JP6524543B2

JP6524543B2 - 細胞培養用足場の製造方法

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Publication number: JP6524543B2
Application number: JP2017035574A
Authority: JP
Inventors: 池田　浩二; 浩二池田; 太一中村
Original assignee: Panasonic Intellectual Property Management Co Ltd
Current assignee: Panasonic Intellectual Property Management Co Ltd
Priority date: 2017-02-27
Filing date: 2017-02-27
Publication date: 2019-06-05
Anticipated expiration: 2037-02-27
Also published as: JP2018139527A

Description

本発明は、細胞培養用足場（以下、便宜的に培地と称する。）の製造方法に関し、特に、一方向に配列した繊維を備える培地の生産性の向上に関する。

近年、生物組織や微生物を培養するための培地として、繊維基材が注目されている（特許文献１参照）。繊維基材は、例えば、織物、編物あるいは不織布であり、三次元の構造を備える。そのため、in vitroで生理的環境に近い状態で、生物組織や微生物を培養することができる。

特表２０１０−５１７５９０号公報

生物組織や微生物の成長に方向性が見られる場合、繊維基材を構成する繊維は、ある一方向に配列していることが望ましい。生物組織や微生物が成長し易くなるためである。しかし、通常、繊維基材は、繊維同士の交絡によって形状が保持されており、上記のような配列性を有さない。

本発明の一局面は、第１の面と、その反対側の第２の面と、前記第１の面から前記第２の面に貫通する１つ以上の貫通孔と、を備え、前記第１の面に第１の接着部を有する枠体を準備する準備工程と、繊維の原料液をノズルから吐出して、前記繊維を生成させるとともに、前記繊維を巻取回転体の周面に周回するように堆積させて、繊維集合体を形成する堆積工程と、前記巻取回転体を回転させながら、前記繊維集合体を前記枠体の前記第１の面に、前記第１の接着部を介して転写する転写工程と、前記繊維集合体が転写された前記枠体を、前記第１の面が対向するように、基板に搭載する搭載工程と、を備える、培地の製造方法に関する。

本発明に係る製造方法によれば、一方向に配列した繊維を備える培地を、生産性よく製造することができる。

本発明に係る培地を模式的に示す斜視図である。本発明に係る製造方法の各工程における巻取回転体、枠体および基板を模式的に示す側面図である（（ａ）〜（ｃ））。本発明に係る巻取回転体の一例を示す斜視図（ａ）および平面図（ｂ）である。本発明に係る巻取回転体のさらに他の例を示す側面図である。繊維の配列を説明するための繊維集合体の一部の領域の概略上面図である。

［培地］
本実施形態に係る方法により製造される培地は、例えば、生物組織や微生物を保持した状態で、これらの電位を測定するための電位測定装置に好適に利用される。
培地の一例を図１に示す。図１は、培地１００を模式的に示す斜視図である。
培地１００は、基板１１０と、基板１１０に搭載される枠体１２０と、基板１１０と枠体１２０との間に介在する繊維集合体１３０と、を備える。ただし、繊維集合体１３０は、基板１１０の枠体１２０が搭載されている搭載面１１０Ｘの全面ではなく、枠体１２０の一方の主面（第１の面１２０Ｘ）に対向する範囲内に配置されている。培地１００は、必要に応じてホルダーなどに収容されて、電位測定装置に配置されてもよい。

（繊維集合体）
繊維集合体１３０は、複数の繊維１３１の集合体である。繊維集合体１３０において、複数の繊維１３１は一方向に配列している。複数の繊維１３１が一方向に配列しているとは、繊維集合体１３０において、繊維１３１同士が交差していないか、繊維１３１同士が交わる平均的な角度が、０°を超え６０°以下であることをいう。このように、複数の繊維１３１が配列した状態である場合、その繊維１３１の配列方向に沿って繊維１３１が伸び易いため、生物組織や微生物へのストレスが低減される。よって、繊維１３１の配列方向に沿って生物組織や微生物が成長し易くなる。

ここで、繊維１３１同士が交わる平均的な角度は、繊維１３１の平均的な長さ方向の交わりから決定できる。繊維１３１の平均的な長さ方向は、例えば、繊維集合体１３０をその法線方向から見たときのＳＥＭ写真に基づいて決定することができる。図５は、繊維の配列を説明するための繊維集合体の概略上面図である。図５では、繊維集合体１３０を法線方向から撮影したＳＥＭ写真における繊維集合体１３０の状態を模している。複数の繊維１３１で構成される繊維集合体１３０を法線方向から見て、所定のサイズ（例えば、１００μｍ×１００μｍ）の正方形の領域Ｒを設定する。このとき、領域Ｒは、領域Ｒ内に１２本以上の繊維１３１が入り、かつ領域Ｒ内に位置する繊維１３１の５０％以上が領域Ｒの対向する２辺と交差するように決定する。この領域Ｒにおいて、ある繊維１３１が、上記の対向する２辺と交差する２点間を結んだ直線（図５では点線）の方向を、その繊維１３１の平均的な長さ方向とする。

繊維１３１同士が交わる平均的な角度は、例えば、上記領域Ｒにおいて、任意に選択した複数（例えば、２０本）の繊維１３１から、さらに任意に２本の繊維１３１を選択し、各繊維１３１の平均的な長さ方向が交わる角度（例えば、図５のθ１）を求める。別の２本の繊維１３１を選択し、各繊維１３１の平均的な長さ方向が交わる角度（例えば、図５のθ２）を求める。このような作業を、選択した残りの繊維１３１（例えば、１６本）について行う。そして、それぞれの角度の平均を算出し、繊維１３１同士が交わる平均的な角度とする。

繊維集合体１３０の単位面積に占める繊維１３１の面積の割合は１０〜９０％から選択できる。例えば、心筋細胞の培養や電位測定装置に利用する場合には、繊維集合体１３０はごく薄く、単位面積当たりに占める繊維１３１の割合は２０〜５０％であり、３０〜４０％で均一に分散して堆積していることが好ましい。なお、繊維１３１の面積の割合は、繊維集合体１３０の一方の主面（例えば、上面）において、繊維集合体１３０における所定の面積（例えば、短軸３ｍｍ×長軸６ｍｍの楕円形）の領域について、光学顕微鏡等で取得した画像を２値化処理して、繊維１３１が占める面積を算出し、単位面積当たりの面積比率（％）に換算することにより求めることができる。

繊維１３１の材質は、生物組織や微生物の培地として用いることができる限り特に限定されない。なかでも、生物組織や微生物に対する親和性が高く、培養する際、生物組織や微生物にストレスを与え難い点で、繊維１３１は、ポリスチレンブロックおよびポリブタジエンブロックを含むブロックポリマーと、当該ブロックポリマーとは異なるスチレン樹脂と、を含むことが好ましい。繊維１３１は、必要に応じて各種添加剤を含んでいてもよい。

ブロックポリマーは、例えば、ポリブタジエン（ＰＢ）ブロックとポリスチレン（ＰＳ）ブロックとが連結したジブロック体であってもよいが、ＰＢブロックとＰＳブロックとが交互に連結したトリブロック体以上のポリブロック体が好ましい。ブロックポリマーは、スチレン樹脂との親和性を確保する観点から、少なくとも末端にＰＳブロックを含むことが好ましい。ＰＢブロックは、得られる繊維１３１の柔軟性や伸度を高める。

ブロックポリマー中のＰＢブロックの含有量は、例えば、１０〜３０質量％であり、１５〜３０質量％であることが好ましく、２０〜３０質量％または２０〜２５質量％であることがさらに好ましい。ＰＢブロックの含有量がこのような範囲である場合、スチレン樹脂との親和性が高くなって、均質な繊維１３１が生成され易くなる。また、得られる繊維１３１は高い柔軟性および伸度を備える。さらに、繊維１３１を電界紡糸法により生成させる場合、高い曳糸性が確保される。

スチレン樹脂としては、上記のブロックポリマーとは異なるポリマーが使用される。スチレン樹脂としては、例えば、ポリスチレン（スチレンホモポリマー）、スチレンと他の共重合性モノマーとの共重合体が挙げられる。スチレン樹脂は、一種を単独でまたは二種以上を組み合わせてもよい。

繊維１３１の柔軟性と形成し易さとを両立させる観点から、ブロックポリマーとスチレン樹脂との質量比（＝ブロックポリマー：スチレン樹脂）は、例えば、２：１〜１：５であり、好ましくは１：１〜１：４である。特に、溶液を用いる電界紡糸法により繊維集合体１３０を形成する場合には、質量比がこのような範囲であると、ブロックポリマーおよびスチレン樹脂を溶媒に溶解し易く、高い紡糸性を確保することもできる。

繊維１３１の平均繊維径は、例えば、０．５〜１０μｍが好ましく、１〜５μｍがより好ましく、１．５〜４μｍが特に好ましい。
なお、平均繊維径とは、繊維１３１の直径の平均値である。繊維１３１の直径とは、繊維１３１の長さ方向に対して垂直な断面の直径である。そのような断面が円形でない場合には、最大径を直径と見なしてよい。また、繊維集合体１３０の１つの主面の法線方向から見たときの、繊維１３１の長さ方向に対して垂直な方向の幅を、繊維の直径と見なしてもよい。平均繊維径は、例えば、繊維集合体１３０に含まれる任意の１０本の繊維の任意の箇所の直径の平均値である。

（枠体）
枠体１２０は、第１の面１２０Ｘと、その反対側の第２の面１２０Ｙと、第１の面１２０Ｘから第２の面１２０Ｙに貫通する１つ以上の貫通孔１２１と、を備える。第１の面１２０Ｘの表面には、貫通孔１２１の少なくとも一部を覆うように、繊維集合体１３０が配置される。すなわち、貫通孔１２１の第１の面１２０Ｘ側の開口（第１開口）からは、繊維集合体１３０（繊維１３１）が露出する。

枠体１２０が基板１１０に搭載されると、貫通孔１２１の第１開口が繊維集合体１３０を介して基板１１０によって塞がれて、基板１１０の搭載面１１０Ｘには少なくとも１つの窪みが形成される。この窪みに、貫通孔１２１の第２の面１２０Ｙ側の開口（第２開口）から生物組織または微生物を含む培養液が注入される。注液された生物組織または微生物は、繊維集合体１３０を足場として成長する。繊維集合体１３０を構成する繊維１３１は、一方向に沿った状態で配列しているため、生物組織または微生物は、繊維１３１の長さ方向に沿って、ストレスの少ない状態で成長することができる。

枠体１２０の材質は特に制限されず、ガラス製や樹脂製（エラストマー製も含む）であってもよい。枠体１２０のサイズは、第１の面１２０Ｘの全面が基板１１０に対向でき、かつ、基板１１０に配置される電極（後述参照）の配線の妨げにならない限り、特に限定されない。

貫通孔１２１の数も特に限定されず、枠体１２０のサイズや用途に応じて適宜設定すればよい。第１開口および第２開口の形状および大きさも特に限定されず、用途等に応じて適宜設定すればよい。第１開口および第２開口の形状および大きさは、同じであってもよいし、異なっていてもよい。貫通孔１２１によって形成される上記窪みの形状も特に限定されない。例えば、第１開口および第２開口がともに円形である場合、窪みの形状は、円柱状であってもよいし、すり鉢状であってもよい。なかでも、培養液が注入し易い点で、上記窪みは、第２開口が大きいすり鉢状であることが好ましい。

（基板）
基板１１０は絶縁性であって、例えば、図示しない複数の電極（第１電極）と、第１電極と電気的に接続する複数のマイクロ電極（第２電極）とを備えている。複数の第１電極は、互いに絶縁されている。複数の第２電極２０３は、行列方式にて所定の間隔で形成されており、互いに絶縁されている。

複数の第１電極は、繊維集合体１３０に接触しないように配置されている一方、複数の第２電極は、繊維集合体１３０の少なくとも一部に接触するように配置されている。第１電極と第２電極との間の電圧を測定することにより、繊維集合体１３０（すなわち、生物組織または微生物）の電位が測定できる。このように、繊維集合体１３０の電位の経時的な変化や条件を変更した際の変化を計測することにより、この電位変化に基づく、生物組織または微生物の状態や機能などを評価することができる。このとき、生物組織または微生物はストレスの少ない状態でいるため、精度の高い評価が可能となる。さらには、第１電極と第２電極との間に電圧を印加することにより、生物組織または微生物に刺激（電気信号）を与えて、これらの成長を促すことができる。

基板１１０は、絶縁性である限り特に制限されず、用途に応じて適宜選択すればよい。１１０としては、例えば、ガラス板、石英板、アクリル板などが例示される。第１電極も特に制限されず、用途に応じて適宜選択すればよい。第１電極としては、例えば、ＩＴＯ（インジウムスズ酸化物）電極や白金電極などが例示される。

第２電極としては、生物組織や微生物の電位を測定可能であればよく、用途に応じて適宜選択できる。第２電極のサイズ、隣接する第２電極間の距離、第２電極の個数は、生物組織や微生物の種類やサンプルのサイズなどに応じて適宜選択できる。第２電極の一辺の長さ（円盤状の場合には直径）は、例えば、１０〜１００μｍであり、１５〜６０μｍであってもよい。隣接する第２電極間距離（第２電極の中心間距離）は、例えば、５０〜１０００μｍであり、５０〜５００μｍであってもよい。

（接着部）
繊維集合体１３０と枠体１２０とは、枠体１２０に形成された第１の接着部１４０Ａを介して接着されている。このとき、繊維集合体１３０の一部は、第１の接着部１４０Ａに埋め込まれるように保持される。繊維集合体１３０は、一方向に配列する繊維１３１の集合体であるため、第１の接着部１４０Ａの材料は繊維１３１の間に入り込んで、基板１１０側にまで浸透し易い。そのため、第１の接着部１４０Ａは、枠体１２０と基板１１０との接着部としても機能し得る。ただし、図１では、便宜上、第１の接着部１４０Ａを繊維集合体１３０よりも枠体１２０側に配置している。なお、第１開口に対応する領域には、第１の接着部１４０Ａは形成されていない。

第１の接着部１４０Ａの材料（接着剤Ａ）は特に限定されず、例えば、感圧接着剤、ホットメルト型接着剤または硬化性接着剤等が挙げられる。
感圧接着剤は、枠体１２０に塗布され、その粘着性により、枠体１２０と繊維集合体１３０（さらには、基板１１０。以下、同じ。）とを接着する。感圧接着剤の材質は特に限定されず、例えば、シリコーン樹脂等が挙げられる。シリコーン樹脂としては、例えば、ジメチルシリコーン、メチルフェニルシリコーン等が挙げられる。

ホットメルト型接着剤は、加熱されながら枠体１２０に塗布され、冷却されることによって、枠体１２０と繊維集合体１３０とを接着する。ホットメルト型接着剤の材質は特に限定されず、例えば、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル、ウレタン変性共重合ポリエステル等の共重合ポリエステル、ポリアミド、ポリオレフィン（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン）等の熱可塑性樹脂を主成分（５０質量％以上を占める成分）として含む。

硬化性接着剤は、枠体１２０に塗布され、紫外線照射あるいは加熱により重合されて硬化することにより、枠体１２０と繊維集合体１３０とを接着する。硬化性接着剤の種類は特に限定されず、熱硬化性樹脂、紫外線硬化性樹脂等が挙げられる。これらの樹脂としては、例えば、アクリル樹脂、エポキシ樹脂等が挙げられる。硬化性接着剤を用いる場合、転写工程の前に硬化性接着剤を半硬化状態にしておくことが好ましい。この場合、転写工程の後、あるいは、搭載工程の後、さらに硬化作業を行って、硬化性接着剤を完全に硬化させる。

なかでも、接着剤Ａとしては、硬化させるための特別なステップが省略できる点で、感圧接着剤およびホットメルト型接着剤が好ましく、さらに、接着剤を溶融させるための加熱装置が不要である点で、感圧接着剤が好ましい。なお、接着剤Ａが、ホットメルト型接着剤および／または硬化性接着剤を含む場合、２つの部材が「第１の接着部１４０Ａを介して接着されている」とは、当該部材が「接着剤Ａの硬化物を介して接着されている」ことを意味する。後述する接着剤Ｂについても同様である。

第１の接着部１４０Ａは、枠体１２０の第１の面１２０Ｘに形成される。第１の接着部１４０Ａは、第１の面１２０Ｘの第１開口以外の全面に形成されていてもよいし、部分的に形成されていてもよい。

基板１１０と枠体１２０との間に、さらに接着部（第２の接着部１４０Ｂ）を形成してもよい。この場合、第２の接着部１４０Ｂは、基板１１０の枠体１２０を搭載する搭載面１１０Ｘに形成される。第１の接着部１４０Ａと第２の接着部１４０Ｂとは、それぞれ繊維１３１を内包しながら互いに接触し得る。これにより、枠体１２０と基板１１０との接着性がさらに高まるとともに、これらの間に介在する繊維集合体１３０が固定され易くなる。第２の接着部１４０Ｂの材料（接着剤Ｂ）は特に限定されず、例えば、接着剤Ａと同様の接着剤が挙げられる。なかでも、上記と同様の観点から、接着剤Ｂとしては、感圧接着剤が好ましい。また、接着性の観点から、接着剤Ａおよび接着剤Ｂは、同じ材質の接着剤を含むことが好ましい。

第２の接着部１４０Ｂは、搭載面１１０Ｘの第１開口に対向する部分以外の全面に形成されていてもよいし、部分的に形成されていてもよい。なお、図示例では、第２の接着部１４０Ｂが、第１の面１２０Ｘの第１開口に対向する部分以外の全面に形成されている場合を示している。

接着部（１４０Ａ、１４０Ｂ）の単位面積当たりの質量は、特に限定されない。なかでも、繊維集合体１３０と枠体１２０との接着性、さらには基板１１０と枠体１２０との接着性を確保しながら、生物組織や微生物の培養を妨げないようにする観点から、上記質量はそれぞれ０．５〜１００ｍｇ／ｃｍ^２であることが好ましい。

［培地の製造方法］
本実施形態では、高い配列性を有する繊維集合体１３０を含む培地１００を製造するために、繊維１３１を紡糸しながら巻取回転体で巻き取っていく。これにより、巻取回転体の周面に形成される繊維集合体１３０は、一方向への高い配列性を備える。さらに、この繊維１３１の一方向への配列を維持した状態で、繊維集合体１３０を枠体１２０の第１の面１２０Ｘに転写する。その後、繊維集合体１３０を備える枠体１２０を、第１の面１２０Ｘが対向するように基板１１０に搭載する。これにより、巻取回転体に巻き取られたときの高い配列性を保持したまま、繊維集合体１３０は、基板１１０と枠体１２０との間に配置される。

基板１１０の搭載面１１０Ｘは、電気配線の都合上、枠体１２０よりも十分に大きい面積を備える。一方、繊維集合体１３０は、枠体１２０に形成された複数の貫通孔１２１により形成される第１開口から露出するように配置されていればよい。そのため、繊維集合体１３０を、基板１１０ではなく枠体１２０に転写することにより、精密な位置合わせ等を行うことなく、必要な部分にのみ繊維集合体１３０を配置することができて、生産性が向上する。

以下、本実施形態の製造方法を図面を参照しながら説明する。図２（ａ）〜（ｃ）は、本実施形態の各工程における巻取回転体１０、枠体１２０および基板１１０等を模式的に示す側面図である。

本実施形態に係る培地の製造方法は、第１の面１２０Ｘと、その反対側の第２の面１２０Ｙと、第１の面１２０Ｘから第２の面１２０Ｙに貫通する１つ以上の貫通孔１２１と、を備え、第１の面１２０Ｘに第１の接着部１４０Ａを有する枠体１２０を準備する準備工程と、繊維１３１の原料液をノズル５１から吐出して、繊維１３１を生成させるとともに、繊維１３１を巻取回転体１０の周面に周回するように堆積させて、繊維集合体１３０を形成する堆積工程と、巻取回転体１０を回転させながら、繊維集合体１３０を枠体１２０の第１の面１２０Ｘに、第１の接着部１４０Ａを介して転写する転写工程と、繊維集合体１３０が転写された枠体１２０を、第１の面１２０Ｘが対向するように、基板１１０に搭載する搭載工程と、を具備する。

上記の製造方法は、例えば、枠体１２０の第１の面１２０Ｘに第１の接着部１４０Ａを形成する接着部形成部と、繊維１３１の原料液をノズル５１から吐出して、繊維１３１を生成させるとともに、繊維１３１を、巻取回転体１０の周面に周回するように堆積させて、繊維集合体１３０を形成する堆積部と、巻取回転体１０を回転させながら、繊維集合体１３０を枠体１２０の第１の面１２０Ｘに第１の接着部１４０Ａを介して転写する転写部と、繊維集合体１３０が転写された枠体１２０を、第１の面１２０Ｘが対向するように、基板１１０に搭載する搭載部と、を備える装置により実施される。

（１）準備工程
第１の面１２０Ｘと、その反対側の第２の面１２０Ｙと、第１の面１２０Ｘから第２の面１２０Ｙに貫通する１つ以上の貫通孔１２１と、を備える枠体１２０、および、枠体１２０を搭載するための基板１１０を準備する。
第１の面１２０Ｘには第１の接着部１４０Ａが形成されている。第１の接着部１４０Ａは、例えば、印刷、ディスペンサー等により、第１の面１２０Ｘの第１開口以外の少なくとも一部に形成される。

（２）堆積工程（図２（ａ））
原料液１３２から繊維１３１を生成させるとともに、繊維１３１を巻取回転体１０の周面を１周以上、周回させながら堆積させる。これにより、巻取回転体１０の周面には、繊維１３１が一方向に配向した繊維集合体１３０が形成される。

原料液１３２から繊維１３１を生成する方法（紡糸法）は特に限定されず、生成させる繊維１３１の種類等に応じて適宜選択すればよい。紡糸法としては、例えば、溶液紡糸法、溶融紡糸法および電界紡糸法等が挙げられる。

繊維１３１は、巻取回転体１０の周面に沿って堆積するとともに、周面の法線方向に重なり合う場合もある。この繊維の法線方向の重なりは、特に、電界紡糸法により繊維を生成させる場合に多くみられる。先に堆積する繊維１３１は、後から堆積する繊維１３１の刺激によって動きやすく、配向が乱れ易い。また、後述するように、巻取回転体１０が凸部１０Ｐを備える場合、先に堆積する繊維１３１は、凸部１０Ｐ間で弛んで、配向が乱れる場合もある。本実施形態によれば、巻取回転体１０に堆積した繊維集合体１３０を枠体１２０に転写した後、さらに、この枠体１２０を、繊維集合体１３０が対向するように基板１１０に搭載する。そのため、得られる培地１００において、後から堆積する繊維１３１は、枠体１２０の第２の面１２０Ｙ側に配置される。つまり、配向の乱れの少ない繊維１３１が、培養液とより接触し易い方に配置される。よって、生物組織や微生物へのストレスが軽減されて、これらの成長がさらに促進される。

溶液紡糸法は、繊維１３１の原料を溶媒に溶解して得られた溶液を、原料液１３２として用いる方法である。溶媒を用いる溶液紡糸法には、いわゆる湿式紡糸法および乾式紡糸法がある。湿式紡糸法では、原料液１３２を凝固液中に吐出して、繊維１３１の原料と凝固液との化学反応により、あるいは、溶媒と凝固液との置換により、繊維１３１が形成される。乾式紡糸法では、原料液１３２を空気中に吐出した後、加熱等により溶媒を除去することにより、繊維１３１が形成される。なかでも、繊維１３１を一方向に配列させた状態で堆積させ易い点で、乾式紡糸法が好ましい。

溶融紡糸法は、繊維１３１の原料を加熱して溶融させた溶融液を、原料液１３２として用いる方法である。得られた原料液１３２は、空気中に吐出された後、冷却されることにより、繊維状に固化する。この場合、通常、繊維１３１の原料を溶解するための溶媒は使用しない。よって、溶融紡糸法は、溶媒の除去作業が省略できる点で好ましい。

電界紡糸法は、繊維１３１の原料を溶媒に溶解して得られた溶液を原料液１３２として用いる点で、溶液紡糸法と共通する。しかし、電界紡糸法では、原料液１３２に高電圧を印加しながら空気中に吐出する。原料液１３２に含まれる溶媒は、巻取回転体１０の周面に到達するまでの過程において揮発する。

電界紡糸法では、原料液１３２に高電圧を印加するため、原料液１３２をプラスあるいはマイナスに帯電させる。このとき、巻取回転体１０をグランドさせるか、あるいは、原料液１３２とは逆の極性に帯電させることにより、空気中に吐出された原料液１３２の吐出端は巻取回転体１０に引き寄せられて、その周面に付着する。そして、原料液１３２を吐出しながら巻取回転体１０を回転させることにより、溶液紡糸法および溶融紡糸法と同様に、繊維１３１は、巻取回転体１０の周面に周回しながら堆積し、巻取回転体１０の周面の少なくとも一部を覆い、一方向に配列する繊維１３１を備える繊維集合体１３０が形成される。

（原料液）
溶液紡糸法や電界紡糸法で利用する原料液１３２は、繊維１３１の原料と溶媒とを含む。溶融紡糸法で利用する原料液１３２は、溶融した繊維１３１の原料を含む。

溶媒としては、繊維１３１の原料を溶解し、揮発などにより除去可能なものであれば特に制限されず、原料の種類や製造条件に応じて、水および有機溶媒から適宜選択して使用できる。溶媒としては、非プロトン性の極性有機溶媒が好ましい。このような溶媒としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）などのアミド（鎖状または環状アミドなど）；ジメチルスルホキシドなどのスルホキシドなどが挙げられる。これらの溶媒は一種を単独で用いてもよく、二種以上を組み合わせて用いてもよい。

原料液１３２の固形分濃度は、溶媒の種類などに応じて調節できるが、例えば、５〜５０質量％であり、１０〜３０質量％であってもよい。原料液１３２は、必要に応じてさらに添加剤を含んでもよい。

（巻取回転体）
巻取回転体１０の一例を図３に示す。図３（ａ）は、巻取回転体１０の斜視図であり、図３（ｂ）は、その平面図である。図３（ｂ）では、巻取回転体１０の周面に堆積する繊維集合体１３０の一部も併せて示している。

巻取回転体１０（あるいは、後述する回転基体１１）の構成は、回転可能である限り特に限定されず、ドラム状であってもよいし、複数のロールで張架されたベルトであってもよい。後者の場合、少なくとも１本のロールを回転駆動させて、ベルトを回転させる。巻取回転体１０の材質としては、例えば、金属材料、各種樹脂、各種ゴム、セラミックスおよびこれらの組み合わせが挙げられる。巻取回転体１０がベルトである場合、ベルトは、金属ベルトであってもよいし、樹脂ベルトであってもよい。電界紡糸法により繊維１３１が紡糸される場合、樹脂ベルトは導電性を備えることが好ましい。巻取回転体１０の外形は、例えば、円柱または角柱であってもよい。

繊維１３１は、巻取回転体１０の周面を周回する方向（以下、配列方向Ｄ_Ｆ）に配列しながら、巻取回転体１０の周面に堆積される。配列方向Ｄ_Ｆは、例えば、巻取回転体１０の回転方向（すなわち、巻取回転体１０の回転軸Ａに垂直な方向）に沿う方向である。配列方向Ｄ_Ｆと回転軸Ａとのなす角度θ_Ｆ（ただし、θ_Ｆ≦９０°）は、例えば、６０°以上、９０°以下でもよい。なお、配列方向Ｄ_Ｆは、繊維１３１を巻取回転体１０の周面の法線方向から見たときの、繊維１３１の長手方向である。繊維１３１の長手方向は、巻取回転体１０の周面の法線方向から見たときの繊維１３１の近似直線をとって、求めてもよい。角度θ_Ｆは、複数の繊維１３１の配列方向Ｄ_Ｆと回転軸Ａとのなす角度の平均値である。巻取回転体１０に堆積する複数の繊維１３１の配列方向Ｄ_Ｆは、上記範囲内で互いに異なっていてもよい。

巻取回転体１０の周面に、巻取回転体１０の回転軸Ａに沿う方向に延伸する複数の帯状の凸部１０Ｐを配置してもよい。これにより、巻取回転体１０の周面に周回するように配列した繊維１３１の集合体（繊維集合体１３０）は、巻取回転体１０から剥離され易くなる。その結果、繊維１３１の配列を維持したまま、繊維集合体１３０を枠体１２０に容易に転写することができる。複数の凸部１０Ｐの端部は、回転軸Ａと交差する方向に延伸するリブ１０Ｒにより連結されていてもよい。

凸部１０Ｐの延伸方向Ｄ_Ｐは、回転軸Ａに平行である場合に限られず、延伸方向Ｄ_Ｐと回転軸Ａとのなす角度θ_Ｐ（ただし、θ_Ｐ＜９０°）は、例えば、０°以上、３０°以下である。なかでも、繊維集合体１３０の剥離性の観点から、角度θ_Ｐは０°以上、２０°以下であることが好ましい。

また、延伸方向Ｄ_Ｐは、繊維１３１の配列方向Ｄ_Ｆと交差する方向である。延伸方向Ｄ_Ｐと配列方向Ｄ_Ｆとのなす角度θ（ただし、θ≦９０°）は、例えば、６０°以上、９０°以下である。なお、延伸方向Ｄ_Ｐは、凸部１０Ｐを巻取回転体１０の周面の法線方向から見たとき、凸部１０Ｐの長手方向の中心線Ｌ_ＣＰが延伸する方向である。中心線Ｌ_ＣＰが曲線を含む場合、延伸方向Ｄ_Ｐは、中心線Ｌ_ＣＰを囲む最小の矩形の中心線が延伸する方向である。

凸部１０Ｐの形状は、帯状である限り特に限定されない。帯状とは、凸部１０Ｐの延伸方向Ｄ_Ｐの長さが、延伸方向Ｄ_Ｐに垂直な方向の長さよりも長い形状である。凸部１０Ｐを巻取回転体１０の周面の法線方向から見たときの形状としては、例えば、矩形、台形等が挙げられる。

凸部１０Ｐの数は特に限定されず、２本以上であればよい。なかでも、繊維集合体１３０の剥離性の観点から、巻取回転体１０の周面に３本以上配置されることが好ましく、１０本以上配置されることが好ましい。また、同様の観点から、凸部１０Ｐは等間隔に配置されることが好ましい。なお、後述するように、繊維集合体１３０の枠体１２０への転写工程に先立って、繊維集合体１３０が巻取回転体１０に捲回された状態で切断される場合、切断後の繊維集合体１３０の少なくとも一部が凸部１０Ｐに接触した状態になるよう、繊維集合体１３０は凸部１０Ｐ同士の間で切断される。これにより、繊維１３１の配列が維持され易くなる。この場合、切断予定箇所Ｃ（図２（ａ）参照）の凸部１０Ｐ同士の間隔を、他の部分の凸部１０Ｐ同士の間隔よりも小さくすることが好ましい。

凸部１０Ｐの短手方向の長さ（幅）は特に限定されない。なかでも、繊維集合体１３０の剥離性の観点から、すべての凸部１０Ｐの巻取回転体１０の周面に当接する総面積が、巻取回転体１０の周面の表面積の１０％以上、８０％以下、特に３０％以上、７０％以下になるように、各凸部１０Ｐの幅を決定することが好ましい。凸部１０Ｐの延伸方向Ｄ_Ｐの長さも特に限定されない。なかでも、巻取回転体１０の周面のうち、少なくとも繊維１３１が堆積し得る領域にわたって、凸部１０Ｐが延伸していることが好ましい。

凸部１０Ｐの高さは特に限定されない。なかでも、繊維１３１の弛みを抑制し、一方向への配列を維持し易い点で、凸部１０Ｐの高さは過度に高くないことが好ましい。繊維集合体１３０の剥離性および繊維１３１の弛み抑制の観点から、凸部１０Ｐの高さは１００〜５０００μｍであることが好ましい。凸部１０Ｐの高さは、巻取回転体１０の周面の法線方向における平均値である。

凸部１０Ｐの材質は特に限定されず、各種樹脂材料が挙げられる。なかでも、凸部１０Ｐは、少なくとも繊維１３１との接触部にシリコーンゴム層を備えることが好ましい。繊維集合体１３０の剥離性がさらに向上するためである。一方で、シリコーンゴムは適度な粘着性を備えるため、転写工程の前に繊維集合体１３０が巻取回転体１０の周面から剥離することが抑制される。

シリコーンゴムとは、主鎖がケイ素−酸素結合（シロキサン結合）により形成される、熱硬化性の化合物である。シリコーンゴムとしては、例えば、メチルシリコーンゴム、ビニル−メチルシリコーンゴム、フェニル−メチルシリコーンゴム、ジメチルシリコーンゴム、フロロシリコーンゴム等が挙げられる。凸部１０Ｐの全体がシリコーンゴムにより形成されていてもよい。なお、繊維１３１が電界紡糸法により生成される場合、凸部１０Ｐは導電性を備えることが好ましい。

取扱い性の観点から、凸部１０Ｐは、巻取回転体１０に着脱可能な状態で配置されることが好ましい。例えば、図４に示すように、支持シート１２ａと、支持シート１２ａの表面に帯状に配置されたシリコーンゴム１２ｂとを備える凹凸シート１２を準備し、この凹凸シート１２を回転基体１１の周囲に捲回してもよい。このとき、シリコーンゴム１２ｂが凸部１０Ｐに対応する。この構成により、凸部１０Ｐの配設が容易となるとともに、凸部１０Ｐが劣化した場合の交換も容易となる。

支持シート１２ａの材質は特に限定されず、例えば、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル、ポリイミド等が挙げられる。繊維１３１が電界紡糸法により生成される場合、支持シート１２ａもまた導電性を備えることが好ましい。支持シート１２ａの厚みも特に限定されず、支持シート１２ａの材質等に応じて適宜設定すればよい。シリコーンゴム１２ｂとしては、上記した化合物が例示できる。

堆積工程の後、転写工程の前に、繊維集合体１３０および枠体１２０の少なくとも一方を加熱する加熱工程を備えていてもよい。転写工程の前に繊維集合体１３０を加熱することにより、繊維集合体１３０は軟化した状態で枠体１２０に転写される。これにより、繊維集合体１３０と枠体１２０との密着性が向上する。また、転写工程の前に枠体１２０を加熱することにより、転写後、繊維集合体１３０に熱が伝わって軟化する。これにより、繊維集合体１３０と枠体１２０との密着性が向上する。なかでも、枠体１２０を加熱する方法は、繊維１３１の劣化が抑制できる点で好ましい。

加熱方法は特に限定されないが、繊維１３１の配列が維持できる点で、非接触式であることが好ましい。非接触式の加熱装置としては、例えば、ハロゲンランプ等、公知のものが挙げられる。加熱温度は、繊維１３１の軟化点あるいは融点等を考慮して、適宜設定すればよい。加熱温度は、例えば、繊維１３１が８０〜１４０℃になるように調整する。

（３）転写工程（図２（ｂ））
巻取回転体１０を回転させながら、繊維集合体１３０を枠体１２０に転写する。
転写工程に先立って、繊維集合体１３０は、巻取回転体１０に捲回された状態で切断予定箇所Ｃにおいて切断されてもよい。切断予定箇所Ｃは、例えば、枠体１２０（あるいは第１開口）の形状およびサイズに応じて設定される。繊維集合体１３０は、例えば、回転軸Ａに沿う方向に切断される。この切断部をきっかけにして、繊維集合体１３０は枠体１２０に転写される。

枠体１２０は、例えばＸＺステージ５２に支持されたステージ５３に載置されて、搬送される。ＸＺステージ５２は、ステージ５３、つまりステージ５３に載置される枠体１２０を、巻取回転体１０の回転軸Ａに垂直な方向（Ｘ軸方向）および上下方向（Ｚ軸方向）に搬送することができる。

生産性がさらに向上する点で、転写工程は、複数の枠体１２０に対し一括してあるいは連続的に実施されることが好ましい。この場合、複数の枠体１２０は、ステージ５３上にＹ軸方向（巻取回転体１０の回転軸Ａに沿う方向）に沿って配置されてもよいし、Ｘ軸方向に沿って配置されてもよい。また、一体的に形成された複数の枠体１２０の集合体に対して、転写工程が行われてもよい。この場合、転写工程の後、搭載工程の前に、上記枠体１２０の集合体を個々の枠体１２０に分離する。この方法によれば、複数の枠体１２０に対し、一括して繊維集合体１３０が転写できるとともに、巻取回転体１０に堆積した繊維１３１の大部分が枠体１２０の転写に利用されるため、生産性がさらに向上する。

（４）搭載工程（図２（ｃ））
繊維集合体１３０が転写された枠体１２０を、第１の面１２０Ｘが対向するように、基板１１０に搭載する。このとき、枠体１２０と基板１１０との間には、第１の接着部１４０Ａおよび繊維集合体１３０が介在しており、さらに第２の接着部１４０Ｂが介在していてもよい。転写工程が、複数の枠体１２０に対し、一括してあるいは連続的に実施された場合にも、１つの基板１１０には１つの枠体１２０が搭載される。

本発明の方法によれば、一方向に配列した繊維を有する繊維集合体を備える培地を生産性よく製造することができる。さらに、本発明により得られる培地は、一方向に配列した繊維を備えるため、特に、成長に方向性がある生物組織または微生物を培養するための培地として有用である。

１０：巻取回転体
１０Ｐ：凸部
１０Ｒ：リブ
１１：回転基体
１２：凹凸シート
１２ａ：支持シート
１２ｂ：シリコーンゴム
５１：ノズル
５２：ＸＺステージ
５３：ステージ
１００：培地
１１０：基板
１１０Ｘ：搭載面
１２０：枠体
１２０Ｘ：第１の面
１２０Ｙ：第２の面
１２１：貫通孔
１３０：繊維集合体
１３１：繊維
１３２：原料液
１４０Ａ：第１の接着部
１４０Ｂ：第２の接着部

Claims

第１の面と、その反対側の第２の面と、前記第１の面から前記第２の面に貫通する１つ以上の貫通孔と、を備え、前記第１の面に第１の接着部を有する枠体を準備する準備工程と、
繊維の原料液をノズルから吐出して、前記繊維を生成させるとともに、前記繊維を巻取回転体の周面に周回するように堆積させて、繊維集合体を形成する堆積工程と、
前記巻取回転体を回転させながら、前記繊維集合体を前記枠体の前記第１の面に、前記第１の接着部を介して転写する転写工程と、
前記繊維集合体が転写された前記枠体を、前記第１の面が対向するように、基板に搭載する搭載工程と、を備える、細胞培養用足場の製造方法。
前記搭載工程において、前記枠体の前記第１の面と前記基板とが、前記第１の接着部を介して接着される、請求項１に記載の細胞培養用足場の製造方法。
前記基板が、第２の接着部を備えており、
前記搭載工程において、前記枠体の前記第１の面と前記基板とが、前記第２の接着部を介して接着される、請求項１に記載の細胞培養用足場の製造方法。
前記第１の接着部が、感圧接着剤を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養用足場の製造方法。
前記第２の接着部が、感圧接着剤を含む、請求項３に記載の細胞培養用足場の製造方法。
前記転写工程において、複数の前記枠体に、一括してあるいは連続的に、前記繊維集合体の転写が行われ、
前記搭載工程において、１つの前記枠体が１つの前記基板に搭載される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞培養用足場の製造方法。