JP6449469B2 - トラン化合物 - Google Patents
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Description
本発明はトラン化合物に関する。また、本発明は前記トラン化合物によって修飾されてなるペプチド核酸に関する。また、本発明は前記ペプチド核酸を含むキットに関する。
遺伝子診断、オーダーメイド治療、テーラーメイド治療などに有用な情報を与えるとされる一塩基多形（ＳＮＰｓ）を検出するには、塩基対がマッチする際（完全な相補鎖を形成する際）に得られるＴｍ値と、塩基対がミスマッチする際（不完全な相補鎖を形成する際）に得られるＴｍ値との差分（以後、ΔＴｍ値とする）が大きい方が好ましいとされる。特にΔＴｍ値が１０℃以上の場合には、一塩基多型を基に遺伝子診断する際の誤診が１％未満と、優れた診断方法を提供することができることが知られている。
近年、核酸アナログの一種として知られるペプチド核酸が、その安定性の高さの観点から、着目を浴びている。このようなペプチド核酸を用いて一塩基多形を検出する技術の開発も進められている（非特許文献１および２）。
ペプチド核酸を用いた一塩基多型を検出する技術に関し、非特許文献２に示すようなペプチド核酸は、Ｎ末端から２番目にあたる標的ＤＮＡ鎖の塩基にミスマッチが存在する場合のΔＴｍ値が６．４℃以下程度と、一塩基多形を検出するのに十分なΔＴｍ値を示すものではない。
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（２０１２）９，６８５−６９３
Ｇ．Ｌ．ｌｇｌｏｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８），９５，８５６２−８５６７
本発明は、一塩基多型を検出するのに有効なペプチド核酸、特に、塩基対がマッチする際に得られるＴｍ値をより大きくすることができるペプチド核酸を提供することを目的とする。また、本願発明は、当該ペプチド核酸の製造に有用な中間体（製造原料）を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、Ｎ末端に特定のトラン化合物が結合してなるペプチド核酸を作製したところ、これが一塩基多型の検出に有用であることを見出した。本発明は、かかる知見を基に完成されたものであり、以下に示す態様の発明を包含する。
I．トラン化合物
(I-1) 下記式（１）
［式中、Ｒ１は、フェニル基またはナフチル基を示す。
該フェニル基は、同一または異なって、１〜５個の置換基を有していてもよい。
該ナフチル基は、同一または異なって、１〜７個の置換基を有していてもよい。］
で表されるトラン化合物。
(I-2) 前記置換基が電子吸引基である(I-1)に記載のトラン化合物。
(I-3) 前記電子吸引基が、シアノ基、ニトロ基、アシル基、ハロゲン基、トシル基、メシル基、およびフェニル基からなる群から選択される少なくとも一種である、(I-2)に記載のトラン化合物。
(I-1) 下記式（１）
該フェニル基は、同一または異なって、１〜５個の置換基を有していてもよい。
該ナフチル基は、同一または異なって、１〜７個の置換基を有していてもよい。］
で表されるトラン化合物。
(I-2) 前記置換基が電子吸引基である(I-1)に記載のトラン化合物。
(I-3) 前記電子吸引基が、シアノ基、ニトロ基、アシル基、ハロゲン基、トシル基、メシル基、およびフェニル基からなる群から選択される少なくとも一種である、(I-2)に記載のトラン化合物。
II．トラン化合物(I)の製造方法
(II-1) (I-1)に記載するトラン化合物(1)の製造方法であって、下記式（２）
［式中、Ｒ１は、(I-1)の記載に同じである。
Ｒ２は、カルボキシル基の保護基である。］で表される化合物（２）と、脱保護剤とを反応させる工程を含む方法。
(II-1) (I-1)に記載するトラン化合物(1)の製造方法であって、下記式（２）
Ｒ２は、カルボキシル基の保護基である。］で表される化合物（２）と、脱保護剤とを反応させる工程を含む方法。
(II-2) 前記(I-1)に記載する式（１）中のＲ１が有する置換基が、電子吸引基である、(II-1)に記載の製造方法。
(II-3) 前記電子吸引基が、シアノ基、ニトロ基、アシル基、ハロゲン基、トシル基、メシル基、およびフェニル基からなる群から選択される少なくとも一種である、(II-2)に記載の製造方法。
III．ペプチド核酸
(III-1) 下記式（３）
［式中、Ｒ１は、(I-1)に記載のとおりである。
Ｒ３は、ペプチド核酸残基を示す。］
で表される、トラン修飾されたペプチド核酸。
(III-1) 下記式（３）
Ｒ３は、ペプチド核酸残基を示す。］
で表される、トラン修飾されたペプチド核酸。
(III-2) 前記ペプチド核酸残基が、下記式（４）
［式中、Baseは、同一または異なって、それぞれアデニン、チミン、グアニン、シトシン、またはウラシルを示す。
ｎは、６〜２５の整数を意味する。］
で表される残基である、(III-1)に記載のペプチド核酸。
(III-3) 前記(I-1)に記載する式（１）中のＲ１が有する置換基が電子吸引基である(III-1)または(III-2)に記載のペプチド核酸。
(III-4) 前記電子吸引基が、シアノ基、ニトロ基、アシル基、ハロゲン基、トシル基、メシル基、およびフェニル基からなる群から選択される少なくとも一種である、(III-3)に記載のペプチド核酸。
(III-5) 前記ペプチド核酸酸基がアミノ酸残基および／またはスペーサーを含むものである、(III-1)〜(III-4)の何れか１項に記載のペプチド核酸。
(III-6) 化学修飾されてなる、(III-1)〜(III-5)の何れかに記載のペプチド核酸。
(III-7) 化学修飾が、アセチル化、ホルミル化、ミリストイル化、ピログルタミン酸化、アルキル化、グリコシル化、アミド化、アシル化、ヒドロキシル化、脱アミノ化、プレニル化、パルミトイル化、リン酸化、ビオチニル化、およびスクシンイミジル化からなる群より選択される、少なくとも一種である、(III-6)に記載のペプチド核酸。
ｎは、６〜２５の整数を意味する。］
で表される残基である、(III-1)に記載のペプチド核酸。
(III-3) 前記(I-1)に記載する式（１）中のＲ１が有する置換基が電子吸引基である(III-1)または(III-2)に記載のペプチド核酸。
(III-4) 前記電子吸引基が、シアノ基、ニトロ基、アシル基、ハロゲン基、トシル基、メシル基、およびフェニル基からなる群から選択される少なくとも一種である、(III-3)に記載のペプチド核酸。
(III-5) 前記ペプチド核酸酸基がアミノ酸残基および／またはスペーサーを含むものである、(III-1)〜(III-4)の何れか１項に記載のペプチド核酸。
(III-6) 化学修飾されてなる、(III-1)〜(III-5)の何れかに記載のペプチド核酸。
(III-7) 化学修飾が、アセチル化、ホルミル化、ミリストイル化、ピログルタミン酸化、アルキル化、グリコシル化、アミド化、アシル化、ヒドロキシル化、脱アミノ化、プレニル化、パルミトイル化、リン酸化、ビオチニル化、およびスクシンイミジル化からなる群より選択される、少なくとも一種である、(III-6)に記載のペプチド核酸。
IV．キット
(IV-1) (III-1)〜(III-7)に記載する少なくとも１つのペプチド核酸(3)を含む、キット。
(IV-2) 薬剤耐性菌、薬剤耐性ウイルス、および薬剤耐性マイコプラズマからなる群より選択される少なくとも一種を検出するために用いられる、(IV-1)に記載のキット。
(IV-3) 前記薬剤耐性ウイルスが、インフルエンザウイルスである、(IV-2)に記載のキット。
(IV-4) 前記インフルエンザウイルスが、オセルタミビル耐性である(IV-3)記載のキット。
(IV-1) (III-1)〜(III-7)に記載する少なくとも１つのペプチド核酸(3)を含む、キット。
(IV-2) 薬剤耐性菌、薬剤耐性ウイルス、および薬剤耐性マイコプラズマからなる群より選択される少なくとも一種を検出するために用いられる、(IV-1)に記載のキット。
(IV-3) 前記薬剤耐性ウイルスが、インフルエンザウイルスである、(IV-2)に記載のキット。
(IV-4) 前記インフルエンザウイルスが、オセルタミビル耐性である(IV-3)記載のキット。
ペプチド核酸(3)は、一塩基多型のミスマッチ検出に有用である。
上記ペプチド核酸(3)を含むキットは、一塩基多形のミスマッチ検出に基づいた遺伝子診断、オーダーメイド治療（テーラーメイド治療）などに有用である。
トラン化合物(1)は、ペプチド核酸(3)を製造するための原料（中間体）として有用である。
I. トラン化合物
トラン化合物(I1)とは、下記式（１）
で表される化合物である。
トラン化合物(I1)とは、下記式（１）
式（１）におけるＲ１は、フェニル基またはナフチル基を示す。
前記のフェニル基は、同一または異なって、１個、２個、３個、４個または５個の置換基を有していてもよい。
前記のナフチル基は、同一または異なって、１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個の置換基を有していてもよい。
前記の置換基を設ける位置は、特に限定はされない。例えば、前記のＲ１がフェニル基の場合、トラン構造に結合しているフェニル基に対して、オルト位、メタ位、および／またはパラ位に置換基を設けることができる。また、前記のＲ１がナフチル基の場合、トラン構造に結合しているナフチル基に対して、１位、２位、３位、４位、５位、６位、および／または７位に置換基を設けることができる。
これらの置換基を設ける位置の中でも、後述する実施例における本発明のトラン修飾されたペプチド核酸の有用性の観点から、前記のＲ１がフェニル基の場合であれば、パラ位に設けることが好ましく、前記のＲ１がナフチル基の場合であれば、４位に設けることが好ましい。
前記の置換基は、特に限定はされない。例えば、電子吸引基を挙げることができる。具体的な電子吸引基として、シアノ基、ニトロ基、アシル基、ハロゲン基、トシル基、メシル基、およびフェニル基からなる群から選択される少なくとも一種を例示することができる。
前記のＲ１がフェニル基である場合、隣接塩基との立体障害を避けスタッキング効果を高める観点からシアノ基、直鎖アルキニル基とすることが好ましく、シアノ基とすることがより好ましい。前記のＲ１がナフチル基である場合、接塩基との立体障害を避けスタッキング効果を高める観点からシアノ基、直鎖アルキニル基とすることが好ましく、シアノ基とすることがより好ましい。
II．トラン化合物(1)の製造方法
トラン化合物(1)の製造方法は、下記式（２）
で表される化合物（２）と、脱保護剤とを反応させることで、トラン化合物(1)を製造することができる。
トラン化合物(1)の製造方法は、下記式（２）
式（２）におけるＲ１は、上記のとおり、１〜５個の置換基を有していてもよいフェニル基または１〜７個の置換基を有していてもよいナフチル基である。
式（２）におけるＲ２は、カルボキシル基の保護基である。
カルボキシル基の保護基とは、特に限定されない。このような基として、例えば、アルキル基、ベンジル基、アリル基、およびシリル基などを挙げることができる。これらの保護基の中でも、エステルの安定性の観点から、アルキル基、アリル基が好ましく、アルキル基がより好ましい。アルキル基の中でもメチル基が最も好ましい。
脱保護剤としては特に限定されない。通常は、上記カルボキシル基の保護基を取り除くために用いられる公知の脱保護剤を採用することができる。具体的な脱保護剤として、例えば、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、トリフルオロ酢酸、パラジウム（Ｈ２／Ｐｄ−Ｃ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム、および酢酸などを挙げることができる。
このような脱保護剤の中でも、水酸化リチウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウムが好ましく、水酸化リチウムがより好ましい。
脱保護剤の使用量は特に限定されない。例えば、化合物（２）の使用量（１モル）に対して、通常は１モル当量〜５モル当量程度、好ましくは１．５モル当量〜４モル当量程度、さらに好ましくは２モル当量〜３モル当量程度の使用量を挙げることができる。
上記の脱保護反応の条件は、特に限定されない。例えば、カルボキシル基の保護基を取り除くために用いられる条件を適宜採用することができる。このような条件として、通常は、ＴＨＦなどの溶媒中で、０℃〜４０℃程度に適宜冷却または加温する条件を挙げることができる。
なお、目的の生成化合物を純度よく得るために、上記の反応終了後に、慣用の単離および／または精製工程を適宜組み合わせながら採用することができる。このような単離または精製工程として、例えば、クロマトグラフィー、再結晶、抽出、および蒸留などを挙げることができる。
上記の化合物（２）は、公知の化合物から公知の方法に準じて容易に製造される化合物である。例えば、公知のクロスカップリング反応の中でも、薗頭カップリング反応と呼ばれるクロスカップリング反応を、適宜改変しながら採用することにより、下記式（５）で表される化合物を出発原料として化合物（２）を製造することができる。
より具体的には、下記式（５）
で表される化合物（５）と、下記式（６）または下記式（７）
で表される、それぞれ化合物（６）または化合物（７）とを、パラジウム触媒、銅(I)化合物、および塩基の存在下で反応させる方法によって、化合物（２）を製造する方法を挙げることができる。
式（５）におけるＸは、ハロゲン原子を示す。
Ｘにて示すハロゲン原子とは、特に限定されない。例えば、塩素原子、臭素原子、フッ素原子またはヨウ素原子を挙げることができる。
式（５）におけるＲ２は、上記のとおり、カルボキシル基の保護基である。
式（５）におけるＲ２は、上記のとおり、カルボキシル基の保護基である。
式（６）および式（７）におけるＲ4は、同一または異なって、置換基を示す。このような置換基は、特に限定はされない。例えば、電子吸引基を挙げることができる。具体的な電子吸引基として、トリフルオロ基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、ハロゲン基、トシル基、メシル基、およびフェニル基からなる群から選択される少なくとも一種を例示することができる。
式（６）における電子吸引基として、隣接塩基対との立体障害を避ける観点からシアノ基、ハロゲン基、トリフルオロ基とすることが好ましく、シアノ基とすることがより好ましい。式（７）における電子吸引基として、隣接塩基対との立体障害を避ける観点からシアノ基、ハロゲン基、トリフルオロ基とすることが好ましく、シアノ基とすることがより好ましい。
式（６）における置換基の個数（ｍ）は、１、２、３、４または５とすることができる。また、このような置換基を設ける位置は、トラン構造に結合しているフェニル基に対して、オルト位、メタ位、および／またはパラ位とすることができる。
式（７）における置換基の個数（ｐ）は、１、２、３、４、５、６、または７とすることができる。また、このような置換基を設ける位置は、トラン構造に結合しているナフチル基に対して１位、２位、３位、４位、５位、６位、および／または７位とすることができる。
上記の置換基を設ける位置について、上記の通り、式（６）であれば、パラ位に設けることが好ましく、式（７）であれば、４位に設けることが好ましい。
パラジウム触媒とは、特に限定はされない。例えば、テトラクロロパラジウム（ＩＩ）ナトリウム、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化ビストリフェニルホスフィンパラジウム（ＩＩ）、酢酸パラジウム（ＩＩ）などを挙げることができる。これらのパラジウム触媒の中でも、反応性の観点から、テトラクロロパラジウム（ＩＩ）ナトリウム、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、が好ましく、テトラクロロパラジウム（ＩＩ）ナトリウムがより好ましい。
パラジウム触媒の使用量は特に限定されない。例えば、化合物（５）の使用量（１モル）に対して、通常は、０．００１モル当量〜０．５モル当量程度、好ましくは０．００５モル当量〜０．０５モル当量程度の使用量を挙げることができる。
銅(I)化合物も触媒として用いられ、特に限定はされない。例えば、塩化銅、臭化銅、およびヨウ化銅などのハロゲン化銅を挙げることができる。これらの銅(I)触媒の中でも、反応性の観点からヨウ化銅、臭化銅が好ましく、ヨウ化銅がより好ましい。
銅(I)化合物の使用量は特に限定されない。例えば、上記の化合物（５）の使用量（１モル）に対して、通常は、０．００１モル当量〜０．５モル当量程度、好ましくは０．００５モル当量〜０．０５モル当量程度の使用量を挙げることができる。
塩基とは特に限定はされない。例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン、ジエチルアミン、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）、水素化ナトリウムなどを挙げることができる。これらの塩基の中でも、反応性の観点から、トリエチルアミン、ジエチルアミンなどが好ましく、トリエチルアミンがより好ましい。
塩基の使用量は特に限定されない。例えば、化合物（５）の使用量（１モル）に対して、通常は１モル当量〜１０モル当量程度、好ましくは２モル当量〜４モル当量程度の使用量を挙げることができる。
化合物（６）の使用量も、化合物（７）の使用量も特に限定はされない。例えば、化合物（５）の使用量の１モルに対する化合物（６）または化合物（７）の使用割合として、通常は０．８モル当量〜５モル当量程度の使用量、好ましくは１モル当量〜１．５モル当量程度の使用量を挙げることができる。
なお、上記の銅(I)化合物およびパラジウム触媒とは別に、２−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ）−１−フェニルインドール（ＰＩｎｔＢ）などのその他の触媒を用い、これを塩基としてテトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）中で反応させることで、上記の化合物（２）を製造する反応効率を高めることができる。
このような、その他の触媒の使用量は特に限定されない。例えば、化合物（５）の使用量（1モル）に対して、通常は０．０１モル当量〜０．５モル当量程度の使用量、好ましくは０．１モル当量〜０．５モル当量程度の使用量を挙げることができる。
上記のクロスカップリング反応の条件は、特に限定されることはない。例えば、この種の反応に用られる条件を適宜採用することができる。このような条件として、通常は、アルゴン雰囲気下の水−アセトン混合溶媒、水−１，４−ジオキサン混合溶媒、水−テトラヒドロフラン混合溶媒、水−ジメトキシエタン混合溶媒、水−アセトニトリル混合溶媒、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、または水-テトラメチルエチレンジアミンなどの溶媒中で、３０℃〜８０℃程度に適宜冷却または加温する条件を挙げることができる。
なお、目的の生成化合物（２）を純度よく得るために、上記の反応終了後に、慣用の単離および／または精製工程を適宜組み合わせながら採用することができる。具体的な単離または精製工程として、例えば、クロマトグラフィー、再結晶、抽出、および蒸留などを挙げることができる。
上述の化合物（５）、化合物（６）、および化合物（７）は、それぞれ公知の化合物から公知の方法に準じて容易に製造される化合物である。例えば、化合物（５）は、下記に示す化合物（８）を出発原料として公知のクロスカップリング反応を適宜改変しながら採用することにより製造することができる。
具体的には、下記式（８）
で表される化合物（８）と、下記式（９）
で表される化合物（９）とを、塩基の存在下で反応させる方法により、上記の化合物（５）を製造することができる。
式（８）におけるＸは、式（５）に示すＸと同じである。
式（９）におけるＹは、ハロゲン原子である。
Ｙで示されるハロゲン原子は特に限定されない。例えば、塩素原子、臭素原子、フッ素原子またはヨウ素原子を挙げることができる。なお、ハロゲン原子（Ｘ）とハロゲン原子（Ｙ）は同一の原子とすることもできるし、また異なる原子とすることもできる。
塩基とは特に限定はされない。例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）水素化ナトリウムなどを挙げることができる。これらの塩基の中でも、反応性の観点から、トリエチルアミン、ジエチルアミンなどが好ましく、トリエチルアミンがより好ましい。
塩基の使用量は特に限定されない。例えば、化合物（８）の使用量（1モル）に対して、通常は１モル当量〜５モル当量程度、好ましくは１．５モル当量〜３モル当量程度の使用量を挙げることができる。
上記のクロスカップリング反応の条件は、特に限定されることはない。例えば、この種の反応において多用される条件を適宜採用することができる。このような条件として、通常はテトラヒドロフランなどの溶媒中で、当該溶媒の沸点以下の温度、例えば３０℃〜６６℃程度に適宜冷却または加温する条件を挙げることができる。
なお、目的の生成化合物を純度よく得るために、上記の反応終了後に、慣用の単離および／または精製工程を適宜組み合わせながら採用することができる。具体的な単離または精製工程として、例えば、クロマトグラフィー、再結晶、抽出、および蒸留などを挙げることができる。
III. ペプチド核酸
ペプチド核酸(3)とは、下記式（３）
で表される、トラン修飾されてなるペプチド核酸である。
ペプチド核酸(3)とは、下記式（３）
式（３）におけるＲ１は、上記のとおり、１〜５個の置換基を有していてもよいフェニル基または１〜７個の置換基を有していてもよいナフチル基である。
Ｒ３は、ペプチド核酸残基を示す。
ペプチド核酸残基とはペプチド核酸のＮ末端のアミド基から水素原子が除かれたものとすることができ、特に限定されない。
ペプチド核酸とはポリマーである。当該ポリマーを構成するモノマーは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルなどに代表される塩基を側鎖としてそれぞれに有するアミノ酸である。このようなアミノ酸とはアミノ基とカルボキシル基を有する化合物（広義のアミノ酸）とすることができる。そして、これらのモノマーがペプチド結合したポリマーが、上記のペプチド核酸である。
このようなペプチド核酸の重合数は特に限定はされない。例えば、６〜２５の何れかの整数とすることができる。好ましくは８〜２３の整数であり、より好ましくは１０〜２１の整数である。
前記モノマーに含まれる塩基は、同一であっても異なっていてもよい。よって、ペプチド核酸における塩基配列は特に限定されない。なお、上記のアミノ酸がペプチド結合した部分を、特に主鎖と呼ぶことがある。
このようなペプチド核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸、もしくはその他のペプチド核酸と、互いの塩基を通じて相補鎖を形成する性質を有する化合物である。好ましくは、二重らせん構造を形成しながら相補鎖を形成する性質を有する化合物である。
このようなペプチド核酸残基として、例えば、下記式（４）
で表される、ペプチド核酸残基を挙げることができる。
式（４）におけるBaseは、同一または異なって、それぞれアデニン、チミン、グアニン、シトシン、またはウラシルを示す。
式（４）におけるｎは、６〜２５の整数を意味する。好ましくは８〜２３の整数を意味する。より好ましくは１０〜２１の整数を意味する。
式（４）におけるBaseがアデニンの場合、下記式で表される基が結合する。
式（４）におけるBaseがチミンの場合、下記式で表される基が結合する。
式（４）におけるBaseがグアニンの場合、下記式で表される基が結合する。
式（４）におけるBaseがシトシンの場合、下記式で表される基が結合する。
式（４）におけるBaseがウラシルの場合、下記式で表される基が結合する。
上記のペプチド核酸残基には、アミノ酸残基および／またはスペーサー含むものとすることができる。すなわち、上記ペプチド核酸残基に、任意のアミノ酸残基および／またはｚ.スペーサーを結合させることができる。ここでの結合とは、ペプチド結合である。
上記のペプチド核酸残基に結合させる具体的なアミノ酸残基は特に限定されない。例えば、側鎖にアミノ基を有するリジン残基、ヒスチジン残基、またはアルギニン残基などが挙げられる。中でも、リジン残基を設けることが好ましい。ペプチド核酸残基に結合させるアミノ酸残基の個数は特に限定はされない。通常は、１〜１０個程度とすることができ、１〜５個程度とすることが好ましい。
上記のペプチド核酸残基に結合させるスペーサーは特に限定されない。例えば、カルボキシル基およびアミド基を有する化合物（いわゆる広義のアミノ酸）を挙げることができる。
具体的なスペーサーとして、下記式（１０）
表される化合物（１０）を挙げることができる。
更に、上記の化合物をモノマーとするオリゴマーまたはポリマーも、上記のスペーサーとすることができる。
上記のスペーサーとして挙げるオリゴマーまたはポリマーの重合数は特に限定されない。例えば２〜１００程度とすることができ、好ましくは２〜５０個程度、より好ましくは２〜１０個程度、更に好ましくは２〜５個程度であり、２個が最も好ましい。
上記のペプチド核酸残基に結合させるアミノ酸残基またはスペーサーの位置は特に限定はされない。通常は、ペプチド核酸残基の内部またはＣ末端に設けることができる。中でもペプチド核酸残基のＣ末端に設けることが好ましい。
上記のペプチド核酸残基に結合させるアミノ酸残基および／またはスペーサーは、それぞれがペプチド結合により重合した態様にてペプチド核酸残基に結合していてもよく、別個に結合していてもよい。中でも、重合して（すなわちオリゴマーまたはポリマーの態様で）ペプチド核酸残基に結合していることが好ましく、オリゴマーまたはポリマーがアミノ酸残基にペプチド結合により挟まれた態様でペプチド核酸残基に結合することが最も好ましい。
上記のペプチド核酸(3)は、化学修飾されてなるものを包含することができる。具体的な化学修飾として、アセチル化、ホルミル化、ミリストイル化、ピログルタミン酸化、アルキル化、グリコシル化、アミド化、アシル化、ヒドロキシル化、脱アミノ化、プレニル化、パルミトイル化、リン酸化、ビオチニル化およびスクシンイミジル化などが挙げられる。これらのペプチド核酸(3)に対して施される化学修飾は、１種類に限らず２種類以上が施されていてもよい。上記の化学修飾の中でも、アセチル化、アルキル化、グリコシル化、ビオチニル化などが好ましく、ビオチニル化が最も好ましい。また、２種以上を組み合わせる場合は、少なくともビオチニル化が含まれていることが好ましい。
上記の化学修飾を施す位置は特に限定はされない。例えば、上記のようなペプチド核酸残基に設けるアミノ酸残基に対して施されることが好ましい。
（製造方法）
ペプチド核酸(3)の製造方法は特に限定されない。例えば、Fmoc固相合成法により、ペプチド核酸を構成する下記式で表される各種の塩基を原料として、ペプチド核酸残基（PNAオリゴマー）を合成する。次いで、合成したペプチド核酸残基のＮ末端またはＣ末端に、下記製造例１で製造する各トラン化合物１〜６を原料に、固相合成法によって脱水縮合的にペプチド結合を介して原料化合物を導入することにより、ペプチド核酸(3)を製造することができる。詳細な製造方法は、後述する製造例２において説明する。
ペプチド核酸(3)の製造方法は特に限定されない。例えば、Fmoc固相合成法により、ペプチド核酸を構成する下記式で表される各種の塩基を原料として、ペプチド核酸残基（PNAオリゴマー）を合成する。次いで、合成したペプチド核酸残基のＮ末端またはＣ末端に、下記製造例１で製造する各トラン化合物１〜６を原料に、固相合成法によって脱水縮合的にペプチド結合を介して原料化合物を導入することにより、ペプチド核酸(3)を製造することができる。詳細な製造方法は、後述する製造例２において説明する。
本発明のペプチド核酸（3）は、後述する実施例に示すように、一塩基ミスマッチ配列に対する非特異的な二重鎖形成を抑制し、目的となる対象とする塩基配列に対して、より高い配列特異性を有するものである。このため、隣接する塩基対のマッチ、ミスマッチを厳密に識別できる、遺伝子配列診断に有用な分子として利用することができる。
つまり、本発明のペプチド核酸（3）によれば、一塩基変異をより厳密に検出（SNPsの検出）することが可能となり、この手法を利用することでより精度の高い測定方法や診断方法を提供することが可能になる。
VI. キット
キットは、上記のペプチド核酸(3)を含む。ペプチド核酸(3)の中でも、そのＣ末端にリジン残基を有し、且つ該リジン残基のε−アミノ基に対してビオチンが結合したビオチニル化ペプチド核酸であることが好ましい。
キットは、上記のペプチド核酸(3)を含む。ペプチド核酸(3)の中でも、そのＣ末端にリジン残基を有し、且つ該リジン残基のε−アミノ基に対してビオチンが結合したビオチニル化ペプチド核酸であることが好ましい。
キットに含まれるペプチド核酸(3)以外の構成物は特に限定はされない。例えば、免疫クロマトグラフ（ＩＣＡ）法に基づいたキットを製造する際に必要となる各種部材が設けられたテストストリップなどを挙げることができる。このような部材として、通常は、試料滴下部（サンプルパッドとも呼ばれる）、標識抗体含有部（コンジュゲートパッドとも呼ばれる）、検出部（判定部とも呼ばれる）、コントロール部、吸収部などを挙げることができる。
テストストリップに設ける上記の各部材は、ニトロセルロース、ラテックスなどの当該分野にて通常に用いられる素材とすることができる。また、上記の各部材の配置は、当該分野で通常に用いられる技術を基に決定することができる。また、各部材に含有されるべき物質も、当該分野で通常に用いられる技術を基に決定することができる。
例えば、検出部には検出対象物質と本発明のペプチド核酸(3)とを構成成分として含む複合体を補捉するための物質が設けられていることが好ましい。具体的には、ビオチニル化ペプチド核酸を用いる場合であれば、前記複合体を効率的に補捉するために、ビオチンと効率的に結合することが知られる、抗ビオチン抗体またはアビジン化合物を検出部に設けることが好ましい。
キットの用途は、特に限定はされない。例えば、薬剤耐性菌、薬剤耐性ウイルス、薬剤耐性原虫、および薬剤耐性マイコプラズマなどの有無を検出する用途に好適に用いることができる。
薬剤耐性菌は特に限定はされない。例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、バンコマイシン低度耐性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）、多剤耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、カルバパネム耐性緑膿菌、多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）、多剤耐性結核菌（ＭＤＲ−ＴＢ）、超多剤耐性結核菌（ＸＤＲ−ＴＢ）、ペニシリン耐性肺炎球菌（ＰＲＳＰ）、カルバパネム耐性肺炎桿菌、剤耐性肺炎桿菌、多剤耐性アシネトバクター（ＭＤＲＡ）、カルバパネム耐性大腸菌、セファロスポリン耐性大腸菌、ＮＤＭ−１産生多剤耐性菌、カルバペネム耐性腸内細菌（ＣＲＥ）、セファロスポリン耐性腸内細菌、βラクタマーゼ産生菌インフルエンザ菌（ＢＬＰＡＲ）、βラクタマーゼ陰性アンピシリン耐性インフルエンザ菌（ＢＬＮＡＲ）、およびペニシリナーゼ産生淋菌（ＰＰＮＧ）などを挙げることができる。
薬剤耐性ウイルスは特に限定されない。例えば、アマンタジン耐性インフルエンザウイルス、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルス、および薬剤耐性ヒト免疫不全ウイルスなどを挙げることができる。
薬剤耐性原虫とは特に限定されない。例えば、クロロキン耐性マラリアなどを挙げることができる。
薬剤耐性マイコプラズマは特に限定されない。例えば、マクロライド耐性マイコプラズマを挙げることができる。
なお、上記の薬剤耐性菌、薬剤耐性ウイルス、薬剤耐性原虫、および薬剤耐性マイコプラズマの薬剤への耐性の度合いは特に限定されない。また多剤耐性を検出するためには、ペプチド核酸(3)の種類を検出を所望する各耐性薬剤に応じて適宜選択すればよい。
本発明のキットの用途として挙げた、上記の薬剤耐性菌、薬剤耐性ウイルス、および薬剤耐性マイコプラズマの有無の検出のうち、薬剤耐性ウイルスの検出が好ましい。中でも、薬剤耐性インフルエンザウイルスの検出が好ましく、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスの検出が最も好ましい。
これらの検出は、生体から採取した検体（例えば、スワブなどの粘膜組織や血液など）に含まれるＤＮＡまたはＲＮＡと、本発明のペプチド核酸(3)との相補鎖の形成に有無に基づいて判断することができる。このような相補鎖の形成は、相補鎖の配列中のＣＧ含量を基に算出したＴｍ値を参考にした温度条件の下で実施することができる。
よって、上記のように相補鎖を形成させた後に、これを上記に説明したペプチド核酸(3)以外のキットの構成物（例えば、テストストリップなど）に供することによって、キットの一つの使用態様である薬剤耐性菌、薬剤耐性ウイルス、薬剤耐性原虫、および薬剤耐性マイコプラズマなどの有無の検出を実施することができる。ただし、相補鎖の形成後のサンプルは、急冷しないことが好ましい。
このような有無の検出は、検出部に標識抗体によるシグナルが確認できた場合に、薬剤耐性菌、薬剤耐性ウイルス、薬剤耐性原虫、および薬剤耐性マイコプラズマなどが存在すると判断することができる。
以下に、本発明をより詳細に説明するための実施例を示す。なお、本発明が以下に示す実施例に限定されないのは言うまでもない。
製造例
＜製造例１：トラン化合物＞
以下の製造例１では、特に記述がない限り、市販の化合物をそのまま精製せずに使用した。また、反応溶媒は特に記述が無い限り、市販の脱水された溶媒を使用した。化合物の精製に用いたカラムクロマトグラフィー用シリカゲルには特に記述がない限り、関東化学60N(球状、中性)40-50μmを使用した。TLCプレートはMERCK Silicagel(60 F254)を使用した。
＜製造例１：トラン化合物＞
以下の製造例１では、特に記述がない限り、市販の化合物をそのまま精製せずに使用した。また、反応溶媒は特に記述が無い限り、市販の脱水された溶媒を使用した。化合物の精製に用いたカラムクロマトグラフィー用シリカゲルには特に記述がない限り、関東化学60N(球状、中性)40-50μmを使用した。TLCプレートはMERCK Silicagel(60 F254)を使用した。
生成物の解析には以下の装置を使用した。
・核磁気共鳴スペクトル：日本電子 JML-LA-400(H1：400MHz；C13：100MHz)
日本電子 JML-LA-600(H1：600MHz；C13：150MHz)
・質量スペクトル ：日本電子 JMS-T100LC(ESI-TOF-HRMS)
・核磁気共鳴スペクトル：日本電子 JML-LA-400(H1：400MHz；C13：100MHz)
日本電子 JML-LA-600(H1：600MHz；C13：150MHz)
・質量スペクトル ：日本電子 JMS-T100LC(ESI-TOF-HRMS)
H1-NMRの化学シフトは、テトラメチルシラン(0.00ppm)、クロロホルム(7.24ppm)、ジメチルスルホキシド(2.50ppm)を内部標準とした。また、C13-NMRの場合の化学シフトは、テトラメチルシラン(0.00ppm)、クロロホルム(77.0ppm)、ジメチルスルホキシド(39.7ppm)を内部標準とした。
製造例１−１ トラン化合物１：3-(4-(phenylethynyl)phenyl)propanoic acid
下記式で表されるトラン化合物1を製造した。以下に詳細な製造方法を示す。
下記式で表されるトラン化合物1を製造した。以下に詳細な製造方法を示す。
化合物[1] methyl 3-(4-bromophenyl)propanoate
上記の反応スキームに従って、化合物[1]を製造した。以下に詳細を示す。
反応容器に、40mLのメタノールを加え、Ar雰囲気下で0℃に冷却した。ここに、3.8mLの塩化アセチル（41.9mmol）を滴下し、10分間、0℃で撹拌した。次いで、4.0gの3-(4-bromophenyl) propanoic acid(52.4mmol）を加えた後、室温で２時間撹拌した。反応溶液を炭酸カリウムで中和した後、溶媒を減圧下で留去した。次いで、残渣を酢酸エチルと水で分配し、有機層を食塩水 (Brine)で洗浄した後、硫酸マグネシウムを加え乾燥し、次いで溶媒を減圧下で留去することで、目的物である4.35gのmethyl 3-(4-bromophenyl)propanoateを得た （収率：quant）。得られた化合物[1]は次のステップに使用した。
化合物[1]の物性値は以下のとおりである。
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.42-7.39(m, 2H), 7.09-7.06(m, 2 H), 3.66(s, 3H), 2.90(t, 2H), 2.61(t, 2H)
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.42-7.39(m, 2H), 7.09-7.06(m, 2 H), 3.66(s, 3H), 2.90(t, 2H), 2.61(t, 2H)
化合物[2] methyl 3-(4-((trimethylsilyl)ethynyl)phenyl) propanoate
上記の反応スキームに従って、化合物[2]を製造した。以下に詳細を示す。
反応容器に、上記の1.0gのmethyl 3-(4-bromophenyl)propanoate（4.11mmol）を加え、7mLのDMFに溶かした。ここに、156mgのヨウ化銅（0.82mmol）、1.2mLのTriethylamine（8.23mmol）、475mgのTetrakis(triphenylphosphine)palladium(0)（Pd(PPh3)4：0.41mmol）、および0.74mLのTMSA（5.35mmol）を順に加えた後、Ar雰囲気下80℃で撹拌した。
TLCにて原料の消失が確認された後、反応溶液をセライトろ過し、酢酸エチル:ヘキサン=10:1の混合溶媒を加え、塩化アンモニウム水溶液で2回、食塩水(Brine)で1回洗浄した。次いで、これを硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下で留去することで、目的の化合物である740mgのmethyl 3-(4-((trimethylsilyl)ethynyl)phenyl) propanoateを得た。得られた化合物[2]は次のステップに用いた。
化合物[3] methyl 3-(4-ethynylphenyl)propanoate
上記の反応スキームに従って、化合物[3]を製造した。以下に詳細を示す。
反応容器に、上記の740mgのmethyl 3-(4-((trimethylsilyl)ethynyl)phenyl) propanoate、10mLのメタノール、および780mgの炭酸カリウムを加え、室温で撹拌した。TLCにて原料の消失が確認できた後、反応溶液に水を加え、酢酸エチルで3回抽出した。有機層を合わせて食塩水(Brine)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下で留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（Hexane:AcOEt=5:1(v/v)）で精製し、目的物である243mgのmethyl 3-(4-ethynylphenyl) propanoateを得た（収率31%：over 2 steps）。得られた化合物[3]は次のステップに使用した。
化合物[3]の物性値は以下のとおりである。
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.40(d, 2H), 7.14(d, 2 H), 3.64(s, 3H), 3.06(s, 1H) 2.90(t, 2H), 2.61(t, 2H)
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.40(d, 2H), 7.14(d, 2 H), 3.64(s, 3H), 3.06(s, 1H) 2.90(t, 2H), 2.61(t, 2H)
化合物[4] methyl 3-(4-(phenylethynyl)phenyl) propanoate
上記の反応スキームに従って、化合物[4]を製造した。以下に詳細を示す。
反応容器に、上記の243mgのmethyl 3-(4-ethynylphenyl) propanoate（1.29mmol）を加え、7mLのDMFに溶かした。ここに、156mgのヨウ化銅(0.82mmol)、1.2mLのTEA(8.23mmol)、475mgのTetrakis(triphenylphosphine)palladium(0) （Pd(PPh3)4：0.41mmol）、および0.74mLのTMSA(5.35mmol)を順に加えた後、Ar雰囲気下80℃で撹拌した。
TLCにて原料の消失が確認された後、反応溶液をセライトろ過し、酢酸エチル:ヘキサン=10:1の混合溶媒を加え、塩化アンモニウム水溶液で２回、食塩水(Brine)で1回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで溶媒を減圧下で留去することで、目的物である308mgのmethyl 3-(4-(phenylethynyl)phenyl) propanoateを得た（収率：90%）。得られた化合物[4]は次のステップに使用した。
化合物[4]の物性値は以下のとおりである。
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.51-7.49(m, 2H), 7.43(d, 2 H), 7.30-7.26(m, 3H), 7.12(d, 2H), 3.60(s, 3H), 2.89(t, 2H), 2.56(t, 2H)
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.51-7.49(m, 2H), 7.43(d, 2 H), 7.30-7.26(m, 3H), 7.12(d, 2H), 3.60(s, 3H), 2.89(t, 2H), 2.56(t, 2H)
トラン化合物１； 3-(4-(phenylethynyl)phenyl) propanoic acid
上記の反応スキームに従って、トラン化合物１を製造した。以下に詳細を示す。
反応容器に、上記のmethyl 3-(4-(phenylethynyl)phenyl) propanoateを308mg（1.17mmol）および5mLのTHFを加えて撹拌した。3mLの精製水に溶かした98mgの水酸化リチウム一水和物（2.33mmol）を反応溶液に加え、室温で撹拌した。
TLCで原料の消失が確認された後、反応液に水を加え、３％の塩酸水溶液を加えてpH<1に調整した。反応液を酢酸エチルで３回抽出し、有機層を合わせて食塩水(Brine)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下で留去することで、最終目的物である248mgの3-(4-(phenylethynyl)phenyl) propanoic acid（トラン化合物１）を得た（収率：85%）。
トラン化合物１の物性値は以下のとおりである。
H1-NMR(400MHz, DMSO-d6) : 7.53-7.50(m, 2H), 7.55(d, 2 H), 7.35-7.30(m, 3H), 7.18(d, 2H), 2.95(t, 2H), 2.68(t, 2H) ESI HRMS m/z 〔M+Na〕+ calcd 273.0891, found 273.0889
H1-NMR(400MHz, DMSO-d6) : 7.53-7.50(m, 2H), 7.55(d, 2 H), 7.35-7.30(m, 3H), 7.18(d, 2H), 2.95(t, 2H), 2.68(t, 2H) ESI HRMS m/z 〔M+Na〕+ calcd 273.0891, found 273.0889
製造例１−２ トラン化合物２：4-(4-(phenylethynyl)phenyl)butanoic acid
下記式で表されるトラン化合物２を製造した。以下に詳細な製造方法を示す。
下記式で表されるトラン化合物２を製造した。以下に詳細な製造方法を示す。
化合物［5］ methyl 4-(4-bromophenyl)butanoate
上記の反応スキームに従って、化合物[5]を製造した。以下に詳細を示す。
反応容器に、30mLのメタノールを加えてAr雰囲気下で0℃に冷却した。ここに、1.8mLの塩化アセチル（24.7mmol）を滴下し、10分間0℃で撹拌した。次いで、2.0gの4-(4-bromophenyl)butanoic acid（8.23mmol）を加えた後、室温で２時間撹拌した。
反応溶液を炭酸カリウムで中和した後、溶媒を減圧下で留去した。次いで、残渣を酢酸エチルと水で分配し、有機層を食塩水(Brine)で洗浄した後、硫酸マグネシウムを加え乾燥し、溶媒を減圧下で留去し、目的物である2.12gのmethyl 4-(4-bromophenyl)butanoateを得た（収率：quant）。得られた化合物[5]は次のステップに使用した。
化合物[5]の物性値は以下のとおりである。
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.41(d, 2H), 7.05(d, 2H), 3.67(s, 3H), 2.60(t, 2H), 2.32(t, 2H), 1.93(q, 2H)
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.41(d, 2H), 7.05(d, 2H), 3.67(s, 3H), 2.60(t, 2H), 2.32(t, 2H), 1.93(q, 2H)
化合物[6] methyl 4-(4-(phenylethynyl)phenyl)butanoate
上記の反応スキームに従って、化合物[6]を製造した。以下に詳細を示す。
反応容器に、上記の1.0gのmethyl 4-(4-bromophenyl)butanoate(3.89mmol)を加え、6mLのTMEDAおよび1mL精製水の混合溶媒に溶かした。ここに、10mgのNa2PdCl4（0.04mmol）、14mgのヨウ化銅（0.07mmol）、28mgの2-(di-tert-butylphosphino)-N-phenylindole（PintB；0.07mmol）、および0.4mLのEthynylbenzene(3.53mmol)を順に加えた後、80℃のAr雰囲気下で撹拌した。
TLCにて原料の消失が確認された後、反応液に水を加え、酢酸エチルで3回抽出した。有機層を合わせて飽和塩化アンモニウム水溶液で２回洗浄し、食塩水(Brine)で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下で留去した。
次いで、残渣をカラムクロマトグラフィー（hexane:AcOEt=4:1(v/v)）で精製することで、目的物である745mgのmethyl 4-(4-(phenylethynyl)phenyl)butanoateを得た（収率：71%）。得られた化合物[6]は次のステップに使用した。
化合物[6]の物性値は以下のとおりである。
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.51-7.49(m, 2H), 7.43(d, 2H), 7.27-7.24(m, 3H), 7.08(d, 2H), 3.58(s, 3H), 2.56(t, 2H), 2.24(t, 2H), 1.87(q, 2H)
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.51-7.49(m, 2H), 7.43(d, 2H), 7.27-7.24(m, 3H), 7.08(d, 2H), 3.58(s, 3H), 2.56(t, 2H), 2.24(t, 2H), 1.87(q, 2H)
トラン化合物２； 4-(4-(phenylethynyl)phenyl)butanoic acid
上記の反応スキームに従って、トラン化合物２を製造した。以下に詳細を示す。
反応容器に、上記の745mgのmethyl 4-(4-(phenylethynyl)phenyl)butanoate （2.68mmol）および13mLのTHFを加えて撹拌した。反応液に精製水5mLに溶かした225mgの水酸化リチウム一水和物を加え、室温で撹拌した。
TLCで原料の消失が確認された後、反応液に水を加え、３％の塩酸水溶液を加えてpH<1に調整した。反応液を酢酸エチルで３回抽出し、有機層を合わせて食塩水(Brine)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下で留去することで最終目的物である700mgの(4-(4-(phenylethynyl)phenyl)butanoic acid（トラン化合物２)を得た(収率：99%)。
トラン化合物２の物性値は以下のとおりである。
H1-NMR(400MHz, DMSO-d6) : 7.56-7.54(m, 2H), 7.48(d, 2H), 7.44-7.41(m, 3H), 7.26(d, 2H), 2.63(t, 2H), 2.23(t, 2H), 1.81(q, 2H) ESI HRMS m/z 〔M+Na〕+ calcd 287.1043, found 287.1040
H1-NMR(400MHz, DMSO-d6) : 7.56-7.54(m, 2H), 7.48(d, 2H), 7.44-7.41(m, 3H), 7.26(d, 2H), 2.63(t, 2H), 2.23(t, 2H), 1.81(q, 2H) ESI HRMS m/z 〔M+Na〕+ calcd 287.1043, found 287.1040
製造例１−３ トラン化合物３：5-(4-(phenylethynyl)phenyl)pentanoic acid
下記式で表されるトラン化合物３を製造した。
下記式で表されるトラン化合物３を製造した。
化合物[7] 5-(4-iodophenyl)pentanoic acid
上記の反応スキームに従って、化合物[7]を製造した。以下に詳細を示す。
反応容器に、1.0gの5-phenylpentanoic acid（5.61mmol）、260mgのH5IO6（1.12mmol）、280mgのヨウ素(2.24mmol)、0.2mLの硫酸(10M)、6mLの氷酢酸、および1.2mLの精製水を加え、Ar雰囲気下75℃で18時間撹拌させた。
反応溶液を室温まで冷ました後に精製水を加え、クロロホルムで３回抽出した。有機層を合わせてチオ硫酸ナトリウム水溶液で2回、食塩水(Brine)で1回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下で留去した。
残渣を微量のクロロホルムに溶かし、ここにヘキサンを加えて再結晶させることで、目的物である405mgの5-(4-iodophenyl)pentanoic acidを得た（収率：24%）。得られた化合物[7]は次のステップに使用した。
化合物[7]の物性値は以下のとおりである。
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.59(d,2H), 6.93(d, 2H), 2.59(t, 2H), 2.38(t, 2H), 1.65(q, 4H)。
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.59(d,2H), 6.93(d, 2H), 2.59(t, 2H), 2.38(t, 2H), 1.65(q, 4H)。
上記の反応スキームに従って、化合物[8]を製造した。以下に詳細を示す。
反応容器に、5mLのメタノールを加えてAr雰囲気下で0℃に冷却した。塩化アセチル(0.3mL, 4.00mmol)を滴下し、10分間0℃で撹拌した。ここに、上記の405mgの5-(4-iodophenyl)pentanoic acid(1.33mmol)を加えた後、室温２時間撹拌した。
次いで、炭酸カリウムで反応溶液を中和した後、溶媒を減圧下で留去した。残渣を酢酸エチルと水で分配し、有機層を食塩水(Brine)で洗浄した後、硫酸マグネシウムを加え乾燥し、溶媒を減圧下で留去することで、目的物である445mgのmethyl 5-(4-iodophenyl)pentanoateを得た（収率：quant）。得られた化合物[8]は次のステップに使用した。
化合物[8]の物性値は以下のとおりである。
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.55(d,2H), 6.89(d, 2H), 3.63(s, 3H), 2.54(t, 2H), 2.30(t, 2H), 1.62(m, 4H)
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.55(d,2H), 6.89(d, 2H), 3.63(s, 3H), 2.54(t, 2H), 2.30(t, 2H), 1.62(m, 4H)
化合物[9] methyl 5-(4-(phenylethynyl)phenyl)pentanoate
上記の反応スキームに従って、化合物[9]を製造した。以下に詳細を示す。
反応容器に、上記の445mgのmethyl 5-(4-iodophenyl)pentanoate（1.40mmol）を加え、2.5mLのTMEDAおよび0.3mLの精製水の混合溶媒に溶かした。ここに3.7mg Disodium tetrachloropalladate(Na2PdCl4,：0.01mmol)、5.0mgのCuI（0.2mmol）、10mgの2-(di-tert-butylphosphino)-N-phenylindole(PintB；0.02mmol)、および0.14mLのEthynylbenzene(1.30mmol)を順に加えた後、80℃のAr雰囲気下で撹拌した。
TLCにて原料の消失が確認された後、反応溶液に水を加え、酢酸エチルで3回抽出した。有機層を合わせて飽和塩化アンモニウム水溶液で２回洗浄し、食塩水(Brine)で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下で留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(hexane:AcOEt=4:1(v/v))で精製することで、目的物である395mgのmethyl 5-(4-(phenylethynyl)phenyl)pentanoateを得た（収率：97%)。得られた化合物[9]は次のステップに使用した。
化合物[9]の物性値は以下のとおりである。
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.51-7.49(m, 2H), 7.43(d、2H), 7.31-7.27(m, 3H), 7.10(d, 2H), 3.61(s, 3H), 2.57(t, 2H), 2.28(t, 2H), 1.61(q, 4H)
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.51-7.49(m, 2H), 7.43(d、2H), 7.31-7.27(m, 3H), 7.10(d, 2H), 3.61(s, 3H), 2.57(t, 2H), 2.28(t, 2H), 1.61(q, 4H)
トラン化合物３；5-(4-(phenylethynyl)phenyl)pentanoic acid
上記の反応スキームに従って、トラン化合物３を製造した。以下に詳細を示す。
反応容器に、上記の395mgのmethyl 5-(4-(phenylethynyl)phenyl)pentanoate（1.35mmol）および7mLのTHFを加えて撹拌した。反応溶液に3mL精製水に溶かした113mgの水酸化リチウム一水和物(2.70mmol）を加え、室温で撹拌した。
TLCで原料の消失が確認された後、反応液に水を加え、３％の塩酸水溶液を加えてpH<1に調整した。反応液を酢酸エチルで３回抽出し、有機層を合わせて食塩水(Brine)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで溶媒を減圧下で留去することで、最終目的物である306mgの(5-(4-(phenylethynyl)phenyl)pentanoic acid（トラン化合物３）を得た（収率：81%）。
トラン化合物３の物性値は以下のとおりである。
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.53-7.51(m, 2H), 7.45(d、2H), 7.35-7.32(m, 3H), 7.15(d, 2H), 2.64(t, 2H), 2.38(t, 2H), 1.69(q, 4H) ESI HRMS m/z 〔M+Na〕+ calcd 301.1199, found 301.1198
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.53-7.51(m, 2H), 7.45(d、2H), 7.35-7.32(m, 3H), 7.15(d, 2H), 2.64(t, 2H), 2.38(t, 2H), 1.69(q, 4H) ESI HRMS m/z 〔M+Na〕+ calcd 301.1199, found 301.1198
製造例１−４ トラン化合物４：2-(4-(phenylethynyl)phenethoxy)acetic acid
下記式で表されるトラン化合物４を製造した。
下記式で表されるトラン化合物４を製造した。
化合物[10] ethyl 2-(4-bromophenethoxy)acetate
上記の反応スキームに従って、化合物[10]を製造した。以下に詳細を示す。
反応容器に、220mgのNaH（in 60% mineral oil；5.47mmol）を加え、これを氷冷下で15mLのTHFに懸濁し、ここに1.0gの2-(4-bromophenyl)ethan-1-ol（4.97mmol）を少しずつ加え、30分撹拌した。
ここに、0.5mLのethyl 2-bromoacetate（4.48mmol）を滴下し、反応液を室温に戻して２時間撹拌した。さらに、これに20mLの水を加え、酢酸エチルで分配した後、水層を酢酸エチルで3回抽出した。有機層を合わせて食塩水(Brine)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下で留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（Hexane:EtOAc=10:1(v/v)）で精製することで、目的物である785mgのethyl 2-(4-bromophenethoxy)acetateを得た（収率：55%）。得られた化合物[10]は次のステップに使用した。
化合物[10]の物性値は以下のとおりである。
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.35(d, 2H), 7.09(d, 2H), 4.15(t, 2H), 4.02(s, 2H), 3.69(t, 2H), 2.84(t, 2H), 1.22(t, 3H)
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.35(d, 2H), 7.09(d, 2H), 4.15(t, 2H), 4.02(s, 2H), 3.69(t, 2H), 2.84(t, 2H), 1.22(t, 3H)
化合物[11] ethyl 2-(4-(phenylethynyl)phenethoxy)acetate
上記の反応スキームに従って、化合物[11]を製造した。以下に詳細を示す。
反応容器に、上記の785mgのethyl 2-(4-bromophenethoxy)acetate（2.73mmol）を加え、5mLのTMEDAおよび0.5mL精製水の混合溶媒に溶かした。ここに、7.3mgのDisodium tetrachloropalladate（Na2PdCl4：0.02mmol）、9.5mgのCuI（0.05mmol）、20mgの2-(di-tert-butylphosphino)-N-phenylindole（PintB：0.05mmol）、および0.27mLのEthynylbenzene（2.49mmol）を順に加えた後、80℃のAr雰囲気下で撹拌した。
TLCにて原料の消失が確認された後、反応液に水を加え、酢酸エチルで３回抽出した。次いで、有機層を合わせて飽和塩化アンモニウム水溶液で２回洗浄し、食塩水(Brine)で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下で留去した。
残渣をカラムクロマトグラフィー(hexane:AcOEt=4:1(v/v))で精製することで、目的物である676mgのethyl 2-(4-(phenylethynyl)phenethoxy)acetate)を得た（収率80%）。得られた化合物[11]は次のステップに使用した。
化合物[11]の物性値は以下のとおりである。
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.52-7.45(m, 4H), 7.30-7.18(m, 5H), 4.15(q, 2H), 4.02(s, 2H), 3.69(t, 2H), 2.84(t, 2H), 1.22(t, 3H)
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.52-7.45(m, 4H), 7.30-7.18(m, 5H), 4.15(q, 2H), 4.02(s, 2H), 3.69(t, 2H), 2.84(t, 2H), 1.22(t, 3H)
トラン化合物４；2-(4-(phenylethynyl)phenethoxy)acetic acid
上記の反応スキームに従って、トラン化合物４を製造した。以下に詳細を示す。
反応容器に、上記の676mgのethyl 2-(4-(phenylethynyl)phenethoxy)acetate（2.19mmol）および8mLのTHFを加えて撹拌した。4mLの精製水に溶かした185mgの水酸化リチウム一水和物（4.38mmol）を反応溶液に加え、室温で撹拌した。
TLCで原料の消失が確認された後、反応容器に水を加え、ここに３％の塩酸水溶液を加えてpH<1に調整した。反応液を酢酸エチルで３回抽出し、有機層を合わせて食塩水(Brine)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで溶媒を減圧下で留去することで、最終目的物である583mgの(2-(4-(phenylethynyl) phenethoxy)acetic acid（トラン化合物４)を得た（収率：95%）。
トラン化合物４の物性値は以下のとおりである。
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.53-7.50(m, 2H), 7.46(d, 2H), 7.35-7.31(m, 3H), 7.21(d, 2H), 4.12(s, 2H), 3.77(t, 2H), 2.95(t, 2H) ESI HRMS m/z 〔M+Na〕+ calcd 289.0835, found 289.0827
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.53-7.50(m, 2H), 7.46(d, 2H), 7.35-7.31(m, 3H), 7.21(d, 2H), 4.12(s, 2H), 3.77(t, 2H), 2.95(t, 2H) ESI HRMS m/z 〔M+Na〕+ calcd 289.0835, found 289.0827
製造例１−５ トラン化合物５：2-(4-(naphthalen-2-ylethynyl)phenethoxy)acetic acid
下記式で表されるトラン化合物５を製造した。
下記式で表されるトラン化合物５を製造した。
化合物[12] ethyl 2-(4-(naphthalen-2-ylethynyl)phenethoxy)acetate
上記の反応スキームに従って、化合物[12]を製造した。以下に詳細を示す。
反応容器に、上述の110mgのethyl 2-(4-bromophenethoxy)acetate(0.38mmol)を加え、1mLのTMEDAおよび0.1mL精製水の混合溶媒に溶かした。ここに、1.1mgの Disodium tetrachloropalladate(Na2PdCl4：3.48μmol)、1.5mgのCuI(7.88μmol)、3.0mgの2-(di-tert-butylphosphino)-N-phenylindole(PintB:6.97μmol)、および53mgの2-ethynylnaphthalene(0.35mmol)を順に加えた後、80℃のAr雰囲気下で撹拌した。
TLCにて原料の消失が確認された後、反応液に水を加え、酢酸エチルで３回抽出した。次いで、有機層を合わせて飽和塩化アンモニウム水溶液で２回洗浄し、食塩水(Brine)で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下で留去した。
残渣をカラムクロマトグラフィー(hexane:AcOEt=8:1(v/v))で精製することで、目的物である72mgの(ethyl 2-(4-(naphthalen-2-ylethynyl)phenethoxy)acetate)を得た(収率58%)。得られた化合物[12]は次のステップに使用した。
化合物[12]の物性値は以下のとおりである。
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 8.05(s, 1H), 7.83-7.80(m, 3H), 7.59-7.49(m, 5H), 7.24(d, 2H), 4.23(q, 2H), 4.12(s, 2H), 3.83(t, 2H), 2.99(t, 2H), 1.22(t, 3H)
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 8.05(s, 1H), 7.83-7.80(m, 3H), 7.59-7.49(m, 5H), 7.24(d, 2H), 4.23(q, 2H), 4.12(s, 2H), 3.83(t, 2H), 2.99(t, 2H), 1.22(t, 3H)
トラン化合物５；2-(4-(naphthalen-2-ylethynyl)phenethoxy)acetic acid
上記の反応スキームに従って、トラン化合物５を製造した。以下に詳細を示す。
反応容器に、72mgのethyl 2-(4-(naphthalen-2-ylethynyl)phenethoxy)acetate (0.20mmol)および1.5mLのTHFを加えて撹拌した。0.5mLの精製水に溶かした水酸化リチウム一水和物(0.40mmol)を反応溶液に加え、室温で撹拌した。
TLCで原料の消失が確認された後、反応容器に水を加え、ここに３％の塩酸水溶液を加えてpH<1に調整した。反応液を酢酸エチルで３回抽出し、有機層を合わせて食塩水(Brine)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで溶媒を減圧下で留去することで、最終目的物である62mgの(2-(4-(naphthalen-2-ylethynyl) phenethoxy)acetic acid（トラン化合物５)を得た(収率：93%)。
トラン化合物５の物性値は以下のとおりである。
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 8.05(s, 1H), 7.83-7.80(m, 3H), 7.59-7.49(m, 5H), 7.24(d, 2H), 4.12(s, 2H), 3.83(t, 2H), 2.99(t, 2H) ESI HRMS m/z 〔M+Na〕+ calcd 353.1148, found 353.1143
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 8.05(s, 1H), 7.83-7.80(m, 3H), 7.59-7.49(m, 5H), 7.24(d, 2H), 4.12(s, 2H), 3.83(t, 2H), 2.99(t, 2H) ESI HRMS m/z 〔M+Na〕+ calcd 353.1148, found 353.1143
製造例１−６ トラン化合物６：2-(4-((4-cyanophenyl)ethynyl)phenethoxy)acetic acid
下記式で表されるトラン化合物６を製造した。
下記式で表されるトラン化合物６を製造した。
化合物[13] ethyl 2-(4-((4-cyanophenyl)ethynyl)phenethoxy)acetate
上記の反応スキームに従って、化合物[13]を製造した。以下に詳細を示す。
反応容器に、上述の112mgのethyl 2-(4-bromophenethoxy)acetate(390μmol)を加え、1mLのTMEDAおよび0.1mL精製水の混合溶媒に溶かした。ここに、1.1mgのDisodium tetrachloropalladate(Na2PdCl4：3.48μmol)、1.5mgのCuI(7.88μmol)、3.1mgの2-(di-tert-butylphosphino)-N-phenylindole(PintB:7.88μmol)、および140mgの4-ethynylbenzonitrile (172μmol)を順に加えた後、80℃のAr雰囲気下で撹拌した。
TLCにて原料の消失が確認された後、反応液に水を加え、酢酸エチルで３回抽出した。次いで、有機層を合わせて飽和塩化アンモニウム水溶液で２回洗浄し、食塩水(Brine)で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下で留去した。
残渣をカラムクロマトグラフィー(hexane:AcOEt=8:1(v/v))で精製することで、目的物である37mgのethyl 2-(4-((4-cyanophenyl)ethynyl)phenethoxy)acetateを得た(収率29%)。得られた化合物[13]は次のステップに使用した。
化合物[13]の物性値は以下のとおりである。
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.64-7.58(m, 4H), 7.47(d, 2H), 7.27(d, 2H), 4.21(q, 2H), 4.07(s, 2H), 3.78(t, 2H), 2.98(t, 2H), 1.28(t, 3H)。
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.64-7.58(m, 4H), 7.47(d, 2H), 7.27(d, 2H), 4.21(q, 2H), 4.07(s, 2H), 3.78(t, 2H), 2.98(t, 2H), 1.28(t, 3H)。
トラン化合物６；2-(4-((4-cyanophenyl)ethynyl)phenethoxy)acetic acid
上記の反応スキームに従って、トラン化合物６を製造した。以下に詳細を示す。
反応容器に、35mgのethyl 2-(4-((4-cyanophenyl)ethynyl)phenethoxy)acetate (105μmol)および1.8mLのTHFを加えて撹拌した。0.5mLの精製水に溶かした水酸化リチウム一水和物(214μmol)を反応溶液に加え、室温で撹拌した。
TLCで原料の消失が確認された後、反応容器に水を加え、ここに３％の塩酸水溶液を加えてpH<1に調整した。反応液を酢酸エチルで３回抽出し、有機層を合わせて食塩水(Brine)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで溶媒を減圧下で留去することで、最終目的物である18mgの2-(4-((4-cyanophenyl)ethynyl)phenethoxy)acetic acid（トラン化合物6)を得た(収率：56%)
トラン化合物６の物性値は以下のとおりである。
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.65-7.60(m, 4H), 7.49(d, 2H), 7.24(d, 2H), 4.11(s, 2H), 3.82(t, 2H), 2.98(t, 2H)
H1-NMR(400MHz, CDCl3) : 7.65-7.60(m, 4H), 7.49(d, 2H), 7.24(d, 2H), 4.11(s, 2H), 3.82(t, 2H), 2.98(t, 2H)
＜製造例２：ペプチド核酸＞
Ｎ末端がトラン化合物（トラン化合物１〜６）で修飾されたペプチド核酸を合成した。具体的には、Ｆｍｏｃ固相合成法により合成したＰＮＡオリゴマー〔Ｋ...（ＡＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＴ：配列番号１）〕のＮ末端に上記製造例１で製造したトラン化合物１〜６を固相合成によって導入し、表１に示す配列のペプチド核酸１〜６を合成した。
Ｎ末端がトラン化合物（トラン化合物１〜６）で修飾されたペプチド核酸を合成した。具体的には、Ｆｍｏｃ固相合成法により合成したＰＮＡオリゴマー〔Ｋ...（ＡＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＴ：配列番号１）〕のＮ末端に上記製造例１で製造したトラン化合物１〜６を固相合成によって導入し、表１に示す配列のペプチド核酸１〜６を合成した。
なお、Ｆｍｏｃ固相合成法にはＮｏｖａＳｙｎ（登録商標）ＴＧＲ樹脂（０．２４ｍｍｏｌｅ／ｇ）を使用し、合成したＰＮＡオリゴマーの樹脂からの切り出しには８０％ＴＦＡ／ｍ−ｃｒｅｓｏｌ溶液を用いて行った。目的物の精製はＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３：４．６×１５０ｍｍ、ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ／ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．１％ＴＦＡ、ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ １０％ ｔｏ ５０％ ｆｏｒ ８０ｍｉｎ．）で行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いて目的物の質量同定を行った。
表１に示す各ＰＮＡの塩基配列（配列番号１）は、左から右に向かってＣ末端からＮ末端となるように記載している。なお、表１に示す「Ｋ」とはリジン残基を示し、そのＮ末端とアデニン（Ａ）を有するペプチド核酸のＣ末端とが、ペプチド結合していることを示している（表中の「…」で示す。）。また、表中の「-」は、トラン化合物１〜６に含まれるカルボキシル基とペプチド核酸のＮ末端のチミン（Ｔ）とが、ペプチド結合していることを示す。
（１）Ｒｅｓｉｎ−Ｋまでの合成
樹脂（０．２４ｍｍｏｌ／ｇ）の１／３（０．０８ｍｍｏｌ）を伸長させた。
樹脂（０．２４ｍｍｏｌ／ｇ）の１／３（０．０８ｍｍｏｌ）を伸長させた。
１）カップリング過程
６ｍｌのディスポシリンジに樹脂４００ｍｇを量りとり、ＤＭＦを３ｍｌ加えて１５分間撹拌し樹脂を膨潤させ、ＤＭＦを除去した。次にＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｉｏｔｉｎ）−ＯＨ（１５．６ｍｇ：０．０３ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）−ＯＨ（２５．４ｍｇ：０．０６ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４０．５ｍｇ：０．３０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１１３．８ｍｇ：０．３０ｍｍｏｌ）をカップリング溶液（ＮＭＭ／ｐｙｒｉｄｉｎｅ（１／４４；ｖ／ｖ）／ＤＭＦ（３／２；ｖ／ｖ））１．２ｍｌに溶解した後、樹脂に加えて４０分間撹拌した。その後、反応溶液を除去し、ＤＭＦで５回洗浄した。
６ｍｌのディスポシリンジに樹脂４００ｍｇを量りとり、ＤＭＦを３ｍｌ加えて１５分間撹拌し樹脂を膨潤させ、ＤＭＦを除去した。次にＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｉｏｔｉｎ）−ＯＨ（１５．６ｍｇ：０．０３ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）−ＯＨ（２５．４ｍｇ：０．０６ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４０．５ｍｇ：０．３０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１１３．８ｍｇ：０．３０ｍｍｏｌ）をカップリング溶液（ＮＭＭ／ｐｙｒｉｄｉｎｅ（１／４４；ｖ／ｖ）／ＤＭＦ（３／２；ｖ／ｖ））１．２ｍｌに溶解した後、樹脂に加えて４０分間撹拌した。その後、反応溶液を除去し、ＤＭＦで５回洗浄した。
２）キャッピング過程
樹脂にキャッピング溶液（無水酢酸／2,6-ルチジン／ＤＭＦ（５／６／８９；ｖ／ｖ／ｖ））を２ｍｌ加えて１０分間撹拌した後、溶液を除去し、ＤＭＦで１０回洗浄した。
樹脂にキャッピング溶液（無水酢酸／2,6-ルチジン／ＤＭＦ（５／６／８９；ｖ／ｖ／ｖ））を２ｍｌ加えて１０分間撹拌した後、溶液を除去し、ＤＭＦで１０回洗浄した。
３）脱保護過程
樹脂に脱保護溶液（ピペリジン／ＤＭＦ（４／６；ｖ／ｖ））を２ｍｌ加えて５分間撹拌した後、脱保護溶液をエッペンチューブにとり、樹脂をＤＭＦで１０回洗浄した。脱保護溶液を４０倍に希釈し、３００ｎｍにおける吸光度を測定することで、伸長反応を確認した。
樹脂に脱保護溶液（ピペリジン／ＤＭＦ（４／６；ｖ／ｖ））を２ｍｌ加えて５分間撹拌した後、脱保護溶液をエッペンチューブにとり、樹脂をＤＭＦで１０回洗浄した。脱保護溶液を４０倍に希釈し、３００ｎｍにおける吸光度を測定することで、伸長反応を確認した。
（２）Ｒｅｓｉｎ-Ｋ…ＡＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＴまでの合成
１）カップリング過程
伸長させる各塩基を有するモノマー（０．１０ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４０．５ｍｇ：０．３０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１１３．８ｍｇ：０．３０ｍｍｏｌ）をカップリング溶液１．２ｍｌに溶解した後樹脂に加え、３０分間撹拌した。その後、反応溶液を除去し、ＤＭＦで５回洗浄した。
１）カップリング過程
伸長させる各塩基を有するモノマー（０．１０ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４０．５ｍｇ：０．３０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１１３．８ｍｇ：０．３０ｍｍｏｌ）をカップリング溶液１．２ｍｌに溶解した後樹脂に加え、３０分間撹拌した。その後、反応溶液を除去し、ＤＭＦで５回洗浄した。
２）キャッピング過程
樹脂にキャッピング溶液を２ｍｌ加えて１０分間撹拌した。その後、反応溶液を除去し、ＤＭＦで１０回洗浄した。
樹脂にキャッピング溶液を２ｍｌ加えて１０分間撹拌した。その後、反応溶液を除去し、ＤＭＦで１０回洗浄した。
３）脱保護過程
樹脂に脱保護溶液を２ｍｌ加えて５分間撹拌した。その後、反応溶液を除去し、ＤＭＦで１０回洗浄した。各伸長反応の確認は、上記と同様に行った。
樹脂に脱保護溶液を２ｍｌ加えて５分間撹拌した。その後、反応溶液を除去し、ＤＭＦで１０回洗浄した。各伸長反応の確認は、上記と同様に行った。
（３）Ｒｅｓｉｎ-Ｋ…ＡＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＴ以降の合成
まず、これまでに合成した４００ｍｇの樹脂を６ｍｌのディスポシリンジにおよそ５０ｍｇずつ分注した。
まず、これまでに合成した４００ｍｇの樹脂を６ｍｌのディスポシリンジにおよそ５０ｍｇずつ分注した。
１）カップリング過程
ＰＮＡのＮ末端に修飾する化合物（１２．５μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（５．１ｍｇ：３７．５μｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１４．２ｍｇ：３７．５μｍｏｌ）をカップリング溶液２００ｕｌに溶解した後樹脂に加え、３０分間撹拌した。その後、反応溶液を除去し、ＤＭＦで５回洗浄した。
ＰＮＡのＮ末端に修飾する化合物（１２．５μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（５．１ｍｇ：３７．５μｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１４．２ｍｇ：３７．５μｍｏｌ）をカップリング溶液２００ｕｌに溶解した後樹脂に加え、３０分間撹拌した。その後、反応溶液を除去し、ＤＭＦで５回洗浄した。
２）キャッピング過程
樹脂にキャッピング溶液を１ｍｌ加えて１０分間撹拌した。その後、反応溶液を除去し、ＤＭＦで１０回洗浄した。
樹脂にキャッピング溶液を１ｍｌ加えて１０分間撹拌した。その後、反応溶液を除去し、ＤＭＦで１０回洗浄した。
（４）樹脂からの切り出し
伸長反応が完了した樹脂をＣＨ２Ｃｌ２で１０回洗浄した後、ＭｅＯＨで５回洗浄して、真空中で乾燥させた。脱樹脂溶液（ＴＦＡ／ｍ−クレゾール（４／１；ｖ／ｖ））を樹脂が浸るまで加え、１時間撹拌した。１５ｍｌファルコンチューブにＥｔ２Ｏを２ｍｌ加え、その上から脱樹脂溶液を加えて生成物を沈殿させた。樹脂をＥｔ２Ｏで洗浄し生成物を回収した後、−８０℃で１０分間冷却して生成物を析出させ、４４００ｒｐｍで４分間遠心分離を行い、生成物を沈殿させて、Ｅｔ２Ｏを除去した。この操作を更に２回行い、生成物を真空中で乾燥させた。
伸長反応が完了した樹脂をＣＨ２Ｃｌ２で１０回洗浄した後、ＭｅＯＨで５回洗浄して、真空中で乾燥させた。脱樹脂溶液（ＴＦＡ／ｍ−クレゾール（４／１；ｖ／ｖ））を樹脂が浸るまで加え、１時間撹拌した。１５ｍｌファルコンチューブにＥｔ２Ｏを２ｍｌ加え、その上から脱樹脂溶液を加えて生成物を沈殿させた。樹脂をＥｔ２Ｏで洗浄し生成物を回収した後、−８０℃で１０分間冷却して生成物を析出させ、４４００ｒｐｍで４分間遠心分離を行い、生成物を沈殿させて、Ｅｔ２Ｏを除去した。この操作を更に２回行い、生成物を真空中で乾燥させた。
（５）精製
精製はＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３；４．６×１５０ｍｍ、ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ／ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．１％ＴＦＡ、ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ １０％ ｔｏ ５０％ ｆｏｒ ８０ｍｉｎ）で行い、各目的物を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いて目的物の同定を行った後、ＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３；１．５×１５０ｍｍ、ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ／ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．１％ＴＦＡ、ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ０％ ｔｏ ５０％ ｆｏｒ ３０ ｍｉｎ、ＵＶ２６５ｎｍ）によって核酸塩基の吸光度を検出し、純度を確認した。
精製はＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３；４．６×１５０ｍｍ、ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ／ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．１％ＴＦＡ、ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ １０％ ｔｏ ５０％ ｆｏｒ ８０ｍｉｎ）で行い、各目的物を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いて目的物の同定を行った後、ＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３；１．５×１５０ｍｍ、ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ／ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．１％ＴＦＡ、ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ０％ ｔｏ ５０％ ｆｏｒ ３０ ｍｉｎ、ＵＶ２６５ｎｍ）によって核酸塩基の吸光度を検出し、純度を確認した。
実験例１ トラン誘導体修飾ＰＮＡの相補ＤＮＡおよび非相補ＤＮＡに対する会合挙動の解析
製造例２で製造したペプチド核酸１〜６について、相補ＤＮＡおよび非相補ＤＮＡのそれぞれのＤＮＡに対する会合挙動（二重鎖の熱力学的安定性）を、融解温度測定により定量的に評価した。
製造例２で製造したペプチド核酸１〜６について、相補ＤＮＡおよび非相補ＤＮＡのそれぞれのＤＮＡに対する会合挙動（二重鎖の熱力学的安定性）を、融解温度測定により定量的に評価した。
ペプチド核酸１〜６と各ＤＮＡ（相補ＤＮＡおよび非相補ＤＮＡ）との二重鎖のＴｍ値の測定
相補配列を持つＤＮＡあるいは非相補配列を有するＤＮＡ（表２参照）とペプチド核酸１〜６をそれぞれＤＮＡ：ペプチド核酸＝１：１となるように調整した。この時の各核酸分子の濃度は４μｍｏｌ／Ｌ（２０ｍＭリン酸緩衝液；ｐＨ７．４）とした。８連セルを備えた紫外−可視吸収スペクトル測定装置を用いて、２６０ｎｍにおける吸光度の温度変化を５℃から９５℃の範囲を１分間あたり０．５℃ずつ温度変化させて測定し、融解曲線を得た。得られた融解曲線から、中線法を用いてＴｍ値を算出した。
相補配列を持つＤＮＡあるいは非相補配列を有するＤＮＡ（表２参照）とペプチド核酸１〜６をそれぞれＤＮＡ：ペプチド核酸＝１：１となるように調整した。この時の各核酸分子の濃度は４μｍｏｌ／Ｌ（２０ｍＭリン酸緩衝液；ｐＨ７．４）とした。８連セルを備えた紫外−可視吸収スペクトル測定装置を用いて、２６０ｎｍにおける吸光度の温度変化を５℃から９５℃の範囲を１分間あたり０．５℃ずつ温度変化させて測定し、融解曲線を得た。得られた融解曲線から、中線法を用いてＴｍ値を算出した。
表２に示す各ＤＮＡの塩基配列は、左から右に向かって５’末端から３’末端となるように記載している。また、表２に示す各ＰＮＡの塩基配列の表記は、左から右に向かってＣ末端からＮ末端となるように記載している。
表２の | は、ＤＮＡ配列とＰＮＡ配列とが相補的であることを示す。表中の : について、ＤＮＡ配列が「Ａ」の時は、これと各ＰＮＡ配列とが相補的であること示し、ＤＮＡ配列が「Ｃ」の時は、これと各ＰＮＡ配列とが非相補的であることを示す。
上記のようにＴｍ値を少なくとも３回測定し、Ｔｍ値の平均値±標準偏差を求めた。
ペプチド核酸１〜６と各ＤＮＡ（相補ＤＮＡおよび非相補ＤＮＡ）との二重鎖のＴｍ値［℃］、および相補二重鎖のＴｍ値と非相補二重鎖のＴｍ値との差分（ΔＴｍ値［℃］）を算出した結果を表３に示す。
表３に示す結果から、ペプチド核酸１からペプチド核酸５に対して、順にΔＴｍ値が大きくなることが見て取れる。より詳細には、非相補的配列に関しては、何れのＰＮＡも４９℃〜５０℃近辺のＴｍ値であるが、相補的配列によるＴｍ値においては、単なるＰＮＡを用いた時よりもトラン修飾した各種ＰＮＡの方が大きくなり、結果としてペプチド核酸５が相補二重鎖の安定性、配列選択性が最も向上することが明らかとなった。
また、ペプチド核酸４とペプチド核酸６を比較して、ペプチド核酸のトラン化合物４の末端に位置するベンゼン環のパラ位にシアノ基を設けたペプチド核酸６の方がΔＴｍ値が高くなることも明らかである。よって、
実験例２ ミスマッチ塩基対および位置による会合特性の評価
実験例２では、ペプチド核酸として、実験例１において最も相補二重鎖の安定性および配列選択性の向上が認められたペプチド核酸５を用いて、ミスマッチ塩基対およびその位置が異なるＤＮＡ配列（表４参照）に対する識別性（会合特性）を評価した。
実験例２では、ペプチド核酸として、実験例１において最も相補二重鎖の安定性および配列選択性の向上が認められたペプチド核酸５を用いて、ミスマッチ塩基対およびその位置が異なるＤＮＡ配列（表４参照）に対する識別性（会合特性）を評価した。
表４における各ＤＮＡおよびＰＮＡの塩基配列の表記は、左から右に向かってＣ末端からＮ末端となるように記載している。なお表中のＢはシトシン（Ｃ）、グア二ン（Ｇ）、またはチミン（Ｔ）を示す。表中のＨは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、またはチミン（Ｔ）を示す。
表４に示すように、二重鎖を形成する３’末端にミスマッチ（Ｂ）を有するＤＮＡ配列をＤＮＡ ＭＭ−１、３’末端から２番目にミスマッチ（Ｂ）を有するＤＮＡ配列をＤＮＡ ＭＭ-２、そして３’末端から３番目にミスマッチ（Ｈ）を有するＤＮＡ配列をＤＮＡ ＭＭ−３と定義した。これらの配列を用いて、実験例１の方法に準じてＴｍ値の測定を行った。
具体的には、表４に示した種々のＤＮＡ配列に対するペプチド核酸５の会合特性をＴｍ値の測定によって定量的に評価した。まずペプチド核酸５とＤＮＡを１：１の濃度比で混合したサンプルを調製し、５℃〜９５℃の間での２６０ｎｍにおける吸光度の変化を測定し、融解曲線を得た。得られた融解曲線から中線法を用いてＴｍ値を算出した。少なくとも３回のＴｍ値を測定し、得られたＴｍ値の平均値および標準偏差を求めた。また、相補二重鎖のＴｍ値と非相補二重鎖（ＭＭ−１、ＭＭ−２、およびＭＭ−３）のＴｍ値との差分であるΔＴｍ値［℃］を算出した。コントロール（Ｃｔｒｌ）として、上記のペプチド核酸（対照）を使用した。これらの結果を表５に示す。
表５に示すように、ペプチド核酸５を用いた非相補ＤＮＡ配列に対する非特異的な安定化効果は＋０．３〜２．６℃であった。他の芳香族化合物（ピレンやアゾベンゼン等）によって修飾した場合の非相補配列に対する非特異的な安定化効果は＋４〜６℃であったことから、ミスマッチ塩基対およびミスマッチが存在する位置によって程度には差はあるものの、ペプチド核酸５はミスマッチ配列に対する非特異的な安定化効果は比較的少ないことが明らかになった。
また、図１から明らかなように、ペプチド核酸５を用いると、トラン化合物で修飾されていないペプチド核酸（対照）では識別すらできなかったものも含めて、すべての配列において配列選択性を大きく向上させるという結果が得られた（５〜８℃）。このことから本発明のペプチド核酸、特にペプチド核酸５を用いることによる配列選択性向上の効果は、対象とするＤＮＡの配列に依存することなく発揮されると考えられる。
実験例３ ＰＮＡを用いたオセルタミビル耐性型ゲノム検出キットの構築とその確認
上記のように、トラン化合物にて修飾されたペプチド核酸は、優れた一塩基多型（一塩基ミスマッチ）の検出ができることを見い出されたので、これをオセルタミビル耐性型インフルエンザウイルスの検出キットに適用可能かどうかを検討した。
上記のように、トラン化合物にて修飾されたペプチド核酸は、優れた一塩基多型（一塩基ミスマッチ）の検出ができることを見い出されたので、これをオセルタミビル耐性型インフルエンザウイルスの検出キットに適用可能かどうかを検討した。
（１）ＤＮＡとＰＮＡを用いたＴｍ値の測定
先ず、オセルタミビル耐性型インフルエンザウイルスに特徴的なＤＮＡの（本来、インフルエンザウイルスはＲＮＡを遺伝物質として保持するが、予備実験としてＤＮＡで実験することにする。）塩基配列の一部である、５’末端＞ＣＴＣＡＴＡＡＴＡＡＡＡ＞３’末端（配列番号７）に対して相補的な塩基配列である、Ｃ末端＞ＧＡＧＴＡＴＴＡＴＴＴＴ＞Ｎ末端（配列番号８）を有するＰＮＡ（対照ＰＮＡ−１）を作製した。使用したＰＮＡおよびＤＮＡについて、表６に示す。
先ず、オセルタミビル耐性型インフルエンザウイルスに特徴的なＤＮＡの（本来、インフルエンザウイルスはＲＮＡを遺伝物質として保持するが、予備実験としてＤＮＡで実験することにする。）塩基配列の一部である、５’末端＞ＣＴＣＡＴＡＡＴＡＡＡＡ＞３’末端（配列番号７）に対して相補的な塩基配列である、Ｃ末端＞ＧＡＧＴＡＴＴＡＴＴＴＴ＞Ｎ末端（配列番号８）を有するＰＮＡ（対照ＰＮＡ−１）を作製した。使用したＰＮＡおよびＤＮＡについて、表６に示す。
また、これと同じ塩基配列を有するＰＮＡであって、且つトラン化合物５を用いたペプチド結合を介して修飾したＰＮＡを作製した（ＰＮＡ５−１）。より詳細には、上記の対照ＰＮＡ−１のＮ末端に存在するＴを有するペプチド核酸残基のアミド基と、トラン化合物が有するカルボキシル基とがペプチド結合している（表６の「ー」に示す位置の説明。）。ＰＮＡのこのようなＰＮＡ５−１の作成方法は、上記に説明したＰＮＡ１〜５などと同様である。
これと同様に、上記のＤＮＡ配列に対して相補的な塩基配列を有するＰＮＡであって、トラン化合物５に変えてトラン化合物６を用い、これを上記と同様にペプチド結合を介して修飾したＰＮＡ（ＰＮＡ６−１）および上記のＤＮＡ配列に対して相補的な塩基配列を有するＰＮＡであって、カルボキシル基を有するアクリジン化合物（Ｎ−（２−カルボキシエチル）−９−アクリジナミニウム；シグマアルドリッチ社製：Ｌ１３５７６３）によって、上記の同様にペプチド結合を介して修飾したＰＮＡ（ＰＮＡａｃｒ）を製造した。
上記の各ＰＮＡの（Ｇ）を有するペプチド核酸残基のＣ末端には、ＫＯＯＫからなるリジン残基およびスペーサーが設けられている。より詳細には、上記のＣ末端のカルボキシル基とリジン残基の主鎖のアミド基とがペプチド結合している（表中の「…」に示す位置の説明。）。
さらに、上記のリジン残基の主鎖のカルボキシル基は、下記式に示す基がアミド結合している（式中の波線部が上記のリジン残基とペプチド結合する）。よって、上記表６に記載する各ＰＮＡのＣ末端は、下記式に示す基に記載するリジン残基である。
表６に示すＤＮＡの塩基配列は、左から右に向かって、５’末端から３’末端となるように記載している。また、各ＰＮＡの塩基配列の表記は、左から右に向かってＣ末端からＮ末端となるように記載している。なお、各ＰＮＡのＣ末端のカルボキシル基はアミド化されている。表中の | は、ＤＮＡ配列とＰＮＡ配列とが相補的であることを示す。表中の : は非相補的であることを示す。
このようにして作製した各種ＰＮＡの存在を確認するために、マス・スペクトラム（ＢＲＵＫＥＲ社製 Ｕｌｔｔａｆｌｅｘ ＩＩＩ）にて得られた結果を、下記の表７に示す。
上記の表６に示す各種ＰＮＡと、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスに特徴的な塩基配列（配列番号７）を有するＤＮＡおよびオセルタミビル感受性インフルエンザウイルスに特徴的な塩基配列（配列番号９）を有するＤＮＡとの会合特性を検討するために、実験例１に記載の方法と同様にしてＴｍ値を算出した。また、配列番号７を用いた際に得られたＴｍ値と配列番号９を用いた際に得られたＴｍ値との差分を、１塩基ミスマッチの識別の程度を評価するためのΔＴｍ値として算出した。表８に結果を示す。
表８に示す結果から、ＰＮＡ５−１を用いるとΔＴｍ値が１１．７と高く、１塩基のミスマッチを最も効率よく識別できることが明らかとなった。
（２）ＲＮＡとＰＮＡを用いたＴｍ値の測定
上記の通り、インフルエンザウイルスはＲＮＡを遺伝物質として有するため、上記のオセルタミビル耐性インフルエンザウイルスに特徴的な塩基配列（配列番号７）を有するＤＮＡに変えて、５’末端＞ＣＵＣＡＵＡＡＵＡＡＡＡ＞３’末端からなる配列を有するＲＮＡ（配列番号１０）およびオセルタミビル耐性インフルエンザウイルスに特徴的な塩基配列（配列番号９）を有するＤＮＡに変えて、５’末端＞ＣＵＣＡＵＡＡＵＧＡＡＡ＞３’末端（配列番号１１）を用い、上記の（１）と同様にＴｍ値およびΔＴｍ値を算出した。この結果を表９に示す。
上記の通り、インフルエンザウイルスはＲＮＡを遺伝物質として有するため、上記のオセルタミビル耐性インフルエンザウイルスに特徴的な塩基配列（配列番号７）を有するＤＮＡに変えて、５’末端＞ＣＵＣＡＵＡＡＵＡＡＡＡ＞３’末端からなる配列を有するＲＮＡ（配列番号１０）およびオセルタミビル耐性インフルエンザウイルスに特徴的な塩基配列（配列番号９）を有するＤＮＡに変えて、５’末端＞ＣＵＣＡＵＡＡＵＧＡＡＡ＞３’末端（配列番号１１）を用い、上記の（１）と同様にＴｍ値およびΔＴｍ値を算出した。この結果を表９に示す。
表９に示す結果から、ＤＮＡに変えてＲＮＡとしても、ＰＮＡ５−１を用いる際の優位性は変わらず良好であり、むしろその程度はＲＮＡとしたときの方が顕著であると言える。よって、このようなＰＮＡを用いたキットを作製し、インフルエンザ耐性菌の検出ができるかどうかを試した。
（３）オセルタミビル耐性インフルエンザ判定キット
下記の実験にて用いたキットとこれを用いた実験の模式図を図２に示す。
下記の実験にて用いたキットとこれを用いた実験の模式図を図２に示す。
・捕捉抗体用希釈液の作製
ヤギ由来抗ビオチン抗体（ＢＥＴＨＹＬ社製：Ａ１５０−１１１Ａ）とマウス由来抗インフルエンザＡモノクローナル抗体（ａｂｃａｍ社製：ａｂ６６１９１）は、５％スクロースを含む滅菌水に０．５ｍｇ／ｍｌの終濃度になるように希釈した。
ヤギ由来抗ビオチン抗体（ＢＥＴＨＹＬ社製：Ａ１５０−１１１Ａ）とマウス由来抗インフルエンザＡモノクローナル抗体（ａｂｃａｍ社製：ａｂ６６１９１）は、５％スクロースを含む滅菌水に０．５ｍｇ／ｍｌの終濃度になるように希釈した。
・クロマトグラフ媒体上の判定部の作成
上記（１）で作成した抗体２００μｌをメンブレン上に１ｍｍの幅で塗布機（ニップンエンジニアリング社製）を用いて、３０×２．５ｃｍのニトロセルロースメンブレン（ミリポア社製：ＨＦ１８０ＭＣ１００）に塗布し、５５℃、５分間乾燥させたのち、０．５％カゼインを含む５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に５分間浸潤した。次いで、これを０．０１％ＳＤＳを含む５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に１５分間浸潤した後、クロマトグラフ媒体上の判定部に塗布し、これを室温で１晩乾燥させた。
上記（１）で作成した抗体２００μｌをメンブレン上に１ｍｍの幅で塗布機（ニップンエンジニアリング社製）を用いて、３０×２．５ｃｍのニトロセルロースメンブレン（ミリポア社製：ＨＦ１８０ＭＣ１００）に塗布し、５５℃、５分間乾燥させたのち、０．５％カゼインを含む５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に５分間浸潤した。次いで、これを０．０１％ＳＤＳを含む５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に１５分間浸潤した後、クロマトグラフ媒体上の判定部に塗布し、これを室温で１晩乾燥させた。
・金コロイド標識抗体溶液の作製
０．１ｍｌの金コロイド懸濁液（ワインレッドケミカル社製：ＷＲＧＨ−２ 平均粒子径４０ｎｍ）に０．７ｍｌのホウ酸緩衝液（２ｍＭ；ｐＨ９．２）を加えて希釈した。マウス由来抗インフルエンザＡモノクローナル抗体（ａｂｃａｍ社製：ａｂ１１０６６１）を、２ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で０．１ｍｇ／ｍｌに希釈した。抗体溶液１５０μｌと金コロイド懸濁液１ｍｌに加え、３７℃、１０分間静置した。次いで、１０％のＢＳＡを含む２ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）を０．１５ｍｌ加え、室温で１０分間静置した。その後、３０秒超音波をかけ、８０００×ｇ、２０分間遠心分離を行った。上清を除去した後、１．０％ＢＳＡ、５％トレハロースを含む２ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１ｍｌ加えた。
０．１ｍｌの金コロイド懸濁液（ワインレッドケミカル社製：ＷＲＧＨ−２ 平均粒子径４０ｎｍ）に０．７ｍｌのホウ酸緩衝液（２ｍＭ；ｐＨ９．２）を加えて希釈した。マウス由来抗インフルエンザＡモノクローナル抗体（ａｂｃａｍ社製：ａｂ１１０６６１）を、２ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で０．１ｍｇ／ｍｌに希釈した。抗体溶液１５０μｌと金コロイド懸濁液１ｍｌに加え、３７℃、１０分間静置した。次いで、１０％のＢＳＡを含む２ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）を０．１５ｍｌ加え、室温で１０分間静置した。その後、３０秒超音波をかけ、８０００×ｇ、２０分間遠心分離を行った。上清を除去した後、１．０％ＢＳＡ、５％トレハロースを含む２ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１ｍｌ加えた。
・イムノクロマト法に基づく測定キットの作成
上記で作成した金コロイド標識抗体溶液４０μｌを５ｍｍ×１５ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に添加した後、真空乾燥器にて１晩乾燥させ、コンジュゲートパッドを作成した。次に、パッキングシートから成る基材に、上記作成したクロマトグラフ媒体、試料を添加するサンプルパット（ミリポア社製：ＣＦＳＰ２０３０００）、試料吸収する吸収パッド（ミリポア社製）を貼り合わせたものを、幅が５ｍｍになるように裁断した。さらに、上記作成したコンジュゲートパッドを貼りあわせて、イムノクロマトグラフィー測定キットを作成した。
上記で作成した金コロイド標識抗体溶液４０μｌを５ｍｍ×１５ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に添加した後、真空乾燥器にて１晩乾燥させ、コンジュゲートパッドを作成した。次に、パッキングシートから成る基材に、上記作成したクロマトグラフ媒体、試料を添加するサンプルパット（ミリポア社製：ＣＦＳＰ２０３０００）、試料吸収する吸収パッド（ミリポア社製）を貼り合わせたものを、幅が５ｍｍになるように裁断した。さらに、上記作成したコンジュゲートパッドを貼りあわせて、イムノクロマトグラフィー測定キットを作成した。
・展開液の調製
界面活性剤（ＮＰ４０）、ＢＳＡ、ＦＢＳ、リン酸系緩衝液を含む溶液（ｐＨ：７．４）を、試料の展開液とした。
界面活性剤（ＮＰ４０）、ＢＳＡ、ＦＢＳ、リン酸系緩衝液を含む溶液（ｐＨ：７．４）を、試料の展開液とした。
・試料調製と測定
上記のオセルタミビル感受性インフルエンザウイルスが有するＲＮＡと相補的な配列を有する上記のＰＮＡ５−１を０．１μｇ／μｌの濃度になるように超純水で希釈した。このように調製したＰＮＡ溶液の５μＬと、１．０×１０６ｐｆｕ／ｍｌのオセルタミビル耐性型インフルエンザウイルス溶液（ｆｌｕ／Ａ／Ｙｏｋｏｈａｍａ／７７／Ｈ１Ｎ１）１０μｌおよびオセルタミビル感受性型インフルエンザウイルス溶液（ｆｌｕ／Ａ／Ｙｏｋｏｈｍａ／１０／Ｈ１Ｎ１）１０μｌとを、それぞれ展開液１０５μｌの存在下にて５５℃、５分間静置した。
上記のオセルタミビル感受性インフルエンザウイルスが有するＲＮＡと相補的な配列を有する上記のＰＮＡ５−１を０．１μｇ／μｌの濃度になるように超純水で希釈した。このように調製したＰＮＡ溶液の５μＬと、１．０×１０６ｐｆｕ／ｍｌのオセルタミビル耐性型インフルエンザウイルス溶液（ｆｌｕ／Ａ／Ｙｏｋｏｈａｍａ／７７／Ｈ１Ｎ１）１０μｌおよびオセルタミビル感受性型インフルエンザウイルス溶液（ｆｌｕ／Ａ／Ｙｏｋｏｈｍａ／１０／Ｈ１Ｎ１）１０μｌとを、それぞれ展開液１０５μｌの存在下にて５５℃、５分間静置した。
その後、得られたＲＮＡ溶液を急冷することなく、全量の１２０μｌを上記にて作製したイムノクロマトグラフィー測定キットのサンプルパッド上に室温にて展開させ、１０分後にテストラインを目視にて判定した。同様に、ＰＮＡ５−１に変えて上記の対照ＰＮＡ−１を用いた実験も行った。結果を図３に示す。
図３の（Ａ）に示す結果から、ＰＮＡ５−１を用いた場合には、テストライン上に陽性であることを示すバンドを目視で確認することができた。一方で、対象ＰＮＡ−１を用いた場合には、テストライン上およびコントロールライン上の両方にバンドが現れる結果となってしまい、オセルタミビル耐性／感受性インフルエンザウイルスの判定キットとして使えないことが明らかとなった。
配列番号１はペプチド核酸（ＰＮＡオリゴマー）（対照）（Ctrl）の塩基配列を示す。なお、配列番号１〜６に示す各種ペプチド核酸は、この塩基配列の5'末端（ペプチド核酸のＣ末端）にリジン残基を有している。
配列番号２は上記配列番号１に示す塩基配列からなるペプチド核酸と相補鎖を形成する塩基配列を、配列番号３〜６は上記配列番号１に示す塩基配列からなるペプチド核酸の塩基配列とミスマッチする塩基配列を示す。
配列番号７に示す塩基配列は、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスに特徴的な塩基配列をＤＮＡの塩基配列に置換したものである。配列番号８に示す塩基配列はこの配列番号７に示す塩基配列に対して相同性を有するＰＮＡの塩基配列を示す。配列番号９に示す塩基配列は、オセルタミビル感受性型インフルエンザウイルスに特徴的な塩基配列をＤＮＡの塩基配列に置換したものである。
配列番号１０に示す塩基配列はオセルタミビル耐性インフルエンザウイルスに特徴的なＲＮＡの塩基配列である。配列番号１１に示す塩基配列は、オセルタミビル感受性型インフルエンザウイルスに特徴的なＲＮＡの塩基配列である。
Claims (14)
- 下記式（１）
該フェニル基は、同一または異なって１〜５個の置換基を有していてもよい。
該ナフチル基は、同一または異なって１〜７個の置換基を有していてもよい。］
で表される、トラン化合物。 - 置換基が電子吸引基である請求項１に記載のトラン化合物。
- 電子吸引基が、シアノ基、ニトロ基、アシル基、ハロゲン基、トシル基、メシル基、およびフェニル基からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１または２に記載のトラン化合物。
- 下記式（３）
該フェニル基は、同一または異なって１〜５個の置換基を有する。
該ナフチル基は、同一または異なって１〜７個の置換基を有する。
Ｒ３は、ペプチド核酸残基を示す。］
で表される、トラン修飾されたペプチド核酸。 - 前記ペプチド核酸残基が、下記式（４）
ｎは、６〜２５の整数を意味する。］
で表される残基である、請求項４に記載のペプチド核酸。 - 置換基が電子吸引基である請求項４または５に記載のペプチド核酸。
- 電子吸引基が、シアノ基、ニトロ基、アシル基、ハロゲン基、トシル基、メシル基、およびフェニル基からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項６に記載のペプチド核酸。
- 前記ペプチド核酸残基が、そのアミノ酸残基を含むものである、請求項４〜７の何れかに記載のペプチド核酸。
- 化学修飾がされてなる、請求項４〜８の何れかに記載のペプチド核酸であって、該化学修飾が、アセチル化、ホルミル化、ミリストイル化、ピログルタミン酸化、アルキル化、グリコシル化、アミド化、アシル化、ヒドロキシル化、脱アミノ化、プレニル化、パルミトイル化、リン酸化、ビオチニル化、およびスクシンイミジル化からなる群より選択される少なくとも一種である、ペプチド核酸。
- 請求項４〜９の何れかに記載のペプチド核酸を含む、キット。
- 薬剤耐性菌、薬剤耐性ウイルス、および薬剤耐性マイコプラズマからなる群より選択される少なくとも一種を検出するために用いられる、請求項１０に記載のキット。
- 前記薬剤耐性ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項１１に記載のキット。
- 前記インフルエンザウイルスが、オセルタミビル耐性である、請求項１２に記載のキット。
- 一塩基多型を検出するために用いられる、請求項１０に記載するキット。
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