JP6535710B2

JP6535710B2 - α−Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎの発現誘導剤、α−Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎの発現誘導剤を含む白内障予防・進行抑制剤、およびα−Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎの発現誘導剤の製造方法

Info

Publication number: JP6535710B2
Application number: JP2017154174A
Authority: JP
Inventors: 晴隆坂野; 侑子楠見; 安則金保; 敦士高田; 克昭團
Original assignee: Orbit Co Ltd
Current assignee: Orbit Co Ltd
Priority date: 2017-08-09
Filing date: 2017-08-09
Publication date: 2019-06-26
Anticipated expiration: 2037-08-09
Also published as: CN110167572B; WO2019030954A1; JP2019031467A; CN110167572A

Description

本発明は、ブラックラズベリー抽出物、ブラックラズベリー抽出物を含む白内障予防・進行抑制剤および飲食物、ブラックラズベリー抽出物の製造方法およびブラックラズベリー抽出物を用いた白内障の予防方法またはその進行抑制方法に関するものである。

ほとんどの生物にとって酸素は不可欠であるが、体内に取り込まれた酸素の数％は活性酸素となり、細菌感染などの防御に使用される。しかし、余剰の活性酸素は、恒常性を維持するために生体内の抗酸化酵素や食品中の外来の抗酸化物質により消去されることが必要である。

また紫外線、喫煙、排気ガス、大気汚染、ストレスなどによって過剰の活性酸素が産生されると生体組織へ酸化的障害を与える（例えば、非特許文献１参照）。その結果、生活習慣病、加齢性疾患をはじめ、がん、痴呆症などを引き起こし、９０％以上の疾病は過剰に産生される活性酸素と因果関係があると言われている（例えば、非特許文献２参照）。

そこで、体内のSuperoxide dismutase (SOD)の活性化とともに食品中の抗酸化物質が注目され、アメリカ農務省（USDA）で開発された抗酸化力の測定方法（ＯＲＡＣ；Oxygen Radical Absorbance Capacity）が確立され、それが普及している（例えば、非特許文献３参照）。また、ＯＲＡＣ値の高い食品、即ち抗酸化力の高い食品ベスト１００の中に１２品目のベリー系食品が存在している（例えば、非特許文献４参照）。

また、加齢性疾患の一例として、白内障が挙げられる。白内障は水晶体に混濁が生じて発症するが、なぜ水晶体の透明性が失われ、混濁に至るのかは未だ明らかになっていない。水晶体の透明性の維持には、水晶体構成蛋白質の秩序正しい構造が関与している。その構成タンパク質であるCrystallinが凝集すると、水晶体のレンズ機能を低下させる濁りとなって現れ、視界や視力に影響を及ぼす（例えば、非特許文献５参照）。また、Crystallinのうち、α-CrystallinはCrystallinの凝集結合を抑制する機能を有することが判明している。

眼の水晶体タンパク質は生涯入れ替わらないと言われ、不溶化によって濁らせないようにα-Crystallinが新たに遺伝子発現して供給されることは水晶体にとって有用なことである。

Oberdanner, C. ROS and Antioxidant Systems in Apoptosis. VDM Verlag, 2008. ISBN 978-3836482110 Slavin JL et al. Health benefits of fruits and vegetables. Adv Nutr. 2012. 1; 3(4):506-516 Cao G et al. Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants. Free Radical Biol. Med. 1993. 14: 303-311 「ORAC値の高い（抗酸化作用の高い）食品トップ１００リスト」［online］(平成２９年６月３０日検索) http://www.anteaoxidant.com/orac_top100.html Alan R. Hipkiss, Accumulation of altered proteins and ageing: Causes and effects Experimental Gerontology 41 (2006) 464-473

本発明の目的は、白内障を予防又はその進行を抑制する作用を有するベリー系の抽出物、これを含む白内障予防・進行抑制剤および飲食物、およびベリー系の抽出物の製造方法を提供することである。また、本発明の目的は、ベリー系の抽出物を用いた白内障の予防方法またはその進行抑制方法を提供することである。

本発明者らは、抗酸化作用を有する食品として、ベリー系食品に着目し、ベリー系食品と加齢性疾患である白内障の予防又はその進行を抑制する作用との相関性について検討し、その結果、ブラックラズベリーの抽出物が上記目的を達成することを発見し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明によれば、
（１） α-Crystallinの発現を誘導するブラックラズベリー抽出物、
（２）（１）に記載のブラックラズベリー抽出物を含む白内障予防・進行抑制剤、
（３）（１）に記載のブラックラズベリー抽出物を含む飲食物、
（４）（１）に記載のブラックラズベリー抽出物の製造方法であって、ブラックラズベリーの果実を冷凍する冷凍工程と、前記ブラックラズベリーの果実を解凍する解凍工程と、前記解凍工程にて解凍した前記ブラックラズベリーの果実に溶媒を加えて攪拌する撹拌工程と、前記攪拌工程により攪拌した前記ブラックラズベリーの果実および溶媒を静置し抽出を行う抽出工程とを含むブラックラズベリー抽出物の製造方法、
（５）（１）に記載のブラックラズベリー抽出物を用いた白内障の予防方法またはその進行抑制方法
が提供される。

本発明によれば、白内障を予防又はその進行を抑制する作用を有するベリー系の抽出物、これを含む白内障予防・進行抑制剤および飲食物、およびベリー系の抽出物の製造方法を提供することができる。また、本発明によれば、ベリー系の抽出物を用いた白内障の予防方法またはその進行抑制方法を提供することができる。

ベリー系検体およびBlabinaのα-Crystallin発現誘導を表すグラフである。

以下、本発明のブラックラズベリー抽出物について説明する。本発明のブラックラズベリー抽出物は、白内障を予防する作用又はその進行を抑制する作用を有する。

ブラックラズベリー抽出物の原料となるブラックラズベリーはバラ科キイチゴ属に属する。また、本発明のブラックラズベリー抽出物は、主にブラックラズベリーの果実からの抽出物が好適に用いられる。
ブラックラズベリー抽出物をブラックラズベリーの果実から抽出する方法は、特に限定されないが、溶媒抽出、超臨界抽出等を用いることができる。

溶媒抽出を行う場合に用いる抽出溶媒としては、特に限定されず、水、有機溶媒およびこれらの混合溶媒を用いることができる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等のアルコール類；エチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類；酢酸エチル；アセトン等を用いることができる。これらの有機溶媒は一種類を単独で用いてもよいし、二種類以上を組み合わせて用いてもよい。また、水等の水系溶媒と有機溶媒とを混合して用いてもよい。
これらの中でも、エタノール、エタノールと水とを混合したエタノール水溶液が好ましく、エタノール水溶液中のエタノールの濃度は、好ましくは１〜８０ｖ／ｖ％（ＥｔＯＨ）、より好ましくは１０〜６０ｖ／ｖ％（ＥｔＯＨ）、さらに好ましくは２０〜４０ｖ／ｖ％（ＥｔＯＨ）である。
なお、超臨界抽出を行う場合には、超臨界状態とした二酸化炭素を用いることが好ましい。

また、溶媒抽出を行う場合の抽出方法としては、撹拌抽出、浸漬抽出、振とう抽出、還流抽出、超音波抽出等を用いることができる。これらのなかでも特に、攪拌抽出が好ましい。攪拌抽出の方法は、特に限定されないが、撹拌子を用いた攪拌、ブレンダーを用いた撹拌等を行うことができる。

また、攪拌抽出を行う際は、好ましくは５００〜２００００ｒｐｍ、より好ましくは１０００〜１００００ｒｐｍ、さらに好ましくは６０００〜１００００ｒｐｍの撹拌速度にて攪拌しながら、好ましくは数分〜６０分間、より好ましくは３０分〜６０分間抽出を行う。なお、攪拌後、静置し、静置抽出を行うことが好ましい。より具体的には、ホモジナイザーを用い、６０００〜１００００ｒｐｍで３０分〜６０分間ホモジナイズを行い、その後２４時間静置し抽出を行うことが好ましい。なお、静置し、抽出を行うことにより、固液分離を行うことができる。

また、溶媒抽出を行う場合の温度は、室温であってもよいし、加熱条件下であってもよい。また、溶媒抽出を行う場合の圧力は常圧であってもよいし、加圧下であってもよい。
また、溶媒抽出によって得られた抽出液は、必要に応じて濾過等の処理を行ってもよい。

また、溶媒抽出によって得られた抽出液を乾燥させて粉末としてもよい。乾燥方法としては、公知の方法を用いることができるが、噴霧乾燥、真空乾燥、凍結乾燥等の手法を用いることができる。
なお、ブラックラズベリー抽出物としては、液体や粉末とされた市販品または既製品を用いてもよい。

本発明のブラックラズベリー抽出物は、食品や飲料等に配合することができる。食品としては、パン類、麺類、菓子類、食肉加工品、魚介加工品、冷凍食品、ゼリー類、アイスクリーム類、乳製品、各種調味料等が挙げられる。また、一般食品の他、特定保健用食品、医薬部外品、健康食品、サプリメントにも配合させることができる。飲料としては、清涼飲料水、乳飲料、酒類、茶、紅茶飲料、コーヒー、果汁飲料、炭酸飲料、ミネラルウォーター類、果実・野菜飲料等が挙げられる。
また、本発明のブラックラズベリー抽出物を配合させた食品や飲料を、錠剤、カプセル剤、シロップ等の経口投与製剤と同様の形態としてもよい。

本発明のブラックラズベリー抽出物を配合させた食品や飲料を製造する際に、本発明の効果を妨げない範囲で必要に応じて、甘味料、着色料、保存料、増粘剤、安定化剤、ゲル化剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、乳化剤、膨張剤、酸味料、光沢剤、香料等の添加剤、溶剤、油を添加してもよい。これらの添加剤は一種類を単独で用いてもよいし、二種類以上を組み合わせて用いてもよい。

上記食品や飲料中に配合されるブラックラズベリー抽出物の割合は、使用目的に応じて適宜調整することができるが、上記食品や飲料、サプリメント中に配合されるブラックラズベリー抽出物の割合は、好ましくは０．０００１〜８０重量％、より好ましくは０．００３〜５０重量％、さらに好ましくは０．００５〜３０重量％である。
本発明のブラックラズベリー抽出物は、白内障の予防・進行抑制に有用である。

以下に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本実施例における部および％は、特記しない限り重量基準である。実施例及び比較例においては、ＯＲＡＣ値による抗酸化作用の評価および水晶体細胞におけるα-Crystallinの発現誘導の評価を行った。

試料について
（試料の準備）
試料としては、ベリー系試料３種（ブラックラズベリー（バラ科キイチゴ属）（以下、「ＢＲ」ということがある。）、ブルーベリー（ツツジ科スノキ属）（以下、「ＢＢ」ということがある。）およびラズベリー（バラ科キイチゴ属）（以下、「ＲＢ」ということがある。））の抽出物、およびブラックラズベリーの抽出物を配合した粉末製剤であるBlabina（登録商標）を用いた。

（抽出液の調製）
ブラックラズベリー、ブルーベリーおよびラズベリーの抽出液は、以下の手法により得た。
まず、ブラックラズベリー、ブルーベリーおよびラズベリーの果実をそれぞれ冷凍状態にて保存した。次に、それぞれの果実を解凍してカットした。ブラックラズベリー、ブルーベリーおよびラズベリーをそれぞれ秤量（約１００ｇ）し、５倍量の３０ｖ／ｖ％（ＥｔＯＨ）エタノール水溶液（およそ５００ｍＬ）を加え、ブレンダーを用いて８０００ｒｐｍ、３０分にて撹拌抽出を行った。さらに、室温にて２４時間静置することにより、静置抽出を行い、１５０メッシュで濾過して上記ブラックラズベリー、ブルーベリーおよびラズベリーのエタノール抽出液をそれぞれ得た。後述するＯＲＡＣの測定はエタノール溶解状態で行うため、エタノール抽出液を用いて測定を行った。
なお、Blabinaについては、３０ｖ／ｖ％（ＥｔＯＨ）にBlabinaを９ｍｇ／ｍLとなるように溶解させた。

（抽出物の調製）
上記抽出液の調製にて得られたブラックラズベリー、ブルーベリー、ラズベリーのエタノール抽出液とBlabinaのエタノール溶液から、それぞれエバポレーターを用いてエタノールを蒸発除去し、抽出物を得た。なお、ブラックラズベリー、ブルーベリーおよびラズベリーのエタノール抽出液は、９ｍｇ／ｍＬの抽出物（エキス）を含んでいた。

測定及び評価
（ＯＲＡＣ値による抗酸化作用の評価）
上記にて得られたベリー系検体３種（ブラックラズベリー、ブルーベリーおよびラズベリーのエタノール抽出液）のＯＲＡＣ値を測定した。結果を表１に示す。なお、Blabinaについては、ＯＲＡＣ値の測定を行わなかった。

一般的な抗酸化食品と比較して、ベリー系検体３種のＯＲＡＣ値はいずれも高い値を示した（一般的な抗酸化食品のＯＲＡＣ値については、上記非特許文献４参照）。ベリー系検体３種の中ではブルーベリーが最も高い値を示したが、これはエタノール抽出液を用いて測定した結果であるため、水溶性成分について言及することはできない。

また、０．１％以上のエタノールは細胞へダメージを与えるため、細胞を用いた測定および評価を行う場合には、３０ｖｏｌ％エタノール水溶液を用いたエタノール抽出液を用いることは適切ではない。そのため、以下の水晶体細胞におけるα-Crystallinの発現誘導の評価においてそれぞれエタノール抽出液から、エバポレーターによってエタノール成分を蒸発除去した検体を用いた（上記「抽出物の調製」参照）。

（水晶体細胞におけるα-Crystallinの発現誘導）
実験に用いる細胞としては、水晶体細胞（B-3, eye I lens, transformed with an adenovirus 12-SV40 virus hybrid (Ad12-SV40), human ; ATCC Number; CRL-11421）を用い、１０%ＦＣＳ添加Ｄ−ＭＥＭ培地を使用し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件にてインキュベーターにて培養した。実験の直前に０．２５％Trypsin/EDTA溶液にて細胞を回収し、細胞数をトリパンブルー染色処理後、Countess（Invitrogen）にて算出した。その後、２４ウェルプレートまたは９６ウェルプレートに播種し、２４時間、前培養したのち実験に用いた。

上記抽出物の調製において得られた３種のベリー系（ブラックラズベリー、ブルーベリーおよびラズベリー）抽出物、Blabinaのエタノール除去抽出物を、それぞれ超純水に溶解させて約１１．５ｍｇ／ｍＬとし、検体を得た。次にそれぞれの検体を段階希釈（１０００００倍希釈から１０倍希釈）し、α-Crystallin-mRNAの発現を定量ＰＣＲで解析した。

定量ＰＣＲ法の具体的な手順としては以下のように行った。検体を添加した水晶体細胞からTrizol試薬(ambion)を用いてTotal RNAを抽出した。抽出したRNAからPrimeScript RT Master Mix (Takara)の方法に準じ、cDNAに逆転写し、SYBR Premix EX Taq II (Takara)により増幅した。なお、PCR反応液としては、５０μＬ（２５μＬ SYBR Green Mix (2x), １μＬ cDNA, ２μＬ primer pair mix (５ｐｍｏｌ／μＬ each primer), ２２μＬＨ_２Ｏ）のＰＣＲ反応液を用い、反応は９５℃にて３０秒を１サイクル、さらに９５℃にて５秒および６０℃にて３０秒のサイクルを５０サイクルの条件にて行った。比較Ct法（ΔΔCt法）より相対定量を行った。RT-PCRに用いた各種ターゲット及びハウスキーピング遺伝子（GAPDH）のPrimerは表２に示した。

段階希釈した検体をそれぞれ水晶体細胞に添加後、１、４、８、１２時間でそれぞれTotal RNAを回収した。ＢＢ、ＲＢに比べてBlabina、ＢＲ共に１０００００倍希釈においても添加１時間後からα-Crystallinの発現誘導を示し、１２時間後まで高値を維持した（図１参照）。

水晶体を長期に保持するためには、様々な要因があり、そのメカニズムは未だ解明されていないが、Crystallinは水晶体の構成成分であり、α-Crystallinは他のβ、γ-Crystallinの会合を防ぐシャペロンとしての効果が明らかにされている（たとえば、Andley UP. Crystallins in the eye: Function and pathology. Prog Retin Eye Res. 2007 Jan; 26(1): 78-98.参照）。Blabina、ＢＲにはα-Crystallinの発現を誘導する能力が他のベリー系抽出物より高い傾向が示された。また、白内障を予防又はその進行を抑制するためには、水晶体を長期に保持することが必要であり、上記結果は、白内障を予防又はその進行を抑制する作用が示唆されるものである。

Claims

ブラックラズベリー抽出物を有効成分とするα-Crystallinの発現誘導剤。
請求項１に記載のα-Crystallinの発現誘導剤を含む白内障予防・進行抑制剤。
請求項１に記載のα-Crystallinの発現誘導剤の製造方法であって、
ブラックラズベリーの果実を冷凍する冷凍工程と、
前記ブラックラズベリーの果実を解凍する解凍工程と、
前記解凍工程にて解凍した前記ブラックラズベリーの果実に溶媒を加えて撹拌する撹拌工程と、
前記撹拌工程により撹拌した前記ブラックラズベリーの果実および溶媒を静置し抽出を行う抽出工程と
を含むα-Crystallinの発現誘導剤の製造方法。