JP6490690B2 - 高解像度スキャニング顕微鏡法 - Google Patents
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Description
上述した手法を用いて解像度向上を成功させるための前提条件は、ピンホール平面(検出平面)での蛍光・光フィールド分布の自由な走査にある。データ伝送速度とデータ処理速度を低く抑えるために、最小限必要な数の検出器(ファイバ)部材によって処理がなされる。このような事実関係は、対物レンズひとみ直径および蛍光の波長に対する、検出平面におけるフィールド分布の広がりの依存性との組合せにおいて、サブ・エアリー・フィールド分布の対物レンズ固有の広がりを最善の走査のためにファイババンドルに合わせて、サイズの広がりに関して相対的に適合化できることを必要とする。
好ましい発展例は従属請求項の対象である。
以下において、本発明についての以後の説明は図9〜図12の図面を参照しながら行う。
このような適当なファイババンドルを選択する方法は、非常に迅速に切替えることができるので(ズーム系によるファイババンドルでのエアリーディスクのサイズ変化と比較したとき)、この解決法は、特にマルチスペクトル測定の場合に特別に好ましい。
高い割合の焦点外の光を伴う厚い試料の場合、制御量SNRは集束光学系調整またはファイババンドルを優先し、複数のエアリーディスクがファイババンドルに結像される。その一方、再構成された画像におけるコントラスト(たとえばSheppard et al.In Optik80,No.2,53(1982)に基づく再構成)は、最善の解像度のために好ましくは1つのエアリーディスクだけをファイババンドルへ結像する検出光走査を優先する。規則パラメータを用いてシステムを解像度とSNRの間で最適化することができ、規則では使用する試料の特性が考慮される。
規則のために、たとえば画像が記録される開始時のデータを利用することができ、それにより画像内部でパラメータ(集束光学系調整)を最適化する(画像がすでに縁部のところに代表的な情報を有している場合)。別案として、まずスナップショットによって、低減されたレーザ照明および/または増大したスキャン速度のもとで、画像中の選択された区域について最適化のための関連する情報が取得される。
この態様では、現時点でリアルタイムコンピュータでは処理することができない高いデータレートが発生する。この理由により、たとえば128チャネルのデータを32チャネルまで減らすのが好ましい。ちょうど1つのエアリーがファイババンドルに割り当てられるケースについては、検出器に近いエレクトロニクス(FPGAまたはマイクロコントローラ)でそれぞれたとえば4チャネルがまとめられ、それにより、まとめられた各チャネルが既知の配置を有するようにする。ちょうど2つのエアリーがファイババンドルにあるケースについては、内側の32のチャネルだけが読み出される。中間値については、ファイババンドルにおけるエアリーディスクのサイズに応じて、各々の横方向への解像度向上を実現するためにファイバを1つのチャネルにまとめる適切なコンフィギュレーションを見出さなければならない。たとえば32チャネルになるようにFPGAで補間をすることも同じく可能である。
40,41,42:ファイババンドル
43,44,45:光導波路
46:マルチチャネル検出器
47:旋回可能な主カラースプリッタ
48:スライダ
R 制御ループ
49:コントロールユニット/コンピュータ
50:調整可能な集束光学系
51:信号割り当て
52:信号割り当て
53:ファイバ入力部
54,55,56:ファイバ入力部へのエアリー直径の配分
ここでは、PMTアレイまたはAPDアレイまたはPMTラインまたはAPDラインであってよい同一のマルチチャネル検出器に、複数のファイババンドルから負荷が与えられる(光があてられる)。
ちょうど1つのエアリーがファイババンドルにあたるケースについては、検出器近傍のエレクトロニクス(FPGAまたはマイクロコントローラ)でそれぞれたとえば4つのチャネルがまとめられ、それにより、まとめられたチャネルが既知の構造を有するようにされる(図12b)。ちょうど2つのエアリーがファイババンドル上にあるケースについては、内側の32のチャネルだけが読み出される(図12c)。中間値については、ファイババンドルにおけるエアリーディスクのサイズに応じて、各々の横方向への解像度向上を実現するためにファイバを1つのチャネルにまとめる適切なコンフィギュレーションを見出さなければならない。たとえば32チャネルになるようにFPGAで補間をすることも、同じく可能である。図12d)は、上記の状況についての例を示している。
各々のファイバがそれぞれちょうど1つのチャネルに割り当てられる、測定信号を再分配する別案として、図12d)のように、たとえば画像のスケーリングの際に専門的に通常用いられるアルゴリズムによって、1つのファイバのD信号をFPGDで複数のチャネルに分配することも可能である。
43,44,45 光導波路
46 マルチチャネル検出器
47 旋回可能な主カラースプリッタ
48 スライダ
R 制御ループ
49 コントロールユニット/コンピュータ
50 調整可能な集束光学系
51 信号割り当て
52 信号割り当て
53 ファイバ入力部
54,55,56 ファイバ入力部へのエアリー直径の配分
Claims (23)
- 試料(2)の高解像度スキャニング顕微鏡法のための顕微鏡において、
試料(2)を照明するための照明装置(3)と、
試料(2)にわたって少なくとも1つの点スポットまたは線スポット(14)をスキャンするため、および、点スポットまたは線スポット(14)を検出平面(18)において静止した回折限界の個別画像(17)へと結像させるための結像装置(4)と、
回折限界の個別画像(17)の半値幅の少なくとも2倍の大きさの空間分解能でさまざまなスキャン位置について前記検出平面(18)における前記個別画像(17)を検出するための検出器装置(19)と、
前記検出器装置(19)のデータから前記スキャン位置の前記個別画像(17)の回折構造を評価するため、および、回折限界を超えて高められた解像度を有する試料(17)の画像を生成するための評価装置(C)とを有しており、
前記検出器装置(19)は、
ピクセル(25)を有し、前記個別画像(17)よりも大きい検出器アレイ(24)と、
前記検出器アレイ(24)に前置され、検出平面(18)からの放射を非結像式に前記検出器アレイ(24)のピクセル(25)へ分配する非結像式の再分配部材(20〜21;30〜34;30〜35)とを有しており、
前記顕微鏡はさらに、以下の1)から5)の構成のうち1つまたは複数を有しており、すなわち、
1) 少なくとも1つのさらなる再分配部材が設けられており、前記再分配部材と前記さらなる再分配部材とは、ファイバの数および/またはファイバの配置および/またはファイバ直径および/またはファイバ断面の形状に関して、互いに相違するファイババンドルであること、
2) 前記再分配部材として試料光を検出するために光軸へ入るように旋回挿入可能またはスライド挿入可能に配置される複数の再分配部材が設けられていること、
3) 制御装置をさらに有し、前記制御装置は、前記再分配部材の取替および/または画像サイズを適合化するためのズーム光学系/集束光学系の調整および/または制御信号を用いた前記検出器アレイの個別ピクセルの統合による調整を制御ループで行うように構成されていること、
4) 制御装置をさらに有し、前記制御装置は、再分配部材の取替および/または画像サイズを適合化するためのズーム光学系/集束光学系の調整および/または制御信号を用いた前記検出器アレイの個別ピクセルの統合による調整を制御ループで行うように構成されており、前記調整は制御量として画像コントラストおよび/または画像鮮明度および/または信号/雑音比を含むこと、
5) 検出器アレイに後置された評価回路が設けられており、前記評価回路は前記検出器アレイの複数のチャネルのうちの一部のチャネルを選択的に読み出すように構成されているか、および/または、前記検出器アレイの複数のチャネルのうちの一部のチャネルが以後の処理のためにまとめられている、
顕微鏡。 - 前記再分配部材は、光ファイバ(21)からなるバンドル(20)を含んでおり、検出平面(18)に配置された入力部(22)および出力部(23)を有し、前記光ファイバ(21)は、前記出力部において前記入力部(22)とは幾何学的に相違するように配置され、前記検出器アレイ(24)のピクセル(25)のところで終わる
ことを特徴とする、請求項1に記載の顕微鏡。 - 前記光ファイバはマルチモード光ファイバである、請求項2に記載の顕微鏡。
- 前記光ファイバ(21)は、前記出力部(23)で隣接する光ファイバ(21)が前記入力部(22)でも隣接し、それにより相並んで位置するピクセル(25)の放射強度依存的なクロストークを最低限に抑えるように、前記入力部(22)から前記出力部(23)へ延びていることを特徴とする、請求項2または3に記載の顕微鏡。
- 前記再分配部材は、検出平面(18)からの放射を前記検出器アレイ(24)のピクセル(25)へと導く、それぞれ異なって傾いたミラー部材(31)を備えるミラー(30)を含んでおり、前記検出器アレイ(24)のピクセル(25)は前記ミラー部材(31)の幾何学配置とは相違する幾何学配置を有していることを特徴とする、請求項1に記載の顕微鏡。
- 前記結像装置(4)は前記検出器装置(19)に個別画像(17)のサイズを適合化させるために結像方向において検出平面(18)に前置されたズーム光学系(27)を有していることを特徴とする、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 前記照明装置(3)と前記結像装置(4)は1つのスキャン装置(10)を共有しており、それにより前記照明装置(3)は前記結像装置により結像されるスポット(14)と一致する回折限界の点スポットまたは線スポットで試料(2)を照明し、前記ズーム光学系も前記照明装置(3)の構成要素となるように配置されることを特徴とする、請求項6に記載の顕微鏡。
- 前記検出器アレイ(24)は検出器ラインであることを特徴とする、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 前記検出器ラインはAPDラインまたはPMTラインであることを特徴とする、請求項8に記載の顕微鏡。
- 試料(2)の高解像度のスキャニング顕微鏡法のための方法であって、
試料(2)が照明され、
試料(2)上をスキャンしながら導かれる少なくとも1つの点スポットまたは線スポット(14)が個別画像(17)へと結像され、前記スポット(14)は回折限界で個別画像(17)へと結像され、個別画像(17)は静止するように検出平面(18)に位置しており、
回折限界の個別画像(17)の半値幅の少なくとも2倍の大きさの空間分解能でさまざまなスキャン位置について個別画像(17)が検出され、それにより個別画像(17)の回折構造が検出され、
各々のスキャン位置について個別画像(17)の回折構造が評価され、回折限界を超えて高められた解像度を有する試料(2)の画像が生成され、
ピクセル(25)を有し、個別画像(17)よりも大きい検出器アレイ(24)が提供され、
検出平面(18)からの個別画像の放射が非結像式に前記検出器アレイ(24)のピクセル(25)へ再分配され、
当該方法はさらに、以下の1)から5)の態様のうち1つまたは複数を有しており、すなわち、
1) 前記の再分配のために、少なくとも1つのさらなる再分配部材を設け、前記複数の再分配部材として、ファイバの数および/またはファイバの配置および/またはファイバ直径および/またはファイバ断面の形状に関して互いに相違するファイババンドルをそれぞれ用いる、
2) 前記の再分配のための再分配部材を、試料光を検出するために光軸へ入るように旋回挿入可能またはスライド挿入可能に配置する、
3) 前記の再分配のための再分配部材の取替および/または画像サイズを適合化するためのズーム光学系/集束光学系の調整および/または制御信号を用いた前記検出器アレイの個別ピクセルの統合による調整を制御ループで行う、
4) 前記の再分配のための再分配部材の取替および/または画像サイズを適合化するためのズーム光学系/集束光学系の調整および/または制御信号を用いた前記検出器アレイの個別ピクセルの統合による調整を制御ループで行い、前記調整は制御量として画像コントラストおよび/または画像鮮明度および/または信号/雑音比を含んでいる、
5) 前記検出器アレイに後置された評価回路は、前記検出器アレイの複数のチャネルのうちの一部のチャネルを選択的に読み出し、および/または、前記検出器アレイの複数のチャネルのうちの一部のチャネルを以後の処理のためにまとめる、
方法。 - 個別画像(17)の放射は、光ファイバ(21)からなるバンドル(20)によって再分配され、前記バンドルは、検出平面(18)に配置された入力部(22)および出力部(23)を有し、前記光ファイバ(21)が、前記出力部において前記入力部(22)とは幾何学的に相違するように配置され、前記検出器アレイ(24)のピクセル(25)のところで終わることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記光ファイバはマルチモード光ファイバである、請求項11に記載の方法。
- 前記光ファイバ(21)は、前記出力部(23)で隣接する光ファイバ(21)が前記入力部(22)でも隣接し、それにより相並んで位置するピクセル(25)の放射強度依存的なクロストークを最低限に抑えるように、前記入力部(22)から前記出力部(23)へ導かれることを特徴とする、請求項11または12に記載の方法。
- 各々の光ファイバ(21)には放射によって個々に照射され、前記出力部(23)で隣接する光ファイバ(21)に割り当てられたピクセル(25)の干渉信号が検出され、キャリブレーションマトリクスが作製され、これを用いて試料(2)の顕微鏡法において相並んで位置するピクセル(25)の放射強度依存的なクロストークが修正されることによって、前記光ファイバ(21)からなるバンドル(20)と前記検出器アレイ(24)がキャリブレーションされることを特徴とする、請求項10,11または12に記載の方法。
- 個別画像(17)の放射はそれぞれ異なって傾いたミラー部材(31)を備えるミラー(30)によって再分配され、前記ミラー(30)によって検出平面(18)からの放射が前記検出器アレイ(24)のピクセル(25)へと導かれ、前記検出器アレイ(24)のピクセル(25)は前記ミラー部材(31)の幾何学配置とは相違する幾何学配置を有していることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 検出器アレイ(24)として検出器ラインが使用されることを特徴とする、請求項10乃至15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出器ラインはAPDラインまたはPMTラインであることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 前記検出器アレイ(24)の個々のピクセル(25)の信号が相互相関により評価されることによって、点スポットまたは線スポット(14)のスキャンの移動方向が判定されることを特徴とする、請求項10乃至16のいずれか1項に記載の方法。
- 試料(2)で静止している点スポットまたは線スポット(14)で、回折限界の前記個別画像(17)の時間的変化が判定されて評価されることによって、前記試料(2)における変化が検出されることを特徴とする、請求項10乃至18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記評価回路はFPGAまたはマイクロコントローラである、請求項1に記載の顕微鏡。
- 前記評価回路はFPGAまたはマイクロコントローラである、請求項10に記載の方法。
- 前記顕微鏡はさらに、以下の1)から5)の構成のうち1つまたは複数を有しており、
1) 前記検出器アレイに前置された複数の再分配部材がさらに設けられていること、
2) 前記検出器アレイのピクセルの少なくとも一部について個々のピクセルにそれぞれ少なくとも2つの再分配部材からの放射が割り当てられていること、
3) 個々のピクセルのところでそれぞれ異なる再分配部材からの少なくとも2つの光ファイバが終わっていること、
4) 信号評価にあたって個別ピクセルの統合により前記検出器アレイの個別信号の数が減少していること、
5) 検出器ピクセルの読出しは、少なくとも部分的に試料光が照射される領域でのみ行われること、
請求項1に記載の顕微鏡。 - 前記方法は、さらに、以下の1)から5)の形態のうち1つまたは複数を有しており、
1) 前記検出器アレイに前置して複数の再分配部材がさらに設け、
2) 前記検出器アレイのピクセルの少なくとも一部について個々のピクセルにそれぞれ少なくとも2つの再分配部材からの放射を割り当て、
3) 個々のピクセルのところでそれぞれ異なる再分配部材からの少なくとも2つの光ファイバが終わり、
4) 信号評価にあたって個別ピクセルの統合により前記検出器アレイの個別信号の数が減少し、
5) 検出器ピクセルの読出しを、少なくとも部分的に試料光が照射される領域でのみ行う、
請求項10に記載の方法。
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