JP6931021B2 - 肝線維症治療用組成物および肝線維症の治療法 - Google Patents
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Description
本願は、米国特許法第119条(e)に基づき、2010年10月29日に出願された米国特許仮出願第61/408,271号、2010年8月6日に出願された米国特許仮出願第61/371,481号、および2010年6月2日に出願された米国特許仮出願第61/350,829号の利益を主張するものである。これらの各出願の内容の全体は、参照により本明細書に組み入れられたものとする。
本願は、EFS−Webを介してASCIIフォーマットで提出してある配列表を含み、これによりその全体を参照して組み入れたものとする。2011年6月2日に作成された前記ASCII複製物は51058PCT.txtという名称であり、864,110バイトのサイズである。
本発明は、肝臓におけるコラーゲン1A1(COL1A1)遺伝子、トランスフォーミング増殖因子β1(TGFβ)遺伝子ならびにSMADホモログ2および3(SMAD2/3)遺伝子の発現の阻害、および肝線維症の抑制に関連する。特に、肝星細胞での遺伝子発現の阻害を目的とする。
(a) 互いに相補的な少なくとも2つの配列を含む二本鎖リボ核酸(dsRNA)を細胞に導入する工程。そのdsRNAは第1配列を有するセンス鎖と第2配列を有するアンチセンス鎖を持ち、そのアンチセンス鎖はCOL1A1、TGFβおよび/またはSMAD2/3をコードするmRNAの少なくとも一部と実質的に相補的であって、30ヌクレオチド以下、すなわち、15〜30ヌクレオチドの長さであり、一般的に19〜24ヌクレオチドの長さである相補領域を持ち、そして、そのdsRNAは、COL1A1、TGFβおよび/またはSMAD2/3を発現する細胞と接触するとCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子の発現をそれぞれ少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%またはそれ以上阻害する。そして、
(b) 工程(a)で作製された細胞を、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子のmRNA転写物が分解されるのに十分な時間にわたり維持し、それによって細胞内のCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子の発現をそれぞれ阻害する工程。
COL1A1の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)であって、前記dsRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号53のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号54の対応するアンチセンスヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記dsRNA。
[本発明1002]
COL1A1の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)であって、前記dsRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、COL1A1 RNA転写物と相補的な領域を含み、かつ、表3または表6に列挙されたアンチセンス配列のうちの1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記dsRNA。
[本発明1003]
TFGβの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)であって、前記dsRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号69のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号70の対応するアンチセンスヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記dsRNA。
[本発明1004]
TFGβの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)であって、前記dsRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号91のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号92の対応するアンチセンスヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記dsRNA。
[本発明1005]
TGFβの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)であって、前記dsRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、TGFβ RNA転写物と相補的な領域を含み、かつ、表4または表7に列挙されたアンチセンス配列のうちの1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記dsRNA。
[本発明1006]
SMAD2/3の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)であって、前記dsRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号140のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号141の対応するアンチセンスヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記dsRNA。
[本発明1007]
SMAD2/3の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)であって、前記dsRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、SMAD2/3 RNA転写物と相補的な領域を含み、かつ、表5に列挙されたアンチセンス配列のうちの1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記dsRNA。
[本発明1008]
少なくとも1個の修飾ヌクレオチドを含む、本発明1001〜1007のいずれかのdsRNA。
[本発明1009]
前記修飾ヌクレオチドの少なくとも1つが、2'−O−メチル修飾ヌクレオチド、5'−チオリン酸エステル基含有ヌクレオチド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチド、2'−デオキシ−2'−フルオロ修飾ヌクレオチド、2'−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2'−アミノ修飾ヌクレオチド、2'−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダートおよび非天然塩基含有ヌクレオチドからなる群より選択される、本発明1008のdsRNA。
[本発明1010]
前記相補領域が少なくとも17ヌクレオチド長である、本発明1002、1005、および1007のいずれかのdsRNA。
[本発明1011]
前記相補領域が19〜21ヌクレオチド長である、本発明1002、1005、および1007のいずれかのdsRNA。
[本発明1012]
それぞれの鎖が30ヌクレオチド以下の長さである、本発明1001〜1011のいずれかのdsRNA。
[本発明1013]
少なくとも一方の鎖が、少なくとも1ヌクレオチドの3'オーバーハングを含む、本発明1001〜1012のいずれかのdsRNA。
[本発明1014]
リガンドをさらに含む、本発明1001〜1013のいずれかのdsRNA。
[本発明1015]
前記リガンドが前記dsRNAの前記センス鎖の3'末端と複合体化されている、本発明1014のdsRNA。
[本発明1016]
前記相補領域が表3または表6のアンチセンス配列のうちの1つからなる、本発明1002のdsRNA。
[本発明1017]
表3または表6から選択されるセンス鎖配列からなるセンス鎖と、表3または表6から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖とを含む、本発明1002のdsRNA。
[本発明1018]
前記相補領域が表4または表7のアンチセンス配列の1つからなる、本発明1005のdsRNA。
[本発明1019]
表4または表7から選択されるセンス鎖配列からなるセンス鎖と、表4または表7から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖とを含む、本発明1005のdsRNA。
[本発明1020]
前記相補領域が表5のアンチセンス配列の1つからなる、本発明1007のdsRNA。
[本発明1021]
表5から選択されるセンス鎖配列からなるセンス鎖と、表5から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖とを含む、本発明1007のdsRNA。
[本発明1022]
本発明1001〜1007のいずれかのdsRNAを含有する、細胞。
[本発明1023]
本発明1001または1002のdsRNAを含む、COL1A1遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
[本発明1024]
本発明1003、1004または1005のdsRNAを含む、TGFβ遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
[本発明1025]
本発明1006または1007のdsRNAを含む、SMAD2/3遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
[本発明1026]
脂質製剤をさらに含む、本発明1023〜1025のいずれかの医薬組成物。
[本発明1027]
前記脂質製剤がSNALPまたはXTC製剤である、本発明1026の医薬組成物。
[本発明1028]
細胞内のCOL1A1発現を阻害する方法であって、
a. 本発明1001〜1007のいずれかのdsRNAを前記細胞に導入する工程、および、
b. 工程(a)で作製された細胞を、COL1A1遺伝子のmRNA転写物が分解されるのに十分な時間にわたり維持し、それによって前記細胞内のCOL1A1遺伝子の発現を阻害する工程
を含む、前記方法。
[本発明1029]
前記細胞が肝星細胞である、本発明1028の方法。
[本発明1030]
COL1A1発現が少なくとも30%阻害される、本発明1028または1029の方法。
[本発明1031]
肝線維症を治療する方法であって、そのような治療を必要とするヒトに、治療上有効量の本発明1001〜1007のいずれかのdsRNAまたは本発明1030〜1034のいずれかの医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法。
[本発明1032]
前記対象の体重に対して0.01mg/kg〜5mg/kgの濃度で前記dsRNAが投与される、本発明1040の方法。
[本発明1033]
肝線維症の治療に使用するための、本発明1001〜1007のいずれかのdsRNAまたは本発明1023〜1027のいずれかの医薬組成物。
[本発明1034]
dsRNAの少なくとも一方の鎖をコードするベクターであって、前記dsRNAが、COL1A1をコードするmRNAの少なくとも一部と相補的な領域を含み、30塩基対以下の長さであり、かつ切断のために前記mRNAを標的とする、前記ベクター。
[本発明1035]
dsRNAの少なくとも一方の鎖をコードするベクターであって、前記dsRNAが、TGFβをコードするmRNAの少なくとも一部と相補的な領域を含み、30塩基対以下の長さであり、かつ切断のために前記mRNAを標的とする、前記ベクター。
[本発明1036]
dsRNAの少なくとも一方の鎖をコードするベクターであって、前記dsRNAが、SMAD2/3をコードするmRNAの少なくとも一部と相補的な領域を含み、30塩基対以下の長さであり、かつ切断のために前記mRNAを標的とする、前記ベクター。
[本発明1037]
前記相補領域が19〜21ヌクレオチド長である、本発明1034〜1036のいずれかのベクター。
[本発明1038]
本発明1034〜1037のいずれかのベクターを含む、細胞。
[本発明1039]
肝線維症を特徴とする慢性肝疾患を治療する方法であって、そのような治療を必要とするヒトに、治療上有効量の本発明1001〜1007のいずれかのdsRNAまたは本発明1023〜1027のいずれかの医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法。
[本発明1040]
肝線維症を特徴とする慢性肝疾患の治療に使用するための、本発明1001〜1007のいずれかのdsRNAまたは本発明1023〜1027のいずれかの医薬組成物。
本発明の様々な実施形態の詳細は、以下の記述に表される。本発明のその他の特色、目的および利点が本明細書と添付の図面から、および添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
本明細書において記載される態様および実施形態は、これに限定されないが、慢性肝疾患に関係がある肝線維症を含む肝疾患および肝線維症の治療および/または予防のための組成物と方法に関連する。その実施形態は、肝臓の損傷中に過剰に産生され、そして、線維症の原因となる細胞外マトリックス(ECM)物質のうちの少なくとも1つが減少する可能性がある場合、肝臓の線維症が、予防されなくても、少なくとも低減する可能性があるという前提を利用している。本明細書において記載される組成物と方法は、関連するECM遺伝子とまた線維形成のプロセス中に肝星細胞(HSC)の活性化に関与するシグナル伝達分子、例えばTGF−βおよびSMAD2/3の遺伝子発現のRNA干渉に基づく。
便宜上、本明細書、実施例および添付の請求項で使用されるある用語および言い回しの意味が以下に提供される。本明細書の他の部分での用語の使用法とこの節で提供されるその定義の間に明らかな食い違いがある場合、この節での定義が勝るものとする。
。
COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の発現を阻害するiRNA薬剤が本明細書において記載される。1つの実施形態では、そのiRNA薬剤は細胞または哺乳類、例えば肝線維症を特徴とする肝疾患を有するヒトにおいてCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の発現をそれぞれ阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子であって、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子の発現で形成されるmRNAの少なくとも一部と相補的な相補領域を有するアンチセンス鎖を含むdsRNAであって、そして、その相補領域は30ヌクレオチド以下の長さであり、一般的に19〜24ヌクレオチドの長さであるdsRNAであって、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子をそれぞれ発現している細胞と接触すると、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子の発現をそれぞれ、例えば、PCRまたは分枝状DNA(bDNA)ベースの方法で測定すると、または、ウェスタンブロットなどのタンパク質ベースの方法で測定すると少なくとも10%阻害するdsRNAを含む。bDNAまたはTaqMan測定法などによりCOL1A1 mRNAレベルを測定することで、または、例えば、ウェスタンブロッティングまたは流動細胞分析技術を用いた免疫蛍光分析などによりタンパク質レベルを測定することでCOS細胞、HeLa細胞、一次肝細胞、HepG2細胞、一次培養HSCなどの培養細胞での、または、対象由来の生物学的試料でのCOL1A1遺伝子の発現を分析することができる。
1つの実施形態では、リガンドまたは複合物は脂質または脂質ベースの分子である。そのような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)に結合する。HSA結合リガンドが複合体の標的組織、例えば、身体の非腎臓標的組織への分布を可能とする。例えば、標的組織は肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。HSAに結合できる他の分子もまたリガンドとして使用することができる。例えば、ネプロキシンまたはスピリンを使用することができる。脂質または脂質ベースのリガンドは、(a)複合体の分解への耐性を増大することができ、(b)標的細胞または細胞膜へのターゲティングまたは輸送を向上することができ、および/または(c)血清タンパク質、例えば、HASへの結合を調節するために用いられ得る。
別の態様では、前記リガンドは細胞透過性薬剤であり、好ましくはらせん状細胞透過性薬剤である。好ましくは、その薬剤は両親媒性である。例示的な薬剤は、TATまたはアンテナペディアなどのペプチドである。前記薬剤がペプチドである場合、それは修飾されている可能性があり、ペプチジル模倣物、逆転異性体、非ペプチドまたは偽ペプチド結合、およびD−アミノ酸の使用を含む。前記らせん状薬剤は好ましくはαらせん状薬剤であり、それは好ましくは親油性相および疎油性相を持つ。
いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるiRNAオリゴヌクレオチドは炭水化物複合物をさらに含む。炭水化物複合物は、本明細書に記載されるように、核酸のインビボ送達に好都合であり、ならびに組成物はインビボでの治療上の使用に適切である。本明細書において用いられる場合、「炭水化物」は、少なくとも6炭素原子を各炭素原子に結合する酸素、窒素もしくはイオウ原子とともに有する1つ以上の(線状、分枝状または環状であり得る)単糖単位からなる炭水化物それ自体か少なくとも6炭素原子を各炭素原子に結合する酸素、窒素もしくはイオウ原子とともに有する1つ以上の(線状、分枝状または環状であり得る)単糖単位からなる炭水化物部分をその一部として持つ化合物のどちらかである化合物を意味する。代表的な炭水化物には、糖(単糖、二糖、三糖および約4〜9単糖単位を含有するオリゴ糖)ならびにデンプン、グリコーゲン、セルロースおよびポリサッカリドガムなどのポリサッカリドが含まれる。具体的な単糖には炭素数5の糖および上記の(このましくは炭素数5〜8の)糖が含まれ、二糖および三糖には(好ましくは炭素数5〜8の)単糖単位を有する糖が含まれる。
いくつかの実施形態では、切断可能または切断不可能であり得る様々なリンカーを用いて本明細書において記載される複合物をiRNAオリゴヌクレオチドに結合することができる。
切断可能な結合基の1つの分類は、還元または酸化されて切断される酸化還元で切断可能な結合基である。還元により切断可能な結合基の例は、ジスルフィド結合基(−S−S−)である。切断可能な結合基候補が適切な「還元により切断可能な結合基」であるかどうか決定するために、または、例えば、特定のiRNA部分および特定のターゲティング剤との使用に適切であるかどうか決定するために、本明細書において記載される方法に頼ることができる。例えば、標的細胞などの細胞で観察されるであろう切断速度を模倣する当技術分野において公知の試薬を使用して、ジチオスレイトール(DTT)、または他の還元剤と保温することにより候補を評価することができる。血液または血清の条件を模倣するように選択されている条件で候補を評価することもできる。好ましい実施形態では、血液では候補化合物が多くとも10%切断される。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液(または、細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件)と比較して、細胞中で(または、細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件で)少なくとも2、4、10または100倍速く分解される。候補化合物の切断速度を、細胞内媒体を模倣するように選択された条件での標準的な酵素反応速度測定法を用いて決定することができ、そして、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較することができる。
リン酸エステルベースの切断可能な結合基は、リン酸エステル基を分解する、または、加水分解する因子により切断される。細胞中でリン酸エステル基を切断する因子の例は細胞中のホスファターゼなどの酵素である。リン酸エステルベースの結合基の例は、−O−P(O)(ORk)−O−、−O−P(S)(ORk)−O−、−O−P(S)(SRk)−O−、−S−P(O)(ORk)−O−、−O−P(O)(ORk)−S−、−S−P(O)(ORk)−S−、−O−P(S)(ORk)−S−、−S−P(S)(ORk)−O−、−O−P(O)(Rk)−O−、−O−P(S)(Rk)−O−、−S−P(O)(Rk)−O−、−S−P(S)(Rk)−O−、−S−P(O)(Rk)−S−、−O−P(S)(Rk)−S−である。好ましい実施形態は、−O−P(O)(OH)−O−、−O−P(S)(OH)−O−、−O−P(S)(SH)−O−、−S−P(O)(OH)−O−、−O−P(O)(OH)−S−、−S−P(O)(OH)−S−、−O−P(S)(OH)−S−、−S−P(S)(OH)−O−、−O−P(O)(H)−O−、−O−P(S)(H)−O−、−S−P(O)(H)−O−、−S−P(S)(H)−O−、−S−P(O)(H)−S−、−O−P(S)(H)−S−である。好ましい実施形態は−O−P(O)(OH)−O−である。上記のものと類似する方法を用いて、これらの候補を評価することができる。
酸で切断可能な結合基は、酸性条件で切断される結合基である。好ましい実施形態では、酸で切断可能な結合基は、約6.5以下(例えば、約6.0、5.5、5.0またはそれ以下)のpHを持つ酸性環境中で、または、一般的な酸として作用することができる酵素のような因子により切断される。細胞中では、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低pHオルガネラが酸で切断可能な結合基に切断環境を提供することができる。酸で切断可能な結合基の例には、ヒドラゾン、エステルおよびアミノ酸のエステルが含まれるがこれらに限定されない。酸切断基は、一般式−C=NN−、C(O)Oまたは−OC(O)を有することができる。好ましい実施形態は、前記エステル(アルコキシ基)の酸素に結合する炭素がアリール基であるとき、ジメチルペンチル基またはt−ブチル基などの置換アルキル基または第3級アルキル基である。上記のものと類似する方法を用いて、これらの候補を評価することができる。
エステルベースの切断可能な結合基は、細胞中のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素により切断される。エステルベースの切断可能な結合基の例には、アルキレン基、アルケニレン基およびアルキニレン基のエステルが含まれるがこれらに限定されない。エステルの切断可能な結合基は、一般式−C(O)O−または−OC(O)−を有する。上記のものと類似する方法を用いて、これらの候補を評価することができる。
ペプチドベースの切断可能な結合基は、細胞中のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドベースの切断可能な結合基は、オリゴペプチド(例えば、ジペプチド、トリペプチドなど)およびポリペプチドを産生するためにアミノ酸間で形成されるペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基はアミド基(−C(O)NH−)を含まない。アミド基は任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキネレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、ペプチドおよびタンパク質を産生するためにアミノ酸間で形成される特別な種類のアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般的に、ペプチドおよびタンパク質を産生するアミノ酸間で形成されるペプチド結合(すなわち、アミド結合)に限定され、アミド官能基全体を含んでいるわけではない。ペプチドベースの切断可能な結合基は、一般式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)−(配列番号876)を有し、式中、RAとRBは2つの隣接するアミノ酸のR基である。上記のものと類似する方法を用いて、これらの候補を評価することができる。
多数の異なる方法で、それを必要とする対象へのiRNAの送達を達成することができる。iRNA、例えば、dsRNAを含む組成物を対象に投与することにより、インビボ送達を直接的に実行することができる。あるいは、iRNAをコードしそのiRNAの発現を指向する1つ以上のベクターを投与することにより、送達を間接的に実行することができる。これらの変形例を以下でさらに論じる。
一般的に、核酸分子の任意の送達方法をiRNAとの使用のために適合させることができる(例えば、Akhtar S. and Julian RL.,1992, Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 および国際公開第WO94/02595号を参照のこと。それら文献の全体を参照して本明細書に組み入れる)。しかしながら、分子をインビボでうまく送達するために考慮する重要な3つの因子が存在する:(a)送達される分子の生物学的安定性、(2)非特異的効果の予防、および(3)標的組織での送達された分子の蓄積。例えば、組織(非限定的な例としては腫瘍)への直接注入もしくは移植などの局所投与により、または、製剤を局所的に投与することにより、iRNAの非特異的効果を最小化することができる。治療部位への局所投与が薬剤の局所濃度を最大化し、別の方法ではその薬剤により害を受ける可能性がある全身組織、または、その薬剤を分解することができる全身組織への薬剤の曝露を限定し、そして、より少ない総投与量のiRNA分子が投与されることを可能とする。いくつかの研究で、iRNAが局所的に投与されるときの遺伝子産物の成功したノックダウンが示されている。例えば、カニクイザルでの硝子体内注入(Tolentino, MJ., et al (2004) Retina 24:132-138)とマウスでの網膜下注入(Reich, SJ., et al (2003) Mol. Vis. 9:210-216)によるVEGF dsRNAの眼内送達が両方とも加齢黄斑変性の実験モデルにおける血管新生を妨げることが示された。さらに、マウスでのdsRNAの直接腫瘍内注入が腫瘍体積を減少させ(Pille, J., et al (2005) Mol. Ther.11:267-274)、そして、腫瘍担持マウスの生存時間を延長することができる(Kim, WJ., et al (2006) Mol. Ther. 14:343-350、 Li, S., et al (2007) Mol. Ther. 15:515-523)。RNA干渉は、直接注入によるCNSへの局所送達について成功を示しており(Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49、 Tan, PH., et al (2005) Gene Ther. 12:59-66、 Makimura, H., et al (2002) BMC Neurosci. 3:18、 Shishkina, GT., et al (2004) Neuroscience 129:521-528、 Thakker, ER., et al (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275、 Akaneya,Y., et al (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602)、鼻腔内投与による肺への局所送達について成功を示している(Howard, KA., et al (2006) Mol. Ther. 14:476-484、 Zhang, X., et al (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684、 Bitko, V., et al (2005) Nat. Med. 11:50-55)。疾患の治療用にiRNAを全身投与するために、RNAを修飾することができ、または、代わりに薬物送達システムを用いて送達することができる。両方の方法が、インビボでのエンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼによるdsRNAの急速な分解を防ぐように作用する。RNAまたは医薬担体の修飾もiRNA組成物の標的組織へのターゲティングを可能にすることができ、そして、望まないオフターゲット効果を避けることができる。コレステロールなどの親油性基への化学的複合体化によりiRNA分子を修飾し、細胞取込を向上させ、そして分解を防ぐことができる。例えば、親油性コレステロール部分と複合体化されたApoB指向性iRNAをマウスに全身注入し、肝臓と空腸の両方でapoB mRNAをノックダウンすることとなった(Soutschek,J.,et al (2004) Nature 432:173-178)。アプタマーへのiRNAの複合体化が前立腺癌のマウスモデルでの腫瘍増殖を抑制し、そして、腫瘍退縮に介在することが示されている(McNamara, JO., et al (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015)。他の実施形態では、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソームまたはカチオン性送達システムなどの薬物送達システムを使用してiRNAを送達することができる。正に荷電したカチオン性送達システムは(負に荷電した)iRNA分子の結合を促進し、そしてまた、負に荷電した細胞膜での相互作用を増強して細胞によるiRNAの効率的な取込を可能とする。カチオン性脂質、デンドリマーまたはポリマーはiRNAと結合させられることができるか、iRNAを包むベシクルまたはミセルを形成するように導入されることができるかのどちらかである(例えば、Kim SH., et al (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116を参照のこと)。ベシクルまたはミセルの形成が全身投与される時のiRNAの分解をさらに防ぐ。カチオン性iRNA複合体の作製法および投与法は十分に当業者の能力の範囲内である(例えば、Sorensen, DR., et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766、 Verma, UN., et al (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300、Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25:197-205を参照のこと。それらの文献の全体を参照して本明細書に組み入れる。)。iRNAの全身送達に有用な薬物送達システムのいくつかの非限定的な例には、DOTAP(Sorensen, DR., et al (2003),上記、 Verma, UN., et al (2003),上記)、オリゴフェクタミン、「固形核酸脂質粒子」(Zimmermann, TS., et al (2006) Nature 441:111-114)、カルジオリピン(Chien, PY., et al (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328、 Pal, A., et al (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091)、ポリエチレンイミン(Bonnet ME., et al (2008) Pharm. Res. 印刷前の8月16日付電子出版、 Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659)、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(RGD)ペプチド(Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487)、およびポリアミドアミン(Tomalia, DA., et al (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67、 Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804)が含まれる。いくつかの実施形態では、iRNAは全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成する。iRNAとシクロデキストリンの投与方法と医薬組成物は米国特許第7,427,605号に見つけることができ、その文献の全体を参照して本明細書に組み入れる。
別の態様では、DNAベクターまたはRNAベクターに挿入された転写単位からCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3遺伝子を標的とするiRNAを発現することができる(例えば、Couture, A, et al., TIG.,1996, 12:5-10、 Skillern, A., et al., 国際公開第WO00/22113号、 Conrad, 国際公開第WO00/22114号およびConrad, 米国特許第6,054,299号を参照のこと)。発現は、使用された特定のコンストラクトおよび標的組織または細胞種に応じて一時的でも(数時間から数週間の単位)持続性でも(数週間から数か月またはそれ以上)あり得る。組み込み型ベクターまたは非組み込み型ベクターでありうる線状コンストラクト、環状プラスミドまたはウイルスベクターとしてこれらの導入遺伝子を導入することができる。染色体外プラスミドとして遺伝されることを可能にするように、導入遺伝子を構築することもできる(Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92:1292)。
1つの実施形態では、iRNAと薬学的に許容可能な担体を含有する医薬組成物が本明細書において提供される。iRNA含有医薬組成物はCOL1A1遺伝子の過剰発現に関連する肝線維症の治療に有用である。送達モードに基づいてそのような医薬組成物を製剤する。一例は、静脈内(IV)送達などの非経口送達による全身性投与用に製剤される組成物である。別の例は、例えば連続ポンプ点滴での脳への点滴などによる脳柔組織への直接送達用に製剤される組成物である。
薬品の製剤に研究され、そして、使用されてきている、多くの組織化界面活性剤構造体がマイクロエマルジョンの他に存在する。これらには、モノレイヤー、ミセル、バイレイヤーおよびベシクルが含まれる。リポソームなどのベシクルは、薬物送達の観点からそれらが提供するそれらの特異性と作用期間のために、関心を非常に引きつけている。本発明で用いられる場合、用語「リポソーム」は球状の1つのバイレイヤーまたは複数のバイレイヤーに整えられた両親媒性脂質からなるベシクルを意味する。
1つの実施形態では、例えば、SPLP、pSPLP、SNALPまたは他の核酸脂質粒子を形成する脂質製剤中に本発明において取り上げられるCOL1A1、TGFβおよびSMAD2/3のdsRNAを完全にカプセル化する。本明細書において用いられる場合、用語「SNALP」は、SPLPを含む安定な核酸脂質粒子を意味する。本明細書において用いられる場合、用語「SPLP」は、脂質小胞内にカプセル化されたプラスミドDNAを含む核酸脂質粒子を意味する。SNALPおよびSPLPは典型的にはカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を防ぐ脂質(例えば、PEG−脂質複合体)を含む。SNALPおよびSPLPは静脈内(i.v.)注入後の循環存続期間の延長を示し、そして、遠位部分(例えば、投与部位から物理的に離れている部位)に蓄積するので、それらは全身性適用に極めて有用である。SPLPには、国際公開第WO00/03683号に記載されるカプセル化濃縮化剤−核酸複合体を含む「pSPLP」が包含される。本発明の粒子は典型的には約50nm〜約150nm、より典型的には約60nm〜約130nm、より典型的には約70nm〜約110nm、最も典型的には約70nm〜約90nmの平均直径を有し、そして、実質的に非毒性である。さらに、核酸は、本発明の核酸脂質粒子中に存在するとき、水性溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して耐性である。核酸脂質粒子およびその調製方法は、例えば、米国特許第5,976,567号、第5,981,501号、第6,534,484号、第6,586,410号、第6,815,432号、および国際公開第WO96/40964号に開示される。
1つの実施形態では、脂質dsRNAナノ粒子(すなわち、LNP01粒子)を調製するために脂質様物質ND98・4HCl(MW1487)(2008年3月26日に提出された米国特許出願第12/056,230号を参照のこと。その文献を参照して本明細書に組み入れる。)、コレステロール(Sigma−Aldrich)およびPEG−セラミドC16(Avanti Polar Lipids)を使用することができる。エタノール中の各々の原液を次のように調製することができる:ND98,133mg/ml、コレステロール,25mg/ml、PEG−セラミドC16,100mg/ml。次にND98、コレステロールおよびPEG−セラミドC16原液を例えば42:48:10のモル比で混合することができる。混合された脂質溶液を(例えば、pH5の酢酸ナトリウム中の)dsRNA水性溶液と、最終エタノール濃度が約35〜45%であり、そして、最終酢酸ナトリウム濃度が約100〜300mMであるように混合することができる。脂質−dsRNAナノ粒子は典型的には混合すると自然に形成する。所望の粒子サイズ分布に応じて、その結果のナノ粒子混合物を、例えばLipex Extruder(Northern Lipids,Inc)などのサーモバレル型押出成形機を使用することにより(例えば、100nmカットオフ性の)ポリカーボネート膜から押し出すことができる。いくつかの場合では押出工程を省略することができる。エタノールの除去およびそれと同時の緩衝液交換を、例えば、透析濾過または接線流濾過により達成することができる。緩衝液を約pH7、例えば、約pH6.9、約pH7.0、約pH7.1、約pH7.2、約pH7.3または約pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と交換することができる。
DSPC:ジステアロイルホスファチジルコリン
DPPC:ジパルミトイルホスファチジルコリン
PEG−DMG:PEG−ジジミリストイルグリセロール(C14−PEGまたはPEG−C14)(平均分子量2,000のPEG)
PEG−DSG:PEG−ジスチリルグリセロール(C18−PEGまたはPEG−C18)(平均分子量2,000のPEG)
PEG−cDMA:PEG−カルバモイル−1,2−ジミリスチルオキシプロピルアミン(平均分子量2,000のPEG)
本発明の核酸脂質粒子で使用される化合物のいずれも、例えばカチオン性脂質などは実施例においてより詳細に記載される方法を含む公知の有機合成技術により調製されることができる。他に指示されない限り、全ての置換基は以下に定義される通りである。
いくつかの実施形態では、式A
であって、式中、R1とR2は独立してアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であり、各々が置換されていてもよく、そしてR3とR4は独立して低級アルキル基であるか所望により結合させられて置換複素環を形成するものであるカチオン性脂質を使用して本発明の核酸脂質粒子を製剤する。いくつかの実施形態では、前記カチオン性脂質はXTC(2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノエチル−[1,3]−ジオキソラン)である。一般的に、他に指示されない限り全ての置換基が先に定義したとおりである次の反応計画1または2により上記の式Aの脂質が作製され得る。
計画1
計画1に従って、R1とR2は独立してアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であり、各々が置換されていてもよく、そしてR3とR4は独立して低級アルキル基であるか所望により結合させられて置換複素環を形成する脂質Aを調製することができる。ケトン1および臭化物2は購入可能であり、または、当業者に公知の方法に従ってそれらを調製することができる。1と2の反応がケタール3を産生する。ケタール3のアミン4での処理が式Aの脂質を産生する。Xがハロゲンイオン、水酸化物イオン、リン酸イオン、硫酸イオンなどから選択される陰イオン性対イオンである式5の有機塩を用いて式Aの脂質を対応するアンモニウム塩に変換することができる。
計画2
DLin−M−C3−DMA(すなわち、(6Z,9Z,28Z,31Z)−ヘプタトリアコンタ−6,9,28,31−テトラエン−19−イル4−(ジメチルアミノ)ブタノエート)の調製は次の通りであった。ジクロロメタン(5mL)中の(6Z,9Z,28Z,31Z)−ヘプタトリアコンタ−6,9,28,31−テトラエン−19−オール(0.53g)、4−N,N−ジメチルアミノ酪酸塩酸塩(0.51g)、4−N,N−ジメチルアミノピリジン(0.61g)および1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(0.53g)の溶液を室温で一晩撹拌した。前記溶液を希塩酸で洗浄し、次に希炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機画分を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、そして、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。1〜5%メタノール/ジクロロメタン溶出濃度勾配を用いてシリカゲルカラム(20g)に残留物を通した。精製産物を含む画分を混合し、そして、溶媒を除去し、無色の油分(0.54g)が産生した。
2つ口丸底フラスコ(RBF)(1L)内の200mlの無水THF中のLiAlH4(3.74g,0.09852mol)の撹拌懸濁液に70mLのTHF中の514(10g,0.04926mol)の溶液を0℃窒素雰囲気下でゆっくりと加えた。添加を完了した後に、反応混合物を室温まで温め、次に、加熱して4時間還流した。反応の進行はTLCによりモニターした。反応の完了の後(TLCによる)、混合物を0℃までに冷却し、そして、飽和Na2SO4溶液を注意深く加えて反応の抑制を行った。反応混合物を室温で4時間撹拌し、そして、濾過した。残留物をTHFでよく洗浄した。濾過液と洗液を混合し、そして、400mLのジオキサンと26mLの濃塩酸で希釈し、そして、室温で20分間撹拌した。真空下で揮発性成分を取り除いて515の塩酸塩を白色の固形物として供給した。収量:7.12g 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 9.34 (broad, 2H), 5.68 (s, 2H), 3.74 (m, 1H), 2.66-2.60 (m, 2H), 2.50-2.45 (m, 5H).
250mLの2つ口RBF内の100mLの乾燥DCM中の化合物515の撹拌溶液に、トリエチルアミン(37.2mL,0.2669mol)を加え、そして、窒素雰囲気下で0℃まで冷却した。50mLの乾燥DCM中のN−(ベンジルオキシ−カルボニルオキシ)−スクシンイミド(20g,0.08007mol)をゆっくりと添加した後に反応混合物が室温まで温まるにまかせた。反応の完了の後(2〜3時間、TLCによる)、混合物を1NのHCl溶液(1x100mL)と飽和NaHCO3溶液(1x50mL)で続けて洗浄した。次に有機層を無水Na2SO4上で乾燥し、そして、溶媒を蒸発乾燥させて粗製物質が生じ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーでそれを精製して粘着性の塊として516を得た。収量:11g(89%)。1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ = 7.36-7.27(m, 5H), 5.69 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.96 (br., 1H) 2.74 (s, 3H), 2.60(m, 2H), 2.30-2.25(m, 2H). LC-MS [M+H] -232.3 (96.94%).
シクロペンテン516(5g,0.02164mol)を500mLの1つ口RBF内の220mLのアセトンと水(10:1)の溶液に溶解し、そして、N−メチルモルホリン−N−オキシド(7.6g,0.06492mol)と続けて4.2mLのtert−ブタノール中のOsO4の7.6%溶液(0.275g,0.00108mol)を室温でそれに添加した。反応の完了後(約3h)、固形のNa2SO3を添加して混合物の反応を抑制し、そして、その結果生じる混合物を室温で1.5時間撹拌した。DCM(300mL)で反応混合物を希釈し、そして、水(2x100mL)と続けて飽和NaHCO3(1x50mL)溶液、水(1x30mL)そして最後に塩水(1x50mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥し、そして、真空で溶媒を除去した。粗物質のシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製によりジアステレオマーの混合物が供給され、それらは分取HPLCにより分離された。収量:−6g粗物質
化合物505の合成について記載されるものと類似の方法を用いて化合物518(1.2g,41%)が無色の油分として得られた。1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ= 7.35-7.33(m, 4H), 7.30-7.27(m, 1H), 5.37-5.27(m, 8H), 5.12(s, 2H), 4.75(m,1H), 4.58-4.57(m,2H), 2.78-2.74(m,7H), 2.06-2.00(m,8H), 1.96-1.91(m, 2H), 1.62(m, 4H), 1.48(m, 2H), 1.37-1.25(br m, 36H), 0.87(m, 6H). HPLC-98.65%.
ヘキサン(15mL)中の化合物518(1等量)の溶液をTHF中のLAHの氷冷溶液(1M,2等量)に滴下して加えた。添加を完了した後に混合物を40℃で0.5時間にわたって加熱し、次に氷浴で再度冷却した。混合物を飽和Na2SO4水溶液で注意深く加水分解し、次にセライトに通して濾過し、そして油分に還元した。カラムクロマトグラフィーにより純粋な519(1.3g,68%)がもたらされ、それを無色の油分として得た。13C NMR □ = 130.2, 130.1 (x2), 127.9 (x3), 112.3, 79.3, 64.4, 44.7, 38.3, 35.4, 31.5, 29.9 (x2), 29.7, 29.6 (x2), 29.5 (x3), 29.3 (x2), 27.2 (x3), 25.6, 24.5, 23.3, 226, 14.1; エレクトロスプレーMS (+ve): C44H80NO2 (M + H)+の分子量、計算値:654.6、実測値:654.6.
乳剤
本発明の組成物は乳剤として調製および製剤され得る。典型的には乳剤は、通常、直径が0.1μmを超える液滴の形状で1つの液体が別の液体に分散する不均一系である(例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY、 Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199、 Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245、Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335、 Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301を参照のこと)。乳剤は、多くの場合、緊密に混合され、そして、互いに分散した2つの非混和性液体を含む二相系である。一般的に、乳剤は油中水型(w/o)か水中油型(o/w)のどちらかであり得る。水相が小さい液滴に細かく分割され、大容量の油相中に分散されるとき、その結果生じる組成物は油中水型(w/o)乳剤と呼ばれる。あるいは、油相が小さい液滴に細かく分割され、大容量の水相中に分散されるとき、その結果生じる組成物は水中油型(o/w)乳剤と呼ばれる。乳剤は分散層に加えてその他の成分、および、水相、油相またはそれ自体別の相に存在し得る活性薬物を含有することができる。乳化剤、安定化剤、色素および抗酸化剤などの医薬賦形剤も必要に応じて乳剤中に存在し得る。医薬乳剤はまた、例えば、油中水中油型(o/w/o)乳剤および水中油中水型(w/o/w)乳剤の場合のように、2つよりも多い相からなる多重乳剤でもあり得る。そのような複合型製剤は、単純な二相型乳剤が提供しないいくらかの利点を多くの場合提供する。o/w乳剤の個々の油滴が小さい水滴を取り囲む多重乳剤は、w/o/w乳剤を構成する。同様に、油の連続相中で安定化された水の小球の中に取り囲まれた油滴の系はo/w/o乳剤を提供する。
1つの実施形態では、本発明は、動物の皮膚への核酸、特にiRNAの効率的な送達をもたらすために様々な浸透促進剤を用いる。大半の薬品が溶液中にイオン化形態と非イオン化形態の両方の形態で存在する。しかしながら、通常、脂質可溶性薬品または親油性薬品だけが容易に細胞膜を通過する。通過される予定の膜が浸透促進剤で処理された場合、非親油性薬品でさえ細胞膜を通過することが明らかになっている。非親油性薬品の細胞膜を越えた拡散の補助に加えて、浸透促進剤はまた親油性薬品の透過性を向上する。
本発明との関連では、界面活性剤(または、「表面活性剤」)は、水性溶液に溶解すると、その溶液の表面張力を、または、その水性溶液と別の液体との間の界面間張力を低減させ、結果として、粘膜によるiRNAの吸収を増大させることになる化学的実体である。胆汁塩と脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−20−セチルエーテル)(例えば、Malmsten, M. Surfactant s and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002、 Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92を参照のこと)、および、FC−43などのパーフルオロ化合物乳剤が含まれる。Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252)。
浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸とその誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリル酸、カプリン酸(n−デカノイン酸)、ミリスチル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン(1−モノオレオイル−rac−グリセロール)、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール1−モノカプレート、1−ドデシルアザシクロヘプタン−2−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらの炭素数1〜20のアルキル(例えば、メチル、イソプロピルおよびt−ブチル)エステル、およびそれらのモノ−およびジ−グリセリド(すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリスチレート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど)が含まれる(例えば、Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006、 Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92、 Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654を参照のこと)。
胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が含まれる(例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002、 Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935を参照のこと)。様々な天然胆汁塩およびそれらの合成誘導体が浸透促進剤として作用する。したがって、用語「胆汁塩」には、胆汁の天然成分のいずれもが、ならびに、それらの合成誘導体のいずれもが含まれる。適切な胆汁塩には、例えば、コール酸(または、その薬学的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム)、デヒドロコール酸(デヒドロコール酸ナトリウム)、デオキシコール酸(デオキシコール酸ナトリウム)、グルコール酸(グルコール酸ナトリウム)、グリコール酸(グリココール酸ナトリウム)、グリコデオキシコール酸(グリコデオキシコール酸ナトリウム)、タウロコール酸(タウロコール酸ナトリウム)、タウロデオキシコール酸(タウロデオキシコール酸ナトリウム)、ケノデオキシコール酸(ケノデオキシコール酸ナトリウム)、ウルソデオキシコール酸(UDCA)、タウロ−24,25−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム(STDHF)、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル(POE)が含まれる(例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002、 Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92、 Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783、 Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33、 Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25、 Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583を参照のこと)。
本発明との関連で使用されるようなキレート剤は、溶液から金属イオンをそれと錯体を形成することにより除去し、結果として、粘膜によるiRNAの吸収を増大させることになる化合物として定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのその使用に関して、大半の特徴が明らかになったDNAヌクレアーゼは触媒作用に二価の金属イオンを必要とし、したがって、キレート剤により阻害されるので、キレート剤はDNase阻害剤として働きもするという追加の利点を追加する(Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339)。適切なキレート剤には、エチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム(EDTA)、クエン酸、サリチレート(例えば、サリチル酸ナトリウム、5−メトキシサリチレートおよびホモバニレート)、コラーゲンのN−アシル誘導体、ラウレス−9およびβ‐ジケトン(エナミン)のN−アミノアシル誘導体が含まれるが、これらに限定されない(例えば、Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006、 Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92、 Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51を参照のこと)。
本明細書において用いられる場合、非キレート非界面活性剤浸透促進化合物は、キレート剤または界面活性剤として示される活性は有意ではないが、にもかかわらず消化管粘膜を通してiRNAの吸収を増大させる化合物として定義され得る(例えば、Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33を参照のこと)。この種類の浸透促進剤には、例えば、不飽和環状尿素、1−アルキル−アルカノン誘導および1−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92)、およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド系抗炎症剤(Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626)が含まれる。
本発明のある組成物はまた製剤中に担体化合物を組み入れる。本明細書において用いられる場合、「担体化合物」または「担体」は、不活性である(すなわち、それ自体は生物学的活性を持たない)が、例えば、生物学的に活性がある核酸を分解することにより、または、循環系からのそれの除去を促進することにより生物学的活性を持つ核酸の生物学的利用能を低減させるインビボプロセスにより核酸として認識される核酸、またはその類似体を意味することができる。核酸と担体化合物の共投与、典型的には後者の物質が過剰な共投与は、肝臓、腎臓または他の循環外貯蔵場所で回収される核酸の量を、おそらくは担体化合物と核酸の間での共通の受容体をめぐる競合のために実質的に減少させる結果になり得る。例えば、部分的にチオリン酸エステルを有するdsRNAがポリイノシン酸、デキストラン硫酸、ポリシチジン酸または4−アセタミド−4'イソチオシアノ−スチルベン−2,2'−ジスルホン酸と共投与されるとその肝臓組織での回収が低減する可能性がある(Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121、 Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183)。
担体化合物と対照的に、「医薬担体」または「賦形剤」は、1つ以上の核酸を動物に送達するための薬学的に許容可能な溶媒、懸濁剤または他のあらゆる薬学的に不活性な媒体である。賦形剤は液体または固体であることができ、そして、計画された投与方式を念頭に、核酸および所与の医薬組成物の他の成分と組み合わされたとき、所望の容積、硬度などを提供するように選択される。典型的な医薬担体には、結合剤(例えば、トウモロコシαデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど)、充填剤(例えば、乳糖および他の糖、ミクロクリスタリンセルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど)、滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、硬化植物性油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど)、崩壊剤(例えば、デンプン、グリコール酸デンプンナトリウムなど)および湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど)が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の組成物は、当技術分野で確立されている使用レベルで医薬組成物中に従来見られる他の補助成分をさらに含有することができる。したがって、例えば、前記組成物はその他の適合性を有する薬学的に活性がある物質、例えば、痒み止め薬、収斂薬、局所麻酔薬または抗炎症薬のような物質を含有することができ、または、前記組成物を様々な剤形に物理的に製剤するのに有用な、色素、着香剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定化剤などのその他の物質を含有することができる。しかしながら、そのような物質は、添加されると、本発明の組成物の生物学的活性を過度に干渉しない必要がある。製剤は無菌化されることができ、そして、所望により、製剤の核酸と有害に相互作用しない、例えば、滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、緩衝液、着色剤、着香剤、および/または芳香物質などの補助剤と混合されることができる。
ヒト(Homo sapiens)コラーゲンI型α1(COL1A1)はコラーゲンα−1(I)鎖、α−1I型コラーゲン、プロ−α−1コラーゲン1型、コラーゲンα1鎖I型、皮膚、腱および骨コラーゲンα−1鎖、OI4およびCOL1A1としても知られる。
線維症は、炎症、刺激状態、または傷治癒の結果として器官または部分で異常な量の線維性結合組織を形成することを特徴とする。線維性疾患には、全身性硬化症(SSc)、特発性肺線維症(IPF)、間質性肺疾患(ILD)、肝硬変、腎性全身性線維症(NSF)、塵肺症(金属粒子または鉱物粒子の吸入を原因とする慢性呼吸器疾患)、筋膜炎、硬化性粘液水腫、後腹膜線維症、肺線維症、肝線維症、慢性移植片対宿主病および慢性同種移植片拒絶反応および嚢胞性線維症が含まれるがこれらに限定されず、線維性疾患は様々な組織でのコラーゲンおよび他の細胞外マトリックス(ECM)成分の異常で過剰な沈着を特徴とする。活動性線維症はまたリウマチ性関節炎、ループス、自己免疫疾患、ライム病、喘息、特発性肺線維症、慢性肺線維症、子宮線維症および卵巣線維症において生じる可能性もある。それらの病因はきわめて多様であるが、活性化表現型を示すECM産生線維芽細胞の患部組織での存在が全ての線維性疾患に典型的である。線維芽細胞の活性化は、I型およびIII型コラーゲンならびにフィブロネクチンをコードする遺伝子の転写活性の著しい上昇、平滑筋αアクチン(α−SMA)の発現の開始、およびECM分解活性の低下を特徴とする。活性化線維芽細胞は、α−SMAを含有するストレスファイバーの発現の結果として生じる収縮性特性を示し、そして、それらの線維症促進性活性化は、インビトロでの複数回の継代培養の間に保存される一組の複雑な分子的および生化学的変化の一部である。
1つの態様では、細胞内のCOL1A1の発現を阻害する方法であって、(a)前記細胞内のCOL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子を標的とするdsRNAを前記細胞に導入する工程、および(b)工程(a)で作製された細胞を、COL1A1遺伝子、TGFβ遺伝子またはSMAD2/3遺伝子それぞれのmRNA転写物が分解されるのに十分な時間にわたり維持する工程を含む方法が、本明細書において提供される。dsRNAがTGFβ遺伝子および/またはSMAD2/3の遺伝子の発現を標的とする実施形態では、細胞を刺激してCOL1A1を過剰発現させるTGFβからのシグナル伝達を低減することにより、その細胞でのCOL1A1遺伝子の発現が間接的に阻害される。その阻害はCOL1A1遺伝子のmRNA転写物の分解によるものではない。遺伝子発現の減少は当技術分野において公知のどんな方法によっても、および、本明細書において記載される方法、例えば、定量RT−PCRによって評価され得る。
本発明の態様および実施形態は、特に、COL1A1遺伝子の発現を標的とするiRNAとCOL1A1介在性肝線維症の治療用の少なくとも1つのiRNAを含有する組成物の使用に関連する。本発明の実施形態はまた、COL1A1遺伝子の発現を促進する伝達経路中の分子、例えば、TFGβおよびSMAD2/3を標的とするiRNAの使用に関連する。例えば、COL1A1遺伝子を標的とするiRNAを含有する組成物を肝線維症の治療および/もしくは予防のために使用し、または、TGFβ遺伝子および/もしくはSMAD2/3遺伝子を標的とするiRNAを含有する組成物を肝線維症の治療および/もしくは予防のために使用する。
試薬の供給元
本明細書において試薬の供給元が具体的に教示されていない場合、分子生物学での適用に標準的な品質/純度の分子生物学用試薬の任意の供給会社からそのような試薬を得ることができる。
申請者らは、本明細書において記載されるiRNA分子を生成するためにいくつかの異なる方法を用いている。本実施例は、使用している1つの方法を記述するものである。当業者は、本明細書において記載されるようなiRNAを調製するために当技術分野において公知の任意の方法を用いることができる。
合成の完了後、100mLのガラスボトル(VWR)に前記支持体を移す。80mLのエタノールアンモニア混合液[アンモニア:エタノール(3:1)]を55℃で6.5時間用いて塩基とリン酸エステル基を同時脱保護することにより、オリゴヌクレオチドを支持体から切り離す。ボトルを氷上で一時的に冷却し、次に前記エタノールアンモニア混合液を濾過して新しい250mLのボトルに移す。1部40mLのエタノール/水(1:1 体積/体積)で2回、前記多孔質ガラス(CPG)を洗浄する。前記混合液の体積を次にロータリーエバポレーターにより約30mLに減少させる。次に、前記混合液をドライアイス上で凍結し、真空乾燥機を用いて真空で乾燥させる。
26mLのトリエチルアミン、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩(TEA・3HF)またはピリジン−HFおよびDMSO(3:4:6)に前記乾燥残留物を再懸濁し、2'位のtert−ブチルジメチルシリル(TBDMS)基を取り除くために60℃で90分間加熱する。次に、50mLの20mM酢酸ナトリウムを用いて反応を抑制し、pHを6.5に調整する。精製までオリゴヌクレオチドを冷凍庫に貯蔵する。
精製の前に高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によりオリゴヌクレオチドを分析する。緩衝液とカラムの選択は、配列および/または複合体化されたリガンドの性質に依る。
逆相分取HPLCによりリガンド複合体化オリゴヌクレオチドを精製する。自分で充填したTSKゲルカラムでの陰イオン交換HPLCにより複合体化しなかったオリゴヌクレオチドを精製する。緩衝液は、10%CH3CN中の20mMリン酸ナトリウム(pH8.5)(緩衝液A)と10%CH3CN、1M NaBr中の20mMリン酸ナトリウム(pH8.5)である。全長のオリゴヌクレオチドを含む画分をプールし、脱塩し、そして、凍結乾燥する。およそ0.15の分光密度(OD)の脱塩化オリゴヌクレオチドを150μLまで水に希釈し、次に、CGEおよびLC/MS分析のための特別なバイアルにピペットで分注する。次に化合物をLC−ESMSとCGEにより分析する。
iRNAの一般的な調製には、1xPBS中で等モル量のセンス鎖とアンチセンス鎖を95℃で5分間加熱し、そして、室温までゆっくりと冷やす。二重鎖が完全体であることをHPLC分析により確認する。
転写物
ヒトコラーゲン1A1分子(COL1A1)、ヒトトランスフォーミング増殖因子β1(TGFβ)、SMADファミリーメンバー2および3をコードする遺伝子、ならびにマウス(Mus musculus)およびラット(Rattus norvegicus)由来のオルソロガスな配列を標的とするsiRNAを特定するためにオリゴヌクレオチドの設計を行った。その設計の過程でヒトCOL1A1 mRNA NM_000088.3(配列番号172)、マウスCOL1A1 mRNA NM_007742.3(配列番号173)、ヒトTGFβ mRNA NM_000660.4(配列番号174)、マウスTGFβ mRNA NM_011577.1(配列番号175)、4つのヒトSMAD3 mRNA NM_001145102.1(配列番号180)、NM_001145103.1(配列番号181)、NM_001145104.1(配列番号182)、およびNM_005902.3(配列番号183)、マウスSMAD3 mRNA NM_016769.4(配列番号184)を用い、3つのヒトSMAD2 mRNAはNM_001003652.2(配列番号176)、NM_001135937.1(配列番号177)、およびNM_005901.4(配列番号178)であり、ならびにマウスSMAD2mRNAはNM_010754.4である。NCBI Refseqコレクションから全ての配列を得た。
19塩基長のオリゴセットの特異性を各配列から予測した。COL1A1、TGFβおよびSMAD2/3のsiRNAを、それらそれぞれのヒト、またはマウスおよびラットの(NCBI Refseqセット内でNM_recordおよびXM_recordとして定義される)トランスクリプトームに対するFASTAアルゴリズムを用いる包括的な検索に使用した。次に、アラインメントをパースし、そして、siRNAと任意の潜在的な「オフターゲット」転写物の間のミスマッチの位置と数に基づいてスコアを生成するために「offtargetFasta.py」という名称のPythonスクリプトを使用した。siRNAの「シード」領域での、その分子の5'末端から2〜9の位置での差異を強調するために、オフターゲットスコアに荷重がかけてある。次のようにオフターゲットスコアを計算する。オリゴと転写物の間のミスマッチにペナルティーが与えられる。オリゴの位置2〜9中のシード領域での1つのミスマッチに2.8のペナルティーが与えられ、推定上の切断部位10および11でのミスマッチに1.2のペナルティーが与えられ、および、他の全てのミスマッチに1のペナルティーが与えられる。次に、ミスマッチペナルティーを合計して各オリゴ‐転写物対についてのオフターゲットスコアを計算する。次に、全てのオリゴ‐転写物対由来の最小のオフターゲットスコアを決定し、そして、その後のオリゴの分別に用いる。計算されたスコアに従って、特異性でsiRNAの両鎖を分類した。3より高いスコアは非常に特異的であるとみなされ、3に等しいスコアは特異的であるとみなされ、そして、2.2と2.8の間のスコアは適度に特異的であるとみなされる。どのオリゴを合成するか選択するときに、我々はアンチセンス鎖のオフターゲットスコアによって高いものから低いものまで分類し、そして、最も良い(オフターゲットスコアが最も低い)オリゴ対を選んだ。
MerMade192シンセサイザーでCOL1A1、TGFβおよびSMAD2/3のiRNA配列を1μmolの規模で合成した。
● センス鎖中の全てのピリミジン類(シトシンおよびウリジン)が2'−O−メチル塩基(2'O−メチルCおよび2'−O−メチルU)を含んだ。
● アンチセンス鎖では、リボAヌクレオシドに(5'位の方向に)隣接するピリミジン類はそれらに対応する2−O−メチルヌクレオシドで置き換えられた。
● センス配列およびアンチセンス配列の両方の3'末端に2塩基のdTsdT伸長部が導入された。
● MerMade192合成ソフトウェアでのローディングに適合するように配列ファイルをテキストファイルに変換した。
ホスホラミダイト化学を用いる固形物支持型オリゴヌクレオチド合成をCOL1A1、TGFβおよびSMAD2/3のRNA配列の合成に用いた。
Source15Qカラムを使用するAKTAエクスプローラー精製システムでCOL1A1、TGFβおよびSMAD2/3のRNA配列を精製した。精製中にカラム温度を65℃に維持した。96ウェル(1.8mLのディープウェル)プレートにおいて試料注入および回収を実行した。全長の配列に相当する1つのピークを溶離液中に回収した。AKTAピューリファイアーを使用してSephadex G25カラムで精製された配列を脱塩した。脱塩したCOL1A1配列、TGFβ配列およびSMAD2/3配列を(A260での紫外線測定により)濃度および(イオン交換HPLCにより)純度について分析した。次に、一本鎖をアニーリングさせた。
細胞培養および形質移入
トリプシン処理によりプレートから剥がす前に、5%のCO2濃度の大気中、37℃、10%FBSを添加したDMEM(INVITROGEN(商標))でNIH3T3細胞を集密近くまで増殖させた。96ウェルプレートに1ウェルあたり10μlのOpti−MEMと0.2μlのリポフェクタミンRNAiMax(INVITROGEN(商標)、Carlsbad、カリフォルニア州、カタログ番号13778−150)と共に1ウェルあたり5μlのsiRNA二重鎖に5μlのOpti−MEMを加えてリバーストランスフェクションを実行し、室温で15分間保温した。前記形質移入ミックスに細胞を加え、そして、RNA精製の前に24時間培養した。複数のCOL1A1二重鎖の各々を用いる単一用量スクリーンについて、10nMの最終二重鎖濃度で実験を実行した。10nMの単一用量スクリーンで強いサイレンシングを示す10個の二重鎖のサブセットを、段階希釈を用いて10nMから10fMまでの濃度範囲にわたって試験して、それらのIC50を決定した。選択したAD21349(配列番号53および配列番号54)は65pMのIC50を有する。試験されたsiRNAはげっ歯類、非ヒト霊長類(NHP)およびヒトと交差反応した(図1を参照のこと)。
細胞を回収し、そして、140μlの溶解/結合溶液中に溶解し、次にEppendorfのサーモミキサーを用いて850rpmで1分間混合した(その過程を通して混合速度は同じであった)。20マイクロリッターの磁気ビーズおよび溶解/結合促進混合液を細胞溶解物に加え、そして、5分間混合した。磁気スタンドを使用して磁気ビーズを捕捉し、そして、ビーズをかき乱すことなく上清を除去した。上清を除去した後に磁気ビーズを(イソプロパノールを添加した)洗浄溶液1で洗浄し、そして、1分間混合した。再びビーズを捕捉し、そして、上清を除去した。次に、ビーズを150μlの(エタノールを添加した)洗浄溶液2で洗浄し、捕捉し、そして、上清を除去した。次に50μlのDNase混合液(MagMaxターボDNase緩衝液およびTurbo DNase)をビーズに加え、そして、それらを10〜15分間混合した。混合した後に100μlのRNA再結合溶液を加え、そして、3分間混合した。上清を除去し、そして、磁気ビーズを150μlの洗浄溶液2で再び洗浄し、そして、1分間混合し、そして、上清を完全に除去した。磁気ビーズを2分間混合して乾燥させた後にRNAを50μlの水に溶出した。
一反応当たり2μlの10×緩衝液、0.8μlの25×dNTP混合物、2μlのランダムプライマー、1μlの逆転写酵素、1μlのRNase阻害剤および3.2μlの水のマスターミックスを10μlの全RNAに加えた。MJ ResearchまたはBio−Rad C−1000もしくはS−1000サーマルサイクラー(Hercules、カリフォルニア州)を使用して次の工程でcDNAを生成した:25℃10分、37℃120分、85℃5秒、4℃で保持。
LightCycler480用384ウェルプレート(Roche、カタログ番号0472974001)に1ウェルあたり合計で10μlの中に0.5μlのGAPDH用TaqManプローブ(Applied Biosystems、カタログ番号4326317E)、0.5μlのCOL1A1、TGFβまたはSMAD2/3用TaqManプローブおよび5μlのRoche Probes Master Mix(Roche、カタログ番号04887301001)を含むマスターミックスに2μlのcDNAを加えた。LightCycler480リアルタイムPCRマシーン(Roche)でリアルタイムPCRを行った。少なくとも2回の独立した形質移入で各二重鎖を試験した。各形質移入をqPCRで2回試験した。
一般的に、肝臓傷害は多くの要因、例えば、四塩化炭素(CCl4)、ジアメチルニトロザミンおよびチオアセトアミドなどの毒性化学物質、例えば、異種血清に対するインビボでの免疫反応および住血吸虫やウイルスなどの病原体に起因する損傷、胆管線維症に至る総胆管の結紮、ならびに過度の飲酒により引き起こされ得る。エタノール飼料で飼育されたヒヒおよびラットのツカモト/フレンチモデルがアルコール性肝臓傷害動物モデルの例である。
CCl4マウスモデルでのCOL1A1ノックダウン用siCOL1A1のAF09およびAF12ベースの送達を評価するために、第1日および第8日に経口強制投与により(2回)1.75ml/kgの最終用量でCCl4を用いてBalb/c動物に肝臓傷害を誘導した。対照動物にはミネラルオイルだけが与えられた。その後、第9日にAF09およびAF12製剤化siRNAを前記マウスに静脈内注入し、次に、第11日のsiRNA注入後約40時間で前記マウスを殺処理した。使用した対照siRNAはsiLUC(AD1955)であった。siCOL1A1(AD21349)(配列番号53および配列番号54)とsiLUC(AD1955)の両方の投与量は3mg/kgであった。Taqman−定量PCRを用いて肝臓でのCOL1A1およびGAPDHのmRNAレベルを分析した。1条件1群あたり合計で10〜15匹の動物を用いた。COL1A1 mRNAのレベルをGAPDH mRNAレベルのそれに対して正規化した。
NIH3T3細胞を増殖させ、培養し、そして、用いたsiRNAがトランスフォーミング増殖因子β1(TGFβ)遺伝子を標的としたこと以外は実施例3に記載されるようにsiRNAで処理した。複数のTGFβ二重鎖の各々を用いる単一用量スクリーンについて、10nMの最終二重鎖濃度で実験を実行した(図9)。
NIH3T3細胞を増殖させ、培養し、そして、用いたsiRNAがSMADファミリーメンバー2および3(SMAD2およびSMAD3)遺伝子を標的としたこと以外は実施例3に記載されるようにsiRNAで処理した。複数のSMAD2/3二重鎖の各々を用いる単一用量スクリーンについて、10nMの最終二重鎖濃度で実験を実行した(図10)。
SMADは線維症発生でのTGFβシグナル伝達に関与しているので、SMADの発現をノックダウンすると肝臓傷害マウスモデルでのCOL1A1の発現が影響を受けるかどうか検討した。CCl4マウスモデルでのSMAD2ノックダウン用siSMAD2 AD−20916(配列番号140および配列番号141)のLNPベースの送達を評価するために、第0日に経口強制投与により(2回)1.75ml/kgの用量でCCl4を用いてBalb/c動物に肝臓傷害を誘導した。対照動物にはミネラルオイルだけが与えられた。第2日にLNP製剤化siRNAを前記マウスに静脈内注入し、次に、CCl4誘導後第4日に前記マウスを殺処理した。対照siRNAはsiLUC(AD1955)であった。siSMAD2/3 AD−20916(配列番号140および配列番号141)とsiLUC(AD1955)の両方の投与量は3mg/kgであった。Taqman−定量PCRを用いて肝臓でのSMAD2およびGAPDHのmRNAレベルを分析した。1条件1群あたり合計で10匹の動物を用いた。SMAD2 mRNAのレベルをGAPDH mRNAレベルのそれに対して正規化した。
肝臓に対する反復性損傷により慢性肝疾患が引き起こされ、その結果、最終的には肝線維症および硬変になる肝臓破壊および肝臓退縮の進行性のプロセスに入る。肝臓に対するそのような反復性損傷の条件でCOL1A1の効果的な阻害が仲介され得るかどうか、および、そのような状況でそのような処理が線維症の低減に効果的であるかどうか評価するために、複数回の損傷を含む慢性肝臓傷害のマウスモデルを確立し、そして、COL1A1のノックダウン用のCOL1A1に対するsiRNAの反復投与の効果を測定した。この慢性肝臓傷害のマウスモデルでは、第1日、第8日、第15日、第22日、第29日および第36日に経口強制投与により1.75ml/kgの最終用量でCCl4を用いてBalb/c動物に肝臓傷害を誘導した。これらの同じ日に対照動物にはミネラルオイルだけが与えられた。第23日、第27日、第30日、第33日および第37日にAF09およびAF12製剤化COL1A1 siRNAを前記マウスに静脈注入し、次に、最後のsiRNA注入後の約40〜48時間で、すなわち、第39日で前記マウスを殺処理した。使用した対照siRNAはsiLUC(AD1955)であった。siCOL1A1(AD21349)(配列番号53および配列番号54)とsiLUC(AD1955)の両方の投与量は1mg/kgであった。Taqman−定量PCRを用いて肝臓でのCOL1A1およびGAPDHのmRNAレベルを分析した。1条件1群あたり合計で10匹の動物を用いた。COL1A1 mRNAのレベルをGAPDH mRNAレベルのそれに対して正規化した。
CCl4モデルでは、肝臓損傷が中心静脈周辺領域のみへ非常に集中することになり、したがって、CCl4モデルは肝臓の中心静脈周辺領域への肝臓損傷の良いモデルである。
Desmet VJ, Gerber M, Hoofnagle JH, Manns M, Scheuer PJ. Classification of chronic hepatitis: diagnosis, grading and staging. Hepatology 1994, 19(6):1513-20.
Ishak K, Baptista A, Bianchi L, Callea F, De Groote J, Gudat F, et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol 1995, 22(6):696-9.
Knodell RG, Ishak KG, Black WC, Chen TS, Craig R, Kaplowitz N, Kiernan TW, Wollman J. Formulation and application of a numerical scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis. Hepatology 1981, 1(5):431-5.
Schirmacher P, Fleig WE, Dienes HP. (Biopsy diagnosis of chronic hepatitis). Z Gastroenterol 2004, 42(2):175-85.
Claims (17)
- TGFβの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)であって、前記dsRNAがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、
(i)前記センス鎖が配列番号63のヌクレオチド配列からなり、かつ前記アンチセンス鎖が配列番号64のヌクレオチド配列からなるか、
(ii)前記センス鎖が配列番号65のヌクレオチド配列からなり、かつ前記アンチセンス鎖が配列番号66のヌクレオチド配列からなるか、
(iii)前記センス鎖が配列番号69のヌクレオチド配列からなり、かつ前記アンチセンス鎖が配列番号70のヌクレオチド配列からなるか、
(iv)前記センス鎖が配列番号75のヌクレオチド配列からなり、かつ前記アンチセンス鎖が配列番号76のヌクレオチド配列からなるか、
(v)前記センス鎖が配列番号77のヌクレオチド配列からなり、かつ前記アンチセンス鎖が配列番号78のヌクレオチド配列からなるか、
(vi)前記センス鎖が配列番号85のヌクレオチド配列からなり、かつ前記アンチセンス鎖が配列番号86のヌクレオチド配列からなるか、
(vii)前記センス鎖が配列番号91のヌクレオチド配列からなり、かつ前記アンチセンス鎖が配列番号92のヌクレオチド配列からなるか、
(viii)前記センス鎖が配列番号93のヌクレオチド配列からなり、かつ前記アンチセンス鎖が配列番号94のヌクレオチド配列からなるか、
(ix)前記センス鎖が配列番号99のヌクレオチド配列からなり、かつ前記アンチセンス鎖が配列番号100のヌクレオチド配列からなるか、または
(x)前記センス鎖が配列番号105のヌクレオチド配列からなり、かつ前記アンチセンス鎖が配列番号106のヌクレオチド配列からなる、
前記dsRNA。 - 少なくとも1個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項1に記載のdsRNA。
- 前記修飾ヌクレオチドの少なくとも1つが、2'−O−メチル修飾ヌクレオチド、5'−チオリン酸エステル基含有ヌクレオチド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチド、2'−デオキシ−2'−フルオロ修飾ヌクレオチド、2'−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2'−アミノ修飾ヌクレオチド、2'−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダートおよび非天然塩基含有ヌクレオチドからなる群より選択される、請求項2に記載のdsRNA。
- それぞれの鎖が30ヌクレオチド以下の長さである、請求項1に記載のdsRNA。
- 少なくとも一方の鎖が、少なくとも1ヌクレオチドの3'オーバーハングを含む、請求項1に記載のdsRNA。
- リガンドをさらに含む、請求項1に記載のdsRNA。
- 前記リガンドが前記dsRNAの前記センス鎖の3'末端と複合体化されている、請求項6に記載のdsRNA。
- 請求項1に記載のdsRNAを含有する、細胞。
- 請求項1に記載のdsRNAを含む、TGFβ遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
- 請求項1に記載のdsRNAを含む、脂質製剤。
- SNALPまたはXTC製剤である、請求項10に記載の脂質製剤。
- インビトロで細胞内のTGFβ発現を阻害する方法であって、
a. 請求項1に記載のdsRNAを前記細胞に導入する工程、および、
b. 工程(a)で作製された細胞を、TGFβ遺伝子のmRNA転写物が分解されるのに十分な時間にわたり維持し、それによって前記細胞内のTGFβ遺伝子の発現を阻害する工程
を含む、前記方法。 - 肝線維症を治療するための、請求項1に記載のdsRNAを含む医薬組成物。
- 請求項1に記載のdsRNAをコードするベクター。
- 請求項14に記載のベクターを含む、細胞。
- 前記センス鎖が配列番号69のヌクレオチド配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖が配列番号70のヌクレオチド配列を含む、請求項5に記載のdsRNA。
- 前記センス鎖が配列番号91のヌクレオチド配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖が配列番号92のヌクレオチド配列を含む、請求項5に記載のdsRNA。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US564562A (en) | 1896-07-21 | Joseph p | ||
US3687808A (en) | 1969-08-14 | 1972-08-29 | Univ Leland Stanford Junior | Synthetic polynucleotides |
US4469863A (en) | 1980-11-12 | 1984-09-04 | Ts O Paul O P | Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof |
US4534899A (en) | 1981-07-20 | 1985-08-13 | Lipid Specialties, Inc. | Synthetic phospholipid compounds |
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US4476301A (en) | 1982-04-29 | 1984-10-09 | Centre National De La Recherche Scientifique | Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon |
JPS5927900A (ja) | 1982-08-09 | 1984-02-14 | Wakunaga Seiyaku Kk | 固定化オリゴヌクレオチド |
FR2540122B1 (fr) | 1983-01-27 | 1985-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application |
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US4824941A (en) | 1983-03-10 | 1989-04-25 | Julian Gordon | Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems |
US4587044A (en) | 1983-09-01 | 1986-05-06 | The Johns Hopkins University | Linkage of proteins to nucleic acids |
US5118802A (en) | 1983-12-20 | 1992-06-02 | California Institute Of Technology | DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside |
US5118800A (en) | 1983-12-20 | 1992-06-02 | California Institute Of Technology | Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide |
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US5317098A (en) | 1986-03-17 | 1994-05-31 | Hiroaki Shizuya | Non-radioisotope tagging of fragments |
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US5082830A (en) | 1988-02-26 | 1992-01-21 | Enzo Biochem, Inc. | End labeled nucleotide probe |
JPH03503894A (ja) | 1988-03-25 | 1991-08-29 | ユニバーシィティ オブ バージニア アランミ パテンツ ファウンデイション | オリゴヌクレオチド n‐アルキルホスホラミデート |
US5278302A (en) | 1988-05-26 | 1994-01-11 | University Patents, Inc. | Polynucleotide phosphorodithioates |
US5109124A (en) | 1988-06-01 | 1992-04-28 | Biogen, Inc. | Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine |
US5216141A (en) | 1988-06-06 | 1993-06-01 | Benner Steven A | Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages |
US5175273A (en) | 1988-07-01 | 1992-12-29 | Genentech, Inc. | Nucleic acid intercalating agents |
US5262536A (en) | 1988-09-15 | 1993-11-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides |
GB8824593D0 (en) | 1988-10-20 | 1988-11-23 | Royal Free Hosp School Med | Liposomes |
US5512439A (en) | 1988-11-21 | 1996-04-30 | Dynal As | Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof |
US5599923A (en) | 1989-03-06 | 1997-02-04 | Board Of Regents, University Of Tx | Texaphyrin metal complexes having improved functionalization |
US5457183A (en) | 1989-03-06 | 1995-10-10 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Hydroxylated texaphyrins |
US5391723A (en) | 1989-05-31 | 1995-02-21 | Neorx Corporation | Oligonucleotide conjugates |
US4958013A (en) | 1989-06-06 | 1990-09-18 | Northwestern University | Cholesteryl modified oligonucleotides |
US5032401A (en) | 1989-06-15 | 1991-07-16 | Alpha Beta Technology | Glucan drug delivery system and adjuvant |
US5451463A (en) | 1989-08-28 | 1995-09-19 | Clontech Laboratories, Inc. | Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides |
US5134066A (en) | 1989-08-29 | 1992-07-28 | Monsanto Company | Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs |
US5436146A (en) | 1989-09-07 | 1995-07-25 | The Trustees Of Princeton University | Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors |
US5254469A (en) | 1989-09-12 | 1993-10-19 | Eastman Kodak Company | Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures |
US5591722A (en) | 1989-09-15 | 1997-01-07 | Southern Research Institute | 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity |
US5356633A (en) | 1989-10-20 | 1994-10-18 | Liposome Technology, Inc. | Method of treatment of inflamed tissues |
US5225212A (en) | 1989-10-20 | 1993-07-06 | Liposome Technology, Inc. | Microreservoir liposome composition and method |
US5013556A (en) | 1989-10-20 | 1991-05-07 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
US5399676A (en) | 1989-10-23 | 1995-03-21 | Gilead Sciences | Oligonucleotides with inverted polarity |
US5264564A (en) | 1989-10-24 | 1993-11-23 | Gilead Sciences | Oligonucleotide analogs with novel linkages |
EP0942000B1 (en) | 1989-10-24 | 2004-06-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-Modified oligonucleotides |
US5292873A (en) | 1989-11-29 | 1994-03-08 | The Research Foundation Of State University Of New York | Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe |
US5177198A (en) | 1989-11-30 | 1993-01-05 | University Of N.C. At Chapel Hill | Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates |
CA2029273A1 (en) | 1989-12-04 | 1991-06-05 | Christine L. Brakel | Modified nucleotide compounds |
US5486603A (en) | 1990-01-08 | 1996-01-23 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide having enhanced binding affinity |
US5587361A (en) | 1991-10-15 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
US5852188A (en) | 1990-01-11 | 1998-12-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages |
US5681941A (en) | 1990-01-11 | 1997-10-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Substituted purines and oligonucleotide cross-linking |
US5459255A (en) | 1990-01-11 | 1995-10-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | N-2 substituted purines |
US7037646B1 (en) | 1990-01-11 | 2006-05-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides |
US5587470A (en) | 1990-01-11 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 3-deazapurines |
US5670633A (en) | 1990-01-11 | 1997-09-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression |
US5578718A (en) | 1990-01-11 | 1996-11-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Thiol-derivatized nucleosides |
US5646265A (en) | 1990-01-11 | 1997-07-08 | Isis Pharmceuticals, Inc. | Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites |
US6783931B1 (en) | 1990-01-11 | 2004-08-31 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides |
US5214136A (en) | 1990-02-20 | 1993-05-25 | Gilead Sciences, Inc. | Anthraquinone-derivatives oligonucleotides |
AU7579991A (en) | 1990-02-20 | 1991-09-18 | Gilead Sciences, Inc. | Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers |
US5321131A (en) | 1990-03-08 | 1994-06-14 | Hybridon, Inc. | Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling |
US5470967A (en) | 1990-04-10 | 1995-11-28 | The Dupont Merck Pharmaceutical Company | Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages |
US5665710A (en) | 1990-04-30 | 1997-09-09 | Georgetown University | Method of making liposomal oligodeoxynucleotide compositions |
GB9009980D0 (en) | 1990-05-03 | 1990-06-27 | Amersham Int Plc | Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides |
EP0455905B1 (en) | 1990-05-11 | 1998-06-17 | Microprobe Corporation | Dipsticks for nucleic acid hybridization assays and methods for covalently immobilizing oligonucleotides |
US5981276A (en) | 1990-06-20 | 1999-11-09 | Dana-Farber Cancer Institute | Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof |
US5608046A (en) | 1990-07-27 | 1997-03-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds |
US5218105A (en) | 1990-07-27 | 1993-06-08 | Isis Pharmaceuticals | Polyamine conjugated oligonucleotides |
US5688941A (en) | 1990-07-27 | 1997-11-18 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds |
US5610289A (en) | 1990-07-27 | 1997-03-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogues |
US5489677A (en) | 1990-07-27 | 1996-02-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms |
US5138045A (en) | 1990-07-27 | 1992-08-11 | Isis Pharmaceuticals | Polyamine conjugated oligonucleotides |
US5541307A (en) | 1990-07-27 | 1996-07-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof |
BR9106702A (pt) | 1990-07-27 | 1993-06-08 | Isis Pharmaceuticals Inc | Analogo de oligonucleotideos e processos para modular a producao de uma proteina por um organismo e para tratar um organismo |
US5623070A (en) | 1990-07-27 | 1997-04-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Heteroatomic oligonucleoside linkages |
US5618704A (en) | 1990-07-27 | 1997-04-08 | Isis Pharmacueticals, Inc. | Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling |
US5677437A (en) | 1990-07-27 | 1997-10-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Heteroatomic oligonucleoside linkages |
US5602240A (en) | 1990-07-27 | 1997-02-11 | Ciba Geigy Ag. | Backbone modified oligonucleotide analogs |
US5245022A (en) | 1990-08-03 | 1993-09-14 | Sterling Drug, Inc. | Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides |
IL99066A (en) | 1990-08-03 | 1996-01-31 | Sterling Winthrop Inc | Nuclease-resistant compounds containing oligonucleotide sequences having either or both of the ends, and preparations containing them |
US5512667A (en) | 1990-08-28 | 1996-04-30 | Reed; Michael W. | Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides |
US5214134A (en) | 1990-09-12 | 1993-05-25 | Sterling Winthrop Inc. | Process of linking nucleosides with a siloxane bridge |
US5561225A (en) | 1990-09-19 | 1996-10-01 | Southern Research Institute | Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages |
JPH06505704A (ja) | 1990-09-20 | 1994-06-30 | ギリアド サイエンシズ,インコーポレイテッド | 改変ヌクレオシド間結合 |
US5432272A (en) | 1990-10-09 | 1995-07-11 | Benner; Steven A. | Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases |
CA2095212A1 (en) | 1990-11-08 | 1992-05-09 | Sudhir Agrawal | Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides |
GB9100304D0 (en) | 1991-01-08 | 1991-02-20 | Ici Plc | Compound |
US7015315B1 (en) | 1991-12-24 | 2006-03-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped oligonucleotides |
JP3220180B2 (ja) | 1991-05-23 | 2001-10-22 | 三菱化学株式会社 | 薬剤含有タンパク質結合リポソーム |
US5714331A (en) | 1991-05-24 | 1998-02-03 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility |
US5539082A (en) | 1993-04-26 | 1996-07-23 | Nielsen; Peter E. | Peptide nucleic acids |
US5719262A (en) | 1993-11-22 | 1998-02-17 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having amino acid side chains |
US5371241A (en) | 1991-07-19 | 1994-12-06 | Pharmacia P-L Biochemicals Inc. | Fluorescein labelled phosphoramidites |
US5571799A (en) | 1991-08-12 | 1996-11-05 | Basco, Ltd. | (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response |
DE59208572D1 (de) | 1991-10-17 | 1997-07-10 | Ciba Geigy Ag | Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte |
US5594121A (en) | 1991-11-07 | 1997-01-14 | Gilead Sciences, Inc. | Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines |
US5252479A (en) | 1991-11-08 | 1993-10-12 | Research Corporation Technologies, Inc. | Safe vector for gene therapy |
US6235887B1 (en) | 1991-11-26 | 2001-05-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines |
US5484908A (en) | 1991-11-26 | 1996-01-16 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines |
US5359044A (en) | 1991-12-13 | 1994-10-25 | Isis Pharmaceuticals | Cyclobutyl oligonucleotide surrogates |
US6277603B1 (en) | 1991-12-24 | 2001-08-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules |
ATE204879T1 (de) | 1991-12-24 | 2001-09-15 | Isis Pharmaceuticals Inc | Antisense oligonukleotide |
US5595726A (en) | 1992-01-21 | 1997-01-21 | Pharmacyclics, Inc. | Chromophore probe for detection of nucleic acid |
US5565552A (en) | 1992-01-21 | 1996-10-15 | Pharmacyclics, Inc. | Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis |
FR2687679B1 (fr) | 1992-02-05 | 1994-10-28 | Centre Nat Rech Scient | Oligothionucleotides. |
DE4203923A1 (de) | 1992-02-11 | 1993-08-12 | Henkel Kgaa | Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis |
US5633360A (en) | 1992-04-14 | 1997-05-27 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation |
US5434257A (en) | 1992-06-01 | 1995-07-18 | Gilead Sciences, Inc. | Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages |
US5587308A (en) | 1992-06-02 | 1996-12-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services | Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter |
EP0577558A2 (de) | 1992-07-01 | 1994-01-05 | Ciba-Geigy Ag | Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte |
US5272250A (en) | 1992-07-10 | 1993-12-21 | Spielvogel Bernard F | Boronated phosphoramidate compounds |
WO1994002595A1 (en) | 1992-07-17 | 1994-02-03 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method and reagent for treatment of animal diseases |
US6346614B1 (en) | 1992-07-23 | 2002-02-12 | Hybridon, Inc. | Hybrid oligonucleotide phosphorothioates |
EP0673431A1 (en) | 1992-12-03 | 1995-09-27 | Genzyme Corporation | Gene therapy for cystic fibrosis |
US5478745A (en) | 1992-12-04 | 1995-12-26 | University Of Pittsburgh | Recombinant viral vector system |
US5574142A (en) | 1992-12-15 | 1996-11-12 | Microprobe Corporation | Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery |
JP3351476B2 (ja) | 1993-01-22 | 2002-11-25 | 三菱化学株式会社 | リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム |
US5476925A (en) | 1993-02-01 | 1995-12-19 | Northwestern University | Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups |
WO1994018987A1 (en) | 1993-02-19 | 1994-09-01 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | Drug composition containing nucleic acid copolymer |
US5395619A (en) | 1993-03-03 | 1995-03-07 | Liposome Technology, Inc. | Lipid-polymer conjugates and liposomes |
GB9304618D0 (en) | 1993-03-06 | 1993-04-21 | Ciba Geigy Ag | Chemical compounds |
ATE155467T1 (de) | 1993-03-30 | 1997-08-15 | Sanofi Sa | Acyclische nucleosid analoge und sie enthaltende oligonucleotidsequenzen |
AU6412794A (en) | 1993-03-31 | 1994-10-24 | Sterling Winthrop Inc. | Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages |
DE4311944A1 (de) | 1993-04-10 | 1994-10-13 | Degussa | Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen |
US6191105B1 (en) | 1993-05-10 | 2001-02-20 | Protein Delivery, Inc. | Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin |
US5955591A (en) | 1993-05-12 | 1999-09-21 | Imbach; Jean-Louis | Phosphotriester oligonucleotides, amidites and method of preparation |
US6015886A (en) | 1993-05-24 | 2000-01-18 | Chemgenes Corporation | Oligonucleotide phosphate esters |
US6294664B1 (en) | 1993-07-29 | 2001-09-25 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Synthesis of oligonucleotides |
US5502177A (en) | 1993-09-17 | 1996-03-26 | Gilead Sciences, Inc. | Pyrimidine derivatives for labeled binding partners |
EP0729474A4 (en) | 1993-11-16 | 1998-10-21 | Genta Inc | SYNTHETIC OLIGOMERS THAT HAVE CHIRALITY-PURE PHOSPHONATE INTERNUCLEOSIDYL BINDINGS MIXED WITH NON-PHOSPHONATE INTERNUKLEOSIDYL BINDINGS |
US5540935A (en) | 1993-12-06 | 1996-07-30 | Nof Corporation | Reactive vesicle and functional substance-fixed vesicle |
US5457187A (en) | 1993-12-08 | 1995-10-10 | Board Of Regents University Of Nebraska | Oligonucleotides containing 5-fluorouracil |
US5446137B1 (en) | 1993-12-09 | 1998-10-06 | Behringwerke Ag | Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides |
US5519134A (en) | 1994-01-11 | 1996-05-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Pyrrolidine-containing monomers and oligomers |
US5596091A (en) | 1994-03-18 | 1997-01-21 | The Regents Of The University Of California | Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides |
US5599922A (en) | 1994-03-18 | 1997-02-04 | Lynx Therapeutics, Inc. | Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties |
US5627053A (en) | 1994-03-29 | 1997-05-06 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid |
US5625050A (en) | 1994-03-31 | 1997-04-29 | Amgen Inc. | Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics |
US6054299A (en) | 1994-04-29 | 2000-04-25 | Conrad; Charles A. | Stem-loop cloning vector and method |
US5525711A (en) | 1994-05-18 | 1996-06-11 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes |
US5543152A (en) | 1994-06-20 | 1996-08-06 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Sphingosomes for enhanced drug delivery |
US5597696A (en) | 1994-07-18 | 1997-01-28 | Becton Dickinson And Company | Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates |
US5597909A (en) | 1994-08-25 | 1997-01-28 | Chiron Corporation | Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use |
US5580731A (en) | 1994-08-25 | 1996-12-03 | Chiron Corporation | N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith |
US5820873A (en) | 1994-09-30 | 1998-10-13 | The University Of British Columbia | Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof |
US6608035B1 (en) | 1994-10-25 | 2003-08-19 | Hybridon, Inc. | Method of down-regulating gene expression |
US5665557A (en) | 1994-11-14 | 1997-09-09 | Systemix, Inc. | Method of purifying a population of cells enriched for hematopoietic stem cells populations of cells obtained thereby and methods of use thereof |
JP3269301B2 (ja) | 1994-12-28 | 2002-03-25 | 豊田合成株式会社 | ガラスラン用ゴム配合物 |
EP0813539B1 (en) | 1995-03-06 | 2006-05-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Improved process for the synthesis of 2'-o-substituted pyrimidines and oligomeric compounds therefrom |
US6166197A (en) | 1995-03-06 | 2000-12-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions |
IL122290A0 (en) | 1995-06-07 | 1998-04-05 | Inex Pharmaceuticals Corp | Lipid-nucleic acid complex its preparation and use |
US5756122A (en) | 1995-06-07 | 1998-05-26 | Georgetown University | Liposomally encapsulated nucleic acids having high entrapment efficiencies, method of manufacturer and use thereof for transfection of targeted cells |
US5981501A (en) | 1995-06-07 | 1999-11-09 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers |
US7422902B1 (en) | 1995-06-07 | 2008-09-09 | The University Of British Columbia | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer |
DE69629702T2 (de) | 1995-08-01 | 2004-06-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad | Liposomale oligonukleotidzusammensetzungen |
US5858397A (en) | 1995-10-11 | 1999-01-12 | University Of British Columbia | Liposomal formulations of mitoxantrone |
WO1997014809A2 (en) | 1995-10-16 | 1997-04-24 | Dana-Farber Cancer Institute | Novel expression vectors and methods of use |
US6160109A (en) | 1995-10-20 | 2000-12-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers |
US5858401A (en) | 1996-01-22 | 1999-01-12 | Sidmak Laboratories, Inc. | Pharmaceutical composition for cyclosporines |
US5994316A (en) | 1996-02-21 | 1999-11-30 | The Immune Response Corporation | Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells |
US20040234999A1 (en) * | 1996-04-02 | 2004-11-25 | Farrar Gwenyth Jane | Genetic suppression and replacement |
US6444423B1 (en) | 1996-06-07 | 2002-09-03 | Molecular Dynamics, Inc. | Nucleosides comprising polydentate ligands |
US6639062B2 (en) | 1997-02-14 | 2003-10-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom |
US6172209B1 (en) | 1997-02-14 | 2001-01-09 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same |
US6576752B1 (en) | 1997-02-14 | 2003-06-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Aminooxy functionalized oligomers |
JP3756313B2 (ja) | 1997-03-07 | 2006-03-15 | 武 今西 | 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体 |
US6887906B1 (en) | 1997-07-01 | 2005-05-03 | Isispharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the delivery of oligonucleotides via the alimentary canal |
US6794499B2 (en) | 1997-09-12 | 2004-09-21 | Exiqon A/S | Oligonucleotide analogues |
US6528640B1 (en) | 1997-11-05 | 2003-03-04 | Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated | Synthetic ribonucleic acids with RNAse activity |
US6617438B1 (en) | 1997-11-05 | 2003-09-09 | Sirna Therapeutics, Inc. | Oligoribonucleotides with enzymatic activity |
US6506559B1 (en) | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
US6320017B1 (en) | 1997-12-23 | 2001-11-20 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Polyamide oligomers |
US7273933B1 (en) | 1998-02-26 | 2007-09-25 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for synthesis of oligonucleotides |
US7045610B2 (en) | 1998-04-03 | 2006-05-16 | Epoch Biosciences, Inc. | Modified oligonucleotides for mismatch discrimination |
CN1202246C (zh) | 1998-04-08 | 2005-05-18 | 联邦科学和工业研究组织 | 获得修饰表型的方法和措施 |
US6531590B1 (en) | 1998-04-24 | 2003-03-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Processes for the synthesis of oligonucleotide compounds |
AR020078A1 (es) | 1998-05-26 | 2002-04-10 | Syngenta Participations Ag | Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta |
US6867294B1 (en) | 1998-07-14 | 2005-03-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages |
CA2335393C (en) | 1998-07-20 | 2008-09-23 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes |
CA2345936A1 (en) | 1998-10-09 | 2000-04-20 | Ingene, Inc. | Production of ssdna in a cell |
AU6430599A (en) | 1998-10-09 | 2000-05-01 | Cytogenix, Inc. | Enzymatic synthesis of ssdna |
DE19956568A1 (de) | 1999-01-30 | 2000-08-17 | Roland Kreutzer | Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens |
US6465628B1 (en) | 1999-02-04 | 2002-10-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Process for the synthesis of oligomeric compounds |
WO2000050050A1 (en) | 1999-02-23 | 2000-08-31 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Multiparticulate formulation |
US7084125B2 (en) | 1999-03-18 | 2006-08-01 | Exiqon A/S | Xylo-LNA analogues |
NZ514348A (en) | 1999-05-04 | 2004-05-28 | Exiqon As | L-ribo-LNA analogues |
US6593466B1 (en) | 1999-07-07 | 2003-07-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Guanidinium functionalized nucleotides and precursors thereof |
US6147200A (en) | 1999-08-19 | 2000-11-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers |
DE10100586C1 (de) | 2001-01-09 | 2002-04-11 | Ribopharma Ag | Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens |
WO2001053307A1 (en) | 2000-01-21 | 2001-07-26 | Geron Corporation | 2'-arabino-fluorooligonucleotide n3'→p5'phosphoramidates: their synthesis and use |
IT1318539B1 (it) | 2000-05-26 | 2003-08-27 | Italfarmaco Spa | Composizioni farmaceutiche a rilascio prolungato per lasomministrazione parenterale di sostanze idrofile biologicamente |
DE60119562T2 (de) | 2000-10-04 | 2007-05-10 | Santaris Pharma A/S | Verbesserte synthese von purin-blockierten nukleinsäure-analoga |
US7063860B2 (en) | 2001-08-13 | 2006-06-20 | University Of Pittsburgh | Application of lipid vehicles and use for drug delivery |
WO2003035083A1 (de) | 2001-10-26 | 2003-05-01 | Ribopharma Ag | Medikament zur behandlung einer fibrotischen erkrankung durch rna interferenz |
US6878805B2 (en) | 2002-08-16 | 2005-04-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Peptide-conjugated oligomeric compounds |
EP2314691A3 (en) * | 2002-11-14 | 2012-01-18 | Dharmacon, Inc. | Fuctional and hyperfunctional siRNA |
EP2567693B1 (en) | 2003-07-16 | 2015-10-21 | Protiva Biotherapeutics Inc. | Lipid encapsulated interfering RNA |
DK1661905T3 (da) | 2003-08-28 | 2012-07-23 | Takeshi Imanishi | Hidtil ukendte syntetiske nukleinsyrer af N-O-krydsbindingstype |
JP2005112812A (ja) * | 2003-10-09 | 2005-04-28 | Zeria Pharmaceut Co Ltd | リン酸化部位特異的抗体及びそれを用いたスクリーニング方法 |
US7740861B2 (en) | 2004-06-16 | 2010-06-22 | University Of Massachusetts | Drug delivery product and methods |
HUE048419T2 (hu) * | 2004-12-22 | 2020-08-28 | Nitto Denko Corp | Gyógyszerhordozó és kit gyógyszerhordozó kit fibrózis gátlására |
DK1866414T3 (da) | 2005-03-31 | 2012-04-23 | Calando Pharmaceuticals Inc | Inhibitorer af ribonukleotidreduktase-underenhed 2 og anvendelser deraf. |
US8101741B2 (en) | 2005-11-02 | 2012-01-24 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Modified siRNA molecules and uses thereof |
CA2674210A1 (en) * | 2005-12-30 | 2007-07-12 | Intradigm Corporation | Sirna compositions promoting scar-free wound healing of skin and methods for wound treatment |
PL2314594T3 (pl) | 2006-01-27 | 2014-12-31 | Isis Pharmaceuticals Inc | Zmodyfikowane w pozycji 6 analogi bicykliczne kwasów nukleinowych |
US7846908B2 (en) * | 2006-03-16 | 2010-12-07 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | RNAi modulation of TGF-beta and therapeutic uses thereof |
WO2007133800A2 (en) | 2006-05-15 | 2007-11-22 | University Of Kentucky | Toll-like receptor (tlr) stimulation for ocular angiogenesis and macular degeneration |
US7524640B2 (en) * | 2006-08-06 | 2009-04-28 | Children's Medical Center Corporation | Inhibiting Smad2/3 signaling promotes neurite outgrowth in dorsal root ganglia |
MX2009003548A (es) | 2006-10-03 | 2009-04-15 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Formulaciones que contienen lipidos. |
US8735567B2 (en) * | 2007-11-06 | 2014-05-27 | Patrick Y. Lu | Multi-targeted RNAi therapeutics for scarless wound healing of skin |
US9006191B2 (en) | 2007-12-27 | 2015-04-14 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Silencing of polo-like kinase expression using interfering RNA |
WO2009127060A1 (en) | 2008-04-15 | 2009-10-22 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Novel lipid formulations for nucleic acid delivery |
AU2009307677C1 (en) * | 2008-10-20 | 2022-09-22 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin |
US20100113596A1 (en) * | 2008-11-05 | 2010-05-06 | Kun-Lin Yang | Method for inhibiting liver fibrosis via retinoic acid derivative |
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