＣＤ１Ｌ１、ＰＤＣＤ１ＬＧ１、およびＰＤＬ１としても知られる。ヒトＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ転写物の配列は、ＮＭ＿０１４１４３．２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６９）で見出され得る。マウスＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡの配列は、ＮＭ＿０２１８９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７０）で見出され得、ラットＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡの配列は、ＸＭ＿００１０７９５７２．１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７１）またはＸＭ＿５７４６５２．２；（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７２）で見出され得る。

本明細書で使用される、「ｉＲＮＡ」という用語は、その用語が本明細書で定義される場合、ＲＮＡを含有する剤を指し、これは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路によりＲＮＡ転写物の標的切断を媒介する。一実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現の阻害をもたらす。あるいは、別の実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現を活性化する。

本明細書で使用される、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の転写の間に形成される、ｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する部分を指す。配列の標的部分は、その部分でまたはその近くに、ｉＲＮＡ指向切断のための基質としての役割を果たすのに少なくとも十分な長さである。例えば、標的配列は、一般に、９〜３６ヌクレオチド長、例えば、１５〜３０ヌクレオチド長であり、これには、それらの間の全ての部分的な範囲が含まれる。限定されない例として、該標的配列は、１５〜３０ヌクレオチド、１５〜２６ヌクレオチド、１５〜２３ヌクレオチド、１５〜２２ヌクレオチド、１５〜２１ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、１５〜１９ヌクレオチド、１５〜１８ヌクレオチド、１５〜１７ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、１８〜２６ヌクレオチド、１８〜２３ヌクレオチド、１８〜２２ヌクレオチド、１８〜２１ヌクレオチド、１８〜２０ヌクレオチド、１９〜３０ヌクレオチド、１９〜２６ヌクレオチド、１９〜２３ヌクレオチド、１９〜２２ヌクレオチド、１９〜２１ヌクレオチド、１９〜２０ヌクレオチド、２０〜３０ヌクレオチド、２０〜２６ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、２０〜２４ヌクレオチド、２０〜２３ヌクレオチド、２０〜２２ヌクレオチド、２０〜２１ヌクレオチド、２１〜３０ヌクレオチド、２１〜２６ヌクレオチド、２１〜２５ヌクレオチド、２１〜２４ヌクレオチド、２１〜２３ヌクレオチド、または２１〜２２ヌクレオチドであり得る。

本明細書で使用される、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチド命名法を使用して言及される配列により説明される、ヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。

本明細書で使用される場合、別途記載のない限り、第２のヌクレオチド配列に関連して第１のヌクレオチド配列を説明するために使用される時の「相補的」という用語は、当業者には理解されるように、特定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドとハイブリダイズして二本鎖構造を形成する、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの能力を指す。かかる条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得、ストリンジェントな条件は、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１２〜１６時間５０℃もしくは７０℃、その後の洗浄を含み得る。生物内で遭遇され得る、生理学的な関連条件等の他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に応じて、２つの配列の相補性の試験に最も適切な、一連の条件を決定することができよう。

例えば、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ内の、ｉＲＮＡ内の相補配列は、ヌクレオチド配列の１つまたは両方の全長にわたる、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドに対する、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの塩基対形成が含まれる。かかる配列は、本明細書において、互いに対して「完全に相補的」と呼ぶことができる。しかしながら、第１の配列が、本明細書で第２の配列に対して「実質的に相補的」であると称される場合、２つの配列は、完全に相補的であり得るか、あるいは、例えば、ＲＩＳＣ経路により遺伝子発現の阻害等のそれらの最終的な用途に最も適した条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、最大３０塩基対（ｂｐ）までの二重鎖のためのハイブリダイズ時に、１個またはそれ以上であるが、一般に５、４、３、または２個を超えないミスマッチ塩基対を形成してもよい。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズ時に１つまたはそれ以上の単鎖のオーバーハングを形成するように設計される場合、かかるオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチとは見なされないものとする。例えば、２１ヌクレオチド長の１つのオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡであって、より長いオリゴヌクレオチドが、より短いオリゴヌクレオチドに完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡは、本明細書に記載の目的上、やはり「完全に相補的」であると称され得る。

また、本明細書で使用される、「相補」配列は、それらのハイブリダイズ能に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソンクリック塩基対、および／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含み得るか、または完全にそれらから形成され得る。かかる非ワトソンクリック塩基対には、Ｇ−Ｕゆらぎまたはフーグスティーン型塩基対が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書における「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、これらが使用される文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、またはｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基一致に対して使用され得る。

本明細書で使用される、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部に実質的に相補的」であるポリヌクレオチドは、対象となるｍＲＮＡ（例えば、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１をコードするｍＲＮＡ）の連続する部分に実質的に相補的であるポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１をコードするｍＲＮＡの中断されていない部分に実質的に相補的である場合、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。

本明細書で使用される、「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、２本の逆平行を含み、実質的に相補的な核酸構造である、ハイブリダイズされた二本鎖領域を有するＲＮＡ分子または分子の複合体を含むｉＲＮＡを指し、これら核酸構造は、標的ＲＮＡに対する「センス」および「アンチセンス」の配向を有すると称される。二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を通って所望の標的ＲＮＡの特異的な分解を可能にする任意の長さからなり得るが、一般に、９〜３６塩基対長、例えば、１５〜３０塩基対長の範囲に及ぶ。９〜３６塩基対の間の二本鎖を考慮すると、該二本鎖は、この範囲内の、例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６、および１５〜３０塩基対、１５〜２６塩基対、１５〜２３塩基対、１５〜２２塩基対、１５〜２１塩基対、１５〜２０塩基対、１５〜１９塩基対、１５〜１８塩基対、１５〜１７塩基対、１８〜３０塩基対、１８〜２６塩基対、１８〜２３塩基対、１８〜２２塩基対、１８〜２１塩基対、１８〜２０塩基対、１９〜３０塩基対、１９〜２６塩基対、１９〜２３塩基対、１９〜２２塩基対、１９〜２１塩基対、１９〜２０塩基対、２０〜３０塩基対、２０〜２６塩基対、２０〜２５塩基対、２０〜２４塩基対、２０〜２３塩基対、２０〜２２塩基対、２０〜２１塩基対、２１〜３０塩基対、２１〜２６塩基対、２１〜２５塩基対、２１〜２４塩基対、２１〜２３塩基対、または２１〜２２塩基対が挙げられるがこれらに限定されない、それらの間の任意の部分的な範囲の、任意の長さであり得る。ダイサーおよび類似の酵素で処理することにより細胞内で生成されたｄｓＲＮＡは、一般に、１９〜２２塩基対長の範囲内である。ｄｓＤＮＡの二本鎖領域の１本の鎖は、標的ＲＮＡの領域に実質的に相補的である配列を含む。二本鎖構造を形成する２本の鎖は、少なくとも１つの自己相補的な領域を有する単一のＲＮＡ分子に由来し得るか、または２つまたはそれ以上の別個のＲＮＡ分子から形成され得る。該二本鎖領域が、単一分子の２本の鎖から形成される場合、該分子は、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３'端と、それぞれのもう一方の鎖の５'端との間のヌクレオチドの一本鎖（本明細書では、「ヘアピンループ」と称される）により分離される二本鎖領域を有し得る。該ヘアピンループは、少なくとも１個の不対ヌクレオチドを含むことができ、幾つかの実施形態において、該ヘアピンループは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２３個またはそれ以上の不対ヌクレオチドを含むことができる。ｄｓＲＮＡの２つの実質的に相補的な鎖が、別個のＲＮＡ分子により含まれる場合、これらの分子は、共有結合的に結合される必要はないが、共有結合的に結合することができる。２本の鎖が、ヘアピンループ以外の手段により共有結合的に結合される場合、該結合構造は、「リンカー」と称される。また、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、上に記載の通り、ｄｓＲＮＡを指すように本明細書に使用される。

当業者は、「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」という用語が、発現される、もしくは自然に見出されるＲＮＡ分子だけでなく、本明細書に記載される、もしくは当技術分野で周知である１つまたはそれ以上のリボヌクレオチド／リボヌクレオシド類似体を含むＲＮＡの類似体および誘導体も包含されることを認識されよう。厳密に言えば、「リボヌクレオシド」は、ヌクレオシド塩基およびリボース糖を含み、「リボヌクレオチド」は、１つ、２つ、または３つのリン酸部分を有するリボヌクレオシドである。しかしながら、「リボヌクレオシド」および「リボヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される際、同等であると見なされ得る。ＲＮＡは、例えば、以下の本明細書に記載される、核酸塩基構造またはリボースリン酸骨格構造において、修飾され得る。しかしながら、リボヌクレオシド類似体または誘導体を含む分子は、二本鎖を形成する能力を保持しなければならない。限定されない例として、ＲＮＡ分子はまた、２'−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシド、５'ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合される末端ヌクレオシド、ロックドヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、２'−デオキシ−２'−フルオロ修飾ヌクレオシド、２'−アミノ−修飾ヌクレオシド、２'−アルキル−修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ホスホルアミデート、およびヌクレオシドを含む非天然塩基、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない、少なくとも１つの修飾リボヌクレオシドも含むことができる。あるいは、ＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子の全長に至るまでの少なくとも２個の修飾リボヌクレオシド、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個またはそれ以上の修飾リボヌクレオシドを含むことができる。この修飾物は、ＲＮＡ分子におけるそのような複数の修飾リボヌクレオシドのそれぞれに対して同一である必要はない。一実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物で用いることが企図される修飾ＲＮＡは、必要とされる二本鎖構造を形成する能力を有し、ＲＩＳＣ経路により標的ＲＮＡの特異的な分解を可能にするか、あるいは介在するペプチド核酸（ＰＮＡ）である。

一態様において、修飾リボヌクレオシドは、デオキシリボヌクレオシドを含む。そのような例において、ｉＲＮＡ剤は、例えば、ｄｓＲＮＡの二重鎖部分内でデオキシヌクレオシドオーバーハング（１つまたは複数）、または１つまたはそれ以上のデオキシヌクレオシドを含む、１つまたはそれ以上のデオキシヌクレオシドを含むことができる。しかしながら、いかなる場合でも、「ｉＲＮＡ」という用語により包含される二本鎖ＤＮＡ分子でないことは自明である。

一態様において、ＲＮＡ干渉剤は、標的ＲＮＡの切断を導くように、標的ＲＮＡ配列と相互に作用する一本鎖ＲＮＡを含む。理論に束縛されるものではないが、植物および無脊椎動物細胞に導入される長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして公知のＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによりｓｉＲＮＡに分解される（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００１，１５：４８５）。ダイサーは、リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であり、ｄｓＲＮＡを、特徴的な２塩基３'オーバーハングを有する１９〜２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにプロセシングする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次いで、ｓｉＲＮＡをＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組込み、１つまたはそれ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二重鎖を巻き戻し、相補的アンチセンス鎖が標的認識をガイドすることが可能となる（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合する際、ＲＩＳＣ内の１つまたはそれ以上のエンドヌクレアーゼが、標的を切断してサイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。したがって、一態様において、本発明は、標的遺伝子のサイレンシングに影響を及ぼすように、ＲＩＳＣ複合体の形成を促進する一本鎖ＲＮＡに関する。

本明細書で使用される、「ヌクレオチドオーバーハング」という用語は、例えば、ｄｓＲＮＡ等のｉＲＮＡの二本鎖構造から突出する少なくとも１個の不対ヌクレオチドを指す。例えば、ｄｓＲＮＡの鎖の３'端が、もう一方の鎖の５'端を越えて延びるか、またはその逆であるときに、ヌクレオチドオーバーハングがある。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１個のヌクレオチドのオーバーハングを含むことができ、または、該オーバーハングは、少なくとも２個のヌクレオチド、少なくとも３個のヌクレオチド、少なくとも４個のヌクレオチド、少なくとも５個のヌクレオチドまたはそれ以上を含むことができる。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含むこと、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含むこと、またはこれらからなることができる。該オーバーハング（１つまたは複数）は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその任意の組み合わせにおけるものであり得る。さらに、オーバーハングのヌクレオチド（１つまたは複数）は、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖あるいはセンス鎖のいずれかの５'端、３'端、または両端に存在し得る。

一実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３'端および／または５'端で１〜１０個のヌクレオチドオーバーハングを有する。一実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３'端および／または５'端で１〜１０個のヌクレオチドオーバーハングを有する。別の実施形態において、オーバーハング内のヌクレオチドのうちの１つまたはそれ以上が、ヌクレオシドチオリン酸と置換される。

ｄｓＲＮＡに関連して本明細書に使用される「平滑」または「平滑末端」という用語は、ｄｓＲＮＡの所定の末端で不対ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体がないこと、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。ｄｓＲＮＡの一方の端または両端が、平滑であり得る。ｄｓＲＮＡの両端が、平滑である場合、該ｄｓＲＮＡは、平滑末端であると言われる。明らかにするために、「平滑末端の」ｄｓＲＮＡは、両端で平滑であるｄｓＲＮＡであり、すなわち、該分子のいずれの端にもヌクレオチドオーバーハングがない。ほとんどの場合、そのような分子は、その全長にわたって二本鎖である。

「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」という用語は、標的配列に実質的に相補的である領域を含む、ｉＲＮＡの鎖、例えば、ｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書で使用される、「相補性領域」という用語は、配列、例えば本明細書において定義される標的配列に対して実質的に相補的である、アンチセンス鎖の領域を指す。相補性領域が、標的配列に対して完全に相補的でない場合、ミスマッチは、分子の内部または末端領域内にあり得る。一般に、最も許容されるミスマッチは、末端領域内、例えば、５'および／または３'末端の５、４、３、もしくは２ヌクレオチド内にある。

本明細書で使用される、「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語は、その用語が本明細書に定義されるアンチセンス鎖の領域に実質的に相補的である領域を含む、ｉＲＮＡの鎖を指す。

一実施形態において、本明細書で使用される、「ＳＮＡＬＰ」という用語は、安定な核酸脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰは、ｉＲＮＡ、またはｉＲＮＡが転写されるプラスミド等の核酸を含む、還元された水性内部をコーティングする、脂質の小胞を表す。ＳＮＡＬＰは、例えば、米国特許出願公開第２００６０２４００９３号、第２００７０１３５３７２号、および国際出願番号ＷＯ２００９０８２８１７に説明されている。これらの出願は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。「ＳＮＡＬＰ」製剤の例は、本明細書の他の箇所に説明されている。

ｉＲＮＡについて言及する際、「細胞への導入」とは、当業者には理解されるように、細胞への取り込みまたは吸収を促進すること、あるいは該取り込みまたは該吸収に影響を及ぼすことを意味する。ｉＲＮＡの吸収または取り込みは、支援を伴わない拡散過程もしくは細胞の能動的過程を通じて、または補助的な剤もしくは装置により発生し得る。この用語の意味は、インビトロでの細胞に限定されず、ｉＲＮＡは、該細胞が、生命体の一部である「細胞に導入」することもできる。そのような場合、細胞への導入は、該生物への送達を含む。例えば、インビボ送達については、ｉＲＮＡを組織部位に注射するか、または全身投与することができる。インビボ送達はまた、米国特許第５，０３２，４０１号および第５，６０７，６７７号、ならびに米国特許出願公開第２００５／０２８１７８１号に開示されるもの等のβグルカン送達システムによるものであり得、当該出願は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。細胞へのインビトロでの導入には、電気穿孔法およびリポフェクション法等の当該技術分野において既知の方法が含まれる。さらなるアプローチは、本明細書の以下に説明されているか、または当該技術分野において既知である。

本明細書で使用される、「〜の発現を調節する」という用語は、未処理の細胞におけるＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現と比較して、本明細書に記載されるｉＲＮＡ組成物により処理された細胞におけるＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現の少なくとも部分的な「阻害」または部分的な「活性化」を指す。

「活性化する」、「亢進させる」、「〜の発現を上方調節する」、「〜の発現を増加する」等の用語は、それらがＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子について言及する限り、本明細書において、第１の細胞もしくは細胞群と実質的に同一であるが、そのように処理されていない第２の細胞もしくは細胞群（対照細胞）と比較して、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子が転写され、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現が増加するように処理された第１の細胞もしくは細胞群から単離され得る、または検出され得る、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１ｍＲＮＡの量の増加により現れる、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現の少なくとも部分的な活性化を指す。

一実施形態において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現は、本明細書に記載されるｉＲＮＡの投与により、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％活性化される。幾つかの実施形態において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子は、本発明で特徴となるｉＲＮＡの投与により少なくとも約６０％、７０％、または８０％活性化される。幾つかの実施形態において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現は、本明細書に記載されるｉＲＮＡの投与により少なくとも約８５％、９０％、または９５％もしくはそれ以上活性化される。幾つかの実施形態において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現は、未処理の細胞における発現と比較して、本明細書に記載されるｉＲＮＡにより処理された細胞において、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍もしくはそれ以上増加する。小さいｄｓＲＮＡによる発現の活性化は、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３：１７３３７−４２、ＵＳ２００７０１１１９６３、ＵＳ２００５２２６８４８に説明されており、当該出願はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。

「発現停止させる」、「〜の発現を阻害する」、「〜の発現を下方制御する」、および「〜の発現を抑制する」等の用語は、それらがＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子について言及する限り、本明細書において、第１の細胞もしくは細胞群と実質的に同一であるが、そのように処理されていない第２の細胞もしくは細胞群（対照細胞）と比較して、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子が転写され、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現が阻害されるように処理された第１の細胞もしくは細胞群から単離され得る、または検出され得る、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１ｍＲＮＡの量の低下により現れる、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を指す。阻害の程度は、通常、以下で表される。

または、阻害の程度は、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現に機能的に結び付けられるパラメーター、例えばＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子によりコードされるタンパク質の量、または特定の表現型、例えばサイトカイン産生の欠如または低下を提示する細胞の数の低下に関して示され得る。原則的に、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現停止は、構成的に、またはゲノム工学によりのいずれか、ならびに任意の適切なアッセイ法により、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１を発現する任意の細胞において決定することができる。しかしながら、あるｉＲＮＡが特定の程度、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を阻害し、したがって本発明に包含されるかどうかを決定するために参照が必要とされる場合、以下の実施例で提供されるアッセイ法が、かかる参照の役割を果たす。

例えば、特定の場合において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現は、本発明で特徴となるｉＲＮＡの投与により少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％抑制される。幾つかの実施形態において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現は、本明細書に記載されるｉＲＮＡの投与により少なくとも約６０％、７０％、または８０％抑制される。幾つかの実施形態において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現は、本明細書に記載されるｉＲＮＡの投与により少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上抑制される。

ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現の文脈において本明細書で使用される、「治療する」、「治療」等の用語は、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現により媒介される病理過程の軽減または緩和を指す。本発明の文脈において、本明細書で以下に列挙される他の病態のうちのいずれかに関連する限り（ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現により媒介される病理過程以外）、「治療する」、「治療」等の用語は、かかる病態に関連する少なくとも１つの症状の軽減もしくは緩和、または悪性腫瘍または癌の進行の遅延、あるいは例えば肝炎ウイルスによる感染により引き起こされる肝炎等の感染により引き起こされる症状への感染性の生物のクリアランスの増加等の、かかる病態の進行もしくは予想された進行の遅延もしくは逆行を意味する。

疾患マーカーまたは症状の文脈において、「低下させる」とは、そのようなレベルの統計学的有意な低下を意味する。該低下は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％またはそれ以上であり得、そのような障害がない個人に対して正常範囲内として許容されるレベルまで減ることが好ましい。

本明細書で使用される、「治療上有効な量」および「予防上有効な量」という句は、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現により媒介される病理過程の処置、阻止、もしくは管理、またはＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現により媒介される病理過程の明らかな症状において、治療的有用性を提供する量を指す。治療上有効である具体的な量は、一般の医師が容易に決定することができ、例えば、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現により媒介される病理過程の種類、患者の病歴および年齢、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現により媒介される病理過程のステージ、ならびに他のＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現により媒介される病理過程を阻害する他の剤の投与等の、当該技術分野において既知の因子に依存して異なり得る。

本明細書で使用される、「薬学的組成物」は、薬理学上有効な量のｉＲＮＡと、薬学的に許容される担体とを含む。本明細書で使用される、「薬理学上有効な量」、「治療上有効な量」、または単に「有効量」は、目的とする薬理学的、治療的、または阻止的な結果を産生するのに効果的なｉＲＮＡの量を指す。例えば、ある臨床的治療が、疾患または障害に関連する測定可能なパラメーターにおいて、少なくとも１０％の低下があるときに有効であると見なされる場合、該疾患または障害を治療するための薬物の治療上有効な量は、該パラメーターにおける少なくとも１０％の低下をもたらすために必要な量である。例えば、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１を標的とするｉＲＮＡの治療上有効な量は、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１タンパク質レベルを少なくとも１０％低下させることができる。

「薬学的に許容される担体」という用語は、治療薬を投与するための担体を指す。かかる担体には、食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。該用語は、明確に、細胞培養培地を除く。経口投与される薬物について、薬学的に許容される担体には、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、着色剤、および防腐剤等の薬学的に許容される賦形剤が含まれるが、これらに限定されない。好適な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウムおよびカルシウム、リン酸ナトリウムおよびカルシウム、ならびにラクトースが含まれ、コーンスターチおよびアルギン酸が好適な崩壊剤である。結合剤にはデンプンおよびゼラチンを含むことができ、一方滑沢剤が存在する場合は、概してステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクであろう。所望の場合、錠剤をモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル等の材料でコーティングして、消化管内での吸収を遅らせることができる。薬物製剤に含まれる剤は、本明細書の以下にさらに説明される。

本明細書で使用される、「対象」は、哺乳動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、および他の非ヒト霊長類である。好ましい実施形態において、対象は、ヒトである。

本明細書で使用される、「ＸＸ」が数字である「ＬＮＰＸＸ」という用語はまた、本明細書で「ＡＦＸＸ」として称される。例えば、ＬＮＰ０９はまた、ＡＦ０９とも称され、ＬＮＰ１２はまた、ＡＦ１２としても公知であるか、あるいはＡＦ１２とも称される。

本明細書で使用される、「含んでいる」または「含む」という用語は、本発明に不可欠である組成物、方法、およびそれぞれのその成分（１つまたは複数）に関して使用されるが、不可欠であるかどうかにかかわらず特定されない要素を包含する余地がある。

本明細書で使用される、「〜から本質的になる」という用語は、所定の実施形態に必要とされるこれらの要素を指す。該用語は、本発明の実施形態の基本的および新規の、または機能特性（１つまたは複数）に物質的に影響を及ぼさない要素の存在を可能にする。

「〜からなる」という用語は、本明細書に記載される組成物、方法、およびそれぞれのその成分を指し、これらは、実施形態の説明に列挙されないあらゆる要素を除く。

ＩＩ．二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡ剤が、本明細書に記載される。一実施形態において、該ｉＲＮＡ剤は、細胞または哺乳動物内、例えば、癌もしくは感染症に罹患しているヒトにおけるＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含み、該ｄｓＲＮＡは、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補性領域を有する、アンチセンス鎖を含み、該相補性領域は、３０ヌクレオチド長またはそれ未満、一般に１９〜２４ヌクレオチド長であり、該ｄｓＲＮＡは、該ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子を発現する細胞と接触すると、例えば、ＰＣＲまたは分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベースの方法により、またはウエスタンブロット等によるタンパク質ベースの方法によりアッセイされる場合には、該ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を少なくとも１０％阻害する。一実施形態において、該ｉＲＮＡ剤は、細胞または哺乳動物におけるＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を活性化する。例えば、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、初代肝細胞、ＨｅｐＧ２細胞、初代培養細胞、または対象からの生体試料中等の細胞培養におけるＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現は、ｂＤＮＡもしくはＴａｑＭａｎアッセイ法等によるＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１ｍＲＮＡレベルを測定することにより、または例えば、ウエスタンブロット法もしくはフローサイトメトリー法を用いた免疫蛍光分析等によるタンパク質レベルを測定することによりアッセイすることができる。

ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが使用される条件下で、ハイブリダイズして二本鎖構造を形成するのに十分相補的である、２本のＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡのある鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に実質的に相補的であり、一般に完全に相補的である相補性領域を含む。該標的配列は、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現の間に形成されたｍＲＮＡの配列に由来し得る。もう一方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に相補的である領域を含み、その結果、２本の鎖は、好適な条件下で組み合わされると、ハイブリダイズして二本鎖構造を形成する。一般に、二本鎖構造は、１５〜３０塩基対を含み、より一般には、１８〜２５塩基対を含み、さらにより一般には、１９〜２４塩基対を含み、最も一般には、１９〜２１塩基対を含む。同様に、標的配列に対する相補性領域は、１５〜３０ヌクレオチド長を含み、より一般には、１８〜２５ヌクレオチド長を含み、さらにより一般には、１９〜２４ヌクレオチド長を含み、最も一般には、１９〜２１ヌクレオチド長を含む。幾つかの実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、１５〜２０ヌクレオチド長を含み、他の実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、２５〜３０ヌクレオチド長を含む。当業者が、認識するように、切断のために標的としたＲＮＡの標的領域は、ほとんどの場合、より大きいＲＮＡ分子の一部、しばしば、ｍＲＮＡ分子である。場合により、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、ＲＮＡｉ指向切断（すなわち、ＲＩＳＣ経路を通って切断）のための基質であるのに十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続する配列である。９塩基対と同じくらい短い二重鎖を有するｄｓＲＮＡは、ある状況下では、ＲＮＡｉ指向性ＲＮＡ切断を介在する。ほとんどの場合、標的は、少なくとも１５ヌクレオチド長、好ましくは、１５〜３０ヌクレオチド長である。

当業者はまた、二本鎖領域が、ｄｓＲＮＡの一次機能部分、例えば、９〜３６塩基対、例えば、１５〜３０塩基対等の二本鎖領域であることも認識されよう。したがって、一実施形態において、所望のＲＮＡを切断のための標的とする１５〜３０塩基対などの機能的二本鎖に処理されるようになる範囲内において、ＲＮＡ分子または３０塩基対を超える二本鎖領域を有するＲＮＡ分子の複合体は、ｄｓＲＮＡである。したがって、当業者は、一実施形態において、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることが認識されよう。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、天然に存在するｍｉＲＮＡではない。別の実施形態において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現を標的とするのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大きいｄｓＲＮＡの切断により標的細胞内に生成されない。

本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、１個またはそれ以上の単鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含み得る。該ｄｓＲＮＡは、以下でさらに説明されるように、当該技術分野において既知の標準的な方法、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されるもの等の自動ＤＮＡ合成装置の使用により、合成することができる。一実施形態において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子は、ヒトＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子である。別の実施形態において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子は、マウスまたはラットＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子である。特定の実施形態において、第１の配列は、表２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３６）、表３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３７〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６８）、および表５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７７〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２４）からのセンス配列を含むｄｓＲＮＡのセンス鎖であり、第２の配列は、表２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３６）、表３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３７〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６８）、および表５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７７〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２４）の対応するアンチセンス配列からなる群から選択される。表２、表３、および表５に示される標的配列のいずれか別の箇所を標的とする代替のｄｓＲＮＡ剤は、標的配列および隣接するＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１配列を使用して、容易に決定することができる。

一態様において、ｄｓＲＮＡは、少なくともヌクレオチド配列を含み、それにより、該センス鎖は、表２、表３、および表５に示されるセンス配列の群から選択され、該センス鎖の対応するアンチセンス鎖は、表２、表３、および表５から選択される。この態様において、２つの配列のうちの１つは、２つの配列のもう一方に相補的であり、該配列のうちの１つは、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現において生成されたｍＲＮＡの配列に実質的に相補的である。したがって、この態様において、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含み、１つのオリゴヌクレオチドは、表２、表３、および表５にあるセンス鎖として説明され、第２のオリゴヌクレオチドは、表２、表３、および表５からのセンス鎖の対応するアンチセンス鎖として説明される。本明細書の他の箇所に説明され、当該技術分野において既知であるように、ｄｓＲＮＡの相補配列はまた、別個のオリゴヌクレオチドにおけるものとは対照的に、単一核酸分子の自己相補的な領域として含有することもできる。

当業者は、２０〜２３個だが、特に２１個の塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉の誘発に特に効果的であるとして称賛を得ていることをよく認識している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ２００１，２０：６８７７−６８８８）。しかしながら、他の者は、より短いもしくはより長いＲＮＡ二本鎖構造が、同様に効果的であり得ることを見出している。上記の実施形態において、表２、表３、および表５に示されるオリゴヌクレオチド配列の性質のために、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、最小限２１ヌクレオチド長の少なくとも１本の鎖を含むことができる。一端または両端のわずかな数のヌクレオチドを差し引いた、表２、表３、および表５の配列のうちの１つを有するより短い二重鎖が、上記のｄｓＲＮＡと比較して、同様に効果的であり得ることは、当然予想され得る。したがって、表２、表３、および表５の配列のうちの１つからの、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０個もしくはそれ以上の連続するヌクレオチドの部分的配列を有するｄｓＲＮＡであって、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を阻害するそれらの能力が、完全な配列を含むｄｓＲＮＡの阻害から５、１０、１５、２０、２５、もしくは３０％以下まで異なるｄｓＲＮＡが、本発明に従って企図される。

加えて、表２、表３、および表５に示されるＲＮＡは、ＲＩＳＣの媒介による切断の影響を受けやすい、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１転写物内の部位を特定する。したがって、本発明は、そのような配列のうちの１つの配列内を標的とするｉＲＮＡをさらに特徴とする。本明細書で使用される、ｉＲＮＡは、ｉＲＮＡが、その特定の部位内のいずれかの箇所で転写物の切断を促す場合、ＲＮＡ転写物の特定の部位内を標的とすると言われる。そのようなｉＲＮＡは、一般に、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子内の選択した配列に隣接する領域から取られたさらなるヌクレオチド配列に連結される、表２、表３、および表５に示される配列のうちの１つからの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。

標的配列が、一般に、１５〜３０ヌクレオチド長であるとはいえ、任意の所定の標的ＲＮＡの切断を導くために、この範囲内の特定の配列の適合性において幅広いバリエーションがある。本明細書に提示される様々なソフトウェアパッケージおよび指針は、任意の所定の遺伝子標的に対する最適標的配列の特定のためのガイダンスを提供するが、所定のサイズ（限定されない例として、２１ヌクレオチド）の「ウインドウ」または「マスク」が、標的配列として機能し得るサイズ範囲内の配列を特定するために、文字通りまたは比喩的（例えば、インシリコを含む）に標的ＲＮＡ配列上に置かれる、経験的アプローチもまた、取ることができる。完全な一連の可能な配列が、選択された任意の所定の標的サイズに対して特定されるまで、初期の標的配列位置の１つのヌクレオチドの配列「ウインドウ」を徐々に上流または下流に移動させることにより、次の潜在的標的配列を特定することができる。最適化を行うこれらの配列を特定するために、（本明細書に記載されるまたは当該技術分野において既知であるアッセイ法を用いて）特定された配列の系統的合成および試験に加えて、この過程は、ｉＲＮＡ剤を用いて標的化したとき、標的遺伝子の発現の最良の阻害を媒介するこれらのＲＮＡ配列を特定することができる。したがって、例えば、表２、表３、および表５において特定される配列は、効果的な標的配列を示すが、同等もしくはより良好な阻害特徴を有する配列を特定するために、所定の配列の１ヌクレオチド上流または下流に、徐々に「ウインドウを移動させる（ｗａｌｋｉｎｇ ｔｈｅ ｗｉｎｄｏｗ）」ことにより、阻害効率のさらなる最適化を達成することができることが企図される。

さらに、例えば、表２、表３、および表５に特定される任意の配列については、より長いまたはより短い配列を生成するために、ヌクレオチドを系統的に付加するあるいは除去し、これらの配列およびその時点から標的ＲＮＡを上方または下方により長いまたはより短いサイズのウインドウを移動させることにより生成された配列を試験することにより、さらなる最適化を達成することができることが企図される。さらに、当該技術分野で知られている、または本明細書に記載される阻害アッセイ法において、これらの標的配列に基づくｉＲＮＡの有効性についての試験と、新規の候補標的を生成することへのこのアプローチを合わせることにより、阻害効率におけるさらなる改善をもたらすこともできる。さらになお、そのような最適化配列は、例えば、本明細書に記載されるもしくは当該技術分野で知られている修飾ヌクレオチドの導入により、オーバーハングの追加もしくは改変により、または発現阻害剤として該分子をさらに最適化するための当該技術分野で知られているおよび／または本明細書で論じられる他の修飾の付加（例えば、血清安定性の増加、または半減期の循環、熱安定性の増加、膜送達の亢進、特定の位置もしくは細胞型への標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用の増加、エンドソームからの放出の増加等）により調節することができる。

本明細書に記載されるｉＲＮＡは、標的配列との１つまたはそれ以上のミスマッチを含有することができる。一実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、３つ以下のミスマッチを含有する。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチの範囲が、相補性領域の中心に位置しないことが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、例えば、相補性領域の５'端もしくは３'端のいずれかからの最後の５個のヌクレオチド内に制限されることが好ましい。例えば、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の領域に相補的である２３ヌクレオチドｉＲＮＡ剤のＲＮＡ鎖において、該ＲＮＡ鎖は、一般には、中央の１３個のヌクレオチド内にはいかなるミスマッチも含有しない。本明細書に記載される方法または当該技術分野で既知の方法を使用して、標的配列とのミスマッチを含有するｉＲＮＡが、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現の阻害に効果的であるかどうかを判定することができる。ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現の阻害における、ミスマッチを有するｉＲＮＡの有効性を考慮することは、特にＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子内の特定の相補性領域が集団内に多型の配列多様性を有することが既知である場合に、重要である。

一実施形態において、ｄｓＲＮＡの少なくとも一端は、１〜４、一般には１または２個のヌクレオチドの、単鎖のヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、平滑末端の対応物と比較して予想外に優れた阻害特性を有し得る。さらに別の実施形態において、ｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、安定性または他の有益な特徴を亢進させるために化学修飾される。本発明で特徴となる核酸は、"Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，" Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるもの等の、当該技術分野において十分確立された方法により、合成および／または修飾することができ、該文献は、参照により本明細書に組み込まれる。修飾には、例えば、（ａ）例えば、５'端修飾（リン酸化反応、共役、逆結合等）、３'端修飾（共役、ＤＮＡヌクレオチド、逆結合等）等の末端修飾、（ｂ）塩基修飾、例えば、安定塩基、不安定塩基との置換、またはパートナーの広範なレパートリーとの塩基対合する塩基、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、または共役塩基、（ｃ）糖修飾（例えば、２'位または４'位で）、または糖の置換、ならびに（ｄ）ホスホジエステル結合の修飾もしくは置換を含む、骨格修飾が含まれる。本明細書に記載される実施形態に有用であるＲＮＡ化合物の具体例としては、修飾された骨格を含むか、または天然のヌクレオシド間結合を含まないＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。修飾された骨格を有するＲＮＡには、とりわけ、該骨格にリン原子を有しないものが含まれる。本明細書の目的上、また当該技術分野において時折言及されるように、それらのヌクレオシド間骨格にリン原子を有しない修飾されたＲＮＡも、オリゴヌクレオシドであると見なすことができる。特定の実施形態において、修飾されたＲＮＡは、そのヌクレオシド間骨格内にリン原子を有する。

修飾されたＲＮＡ骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３'−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３'−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに正常な３'−５'結合を有するボラノホスフェート、２'−５'結合したこれらの類似体、ならびにヌクレオシド単位の隣接する対が３'−５'から５'−３'へ、または２'−５'から５'−２'へ結合する、逆向きの極性を有するものを含むことができる。また、種々の塩、混合塩、および遊離酸形態も含まれる。

上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９５号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３１６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、第５，６２５，０５０号、第６，０２８，１８８号、第６，１２４，４４５号、第６，１６０，１０９号、第６，１６９，１７０号、第６，１７２，２０９号、第６，２３９，２６５号、第６，２７７，６０３号、第６，３２６，１９９号、第６，３４６，６１４号、第６，４４４，４２３号、第６，５３１，５９０号、第６，５３４，６３９号、第６，６０８，０３５号、第６，６８３，１６７号、第６，８５８，７１５号、第６，８６７，２９４号、第６，８７８，８０５号、第７，０１５，３１５号、第７，０４１，８１６号、第７，２７３，９３３号、第７，３２１，０２９号、および米国再発行特許第３９４６４号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。

その中にリン原子を含まない、修飾されたＲＮＡ骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１個またはそれ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成された）、シロキサン骨格、硫化物、スルホキシド、およびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびにＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ_２を混合した構成成分を有する他のもの、を有するものが含まれる。

上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、および第５，６７７，４３９号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。

好適なまたはｉＲＮＡにおいて使用されることを企図される、他のＲＮＡ模倣体において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、骨格が、新規の基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とハイブリダイズするために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているそのようなオリゴマー化合物の１つであるＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物では、ＲＮＡの糖骨格が、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格と置換される。核酸塩基は保持され、該骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に見出すことができる。

本発明で特徴となる幾つかの実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するＲＮＡ、およびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドを含み、特に上述の米国特許第５，４８９，６７７号の−−ＣＨ_２−−ＮＨ−−ＣＨ_２−−、−−ＣＨ_２−−Ｎ（ＣＨ_３）−−Ｏ−−ＣＨ_２−−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる］、−−ＣＨ_２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ_３）−−ＣＨ_２−−、−−ＣＨ_２−−Ｎ（ＣＨ_３）−−Ｎ（ＣＨ_３）−−ＣＨ_２−−、および−−Ｎ（ＣＨ_３）−−ＣＨ_２−−ＣＨ_２−−［式中、天然のホスホジエステル骨格は、−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ_２−−として表される］、および上述の米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で特徴となるＲＮＡは、上述の米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。

また、修飾されたＲＮＡは、１つまたはそれ以上の置換糖部分も含有することができる。ｉＲＮＡ、例えば、本明細書で特徴となるｄｓＲＮＡは、２'位に、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含むことができ、該アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換のＣ_１〜Ｃ_１０アルキルまたはＣ_２〜Ｃ_１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な適切な修飾には、Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、およびＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）］_２が含まれ、式中、ｎおよびｍは、１〜約１０である。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２'位に、Ｃ_１〜Ｃ_１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、もしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、ｉＲＮＡの薬物動態特性を改善するための基、またはｉＲＮＡの薬力学的特性を改善するための基、ならびに類似した特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。幾つかの実施形態において、該修飾には、２'−メトキシエトキシ（２'−Ｏ−−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３であり、２'−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２'−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６−５０４）、すなわち、アルコキシ−アルコキシ基が含まれる。別の例示的な修飾は、本明細書において以下の実施例に記載される、２'−ＤＭＡＯＥとしても知られる、２'−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基、ならびに、本明細書において以下の実施例にも記載される、２'−ジメチルアミノオキシエトキシエトキシ（当該技術分野において２'−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルもしくは２'−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２'−Ｏ−−ＣＨ_２−−Ｏ−−ＣＨ_２−−Ｎ（ＣＨ_２）_２である。

他の修飾には、２'−メトキシ（２'−ＯＣＨ_３）、２'−アミノプロポキシ（２'−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）、および２'−フルオロ（２'−Ｆ）が含まれる。同様の修飾を、ｉＲＮＡのＲＮＡ上の他の位置、特に３'末端ヌクレオチドもしくは２'−５'結合ｄｓＲＮＡ内の糖の３'位、および５'末端ヌクレオチドの５'位で行うこともできる。また、ｉＲＮＡは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖模倣体を有してもよい。かかる修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、および第５，７００，９２０号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許のうちのあるものは本出願により共同所有され、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。

ｉＲＮＡはまた、核酸塩基（当該技術分野ではしばしば単に「塩基」と称される）修飾または置換も含み得る。本明細書で使用される、「非修飾」もしくは「天然」の核酸塩基には、プリン塩基、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾された核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン等の、他の合成および天然の核酸塩基が含まれる。さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号で開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８で開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０で開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３で開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３で開示されるものが含まれる。これらの核酸塩基のうちの特定のものは、本発明で特徴となるオリゴマー化合物の結合親和性を高めるために、特に有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、例示的な塩基置換であり、２'−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされると、さらに特に有用である。

上記の修飾された核酸塩基の特定のもの、ならびに他の修飾された核酸塩基の調製を教示する代表的な米国特許には、上記の米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６８１，９４１号、第６，０１５，８８６号、第６，１４７，２００号、第６，１６６，１９７号、第６，２２２，０２５号、第６，２３５，８８７号、第６，３８０，３６８号、第６，５２８，６４０号、第６，６３９，０６２号、第６，６１７，４３８号、第７，０４５，６１０号、第７，４２７，６７２号、および第７，４９５，０８８号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれ、米国特許第５，７５０，６９２号も、参照により本明細書に組み込まれる。

ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つまたはそれ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を含むよう修飾されることもできる。ロックド核酸は、修飾リボース部分を有するヌクレオチドであり、該リボース部分は、２'および４'炭素を接続する追加の架橋を含む。この構造は、３'内部の構造的立体配座において、リボースを効果的に「ロックする」。ｓｉＲＮＡへのロックされた核酸の付加は、血清中のｓｉＲＮＡの安定性を増加させ、オフターゲット効果を減少させることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９−４４７、Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３−８４３、Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５−３１９３）。

ロックド核酸ヌクレオチドの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第６，２６８，４９０号、第６，６７０，４６１号、第６，７９４，４９９号、第６，９９８，４８４号、第７，０５３，２０７号、第７，０８４，１２５号、および第７，３９９，８４５号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許はそれぞれ、参照によりその全体か本明細書に組み込まれる。

本発明で特徴となるｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、該ｉＲＮＡの活性、細胞分布、薬物動態学的特徴またはｉＲＮＡの細胞取り込みを亢進させる、１つまたはそれ以上のリガンド、部分、または結合体の該ＲＮＡへの化学的結合を伴う。かかる部分には、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４：１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ベリル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６−３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１９９１，１０：１１１１−１１１８、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７−３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７−３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５，１４：９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３−９３７）等の脂質部分が含まれるが、これらに限定されない。

一実施形態において、リガンドは、取り込まれるｉＲＮＡ剤の分布、標的、または寿命を変化させる。好ましい実施形態において、リガンドは、例えば、そのようなリガンドがない種と比較して、例えば、分子、細胞、もしくは細胞型等の選択された標的、例えば、細胞内もしくは臓器の区画等の区画、体の組織、臓器、もしくは領域に対して強化した親和性を提供する。好ましいリガンドは、二重鎖核酸における二重鎖の対合に関与しない。

リガンドは、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、もしくはグロブリン）、または炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、またはヒアルロン酸）、または脂質等の自然発生する物質を含むことができる。該リガンドはまた、例えば、合成ポリアミノ酸等の合成ポリマー等の組み換えまたは合成分子であってもよい。ポリアミノ酸の例には、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ‐アスパラギン酸、ポリＬ‐グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが含まれる。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、偽ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはαへリックスペプチドが含まれる。

リガンドはまた、標的基、例えば細胞または組織標的剤、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば、腎細胞等の特定の細胞型に結合する抗体等も含むことができる。標的基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、またはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。

リガンドの他の例には、色素、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、親油性分子、例えばコレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド結合体（例えばアンテナペディア(ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ)ペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］_２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えばアスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えばイミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾール群、アクリジン−イミダゾール結合体、テトラアザマクロサイクルのＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが含まれる。

リガンドは、タンパク質、例えば糖タンパク質、またはペプチド、例えばコリガンド(ｃｏｌｉｇａｎｄ)に対する特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば癌細胞、内皮細胞、もしくは骨細胞等の特定の細胞型に結合する抗体であり得る。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含んでもよい。それらはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、または多価フコース等の非ペプチド種を含むこともできる。該リガンドは、例えば、リポ多糖体、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化因子、またはＮＦ−κＢの活性化因子であり得る。

該リガンドは、例えば、細胞骨格を破壊することにより、例えば、細胞の微小管、ミクロフィラメント、および／または中間径フィラメントを破壊することにより、細胞へのｉＲＮＡ剤の取り込みを高めることが可能な物質、例えば、薬物であり得る。該薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド、ラトルンクリンＡ、ファロイジン、スインホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡに結合されるリガンドは、薬物動態学的（ＰＫ）モジュレータとして作用する。「ＰＫモジュレータ」とは、薬物動態学的モジュレータを指す。ＰＫモジュレータには、脂肪親油物、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミン等が含まれる。例示的なＰＫモジュレータとしては、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチン等が挙げられるが、これらに限定されない。また、複数のホスホロチオアート結合を含むオリゴヌクレオチドも、血清タンパク質に結合することが知られており、したがって、骨格に複数のホスホロチオアート結合を含む短鎖オリゴヌクレオチド、例えば、約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基のオリゴヌクレオチドもまた、リガンドとして（例えば、ＰＫ調節リガンドとして）本発明に適用可能である。加えて、血清成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーもまた、本明細書に記載される実施形態において、ＰＫ調節リガンドとして用いるのに適切である。

容易に二分子層膜を通過することができない高分子薬物および親水性薬物分子に対して、細胞のエンドソーム／リソソーム区画への封入は、それらの作用部位への効果的な送達に対する最大の障害であると考えられる。近年、この問題に対処するために、多くのアプローチおよび戦略が考案されてきた。リポソーム製剤に関しては、製剤中の融合性脂質の使用が最も一般的なアプローチである（Ｓｉｎｇｈ，Ｒ．Ｓ．，Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ｏｎ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｅｆｆｉｃａｃｉｅｓ ｏｆ ｐＨ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ ｖｉａ Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ．Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１，７１３−７２３）。プロトン化および／またはｐＨにより誘発された立体配座の変化により、ｐＨ感受性エンドソーム分解性(endosomolytic)活性を示す他の成分は、荷電ポリマーおよびペプチドを含む。例は、Ｈｏｆｆｍａｎ，Ａ．Ｓ．，Ｓｔａｙｔｏｎ，Ｐ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００２）．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ "ｓｍａｒｔ" ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｔｈａｔ ｃａｎ ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ａｄｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３，９９２−９９９、Ｋａｋｕｄｏ，Ｃｈａｋｉ，Ｔ．，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ Ｅｑｕｉｐｐｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｐＨ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ：Ａｎ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｖｉｒａｌ−ｌｉｋｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３６，５６１８−５６２８、Ｙｅｓｓｉｎｅ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｌｅｒｏｕｘ，Ｊ．Ｃ．（２００４）．Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｐｏｌｙａｎｉｏｎｓ：ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ ｏｆ ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５６，９９９−１０２１、Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｓ．，ｖａｎ Ｒｏｏｙ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．（２００７）．Ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｉＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．３３１，２１１−４に見出され得る。それらは、概して、リポソームまたはリポプレックス等、薬物送達システムとの関連で使用されている。リポソーム製剤を使用する葉酸受容体媒介送達に対して、例えば、ｐＨ感受性融合ペプチドがリポソームに取り込まれ、取り込みプロセス中の薬物の排出を改善することにより、活性を亢進させることが示されている（Ｔｕｒｋ，Ｍ．Ｊ．，Ｒｅｄｄｙ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００２）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈａｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｆｏｌａｔｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｔ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｐＨｓがＢｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５５９，５６−６８に記載されている）。

ある実施形態において、本発明のエンドソーム分解性成分は、ｐＨ依存性膜活性および／または融合性を示す、ポリアニオン性ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体は、ペプチドを模倣するように設計される、小タンパク質様鎖であり得る。ペプチド模倣体は、分子の特性を変化させるための既存のペプチドの修飾から、または非天然アミノ酸もしくはそれらの類似体を使用した、ペプチド様分子の合成から生じ得る。ある実施形態において、それらは、ペプチドと比較して、改善された安定性および／または生物活性を有する。ある実施形態において、エンドソーム分解性成分は、エンドソームｐＨ（例えばｐＨ５〜６）においてその活性立体配座を取る。「活性」立体配座は、エンドソーム分解性成分が、エンドソームの溶解、および／またはエンドソームから細胞の細胞質への本発明のモジュール組成物もしくはその成分のいずれか（例えば核酸）の輸送を促進する、立体配座である。

化合物ライブラリーは、溶血アッセイ法を使用して、中性ｐＨに対してエンドソームｐＨにおけるそれらの異なる膜活性に対して、スクリーニングされ得る。本方法により単離される有望な候補を、本発明のモジュール組成物の成分として使用することができる。本発明の組成物および方法で使用するためのエンドソーム分解性成分を特定するための方法は、化合物ライブラリーを供給するステップ、血球をライブラリーのメンバーと接触させ、接触が生じる媒体のｐＨが制御されるステップ、化合物が、中性ｐＨ（例えば約ｐＨ７〜８）に対して低ｐＨ（例えば約ｐＨ５〜６）において、血球の異なる溶解を誘発するかどうかを判定するステップ、を含み得る。

例示的なエンドソーム分解性成分には、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，２６：２９６４−２９７２）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８：１５８１−１５８６）、およびそれらの誘導体（Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２，１５５９：５６−６８）が含まれる。ある実施形態において、エンドソーム分解性成分は、ｐＨの変化に反応した電荷の変化またはプロトン化を受ける化学基（例えばアミノ酸）を含有することができる。エンドソーム分解性成分は、直鎖または分岐鎖であってもよい。エンドソーム分解性成分の例示的な一次配列には、

が含まれる。

ある実施形態において、２つ以上のエンドソーム分解性成分は、本発明のｉＲＮＡ剤に組み込むことができる。幾つかの実施形態において、これは、同一エンドソーム分解性成分のうちの２つ以上をｉＲＮＡ剤に組み込むことを伴う。他の実施形態において、これは、２つまたはそれ以上の異なるエンドソーム分解性成分をｉＲＮＡ剤に組み込むことを伴う。

これらのエンドソーム分解性成分は、エンドソームｐＨにおいて立体配座を変化させることによりエンドソーム脱出を媒介することができる。ある実施形態において、エンドソーム分解性成分は、中性ｐＨにおけるランダムコイル立体配座で存在し、エンドソームｐＨにおいて両親媒性へリックスに再配置され得る。この立体配座遷移の結果として、これらのペプチドは、エンドソームの脂質膜に挿入し、細胞質へのエンドソーム内容物の漏出を引き起こし得る。立体配座遷移は、ｐＨ依存性であるため、エンドソーム分解性成分は、血中を循環する間は融合活性をほとんどまたは全く示すことができない（ｐＨ約７．４）。本明細書で使用される、「融合活性」は、エンドソーム分解性成分により脂質膜の破壊をもたらす活性として定義される。融合活性の一例は、エンドソーム溶解または漏出、およびエンドソームから細胞質への本発明のモジュール組成物の１つまたはそれ以上の成分（例えば核酸）の輸送をもたらす、エンドソーム分解性成分によるエンドソーム膜の破壊である。

本明細書に記載される溶血アッセイ法に加えて、好適なエンドソーム分解性成分は、当業者が他の方法を使用することにより試験および特定することができる。例えば、ｐＨ環境に依存した電荷変化に対応する化合物の能力は、例えば、細胞アッセイ法における通常の方法により試験することができる。ある実施形態において、試験化合物は、細胞と組み合わされるか、または細胞と接触され、該細胞は、例えば、エンドサイトーシスにより試験化合物を取り込むことが可能になる。次いで、エンドソーム調製物を接触した細胞から作製することができ、そのエンドソーム調製物は、対照細胞からのエンドソーム調製物と比較される。接触した細胞対対照細胞からのエンドソーム画分の変化、例えば、減少は、試験化合物が融合剤として機能することができることを示す。または、接触した細胞および対照細胞は、例えば、顕微鏡法により、例えば、光学または電子顕微鏡法により、細胞内のエンドソーム集団の差を判定するために評価することができる。試験化合物および／またはエンドソームは、例えば、エンドソーム漏出を定量化するために、標識化することができる。

別の種類のアッセイ法では、本明細書に記載するｉＲＮＡ剤は、１つまたはそれ以上の試験または推定融合剤を使用して構成される。ｉＲＮＡ剤は、容易な可視化のために標識化することができる。一旦ｉＲＮＡ剤が細胞により取り込まれると、エンドソーム脱出を促進するエンドソーム分解性成分の能力を、例えば、エンドソーム調製物の調製により、または細胞の細胞質内の標識化ｉＲＮＡ剤の可視化を可能にする顕微鏡技術により、評価することができる。ある他の実施形態において、遺伝子発現の阻害または任意の他の生理学的パラメーターが、エンドソーム脱出に対する代理マーカーとして使用されてもよい。

他の実施形態において、円偏光二色性分光法を使用して、ｐＨ依存性構造転移を示す化合物を特定することができる。

二段階アッセイ法もまた実施することができ、第１のアッセイ法は、ｐＨの変化に対応する試験化合物のみの能力を評価し、第２のアッセイ法は、ｐＨの変化に対応する試験化合物を含むモジュール組成物の能力を評価する。

脂質結合体
本明細書に記載される態様の一実施形態において、リガンドまたは結合体は、脂質または脂質に基づく分子である。そのような脂質または脂質に基づく分子は、好ましくは、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡに結合するリガンドは、標的組織、例えば、身体の非腎臓標的組織への結合体の分布を可能にする。例えば、該標的組織は、肝臓の実質細胞を含む、肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得る他の分子もまた、リガンドとして使用することができる。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンを使用することができる。脂質または脂質に基づくリガンドは、（ａ）結合体の分解に対する耐性を増大し、（ｂ）標的細胞または細胞膜への標的化または輸送を増大し、かつ／または（ｃ）血清タンパク質、例えばＨＳＡへの結合を調整するために使用することができる。

脂質に基づくリガンドを使用して、標的組織への結合体の結合を調整すること、例えば制御することができる。例えば、より強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質に基づくリガンドは、腎臓に対して標的化される可能性があまりなく、したがって、身体から排出される可能性があまりない。ＨＳＡとあまり強力には結合しない脂質または脂質に基づくリガンドを使用して、腎臓との結合体を標的化することができる。

好ましい実施形態において、脂質に基づくリガンドは、ＨＳＡに結合する。好ましくは、それは、結合体が好ましくは非腎臓組織に分布されるような十分な親和性でＨＳＡに結合する。しかしながら、親和性は、ＨＳＡ−リガンド結合が逆転され得ないほど強力ではない、というのが好ましい。

別の好ましい実施形態において、脂質に基づくリガンドは、ＨＳＡに弱く結合するか、あるいは全く結合しないため、結合体は、腎臓に分布されるのが好ましい。腎細胞に標的化される他の分子はまた、脂質に基づくリガンドの代わりに、またはそれに加えて使用することもできる。

別の態様において、該リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞により取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性または非悪性型の、例えば、癌細胞の望ましくない細胞増殖を特徴とする障害を治療するのに特に有用である。例示的なビタミンには、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが含まれる。他の例示的なビタミンには、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、あるいは癌細胞により取り込まれるその他のビタミンまたは栄養素が含まれる。また、ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も含まれる。

別の態様において、リガンドは、細胞透過剤、好ましくはらせん状細胞透過剤である。好ましくは、該剤は、両親媒性である。例示的な剤は、ｔａｔまたはアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）等のペプチドである。該剤がペプチドである場合、それは、ペプチジル模倣体、逆転異性体(ｉｎｖｅｒｔｏｍｅｒ)、非ペプチドまたは擬似ペプチド結合、ならびにＤアミノ酸の使用を含めて、修飾され得る。らせん状剤は、好ましくはαらせん剤であり、これは好ましくは親油性および疎油性相を有する。

細胞透過性ペプチド
本発明で用いるのに適しているペプチドは、例えば、ｔａｔまたはアンテノペディアペプチド等の天然ペプチド、合成ペプチド、またはペプチド模倣体であり得る。さらに、該ペプチドは、修飾ペプチドであり得、例えば、ペプチドは、非ペプチドまたは擬似ペプチド結合、およびＤアミノ酸を含むことができる。ペプチド模倣体（本明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然ペプチドに類似する明確な三次元構造にフォールディングすることが可能な分子である。ｉＲＮＡ剤へのペプチドおよびペプチド模倣体の結合は、例えば、細胞認識および吸収を亢進させることにより、ｉＲＮＡの薬物動態学的分布に影響を及ぼすことができる。ペプチドまたはペプチド模倣部分は、約５〜５０個のアミノ酸の長さ、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸の長さであり得る。

ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主としてＴｙｒ、Ｔｒｐ、またはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、構造規制ペプチド、または架橋ペプチドであり得る。別の代替例において、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含むことができる。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列

を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列

）も、標的化部分であり得る。ペプチド部分は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む大型極性分子を、細胞膜を横断して運搬することができる「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質に由来する配列

およびショウジョウバエアンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）タンパク質

は、送達ペプチドとして機能可能であることが見出されている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリーまたは１−ビーズ−１−化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから特定されたペプチド等の、ＤＮＡのランダム配列によりコードされ得る（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４，１９９１）。好ましくは、組み込まれたモノマー単位によりｄｓＲＮＡ剤に連結されたペプチドまたはペプチド模倣体は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチド、またはＲＧＤ模倣物等の細胞を標的化するペプチドである。ペプチド部分は、約５個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸の長さの範囲であり得る。ペプチド部分は、安定性または直接的な立体構造特性を増加させる等の、構造修飾を有し得る。下記に記載されている構造修飾のいずれかを使用することができる。

ＲＧＤペプチド部分を使用して、内皮系腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞等の腫瘍細胞を標的とすることができる（Ｚｉｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２：５１３９−４３，２００２）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含む、様々な他の組織の腫瘍に対するｄｓＲＮＡ剤の標的化を容易にすることができる（Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：７８３−７８７，２００１）。好ましくは、ＲＧＤペプチドは、腎臓に対するｉＲＮＡ剤の標的化を容易にするだろう。ＲＧＤペプチドは、直鎖であっても、環式であってもよく、修飾されていてもよく、例えば、特定の組織に対する標的化を容易にするためにグリコシル化またはメチル化されていてもよい。例えば、グリコシル化ＲＧＤペプチドは、α_Ｖβ_３を発現する腫瘍細胞にｉＲＮＡ剤を送達することができる（Ｈａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４２：３２６−３３６，２００１）。

増殖細胞内に濃縮されるマーカーを標的とするペプチドを使用することができ、例えば、ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣体は、癌細胞、特にαｖβ_３インテグリンを提示する細胞を標的とすることができる。したがって、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含有する環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチド、ならびに合成ＲＧＤ模倣物を使用することができる。ＲＧＤに加えて、αｖβ３インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。一般的に、そのようなリガンドを使用して、増殖細胞および血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を制御することができる。

「細胞透過性ペプチド」は、細胞、例えば、細菌細胞または真菌細胞等の微生物細胞、またはヒト細胞等の哺乳動物細胞を透過することが可能である。微生物の細胞を透過するペプチドは、例えば、α−ヘリックス直鎖ペプチド（例えば、ＬＬ−３７もしくはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−デフェンシン、β−デフェンシン、もしくはバクテネシン（ｂａｃｔｅｎｅｃｉｎ））、または１つもしくは２つの支配的なアミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ−３９もしくはインドリシジン）であり得る。細胞透過ペプチドは、核移行シグナル（ＮＬＳ）を含むこともできる。例えば、細胞透過ペプチドは、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメインおよびＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来する、ＭＰＧ等の二分両親媒性ペプチドであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３）。

炭水化物結合体
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、炭水化物結合体をさらに含む。炭水化物結合体は、本明細書に記載される、核酸、ならびにインビボでの治療上の使用に適している組成物のインビボ送達に有利である。本明細書で使用される、「炭水化物」とは、少なくとも６個の炭素原子を有する１つまたはそれ以上の単糖単位（直鎖、分岐、もしくは環状であり得る）から構成され、それぞれの炭素原子に酸素、窒素、または硫黄原子が結合しているそれ自体が炭水化物である化合物か、あるいはそれぞれが少なくとも６個の炭素原子を有する１つまたはそれ以上の単糖単位（直鎖、分岐、もしくは環状であり得る）から構成され、それぞれの炭素原子に酸素、窒素、または硫黄原子が結合している炭水化物部分をその一部として有する化合物のいずれかを指す。代表的な炭水化物には、糖類（単糖、二糖、三糖、および約４〜９個の単糖単位を含有するオリゴ糖）、ならびにデンプン、グリコーゲン、セルロース、および多糖ゴム等の多糖類が含まれる。特定の単糖には、Ｃ_５またはそれ以上（好ましくはＣ_５−Ｃ_８）の糖、二糖または三糖には、２つまたは３つの単糖単位（好ましくはＣ_５−Ｃ_８）を有する糖が含まれる。

一実施形態において、炭水化物結合体は、

からなる群から選択される。

本明細書に記載される実施形態で用いる別の代表的な炭水化物結合体としては、

が含まれるが、これに限定されず、式中、ＸまたはＹのうちの一方は、オリゴヌクレオチドであり、もう一方は、水素である。

幾つかの実施形態において、炭水化物結合体は、ＰＫモジュレータ、エンドソーム分解性リガンド、および細胞透過性ペプチド等であるが、これらに限定されない、他のリガンドをさらに含む。

リンカー
幾つかの実施形態において、本明細書に記載される結合体は、開裂可能または開裂不可能であり得る様々なリンカーを用いてｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに結合することができる。

「リンカー」または「リンカー基」という用語は、化合物の２つの部分を接続する有機部分を意味する。リンカーは、典型的に、直接結合または酸素もしくは硫黄等の原子、ＮＲ^８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＳＯ_２ＮＨ等の単位、または置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アリールヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール等であるが、これらに限定されない原子鎖、を含み、ここで１つまたはそれ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ_２、Ｎ（Ｒ^８）、Ｃ（Ｏ）、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のへテロ環式で中断または終了することができ、ここでＲ^８は、水素、アシル、脂肪族、もしくは置換脂肪族である。一実施形態において、リンカーは、１〜２４個の原子、好ましくは４〜２４個の原子、好ましくは６〜１８個の原子、より好ましくは８〜１８個の原子、最も好ましくは８〜１６個の原子である。

切断可能な結合基は、細胞の外では十分に安定しているが、標的細胞に進入すると、切断されて、リンカーが一緒に保持する２つの部分を放出するものである。好ましい実施形態において、切断可能な結合基は、対象体の血液中または第２の基準条件（例えば、血液または血清中に見出される条件を模倣するかまたは該条件に相当するように選択することができる）下よりも、標的細胞内でまたは第１の基準条件（例えば、細胞内の条件を模倣するかまたは該条件に相当するように選択することができる）下では、少なくとも１０倍急速に、好ましくは少なくとも１００倍急速に切断される。

切断可能な結合基は、切断剤、例えばｐＨ、酸化還元電位、または分解分子の存在に感受性である。一般的に、切断剤は、血清中または血液中よりも、細胞内部では、より行き渡っているか、またはより高いレベルもしくは活性で見出される。そのような分解剤の例には、特定の基質のために選択される酸化還元剤または基質特異性を有していない酸化還元剤、例えば、酸化もしくは還元酵素、または還元により酸化還元的に切断可能な結合基を分解することができる、細胞内に存在するメルカプタン等の還元剤；エステラーゼ；エンドソームまたは酸性環境を作り出すことができる剤、例えば５またはそれ以下のｐＨをもたらすもの；一般酸、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）、およびホスファターゼとして作用することにより、酸で切断可能な結合基を加水分解または分解することができる酵素が含まれる。

ジスルフィド結合等の切断可能な結合基は、ｐＨに感受性であり得る。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、平均細胞内ｐＨは、わずかに低く、約７．１〜７．３の範囲である。エンドソームは、５．５〜６．０の範囲のより酸性であるｐＨを有し、リソソームは、さらにより酸性である約５．０のｐＨを有する。幾つかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能な結合基を有し、それによりカチオン性脂質をリガンドから細胞内部にまたは細胞の所望の区画に放出するだろう。

リンカーは、特定の酵素により切断可能である切断可能な結合基を含むことができる。リンカーに組み込まれた切断可能な結合基のタイプは、標的とされる細胞に依存する場合がある。例えば、肝臓標的リガンドは、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に結合させることができる。肝細胞は、エステラーゼに富んでおり、したがって、リンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも肝細胞中ではより効率的に切断される。エステラーゼが豊富な他の細胞型には、肺、腎皮質、および精巣の細胞が含まれる。

肝細胞および滑膜細胞等の、ペプチダーゼが豊富な細胞型を標的とするとき、ペプチド結合を含有するリンカーを使用することができる。

一般的に、切断可能な候補結合基の適合性は、切断可能な候補結合基を切断する分解剤（または条件）の能力を試験することにより評価することができる。また、血液中でのまたは他の非標的組織と接触した際の切断耐性能力に関して、切断可能な候補結合基を試験することも望ましい。したがって、第１の条件と第２の条件との間の切断に対する相対的感受性を決定することができ、この場合、第１は、標的細胞中での切断を示すように選択され、第２は、他の組織または生物学的液体、例えば血液または血清中での切断を示すように選択される。評価は、無細胞系中、細胞中、細胞培養中、器官もしくは組織培養中、または動物全身で実施することができる。無細胞条件または培養条件で初期評価を行い、動物全身でさらに評価することにより確認することが有用であり得る。好ましい実施形態において、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞中において（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）少なくとも２、４、１０、または１００倍急速に切断される。

酸化還元的に切断可能な結合基
切断可能な結合基の１つのクラスは、還元または酸化時に切断される酸化還元的に切断可能な結合基である。還元的に切断可能な結合基の一例は、ジスルフィド結合基（−Ｓ−Ｓ−）である。切断可能な候補結合基が、好適な「還元的に切断可能な結合基」であるかどうか、または例えば特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的剤と共に使用するのに好適であるかどうかを判定するためには、本明細書に記載される方法を参考することができる。例えば、候補は、細胞、例えば標的細胞中で観察されるであろう切断速度を模倣する当該技術分野で公知の試薬を用いて、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）または他の還元剤と共にインキュベーションすることにより評価することができる。また、該候補は、血液または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価することもできる。好ましい実施形態において、候補化合物は、血液中で多くとも１０％切断される。好ましい実施形態において、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞中において（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）少なくとも２、４、１０、または１００倍急速に分解される。候補化合物の切断速度は、標準的酵素反応速度アッセイ法を用いて、細胞内媒質を模倣するように選択された条件下で判定し、細胞外媒質を模倣するように選択された条件と比較することができる。

ホスフェートに基づく切断可能な結合基
ホスフェートに基づく切断可能な結合基は、ホスフェート基を分解または加水分解する剤により切断される。細胞内のホスフェート基を切断する剤の例は、細胞内のホスファターゼ等の酵素である。ホスフェートに基づく結合基の例は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。これらの候補は、上記に記載されているものと同様な方法を用いて評価することができる。

酸で切断可能な結合基
酸で切断可能な結合基は、酸性条件下で切断される結合基である。好ましい実施形態において、酸で切断可能な結合基は、約６．５またはそれ以下のｐＨ（例えば、約６．０、５．５、または５．０またはそれ以下）を有する酸性環境中で、または一般酸として作用することができる酵素等の剤により切断される。細胞内では、エンドソームおよびリソソーム等の特定の低ｐＨ細胞小器官は、酸で切断可能な結合基に切断環境を供給することができる。酸で切断可能な結合基の例としては、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。酸で切断可能な基は、一般式−Ｃ＝ＮＮ−、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または−ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施形態は、エステル（アルコキシ基）の酸素に結合された炭素が、アリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルもしくはｔ−ブチル等の三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上記に記載されているものと同様な方法を用いて評価することができる。

エステルに基づく結合基
エステルに基づく切断可能な結合基は、細胞内のエステラーゼおよびアミダーゼ等の酵素により切断される。エステルに基づく切断可能な結合基の例としては、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。エステルの切断可能な結合基は、一般式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−を有する。これらの候補は、上記に記載されているものと同様な方法を用いて評価することができる。

ペプチドに基づく切断基
ペプチドに基づく切断可能な結合基は、細胞内のペプチダーゼおよびプロテアーゼ等の酵素により切断される。ペプチドに基づく切断可能な結合基は、アミノ酸間で形成されて、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチド等）およびポリペプチドを産生するペプチド結合である。ペプチドに基づく切断可能な基は、アミド基（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン間で形成することができる。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質を産生する特別な種類のアミド結合である。ペプチドに基づく切断基は、一般的に、アミノ酸間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質を産生するペプチド結合（つまり、アミド結合）に限定され、アミド官能基全体は含まない。ペプチドに基づく切断可能な結合基は、一般式−ＮＨＣＨＲ^ＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ^ＢＣ（Ｏ）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７６）を有し、Ｒ^ＡおよびＲ^Ｂは、２つの隣接したアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上記に記載されているものと同様な方法を用いて評価することができる。

リンカーを用いる代表的な炭水化物結合体としては、

が含まれるが、これらに限定されず、式中、ＸまたはＹのうちの一方は、オリゴヌクレオチドであり、もう一方は、水素である。

ＲＮＡ結合体の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号、第５，５９１，５８４号、第５，１０９，１２４号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，４１４，０７７号、第５，４８６，６０３号、第５，５１２，４３９号、第５，５７８，７１８号、第５，６０８，０４６号、第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８３５，２６３号、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、第５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号、第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号、および第５，６８８，９４１号、第６，２９４，６６４号、第６，３２０，０１７号、第６，５７６，７５２号、第６，７８３，９３１号、第６，９００，２９７号、第７，０３７，６４６号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。

ある化合物の全ての位置が一様に修飾されている必要はなく、実際、前述の修飾のうちの２つ以上を単一化合物に、あるいはさらにはｉＲＮＡ内の単一ヌクレオシドに組み込むことができる。また、本発明は、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物も含む。本発明の文脈において、「キメラの（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）」は、ｉＲＮＡ化合物であり、好ましくは、２つまたはそれ以上の化学的にはっきりと異なる領域を含有し、それぞれ、少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合は、ヌクレオチドからなる、ｄｓＲＮＡである。これらのｉＲＮＡは、典型的には、少なくとも１つの領域を含有し、該ｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、および／または標的核酸に対する結合親和性の増加を該ＲＮＡに付与するように、修飾される。ｉＲＮＡのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質としての役割を果たすことができる。一例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。ＲＮアーゼＨの活性化は、したがって、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害の効率を大きく亢進させる。したがって、キメラｄｓＲＮＡが使用されるとき、同一標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、しばしばより短いｉＲＮＡにより匹敵する結果を得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、および必要であれば、当該技術分野において既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技法により、日常的に検出することができる。

特定の場合において、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基により修飾され得る。多くの非リガンド分子が、ｉＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞取り込みを亢進させるためにｉＲＮＡに結合されており、かかる結合を行うための手順は、科学文献で入手可能である。かかる非リガンド部分には、コレステロール（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４−６１、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）等の脂質部分が含まれている。かかるＲＮＡ結合体の調製を教示する代表的な米国特許は、上に列記されている。典型的な結合プロトコルは、配列の１つまたはそれ以上の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を伴う。次いで、アミノ基を、適切なカップリングもしくは活性化試薬を使用して、結合される分子と反応させる。結合反応は、固体支持体に依然として結合されたＲＮＡを用いてか、または溶液相中でのＲＮＡの切断後に、実行することができる。典型的には、ＨＰＬＣによるＲＮＡ結合体の精製により、純粋な結合体を得る。

ｉＲＮＡの送達
ｉＲＮＡを必要とする対象へのｉＲＮＡの送達は、多くの異なる方法において達成することができる。インビボ送達は、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物を、対象に投与することにより直接行うことができる。または、送達は、ｉＲＮＡの発現をコードし、導く１つまたはそれ以上のベクターを投与することにより間接的に行うことができる。

ｉＲＮＡ組成物の送達
一般に、核酸分子を送達する任意の方法は、ｉＲＮＡと共に用いるために適合させることができる（例えば、Ａｋｈｔａｒ Ｓ．ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ ＲＬ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９−１４４およびＷＯ９４／０２５９５を参照されたく、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。しかしながら、インビボでｉＲＮＡ分子を首尾よく送達するために考慮される重要な以下の３つの因子がある：（ａ）送達された分子の生物学的安定性、（２）非特異的効果の防止、および（３）標的組織内の送達された分子の蓄積。ｉＲＮＡの非特異的効果は、局所投与により、例えば、組織（限定されない例として、腫瘍）への直接注射もしくは移植により、または調製物を局所的に投与することにより、最小限に抑えることができる。治療部位への局所投与は、剤の局所濃度を最大限にし、そうでなければ、剤により悪影響を及ぼされ得るまたは剤を分解し得る、全身組織への剤の曝露を制限し、投与するｉＲＮＡ分子の総量をより少なくすることが可能である。幾つかの研究は、ｉＲＮＡが局所に投与されるとき、遺伝子産物の成功したノックダウンを示している。例えば、カニクイザルにおける硝子体内注射によるＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼球内送達（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，ＭＪ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｒｅｔｉｎａ ２４：１３２−１３８）およびマウスにおける網膜下注射（Ｒｅｉｃｈ，ＳＪ．，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０−２１６）は両方とも、加齢に関連した黄斑変性の実験モデルにおける新血管形成を防ぐことを示した。加えて、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内投与は、腫瘍容積を低下させ（Ｐｉｌｌｅ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２６７−２７４）、担癌マウスの生存を延長させることができる（Ｋｉｍ，ＷＪ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３４３−３５０、Ｌｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：５１５−５２３）。ＲＮＡの干渉はまた、直接注射による中枢神経系への局所送達（Ｄｏｒｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３２：ｅ４９、Ｔａｎ，ＰＨ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５９−６６、Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ（２００２）ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８、Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２９：５２１−５２８、Ｔｈａｋｋｅｒ，ＥＲ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０−１７２７５、Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４−６０２）、および鼻内への注入による肺への局所送達（Ｈｏｗａｒｄ，ＫＡ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：４７６−４８４、Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０６７７−１０６８４、Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：５０−５５）による成功も示している。疾患の治療のためにｉＲＮＡの全身投与することについて、ＲＮＡは、修飾され得るか、または薬物送達システムを用いることができ、両方の方法は、インビボでのエンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの急速分解を妨げるように作用する。ＲＮＡまたは薬学的担体の修飾はまた、標的組織へのｉＲＮＡ組成物の標的化を可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避することもできる。ｉＲＮＡ分子は、細胞取り込みを亢進させ、分解を防止するコレステロール等の親油基への化学的結合により修飾することができる。例えば、親油性コレステロール部分に共役されるＡｐｏＢを対象とするｉＲＮＡは、マウスに全身投与し、肝臓および空腸の両方において、ａｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンをもたらした（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３−１７８）。アプタマーへのｉＲＮＡの結合は、前立腺癌のマウスモデルにおける腫瘍増殖を阻害し、腫瘍退行を媒介することが示されている（ＭｃＮａｍａｒａ，ＪＯ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００５−１０１５）。代替的な実施形態において、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム等の薬物送達システム、またはカチオン性送達システムを用いて送達することができる。正電荷を持つカチオン性送達システムは、（負電荷を持つ）ｉＲＮＡ分子の結合を促進し、また、負電荷を持つ細胞膜での相互作用を亢進させ、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｉＲＮＡに結合されることができるか、あるいは、ｉＲＮＡを包む小胞またはミセル（例えば、Ｋｉｍ ＳＨ．，ｅｔ ａｌ（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７−１１６を参照のこと）を形成するよう誘発されることができる。小胞またはミセルの形成は、全身投与の場合、ｉＲＮＡの分解をさらに防止する。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作製および投与するための方法は、十分当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３２７：７６１−７６６、Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：１２９１−１３００、Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７−２０５を参照されたく、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。ｉＲＮＡの全身投与に有用な薬物送達システムの幾つかの非限定的な例には、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３）、上記参照、Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．，ｅｔ ａｌ（２００３）、上記参照）、オリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、「固体核酸脂質粒子」（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１−１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：３２１−３２８、Ｐａｌ，Ａ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７−１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ．，ｅｔ ａｌ（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．Ａｕｇ １６ Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２−４８７）、およびポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ．，ｅｔ ａｌ（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１−６７、Ｙｏｏ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９−１８０４）が挙げられる。幾つかの実施形態において、ｉＲＮＡは、全身投与のためにシクロデキストリンを用いて複合体を形成する。ｉＲＮＡおよびシクロデキストリンの薬学的組成物を投与するための方法は、米国特許第７，４２７，６０５号に見出すことができ、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ベクターによりコードされるｄｓＲＮＡ
別の態様において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現することができる（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０、Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａらの国際ＰＣＴ公報番号ＷＯ００／２２１１３、Ｃｏｎｒａｄの国際ＰＣＴ公報番号ＷＯ００／２２１１４、およびＣｏｎｒａｄの米国特許第６，０５４，２９９号を参照のこと）。発現は、使用された特定の構築物および標的組織または細胞型に依存して、一時的（およそ数時間から数週間）または持続的（数週間から数ヶ月またはそれ以上）であり得る。これらの導入遺伝子は、線状構築物、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができ、これらは、組み込み型ベクターまたは非組み込み型ベクターであり得る。また、導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして受け継がれるのを可能にするように、構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。

ｉＲＮＡの個々の１つまたは複数の鎖を、発現ベクター上のプロモーターから転写することができる。２つの別個の鎖は発現されて生成する場合、例えば、ｄｓＲＮＡ、２つの別個の発現ベクターは、標的細胞に、（例えば、形質移入または感染により）共導入することができる。あるいは、ｄｓＲＮＡのそれぞれ個々の鎖を、いずれも同一発現プラスミド上に位置するプロモーターで転写することができる。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステムアンドループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列により接合される逆方向反復ポリヌクレオチドとして発現される。

ｉＲＮＡの発現ベクターは、一般に、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核細胞と互換性がある発現ベクター、好ましくは、脊椎動物細胞と互換性があるものを用いて、本明細書に記載されるｉＲＮＡの発現に対する組み換え構築物を産生することができる。真核細胞の発現ベクターは、当該技術分野で公知であり、多くの商業的供給源から入手できる。典型的には、所望の核酸セグメントを挿入するために便利な制限部位を含むそのようなベクターが提供される。ｉＲＮＡを発現するベクターの送達は、例えば、静脈内もしくは筋肉内投与等により、患者から外植された標的細胞に投与後に該患者へ再導入することにより、または所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段等により、全身的であり得る。

ｉＲＮＡ発現プラスミドは、カチオン性脂質担体（例えばオリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ））、または非カチオン性脂質に基づく担体（例えばＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として、標的細胞に形質移入され得る。１週間またはそれ以上の期間にわたって、標的ＲＮＡの異なる領域を標的とする、ｉＲＮＡにより媒介されるノックダウンのための複数回の脂質の形質移入もまた、本発明により企図される。ベクターの宿主細胞への導入の成功は、種々の既知の方法を使用して監視することができる。例えば、一過性形質移入は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光マーカー等のレポーターを用いて示すことができる。エクスビボ細胞の安定な形質移入は、形質移入細胞に、ハイグロマイシンＢ耐性等の、特定の環境因子（例えば、抗生物質および薬物）に対する耐性を提供するマーカーを使用して、確実にすることができる。

本明細書に記載される方法および組成物と共に利用することができるウイルスベクターシステムとしては、（ａ）アデノウイルスベクター、（ｂ）レンチウイルスベクター、マロニーマウス白血病ウイルス等が挙げられるが、これらに限定されない、レトロウイルスベクター、（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター、（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター、（ｅ）ＳＶ４０ベクター、（ｆ）ポリオーマウイルスベクター、（ｇ）パピローマウイルスベクター、（ｈ）ピコルナウイルスベクター、（ｉ）オルトポックス、例えばワクシニアウイルスベクターまたはアビポックス（例えばカナリア痘もしくは鶏痘）等のポックスウイルスベクター、および（ｊ）ヘルパー依存性もしくは弱毒アデノウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。複製欠損ウイルスはまた、有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムに組み込まれるまたは組み込まれないだろう。構築物は、必要に応じて、形質移入のためにウイルス配列を含むことができる。または、構築物は、エピソーム複製が可能なベクター、例えば、ＥＰＶおよびＥＢＶベクターに組み込まれ得る。ｉＲＮＡの組み換え発現のための構築物は、一般に、標的細胞内のｉＲＮＡの発現を確実にするために、調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサー等を必要とする。ベクターおよび構築物に対して考慮される他の態様は、以下にさらに詳細される。

ｉＲＮＡの送達に有用なベクターは、所望の標的細胞または組織内のｉＲＮＡの発現に十分な調節要素（プロモーター、エンハンサー等）を含む。調節要素は、構成的発現あるいは調節性／誘導性発現のいずれかを提供するように選択することができる。

ｉＲＮＡの発現は、例えば、特定の生理的調節因子、例えば、循環ブドウ糖レベル、またはホルモンに感受性である調節配列等の誘導性調節配列を使用することにより、正確に調節することができる（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：２０−２４）。細胞または哺乳動物内のｄｓＲＮＡの発現を制御するために好適である、かかる誘導性発現システムには、例えば、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量化の化学誘導物質、およびイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節が含まれる。当業者は、ｉＲＮＡ導入遺伝子の目的とする用途に基づいて、適切な調節／プロモーター配列を選択することができよう。

特定の実施形態において、ｉＲＮＡをコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを使用することができる。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージング、および宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な要素を含有する。ｉＲＮＡをコードする核酸配列は、患者への核酸の送達を促進する、１つまたはそれ以上のベクターにクローニングされる。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、例えば、Ｂｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）に見出すことができ、これは、造血幹細胞を化学療法に対してより耐性にするために、造血幹細胞にｍｄｒ１遺伝子を送達するレトロウイルスベクターの使用を記載する。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を記載する他の参考文献は、Ｃｌｏｗｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９９４）、Ｋｉｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１９９４）、Ｓａｌｍｏｎｓ ａｎｄ Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１（１９９３）、およびＧｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４（１９９３）である。使用のために企図されるレトロウイルスベクターには、例えば、米国特許第６，１４３，５２０号、第５，６６５，５５７号、および第５，９８１，２７６号に記載されるＨＩＶに基づくベクターが含まれ、これは、参照により本明細書に組み込まれる。

アデノウイルスはまた、ｉＲＮＡの送達で用いるためにも企図される。アデノウイルスは、例えば、呼吸上皮に遺伝子を送達するのに特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、本来、呼吸上皮に感染し、軽度の病気を引き起こす。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することが可能であるという利点を有する。Ｋｏｚａｒｓｋｙ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスに基づく遺伝子療法の総説を示す。Ｂｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０（１９９４）は、アカゲサルの呼吸上皮に遺伝子を移動するアデノウイルスベクターの使用を示した。遺伝子療法におけるアデノウイルス使用の他の例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９１）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）、Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９９３）、ＰＣＴ公報番号ＷＯ９４／１２６４９、およびＷａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）で見出すことができる。本発明で特徴となるｉＲＮＡを発現するために好適なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、該ベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載されている。

また、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用も、企図される（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００（１９９３）、米国特許第５，４３６，１４６号）。一実施形態において、ｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６もしくはＨ１ ＲＮＡプロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを有する組換えＡＡＶベクターから、２つの別個の相補的な単鎖ＲＮＡ分子として発現され得る。本発明で特徴となるｄｓＲＮＡを発現するために好適なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、および該ベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１、Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０−５３２、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６、米国特許第５，２５２，４７９号、米国特許第５，１３９，９４１号、国際特許出願番号ＷＯ９４／１３７８８、および国際特許出願番号ＷＯ９３／２４６４１に記載され、これらの全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

別の好ましいウイルスベクターは、ワクシニアウイルス等のポックスウイルス、例えば、改変ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）またはＮＹＶＡＣ等の弱毒化ワクシニア、カナリア痘もしくは鶏痘等のアビポックスである。

ウイルスベクターの指向性は、エンベロープタンパク質もしくは他のウイルスからの他の表面抗原を用いて該ベクターをシュードタイピングすることにより、または異なるウイルスのキャプシドタンパク質を適宜置換することにより、修正することができる。例えば、レンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラ等からの表面タンパク質を用いてシュードタイピングされ得る。ＡＡＶベクターは、該ベクターを、異なるカプシドタンパク質血清型を発現するように操作することにより、異なる細胞を標的とするように作製することができる、例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１−８０１を参照されたく、この全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

ベクターの薬学的調製物は、許容される希釈剤中のベクターを含むことができるか、あるいは遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放性マトリックスを含むことができる。または、組換え細胞から完全な遺伝子送達ベクター、例えば、レトロウイルスベクターを無傷で産生することができる場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１つまたはそれ以上の細胞を含むことができる。

ｉＲＮＡを含有する薬学的組成物
一実施形態において、ｉＲＮＡと、薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物が、本明細書において提供される。該ｉＲＮＡを含有する薬学的組成物は、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現により媒介される病理過程等の、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現もしくは活性に関連する疾患もしくは障害の治療に有用である。かかる薬学的組成物は、送達様式に基づいて製剤化される。一例は、非経口投与を介して、例えば、静脈（ＩＶ）送達による全身投与用に製剤化される組成物である。別の例は、例えば、持続ポンプ注入等による脳への注入により、脳実質への直接送達用に製剤化される組成物である。

本明細書で特徴となる薬学的組成物は、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を阻害するために十分な投薬量で投与される。一般に、ｉＲＮＡの好適な用量は、１日当たり受容者の体重１キログラムにつき０．０１〜２００．０ミリグラムの範囲、一般には、１日当たり体重１キログラムにつき１〜５０ｍｇの範囲であろう。例えば、該ｄｓＲＮＡは、単回用量当たり０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。該薬学的組成物は、１日１回投与することができ、あるいは、該ｉＲＮＡは、１日にわたって適切な間隔で、２回、３回、またはそれ以上の分割用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）として、さらに、持続注入を用いて、または放出制御製剤による送達を用いて投与されてもよい。その場合、各分割用量に含有されるｉＲＮＡは、１日当たりの総投薬量を達成するように、対応してより少なくなければならない。投薬量単位は、例えば、数日間にわたって該ｉＲＮＡの持続放出を提供する、従来の持続放出製剤を使用して、数日間にわたる送達用に配合することができる。持続放出製剤は当該技術分野において周知であり、本発明の剤を用いて使用され得る部位等の特定の部位での剤の送達に特に有用である。本実施形態では、投薬量単位は、対応する複数の１日量を含む。

ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１レベルに対する単回用量の効果は、長く続き、その結果、その後の用量は、３、４、もしくは５日の間隔より多い間隔で、または１、２、３、もしくは４週間の間隔より多くない間隔で投与される。

当業者には、限定されないが、疾患もしくは障害の重症度、以前の処置、総体的な健康、および／または対象の年齢、ならびに存在する他の疾患を含む特定の因子が、対象を効果的に処置するために必要とされる投薬量およびタイミングに影響を及ぼし得ることが理解されよう。さらに、治療上有効な量の組成物を用いた対象の治療には、単回処置または一連の治療が含まれ得る。本発明により包含される個々のｉＲＮＡに対する効果的な投薬量およびインビボ半減期の推定は、従来の方法を使用して、または本明細書のいずれかの箇所で記載される適切な動物モデルを使用したインビボ試験に基づいて、行うことができる。

マウス遺伝学における進歩により、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現により媒介される病理過程等の種々のヒト疾患の研究用に、多くのマウスモデルが生成されている。かかるモデルは、ｉＲＮＡのインビボ試験のために、ならびに治療上有効な用量を決定するために使用することができる。好適なマウスモデルは、例えば、ヒトＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１を発現する導入遺伝子を含有するマウスである。

本発明はまた、本発明で特徴となるｉＲＮＡ化合物を含む薬学的組成物および製剤も含む。本発明の薬学的組成物は、局所的または全身的な処置が所望されるどうかかに依存して、および処置される範囲に依存して、多くの方法で投与することができる。投与は、局所的（例えば、経皮パッチによる）、噴霧器によりを含む、例えば、粉末もしくは噴霧剤の吸入もしくは吹送による経肺、気管内、鼻腔内、表皮および経皮、経口もしくは非経口であり得る。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腔内、もしくは筋肉内注射もしくは注入、例えば、埋め込みデバイスによる皮下投与、または頭蓋内、例えば、脳実質内、くも膜下腔内、もしくは脳室内投与が含まれる。

前記ｉＲＮＡは、肝臓（例えば、肝臓の肝細胞）等の特定の組織を標的とする様式で送達することができる。

局所投与用の薬学的組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ剤、坐薬、スプレー、液体、および粉末が含まれ得る。従来の薬学的担体、水性、粉末、もしくは油性基剤、増粘剤等が必要である場合があるか、または望ましい場合がある。被覆したコンドーム、手袋等も有用であり得る。好適な局所製剤には、本発明で特徴となるｉＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、および界面活性剤等の局所送達剤と混合されるものが含まれる。好適な脂質およびリポソームには、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジル ＤＯＰＥ エタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリン ＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール ＤＭＰＧ）、ならびにカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル ＤＯＴＡＰ、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン ＤＯＴＭＡ）が含まれる。本発明で特徴となるｉＲＮＡは、リポソーム内にカプセル化されてもよいか、あるいはそれ、特にカチオン性リポソームと複合体を形成してもよい。または、ｉＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体化されてもよい。好適な脂肪酸およびエステルには、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ_１〜２０アルキルエステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピル ＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、あるいはその薬学的に許容される塩が含まれるが、これらに限定されない。局所製剤は、米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載され、当該特許は、参照により本明細書に組み込まれる。

リポソーム製剤
薬物の製剤化用に研究および使用されているマイクロエマルジョンの他に、組織化された多くの界面活性剤の構造がある。これらには、単層、ミセル、二重層、および小胞が含まれる。リポソーム等の小胞は、薬物送達の観点からの、それらが提示する特異性および作用の持続時間から、大きな関心を集めている。本発明において使用される、「リポソーム」という用語は、球状の１つまたは複数の二重層に配置された両親媒性脂質の小胞を意味する。

リポソームは、親油性材料および水性の内部から形成される膜を有する、単層状または多層状の小胞である。水性部分が、送達される組成物を含有する。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができる利点を有する。非カチオン性のリポソームは、細胞壁とさほど効率的に融合することはできないが、マクロファージによりインビボで取り込まれる。

哺乳動物の無傷の皮膚を横断するために、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下で、それぞれ５０ｎｍ未満の直径を有する一連の微細孔を通過しなければならない。したがって、高度に変形可能で、そのような微細孔を通過することができるリポソームを使用することが望ましい。

リポソームのさらなる利点には、天然のリン脂質から得られたリポソームは、生体適合性および生分解性であること、リポソームは、広範な水溶性および脂溶性の薬物を組み込むことができること、リポソームは、それらの内部区画でカプセル化された薬物を、代謝および分解から保護できること、が含まれる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要な事項は、脂質の表面電荷、小胞の大きさ、およびリポソームの水性容積である。

リポソームは、作用部位への活性成分の移送および送達に有用である。リポソーム膜は、構造的に生体膜と同様であるため、リポソームが組織に適用されると、リポソームは細胞膜との融合を開始し、リポソームと細胞との融合が進行するに従って、リポソームの内容物が細胞内へ出て、そこで活性剤が作用し得る。

リポソーム製剤は、多くの薬物のための送達様式として、広範な調査の焦点となっている。局所投与について、リポソームが他の製剤に勝る幾つかの利点を提示するという証拠が増えつつある。かかる利点には、投与された薬物の高度な体内吸収に関連する副作用の減少、投与された薬物の所望の標的での蓄積の増加、ならびに親水性および疎水性の両方の多岐にわたる薬物を皮膚へ投与する能力が含まれる。

幾つかの報告は、高分子量のＤＮＡを含む剤を皮膚へ送達するリポソームの能力について詳述している。鎮痛剤、抗体、ホルモン、および高分子量のＤＮＡを含む化合物が、皮膚に投与されている。大半の適用が、表皮上層の標的化をもたらした。

リポソームは、広義の２つのクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に荷電したＤＮＡ分子と相互に作用し、安定な複合体を形成する、正に荷電したリポソームである。正に荷電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドソーム内に取り入れられる。エンドソーム内の酸性ｐＨにより、リポソームが破裂し、その内容物を細胞の細胞質内に放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。

ｐＨ感受性であるか、または負に荷電したリポソームは、核酸と複合するのではなく、それを捕捉する。核酸および脂質は共に同様に荷電されているため、複合体形成ではなく反発が生じる。それでもなお、核酸の一部は、これらのリポソームの水性内部内に捕捉される。チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を培養下の細胞単層へ送達するために、ｐＨ感受性リポソームが使用されている。外因性遺伝子の発現が、標的細胞中で検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９−２７４）。

リポソーム組成物の１つの主要な種類には、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。例えば、中性のリポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性のリポソーム組成物は、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、一方アニオン性の膜融合性リポソームは、主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。リポソーム組成物の別の種類は、例えば、大豆ホスファチジルコリン、および卵ホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別の種類は、リン脂質、および／またはホスファチジルコリン、および／またはコレステロールの混合物から形成される。

幾つかの研究が、リポソーム製剤の皮膚への局所送達を評価している。インターフェロンを含有するリポソームのモルモット皮膚への適用は、皮膚ヘルペス炎の軽減をもたらし、一方他の手段（例えば、溶液またはエマルジョンとして）を介したインターフェロンの送達は効果がなかった（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，２，４０５−４１０）。さらに、さらなる研究は、リポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの、水性系を使用するインターフェロンの投与に対する有効性を試験し、リポソーム製剤は水溶性投与より優れていると結論付けた（ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，１８，２５９−２６５）。

また、非イオン性のリポソーム系は、特に非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系における、薬物の皮膚への送達の実用性を決定するために調べられている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性のリポソーム製剤が、シクロスポリンＡをマウス皮膚の真皮に送達するために使用された。結果は、かかる非イオン性のリポソーム系が、皮膚の異なる層へのシクロスポリンＡの沈着の促進に効果的であることを示した（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。

また、リポソームには、「立体的に安定化された」リポソームが含まれ、該用語は、本明細書で使用される場合、１つまたはそれ以上の特定化された脂質を含むリポソームを指し、リポソームに組み込まれると、かかる特定化された脂質を欠くリポソームと比較して、循環寿命の向上をもたらす。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧ_Ｍ１等の１つまたはそれ以上の糖脂質を含むか、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分等の１つまたはそれ以上の親水性ポリマーで誘導体化されるものである。いずれの特定の理論にも束縛されるものではないが、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームについて、これらの立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の増加は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内への取り込みの減少に由来すると、当該技術分野では考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。

１つまたはそれ以上の糖脂質を含む種々のリポソームが当該技術分野において既知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、モノシアロガングリオシドＧ_Ｍ１、ガラクトセレブロシド硫酸、およびホスファチジルイノシトールの、リポソームの血中半減期を改善する能力について報告した。これらの所見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）により詳しく説明されている。共にＡｌｌｅｎらによる、米国特許第４，８３７，０２８号およびＷＯ８８／０４９２４は、（１）スフィンゴミエリン、および（２）ガングリオシドＧ_Ｍ１もしくはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、ＷＯ９７／１３４９９（Ｌｉｍら）に開示されている。

１つまたはそれ以上の親水性ポリマーにより誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびその調製方法は、当該技術分野において既知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３，２７７８）は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン性界面活性剤、２Ｃ_{１２１５Ｇ}を含むリポソームについて記載している。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９８４，１６７，７９）は、ポリスチレン粒子のポリマーグリコールによる親水性コーティングが、血中半減期の著しい増加をもたらすことを指摘している。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボン酸基の結合により修飾された合成リン脂質が、Ｓｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号、および第４，５３４，８９９号）により記載されている。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２６８，２３５）は、ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＥＧにより誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが、血中循環半減期の著しい増加を有することを示す実験について記載している。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１）は、このような観察を、他のＰＥＧ誘導体化リン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧとの組み合わせから形成されるＤＳＰＥ−ＰＥＧに広げた。外部表面に共有結合されたＰＥＧ部分を有するリポソームが、欧州特許番号ＥＰ０ ４４５ １３１ Ｂ１およびＦｉｓｈｅｒのＷＯ９０／０４３８４に記載されている。ＰＥＧにより誘導体化された１〜２０モルパーセントのＰＥを含有するリポソーム組成物、およびその使用方法が、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５５６号、および第５，３５６，６３３号）、ならびにＭａｒｔｉｎら（（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許番号ＥＰ０ ４９６ ８１３ Ｂ１）により記載されている。他の多くの脂質−ポリマー結合体を含むリポソームが、ＷＯ９１／０５５４５および米国特許第５，２２５，２１２号（共にＭａｒｔｉｎらによる）、ならびにＷＯ９４／２００７３（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームが、ＷＯ９６／１０３９１（Ｃｈｏｉら）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉら）および米国特許第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａら）は、それらの表面に官能基部分をさらに誘導体化することができるＰＥＧ含有リポソームについて記載している。

核酸を含む多くのリポソームが当該技術分野において既知である。ＴｈｉｅｒｒｙらによるＷＯ９６／４００６２は、高分子量の核酸をリポソーム中にカプセル化するための方法を開示している。Ｔａｇａｗａらによる米国特許第５，２６４，２２１号は、タンパク質結合リポソームを開示し、かかるリポソームの内容物にはｄｓＲＮＡが含まれ得ると主張している。Ｒａｈｍａｎらによる米国特許第５，６６５，７１０号は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソーム中にカプセル化する特定の方法について記載している。ＬｏｖｅらによるＷＯ９７／０４７８７は、ｒａｆ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含むリポソームを開示している。

トランスファーソームはさらに別の種類のリポソームであり、薬物送達媒体の興味を引く候補者である、高度に変形可能な脂質凝集物である。トランスファーソームは脂質小滴として記載されてもよく、これは、高度に変形可能であるため、この小滴より小さな孔に容易に浸透することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適合可能であり、例えば、自己最適性（皮膚の孔の形状に適合する）、自己修復性であり、しばしば断片化されることなく標的に到達し、しばしば自己負荷性（ｓｅｌｆ−ｌｏａｄｉｎｇ）である。トランスファーソームを作製するために、標準的なリポソーム組成物に対して、表面エッジアクチベータ（ｓｕｒｆａｃｅ ｅｄｇｅ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、通常は界面活性剤を添加することができる。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚へ送達するために使用されている。血清アルブミンのトランスファーソームにより媒介される送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同様に効果的であることが示されている。

界面活性剤は、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）およびリポソーム等の製剤中に幅広い用途を見出す。天然および合成の両方の、多くの異なる種類の界面活性剤の性質を分類および順位付ける最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（「頭部基」としても知られる）の性質が、製剤に使用される異なる界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。

界面活性剤分子がイオン化されていない場合、これは、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、薬学的製品および化粧品に幅広い用途を見出し、広範なｐＨ値にわたって使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値は、その構造に依存して、２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシ化エステル等の非イオン性エステルが含まれる。脂肪アルコールエトキシ化物（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、プロポキシ化（ｐｒｏｐｏｘｙｌａｔｅｄ）アルコール、およびエトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマー等の非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルも、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤が、非イオン性界面活性剤のクラスのうちで最も一般的な構成物質である。

界面活性剤分子が水中に溶解または分散された時に負の電荷を保有する場合、その界面活性剤は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤には、石鹸等のカルボキシレート、アシルラクチレート（ａｃｙｌ ｌａｃｔｙｌａｔｅ）、アミノ酸のアシルアミド、アルキルサルフェートおよびエトキシ化アルキルサルフェート等の硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート（ｉｓｅｔｈｉｏｎａｔｅ）、アシルタウレート（ｔａｕｒａｔｅ）、およびスルホスクシネート等のスルホネート、ならびにホスフェートが含まれる。アニオン性界面活性剤のクラスのうちで最も重要な構成物質は、アルキルサルフェートおよび石鹸である。

界面活性剤分子が水中に溶解または分散された時に正の荷電を保有する場合、その界面活性剤はカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤には、第四アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが含まれる。第四アンモニウム塩がこのクラスで最も使用される構成物質である。

界面活性剤分子が正または負の電荷のいずれをも保有する能力を有する場合、その界面活性剤は、両性として分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびフォスファチドが含まれる。

薬品、製剤、およびエマルジョン中の界面活性剤の使用が概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。

核酸脂質粒子
一実施形態において、本発明で特徴となるＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１のｄｓＲＮＡは、脂質製剤中に完全にカプセル化されて、例えば、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰ、または他の核酸脂質粒子を形成する。本明細書で使用される、「ＳＮＡＬＰ」という用語は、ＳＰＬＰを含む安定な核酸脂質粒子を指す。本明細書で使用される、「ＳＰＬＰ」という用語は、脂質小胞内にカプセル化されたプラスミドＤＮＡを含む核酸脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を阻止する脂質（例えば、ＰＥＧ脂質結合体）を含有する。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に長時間の循環寿命を呈し、遠位の部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するため、全身適用に非常に有用である。ＳＰＬＰには、「ｐＳＰＬＰ」が含まれ、これには、ＰＣＴ公報番号ＷＯ００／０３６８３に記載されるカプセル化された縮合剤と核酸との複合体が含まれる。本発明の粒子は、典型的には約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍ〜約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に無毒である。さらに、該核酸は、本発明の核酸脂質粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に抵抗性である。核酸脂質粒子およびその調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号、第５，９８１，５０１号、第６，５３４，４８４号、第６，５８６，４１０号、第６，８１５，４３２号、およびＷＯ９６／４０９６４に開示されている。

一実施形態において、脂質の薬物に対する比率（質量／質量比率）（例えば、脂質のｄｓＲＮＡに対する比率）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、または約６：１〜約９：１の範囲内であろう。

カチオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルクロライド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルクロライド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ（ＤｉＬｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｎｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌｏｘｙ）−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｔｈｉｏ）−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ（ｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、または３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌａｍｉｎｏ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏ）（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｏ）−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌ）−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、またはそれらの類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１'−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチルアザネジイル）ジドデカン−２−オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、あるいはそれらの混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０モル％〜約５０モル％、または約４０モル％からなり得る。

別の実施形態では、脂質ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製するために、化合物、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランを使用することができる。２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランの合成については、２００８年１０月２３日出願の米国特許仮出願第６１／１０７，９９８号に記載され、当該特許は、参照により本明細書に組み込まれる。

一実施形態において、脂質ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン、１０％のＤＳＰＣ、４０％のコレステロール、１０％のＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（モルパーセント）が含まれ、粒径６３．０±２０ｎｍおよび０．０２７のｓｉＲＮＡ／脂質比である。

非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されない、アニオン性脂質または中性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、コレステロールが含まれる場合、粒子中に存在する総脂質の約５モル％〜約９０モル％、約１０モル％、または約５８モル％であり得る。

粒子の凝集を阻害する結合された脂質は、例えば、制限されないが、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、またはそれらの混合物を含む、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質であり得る。ＰＥＧ−ＤＡＡ結合体は、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ_２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ_４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ_６）、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］_８）であり得る。粒子の凝集を阻止する結合された脂質は、粒子中に存在する総脂質の０モル％〜約２０モル％、または約２モル％であり得る。

幾つかの実施形態において、該核酸脂質粒子には、例えば、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％〜約６０モル％、または約４８モル％のコレステロールがさらに含まれる。

ＬＮＰ０１
一実施形態において、脂質様（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）ＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ１４８７）（２００８年３月２６日に出願された米国特許出願第１２／０５６，２３０号を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ）を使用して、脂質ｄｓＲＮＡナノ粒子（すなわち、ＬＮＰ０１粒子）を調製することができる。それぞれエタノール中の原液を、ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ；ＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６、１００ｍｇ／ｍｌのように調製することができる。次いで、ＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６の原液を、例えば、４２：４８：１０のモル比に混合することができる。混合された脂質溶液は、最終エタノール濃度が約３５〜４５％、および最終酢酸ナトリウム濃度が約１００〜３００ｍＭになるように、（例えば、酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中の）ｄｓＲＮＡ水溶液と混合することができる。脂質ｄｓＲＮＡナノ粒子は、典型的には、混合時に自然発生的に形成される。所望の粒径分布に依存して、得られたナノ粒子混合物は、例えば、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）等のサーモバレル押出機（ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ ｅｘｔｒｕｄｅｒ）を使用して、ポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通して押し出すことができる。場合によっては、押出ステップは割愛されてもよい。エタノール除去および同時の緩衝液交換は、例えば、透析または接線流濾過により達成することができる。緩衝液は、例えば、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と交換することができる。

式Ｉ

ＬＮＰ０１製剤については、例えば、国際出願公報番号ＷＯ２００８／０４２９７３に記載されており、当該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。

さらなる例示的な脂質ｄｓＲＮＡ製剤は、以下の通りである。

ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＰＥＧ−ＤＭＧ：ＰＥＧ−ジジミリストイルグリセロール（Ｃ１４−ＰＥＧまたはＰＥＧ−Ｃ１４）（２０００の平均モル重量を有するＰＥＧ）
ＰＥＧ−ＤＳＧ：ＰＥＧ−ジスチリルグリセロール（Ｃ１８−ＰＥＧまたはＰＥＧ−Ｃ１８）（２０００の平均モル重量を有するＰＥＧ）
ＰＥＧ−ｃＤＭＡ：ＰＥＧ−カルバモイル−１，２−ジミリスチルオキシプロピルアミン（２０００の平均モル重量を有するＰＥＧ）

製剤を含むＳＮＡＬＰ（１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））は、２００９年４月１５日に出願された国際公報番号ＷＯ２００９／１２７０６０に記載されており、当該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。

製剤を含むＸＴＣは、例えば、２００９年９月３日に出願された米国特許仮出願第６１／２３９，６８６号に記載されており、当該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。

製剤を含むＭＣ３は、例えば、２００９年９月２２日に出願された米国特許仮出願第６１／２４４，８３４号、２００９年６月１０日に出願された米国特許仮出願第６１／１８５，８００号、２０１０年６月１０日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／２８２２４に記載されており、当該出願は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

製剤を含むＡＬＮＹ−１００は、例えば、２００９年１１月１０日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３９３３に記載されており、当該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。

製剤を含むＣ１２−２００は、２００９年５月５日に出願された米国特許仮出願第６１／１７５，７７０号および２０１０年５月５日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／３３７７７号に記載されており、当該出願は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

カチオン性脂質の合成
本発明の核酸脂質粒子に使用される、例えば、カチオン性脂質等の化合物のいずれも、実施例により詳細に記載される方法を含む、既知の有機合成技術により調製することができる。全ての置換基は、別途指示されない限り、以下に定義された通りである。

「アルキル」とは、１〜２４個の炭素原子を含有する、直鎖もしくは分枝状の、非環状もしくは環状の、飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等が含まれるが、一方、飽和分枝状アルキルには、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル等が含まれる。代表的な飽和環状アルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が含まれるが、一方、非飽和環状アルキルには、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニル等が含まれる。

「アルケニル」とは、隣接する炭素原子の間に少なくとも１つの二重結合を含有する、上で定義されるアルキルを意味する。アルケニルには、シスおよびトランス異性体の両方が含まれる。代表的な直鎖および分枝鎖アルケニルには、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニル等が挙げられる。

「アルキニル」とは、隣接炭素間に少なくとも１つの三重結合をさらに含む、上で定義される任意のアルキルまたはアルケニルを意味する。代表的な直鎖および分枝鎖のアルキニルには、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１ブチニル等が挙げられる。

「アシル」とは、結合点における炭素が、以下で定義されるようなオキソ基で置換されている任意のアルキル、アルケニル、またはアルキニルを意味する。例えば、−Ｃ（＝Ｏ）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、および−Ｃ（＝Ｏ）アルキニルが、アシル基である。

「複素環」とは、飽和、不飽和、または芳香族であり、かつ、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１または２個のヘテロ原子（その窒素および硫黄ヘテロ原子が、任意に酸化されてもよく、窒素ヘテロ原子が、任意に四級化されてもよい）を含む５〜７員の単環式または７〜１０員の二環式の複素環式環を意味し、これには、上記の複素環のいずれかがベンゼン環に融合された二環式の環が含まれる。複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合され得る。複素環には、以下で定義されるようなヘテロアリールが含まれる。複素環としては、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル等が挙げられる。

「置換されてもよいアルキル」、「置換されてもよいアルケニル」、「置換されてもよいアルキニル」、「置換されてもよいアシル」、および「置換されてもよい複素環」という用語は、置換されるとき、少なくとも１つの水素原子が、ある置換基で置き換えられることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２つの水素原子が置き換えられる。この点において、置換基としては、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲ^ｘ、−ＮＲ^ｘＲ^ｙ、−ＮＲ^ｘＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ _、−ＮＲ^ｘＳＯ_２Ｒ^ｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ、−ＳＯ_ｎＲ^ｘ、および−ＳＯ_ｎＮＲ^ｘＲ^ｙが挙げられ、ｎは、０、１、または２であり、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、同じであるか、または異なり、かつ独立して、水素、アルキル、または複素環であり、かつ該アルキル置換基および複素環置換基のそれぞれは、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲ^ｘ、複素環、−ＮＲ^ｘＲ^ｙ、−ＮＲ^ｘＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｙ _、−ＮＲ^ｘＳＯ_２Ｒ^ｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ、−ＳＯ_ｎＲ^ｘ、および−ＳＯ_ｎＮＲ^ｘＲ^ｙのうちの１つまたはそれ以上でさらに置換され得る。

「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを意味する。

幾つかの実施形態において、本発明の方法は、保護基の使用を必要とし得る。保護基の方法論は、当業者に周知である（例えば、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ，１９９９を参照のこと）。簡潔に言えば、本発明の文脈内の保護基は、官能基の望まれない反応性を減少させるか、または排除する任意の基である。保護基は、官能基に付加されることにより、ある特定の反応中における反応性を遮蔽し、次いで、除去されることにより、元の官能基が現れ得る。幾つかの実施形態において、「アルコール保護基」が使用される。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の望まれない反応性を減少させるか、または排除する任意の基である。保護基は、当該分野において周知の手法を用いて、付加および除去され得る。

式Ａの合成
幾つかの実施形態において、本発明の核酸脂質粒子は、式Ａ

のカチオン性脂質を用いて製剤化され、式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、それぞれが、任意に置換されてもよく、Ｒ３およびＲ４は独立して、低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４は、一緒になって、置換されてもよい複素環を形成することができる。幾つかの実施形態において、該カチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）である。一般に、上の式Ａの脂質は、以下の反応スキーム１または２により生成され得、全ての置換基は、別途示されない限り、上で定義された通りである。

式中、Ｒ_１およびＲ_２が独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、それぞれが、任意に置換されてもよく、Ｒ_３およびＲ_４が独立して、低級アルキルであるか、またはＲ_３およびＲ_４が、一緒になって、置換されてもよい複素環を形成することができる、脂質Ａは、スキーム１に従って調製され得る。ケトン１および臭化物２は、購入され得るか、または当業者に公知の方法に従って調製され得る。１と２との反応により、ケタール３を得る。ケタール３をアミン４で処理することにより、式Ａの脂質を得る。式Ａの脂質を、式中、Ｘがハロゲン、水酸化物、ホスフェート、サルフェート等から選択されるアニオン性対イオンである、式５の有機塩を有する対応するアンモニウム塩に変換し得る。

または、ケトン１の出発材料は、スキーム２に従って調製され得る。グリニャール試薬６およびシアン化物７は、購入され得るか、または当業者に公知の方法に従って調製され得る。６と７との反応により、ケトン１を得る。式Ａの対応する脂質へのケトン１の変換は、スキーム１に記載される通りである。

ＭＣ３の合成
ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ（すなわち、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート）の調製は、以下の通りであった。ジクロロメタン（５ｍＬ）中の（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−オール（０．５３ｇ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノブチル酸塩酸塩（０．５１ｇ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．６１ｇ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．５３ｇ）の溶液を、室温で一晩撹拌した。該溶液を希塩酸で洗浄し、続いて、希重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機画分を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を回転式エバポレータ上で除去した。残渣を、１〜５％のメタノール／ジクロロメタン溶出勾配を用いて、シリカゲルカラム（２０ｇ）に通した。精製産物を含有する画分を組み合わせ、溶媒を除去し、無色油（０．５４ｇ）を得た。

ＡＬＮＹ−１００の合成
ケタール５１９［ＡＬＮＹ−１００］の合成を以下のスキーム３を用いて実施した。

５１５の合成：
２口のＲＢＦ（１Ｌ）において、２００ｍｌの無水ＴＨＦ中のＬｉＡｌＨ４（３．７４ｇ、０．０９８５２ｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、７０ｍＬのＴＨＦ中の５１４の溶液（１０ｇ、０．０４９２６ｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で、0 0Cで徐々に添加した。添加が完了した後、反応混合物を室温まで温め、次いで、４時間加熱還流した。反応の進行をＴＬＣで観察した。（ＴＬＣにより）反応の完了した後、混合物を0 0Cまで冷却し、飽和Ｎａ２ＳＯ４溶液を慎重に添加して、反応停止した。反応混合物を室温で４時間撹拌し、濾過した。残渣をＴＨＦで十分洗浄した。濾液および洗浄液を混合し、４００ｍＬのジオキサンおよび２６ｍＬの濃ＨＣｌで希釈し、室温で２０分間撹拌した。揮発物質を、真空下で揮散して、白色固体として５１５の塩酸塩を得た。収率：７．１２ｇ １Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）：δ＝９．３４（ｂｒｏａｄ，２Ｈ），５．６８（ｓ，２Ｈ），３．７４（ｍ，１Ｈ），２．６６−２．６０（ｍ，２Ｈ），２．５０−２．４５（ｍ，５Ｈ）。

５１６の合成：
２５０ｍＬの２口のＲＢＦにおいて、１００ｍＬの乾燥ＤＣＭ中の化合物５１５の撹拌溶液に、ＮＥｔ３（３７．２ｍＬ、０．２６６９ｍｏｌ）を添加し、窒素雰囲気下で、０℃まで冷却した。５０ｍＬの乾燥ＤＣＭ中でＮ−（ベンジルオキシ−カルボニルオキシ）−スクシンイミド（２０ｇ、０．０８００７ｍｏｌ）を徐々に添加した後、反応混合物を室温まで加温した。（ＴＬＣにより２〜３時間）反応を完了した後、混合物を１Ｎ ＨＣｌ溶液（１×１００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１×５０ｍＬ）で順次洗浄した。次いで、有機層を、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を蒸発させて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した粗材料を得て、粘着塊として５１６を得た。収率：１１ｇ（８９％）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ＝７．３６−７．２７（ｍ，５Ｈ），５．６９（ｓ，２Ｈ），５．１２（ｓ，２Ｈ），４．９６（ｂｒ．，１Ｈ）２．７４（ｓ，３Ｈ），２．６０（ｍ，２Ｈ），２．３０−２．２５（ｍ，２Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］−２３２．３（９６．９４％）。

５１７Ａおよび５１７Ｂの合成：
シクロペンテン５１６（５ｇ、０．０２１６４ｍｏｌ）を、１口の５００ｍＬ ＲＢＦにおいて、２２０ｍＬのアセトンおよび水（１０：１）の溶液中に溶解し、それに、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−酸化物（７．６ｇ、０．０６４９２ｍｏｌ）を室温で添加し、続いて、４．２ｍＬのｔｅｒｔ−ブタノール中の７．６％のＯｓＯ４の溶液（０．２７５ｇ、０．００１０８ｍｏｌ）を室温で添加した。反応が完了した後（約３時間）、混合物を固体Ｎａ２ＳＯ３で反応停止し、得られた混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（３００ｍＬ）で希釈し、水（２×１００ｍＬ）で洗浄し、続いて、飽和ＮａＨＣＯ３（１×５０ｍＬ）溶液、水、（１×３０ｍＬ）、最後にブライン（１×５０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。粗材料のシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製によりジアステレオマーの混合物を得て、これを分取ＨＰＬＣにより分離した。収率：−６ｇの粗製物

５１７Ａ−ピーク−１（白色固体），５．１３ｇ（９６％）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）：δ＝７．３９−７．３１（ｍ，５Ｈ），５．０４（ｓ，２Ｈ），４．７８−４．７３（ｍ，１Ｈ），４．４８−４．４７（ｄ，２Ｈ），３．９４−３．９３（ｍ，２Ｈ），２．７１（ｓ，３Ｈ），１．７２−１．６７（ｍ，４Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ−［Ｍ＋Ｈ］−２６６．３，［Ｍ＋ＮＨ４＋］−２８３．５ 存在、ＨＰＬＣ−９７．８６％。Ｘ線により確認された立体化学。

５１８の合成：
化合物５０５の合成について記載されるものと同様の手順を用いて、化合物５１８（１．２ｇ、４１％）を無色油として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ＝７．３５−７．３３（ｍ，４Ｈ），７．３０−７．２７（ｍ，１Ｈ），５．３７−５．２７（ｍ，８Ｈ），５．１２（ｓ，２Ｈ），４．７５（ｍ，１Ｈ），４．５８−４．５７（ｍ，２Ｈ），２．７８−２．７４（ｍ，７Ｈ），２．０６−２．００（ｍ，８Ｈ），１．９６−１．９１（ｍ，２Ｈ），１．６２（ｍ，４Ｈ），１．４８（ｍ，２Ｈ），１．３７−１．２５（ｂｒ ｍ，３６Ｈ），０．８７（ｍ，６Ｈ）。ＨＰＬＣ−９８．６５％。

化合物５１９の合成についての一般的な手順：
ヘキサン（１５ｍＬ）中の化合物５１８（１当量）の溶液を、ＴＨＦ（１Ｍ、２当量）中のＬＡＨの氷冷却した溶液に、滴加様式で添加した。添加が完了した後、混合物を０．５時間にわたり４０℃で加熱し、次いで、氷浴上で再度冷却した。混合物を、飽和Ｎａ２ＳＯ４水溶液で慎重に加水分解し、次いで、セライトを通して濾過し、還元して油にした。カラムクロマトグラフィーにより、純粋な５１９（１．３ｇ、６８％）が得られ、これを無色油として得た。１３Ｃ ＮＭＲ□＝１３０．２，１３０．１（ｘ２），１２７．９（ｘ３），１１２．３，７９．３，６４．４，４４．７，３８．３，３５．４，３１．５，２９．９（ｘ２），２９．７，２９．６（ｘ２），２９．５（ｘ３），２９．３（ｘ２），２７．２（ｘ３），２５．６，２４．５，２３．３，２２６，１４．１；エレクトロスプレーＭＳ（＋ｖｅ）：Ｃ４４Ｈ８０ＮＯ２（Ｍ＋Ｈ）＋に対する分子量、計算値６５４．６、実測値６５４．６。

標準的な方法、または押出を伴わない方法のうちのいずれかにより調製された製剤を同様の様態で特徴付けることができる。例えば製剤は、典型的には、目視検査により特徴付けられる。それらは、凝集物または沈降物のない、白っぽい半透明の溶液であるべきである。脂質ナノ粒子の粒径および粒径分布は、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ（ＵＳＡ）を使用して、光散乱により測定することができる。粒子は、４０〜１００ｎｍ等の約２０〜３００ｎｍの粒径であるべきである。粒径分布は、単峰型であるべきである。製剤中、ならびに捕捉された画分中の総ｄｓＲＮＡ濃度は、色素排除アッセイ法を使用して推定される。製剤化されたｄｓＲＮＡの試料を、製剤を分裂させる界面活性剤、例えば、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の存在または不在下、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）等のＲＮＡに結合する色素を用いてインキュベートすることができる。製剤中の総ｄｓＲＮＡは、標準曲線に対する、該界面活性剤を含有する試料からのシグナルにより決定することができる。捕捉された画分を、総ｄｓＲＮＡ含有量から「遊離」ｄｓＲＮＡ含有量（界面活性剤の不在下のシグナルにより測定される）を差し引くことにより決定する。捕捉されたｄｓＲＮＡのパーセントは、典型的には８５％超である。ＳＮＡＬＰ製剤については、粒径は、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、および少なくとも１２０ｎｍである。好適な範囲は、典型的には少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、または少なくとも約８０ｎｍ〜少なくとも約９０ｎｍである。

経口投与用の組成物および製剤には、粉末もしくは顆粒、微粒子、ナノ粒子、水もしくは非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、ゲルカプセル、サシェット、錠剤、またはミニタブレットが含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましい場合がある。幾つかの実施形態において、経口製剤とは、本発明で特徴となるｄｓＲＮＡが、１つまたはそれ以上の浸透促進剤、界面活性剤、およびキレート化剤と併用して投与されるものである。好適な界面活性剤には、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩が含まれる。好適な胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコール酸（ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム、ならびにグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが含まれる。好適な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、もしくはその薬学的に許容される塩（例えば、ナトリウム）が含まれる。幾つかの実施形態において、浸透促進剤の組み合わせが使用され、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩が挙げられる。例示的な１つの組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透促進剤には、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが含まれる。本発明で特徴となるｄｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子を含む顆粒形態で経口的に送達されてもよいか、または微小もしくはナノ粒子を形成するように複合されてもよい。ｄｓＲＮＡ複合剤には、ポリ−アミノ酸類；ポリイミン類；ポリアクリレート類；ポリアルキルアクリレート類、ポリオキセタン類、ポリアルキルシアノアクリレート類；カチオン化ゼラチン類、アルブミン類、デンプン類、アクリレート類、ポリエチレングリコール類（ＰＥＧ）、およびデンプン類；ポリアルキルシアノアクリレート類；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン類、ポルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎ）類、セルロース類、およびデンプン類が含まれる。好適な複合剤には、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギネート、ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。ｄｓＲＮＡ用の経口製剤およびそれらの調製は、米国特許第６，８８７，９０６号、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号、および米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載され、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

非経口、実質内（脳内への）、くも膜下腔内、脳室内、または肝内投与用の組成物および製剤には、滅菌水溶液が含まれてもよく、これはまた、限定されないが、浸透促進剤、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体もしくは賦形剤等の、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤を含有し得る。

本発明の薬学的組成物には、溶液、エマルジョン、およびリポソームを含有する製剤が含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物は、予め形成された液体、自己乳化型固体および、自己乳化型半固体を含む種々の構成成分から生成することができるが、これらに限定されない。肝臓癌等の肝障害を処置する際に肝臓を標的とする製剤が特に好ましい。

本発明の薬学的製剤は、簡便に単位剤形で提示することができ、医薬産業において周知である従来の技法により、調製することができる。かかる技法には、活性成分を１つもしくは複数の薬学的担体または１つもしくは複数の賦形剤と合わせるステップが含まれる。一般に、該製剤は、活性成分を液体担体もしくは微粉化した固体担体、あるいはその両方と均一かつ密接に関連させ、次いで必要であれば該産物を成形することにより調製される。

本発明の組成物は、限定されないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬、および浣腸等の考えられる多くの剤形のうちのいずれかに製剤化することができる。また、本発明の組成物は、水性媒体中、非水性媒体中、または混合媒体中の懸濁液として製剤化することもできる。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増加させる物質をさらに含有することができる。また、懸濁液は、安定剤も含有することができる。

さらなる製剤
エマルジョン
本発明の組成物は、エマルジョンとして調製および製剤化することができる。エマルジョンは、典型的には、１つの液体が、通常直径０．１μｍを超える液滴の形態の別の液体中に分散された多相系である（例えば、Ａｎｓｅｌ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５、Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５、Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１）。エマルジョンは、しばしば、互いに密接して混合および分散される、２つの非混合性の液相を含む二相系である。一般に、エマルジョンは、油中水（ｗ／ｏ）型または水中油（ｏ／ｗ）型のいずれかの種類であり得る。水相が、大部分を占める油相中に微細に分割されて、微小液滴として分散される場合、得られる組成物は、油中水（ｗ／ｏ）型エマルジョンと称される。あるいは、油相が、大部分を占める水相中に微細に分割されて、微小液滴として分散される場合、得られる組成物は、水中油（ｏ／ｗ）型エマルジョンと称される。エマルジョンは、分散相に加えてさらなる構成成分と、水相または油相のいずれか中の溶液として、またはそれ自体別個の相として存在し得る、活性薬物とを含有することができる。また、乳化剤、安定剤、染料、および抗酸化剤等の薬学的賦形剤が、必要に応じてエマルジョン中に存在してもよい。また、薬学的エマルジョンは、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）型および水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）型エマルジョンの場合等の、２つを超える相を含む、多重エマルジョンであってもよい。このような複合製剤は、しばしば、単純な二元エマルジョンでは提供されない、特定の利点を提供する。ｏ／ｗ型エマルジョンの個々の油滴が小さな水滴を囲む多重エマルジョンは、ｗ／ｏ／ｗ型エマルジョンを構成する。同様に、油の連続相中で安定化された水の小球内に囲まれた油滴の系は、ｏ／ｗ／ｏ型エマルジョンを提供する。

エマルジョンは、熱力学的安定性によりほとんどまたは全く特徴付けられていない。しばしば、エマルジョンの分散相または不連続相が、外相または連続相中に良好に分散され、乳化剤の手段または製剤の粘度によりこの形態が維持される。エマルジョンの相のいずれも、エマルジョン型軟膏基剤およびクリームの場合のように、半固体または固体であり得る。エマルジョンを安定化する他の手段は、エマルジョンのいずれかの相に組み込むことができる乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、大きく、合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収基剤、および微細に分散された固体の４つのカテゴリーに分類することができる（例えば、Ａｎｓｅｌ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照のこと）。

合成界面活性剤は、表面活性剤としても知られ、エマルジョン製剤における広範な適用性が見出されており、文献で概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照のこと）。界面活性剤は、典型的には両親媒性であり、親水性および疎水性の部分を含む。界面活性剤の、親水性の疎水性に対する比率は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称されており、製剤の調製時の界面活性剤の分類および選択における、貴重なツールである。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性の異なるクラスに分類することができる（例えば、Ａｎｓｅｌ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５を参照のこと）。

エマルジョン製剤に使用される天然に存在する乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、フォスファチド類、レシチン、およびアカシアが含まれる。吸収基剤は、水を吸収してｗ／ｏ型エマルジョンを形成するが、依然として無水ラノリンおよび親水性ペトロラタム等のそれらの半固体の稠度を保持することができる、親水性を有する。微細に分割された固体も、特に界面活性剤と組み合わせておよび粘性の調製物中で、良好な乳化剤として使用されている。これらには、極性の無機固体、例えば、重金属水酸化物、非膨張性粘土、例えば、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド性ケイ酸アルミニウムおよびコロイド性ケイ酸アルミニウムマグネシウム、顔料、ならびに非極性固体、例えば、炭素もしくはトリステアリン酸グリセリルが含まれる。

また、多岐にわたる非乳化材料もエマルジョン製剤に含まれ、エマルジョンの性質に寄与する。これらには、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、防腐剤、および抗酸化剤が含まれる（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。

親水性コロイドまたは親水コロイドには、多糖類（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲニン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）等の、天然に存在するガムおよび合成ポリマーが含まれる。これらは、水中で分散または膨張して、分散相の液滴の周りに強い界面薄膜を形成し、外相の粘度を増加させることによりエマルジョンを安定化させる、コロイド溶液を形成する。

エマルジョンは、しばしば、微生物の成長を容易に支持することができる炭水化物、タンパク質、ステロール、およびフォスファチド等の多くの成分を含有するため、これらの製剤には、しばしば防腐剤が組み込まれる。エマルジョン製剤に含まれる一般的に使用される防腐剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が含まれる。また、製剤の劣化を阻止するために、抗酸化剤も一般的にエマルジョン製剤に添加される。使用される抗酸化剤は、フリーラジカルスカベンジャー、例えば、トコフェロール、アルキルガレート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、または還元剤、例えば、アスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウム、ならびに抗酸化相乗剤、例えば、クエン酸、酒石酸、およびレシチンであり得る。

皮膚、経口、および非経口経路を介するエマルジョン製剤の適用、ならびにそれらを製造するための方法は、文献で概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照のこと）。経口送達用のエマルジョン製剤は、製剤化の容易さ、ならびに吸収および生物学的利用能の見地からの有効性から、非常に広範に使用されている（例えば、Ａｎｓｅｌ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照のこと）。鉱油基材の緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養調製物が、ｏ／ｗ型エマルジョンとして一般的に経口投与されている材料に含まれる。

本発明の一実施形態において、ｉＲＮＡおよび核酸の組成物が、マイクロエマルジョンとして製剤化される。マイクロエマルジョンは、水、油、および単一の、光学的に等方性かつ熱力学的に安定な液体溶液である両親媒性物質の系として定義することができる（例えば、Ａｎｓｅｌ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５を参照のこと）。典型的には、マイクロエマルジョンは、まず油を界面活性剤水溶液中に分散し、次に十分な量の第４の構成成分、一般には中間鎖長のアルコールを添加して透明な系を形成することにより調製される、系である。したがって、マイクロエマルジョンはまた、表面活性分子の界面薄膜により安定化される、２つの非混和液の熱力学的に安定で等方的な、透明の分散物質としても記載されている（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，ｉｎ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ１８５−２１５）。マイクロエマルジョンは、一般的に、油、水、界面活性剤、共界面活性剤、および電解質を含む、３〜５つの構成成分の組み合わせを通じて調製される。マイクロエマルジョンが油中水（ｗ／ｏ）型、または水中油（ｏ／ｗ）型であるかは、使用される油および界面活性剤の性質、ならびに界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的な畳み込みに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。

状態図を利用する現象論的手法が広範に研究されており、マイクロエマルジョンを製剤化する方法についての包括的な知識を当業者にもたらしている（例えば、Ａｎｓｅｌ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５、Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５を参照のこと）。従来のエマルジョンと比較して、マイクロエマルジョンは、自然発生的に形成される熱力学的に安定な液滴の製剤において、非水溶性薬物を可溶化する利点を提示する。

マイクロエマルジョンの調製に使用される界面活性剤には、単独、または共界面活性剤と組み合わせた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセクイオレエート（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）が含まれるが、これらに限定されない。共界面活性剤は、通常、エタノール、１−プロパノール、および１−ブタノール等の短鎖アルコールであるが、界面活性剤の薄膜中に浸透し、その結果、界面活性剤分子の間に生成される空隙のために不規則な薄膜を形成することにより、界面流動性を増加させる役目を果たす。しかしながら、マイクロエマルジョンは、共界面活性剤の使用を伴わずに調製することができ、アルコールを含まない自己乳化型のマイクロエマルジョン系が、当該技術分野において既知である。水相は、典型的には、水、該薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得るが、これらに限定されない。油相には、Ｃａｐｔｅｘ３００、Ｃａｐｔｅｘ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）のモノ、ジ、およびトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリ糖化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）グリセリド、飽和ポリ糖化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油、ならびにシリコーンオイル等の材料が含まれ得るが、これらに限定されない。

マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化、および薬物吸収の亢進の見地から、特に興味深い。ペプチドを含む薬物の経口での生物学的利用能を亢進させるために、脂質基剤のマイクロエマルジョン（ｏ／ｗ型およびｗ／ｏ型の両方）が提案されている（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号、第７，０６３，８６０号、第７，０７０，８０２号、第７，１５７，０９９号、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５を参照のこと）。マイクロエマルジョンは、改善された薬物の可溶化、酵素的加水分解からの薬物の保護、界面活性剤が誘発する膜流動性および透過性における変化による薬物吸収の潜在的な亢進、調製の容易さ、固形剤形を超える経口投与の容易さ、改善された臨床的効力、および低減した毒性の利点を提供する（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号、第７，０６３，８６０号、第７，０７０，８０２号、第７，１５７，０９９号、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５、Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３を参照のこと）。しばしば、マイクロエマルジョンは、その構成成分が周囲温度で引き合わされると、自然発生的に形成され得る。これは、熱不安定性の薬物、ペプチド、またはｉＲＮＡを製剤化する際に特に有利であり得る。また、マイクロエマルジョンは、化粧用途および薬学的用途の双方における活性構成成分の経皮送達に効果的である。本発明のマイクロエマルジョン組成物および製剤は、消化管からのｉＲＮＡおよび核酸の向上された体内吸収を促進し、ｉＲＮＡおよび核酸の局所的な細胞取り込みを改善することが期待される。

また、本発明のマイクロエマルジョンは、製剤の特性を改善し、本発明のｉＲＮＡおよび核酸の吸収を亢進させるための、モノステアリン酸ソルビタン（Ｇｒｉｌｌ ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透促進剤等のさらなる構成成分および添加剤を含有することもできる。本発明のマイクロエマルジョンに使用される浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤の、５つの大きなカテゴリーのうちの１つに属するものとして分類することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらのクラスのそれぞれが、上述されている。

浸透促進剤
一実施形態において、本発明は、核酸、特にｉＲＮＡの、動物の皮膚への効率的な送達をもたらすために、種々の浸透促進剤を用いる。ほとんどの薬物は、イオン化および非イオン化の両方の形態で溶液中に存在する。しかしながら、通常脂溶性または親油性の薬物のみが、容易に細胞膜を横断する。横断される膜が浸透促進剤で処理されている場合、非親油性薬物でさえも、細胞膜を横断し得ることが発見されている。非親油性薬物の細胞膜を横断する拡散の補助に加えて、浸透促進剤は、親油性薬物の透過性も亢進する。

浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤の、５つの大きなカテゴリーのうちの１つに属するものとして分類することができる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照のこと）。浸透促進剤の前述のクラスのそれぞれについて、以下により詳細に記載する。

界面活性剤：本発明に関連して、界面活性剤（または「表面活性剤」）とは、水溶液中に溶解されると、溶液の表面張力または該水溶液と別の液体との間の界面張力を減少させ、粘膜を通るｉＲＮＡの吸収が亢進されるという結果をもたらす、化学物質である。胆汁塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照のこと）、ならびにＦＣ−４３等のペルフルオロ化合物エマルジョンが含まれる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）。

脂肪酸：浸透促進剤として作用する種々の脂肪酸およびそれらの誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ_１−２０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル、およびｔ−ブチル）、ならびにそれらのモノグリセリドおよびジグリセリド（すなわち、オレアート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレアート等）が含まれる（例えば、Ｔｏｕｉｔｏｕ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３、Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４を参照のこと）。

胆汁塩：胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が含まれる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２、Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ'ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５を参照のこと）。種々の天然胆汁塩、およびそれらの合成誘導体は、浸透促進剤として作用する。したがって、「胆汁塩」という用語には、胆汁の天然に存在する構成成分のうちのいずれも、ならびにそれらの合成誘導体のうちのいずれもが含まれる。好適な胆汁塩には、例えば、コール酸（もしくはその薬学的に許容されるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｕｃｈｏｌａｔｅ））、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が含まれる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ７８２−７８３、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５、Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３を参照のこと）。

キレート剤：本発明に関連して使用されるキレート剤は、金属イオンとの複合体を形成することにより溶液から金属イオンを除去し、粘膜を通るｉＲＮＡの吸収の亢進という結果をもたらす化合物として、定義することができる。本発明における浸透促進剤としての使用に関して、ほとんどの特徴付けられたＤＮＡヌクレアーゼは触媒作用に二価金属イオンを必要とすることから、キレート剤により阻害されるため、キレート剤は、ＤＮアーゼ阻害剤としても機能するさらなる利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５−３３９）。好適なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレート、およびホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、およびβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｋａｔｄａｒｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ９２、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３、Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１を参照のこと）。

非キレート非界面活性剤：本明細書で使用される、非キレート非界面活性剤の浸透促進化合物は、キレート剤または界面活性剤としてわずかな活性しか示さないが、それにもかかわらず消化器粘膜を通じてのｉＲＮＡの吸収を亢進する化合物として、定義することができる（例えば、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３を参照のこと）。このクラスの浸透促進剤には、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ９２）、ならびにジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾン等の非ステロイド性抗炎症薬（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）が含まれる。

細胞レベルでｉＲＮＡの取り込みを亢進させる剤はまた、本発明の薬学的組成物および他の組成物に添加することもできる。例えば、リポフェクチン等のカチオン性脂質（Ｊｕｎｉｃｈｉらの米国特許第５，７０５，１８８号）、カチオングリセロール誘導体、およびポリリシン等のポリカチオン性分子（ＬｏｌｌｏらのＰＣＴ出願ＷＯ９７／３０７３１）もまた、ｄｓＲＮＡの細胞への取り込みを亢進させることが知られている。市販の形質移入試薬の例には、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ），Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、またはＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−５０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓ^a Ｄ１ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ （Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）等が含まれる。

他の剤を利用して、エチレングリコールおよびプロピレングリコール等のグリコール、２−ピロール等のピロール、アゾン、ならびにリモネンおよびメントン等のテルペンを含む、投与された核酸の浸透を亢進させることができる。

担体
また、本発明の特定の組成物には、製剤中に担体化合物が組み込まれる。本明細書で使用される、「担体化合物」または「担体」は、不活性（すなわち、それ自体生物活性を有さない）であるが、例えば、生物活性のある核酸の分解、または循環からのその除去の促進により、生物活性を有する核酸の生物学的利用能を減少させるインビボ過程により、核酸として認識される、核酸、またはその類似体を指すことができる。核酸と担体化合物との同時投与は、典型的には後者の物質を過剰に伴い、おそらく共通の受容体に対する担体化合物と核酸との間の競合により、肝臓、腎臓、または他の循環外の貯蔵所で回収される核酸の量の著しい減少をもたらし得る。例えば、肝組織中の部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、それがポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、または４−アセトアミド−４'イソチオシアノ−スチルベン−２，２'−ジスルホン酸と同時投与されるとき、減少され得る（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１、Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３。

賦形剤
担体化合物とは対照的に、「薬学的担体」または「賦形剤」は、１つまたはそれ以上の核酸を動物に送達するための、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性な媒体である。賦形剤は液体または固体であり得、核酸および所定の薬学的組成物の他の構成成分と組み合わされたときに、所望の用量、軟度等を与えるように、計画された投与の様態を念頭において選択される。典型的な薬学的担体としては、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、またはリン酸水素カルシウム等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアレート、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム等）、ならびに湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）が含まれるが、これらに限定されない。

また、核酸と有害に反応しない、非経口でない投与に好適な薬学的に許容される有機または無機賦形剤を、本発明の組成物を製剤化するために使用することができる。好適な薬学的に許容される担体としては、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これらに限定されない。

核酸の局所投与用の製剤には、滅菌および非滅菌水溶液、アルコール等の一般的な溶媒中の非水溶液、または液体もしくは固形の油基剤中の核酸の溶液が含まれ得る。該溶液は、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る。核酸と有害に反応しない、非経口でない投与に好適な薬学的に許容される有機または無機賦形剤を使用することができる。

好適な薬学的に許容される賦形剤には、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これらに限定されない。

他の構成成分
本発明の組成物は、薬学的組成物中に従来認められる他の補助的な構成成分を、それらの当該技術分野において確立された使用量レベルで、さらに含有することができる。したがって、例えば、本組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬、または抗炎症薬等の、適合性のさらなる薬学的に活性な材料を含有してもよいか、あるいは、染料、香味剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤等の、本発明の組成物の種々の剤形に物理的に製剤化するために有用なさらなる材料を含有してもよい。しかしながら、かかる材料は、添加されたときに、本発明の組成物の構成成分の生物活性を過度に妨げてはならない。該製剤を滅菌することができ、かつ、所望される場合には、補助的な剤、例えば、該製剤の１つまたは複数の核酸と有害に相互作用しない滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝液、着色物質、香味物質、および／または芳香物質等と混合することができる。

水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有することができる。また、懸濁液は、安定剤も含有することができる。

幾つかの実施形態において、本発明で特徴となる薬学的組成物には、（ａ）１つまたはそれ以上のｉＲＮＡ化合物、および（ｂ）非ＲＮＡｉ機序により機能する１つまたはそれ以上の生物剤が含まれる。かかる生物製剤の例には、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、もしくはＢ７−Ｈ１（ＣＤ８０）のうちの１つまたはそれ以上（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、もしくはＢ７−Ｈ１に対するモノクローナル抗体）、または１つまたはそれ以上の組み換えサイトカイン（例えば、ＩＬ６、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ）を標的とする生物製剤が含まれる。

かかる化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）、およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順により決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を呈する化合物が好ましい。

細胞培養アッセイ法および動物研究から得られるデータを、ヒトにおける使用のための一連の投薬量の処方決定に使用することができる。本明細書で特徴となる組成物の投薬量は、一般に、ほとんどまたは全く毒性のないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存して、この範囲内で異なり得る。本発明で特徴となる方法において使用されるいずれの化合物についても、治療上有効な用量は、まず細胞培養アッセイ法から推定することができる。用量は、細胞培養において決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の半値阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物または適切な場合には標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を達成する（例えば、該ポリペプチドの濃度の低下を達成すること）ように、動物モデルにおいて処方することができる。かかる情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。

それらの投与に加えて、上述のように、本明細書で記載されるｉＲＮＡは、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現により媒介される病理過程の処置に効果的な他の既知の剤と組み合わせて投与することができる。いずれの場合においても、投与する医師は、当該技術分野において既知であるか、または本明細書に記載される、標準的な有効性の測定値を使用して認められた結果に基づいて、ｉＲＮＡ投与の量およびタイミングを調整することができる。

ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現により引き起こされる疾患を治療するための方法
本発明は、特に、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１を標的とするｉＲＮＡ、およびＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１媒介性障害もしくは疾患の治療のために、少なくとも１つのかかるｉＲＮＡを含有する組成物の使用に関する。例えば、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡを含有する組成物は、癌の治療のために使用される。本明細書で使用される、癌とは、周辺組織に侵襲し、新たな身体部位に転移する傾向がある未分化細胞の増殖を特徴とする様々な悪性新生物のいずれかを指し、そのような悪性新生物成長を特徴とする病理学的状態も指す。癌は、腫瘍または血液学的悪性腫瘍であり得、これには、肛門、膀胱、胆管、骨、脳、乳房、頸部、結腸／直腸、子宮内膜、食道、眼、胆嚢、頭頸部、肝臓、腎臓、喉頭、肺、縦隔（胸部）、口腔、卵巣、膵臓、陰茎、前立腺、皮膚、小腸、胃、脊髄、尾骨、精巣、甲状腺、および子宮に見出される癌または腫瘍等の、全ての種類のリンパ腫／白血病、癌腫、および肉腫が含まれるが、これらに限定されない。

白血病、または、白色血液細胞、すなわち、白血球の異常増殖により特徴付けられる血液もしくは骨髄の癌は、４つの主要な分類に分けられることができ、これには、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨肉腫性白血病もしくは急性脊髄白血病（ＡＭＬ）（染色体１０と１１［ｔ（１０，１１）］、染色体８と２１［ｔ（８；２１）］、染色体１５と１７［ｔ（１５；１７）］との間に転座を有するＡＭＬおよび染色体１６番逆位［ｉｎｖ（１６）］を有するＡＭＬ；以前にＡＭＬに転換する骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）もしくは骨髄増殖性疾患を患ったことがある患者を含む多系列の異形成を伴うＡＭＬ；療法関連のＡＭＬおよび骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）（このカテゴリーには、以前に化学療法および／もしくは放射線療法を受けたことがあり、その後、ＡＭＬもしくはＭＤＳを発症した患者が含まれる）；（ｄ）上のカテゴリーには分類されないＡＭＬの亜類型を含む、他の形では分類されないＡＭＬ；ならびに（ｅ）白血病細胞が骨髄もしくはリンパ球様細胞として分類することができない場合か、あるいは両方の細胞型が存在する場合に生じる、あいまいな系統の急性白血病）、ならびに慢性骨肉腫性白血病（ＣＭＬ）が含まれる。

癌腫の種類としては、乳頭腫／癌腫、絨毛腫、内胚葉洞腫瘍、奇形腫、腺腫／腺癌、黒色腫、線維腫、脂肪腫、平滑筋腫、横紋筋腫、中皮腫、血管腫、骨腫、軟骨腫、神経膠腫、リンパ腫／白血病、扁平上皮癌、小細胞癌、大細胞未分化癌、基底細胞癌、および副鼻腔未分化癌が含まれるが、これらに限定されない。

肉腫の種類としては、胞状軟部肉種のような軟部組織肉腫、血管肉腫、皮膚線維肉腫、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管外皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、およびアスキン腫瘍、ユーイング肉腫（原始神経外胚葉性腫瘍）、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、および軟骨肉腫が含まれるが、これらに限定されない。

本発明は、さらに、例えば、これらの障害を治療するために現在用いられているもの等の、他の薬剤および／または他の治療方法、例えば、既知の薬剤および／または既知の治療方法と併用して、例えば、癌を治療するための、ｉＲＮＡまたはその薬学的組成物の使用に関する。例えば、ｉＲＮＡおよびその薬学的組成物はまた、生物学的製剤、化学療法、および放射線療法等の１つまたはそれ以上のさらなる抗癌治療と併用して投与することもできる。したがって、治療は、例えば、イマチニブ（グリーバック）、全トランスレチノイン酸、モノクローナル抗体治療（ゲムツズマブ、オゾガマイシン）、化学療法（例えば、クロラムブシル、プレドニゾン、プレドニゾロン、ビンクリスチン、シタラビン、クロファラビン、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、デシタビン、ＭＤＲ１の阻害剤）、リツキシマブ、インターフェロン−α、アントラサイクリン系薬物（ダウノルビシンもしくはイダルビシン等）、Ｌ−アスパラギナーゼ、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ブレオマイシン、フルダラビン、エトポシド、ペントスタチン、もしくはクラドリビン）、骨髄移植、幹細胞移植、放射線療法、抗代謝物薬物（メトトレキサートおよび６−メルカプトプリン）、またはその任意の組み合わせを含むことができる。

放射線治療（放射線療法、Ｘ線療法、または照射とも呼ばれる）は、癌細胞を殺滅し、腫瘍を縮小させるために、イオン化放射線の使用である。放射線治療は、外照射療法（ＥＢＲＴ）により外部から実施することも、近接照射療法により内部から実施することもできる。放射線治療の効果は、治療される領域に限局かつ限定される。放射線治療を用いて、脳癌、乳癌、頸癌、喉頭癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、子宮癌、または軟部組織肉腫を含むほぼ全ての種類の固形腫瘍を治療することができる。また、放射線を用いて、白血病およびリンパ腫も治療する。

化学療法は、癌細胞を破壊することができる薬物による癌の治療である。現行の使用において、「化学療法」という用語は、通常、標的療法とは対照的に、急速に分裂する細胞全般に影響を及ぼす細胞毒性薬を指す。化学療法薬は、様々な可能な方法で、細胞分裂、例えば、ＤＮＡの複製、または新たに形成された染色体の分離を妨害する。化学療法の大半の形態は、急速に分裂する細胞の全てを標的とし、かつ癌細胞に対して特異的であるわけではないが、正常細胞が通常、ＤＮＡ損傷を修復できるが、多くの癌細胞がＤＮＡ損傷を修復できないことから、ある程度の特異性が得られる場合もある。大半の化学療法レジメンは、併用して実施される。例示的な化学療法剤としては、５−ＦＵエンハンサー、９−ＡＣ、ＡＧ２０３７、ＡＧ３３４０、アグリカネース阻害剤、アミノグルテチミド、アムサクリン（Ａｍｓａｃｒｉｎｅ）（ｍ−ＡＭＳＡ）、アスパラギナーゼ、アザシチジン（Ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、バチマスタート（Ｂａｔｉｍａｓｔａｔ）（ＢＢ９４）、ＢＡＹ１２−９５６６、ＢＣＨ−４５５６、ビス−ナフタルイミド、ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆａｎ）、カペシタビン（Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、カルムスタイン（Ｃａｒｍｕｓｔａｉｎｅ）＋ポリフェプルオサン（Ｐｏｌｉｆｅｐｒ Ｏｓａｎ）、ｃｄｋ４／ｃｄｋ２阻害剤、クロロブシル（Ｃｈｌｏｒｏｍｂｕｃｉｌ）、ＣＩ−９９４、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、クラドリビン（Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、ＣＳ−６８２、シタラビン（Ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）ＨＣｌ、Ｄ２１６３、ダクチノマイシン（Ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）ＨＣｌ、デポサイト（ＤｅｐｏＣｙｔ）、デキシホサミド（Ｄｅｘｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ドラスタイン（Ｄｏｌａｓｔａｉｎ）、ドキシフルリジン（Ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキソルブシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ＤＸ８９５１ｆ、Ｅ７０７０、ＥＧＦＲ、エピルビシン（Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、エリスロポイエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、エストラムスチン（Ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）リン酸ナトリウム、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）（ＶＰ１６−２１３）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＦＫ３１７、フラボピリドール（Ｆｌａｖｏｐｉｒｉｄｏｌ）、フロキシウリジン（Ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、フラジリン（Ｆｒａｇｙｌｉｎｅ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、ヒドロキシウレア（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド（Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、インターフェロンアルファ２ａ、インターフェロンアルファ２ｂ、インターロイキン２、イリノテカン（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、ＩＳＩ６４１、クレスチン（Ｋｒｅｓｔｉｎ）、レモナール（Ｌｅｍｏｎａｌ）ＤＰ２２０２、酢酸ロイプロリド（Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）（ＬＨＲＨ放出因子類似体）、レバミゾール（Ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）、ＬｉＧＬＡ（リチウム−γリノレネート）、ロジンシーズ（Ｌｏｄｉｎｅ Ｓｅｅｄｓ）、ロメテクソール、ロムスチン（Ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）（ＣＣＮＵ）、マリミスタット（Ｍａｒｉｍｉｓｔａｔ）、塩酸メクロレタミン（窒素マスタード）、酢酸メゲステロール、メグラミン（Ｍｅｇｌａｍｉｎｅ）ＧＬＡ、メルカプトプリン、メスナ（Ｍｅｓｎａ）、ミトグアゾン（Ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ（メチルＧＡＧ；メチルグリオキサール ビス−グアニルヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、ミトタン（Ｍｉｔｏｔａｎｅ）（ｏ．ｐ'−ＤＤＤ）、ミトキサントロン（Ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ミトキサントロンＨＣｌ、ＭＭＩ２７０、ＭＭＰ、ＭＴＡ／ＬＹ２３１５１４、オクトレオチド（Ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）、ＯＤＮ６９８、ＯＫ−４３２、オーラルプラチナム（Ｏｒａｌ Ｐｌａｔｉｎｕｍ）、オーラルトキソイド（Ｏｒａｌ Ｔａｘｏｉｄ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（タキソール（ＴＡＸＯＬ）（登録商標））、ＰＡＲＰ阻害剤、ＰＤ１８３８０５、ペントスタチン（Ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）（２'デオキシコフォルミシン）、ＰＫＣ４１２、プリカミシン（Ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、プロカルバジン（Ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）ＨＣｌ、ＰＳＣ８３３、ラリトレキセド（Ｒａｌｉｔｒｅｘｅｄ）、ＲＡＳファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＲＡＳ癌遺伝子阻害剤、セムスチン（Ｓｅｍｕｓｔｉｎｅ）（メチル−ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、スラミン（Ｓｕｒａｍｉｎ）、クエン酸タモキシフェン、タキサン（Ｔａｘａｎｅ）類似体、テモゾロミド（Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、テニポシド（Ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）（ＶＭ−２６）、チオグアニン（Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、チオテパ（Ｔｈｉｏｔｅｐａ）、トポテカン（Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、チロシンキナーゼ、ＵＦＴ（テガフル／ウラシル）、バルルビシン（Ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンデシン、ＶＸ−７１０、ＶＸ−８５３、ＹＭ１１６、ＺＤ０１０１、ＺＤ０４７３／アノルムド（Ａｎｏｒｍｅｄ）、ＺＤ１８３９、ＺＤ９３３１が挙げられる。

生物学的療法は、癌と闘うために、または幾つかの癌治療により生じ得る副作用を軽減するために、直接あるいは間接的に身体の免疫系を用いる。ある意味で、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の標的化は、例えば、腫瘍に対して免疫系の作用を刺激することができるという点において、療法のこの群内であると考えられ得る。しかしながら、このアプローチはまた、他のそのような生物学的アプローチとともに考えることもでき、例えば、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、モノクローナル抗体、ワクチン、遺伝子療法、および非特異的免疫賦活剤等の投与等の免疫応答修飾療法はまた、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の阻害と併用される抗癌療法として想定される。小分子標的療法薬物は、一般に、チロシンキナーゼ阻害剤のイマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ／Ｇｌｉｖｅｃ）およびゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）等の、癌細胞内の突然変異タンパク質、過剰発現タンパク質、またはそうでなければ他の重要なタンパク質上の酵素ドメインの阻害剤である。ｉＲＮＡまたはその薬学的組成物で用いることができるモノクローナル抗体療法の例としては、乳癌で使用される抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）および様々なＢ細胞悪性腫瘍で使用される抗ＣＤ２０抗体リツキシマブが挙げられる。特定のホルモンを供給または遮断することにより、一部の癌の増殖を阻害する。ホルモン感受性腫瘍の一般的な例には、特定の種類の乳癌および前立腺癌が含まれる。エストロゲンまたはテストステロンの除去または遮断は、しばしば、重要なさらなる治療である。特定の癌において、プロゲストゲン等のホルモン作動薬の投与は、治療に有益であり得る。

癌免疫療法は、患者自身の免疫系が腫瘍と戦うことを誘発するように設計された治療ストラテジーの多様な集合を指し、表在性膀胱癌に対する膀胱内ＢＣＧ免疫療法、悪性黒色腫および腎細胞癌等に対する特定の免疫応答を生じるためのワクチン、前立腺癌に対するＳｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔの使用が含まれるが、これらに限定されず、前立腺由来の細胞に対する特異的免疫応答を誘導するために、患者由来の樹枝状細胞に、前立腺酸性フォスファターゼペプチドを負荷する。

幾つかの実施形態において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１を標的とするｉＲＮＡは、血管形成阻害剤と併用して投与される。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法で用いる血管形成阻害剤としては、特異的な血管新生促進成長因子および／またはそれらの受容体を対象とするモノクローナル抗体療法が含まれるが、これに限定されない。これらの例は、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商標））、およびトラツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））である。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法で用いる血管形成阻害剤としては、複数の血管新生促進成長因子受容体の小分子チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）が含まれるが、これに限定されない。抗癌治療として現在認可されている３つのＴＫＩは、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））、およびスニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））である。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法で用いる血管形成阻害剤としては、テムシロリムス（Ｔｏｒｉｃｅｌ（商標））、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））、サリドマイド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標））、およびドキシサイクリン等のｍＴＯＲ（哺乳動物ラパマイシン標的）の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。

他の実施形態において、本明細書に記載される方法で用いる血管形成阻害剤には、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））、およびソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））が含まれるが、これらに限定されない、ＶＥＧＦ経路を標的とする１つまたはそれ以上の薬物が含まれる。さらなるＶＥＧＦ阻害剤には、ＣＰ−５４７，６３２（３−（４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−５−［３−（４−ピロリジン１−イル−ブチル）−ウレイド］−イソチアゾール−４−カルボン酸アミド塩酸塩；Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．，ＮＹ）、ＡＧ１３７３６、ＡＧ２８２６２（Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．）、ＳＵ５４１６、ＳＵ１１２４８、およびＳＵ６６６８（旧Ｓｕｇｅｎ Ｉｎｃ．、現在はＰｆｉｚｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ＺＤ−６４７４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＶＥＧＦ−Ｒ２および−Ｒ１を阻害するＺＤ４１９０（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＣＥＰ−７０５５（Ｃｅｐｈａｌｏｎ Ｉｎｃ．，Ｆｒａｚｅｒ，ＰＡ）、ＰＫＣ４１２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＡＥＥ７８８（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＡＺＤ−２１７１）、ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）（ＢＡＹ４３−９００６、ソラフェニブ；Ｂａｙｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｏｎｙｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、バタラニブ（ＰＴＫ−７８７、ＺＫ−２２２５８４としても知られる：Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＆ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ：ＡＧ）、ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ペガプタニブオクタナトリウム、ＮＸ−１８３８、ＥＹＥ−００１、Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．／Ｇｉｌｅａｄ／Ｅｙｅｔｅｃｈ）、ＩＭ８６２（グルファニド二ナトリウム、Ｃｙｔｒａｎ Ｉｎｃ．ｏｆ Ｋｉｒｋｌａｎｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡ）、ＶＥＧＦＲ２選択的モノクローナル抗体ＤＣ１０１（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、Ｒｉｂｏｚｙｍｅ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）およびＣｈｉｒｏｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の合成リボザイムであるアンギオザイム、Ｓｉｒｎａ−０２７（ｓｉＲＮＡに基づくＶＥＧＦＲ１阻害剤、Ｓｉｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、Ｃａｐｌｏｓｔａｔｉｎ、ＶＥＧＦ受容体の可溶性外部ドメイン、Ｎｅｏｖａｓｔａｔ（AEｔｅｒｎａ Ｚｅｎｔａｒｉｓ Ｉｎｃ；Ｑｕｅｂｅｃ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＺＭ３２３８８１（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ．ＣＡ，ＵＳＡ）、ペガプタニブ（Ｍａｃｕｇｅｎ）（Ｅｙｅｔｅｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、抗ＶＥＧＦアプタマー、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。

他の実施形態において、本明細書に記載される方法で用いる血管形成阻害剤には、α−２抗プラスミン（フラグメント）、アンギオスタチン（プラスミノゲンフラグメント）、抗血管新生促進抗トロンビンＩＩＩ、軟骨由来阻害剤（ＣＤＩ）、ＣＤ５９補体フラグメント、エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩ断片）、フィブロネクチンフラグメント、グロ（ｇｒｏ）−β（Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン）、ヘパリナーゼ ヘパリン六糖類フラグメント、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インターフェロンα／β／γ、インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）、インターロイキン−１２、クリングル５（プラスミノゲンフラグメント）、β−トロンボグロブリン、ＥＧＦ（フラグメント）、ＶＥＧＦ阻害剤、エンドスタチン、フィブロネクチン（４５ｋＤフラグメント）、高分子量キニノゲン（ドメイン５）、ＨＧＦのＮＫ１、ＮＫ２、ＮＫ３フラグメント、ＰＦ−４、セルピンプロテイナーゼ阻害剤８、ＴＧＦ−β−１、トロンボスポンジン−１、プロサポシン、ｐ５３、アンジオアレスチン、メタロプロテイナーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ）、２−メトキシエストラジオール、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、プラスミノゲン活性化阻害剤、プロラクチン１６ｋＤフラグメント、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、レチノイド、テトラヒドロコルチゾール−Ｓ形質転換成長因子β（ＴＧＦ−ｂ）、バスキュロスタチン、およびバソスタチン（カルレティキュリンフラグメント）、パミドロネートサリドマイド、ＴＮＰ４７０、アミノビスホスフォネートゾレドロン酸等のビスホスフォネートファミリー、ＲＣ−３０９５およびＲＣ−３９４０−ＩＩ（Ｂａｊｏ１ ＡＭ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（２００４）９０，２４５−２５２）等のボンベシン／ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）アンタゴニスト、抗ＶＥＧＦペプチドＲＲＫＲＲＲ（ｄＲＫ６）（Ｓｅｕｎｇ−Ａｈ Ｙｏｏ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ，２００５，１７４：５８４６−５８５５）等の、抗血管新生促進因子が含まれる。

疾患の治療、予防、または改善の有効性は、例えば、疾患の増悪、疾患の回復、症状の重症度、疼痛の減少、生活の質、治療効果を持続するために必要とされる医薬の用量、疾患マーカーのレベル、または治療されるもしくは予防のための標的とされるある疾患に適切である任意の他の測定可能なパラメーターを測定することにより、評価することができる。かかるパラメーターのうちのいずれか１つ、またはパラメーターの任意の組み合わせを測定することにより、治療または予防の有効性を観察することは、十分に当業者の能力の範囲内である。ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１を標的とするｉＲＮＡまたはその薬学的組成物の投与に関連して、癌「に対して有効的である」とは、臨床的に適切な様式での投与が、少なくとも患者の統計的に有意な割合に対して有益な効果、例えば、症状の改善、治癒、疾患負荷の減少、腫瘍質量もしくは細胞数の減少、延命、生活の質の改善、または癌の特定の型を治療するのに精通した医師により一般に陽性と認識される他の効果をもたらすことを示す。

治療または予防効果は、疾患状態の１つまたはそれ以上のパラメーターにおいて統計的に有意な改善があるとき、またはそうでなければ失敗により、予想され得る症状の悪化または症状を起こすとき、明らかである。一例として、疾患の測定可能なパラメーターの少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％もしくはそれ以上の好ましい変化は、効果的な治療を示すことができる。既定のｉＲＮＡ薬物またはその薬物の製剤における有効性はまた、当該技術分野で既知のある疾患に対する実験動物モデルを用いて判定することもできる。実験動物モデルを用いるとき、治療の有効性は、マーカーまたは症状の統計的に有意な減少が観察されるとき、明らかである。

本発明は、特に、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１を標的とするｉＲＮＡ、およびＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１媒介性障害もしくは疾患の治療のための少なくとも１つのかかるｉＲＮＡを含有する組成物の使用に関する。例えば、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡを含有する組成物は、例えば、感染症を有する対象における、感染症または障害の治療のために使用される。幾つかの好ましい実施形態において、該対象は、感染症を患っているか、または感染症を患う危険性がある。本明細書で使用される「感染症」とは、宿主内で複製される外来の生物または病原体が宿主内に存在することに起因する疾患または状態を指す。感染症は、典型的には、感染性の生物または病原体による正常な粘膜または他の組織壁の破壊を伴う。感染症を患っている対象は、対象の身体中に存在する客観的に測定可能な感染性の生物または病原体を有する対象である。感染症を患う危険性がある対象は、感染症を発症しやすい対象である。かかる対象には、例えば、感染性の生物または病原体に曝露されたことがわかっているか、またはそれが疑われる対象が含まれ得る。また、感染症を患う危険性がある対象は、感染性の生物または病原体に対する免疫応答を高める能力の障害と関連する状態を有する対象、例えば、先天性または後天性免疫不全症を有する対象、放射線治療もしくは化学療法を受けている対象、火傷を有する対象、外傷を有する対象、外科手術もしくは他の侵襲的な医科処置もしくは歯科処置を受けている対象も含むことができる。

感染症は、関与する感染性の生物または病原体の種類に基づき、大きく、細菌性、ウイルス性、真菌性、または寄生虫性に分類される。また、他のあまり一般的でない型の感染症も当該技術分野で知られており、例えば、リケッチア、マイコプラズマが関与する感染症、ならびにスクレピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）およびプリオン疾患（例えば、クールーおよびクロイツフェルト・ヤコブ病）を引き起こす病原体が挙げられる。感染症を引き起こす細菌、ウイルス、真菌および寄生虫の例は、当該技術分野でよく知られている。感染症は、急性、亜急性、慢性または潜伏性であり得、限局性または全身性であり得る。本明細書で定義される「慢性感染症」とは、先天性免疫応答または適応免疫応答の通常の作用により除去されず、およそ数週間、数ヶ月、および数年の長期間、対象にとどまる感染症を指す。慢性感染症は、感染性病原体の潜伏に反映し得、感染症の症状が存在しない期間、すなわち、無症候期間を含み得る。慢性感染症の例としては、ＨＩＶ感染およびヘルペスウイルス感染が含まれるが、これらに限定されない。さらに、感染症は、宿主における少なくとも１つの相の感染症の生物または病原体のライフサイクル中、主に、細胞内または細胞外であり得る。

例示的なウイルスとしては、レトロウイルス科(Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ)（例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩとも称される）、ＨＩＶ−２、ＬＡＶもしくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩ等のヒト免疫不全ウイルス、ならびにＨＩＶ−ＬＰ等の他の分離株；ピコルナウイルス科(Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ)（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルジオウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科(Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ)（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科(Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ)（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科(Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ)（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科(Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ)（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科(Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ)（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科(Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ)（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス）；アデノウイルス；オルトミクソウイルス科(Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ)（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンヤウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ハンターンウイルス、ブンヤ（ｂｕｎｇａ）ウイルス、フェレボウイルス、およびナイロウイルス）；アレナウイルス科(Ａｒｅｎａ ｖｉｒｉｄａｅ)（出血熱ウイルス）；レオウイルス科(Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ)（例えば、レオウイルス、オルビウイルス（ｏｒｂｉｖｉｕｒｓ）およびロタウイルス、すなわち、ロタウイルスＡ、ロタウイルスＢ、ロタウイルスＣ）；ビルナウイルス科(Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ)；ヘパドナウイルス科(Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ)（Ａ型およびＢ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科(Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ)（パルボウイルス）；パポバウイルス科(Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ)（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科(Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ)（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科(Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ)（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型、ヒトヘルペスウイルス６型、ヒトヘルペスウイルス７型、ヒトヘルペスウイルス８型、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；エプスタイン・バー・ウイルス；ラウス肉腫ウイルス；ウエストナイルウイルス；日本ウマ脳炎、ノーウォーク、乳頭腫ウイルス、パルボウイルスＢ１９；ポックスウイルス科(Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ)（天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科(Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ)（例えば、アフリカブタコレラウイルス）；ならびにＤ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、および未分類ウイルス（例えば、海綿状脳症の病原因子、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトと考えられる）、非Ａ、非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝経腸感染；クラス２＝腸管外感染（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークおよび関連ウイルス、およびアストロウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。

細菌には、グラム陰性菌およびグラム陽性菌の両方が含まれる。グラム陽性菌の例には、パスツレラ菌(Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ)種、ブドウ球菌(Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ)種、およびストレプトコッカス菌(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ)種が含まれる。グラム陰性菌の例には、大腸菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ)、シュードモナス菌(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)種、およびサルモネラ菌(Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ)種が含まれるが、これらに限定されない。感染性細菌の具体例としては、ヘリコバクター・ピロリ種、ボレリア・ブルグドルフェリ(Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ)、レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、マイコバクテリア(Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ)種（例えば、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、Ｍ・イントラセルラレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ・カンサイイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ・ゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｍ・レプラエ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ））、黄色ブドウ球菌(Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ)、淋菌(Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ)、髄膜炎菌(Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ)、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿連鎖球菌(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ)（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ)（ビリダンス群）、大便連鎖球菌(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ)、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ)、病原性カンピロバクター(Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ)種、エンテロコッカス(Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ)種、ヘモフィルス・インフルエンザ(Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（Ｂ型インフルエンザおよび型別不能ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｎｏｎ−ｔｙｐａｂｌｅ））、炭疽菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ)、ジフテリア菌(Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ)、コリネバクテリア(Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ)種、ブタ丹毒菌(Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ)、ウェルシュ菌(Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ)、破傷風菌(Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ)、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス(Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ)属、フソバクテリウム・ヌクレアツム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバチルス・モニリホルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、梅毒トレポネーマ、トレポネーマ・ペルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ属(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)、リケッチア属(Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ)、イスラエル放線菌(Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ)、髄膜炎菌(ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ)、百日咳、肺炎球菌(ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ)、赤痢菌(ｓｈｉｇｅｌｌａ)、破傷風、コレラ菌(Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ)、エルシニア属(ｙｅｒｓｉｎｉａ)、シュードモナス菌(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)種、クロストリジア(Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ)種、チフス菌(Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ)、シゲラ・ディゼンテリエ(Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ)、ペスト菌(Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ)、ブルセラ菌(Ｂｒｕｃｅｌｌａ)種、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リケッチア(Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ)、クラミジア属(Ｃｈｌａｍｙｄｉａ)、ウェルシュ菌種、ボツリヌス菌(Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ)、黄色ブドウ球菌、緑膿菌(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓ)、クリプトスポリジウムパルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、肺炎連鎖球菌(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ)、および百日咳菌(Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ)が含まれるが、これらに限定されない。

例示的な真菌および酵母菌としては、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ)、カンジダ・アルビカンス(Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・ステラトイデア（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・ギリエルモンジィ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・ビスワナチ（Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）、カンジダ・ルシタニアエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、ロドトルラ・ムチラギノーザ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、アスペルギルス・フミガーツス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ)、アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、アスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ,)、クラミジア・トラコマチス(Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ)、コクシジオイデス・イミチス(Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ)、クリプトコックス・ラウレンティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、クリプトコックス・アルビズス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｉｄｕｓ）、クリプトコックス・ガッティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｔｔｉｉ）、ノカルジア属、ヒストプラスマ・カプスラーツム(Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ)、ニューモシスチス・イロベチイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）（またはニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ））、スタキボトリス・チャルトラム（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ ｃｈａｒｔａｒｕｍ）、およびそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

例示的な寄生虫としては、赤痢アメーバ(Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ)、マラリア原虫(Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ)種（熱帯熱マラリア原虫(Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ)、四日熱マラリア原虫(Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ)、卵形マラリア原虫(Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ)、三日熱マラリア原虫(Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ)）、リーシュマニア(Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ)属（熱帯リーシュマニア(Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔｒｏｐｉｃａ)、ブラジル・リーシュマニア(Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ)、ドノバン・リーシュマニア(Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ)）、トキソプラズモシス（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）（トキソプラズマ原虫(Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ)）、トリパノソーマ・ガンビエンス（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｇａｍｂｉｅｎｓｅ）、ローデシアトリパノソーマ(Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ)（アフリカ睡眠病）、クルーズトリパノソーマ(Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ)（シャーガス病）、蠕虫類（扁虫、回虫）、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）、多型バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、ランブル鞭毛虫、およびそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

本発明は、さらに、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１を標的とするｉＲＮＡの使用、ならびに他の薬剤および／もしくは、例えば、かかる感染性の疾患または障害を治療するために現在利用されるもの（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤）等の、既知の薬剤および／もしくは既知の治療方法を用いた他の治療方法と組み合わせて、Ｂ型肝炎等の感染症もしくは慢性細菌感染症の治療のために、少なくとも１つのかかるｉＲＮＡを含有する組成物に関する。例えば、ある実施形態において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１を標的とするｄｓＲＮＡの投与は、抗菌剤と組み合わせて実施される。本明細書に記載される方法に有用な抗菌剤の例としては、天然ペニシリン、半合成ペニシリン、クラブラン酸、セファロスポリン、バシトラシン、アンピシリン、カルベニシリン、オキサシリン、アズロシリン、メズロシリン、ピぺラシリン、メチシリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、セファロシン、セファピリン、セファレキシン、セファマンドール、セファクロール、セファゾリン、セフロキシン、セフォキシチン、セフォタキシーム、セフスロジン、セフェタメト、セフィキシム、セフトリアキソン（ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ）、セフォペラゾン、セフタジジン、モキサラクタム、カルバペネム、イミペネム、モノバクテム（ｍｏｎｏｂａｃｔｅｍ）、ユートレオナム（ｅｕｚｔｒｅｏｎａｍ）、バンコマイシン、ポリミキシン、アムホテリシンＢ、ナイスタチン、イミダゾール、クロトリマゾール、ミコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、フルコナゾール、リファンピン、エタンブートル、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、マクロライド系、アミノグリコシド系、ストレプトマイシン、カナマイシン、トブラマイシン（ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ）、アミカシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、クロロテトラサイクリン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、オレアンドマイシン（ｏｌｅａｎｄｏｍｙｃｉｎ）、アジスロマイシン、クロラムフェニコール、キノロン系、ｃｏ−トリモキサゾール（ｃｏ−ｔｒｉｍｏｘａｚｏｌｅ）、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、ナリジクス酸、テマフロキサシン、スルホンアミド、ガントリシン、およびトリメトプリム；アセダプソン；アセトスルホンナトリウム；アラメシン（Ａｌａｍｅｃｉｎ）；アレキシジン；アムジノシリン；アムジノシリンピボキシル（Ａｍｄｉｎｏｃｉｌｌｉｎ Ｐｉｖｏｘｉｌ）；アミサイクリン；アミフロキサシン；メシル酸アミフロキサシン；アミカシン；硫酸アミカシン；アミノサリチル酸；アミノサリチル酸ナトリウム；アモキシシリン；アンフォマイシン；アンピシリン；アンピシリンナトリウム；アパルシリンナトリウム（Ａｐａｌｃｉｌｌｉｎ Ｓｏｄｉｕｍ）；アパラマイシン；アスパルトシン：硫酸アストロマイシン；アビラマイシン（Ａｖｉｌａｍｙｃｉｎ）；アボパルシン（Ａｖｏｐａｒｃｉｎ）；アジスロマイシン；アズロシリン；アズロシリンナトリウム；塩酸バカンピシリン；バシトラシン；パシトラシンメチレンジスアリシレート（Ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｄｉｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）；バシトラシン亜鉛（Ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ Ｚｉｎｃ）；バンベルマイシン（Ｂａｍｂｅｒｍｙｃｉｎ）；ベンゾイルパスカルシウム（Ｂｅｎｚｏｙｌｐａｓ Ｃａｌｃｉｕｍ）；ベリスロマイシン；硫酸ベタマイシン；ビアペネム；ビニラマイシン；塩酸ビフェナミン；ビスピリチオンマグスルフェクス；ブチカシン；硫酸ブチロシン；硫酸カプレオマイシン；カルバドクス；カルベニシリン二ナトリウム；カルベニシリンインダニルナトリウム；カルベシリンフェニルナトリウム；カルベニシリンカリウム；カルモナムナトリウム；セファクロール；セファドロキシル；セファマンドール；セファマンドールナフェート（Ｃｅｆａｍａｎｄｏｌｅ Ｎａｆａｔｅ）；セファマンドールナトリウム；セファパロール；セファトリジン；セファザフルールナトリウム；セファゾリン；セファゾリンナトリウム；セフブペラゾン；セフジニル；セフェピム（Ｃｅｆｅｐｉｍｅ）；塩酸セフェピム；セフェテコール（Ｃｅｆｅｔｅｃｏｌ）；セフィキシム；塩酸セフメノキシム；セフメタゾール；セフメタゾールナトリウム；セフォニシド一ナトリウム；セフォニシドナトリウム；セフォペラゾンナトリウム；セフォラニド；セフォタキシムナトリウム；セフォテタン；セフォテタン二ナトリウム；塩酸セフォチアム；セフォキシチン；セフォキシチンナトリウム；セフピミゾール；セフピミゾールナトリウム；セフピラミド；セフピラミドナトリウム；硫酸セフピロム；セフポドキシムプロキセチル；セフプロジル；セフロキサジン；セフスロジンナトリウム；セフタジジム；セフチブテン；セフチゾキシムナトリウム；セフトリアキソンナトリウム；セフロキシム；セフロキシムアキセチル；セフロキシムピボキセチル；セフロキシムナトリウム；セファセトリルナトリウム（Ｃｅｐｈａｃｅｔｒｉｌｅ Ｓｏｄｉｕｍ）；セファレキシン；塩酸セファレキシン；セファログリシン；セファロリジン；セファロチンナトリウム；セファピリンナトリウム；セフラジン；塩酸セトサイクリン；セトフェニコール；クロラムフェニコール；クロラムフェニコールパルミテート；クロラムフェニコールパントテネート複合体（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ Ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ）；クロラムフェニコールコハク酸ナトリウム；クロルヘキシジンホスファニレート；クロロキシレノール；重硫酸クロルテトラサイクリン；塩酸クロルテトラサイクリン；シノキサシン；シプロフロキサシン；塩酸シプロフロキサシン；シロレマイシン；クラリスロマイシン；塩酸クリナフロキサシン；クリンダマイシン；塩酸クリンダマイシン；クリンダマイシンパルミテート塩酸塩（Ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ Ｐａｌｍｉｔａｔｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；クリンダマイシンホスフェート；クロファジミン；クロキサシリンベンザチン；クロキサシリンナトリウム；クロキシキン（Ｃｌｏｘｙｑｕｉｎ）；コリスチンメタナトリウム；硫酸コリスチン；クメルマイシン；クメルマイシンナトリウム；シクラシリン（Ｃｙｃｌａｃｉｌｌｉｎ）；サイクロセリン；ダルフォプリスチン；ダプソン；ダプトマイシン；デメクロサイクリン；塩酸デメクロサイクリン；デメサイクリン；デノファンジン；ジアベリジン；ジクロキサシリン；ジクロキサシリンナトリウム；硫酸ジヒドロストレプトマイシン；ジピリチオン；ジリスロマイシン；ドキシサイクリン；ドキシサイクリンカルシウム；ドキシサイクリンフォスファテックス（Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ Ｆｏｓｆａｔｅｘ）；ドキシサイクリンヒクレート（Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ Ｈｙｃｌａｔｅ）；ドロキサシンナトリウム；エノキサシン；エピシリン；塩酸エピテトラサイクリン；エリスロマイシン；エリスロマイシンアシストレート（Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ Ａｃｉｓｔｒａｔｅ）；エリスロマイシンエストレート（Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ Ｅｓｔｏｌａｔｅ）；エリスロマイシンエチルスクシネート（Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ Ｅｔｈｙｌｓｕｃｃｉｎａｔｅ）；エリスロマイシングルセプテート（Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ Ｇｌｕｃｅｐｔａｔｅ）；エリスロマイシンラクトビオネート（Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ Ｌａｃｔｏｂｉｏｎａｔｅ）；エリスロマイシンプロピロネート；エリスロマイシンステアレート；塩酸エタンブートル；エチオナミド；フレロキサシン；フロキサシリン；フルダラニン；フルメキン（Ｆｌｕｍｅｑｕｉｎｅ）；ホスホマイシン；ホスホマイシントロメタミン；フモキシシリン；フラゾリウムクロリド；酒石酸フラゾリウム；フシジン酸ナトリウム；フシジン酸；硫酸ゲンタマイシン；グロキシモナム；グラミシジン；ハロプロジン；ヘタシリン；ヘタシリンカリウム；ヘキセジン；イバフロキサシン；イニペネム；イソコナゾール；イセパマイシン；イソニアジド；ジョサマイシン；硫酸カナマイシン；キタサマイシン；レボフラルタドン；レボプロピルシリンカリウム（Ｌｅｖｏｐｒｏｐｙｌｃｉｌｌｉｎ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ）；レキシスロマイシン；リンコマイシン；リンコマイシン塩酸塩；ロメフロキサシン；ロメフロキサシン塩酸塩；ロメフロキサシンメシレート；口ラカルベフ（Ｌｏｒａｃａｒｂｅｆ）；マフェニド；メクロサイクリン；スルホサリチル酸メクロサイクリン；メガロミシンリン酸カリウム（Ｍｅｇａｌｏｍｉｃｉｎ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；メキドクス；メロペネム；メタサイクリン；塩酸メタサイクリン；メテナミン；メテナミンヒプレート；マンデル酸メテナミン；メチシリンナトリウム；メチオプリム；塩酸メトロニダゾール；リン酸メトロニダゾール；メズロシリン；メズロシリンナトリウム；ミノサイクリン；塩酸ミノサイクリン；塩酸ミリカマイシン；モネンシン；モネンシンナトリウム；ナフシリンナトリウム；ナリジクセートナトリウム；ナリジクス酸；ナタマイシン；ネブラマイシン；ネオマイシンパルミテート；硫酸ネオマイシン；ネオマイシンウンデシレネート；硫酸ネチルミシン；ニュートラマイシン；ニフラデン；ニフラルデゾン；ニフラテル；ニフラトロン；ニフラダジル；ニフルイミド；ニフルピリノール；ニフルキナゾール；ニフルチアゾール；ニトロサイクリン；ニトロフラントイン；ニトロミド；ノルフロキサシン；ノボビオシンナトリウム；オフロキサシン；オルメトプリム；オキサシリンナトリウム；オキシモナム；オキシモナムナトリウム；オキソリン酸；オキシテトラサイクリン；オキシテトラサイクリンカルシウム；塩酸オキシテトラサイクリン；パルジマイシン；パラクロロフェノール；パウロマイシン；ペフロキサシン；ペフロキサシンメシレート；ペナメシリン；ペニシリンＧベンザチン；ペニシリンＧカリウム；ペニシリンＧプロカイン；ペニシリンＧナトリウム；ペニシリンＶ；ペニシリンＶベンザチン；ペニシリンＶヒドラバミン；ペニシリンＶカリウム；ペンチジドンナトリウム；フェニルアミノサリチレート；ピペラシリンナトリウム；ピルベニシリンナトリウム；ピリジシリンナトリウム；塩酸ピリミシン；ピバンピシリン塩酸塩（Ｐｉｖａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ピバンピシリンパモエート；ピバンピシリンプロベネート；硫酸ポリミキシンＢ；ポルフィロマイシン；プロピカシン；ピラジナミド；ピリチオン亜鉛（Ｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ Ｚｉｎｅ）；キンデカミンアセテート（Ｑｕｉｎｄｅｃａｍｉｎｅ Ａｃｅｔａｔｅ）；キヌプリスチン；ラセフェニコール；ラモプラニン；ラニマイシン；レロマイシン；レプロマイシン（Ｒｅｐｒｏｍｉｃｉｎ）；リファブチン；リファメタン；リファメキシル；リファミド；リファンピン；リファペンチン；リファキシミン；ロリテトラサイクリン；硝酸ロリテトラサイクリン；ロサラマイシン（Ｒｏｓａｒａｍｉｃｉｎ）；ロサラミマインブチレート；ロサラマイシンプロピオネート；ロサラマイシンリン酸ナトリウム；ロサラマイシンステアレート；ロソキサシン；ロキサルソン；ロキシスロマイシン；サンサイクリン；サンフェトリネムナトリウム；サルモキシシリン；サルピシリン；スコパファンジン；シソマイシン；硫酸シソマイシン；スパルフロキサシン；塩酸スペクチノマイシン；スピラマイシン；塩酸スタリマイシン；ステフィマイシン；硫酸ストレプトマイシン；ストレプトニコジド（Ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｃｏｚｉｄ）；スルファベンズ；スルファベンズアミド；スルファセタミド；スルファセタミドナトリウム；スルファサイチン（Ｓｕｌｆａｃｙｔｉｎｅ）；サルファジアジン；サルファジアジンナトリウム；スルファドキシン；スルファレン；スルファメラジン；スルファメーテル（Ｓｕｌｆａｍｅｔｅｒ）；スルファメタジン；スルファメチゾール；スルファメトキサゾール；スルファモノメトキシン；スルファモキソール；スルファニレート亜鉛（Ｓｕｌｆａｎｉｌａｔｅ Ｚｉｎｃ）；スルファニトラン；スルファサラジン；スルファソミゾール；スルファチアゾール；スルファザメト（Ｓｕｌｆａｚ
ａｍｅｔ）；スルフィソキサゾール；アセチルスルフィソキサゾール；スルフィソキサゾールジオラミン；スルホミキシン；スロペネム；スルタミシリン；サンシリンナトリウム；塩酸タランピシリン；テイコプラニン；塩酸テマフロキサシン；テモシリン；テトラサイクリン；塩酸テトラサイクリン；テトラサイクリンホスフェート複合体（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ）；テトロキソプリム；チアンフェニコール；チフェンシリンカリウム；チカルシリンクレシルナトリウム；チカルシリン二ナトリウム；チカルシリン一ナトリウム；チクラトン；チオドニウムクロリド；トブラマイシン；硫酸トブラマイシン；トスフロキサシン；トリメトプリム；硫酸トリメトプリム；トリスルファピリミジン；トロールアンドマイシン（Ｔｒｏｌｅａｎｄｏｍｙｃｉｎ）；硫酸トロスペクトロマイシン；チロトリシン；バンコマイシン；塩酸バンコマイシン；バージニアマイシン；およびゾルバマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。

他の実施形態において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１を標的とするｄｓＲＮＡの投与は、抗ウイルスの医薬または剤と組み合わせて実施される。本明細書に記載される方法に有用な例示的な抗ウイルス剤には、免疫グロブリン、アマンタジン、インターフェロン、ヌクレオシド類似体、およびタンパク質分解酵素阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。抗ウイルス剤の具体的な例としては、アセマナン（Ａｃｅｍａｎｎａｎ）、アシクロビル（Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）、アシクロビルナトリウム（Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ Ｓｏｄｉｕｍ）、アデホビル（Ａｄｅｆｏｖｉｒ）、アロブジン（Ａｌｏｖｕｄｉｎｅ）、アルビルセプトスドトクス（Ａｌｖｉｒｃｅｐｔ Ｓｕｄｏｔｏｘ）、アマンタジン塩酸塩、アラノチン（Ａｒａｎｏｔｉｎ）、アリルドン（Ａｒｉｌｄｏｎｅ）、アテビルジンメシレート（Ａｔｅｖｉｒｄｉｎｅ Ｍｅｓｙｌａｔｅ）、アブリジン（Ａｖｒｉｄｉｎｅ）、シドホビル、シパムフィリン（Ｃｉｐａｍｆｙｌｌｉｎｅ）、シタラビン塩酸塩、デルビルジンメシレート（Ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ Ｍｅｓｙｌａｔｅ）、デシクロビル（Ｄｅｓｃｉｃｌｏｖｉｒ）、ジダノシン（Ｄｉｄａｎｏｓｉｎｅ）、ジソキサリル（Ｄｉｓｏｘａｒｉｌ）、エドクスウジン（Ｅｄｏｘｕｄｉｎｅ）、エンビラデン（Ｅｎｖｉｒａｄｅｎｅ）、エンビロキシム（Ｅｎｖｉｒｏｘｉｍｅ）、ファムシクロビル（Ｆａｍｃｉｃｌｏｖｉｒ）、ファモチン塩酸塩（Ｆａｍｏｔｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、フィアシタビン（Ｆｉａｃｉｔａｂｉｎｅ）、フィアルウリジン（Ｆｉａｌｕｒｉｄｉｎｅ）、フォサリレート（Ｆｏｓａｒｉｌａｔｅ）、フォスカメットナトリウム（Ｆｏｓｃａｍｅｔ Ｓｏｄｉｕｍ）、フォスホネットナトリウム（Ｆｏｓｆｏｎｅｔ Ｓｏｄｉｕｍ）、ガンシクロビル（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、ガンシクロビルナトリウム（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ ｓｏｄｉｕｍ）、イドクスウリジン（Ｉｎｄｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ケトキサール（Ｋｅｔｈｏｘａｌ）、ラミブジン（Ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）、ロブカビル（Ｌｏｂｕｃａｖｉｒ）、メモチン塩酸塩（Ｍｅｍｏｔｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メチサゾン（Ｍｅｔｈｉｓａｚｏｎｅ）、ネビラピン（Ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ）、ペンジクロビル（Ｐｅｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、ピロダビル（Ｐｉｒｏｄａｖｉｒ）、リバビリン、リマンタジン塩酸塩（Ｒｉｍａｎｔａｄｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、サキナビルメシレート（Ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ Ｍｅｓｙｌａｔｅ）、ソマンタジン塩酸塩（Ｓｏｍａｎｔａｄｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ソリブジン、スタトロン（Ｓｔａｔｏｌｏｎ）、スタブジン、チロロン塩酸塩（Ｔｉｌｏｒｏｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、トリフルリジン（Ｔｒｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、バラシクロビル塩酸塩（Ｖａｌａｃｙｃｌｏｖｉｒ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ビダラビン、ビダラビンホスフェート（Ｖｉｄａｒａｂｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ビダラビンリン酸ナトリウム（Ｖｉｄａｒａｂｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ビロキシム（Ｖｉｒｏｘｉｍｅ）、ザルシタビン（Ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）、ジドブジン、およびジンビロキシム（Ｚｉｎｖｉｒｏｘｉｍｅ）が含まれるが、これらに限定されない。

他の実施形態において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１を標的とするｄｓＲＮＡの投与は、抗真菌の医薬または剤と組み合わせて実施される。「抗真菌薬」は、感染性の真菌を殺すか、または増殖あるいは機能を阻害する剤である。抗真菌薬は、しばしばその作用機序により分類される。幾つかの抗真菌剤は、グルコースシンターゼを阻害することにより、細胞壁阻害剤として機能し、他の抗真菌剤は、膜の完全性を不安定にすることにより機能し、他の抗真菌剤は、キチン（例えば、キチナーゼ）または免疫抑制（５０１クリーム）を壊すことにより機能する。したがって、本明細書に記載される方法に有用な例示的な抗真菌薬としては、イミダゾール類、５０１クリーム、およびアクリソルシン（Ａｃｒｉｓｏｒｃｉｎ）、アンブルチシン（Ａｍｂｒｕｔｉｃｉｎ）、アモロルフィン（Ａｍｏｒｏｌｆｉｎｅ）、アンホテリシン（Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）Ｂ、アザコナゾール（Ａｚａｃｏｎａｚｏｌｅ）、アザセリン（Ａｚａｓｅｒｉｎｅ）、バシフジン（Ｂａｓｉｆｕｎｇｉｎ）、ＢＡＹ３８−９５０２、ビフォナゾール（Ｂｉｆｏｎａｚｏｌｅ）、ピフェナミン塩酸塩（Ｂｉｐｈｅｎａｍｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ビスフィルチオンマグスルフェクス（Ｂｉｓｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ Ｍａｇｓｕｌｆｅｘ）、ブテナフィン（Ｂｕｔｅｎａｆｉｎｅ）、ブトコナゾールニトレート（Ｂｕｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ Ｎｉｔｒａｔｅ）、ウンデシレン酸カルシウム（Ｃａｌｃｉｕｍ Ｕｎｄｅｃｙｌｅｎａｔｅ）、カンジシジン（Ｃａｎｄｉｃｉｄｉｎ）、カルボル−フクシン（Ｃａｒｂｏｌ−Ｆｕｃｈｓｉｎ）、キチナーゼ（Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）、クロルダントイン（Ｃｈｌｏｒｄａｎｔｏｉｎ）、シクロピロクス（Ｃｉｃｌｏｐｉｒｏｘ）、シクロピロクスオラミン（Ｃｉｃｌｏｐｉｒｏｘ Ｏｌａｍｉｎｅ）、シロファンジン（Ｃｉｌｏｆｕｎｇｉｎ）、シスコナゾール（Ｃｉｓｃｏｎａｚｏｌｅ）、クロトリマゾール（Ｃｌｏｔｒｉｍａｚｏｌｅ）、クプリミキシン（Ｃｕｐｒｉｍｙｘｉｎ）、デノファンジン（Ｄｅｎｏｆｕｎｇｉｎ）、ジピリチオン（Ｄｉｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ）、ドコナゾール（Ｄｏｃｏｎａｚｏｌｅ）、エコナゾール（Ｅｃｏｎａｚｏｌｅ）、エコナゾールニトレート（Ｅｃｏｎａｚｏｌｅ Ｎｉｔｒａｔｅ）、エニルコナゾール（Ｅｎｉｌｃｏｎａｚｏｌｅ）、エトナムニトレート（Ｅｔｈｏｎａｍ Ｎｉｔｒａｔｅ）、フェンチコナゾールニトレート（Ｆｅｎｔｉｃｏｎａｚｏｌｅ Ｎｉｔｒａｔｅ）、フィリピン（Ｆｉｌｉｐｉｎ）、ＦＫ４６３、フルコナゾール（Ｆｌｕｃｏｎａｚｏｌｅ）、フルシトシン（Ｆｌｕｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ファンギマイシン（Ｆｕｎｇｉｍｙｃｉｎ）、グリセオフルビン（Ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｉｎ）、ハミシン（Ｈａｍｙｃｉｎ）、イソコナゾール（Ｉｓｏｃｏｎａｚｏｌｅ）、イトラコナゾール（Ｉｔｒａｃｏｎａｚｏｌｅ）、カラファンジン（Ｋａｌａｆｕｎｇｉｎ）、ケトコナゾール（Ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ）、ロモファンジン（Ｌｏｍｏｆｕｎｇｉｎ）、リジマイシン（Ｌｙｄｉｍｙｃｉｎ）、メパルトリシン（Ｍｅｐａｒｔｒｉｃｉｎ）、ミコナゾール（Ｍｉｃｏｎａｚｏｌｅ）、ミコナゾールニトレート（Ｍｉｃｏｎａｚｏｌｅ Ｎｉｔｒａｔｅ）、ＭＫ９９１、モネンシン（Ｍｏｎｅｎｓｉｎ）、モネンシンナトリウム（Ｍｏｎｅｎｓｉｎ Ｓｏｄｉｕｍ）、ナフチフィンニトレート（Ｎａｆｔｉｆｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ネオマイシンウンデシレネート（Ｎｅｏｍｙｃｉｎ Ｕｎｄｅｃｙｌｅｎａｔｅ）、ニフラテル（Ｎｉｆｕｒａｔｅｌ）、ニフルメロン（Ｎｉｆｕｒｍｅｒｏｎｅ）、ニトラルアミン塩酸塩（Ｎｉｔｒａｌａｍｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ナイスタチン（Ｎｙｓｔａｔｉｎ）、オクタン酸、オロコナゾールニトレート（Ｏｒｃｏｎａｚｏｌｅ Ｎｉｔｒａｔｅ）、オキシコナゾールニトレート（Ｏｘｉｃｏｎａｚｏｌｅ Ｎｉｔｒａｔｅ）、オキシファンジン塩酸塩（Ｏｘｉｆｕｎｇｉｎ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、パラコナゾール塩酸塩（Ｐａｒｃｏｎａｚｏｌｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、パルトリシン（Ｐａｒｔｒｉｃｉｎ）、ヨウ化カリウム、プラジミシン（Ｐｒａｄｉｍｉｃｉｎ）、プロコロノール（Ｐｒｏｃｌｏｎｏｌ）、ピリチオン亜鉛（Ｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ Ｚｉｎｃ）、ピロルニトリン（Ｐｙｒｒｏｌｎｉｔｒｉｎ）、ルタマイシン（Ｒｕｔａｍｙｃｉｎ）、サングイナリウムクロリド（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、サペルコナゾール（Ｓａｐｅｒｃｏｎａｚｏｌｅ）、スコパファンジン（Ｓｃｏｐａｆｕｎｇｉｎ）、硫化セレニウム（Ｓｅｌｅｎｉｕｍ Ｓｕｌｆｉｄｅ）、セルタコナゾール（Ｓｅｒｔａｃｏｎａｚｏｌｅ）、シネファンジン（Ｓｉｎｅｆｕｎｇｉｎ）、スルコナゾールニトレート（Ｓｕｌｃｏｎａｚｏｌｅ Ｎｉｔｒａｔｅ）、テルビナフィン（Ｔｅｒｂｉｎａｆｉｎｅ）、テルコナゾール（Ｔｅｒｃｏｎａｚｏｌｅ）、チラム（Ｔｈｉｒａｍ）、チクラトン（Ｔｉｃｌａｔｏｎｅ）、チオコナゾール（Ｔｉｏｃｏｎａｚｏｌｅ）、トルシクレート（Ｔｏｌｃｉｃｌａｔｅ）、トリンデート（Ｔｏｌｉｎｄａｔｅ）、トルナフテート（Ｔｏｌｎａｆｔａｔｅ）、トリアセチン（Ｔｒｉａｃｅｔｉｎ）、トリアファンジン（Ｔｒｉａｆｕｎｇｉｎ）、ＵＫ２９２、ウンデシレン酸、ビリドフルビン（Ｖｉｒｉｄｏｆｕｌｖｉｎ）、ボリコナゾール（Ｖｏｒｉｃｏｎａｚｏｌｅ）、ウンデシレン酸亜鉛、およびジノコナゾール塩酸塩（Ｚｉｎｏｃｏｎａｚｏｌｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）が含まれるが、これらに限定されない。

さらなる実施形態において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１を標的とするｄｓＲＮＡの投与は、抗寄生虫の医薬または剤と組み合わせて実施される。「抗寄生虫薬」とは、感染性の寄生虫を殺すか、もしくは寄生虫の増殖または機能を阻害する剤を指す。本明細書に記載される方法に有用な、寄生虫駆除剤とも称される、抗寄生虫薬の例としては、アルベンダゾール（ａｌｂｅｎｄａｚｏｌｅ）、アンホテリシン（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）Ｂ、ベンズニダゾール（ｂｅｎｚｎｉｄａｚｏｌｅ）、ビチオノール（ｂｉｔｈｉｏｎｏｌ）、クロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）ＨＣｌ、クロロキンホスフェート（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、クリンダマイシン（ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ）、デヒドロエメチン（ｄｅｈｙｄｒｏｅｍｅｔｉｎｅ）、ジエチルカルバマジン（ｄｉｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍａｚｉｎｅ）、ジロキサニドフロエート（ｄｉｌｏｘａｎｉｄｅ ｆｕｒｏａｔｅ）、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、エフロミチン（ｅｆｌｏｍｉｔｈｉｎｅ）、フラゾリドン（ｆｕｒａｚｏｌｉｄａｏｎｅ）、糖質コルチコイド、ハロファントリン（ｈａｌｏｆａｎｔｒｉｎｅ）、ヨードキノール（ｉｏｄｏｑｕｉｎｏｌ）、アイバルメクチン（ｉｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）、メベンダゾール（ｍｅｂｅｎｄａｚｏｌｅ）、メフロキン（ｍｅｆｌｏｑｕｉｎｅ）、メグルミンアンチモニエート（ｍｅｇｌｕｍｉｎｅ ａｎｔｉｍｏｎｉａｔｅ）、メラルソプロール（ｍｅｌａｒｓｏｐｒｏｌ）、メトリフォネート（ｍｅｔｒｉｆｏｎａｔｅ）、メトロニダゾール（ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ）、ニクロサミド（ｎｉｃｌｏｓａｍｉｄｅ）、ニフルチモクス（ｎｉｆｕｒｔｉｍｏｘ）、オキサムニキン（ｏｘａｍｎｉｑｕｉｎｅ）、パロモマイシン（ｐａｒｏｍｏｍｙｃｉｎ）、ペンタミジンイセチネート（ｐｅｎｔａｍｉｄｉｎｅ ｉｓｅｔｈｉｏｎａｔｅ）、ピペラジン、プラジカンテル、プリマキンホスフェート（ｐｒｉｍａｑｕｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、プログアニル、ピランテルパモエート（ｐｙｒａｎｔｅｌ ｐａｍｏａｔｅ）、ピリメタンミンスルホンアミド、ピリメタミンスルファドキシン（ｐｙｒｉｍｅｔｈａｎｍｉｎｅ−ｓｕｌｆａｄｏｘｉｎｅ）、キナクリンＨＣｌ、キニーネサルフェート（ｑｕｉｎｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ）、キニジングルコネート（ｑｕｉｎｉｄｉｎｅ ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）、スピラマイシン（ｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ）、スチボグルコネートナトリウム（ｓｔｉｂｏｇｌｕｃｏｎａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ）（ナトリウムアンチモングルコネート（ｓｏｄｉｕｍ ａｎｔｉｍｏｎｙ ｇｌｕｃｏｎａｔｅ））、スラミン、テトラサイクリン、チアベンダゾール、チニダゾール、トリメスロプリムスルファメトオキサゾール（ｔｒｉｍｅｔｈｒｏｐｒｉｍ−ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｅ）、およびトリパルサミドが含まれるがこれらに限定されず、これらのうちの幾つかは、単独で、あるいは他のものと組み合わせて用いられる。

ｉＲＮＡおよびさらなる治療剤は、同一の組成物での併用で、例えば、非経口で投与することができるか、またはさらなる治療剤は、別個の組成物の一部として、または本明細書に記載される別の方法により投与することができる。

患者には、治療量のｉＲＮＡ、例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、または２．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡを投与することができる。該ｉＲＮＡは、一定期間、例えば、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間にわたって静脈内注入により投与することができる。例えば、定期的に、例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、またはそれ以上の期間、隔週で（すなわち、２週間ごとに）、反復投与される。初期治療レジメン後、該治療は、より低い頻度で、投与することができる。例えば、隔週で３ヶ月間、投与した後、６ヶ月間、または１年間またはそれ以上の期間、１ヶ月に１回、反復投与することができる。ｉＲＮＡの投与は、例えば、患者における細胞、組織、血液、尿、または他の区画中のＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１レベルを、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％もしくはそれ以上軽減することができる。

総量の該ｉＲＮＡを投与する前に、患者は、５％注入反応等の少量の用量を投与し、アレルギー反応等の副作用、または脂質レベルもしくは血圧の上昇を監視することができる。別例において、患者は、上昇したサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−αまたはＩＮＦ−α）レベル等の望ましくない免疫活性化作用に対して監視することができる。

遺伝性素因は、幾つかの癌および血液学的悪性腫瘍の発症に役割を果たす。したがって、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１のｉＲＮＡを必要とする患者は、家族歴を得ることにより、または例えば、１つまたはそれ以上の遺伝子マーカーもしくは変異体をスクリーニングすることにより特定することができる。医者、看護師等のヘルスケア提供者または家族は、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１のｄｓＲＮＡを処方すること、または投与する前に家族歴を得ることができる。例えば、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２遺伝子におけるある種の変異体は、乳癌および卵巣癌に対する危険性を増加させることが知られている。ＤＮＡテストもまた、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１のｄｓＲＮＡを患者に投与する前に、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の変異を特定するために、該患者に実施され得る。

ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現に対する阻害効果により、本発明に従う組成物またはそれから調製される薬学的組成物は、生活の質を向上させることができる。

ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を調節するための方法
さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物におけるＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害もしくは活性化する）ための方法を提供する。

一実施形態において、本方法は、標的ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現または活性が減少するように、哺乳動物に、例えば、延長した持続期間中、例えば、少なくとも２日、３日、４日もしくはそれ以上、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間もしくはそれ以上、本発明で特徴となる組成物を投与するステップを含む。幾つかの実施形態において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現または活性は、治療前レベルと比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％減少する。

別の実施形態において、本方法は、標的ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現または活性が、未処置動物と比較して、例えば、少なくとも１０％増加するように、哺乳動物に、本明細書に記載される組成物を投与するステップを含む。幾つかの実施形態において、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の活性化は、延長した持続期間、例えば、少なくとも２日、３日、４日もしくはそれ以上、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間もしくはそれ以上にわたって生じる。理論に束縛されるものではないが、ｉＲＮＡは、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ転写物を安定化することにより、ゲノム中のプロモーターと相互作用することにより、および／またはＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現の阻害剤を阻害することにより、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現を活性化することができる。

好ましくは、本発明で特徴となる方法および組成物に有用なｉＲＮＡは、標的ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子のＲＮＡ（一次または処理された）を特異的に標的とする。ｉＲＮＡを用いたこれらのＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法は、本明細書の他の箇所に説明されるように調製および実施することができる。

一実施形態において、本方法は、ｉＲＮＡを含有する組成物を投与するステップを含み、該ｉＲＮＡは、処置される哺乳動物のＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を含む。処置される生物がヒト等の哺乳動物である場合、本組成物は、頭蓋内（例えば脳室内、脳実質内、およびくも膜下腔）、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（噴霧剤）、経鼻、直腸、ならびに局所（口腔および舌下を含む）投与を含む、経口、腹腔内、または非経口の経路を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において既知の任意の手段により投与することができる。ある実施形態において、本組成物は、静脈内注入もしくは注射により投与される。

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野における当業者により一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本発明で特徴となるｉＲＮＡおよび方法の実践または試験に際して、本明細書に記載されるものと同様または等価の方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含み、本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および例は例示に過ぎず、限定するものではない。

実施例１．ｉＲＮＡの合成
試薬の供給源
試薬の供給源が本明細書に具体的に示されていない場合、かかる試薬は、分子生物学の用途に標準的な質／純度で、分子生物学用の試薬の任意の供給業者から得ることができる。

オリゴヌクレオチドの合成
本出願人らは、本明細書に記載されるｉＲＮＡ分子を生成するための幾つかの異なる方法を使用している。本実施例は、使用されているあるアプローチを説明する。当業者は、本明細書に記載されるｉＲＮＡを調製するための当該技術分野において既知であるあらゆる方法を使用することができる。

オリゴヌクレオチドは、ＡＫＴＡオリゴパイロット合成装置上で合成される。標準的な保護基、５'−Ｏ−ジメトキシトリチルＮ６−ベンゾイル−２'−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２'−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−−イソブチル−２'−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、および５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−２'−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト（Ｐｉｅｒｃｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する市販の制御された孔質ガラス固体支持体

およびＲＮＡホスホルアミダイトを、オリゴヌクレオチドの合成のために使用した。２'−Ｆホスホルアミダイト、５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２'−フルオロ−シチジン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホルアミダイトおよび５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−２'−フルオロ−ウリジン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホルアミダイトが、（Ｐｒｏｍｅｇａ）から購入される。ホスホルアミダイトは全て、１０％ ＴＨＦ／ＡＮＣ（ｖ／ｖ）中の０．２Ｍの濃度で使用されるグアノシンを除いては、アセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）中の０．２Ｍの濃度で使用する。１６分間のカップリング／再利用時間を使用する。活性化剤は、５−エチルチオテトラゾール（０．７５Ｍ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）であり、ＰＯ−酸化ヨウ素／水／ピリジン用に使用され、２，６−ルチジン／ＡＣＮ（１：１ ｖ／ｖ）中のＰＳ−酸化ＰＡＤＳ（２％）用に使用される。

３'−リガンド結合鎖は、対応するリガンドを含有する固体支持体を用いて合成される。例えば、配列へのコレステロール単位の導入は、ヒドロキシプロリノール−コレステロールホスホルアミダイトから実施する。コレステロールを、６−アミノヘキサノアート結合によりｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリノールに結合させて、ヒドロキシプロリノール−コレステロール部分を得る。５'端Ｃｙ−３およびＣｙ−５．５（蛍光体）標識ｉＲＮＡを、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入する対応するＱｕａｓａｒ−５７０（Ｃｙ−３）ホスホルアミダイトから合成する。５'端およびまたは内部位置へのリガンドの結合は、適切に保護されたリガンド−ホスホルアミダイト基本単位を使用して、達成する。５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール活性化剤の存在下で、無水ＣＨ_３ＣＮ中の０．１Ｍのホスホルアミダイト溶液を、固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドに、１５分間の長期にわたって結合させる。ヌクレオチド間ホスファイトのホスフェートへの酸化は、報告されている（１）の標準的なヨウ素−水を使用するか、またはｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド／アセトニトリル／水（１０：８７：３）を用いて１０分間の酸化待機時間で、結合されたオリゴヌクレオチドを処理することにより実施する。ホスホロチオアートは、ＤＤＴＴ（ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入）、ＰＡＤＳ、またはＢｅａｕｃａｇｅ試薬等の硫黄転移試薬を使用することにより、ホスファイトをホスホロチオアートに酸化することにより導入する。コレステロールホスホルアミダイトは、施設内で合成し、ジクロロメタン中０．１Ｍの濃度で使用する。コレステロールホスホラミダイトの結合時間は１６分間である。

脱保護Ｉ（核酸塩基脱保護）
合成の完了後、支持体を１００ｍＬのガラスボトル（ＶＷＲ）に移す。５５℃で６．５時間、８０ｍＬのエタノールアンモニア［アンモニア：エタノール（３：１）］の混合物による塩基およびリン酸基の脱保護と同時に、オリゴヌクレオチドを支持体から開裂する。ボトルを氷上で短期間冷却し、次いで、エタノールアンモニア混合物を新しい２５０ｍＬボトルに濾過する。ＣＰＧを２×４０ｍＬ部分のエタノール／水（１：１ ｖ／ｖ）で洗浄する。次いで、混合物の体積を回転式エバポレータにより約３０ｍＬまで減少させる。次いで、混合物をドライアイス上で冷凍し、真空遠心分離装置（sｐｅｅｄ vａｃ）上の真空下で乾燥させる。

脱保護ＩＩ（２'−ＴＢＤＭＳ基の除去）
乾燥残渣を２６ｍＬのトリエチルアミン、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（ＴＥＡ・３ＨＦ）またはピリジン−ＨＦおよびＤＭＳＯ（３：４：６）中に再懸濁し、９０分間、６０℃で加熱し、２'位におけるｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去する。次いで、反応物を５０ｍＬの２０ｍＭ 酢酸ナトリウムで反応停止し、ｐＨを６．５に調節する。精製するまで、オリゴヌクレオチドを冷凍庫中に保存する。

分析
オリゴヌクレオチドは、精製する前に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、緩衝液およびカラムの選択は、配列およびまたは結合リガンドの性質に依存する。

ＨＰＬＣ精製
リガンド結合オリゴヌクレオチドは、調製用逆相ＨＰＬＣにより精製する。未結合オリゴヌクレオチドは、施設内で充填したＴＳＫゲルカラムの陰イオン交換ＨＰＬＣにより精製する。緩衝液は、１０％ ＣＨ_３ＣＮ中の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）（緩衝液Ａ）、および１０％ ＣＨ_３ＣＮ、１Ｍ ＮａＢｒ中の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）（緩衝液Ｂ）である。全長オリゴヌクレオチドを含有する画分をプールし、脱塩し、凍結乾燥する。約０．１５ＯＤの脱塩オリゴヌクレオチドを水で希釈して１５０μＬにし、次いで、ＣＧＥおよびＬＣ／ＭＳ解析用の特殊バイアルにピペットで移した。次いで、化合物をＬＣ−ＥＳＭＳおよびＣＧＥにより分析する。

ｉＲＮＡの調製
ｉＲＮＡの一般調製の場合、等モル量のセンスおよびアンチセンス鎖を、１×ＰＢＳ中で、５分間９５℃で加熱し、室温まで徐々に冷却する。二本鎖の完全性は、ＨＰＬＣ分析により確認する。

核酸配列を、標準的なヌクレオチド命名法、具体的には、表１の略語を使用して、以下に示す。

（表１）核酸配列の説明に使用されるヌクレオチドモノマーの略語。これらのモノマーは、オリゴヌクレオチドに存在する場合、５'−３'−ホスホジエステル結合により相互に結合することが理解される。

実施例２．ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１のｓｉＲＮＡ設計および合成
転写物
オリゴヌクレオチド設計は、ヒト「ＣＤ２７４分子」をコードする遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ（ＮＣＢＩのヒトシンボルＣＤ２７４）、ならびにマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）およびラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）からのオーソロガス配列を特定するために実行された。設計過程は、ヒトからのＣＤ２７４転写物ＮＭ＿０１４１４３．２（ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩｄ ２９１２６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６９、図１）、マウスからのＮＭ＿０２１８９３．２（ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩｄ ６０５３３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７０、図２）、ならびにラットからのＸＭ＿００１０７９５７２．１およびＸＭ＿５７４６５２．２（ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩｄ ４９９３４２；それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７１、図３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７２、図４）を使用した。全ての配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｓｅｑ収集から得た。

２組のオリゴ：ヒトＣＤ２７４に対して１００％の同一性があるが、マウスもしくはラットにおいて１００％未満の同一性があるヒト特異的な１組のオリゴ、単一のマウスおよび両方のラットのＣＤ２７４転写物に対して１００％の同一性がある第２の組のｓｉＲＮＡを設計した。それらのそれぞれのＣＤ２７４転写物に１００％同一性がある、全てのｓｉＲＮＡ二重鎖を設計した。

ヒトＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１に由来する合計４５６個のセンスのｓｉＲＮＡオリゴを合成し、二重鎖に形成した。本明細書に記載される様々な態様および実施形態で用いる、センスおよび対応するアンチセンスオリゴを、表２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３６）、表３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３７〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６８）、および表５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７７〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２４）（ヒトＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６９）に提示する。表２および３において、対応するセンスおよびアンチセンス配列は、隣接した配列識別子、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（センス）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（アンチセンス）が指定され、割り当てられている。表５において、対応するセンスおよびアンチセンス配列は、隣接した配列識別子が指定されていないが、同じ列で見られる。表５において、センスオリゴヌクレオチド配列識別子は、列３にて、およびセンスオリゴヌクレオチド配列は列５にて見られ、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列識別子は、列６にて、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、列８にて見られる。例えば、センス配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７８に対して対応するアンチセンス配列は、同じ行で見られるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０２である。

ｓｉＲＮＡ設計および特異性の予測
１９量体のオリゴセットの特異性をそれぞれの配列から予測した。ＣＤ２７４のｓｉＲＮＡを、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いて、それらのそれぞれのヒト、マウス、およびラットのトランスクリプトーム（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｓｅｑセット内のＮＭ＿およびＸＭ＿の記録のセットとして定義される）に対する包括的検索において使用した。次いで、Ｐｙｔｈｏｎスクリプト「オフターゲットＦａｓｔａ．ｐｙ」を用いて、整列を解析し、ｓｉＲＮＡと任意の潜在的「オフターゲット」転写物との間のミスマッチの位置および数に基づいてスコアを得た。該オフターゲットスコアは、分子の５'端から２〜９位での、ｓｉＲＮＡの「シード」領域の差異を強調するように重み付けする。該オフターゲットスコアは、以下のとおり算出される。オリゴと転写物との間のミスマッチに、ペナルティーを課す。オリゴの２〜９位での、シード領域のミスマッチには、２．８のペナルティーを課し、推定切断部位１０および１１のミスマッチには、１．２のペナルティーを課し、全ての他のミスマッチには、１のペナルティーを課す。次いで、それぞれのオリゴ転写物対のオフターゲットスコアが、ミスマッチのペナルティーを合計することにより計算される。次いで、全てのオリゴ転写物対からの最小オフターゲットスコアを決定し、オリゴのその後の分類に使用する。両方のｓｉＲＮＡ鎖を、算出したスコアに従って、特異性のカテゴリーに割り当てた。３を超えるスコアは、高度の特異性があり、３に等しいスコアは、特異性があり、２．２〜２．８のスコアは、中程度の特異性があると見なす。どのオリゴが合成されるべきか選択するときに、アンチセンス鎖のオフターゲットスコアを、降順に並べ、最良の（最小オフターゲットスコア）オリゴ対を取った。

ＣＤ２７４配列の合成
１μモルの規模で、ＭｅｒＭａｄｅ１９２合成機において、ＣＤ２７４配列を合成した。

配列表の全ての配列については、「エンドライト」化学反応を以下の詳細のように適用した。
・センス鎖内の全てのピリミジン（シトシンおよびウリジン）は、２'−Ｏ−メチル塩基（２'−Ｏ−メチルＣおよび２'−Ｏ−メチルＵ）を含有した。
・アンチセンス鎖では、リボＡヌクレオシドに隣接する（５'位に向かって）ピリミジンは、それらの対応する２−Ｏ−メチルヌクレオシドと置換された。
・センスおよびアンチセンス配列の両方の３'端で、２つの塩基ｄＴｓｄＴの拡張を導入した。
・配列ファイルをテキストファイルに変換し、ＭｅｒＭａｄｅ１９２合成ソフトウェアにおける負荷に対して互換性を保つようにした。

合成、切断、および脱保護：
ＣＤ２７４配列の合成は、ホスホルアミダイト化学反応を用いて、固体支持されたオリゴヌクレオチド合成を使用した。

９６ウェルプレート中の１ｕｍの規模で、上記の配列の合成を行った。アミダイト溶液を、０．１Ｍ 濃度で調製し、エチルチオテトラゾール（アセトニトリル中０．６Ｍ）を活性剤として使用した。

合成した配列を切断し、第１のステップにおいてメチルアミン、および第２のステップにおいて、フッ化物試薬を用いて、９６ウェルプレート中に脱保護した。粗配列は、アセトン：エタノール（８０：２０）の混合液を用いて、沈殿させ、ペレットを、０．０２Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁させた。それぞれの配列からの試料を、ＬＣ−ＭＳにより同一性を確認するために分析し、定量化のための紫外線、および純度を決定するために、ＩＥＸクロマトグラフィーにより選択された試料のセットを分析した。

精製および脱塩：
ＣＤ２７４配列は、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑカラムを用いて、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ精製システムにおいて精製した。６５℃のカラム温度を精製中維持した。試料の注射および収集を、９６ウェル（１．８ｍＬの深いウェル）プレート中で行った。完全長配列に対応する単一ピークを、溶離液中に収集した。ＡＫＴＡ精製器を用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム上に精製された配列を、脱塩した。濃度（Ａ２６０での紫外線測定により）および純度（イオン交換ＨＰＬＣにより）のために、脱塩したＣＤ２７４配列を、分析した。次いで、アニーリングのために単鎖を提出した。

インビトロスクリーニング：
細胞培養および形質移入：
ＲＫＯまたはＨｅｐ３Ｂ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）細胞を、トリプシン処理によりプレートからはがす前に、１０％ ＦＢＳ、ストレプトマイシン、およびグルタミン（ＡＴＣＣ）で補完されるＭｃＣｏｙ培地またはＥＭＥＭ（それぞれ）（ＡＴＣＣ）中の５％ ＣＯ_２の雰囲気下で、３７℃でほぼコンフルエントまで増殖した。逆転写は、１０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに加えて、ウェル当たり０．２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．ｃａｔ＃１３７７８−１５０）と一緒に、９６ウェルプレート中に５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭをウェル当たり５μＬのｓｉＲＮＡ二重鎖に添加することにより行われ、室温で１５分間インキュベートした。次いで、２．０×１０^４ Ｈｅｌａ細胞を含有する抗生物質を含有しない、８０μＬの完全成長培地を添加した。ＲＮＡ精製前に、細胞を、２４時間インキュベートした。それぞれのＣＤ２７４二重鎖を用いた単回用量スクリーニングのために、０．１または１０ｎＭの最終二重濃度で実験を行った。１０ｎＭおよび０．１ｎＭのスクリーニングにおいて、堅牢なサイレンシングを示した１６本の二重鎖のサブセットを、連続希釈法を用いて１０ｎＭ〜１０ｆＭの濃度の範囲にわたって分析し、それらのＩＣ５０を決定した。

ＭａｇＭＡＸ−９６総ＲＮＡ単離キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｒｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ，ｐａｒｔ＃：ＡＭ１８３０）を用いた総ＲＮＡ単離：
細胞を、採集し、１４０μＬの溶解／結合溶液中で溶解し、次いで、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを用いて８５０ｒｐｍで１分間混合した（混合速度は、過程を通して同一であった）。２０マイクロリットルの電磁ビーズおよび溶解／結合エンハンサーの混合物を、細胞溶解物に添加し、５分間混合した。磁気ビーズは、磁気スタンドを用いて捕捉し、ビーズを妨害することなく、上清を除去した。上清を除去した後、磁気ビーズを洗浄液１（イソプロパノールを添加）で洗浄し、１分間混合した。ビーズを再度捕捉し、上清を除去した。次いで、ビーズを１５０μＬの洗浄液２（エタノールを添加）で洗浄し、捕捉し、上清を除去した。次いで、５０μＬのＤＮアーゼ混合物（ＭａｇＭａｘ ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ ＢｕｆｆｅｒおよびＴｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ）をビーズに添加し、それらを１０〜１５分間混合した。混合後、１００μＬのＲＮＡ再結合溶液を添加し、３分間混合した。上清を除去し、磁気ビーズを１５０μＬの洗浄液２で再度洗浄し、１分間混合し、上清を完全に除去した。磁気ビーズを２分間混合し、ＲＮＡを５０μＬの水で溶離する前に乾燥させた。

ＡＢＩ高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｃａｔ＃４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成：
２μＬの１０×緩衝液、０．８μＬの２５×ｄＮＴＰ、２μＬのランダムプライマー、１μＬの逆転写酵素、１μＬのＲＮａｓｅ阻害剤、および反応当たり３．２μＬのＨ２Ｏのマスターミックスを、１０μＬの総ＲＮＡに添加した。以下のステップを通して、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃ−１０００またはＳ−１０００のサーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、ｃＤＮＡを生成した：２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５秒間、４℃で保持。

リアルタイムＰＣＲ：
２μＬのｃＤＮＡを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ ｃａｔ＃０４７２９７４００１）中のウェル当たり合計１０μＬで、０．５μＬのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ＃ ４３２６３１７Ｅ）、０．５μＬのＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｔ＃Ｈｓ０１１２５３０１＿ｍ１）、および５μＬのＲｏｃｈｅ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ＃０４８８７３０１００１）のマスターミックスに添加した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０リアルタイムＰＣＲ機械（Ｒｏｃｈｅ）において、リアルタイムＰＣＲを行った。それぞれの二本鎖を、少なくとも２つの独立した形質移入において試験した。ＲＫＯおよびＨｅｐ３Ｂ細胞内で試験したこれらのｓｉＲＮＡについては、少なくとも３つの形質移入を実施した。それぞれの形質移入は、二重でｑＰＣＲにより分析した。

ΔΔＣｔ法を用いて、リアルタイムデータを分析した。それぞれの試料を、ＧＡＰＤＨの発現に対して正規化し、非標的二重鎖ＡＤ−１９５５で形質移入した細胞と比較してノックダウンを評価した。ＸＬフィットにおける４パラメーターフィットモデルを用いたＩＣ５０を決定した。

本明細書に記載される実験において、複製実験における一連の例示的な阻害二重鎖配列に対する、ＩＣ５０値が決定された。例えば、阻害二重鎖ＡＤ−３１０６６−ｂ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１４）に対するＩＣ５０値は、０．４５６９７８４６３ｎＭおよび０．８１７３９８６６６ｎＭであり、阻害二重鎖ＡＤ−３１０６７−ｂ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１５）に対しては、０．６１２９７６７２９ｎＭおよび２．９０１９７２１１７ｎＭであり、阻害二重鎖ＡＤ−３１０６８−ｂ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１５）に対しては、０．７６２６９１７２８ｎＭおよび０．４６０７９３３９ｎＭであり、阻害二重鎖ＡＤ−３１０６９−ｂ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１５）に対しては、０．３０６３０５０３ｎＭおよび０．２６１０２０２１５ｎＭであった。

他の実施形態は、特許請求の範囲内にある。

（表２）ヒトＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の単鎖および二本鎖配列

（表３）ヒトＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１修飾単鎖および二本鎖配列

（表４）ヒトCD274/PD-L1のiRNAのインビトロでのスクリーニング結果

（表５）ヒトCD274/PD-L1の単鎖および二本鎖配列

Claims (16)

1. ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、該ｄｓＲＮＡが、
   (a) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３(5’-AGUCUCAGUGUUGGAACGG-3’)のヌクレオチド配列からなるセンス鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４(5’- CCGUUCCAACACUGAGACU-3’)のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖、
   (b) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１３(5’- GCAUGACUGAGAGUCUCAG-3’)のヌクレオチド配列からなるセンス鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１４(5’- CUGAGACUCUCAGUCAUGC-3’)のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖、
   (c) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１５(5’- GACUGAGAGUCUCAGUGUU-3’)のヌクレオチド配列からなるセンス鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１６(5’- AACACUGAGACUCUCAGUC-3’)のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖、
   (d) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１７(5’- GAGUCUCAGUGUUGGAACG-3’)のヌクレオチド配列からなるセンス鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１８(5’- CGUUCCAACACUGAGACUC-3’)のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖、ならびに
   (e) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１９(5’- CUCAGUGUUGGAACGGGAC-3’)のヌクレオチド配列からなるセンス鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２０(5’- GUCCCGUUCCAACACUGAG-3’)のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖、
   から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
   ２'−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５'−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合される末端ヌクレオチドからなる群から選択される、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、
   前記ｄｓＲＮＡ。
2. ２'−デオキシ−２'−フルオロ修飾ヌクレオチド、２'−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２'−アミノ−修飾ヌクレオチド、２'−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基からなる群から選択される修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
3. リガンドをさらに含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
4. 前記リガンドが、前記ｄｓＲＮＡの前記センス鎖の３'端に結合される、請求項３記載のｄｓＲＮＡ。
5. ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、該ｄｓＲＮＡが、
   (a) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５５(5’- AGucucAGuGuuGGAAcGGdTsdT -3’)のヌクレオチド配列からなるセンス鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５６(5’- CCGUUCcAAcACUGAGACUdTsdT -3’)のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖、
   (b) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４５(5’- GcAuGAcuGAGAGucucAGdTsdT -3’)のヌクレオチド配列からなるセンス鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４６(5’- CUGAGACUCUcAGUcAUGCdTsdT -3’)のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖、
   (c) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４７(5’- GAcuGAGAGucucAGuGuudTsdT -3’)のヌクレオチド配列からなるセンス鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４８(5’- AAcACUGAGACUCUcAGUCdTsdT -3’)のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖、
   (d) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４９(5’- GAGucucAGuGuuGGAAcGdTsdT -3’)のヌクレオチド配列からなるセンス鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５０(5’- CGUUCcAAcACUGAGACUCdTsdT -3’)のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖、ならびに
   (e) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５１(5’- cucAGuGuuGGAAcGGGAcdTsdT -3’)のヌクレオチド配列からなるセンス鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５２(5’- GUCCCGUUCcAAcACUGAGdTsdT -3’)のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖、
   から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
   ここでA、C、G、TおよびUは、それぞれ、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジン、およびウリジンであり、a、c、g、およびuは、それぞれ、２'−Ｏ−メチルアデノシン、２'−Ｏ−メチルシチジン、２'−Ｏ−メチルグアノシン、および２'−Ｏ−メチルウリジンであり、dTは２'−デオキシチミジンであり、かつsはホスホロチオエート結合である、
   前記ｄｓＲＮＡ。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡを含有する、細胞。
7. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡを含む、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を阻害するための薬学的組成物。
8. 脂質製剤をさらに含む、請求項７に記載の薬学的組成物。
9. 細胞におけるＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現をインビトロで阻害する方法であって、
   （ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡを、インビトロで該細胞に導入するステップと、
   （ｂ）ステップ（ａ）で産生された細胞を、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を達成するために十分な時間維持し、それにより、該細胞における該ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を阻害するステップと
   を含む、方法。
10. 前記ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現を少なくとも３０％阻害する、請求項９に記載の方法。
11. ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の発現により媒介される障害を治療するための、請求項７または８に記載の薬学的組成物であって、そのような治療を必要とするヒトに投与される、前記薬学的組成物。
12. 前記ヒトが、癌または血液学的悪性腫瘍を患っている、請求項１１に記載の薬学的組成物。
13. 前記ヒトが、感染症を患っている、請求項１１に記載の薬学的組成物。
14. 前記感染症が、ウイルス性、細菌性、真菌性、または寄生虫性の疾患である、請求項１３に記載の薬学的組成物。
15. ウイルス性、細菌性、真菌性、または寄生虫性の前記疾患が、慢性感染症である、請求項１４に記載の薬学的組成物。
16. 前記ｄｓＲＮＡが対象の体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ〜５ｍｇの濃度で投与される、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

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