JP6678895B2 - 水棲動物軟骨抽出物 - Google Patents
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Description
項1.
分子量180万以上のプロテオグリカンを含有する、魚類軟骨水抽出物。
項2.
分子量250万以上のプロテオグリカンを含有する、項1に記載の魚類軟骨水抽出物。
項3.
分子量500万以上のプロテオグリカンを含有する、項2に記載の魚類軟骨水抽出物。
項4.
分子量500万以上のプロテオグリカンが、乾燥質量換算で、9質量%以上含まれる、項3に記載の魚類軟骨水抽出物。
項5−1.
コラーゲンが、乾燥質量換算で、30質量%以上含まれる、項1〜4のいずれか1項に記載の魚類軟骨水抽出物。
項5−2
分子量250万以上のプロテオグリカンが含むウロン酸量が、抽出物に含まれるウロン酸全量の10%以上である、項1〜5−1のいずれか1項に記載の魚類軟骨水抽出物。
項5−3.
抽出物に含まれるウロン酸量が、乾燥質量換算で、抽出物全量に対して10質量%以上である、項1〜5−2のいずれかに記載の魚類軟骨水抽出物。
項6−1.
魚類が、サケ又はマスである、項1〜5のいずれかに記載の魚類軟骨水抽出物。
項6−2.
軟骨が、鼻軟骨である、項1〜6−1のいずれかに記載の魚類軟骨水抽出物。
項7−1.
項1〜6−2のいずれかに記載の魚類軟骨水抽出物を含む外用組成物又は経口組成物。
項7−2.
項1〜6−2のいずれかに記載の魚類軟骨水抽出物を含む飲食品組成物、口腔用組成物、又は化粧品組成物。
項8−1.
炎症改善用又は抗老化用である、項7−1又は7−2に記載の組成物。
項8−2.
炎症改善用又は抗老化用である、項1〜6−2のいずれかに記載の魚類軟骨水抽出物。
項9−1.
70℃〜100℃の水で抽出された、項1〜6−2のいずれかに記載の魚類軟骨水抽出物。
項9−2.
70℃〜100℃の水で3〜4時間抽出された、項9−1に記載の魚類軟骨水抽出物。
項10−1.
単離された、分子量500万以上のプロテオグリカン。
項10−2.
単離された、分子量500万以上の、魚類軟骨由来プロテオグリカン。
カラム: Sepharose CL-2B 充填カラム(Sepharose CL-2Bを担体としてφ1cm×50cmのカラムに充填したもの。Sepharose CL-2Bのデキストランの分画範囲は100〜20,000kDaであり、GE Healthcare社等から入手できる。Sepharose CL-2Bは、2%架橋アガロース、粒子径60〜200μm(レーザー回折散乱法による)、CAS登録番号65099-79-8である。)
バッファー: 0.1Mリン酸緩衝液(pH 7.1, 0.2M NaCl含有)
アプライサンプル量:魚類軟骨水抽出物4mg(乾燥質量換算)(1mLバッファーに溶解させて使用)
流速: 0.15mL/min
分画フラクション量: 1mL/tube
分子量検量線:次の各種デキストラン分子量マーカーについて上記と同様の条件でゲル濾過クロマトグラフィーを行い、糖検出のための周知の方法であるフェノール・硫酸法により各フラクションの吸光度(デキストラン量を反映する)を測定し、各マーカーが溶出されたフラクションを求め、当該条件のゲル濾過クロマトグラフィーの各フラクションに含まれる成分の分子量を反映する検量線を作成する。“各マーカーが溶出されたフラクション”とは、各マーカーが最も多く溶出されたフラクションをいう。換言すれば、各デキストラン分子量マーカーをゲル濾過した際の、デキストラン量を反映するクロマトグラムにおけるピークトップに相当するフラクションである。
Dextran from Leuconostoc mesenteroides(mol wt 5,000,000−40,000,000)(SIGMA)・・・カラムのvoid volume測定用、20000kDa
Dextran Standard 1,400,000(SIGMA)・・・1400kDa
Dextran Standard 670,000(SIGMA) ・・・670kDa
Dextran Standard 410,000(SIGMA) ・・・410kDa
Dextran Standard 270,000(SIGMA) ・・・270kDa
〔1〕105×15mmの試験管に試料水溶液を500μL加える。
〔2〕フェノール試薬(5 v/v%フェノール水溶液)を500μL加え、撹拌する。
〔3〕濃硫酸を2.5mL加え、すぐに10秒間激しく撹拌する。
〔4〕室温に20分以上放置する。
〔5〕分光光度計で490nmの吸収を測定する。
A.凍結した水棲動物組織(魚類組織)を破砕し、これに水を加え、温度0〜20℃、pH4.8〜7で処理する工程
B.Aの固液混合物を遠心分離し、最上部の脂質層と中間層の水層を取り除き、沈殿物を回収する工程
C.沈殿物を乾燥し、微粉末化する工程
D.得られた乾燥微粉末に、溶媒としてヘキサン、アセトン又はエタノールを加え、残存脂質を抽出除去する工程
E.溶媒を除去する工程
サケ鼻軟骨からのプロテオグリカンの抽出検討
<抽出に用いた試料>
以下の3種類((1)〜(3))のサケ鼻軟骨由来試料を、プロテオグリカン抽出検討に用いた。なお、サケ鼻軟骨としては、凍結サケ頭部を解凍後、直ちに鼻軟骨を取り出し、さらに流水に6時間さらして洗浄及び脱脂した後、さらにピンセットで肉片等を取り除き、手で水洗いして得られたサケ鼻軟骨を用いた。
サケ鼻軟骨をフリーザーに保存して凍結させ、これを凍結サケ鼻軟骨ブロックとして用いた。なお、用いたサケ頭部の大きさにもよるが、凍結サケ鼻軟骨ブロックは、およそ、大きさ 2.5×1.5 〜 4.5×2 cm、重さ 1.71 〜 6.91 gの塊(7個あたりの平均の重さは3.701g)であった。凍結サケ鼻軟骨ブロックの写真を図1aに示す。
(1)の凍結サケ鼻軟骨ブロックをブレンダーに入れて10秒間破砕し、凍結サケ鼻軟骨小片を得た。凍結サケ鼻軟骨小片の写真を図1bに示す。なお、ランダムに20小片を採取して、各小片の大きさ及び質量を検討したところ、大きさはおよそ0.2 〜 0.7 cm、質量は約0.0890 〜 0.0116 g(20個の平均の重さは0.033 g)であった。また、凍結サケ鼻軟骨ブロック100gから95.6gの凍結サケ鼻軟骨小片が得られた。
(1)の凍結サケ鼻軟骨を用いて、特許文献1(特開2009−173702号公報)の実施例1に記載の方法により、脱脂サケ鼻軟骨粉末を得た。凍結サケ鼻軟骨ブロック100gから、脱脂サケ鼻軟骨粉末は5.83g得られた。脱脂サケ鼻軟骨粉末の写真を図1cに示す。
『凍結サケ鼻軟骨100gを破砕し、これに15℃の水道水を同容量加え、緩やかに撹件して十分混ぜ合わせ、5℃前後に維持された混合物をただちに遠心分離器9,000rpm、30分、4℃で遠心分離し、脂質とプロテオグリカン他組成物を分けた。遠心分離層は3層に分かれ、最上部の脂質層と中間層の水層を取り除き、沈殿物を回収した。沈殿物は凍結乾燥後、遠心式粉砕機で粉砕し、水脱脂微粉末を得た。この段階で、一部をエーテル抽出にて脂質を測定した結果、脂質は8.8%残存しており、脱脂前の脂質を100%とした場合の除去率は75.0%となり、弱い異臭を含んでいた。ついで、水脱脂微粉末に10倍容量のエタノールを加えて、異臭を含む脂質を溶解抽出した。本操作を2回繰り返してエタノール溶液を濾過除去し、溶媒を蒸発させると微黄褐色無臭のプロテオグリカン組成物粉末を得た。サケ鼻軟骨に対する収率58.7%(ドライベース)、プロテオグリカン含有率77.7%であった。プロテオグリカン組成物粉末の異臭は全く消失した。』
特許文献1実施例1の「凍結サケ鼻軟骨」は、上記「凍結サケ鼻軟骨ブロック」に相当する。また、「ドライベース」とは、乾燥質量換算のことである。
上述のようにして得られた(2)凍結サケ鼻軟骨小片に水を加え、静置又は100℃で加熱することによりプロテオグリカンの抽出を試みた。具体的には、次のようにして検討を行った。凍結サケ鼻軟骨小片約12gに対し60mLの蒸留水を加えたサンプルを4サンプル調製し、これらを100℃で1時間、2時間、3時間、4時間それぞれ加熱し、それらを遠心分離機により5,000rpm、20分、4℃で遠心分離し、不溶物(残渣)を取り除き上清を回収した。回収上清液量を測定した後、回収上清液中のウロン酸量をカルバゾール硫酸法により測定した(ウロン酸量は、プロテオグリカン量を反映する。図表中では、ウロン酸量を、ウロン酸の1種であるグルクロン酸の略記「GlcA」を用いて表すことがある。)。また、回収上清液中のタンパク質量をブラッドフォード法にて測定した。結果を表1に示す。また、表1をグラフにした図を図2に示す。
(1)凍結サケ鼻軟骨ブロック及び(3)脱脂サケ鼻軟骨粉末についても、上記(2)凍結サケ鼻軟骨小片の場合と同様にして(但し、加熱時間及び加熱温度は変化させた)プロテオグリカンを抽出し、その抽出量を比較した。結果を表2に示す。なお、表2には、抽出されたウロン酸量及びタンパク質量を、凍結サケ鼻軟骨ブロック100g当たりの量に換算して示した。タンパク質量はブラッドフォード法にて測定した値である。また、表2をグラフにした図を図3に示す。図3に示される各試料の記載(1〜9)は、表2の「サンプルNo.」欄の1〜9の記載と対応する。
上記脱脂サケ鼻軟骨粉末20gに1000mLの常温の精製水(pH6.5)を加え、30分間撹拌した後、遠心分離(8000rpm,30分,4℃)を行い、上清を回収し、当該上清を凍結乾燥して魚類軟骨水抽出物を得た。当該魚類軟骨水抽出物を以下サンプルNo.10とよぶことがある。
カラム: Sepharose CL-2B 充填カラム(Sepharose CL-2Bを担体としてφ1cm×50cmのカラムに充填したもの。Sepharose CL-2Bのデキストランの分画範囲は100〜20,000kDaであり、GE Healthcare社等から入手できる。Sepharose CL-2Bは、2%架橋アガロース、粒子径60〜200μm(レーザー回折散乱法による)、CAS登録番号65099-79-8である。)
バッファー: 0.1Mリン酸緩衝液(pH 7.1, 0.2M NaCl含有)
アプライサンプル量:サンプルNo.10を4mg(1mLバッファーに溶解させて使用)
流速: 0.15mL/min
分画フラクション量: 1mL/tube
分子量検量線:次の各種デキストラン分子量マーカーについて上記と同様の条件(但しサンプル量は1mg/1mLバッファー)でゲル濾過クロマトグラフィーを行い、フェノール・硫酸法により各フラクションの吸光度(デキストラン量を反映する)を測定し、検量線を作製した。
Dextran from Leuconostoc mesenteroides(mol wt 5,000,000−40,000,000)(SIGMA)・・・カラムのvoid volume測定用、20000kDa
Dextran Standard 1,400,000(SIGMA)・・・1400kDa
Dextran Standard 670,000(SIGMA) ・・・670kDa
Dextran Standard 410,000(SIGMA) ・・・410kDa
Dextran Standard 270,000(SIGMA) ・・・270kDa
デキストラン量を反映するクロマトグラムを得るための吸光度測定は、Hodge, J. E. and Hofreiter, B. T., Method in Carbohydrate Chemistry, 1, 338 (1962)に記載の方法(フェノール・硫酸法)に従った。具体的には、次のようにして行った。
〔1〕105×15mmの試験管に試料水溶液を500μL加える。
〔2〕フェノール試薬(5 v/v%フェノール水溶液)を500μL加え、撹拌する。
〔3〕濃硫酸を2.5mL加え、すぐに10秒間激しく撹拌する。
〔4〕室温に20分以上放置する。
〔5〕分光光度計で490nmの吸収を測定する。』
なお、得られた検量線は(y = −4.1355Ln(x)+59.47 ; R2=0.9869)であり、R2値から考えて分子量とフラクションNo.(即ち溶出液量)はよく相関していることがわかった。
カラム:DEAE充填カラム(DEAE(GEヘルスケア社)を担体として、φ5.0cm×20cmのカラムに充填したもの)
バッファー: 7M尿素-トリス-塩酸緩衝液 (pH 7.2)
グラジェント: NaCl 濃度 0 → 0.75M
アプライサンプル量: サンプルNo.10(魚類軟骨水抽出物の凍結乾燥物)200mg (50mLバッファーに溶解させてアプライ)
流速: 2.0mL/min
フラクション量: 16mL/tube 』
カラム: Sepharose CL-2B充填カラム(Sepharose CL-2B(GEヘルスケア社)を担体として、φ5.0cm×50cmのカラムに充填したもの)
バッファー: 0.1M リン酸緩衝液 (pH7.1, 0.2M NaCl含有)
アプライサンプル量: 150mg
流速: 2.0mL/min
フラクション量:16mL/tube 』
Dextran from Leuconostoc mesenteroides (mol wt 5,000,000 - 40,000,000)(SIGMA)・・・20,000kDa
Dextran Standard 1,400,000(SIGMA)・・・1,400kDa
Dextran Standard 270,000(SIGMA)・・・270kDa
実際に哺乳動物に魚類軟骨水抽出物を摂取させ、その効果を検討した。
<使用実験動物>
ヘアレスマウス(Hr-/Kud ♂)(九動社)を実験に用いた。エストロゲン変動による皮膚状態への影響がないオス(6週齢)を予備飼育後、実験に供した。
マウスを3つの飼育ケージに表3のとおり割りふり、それぞれ異なる群(群1〜群3)とした(1群につき6匹)。また被検体は固体識別できるよう尾部に印を付けた。検討開始時まで予備飼育を続けた。試験時の平均体重は37gであった。なお、表3の群3の評価素材である「魚類軟骨水抽出物」としてはサンプルNo.10を用いた。
サンプルNo.10を0.35mg/mLになるように水に溶解して、投与サンプルを調製した。
ヘアレスマウスが8週齢に達した段階で、各投与サンプル0.5mLを1日1回、ゾンデによる強制経口投与により投与した(0.175mg/day/匹)。コントロールは、蒸留水を0.5mL投与した。この投与を6回/週(月〜土の6日間の各日に1回)の頻度で、試験が終了するまで続けた。
UVB照射は、経口投与開始3週間後より開始した。UVB照射用ケージにマウスを入れ、UVB照射装置内に入れて、1.0mW/ cm2の強度でUVBを6回/週(月〜土の6日間の各日に1回)照射した。照射1週目のみ60mJ/ cm2の照射量とし、2週目以降120mJ/ cm2の照射量とした。なお、UVBは、波長280-315nmの紫外線である。
マルチプローブ式皮膚計測器(MPA580:Courage-Khazaka社)のMaxameterにより、UVB照射4週間後および7週間後の紅斑量を測定し、抗炎症を評価した。各マウス背部5ヶ所を測定し、平均値を算出した。UVB照射による炎症は、紅斑を発生させる。よって、紅斑量が多いほど、炎症が激しいことを示す。
UVB照射4週間後及び7週間後の紅斑量測定結果を図7に示す。結果より、魚類軟骨水抽出物であるサンプルNo.10は、経口投与により紅斑を抑えることがわかった。従って、当該魚類軟骨水抽出物は、紫外線照射による炎症を抑えることがわかった。
マルチプローブ式皮膚計測器(MPA580:Courage-Khazaka社)のTewameterにより、UVB照射4週間後および7週間後の経表皮透過蒸散水分量(TEWL)を測定し、皮膚バリア機能を評価した。各マウス背部3ヶ所を測定し、平均値を算出した。なお、TEWL値が大きいほど皮膚バリア機能(皮膚の外から体内への異物の侵入を防ぐ機能及び体内の水分が外へ逃げていくのを防ぐ機能)が低下していることを示す。
UVB照射4週間後及び7週間後のTEWL測定結果を図8に示す。結果より、魚類軟骨水抽出物であるサンプルNo.10は、経口投与によりTEWL値を下げ、皮膚バリア機能を改善することがわかった。
サンプルNo.10、並びに、サンプルNo.10をさらに精製したPG−1抽出物及びPG−2抽出物を用いて、皮膚抗老化能を検討した。
ヘアレスマウス(Hr-/Kud ♂)(九動社)を実験に用いた。エストロゲン変動による皮膚状態への影響がないオス(6週齢)を予備飼育後、実験に供した。
マウスを5つの飼育ケージに表4のとおり割りふり、それぞれ異なる群(群1〜群5)とした(1群6匹)。また被検体は固体識別できるよう尾部に印を付けた。検討開始まで予備飼育を続けた。
各評価素材を、0.2mg/mLになるように水に溶解して、投与サンプルを調製した。
ヘアレスマウスが8週齢に達した段階で、各投与サンプル0.5mLを1日1回、ゾンデによる強制経口投与により投与した(0.1mg/day)。コントロールは、蒸留水を0.5mL投与した。この投与を6回/週(月〜土の6日間の各日に1回)の頻度で、試験が終了するまで続けた。
UVB照射は、経口投与開始3週間後より開始した。UVB照射用ケージにマウスを入れ、UVB照射装置内に入れて、1.0mW/ cm2の強度でUVBを6回/週(月〜土の6日間の各日に1回)照射した。照射1週目のみ60mJ/ cm2の照射量とし、2週目以降120mJ/ cm2の照射量とした。なお、UVBは、波長280-315nmの紫外線である。
マルチプローブ式皮膚計測器(MPA580:Courage-Khazaka社)のMaxameterにより、UVB照射4週間後および7週間後の紅斑量を測定し、抗炎症を評価した。各マウス背部5ヶ所を測定し、平均値を算出した。UVB照射による炎症は、紅斑を発生させるため、紅斑量が高いほど、炎症が激しいことを示す。
UVB照射4週間後及び7週間後の紅斑量測定結果を図9に示す。結果より、用いた魚類軟骨水抽出物は、経口投与により紅斑を抑えており、従って紫外線照射による炎症を抑えることがわかった。また魚類軟骨水抽出物に含まれるプロテオグリカンのうち、分子量500万以上の高分子量のプロテオグリカン(PG−1抽出物)が特に高い効果を発揮していることがわかった。
マルチプローブ式皮膚計測器(MPA580:Courage-Khazaka社)のTewameterにより、UVB照射4週間後および7週間後の経表皮透過蒸散水分量(TEWL)を測定し、皮膚バリア機能を評価した。各マウス背部3ヶ所を測定し、平均値を算出した。なお、TEWL値が大きいほど皮膚バリア機能(皮膚の外から体内への異物の侵入を防ぐ機能及び体内の水分が外へ逃げていくのを防ぐ機能)が低下していることを示す。
UVB照射4週間後及び7週間後のTEWL測定結果を図10に示す。結果より、用いた魚類軟骨水抽出物は、経口投与によりTEWL値を下げ、皮膚バリア機能を改善することがわかった。
マルチプローブ式皮膚計測器(MPA580:Courage-Khazaka社)のCorneometer により、UVB照射4週間後および7週間後の角層水分量を測定し、皮膚保水性を評価した。各マウス背部10ヶ所を測定し、平均値を算出した。
UVB照射4週間後及び7週間後のTEWL測定結果を図11に示す。結果より、用いた魚類軟骨水抽出物は、経口投与により角層水分量を上げ、皮膚保水性を改善することがわかった。また魚類軟骨水抽出物に含まれるプロテオグリカンのうち、分子量500万以上の分子量を有するプロテオグリカン(PG−1抽出物)が特に高い効果を発揮していることがわかった。
***;p<0.001
** ;p<0.01
* ;p<0.05
+ ;p<0.1
被験者(健常な25歳〜55歳の女性14名)の前腕及び上腕内側皮膚に、下記に示す方法により、ラウリル硫酸ナトリウム(SLS)を含浸させたチャンバーで刺激し、刺激後の紅斑消失速度(前腕部で測定)および経表皮透過蒸散水分量(TEWL)(上腕部で測定)の変化を比較した(試験方法の詳細は下記)。
・SLSパッチ貼付による刺激方法及び測定方法
被験者の腕内側を洗浄後、22℃ 60%設定の恒温恒湿室に15分以上入室した後に0.5% SLS(Sodium dodecyl sulfate : 和光純薬工業株式会社 Lot.STQ8638)を30μL含んだろ紙付きのチャンバー(200 LARGE FINN CHAMBERS ON SCANPOR, NORGESPLASTER Ltd.)を貼り付け、4時間閉塞刺激した。その後チャンバーを剥がし、1時間後、1日後、2日後に、色彩色差計CR-400 (KONICA MINOLTA) にて刺激部位の紅斑の色(a*値)および、Tewameter TM-300 (Courage+Khazaka) にて刺激部のTEWL値を測定した。
上記脱脂サケ鼻軟骨小片500gに、質量比で2.5倍量の精製水を加え、100℃、90℃、70℃、又は50℃で加熱した。100℃と90℃については3時間、70℃と50℃については6時間加熱した。100℃と90℃では軟骨は完全に溶解したが、70℃と50℃は軟骨が溶解しきれず一部残存した状態で抽出を終了した。そして、遠心分離機により8,000rpm、30分、4℃で遠心分離し、不溶物(残渣)を取り除いて上清を回収し、凍結乾燥して乾燥凍結サンプル(FDサンプル)を得た。以下、これらのサンプルを、それぞれ、100℃抽出FDサンプル、90℃抽出FDサンプル、70℃抽出FDサンプル、及び50℃抽出FDサンプルともいう。また、100℃で3時間加熱した後、さらに3時間加熱してから、同様に遠心分離及び凍結乾燥をして、乾燥凍結サンプルを得た。当該サンプルを以下100℃(3h)抽出FDサンプルともいう。
Claims (2)
- サケ鼻軟骨水抽出物から精製された分子量500万以上のプロテオグリカンを含有する、紫外線照射により減少した角質水分量改善効果を奏する、紫外線照射により減少した角質水分量を改善するための飲食品組成物。
- 前記紫外線がUVBである、請求項1に記載の組成物。
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