JP6405369B2 - ポリマー粒子 - Google Patents

Description

多血性腫瘍または動静脈奇形の塞栓等の血管部位および体内の空洞の閉塞のための生分解性ポリマー粒子について記載する。

ここでは、一般的に、生分解性の架橋ポリマー粒子を記載する。ある実施の形態では、粒子は、球形状または実質的に球形状を有し得る。従って、ここに記載する粒子は、マイクロスフィアまたはポリマー球体と称され得る。このようなポリマーは、塞栓のため／塞栓中で、使用することができる。ポリマー粒子は、１または複数のモノマーおよび化学的加水分解または酵素作用を受け易い架橋剤を含み得るか、および／または、それらから形成され得る。

ここに記載する生分解性ポリマー粒子は、血管部位、身体の内腔および体内の他の空洞の塞栓のために利用され得る。ある実施の形態では、ポリマー粒子は、多血性腫瘍または動静脈奇形の塞栓のような目的のために使用することができる。

ポリマー粒子は、少なくとも１つのモノマーおよび少なくとも１つの架橋剤を含み得る。ある実施の形態では、ポリマー粒子は、化学的加水分解または酵素作用による分解を受け易くすることができる。ここに記載する粒子は、粒子の用途に応じて種々の大きさを有することができるが、一般的に、約４０μｍと約１２００μｍとの間または約７５μｍと約１２００μｍとの間の直径を有することができる。

ここに記されるポリマー粒子を製造する方法についても記載する。これらの方法は、少なくとも１つのモノマーと、化学的加水分解または酵素作用による分解を受け易い少なくとも１つの架橋剤と、開始剤とを含む水性プレポリマー溶液を調製すること、水性プレポリマー溶液を鉱油中に分散させること、および、モノマーの重合によりポリマー粒子を形成することを含む。

ポリマー粒子を形成するための他の方法では、油中においてプレポリマー溶液を反応させて、ポリマー粒子を形成することを含み得る。プレポリマー溶液は、少なくとも１つの官能基を含む少なくとも１つのモノマーと、化学的加水分解または酵素作用による分解を受け易い少なくとも１つの架橋剤と、開始剤とを含み得る。

ポリマー粒子形成に使用される架橋剤は、粒子に生分解性を付与することができる。例えば、架橋剤は、化学的加水分解または酵素作用による分解を受け易い少なくとも１つの結合を含み得る。架橋剤は、グリシジル系（グリシジルをベース）、グリシジルアミノ系（グリシジルアミノをベース）、チオエステル系（チオエステルをベース）、またはタンパク質系（タンパク質をベース）とすることができる。グリシジル系の架橋剤は、ビス−グリシジルアミノアルコールであってもよい。タンパク質系の架橋剤は、二官能性メタクリロイル−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＡＥＥ−メタクリレートであってもよい。

異なるポリマー粒子についての分解の段階を示す図である。 異なるポリマー粒子についての完全分解までの時間を示す図である。 ポリマー粒子分解についての得点を示すさらなる図である。

ここでは、概して、ポリマー材料で製造される粒子を記載する。ポリマー材料は、１または複数のモノマーと架橋剤との反応生成物であり得る。ある実施の形態では、ポリマー粒子は加水分解または酵素作用を受け易くすることができる。ポリマー粒子は、ここでは、微粒子、マイクロスフィア等と称され得る。粒子は、約４０μｍと約１２００μｍとの間または約７５μｍと約１２００μｍとの間の直径を有し得る。粒子はまた、針またはカテーテル等の医療機器を介する送達を容易にするために、圧縮性および／または耐久性とすることができる。粒子はまた、いったん送達されると生分解性となることができる。

粒子は、プレポリマー溶液のような混合物から形成され得る。プレポリマー溶液は、（ｉ）重合に適している単一の官能基を含有する１または複数のモノマーと、（ｉｉ）１または複数の架橋剤と、を含むことができる。ある実施の形態では、重合開始剤を使用してもよい。

ある実施の形態では、モノマー（１または複数）および／または架橋剤（１または複数）のいずれかが固体である場合、塞栓として使用されるための粒子の調製において溶媒が使用され得る。液体のモノマーおよび架橋剤を使用する場合、溶媒を必要としなくてもよい。ある実施の形態では、液体のモノマーおよび架橋剤を使用する場合であっても、溶媒がさらに使用されていてもよい。溶媒は、モノマー、モノマー混合物および／または架橋剤を溶解し得る、または実質的に溶解し得る任意の液体を含んでいてもよい。所望のモノマー（１または複数）、架橋剤（１または複数）および／または重合開始剤を溶解する、任意の水性または有機溶媒を使用することができる。有機溶媒が使用される場合、分散のための水性媒体を必要としてもよい。１つの実施の形態では、溶媒を水とすることができる。さらに、例えば塩化ナトリウム等の溶質を、重合速度を増加するために溶媒に加えてもよい。溶媒濃度は、溶液の約１０％ｗ／ｗ（重量％）、約２０％ｗ／ｗ、約３０％ｗ／ｗ、約４０％ｗ／ｗ、約５０％ｗ／ｗ、約６０％ｗ／ｗ、約７０％ｗ／ｗ、約８０％ｗ／ｗ、約９０％ｗ／ｗ、約２０％ｗ／ｗと約８０％ｗ／ｗとの間、約５０％ｗ／ｗと約８０％ｗ／ｗとの間、または、約３０％ｗ／ｗと約６０％ｗ／ｗとの間とすることができる。

ここに記載されるポリマー粒子を調製するために、任意の種類の化学的架橋結合を利用することができる。ある実施の形態では、例えば、限定されないが、求核剤／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、求核剤／ハロゲン化物、ビニルスルホン／アクリレートまたはマレイミド／アクリレート等の、化学的架橋結合を利用することができる。１つの実施の形態の例では、フリーラジカル重合を使用することができる。または、アクリレート、アクリルアミド、メタクリレート、メタクリアミドおよびビニル等の単一のエチレン性不飽和基を有するモノマーが、フリーラジカル重合を用いる場合に使用することができる。

所望の粒子を可能とする任意の量のモノマーが使用され得る。溶媒中のモノマー濃度は、約１％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ、約３％ｗ／ｗ、約４％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ、約１０％ｗ／ｗ、約１５％ｗ／ｗ、約２０％ｗ／ｗ、約３０％ｗ／ｗ、約４０％ｗ／ｗ、約５０％ｗ／ｗ、約６０％ｗ／ｗ、約７０％ｗ／ｗ、約８０％ｗ／ｗ、約９０％ｗ／ｗ、約１００％ｗ／ｗ、約１％ｗ／ｗと約１００％ｗ／ｗとの間、約４０％ｗ／ｗと約６０％ｗ／ｗとの間、約５０％ｗ／ｗと約６０％ｗ／ｗとの間、または、約４０％ｗ／ｗと約６０％ｗ／ｗとの間、とすることができる。

モノマーは、ポリマー粒子または粒子塞栓に与えられる所望の化学的および／または機械的特性に基づいて選択され得る。所望する場合には、非荷電の反応性の基を粒子塞栓中に導入することができる。例えば、ヒドロキシル基は、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシメタクリレート、それらの誘導体またはそれらの組み合わせを加えることで、粒子塞栓中に導入することができる。あるいは、非荷電の相対的に非反応性の基を粒子塞栓中に導入することもできる。例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド、メチルメタクリレート、それらの誘導体またはそれらの組み合わせが加えられ得る。

１つの実施の形態では、ポリマー粒子は、重合に適した単一の官能基を有するモノマーから調製することができる。官能基は、アクリレート、アクリルアミド、メタクリレートおよびメタクリルアミド等のフリーラジカル重合に適したものを含むことができる。他の重合スキームは、限定されないが、求核剤／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、求核剤／ハロゲン化物、ビニルスルホン／アクリレートまたはマレイミド／アクリレートを含むことができる。モノマーの選択は、得られる粒子に所望される機械的特性により、および分解生成物による生物学的効果を最小化することにより、決定される。

ある実施の形態では、モノマーは、さらに、塩基性のイオン化可能な官能基（例えば、アミン、それらの誘導体またはそれらの組み合わせ）を含有することができる。アミノ基は、アミンのｐＫａよりも低いｐＨでプロトン化され、アミンのｐＫａよりも高いｐＨで脱プロトン化され得る。他の実施の形態では、モノマーは、さらに、酸性のイオン化可能な官能基（例えば、カルボン酸、スルホン酸、それらの誘導体またはそれらの組み合わせ）を含有する。酸性基は、酸のｐＫａよりも高いｐＨで脱プロトン化され、酸のｐＫａよりも低いｐＨでプロトン化され得る。

正に荷電した薬物の結合が所望される場合、例えばカルボン酸等の負に荷電した基または他の酸性基を有するモノマーを粒子塞栓中に重合させ得る。酸性のイオン化可能なエチレン性不飽和モノマーは、限定されないが、アクリル酸、メタクリル酸、３−スルホプロピルアクリレート、３−スルホプロピルメタクリレート、それらの誘導体、それらの組み合わせ、およびそれらの塩を含み得る。一方、負に荷電した薬物の結合が所望される場合、例えばアミン等の正に荷電した基または他の塩基性基を有するモノマーを含み得る。塩基性のイオン化可能なエチレン性不飽和モノマーは、限定されないが、アミノエチルメタクリレート、アミノプロピルメタクリレート、それらの誘導体、それらの組み合わせ、およびそれらの塩を含み得る。

粒子塞栓の分解生成物により、ホスト（ｈｏｓｔ、被移植者）からごくわずかな応答しか誘発しないように、モノマー選択においてさらなる要因が望まれ得る。他の実施の形態では、ホストからの応答を実質的に誘発しない粒子の分解生成物が望まれ得る。

架橋剤は、１または複数の重合性基を含むことができ、モノマー鎖を互いに結合することができ、固体粒子の形成を可能とする。生理学的環境で分解を受け易い結合を有する架橋剤を使用することによって、生分解性を粒子塞栓に付与することができる。ｉｎ ｖｉｖｏで経時的に結合を壊すことができ、ポリマー鎖をもはや互いに結合し得なくすることができる。モノマーを適切に選択することで、離れて拡散し、ホストによって取り除かれる、水溶性分解生成物の形成を可能にする。エステル、チオエステル、カルバメートおよびカーボネート等の加水分解を受け易い結合、または酵素により分解されるペプチドが、生分解性生成物において使用され得る。

１つの実施の形態では、１または複数の架橋剤は、重合に適した少なくとも２つの官能基、およびポリマー粒子に生分解性を付与するために破損を受け易い少なくとも１つの結合を含有することができる。生理学的環境で破損を受け易い結合は、限定されないが、エステル、チオエステル、カルバメートおよびカーボネートを含む加水分解を受け易いもの、ならびに、マトリクスメタロプロテイナーゼにより切断されるペプチド、マトリクスコラゲナーゼにより切断されるペプチド、マトリクスエラスターゼにより切断されるペプチドおよびマトリクスカテプシンにより切断されるペプチドを含む酵素作用を受け易いものを含み得る。ある実施の形態では、１つの架橋剤だけでは分解速度を制御することが不可能な場合に、複数の架橋剤を使用することができる。１つの実施の形態では、少なくとも１つの架橋剤は加水分解を受け易く、少なくとも１つの架橋剤は酵素分解を受け易い。

ある実施の形態では、少なくとも１つの結合は、マトリクスメタロプロテイナーゼにより切断可能なペプチド、マトリクスコラゲナーゼにより切断可能なペプチド、マトリクスエラスターゼにより切断可能なペプチド、マトリクスカテプシンにより切断可能なペプチド、または、それらの組み合わせである。

他の実施の形態では、ポリマーは、エステル、チオエステル、カーボネート、カルバメート、マトリクスメタロプロテイナーゼにより切断可能なペプチド、マトリクスコラゲナーゼにより切断可能なペプチド、マトリクスエラスターゼにより切断可能なペプチド、および、マトリクスカテプシンにより切断可能なペプチドから選択される第２の結合を含む第２の架橋剤を含み得る。

さらに他の実施の形態では、ポリマーは、第３の架橋剤、第４の架橋剤、第５の架橋剤またはそれ以上の架橋剤を含むことができ、それぞれが同様または異なる結合を含む。

架橋剤は、ペプチド系の架橋剤、カーボネート系の架橋剤、ビスグリシジルアミン架橋剤、ＴＭＰ ｇｌｙエステル架橋剤、ジチオエステル架橋剤、または、ジェファーミングリシジルアミン架橋剤を含み得る。最終生成物中の架橋剤の好ましい濃度は、約０．０５％ｗ／ｗ、約０．１％ｗ／ｗ、約０．５％ｗ／ｗ、約１．０％ｗ／ｗ、約２．０％ｗ／ｗ、約３．０％ｗ／ｗ、約４．０％ｗ／ｗ、約０．１％ｗ／ｗと約４．０％ｗ／ｗとの間、約０．５％ｗ／ｗと約２％ｗ／ｗとの間、または、約１％ｗ／ｗと約１．５％ｗ／ｗとの間、とすることができる。当業者であれば、上述した溶媒中の量に基づく最終濃度の算出方法は理解できる。

１つの実施の形態では、架橋剤は、ペプチド系の化合物とすることができる。１つの実施の形態では、ペプチド系の架橋剤は、

、またはその誘導体とすることができる。

別の実施の形態では、ペプチド系の架橋剤は、

、またはその誘導体とすることができる。

別の実施の形態では、ペプチド系の架橋剤は、二官能性メタクリロイル−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＡＥＥ−メタクリレートとすることができる。

別の実施の形態では、架橋剤は、次の構造式を有することができ、

式中、ｎは、１から２０であり、
ｍは、１から２０であり、
Ｘは、ＯまたはＳである。

別の実施の形態では、架橋剤は、次の構造式を有することができ、

式中、ｎは、１から２０であり、
ｍは、１から２０である。

別の実施の形態では、架橋剤は、次の構造式を有することができる。

架橋剤はまた、次の構造式を有することができ、

式中、ｏは、１から２０であり、
ｐは、１から２０である。

１つの実施の形態では、構造式は、次のようにすることができる。

架橋剤は、さらに、次の構造式を有することができ、

式中、ｑは、１から１０である。１つの実施の形態では、ｑは、１である。

架橋剤はまた、次の構造式を有することができ、

式中、ｒは、１から２０であり、
ＹおよびＺは、それぞれ独立して、Ｏ、ＳおよびＮＨから選択される。

１つの実施の形態では、架橋剤は、次の構造式、

、または、

、を有することができ、式中、ｒは、１から２０である。

さらに、別の実施の形態では、架橋剤は、次の構造式を有することができ、

式中、Ｇ、ＨおよびＪは、それぞれ独立して、ＣＨ_２、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたは存在せず、
ａ、ｂおよびｃは、それぞれ独立して、１から２０であり、
ｇは、１から２０である。

別の実施の形態では、ａ、ｂおよびｃは、それぞれ独立して、１から１０である。さらに別の実施の形態では、Ｇ、ＨおよびＪは、それぞれ独立して、ＯまたはＮＨである。

１つの実施の形態では、架橋剤は、次の構造式を有することができ、

式中、ａ、ｂおよびｃは、それぞれ独立して、１から２０である。

さらに、別の実施の形態では、架橋剤は、次の構造式を有することができ、

式中、Ｌ、ＭおよびＮは、それぞれ独立して、ＣＨ_２、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたは存在せず、
ｄ、ｅおよびｆは、それぞれ独立して、１から２０であり、
ｈは、１から２０である。

別の実施の形態では、ｄ、ｅおよびｆは、それぞれ独立して、１から１０である。さらに別の実施の形態では、Ｌ、ＭおよびＮは、それぞれ独立して、ＯまたはＮＨである。

１つの実施の形態では、架橋剤は、次の構造式を有して、

式中、ｄ、ｅおよびｆは、それぞれ独立して、１から２０である。

架橋剤はまた、次の構造式を有することができ、

式中、ｓは、１から２０であり、
ｔは、１から２０であり、
Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４は、それぞれ独立して、ＯまたはＳである。

１つの実施の形態では、次の構造式とすることができる。

架橋剤はまた、次の構造式を有することができる。

ある実施の形態では、架橋剤は、テトラエステル、テトラチオエステルまたはジチオエステルとすることができる。他の実施の形態では、架橋剤は、ペプチド架橋剤またはカーボネート架橋剤とすることができる。グリシジル系の架橋剤は、ビス−グリシジルアミノアルコールとしてもよい。

プレポリマー溶液の重合は、還元酸化、放射線、熱または当該技術分野で公知である任意の他の方法によって行われ得る。プレポリマー溶液の放射線架橋は、適切な開始剤を用いた紫外光もしくは可視光、または、開始剤無しでの電離放射線（例えば、電子ビームまたはガンマ線）を用いて達成することができる。架橋は、ヒーティングウェル等の熱源を用いて溶液を従来的に加熱すること、または、モノマー溶液に赤外光を適用することのいずれかによる加熱によって達成され得る。モノマー（１または複数）および架橋剤（１または複数）のフリーラジカル重合が好ましく、反応を開始するために開始剤を必要とする。好ましい実施の形態では、架橋方法は、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、または、２，２’アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロリド等の別の水溶性ＡＩＢＮ誘導体を使用する。他の架橋剤は、限定されないが、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン、過硫酸アンモニウム、過酸化ベンゾイル、および、アゾビスイソブチロニトリルも含めたそれらの組み合わせを含み得る。好ましい開始剤は、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンおよび過硫酸アンモニウムの組み合わせとすることができる。

ポリマー粒子は、少なくとも１つの官能基を含む少なくとも１つのモノマーと、化学的加水分解または酵素作用による分解を受け易い少なくとも１つの架橋剤と、開始剤とを含むプレポリマー溶液を油中において反応させることを含む方法によって、製造または形成することができる。

プレポリマー溶液は、モノマー（１または複数）と、架橋剤（１または複数）と、任意で開始剤（１または複数）とを溶媒中に溶解させることによって調製することができる。粒子塞栓は、乳化重合により調製することができる。モノマー溶媒が水である場合では、典型的に鉱油である、モノマー溶液についての非溶媒が、混入した酸素を除去するために超音波処理される。鉱油および界面活性剤は、反応容器に添加される。オーバーヘッドスターラーが反応容器内に配置される。その後、反応容器を密封し、真空下で脱気して、アルゴン等の不活性ガスでスパージングする。開始剤成分のＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンを反応容器に添加して、攪拌を開始する。過硫酸アンモニウムが重合溶液に添加され、その後両方を反応容器に添加し、そこで攪拌によって鉱油中のプレポリマー溶液の液滴が懸濁される。

攪拌速度は粒子の大きさに影響を与えることができ、より速い攪拌ではより小さい粒子を作り出す。攪拌速度は、所望の直径を有する粒子を作るために、約１００ｒｐｍ、約２００ｒｐｍ、約３００ｒｐｍ、約４００ｒｐｍ、約５００ｒｐｍ、約６００ｒｐｍ、約７００ｒｐｍ、約８００ｒｐｍ、約９００ｒｐｍ、約１０００ｒｐｍ、約１１００ｒｐｍ、約１２００ｒｐｍ、約１３００ｒｐｍ、約２００ｒｐｍと約１２００ｒｐｍとの間、約４００ｒｐｍと約１０００ｒｐｍとの間、遅くとも約１００ｒｐｍ、遅くとも約２００ｒｐｍ、速くとも約１３００ｒｐｍ、または、速くとも約１２００ｒｐｍ、とすることができる。

ここに記載するポリマー粒子は、一般的または実質的に球形状を有し得る。実質的に球形状の粒子または球形状の粒子は、約１０μｍ、約２０μｍ、約３０μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７５μｍ、約１００μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、約４００μｍ、約５００μｍ、約６００μｍ、約７００μｍ、約８００μｍ、約９００μｍ、約１０００μｍ、約１１００μｍ、約１２００μｍ、約１３００μｍ、約１４００μｍ、約１５００μｍ、約１６００μｍ、約５０μｍと約１５００μｍとの間、約１００μｍと約１０００μｍとの間、約７５μｍと約１２００との間、小さくとも約５０μｍ、小さくとも約８０μｍ、大きくとも約１５００μｍ、または、大きくとも約１２００μｍ、の直径を有することができる。ある実施の形態では、直径は、約４０μｍと約１２００μｍとの間、約４０μｍと約６０μｍとの間、または約７５μｍと約１２００μｍとの間、とすることができる。

ポリマー粒子は、カテーテルまたは他の送達装置を介した注入後でさえも、その直径を維持することができる。言い換えれば、ポリマー粒子は、送達の間に離れ離れになったり、あるいは破損しないようにすることができる。ある実施の形態では、ポリマー粒子は、送達後において、元のそれらの直径の、約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９０％、約９９％より大きい値、約９８％より大きい値、約９７％より大きい値、約９６％より大きい値、約９５％より大きい値、約９０％より大きい値、約９０％と約１００％との間の値を維持し得る。

ポリマー粒子はまた、特徴的な真円度を有するか、または実質的に円形である相対的な形状を有し得る。この特徴は、その真円度に基づく領域の形状で記載されるか、または定義される。ここに記載するポリマー粒子は、約０．８、０．９、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９、約０．８より大きい、約０．９より大きい、または約０．９５より大きい真円度の割合を有し得る。１つの実施の形態では、ポリマー粒子の真円度は約０．９より大きい。

ポリマー粒子は、カテーテルまたは他の送達装置を介した注入後でさえも、その真円度を維持することができる。ある実施の形態では、ポリマー粒子は、送達後においてそれらの真円度の、約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９０％、約９９％より大きい値、約９８％より大きい値、約９７％より大きい値、約９６％より大きい値、約９５％より大きい値、約９０％より大きい値、約９０％と約１００％との間の値を維持し得る。

重合は、所望の弾力性を持つ粒子を製造するために、必要な限り継続させることができる。重合は、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、約１時間と約１２時間との間、約１時間と約６時間との間、約４時間と約１２時間との間、約６時間と約２４時間との間、約１時間と約９６時間との間、約１２時間と約７２時間との間、または、少なくとも約６時間、継続させることができる。

重合は、所望の弾力性および／または反応時間を持つ粒子を製造されるために、任意の温度で行われ得る。重合は、約１０℃、約２０℃、約３０℃、約４０℃、約５０℃、約６０℃、約７０℃、約８０℃、約９０℃、約１００℃、約１０℃と約１００℃との間、約１０℃と約３０℃との間、低くとも約２０℃、高くとも約１００℃の温度、または、大凡室温で実行することができる。１つの実施の形態では、重合は室温で起こる。

重合が完了した後、ポリマー粒子は、任意の溶質、鉱油、未反応のモノマー（１または複数）および／または未結合のオリゴマーを除去するために洗浄される。任意の溶媒を使用してもよいが、加水分解を受け易い結合を有する粒子を洗浄するため、水溶液が使用される場合は注意するべきである。好ましい洗浄溶液は、限定されないが、アセトン、アルコール、水と界面活性剤、水、生理食塩水、緩衝食塩水、および、生理食塩水と界面活性剤、を含み得る。

任意に、その後、洗浄したポリマー粒子は、マイクロカテーテルへの注入前に可視化するために染色することができる。染浴は、水中に炭酸ナトリウムと所望の染料とを溶解することにより作ることができる。粒子塞栓を染浴に加えて、攪拌する。染色工程の後、任意の未結合の染料を洗浄によって除去する。染色および洗浄の後、粒子をバイアルまたはシリンジ中に包装して、滅菌することができる。

粒子塞栓の調製後、それらを医師による調製の間において可視化するために、任意に染色（着色）することができる。粒子塞栓に共有結合する反応性染料（着色料、色素）の種類から任意の染料を使用することができる。染料は、限定されないが、ｒｅａｃｔｉｖｅ ｂｌｕｅ ２１、ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｒａｎｇｅ ７８、ｒｅａｃｔｉｖｅ ｙｅｌｌｏｗ １５、ｒｅａｃｔｉｖｅ ｂｌｕｅ Ｎｏ．１９、ｒｅａｃｔｉｖｅ ｂｌｕｅ Ｎｏ．４、Ｃ．Ｉ．ｒｅａｃｔｉｖｅ ｒｅｄ １１、Ｃ．Ｉ．ｒｅａｃｔｉｖｅ ｙｅｌｌｏｗ ８６、Ｃ．Ｉ．ｒｅａｃｔｉｖｅ ｂｌｕｅ １６３、Ｃ．Ｉ．ｒｅａｃｔｉｖｅ ｒｅｄ １８０、Ｃ．Ｉ．ｒｅａｃｔｉｖｅ ｂｌａｃｋ ５、Ｃ．Ｉ．ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｒａｎｇｅ ７８、Ｃ．Ｉ．ｒｅａｃｔｉｖｅ ｙｅｌｌｏｗ １５、Ｃ．Ｉ．ｒｅａｃｔｉｖｅ ｂｌｕｅ Ｎｏ．１９、Ｃ．Ｉ．ｒｅａｃｔｉｖｅ ｂｌｕｅ ２１、または、任意の着色添加物を含むことができる。いくつかの着色添加物は、ＦＤＡ ｐａｒｔ ７３、ｓｕｂｐａｒｔ Ｄによって使用が承認されている。他の実施の形態では、粒子塞栓のポリマーマトリクスに不可逆的に結合できる染料を使用してもよい。

ここに記載するポリマー粒子またはマイクロスフィアが上記の任意の反応性染料と十分に結合しない場合、アミンを含有するモノマーを、所望の着色を達成するための量でモノマー溶液へ添加することができる。ポリマー粒子またはマイクロスフィアが上述の反応性染料に十分に結合する場合であっても、アミンを含有するモノマーをモノマー溶液へ添加することができる。アミンを含有する適切なモノマーの例としては、アミノプロピルメタクリレート、アミノエチルメタクリレート、アミノプロピルアクリレート、アミノエチルアクリレート、それらの誘導体、それらの組み合わせ、およびそれらの塩を含む。最終生成物中のアミン含有モノマーの好ましい濃度は、約１％ｗ／ｗ以下とされ得る。

ここに記載する粒子は、実質的にポリマーが分解されることなく滅菌されることができる。滅菌後、ポリマーの少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％が、元の（損なわれていない）状態のままであり得る。１つの実施の形態では、滅菌方法は、オートクレーブで処理することができ、投入前に利用することができる。

最終的なポリマー粒子調製物は、カテーテル、マイクロカテーテル、針または他の同様の送達装置を介して、塞栓すべき部位に送達され得る。インターベンショナルイメージング技術によって血流が当該部位から閉塞されたと判定されるまで、放射線不透過性造影剤をシリンジ中で粒子調製物と十分に混合して、カテーテルを介して注入することができる。

ある実施の形態では、経時的に分解する粒子が望ましいかもしれない。言い換えると、粒子は、分解性および／または生分解性とされ得る。そのような実施の形態では、粒子は、約２日後、３日後、５日後、約２週間後、約１ヶ月後、約２ヶ月後、約６ヶ月後、約９ヶ月後、約１年後、約２年後、約５年後または約１０年後において、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満または約１％未満が元の状態を保つように分解し得る。１つの実施の形態では、粒子は約１ヶ月未満に実質的に分解し得る。別の実施の形態では、粒子は約６ヶ月未満に実質的に分解し得る。

ある実施の形態では、分解は、適切および／または適当な酵素を用いて促進させることができる。ある実施の形態では、ポリマー粒子は、粒子の分解を促進することができる酵素と一緒に注入され得る。他の実施の形態では、酵素は時を隔てて移植された粒子の部位に送達され、その時点で分解を促進することができる。

ある実施の形態では、最終的なポリマー粒子中の架橋剤の割合をより大きくすると、分解により長い時間がかかる。さらに、粒子の直径をより大きくすると、分解により長い時間がかかる。従って、最も長い分解時間を有する粒子は、架橋剤の最大濃度および最大直径を有するものである。このような２つの特性は、必要に応じて分解時間を調整するために変化され得る。

ここに記載するポリマー粒子は、破損して離れたりまたは断片化しない程の十分な圧縮性と耐久性を有することができる。実質的には、マイクロカテーテルを介して送達される間に粒子の真円度または直径に変化は起こらない。言い換えると、マイクロカテーテルを介して送達された後、ここに記載するポリマー粒子は、元の状態の約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％より大きい割合で保たれている。

さらに、ある実施の形態では、粒子は組織に付着することができ、および／または組織との摩擦によって所定位置に残ることができる。他の実施の形態では、粒子は、血液自体の流れおよび圧力によって脈管中で所定位置に保持される栓（ｐｌｕｇ）として機能することができる。さらに他の実施の形態では、特定の作用部位での粒子の凝集を補助するために、粒子を互いに付着するのに十分な粘着性を有するものとすることができる。

記載されるポリマー粒子は、マイクロカテーテルまたは他の適切な送達装置を介して遠隔組織へ送達することができ、または針を通して局所組織へ注入することができる。ポリマー粒子は、血管部位および体内の空洞の閉塞のために使用することができる。

ある実施の形態では、ポリマー粒子は、多血性腫瘍および／または動静脈奇形の塞栓のために構成され得る。ある実施の形態では、多血性腫瘍または動静脈奇形を示す患者が選択され得る。マイクロカテーテルは腫瘍または奇形の部位に移動させることができる。ここに記載するポリマー粒子は、当該部位を安定化させるために、その中へ注入されることができ、それによって患者の状態を治療する。

実施例１：グリシジル系の架橋剤の調製

２，２−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）１０ｇ（６７．６ｍｍｏｌ）の一定分量を、グリシジルメタクリレート１０ｇ（７０．４ｍｍｏｌ）およびシリカゲル３ｇ（Ａｌｄｒｉｃｈ社 ６４５５２４、６０オングストローム、２００−４２５メッシュ）と混合した。１時間の攪拌後、さらにグリシジルメタクリレート９ｇ（６３．４ｍｍｏｌ）を加えて、懸濁液をさらに１．５時間攪拌した。混合液をクロロホルム２００ｍＬで希釈して、６００ｍＬのフリットガラスブフナー漏斗で濾過して、シリカゲルを除去した。得られたクロロホルム溶液のＬＣ−ＭＳ分析では、モノ−グリシジルアミノアルコールは示されず、主に、４３３．２ｍ／ｚでの［Ｍ＋Ｈ］^＋において、ビス−グリシジルアミノアルコールが示された。溶液を真空中で約５０ｇに濃縮した。得られた重いシロップを、アセトニトリルで１００ｍＬに希釈して、−８０℃で保存した。

実施例２：ペプチド系の架橋剤の調製

ヘテロ二官能性のテトラペプチド（アクリロイル−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＡＥＥ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を準備した（Ｂａｃｈｅｍ社、カリフォルニア州トーランス）。ペプチド（６５３ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を、５ｍＬのＤＭＦおよびＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドヒドロクロリド（１９０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）中に溶解させて、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７４μＬ、１ｍｍｏｌ）を加えた。２時間後、ブチル化ヒドロキシトルエン２０ｍｇを加えて、反応混合物を空気に曝した。反応混合物をエチルエーテル２００ｍＬで沈殿させ、遠心分離で固体を回収した。ペレットを、クロロホルム／メタノール／メタノール＋５％アンモニア水の、９０／５／５（の割合）の溶液中に再度溶解させて、５×２０ｃｍカラム（Ａｌｄｒｉｃｈ社、６０オングストローム、２００−４２５メッシュ）中のシリカゲル５０ｇに適用した。クロロホルム／メタノール／メタノール＋５％アンモニア水の９０／５／５（の割合）の溶液５００ｍＬを用いてシリカゲルカラムで展開させて、ペプチド含有溶離液を真空中で濃縮すると、淡黄色油状物１１０ｇが得られた。淡黄色油状物を、メタノール１０ｍＬ中に溶解させて、−８０℃で保存した。生成物のＬＣ−ＭＳ分析では、所望の６８０ｍ／ｚでの［Ｍ＋Ｈ］^＋および７０２ｍ／ｚでの［Ｍ＋Ｎａ］^＋を示した。

実施例３：ＭＡ−ＡＥＥＡｃ−ＡＬＡＬ−ＡＥＥＡｃ−ＭＡ、ＡＬＡＬテトラペプチド架橋剤

清潔な乾燥させた１５ｍＬフラスコ中において、乾燥させた攪拌棒および乾燥させたセプタム（ｓｅｐｔｕｍ）を使用して、ＮＨＳエステル、ＭＡ−ＡＥＥＡｃ−ＡＬＡＬ−ＡＥＥＡｃ−ＮＨＳの８４１ｍｇ（１ｍｍｏｌ）に、３−アミノプロピルメタクリレート−ＨＣｌ１７９ｍｇを加えて、続けて乾燥ジメチルホルムアミド５ｍＬを加えた。攪拌中に、透明な溶液を得て、ジイソプロピルエチルアミン２００μｌ（１ｍｍｏｌ）を一度に全て加えた。１時間後、反応混合物を、３×５ｍＬのメタノールを使用して、２５０ｍＬの梨型フラスコに移して、真空（ｖａｃ）ラインに一晩置いた。次の日に、反応混合物を、メタノール２ｍＬと共にシンチレーションバイアルに移して、約３５％の固体を得て、−８０℃で保存した。このような粗製の架橋剤では、８６９．９ｍ／ｚでの［Ｍ＋Ｈ］^＋において単一のＨＰＬＣピークが得られ、Ｃ_４１Ｈ_７２Ｎ_８Ｏ_１２に関して計算される分子量は８６８．５である。

実施例４：カーボネート架橋剤

１：１の割合のアセトニトリル：メタノールの５００ｍＬ中に懸濁されている炭酸セシウム３３ｇ（１００ｍｍｏｌ）に、１時間以上よく攪拌しながら、メタクリル酸１７．２ｇ（２００ｍｍｏｌ）を加えた。さらに２時間攪拌した後、反応混合物から溶媒を取り除き、残留物を乾燥エーテル５００ｍＬ中に懸濁して、媒体（ｍｅｄｉｕｍ）フリットを備える、乾燥させた６００ｍＬのブフナー漏斗上での濾過により回収した。注意して乾燥エーテルで数回漏斗上で固体を洗い流した後、固体を真空オーブン中で一晩乾燥させて、吸湿性のベージュ色の粉末（化合物Ａ）４５ｇを得た。この粉末は、直ぐに乾燥環境中に置いておく必要がある。

ＨＥＭＡ−１−クロロエチルカーボネート
乾燥エーテル１０００ｍＬ中のＨＥＭＡ２４ｍＬ（２００ｍｍｏｌ）に、アルゴン下で４−１０℃において、ピリジン１６．８ｍＬ（２１３ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液に、１−クロロエチルクロロカーボネート２１．３ｍＬ（２００ｍｍｏｌ）を、３０分以上攪拌しながら滴下して加えた。４−１０℃での３０分の攪拌後、重い沈殿物（化合物Ｂ）を濾過により取り除き、濾液を真空下で油状物へ濃縮して、４４ｇ（１００％）を得た。

無水ジメチルホルムアミド４０ｍＬ中の化合物Ｂ４．４ｇ（２０ｍｍｏｌ）に、化合物Ａ０．９ｇ（４．０ｍｍｏｌ）を、よく攪拌しながらアルゴン下で１００℃において加えた。１５分後、さらに化合物Ａ１．２ｇ（５．４ｍｍｏｌ）を、よく攪拌しながらアルゴン下で１００℃において加えて、続けて同様の条件下で最後に０．９ｇ（４．０ｍｍｏｌ）添加して、合計で化合物Ａを２．９ｇ（１３．４ｍｍｏｌ）とした。黄褐色の反応混合物を、さらに３時間１００℃で加熱して、室温に冷却した後、溶媒を真空中で除去して、残留物を一晩真空ライン上に残した。残留物を、１：１のクロロホルム：ヘキサン５０ｍＬ中に入れて、７５０ｇの金のカラムに適用して、ヘキサンとその次に０−２０％のヘキサン中の酢酸エチルを用いて溶出させた。２７分で、次の構造式のカーボネートがまず出てきて

、３２分で、次の構造式のカーボネートが最終的に出てきた。

実施例５：ＴＭＰ Ｇｌｙエステル

ＴＭＰ−クロロアセトアミド
乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２５０ｍＬ中のトリアミノトリメチロールプロパンエトキシレート１３．２ｇに、ピリジン６．３２ｇ（８０ｍｍｏｌ）を加えて、この溶液をよく攪拌しながらアルゴン（Ａｒ）下で４−１０℃においてＴＨＦ２５０ｍＬ中のクロロアセチルクロリド６．４４ｇに加えた。１５分間攪拌した後、反応混合物を室温まで温めて、ＴＨＦおよび他の揮発性物質を真空下で除去した。得られた固体を、クロロホルム２００ｍＬ中に溶解させて、次に、当該クロロホルムを飽和重炭酸ナトリウム水溶液１００ｍＬで洗浄して、硫酸マグネシウムで乾燥させて、溶媒を真空中で除去した。

ＴＭＰ−ＮＨ−Ｇｌｙ−メタクリレート
無水ジメチルホルムアミド７５ｍＬ中に溶解させた約１５ｇの上記物質に、セシウムメタクリレート１８ｇを加えて、得られた懸濁液を４０−５０℃で２時間加熱した。

クロロホルム５００ｍＬで沈殿させた後、無機塩を濾過により回収して、濾液を真空下で油状物に濃縮し、赤褐色油状物１８ｇを得た。この油状物は、８０℃でＡＩＢＮを用いて重合させると、ＩＰＡ中で硬いペレットとなった。２−２０％のクロロホルム中のメタノール１２００ｍＬを用いた上記シリカの栓（ｐｌｕｇ）でのこの物質６ｇのクロマトグラフィーでは、明るい赤色の物質６ｇが得られた。

実施例６：ジチオエステル

テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２００ｍＬ中の２，２’−（エチレンジオキシ）エタンジチオール６．６ｍＬ（４０ｍｍｏｌ）に、ジイソプロピルエチルアミン２０．９ｍＬを加えて、得られた乾燥溶液を１時間以上よく攪拌しながら−５℃で乾燥ＴＨＦ２００ｍＬ中のメタクリロイルクロリド１１．５ｍＬ（１２０ｍｍｏｌ）に添加した。反応混合物を０℃で１時間攪拌して、２０℃で１時間攪拌した時点でイソプロピルアルコール１０ｍＬを添加して、溶媒を真空中で除去した。

残留物を最小量のクロロホルム中で３３０ｇのシリカ（金）カラムに適用して、塩化メチレン中０−５％イソプロピルアルコールを用いて、２００ｍＬ／分でカラムから溶出させた。単一のピークとして１３−１４分において溶出された留分を、黄色油状物１．３ｇとして単離した。この物質５０ｍｇに対するＡＩＢＮによる開始反応によって、硬いペレットが現れた。

実施例７：ジチオエステル

メタクリロイルクロリド０．４ｍＬ（４ｍｍｏｌ）を含有する乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）４０ｍＬに、２．０ｇ（１．３３ｍｍｏｌ）のポリ（エチレングリコール）ジチオール１５００ｍｗおよび０．７ｍＬ（４．０ｍｍｏｌ）のジイソプロピルエチルアミンを含有する乾燥ＴＨＦ２０ｍＬを、０℃において迅速に攪拌しながら５分間以上滴下しながら加えた。２時間攪拌した後、反応混合物を室温まで温めて、溶媒を真空中で除去した。その後、クロロホルム１００ｍＬが反応混合物を溶解するために使用され、メタクリロイルクロリドを飛沫同伴するように真空中で除去された。

反応混合物を、約３０ミクロンでの真空ラインに一晩置くと、黄色の固体が形成された。イソプロピルアルコール５０μＬ中におけるこの物質５０ｍｇに対するＡＩＢＮによる開始反応によって、スポンジ状黄色のゲルが生成された。

実施例８：ジェファーミングリシジルアミン

ジェファーミン１１ｇ（２５ｍｍｏｌ）に、グリシジルメタクリレート１０．５ｇ（７５ｍｍｏｌ）を加え、続けて４ｇのシリカゲルおよび１００ｍｇのブチル化ヒドロキシトルエンを加えた。反応混合物を２０℃で攪拌した。２時間後、クロロホルム５０ｍＬを、増粘性の反応混合物に添加して、撹拌を続けた。さらに１８時間後、クロロホルム２００ｍＬをさらに添加して、シリカゲルを除去するために反応混合物を濾過して、ほとんどの溶媒を真空中で取り除いた。残留物をイソプロピルアルコール２０ｍＬ中に溶解させて、約５０％のジェファーミングリシジルアミン４０ｍＬを得た。

実施例９：グリシジル系の架橋剤で調製された粒子

アクリルアミド６．２ｇと、３−スルホプロピルアクリレートカリウム塩１４．６ｇと、実施例１のように調製したグリシジル系の架橋剤０．３ｇとを蒸留水２０．０ｇ中で溶解させて、プレポリマー溶液を調製した。この溶液を濾過して、その後５分間真空脱気してアルゴンでフラッシングした。鉱油１リットルを１時間超音波処理して、その後オーバーヘッド攪拌具を備えた密閉反応容器へ加えた。容器を少なくとも１時間真空脱気して、その後真空をアルゴンで置き換えた。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン約３ｍＬを反応容器に添加して、３００ｒｐｍでオーバーヘッド攪拌を開始した。過硫酸アンモニウム１．０ｇを蒸留水２．０ｇ中に溶解させて、開始剤溶液を調製した。この溶液を濾過して、約５５０μＬをプレポリマー溶液に添加した。混合後、溶液を反応容器に加えた。５から１０分後、鉱油１０ｍＬ中のＳＰＡＮ（登録商標）８０の０．３５ｍＬの溶液を添加して、得られた懸濁液を少なくとも４時間重合させた。

実施例１０：ペプチド架橋剤で調製された粒子

アクリルアミド３．８ｇと、３−スルホプロピルアクリレートカリウム塩５．４ｇと、実施例２のように調製したペプチド系の架橋剤０．０５ｇとを蒸留水１０．０ｇ中で溶解させて、プレポリマー溶液を調製した。この溶液を濾過して、その後５分間真空脱気してアルゴンでフラッシングした。鉱油（３００ｍＬ）を１時間超音波処理して、その後オーバーヘッド攪拌具を備えた密閉反応容器へ加えた。容器を１時間真空脱気して、その後真空をアルゴンで置き換えた。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（２ｍＬ）を反応容器に添加して、３００ｒｐｍでオーバーヘッド攪拌を開始した。過硫酸アンモニウム１．０ｇを蒸留水２．０ｇ中に溶解させて、開始剤溶液を調製した。この溶液を濾過して、約３００μＬをプレポリマー溶液に添加した。混合後、溶液を反応容器に加えた。５から１０分後、鉱油１０ｍＬ中のＳＰＡＮ（登録商標）８０の０．５ｍＬの溶液を添加して、得られた懸濁液を５時間重合させた。

実施例１１：粒子の精製

重合が完了した後、鉱油を反応容器からデカントして、ポリマー粒子を新鮮なヘキサンで４回洗浄し、鉱油を除去した。その後、粒子をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と共に分液漏斗に移して、残留鉱油およびヘキサンから分離した。得られた混合物をＰＢＳで２回洗浄した。

粒子をふるいを用いてサイズで分けた。ふるいは、（上部の）大きいサイズから（下部の）小さいサイズへと積層している。ふるい分け工程を補助するために、ふるい振とう機を利用した。ＰＢＳと共に、上部のふるい上に粒子を置いた。全ての粒子を仕分けた後、それらのサイズに応じて回収して、ボトル中に入れた。

ふるい分け後、粒子をその貯蔵期限を延ばすために脱水した。撹拌しながら、粒子を溶媒／水混合物の一連の勾配中に置いた。アセトンおよびエタノールの両方を、粒子を首尾よく脱水するために使用した。少なくとも４時間、粒子を、７５％の溶媒、８５％の溶媒、９５％の溶媒、９７％の溶媒および１００％の溶媒中に懸濁した。その後、粒子を凍結乾燥し、包装して滅菌した。

実施例１２：粒子の送達特性の判定

送達特性を評価するために、実施例９と同様の手法で調製した粒子を、４．５×１．５ｃｍのフィギュア・エイト・ノット（ｆｉｇｕｒｅ−ｅｉｇｈｔ ｋｎｏｔ）を備えるヘッドウェイ１７マイクロカテーテル（０．０１７’’、４３２μｍ内腔）を介して注入した。２から３ｍＬの粒子、３から４ｍＬの生理食塩水および４から５ｍＬの比較対照を混合することにより、試験サンプルを調製した。サンプルは、マイクロカテーテルを介して１ｍＬシリンジを使用して皿の中へ注入された。マイクロカテーテルを介する注入前後の粒子の写真を撮影した。Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ画像分析ソフトウェアを用いて、粒子の直径および真円度を判定した。以下の表は、結果をまとめたものである。

ある実施の形態では、領域の形状要素は、その真円度に基づく領域の形状で記載される。完全な円では値は１となる。その領域がより細長くなれば、形状要素がより小さくなる。計算は、領域充填および周囲のクロフトン（Ａｒｅａ ｆｉｌｌｅｄ ａｎｄ Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ Ｃｒｏｆｔｏｎ）パラメータに基づき行われる。

粒子の真円度または直径において変化は観察されず、これは、粒子がマイクロカテーテルを介する送達の間に破損して離れたり断片化しなかったことを示している。即ち、粒子はカテーテルを介する送達の時には実質的に元の状態を維持していた。

実施例１３：ｉｎ ｖｉｔｒｏでの加水分解性の判定

異なる量の架橋剤を用いて調製した粒子のサンプルをＰＢＳ中に入れて３７℃で保存し、分解時間を判定した。視覚分析には、粒子の色および透明性、粒子の輪郭の可視性、ならびに、可視粒子の数、を含ませた。サンプルについての評価尺度には、（５）実験開始から粒子数、輪郭または量に変化が無い、（３）十分な粒子数でぼやけた粒子輪郭がまだ見える、（１）殆ど粒子が見えない、および、（０）サンプル中で粒子が観察されない、を含ませた。結果を図１に示す。結果は、分解が架橋剤の濃度に依存し得ることを示している。例えば、最長の分解時間は最大の架橋剤の濃度で起こっていた。

図２は、架橋剤の量の関数として３７℃での分解時間を図式的に示している。図示されるように、架橋剤の割合がより大きいと分解がより長くかかる。さらに、より大きい粒子の直径では（マイクロメートル単位における、グラフの右の数）、分解により長い時間がかかる。このように、最大の分解時間を有する粒子は、最大の架橋剤の濃度および最大の直径を有するものである。これら２つの特性は、必要に応じて分解時間を調整するために変化させることができる。

実施例１４：テトラエステル架橋剤

２００ｍＬのナス型フラスコに、コハク酸１０ｇ（８４．８ｍｍｏｌ）と、アリルアルコール４０ｇ（０．６８９ｍｏｌ）と、９８％のＨ_２ＳＯ_４３０μＬとを加えた。反応混合物を６時間還流して、次いで１Ｍ炭酸ナトリウム溶液２５ｍＬの添加によりクエンチした。溶媒を真空下で除去して、粗製物質を水２５ｍＬ中で再構成させて、生成物であるコハク酸ジアリルを４×５０ｍＬの酢酸エチルで抽出した。有機相を回収して、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、その後溶媒を真空下で除去して、コハク酸ジアリル９．２６ｇを得た。

１Ｌの丸底フラスコにおいて、コハク酸ジアリル５．２ｇ（２６．３ｍｍｏｌ）と、メタ−クロロ過酸化安息香酸（ｍＣＰＢＡ）２０ｇ（０．１１６ｍｏｌ）とをジクロロメタン４００ｍＬ中に溶解させた。反応混合物を４０℃で一晩還流した。その後、副生成物のｍ−クロロ安息香酸を除去するために、反応混合物をアンバーリスト遊離塩基カラムに通した。溶媒を真空下で除去して、粗製物質を得た。２１０ｎｍでの５％から２０％のヘキサン中の酢酸エチルを使用したクロマトグラフィーで、純粋なコハク酸ジグリシジルを得た。

２０ｍＬのバイアルに、コハク酸ジグリシジル１．１５ｇ（５ｍｍｏｌ）と、メタクリル酸９５０ｍｇ（１１ｍｍｏｌ）と、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムブロミド（［ｂｍｉｍ］Ｂｒ）１．５ｇ（７ｍｍｏｌ）とを加えた。反応混合物を７５℃で攪拌した。１時間後、ＴＬＣではエポキシドが無いことを示していた。反応混合物を１Ｍ炭酸ナトリウム溶液５０ｍＬ中に懸濁して、３×５０ｍＬの酢酸エチルを用いて生成物を抽出した。有機相を回収して、ＭｇＳＯ_４で乾燥させて、その後真空下で濃縮した。５０：５０の酢酸エチル：ジクロロメタンを用いてＴＬＣで展開させると、１つのスポットのみを示していた。２ｇの表題のテトラエステル架橋剤が、９９％の収率で回収された。

実施例１５：テトラチオエステル架橋剤

０℃で冷却されたアルゴン下で、５００ｍＬの三つ口丸底フラスコに、１００ｍＬの乾燥ＴＨＦを加えた。攪拌しながら、２，２’−（エチレンジオキシ）エタンチオール２０ｇ（０．１１ｍｏｌ）と、ジイソプロピルエチルアミン１６ｍＬ（０．０９ｍｏｌ）を加えた。４０ｍＬの乾燥ＴＨＦにスクシニルクロリド５ｍＬ（０．０４５ｍｏｌ）を溶解させた。アルゴン下で激しく攪拌しながら添加漏斗を介して、溶液を０℃で反応混合物中に滴下して加えた。添加後、反応混合物を０℃で１時間攪拌して、その後室温まで温めて一晩攪拌した。その後、反応混合物を氷上で冷却してアミン塩を沈殿させた。媒体フリットガラスフィルターで濾過することにより白色沈殿物を除去して、氷冷ＴＨＦで洗浄した。濾液を回収して、真空下で濃縮した。２５４ｎｍでの０％から１５％のＤＣＭ中の酢酸エチルを用いたフラッシュクロマトグラフィーで、ジチオールエステル中間体が得られた。

０℃に冷却されたアルゴン下で、２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコに５０ｍＬの乾燥ＴＨＦを加えた。攪拌しながら、ジチオールエステル中間体３．１７ｇ（７．１ｍｍｏｌ）と、ジイソプロピルエチルアミン３．６ｍＬ（２０ｍｍｏｌ）を加えた。５０ｍＬの乾燥ＴＨＦにメタクリロイルクロリド２ｍＬ（２０ｍｍｏｌ）を溶解させた。アルゴン下で激しく攪拌しながら添加漏斗を介して、溶液を０℃で反応混合物中に滴下して加えた。添加後、反応混合物を１時間以上０℃で攪拌して、その後室温まで温めて一晩攪拌した。その後、反応混合物を氷上で冷却してアミン塩を沈殿させた。媒体フリットガラスフィルターで濾過することにより白色沈殿物を除去して、氷冷ＴＨＦを用いて洗浄した。濾液を回収して、真空下で濃縮した。２５４ｎｍでの０％から１０％のジクロロメタン中の酢酸エチルを用いたフラッシュクロマトグラフィーで、４分から１２分において、所望のテトラチオールエステル架橋剤が溶出された。質量分析では、Ｃ_２４Ｈ_３８Ｏ_８Ｓ_４の計算された質量の［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対応する６０５．１が得られた。

実施例１６：ペプチド架橋剤で調製された粒子

アクリルアミド３．１ｇと、３−スルホプロピルアクリレートカリウム塩７．３ｇと、実施例３のように調製したペプチド系の架橋剤０．２ｇとを蒸留水１０．０ｇ中で溶解させて、プレポリマー溶液を調製した。この溶液を濾過して、その後５分間真空脱気してアルゴンでフラッシングした。鉱油（５００ｍＬ）を１時間超音波処理して、その後オーバーヘッド攪拌具を備えた密閉反応容器へ加えた。容器を少なくとも１時間真空脱気して、その後真空をアルゴンで置き換えた。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン約２ｍＬを反応容器に添加して、３００ｒｐｍでオーバーヘッド攪拌を開始した。過硫酸アンモニウム１．０ｇを蒸留水２．０ｇ中に溶解させて、開始剤溶液を調製した。この溶液を濾過して、約２５０μＬをプレポリマー溶液に添加した。混合した後、溶液を反応容器に加えた。次いで、鉱油１０ｍＬ中のＳＰＡＮ（登録商標）８０の０．３５ｍＬの溶液を添加して、得られた懸濁液を少なくとも４時間にわたって重合させた。

実施例１７：ｉｎ ｖｉｔｒｏでの酵素分解性の判定

ペプチドの架橋剤を用いて調製した粒子のサンプルを、酵素存在下および酵素不在下のＰＢＳ中に入れて、３７℃または５５℃でインキュベートして、分解時間を判定した。サンプルには、高濃度酵素および低濃度酵素を含ませている。

視覚分析には、粒子の色および透明性、粒子の輪郭の可視性、ならびに、可視粒子の数、を含ませた。サンプルについての評価尺度には、（５）実験開始から粒子数、輪郭または量に変化が無い、（３）十分な粒子数でぼやけた粒子輪郭がまだ見える、（１）殆ど粒子が見えない、および、（０）サンプル中で粒子が観察されない、を含ませた。結果を図３に示す。結果は、粒子はゆっくりと加水分解されるが、適当な酵素の存在下では分解速度が増加し得ることを示している。例えば、最短の分解時間はＰＢＳ溶液中の酵素の最高濃度存在下で起こっていた。

前述の開示は例示的な実施の形態である。ここに記載された機器、技術および方法は、本開示の実践においてよく機能する代表的な実施の形態を明らかにしているものであることは当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に鑑みて、記載された具体的な実施の形態において多くの変形を作ることが可能であり、本発明の精神および範囲から逸脱することなく類似または同様の産物も得ることができることを理解すべきである。

別段の指示がない限り、明細書および特許請求の範囲において使用される成分の量、分子量等の性質、反応条件を表現する全ての数字は、全ての場合において「約（ａｂｏｕｔ）」の用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。従って、逆の指示がない限り、明細書および添付の特許請求の範囲において示される数値パラメータは、本発明により得ようとする所望の特性によって変わり得る近似値である。少なくとも、均等論の適用を特許請求の範囲の範囲に限定しようとする試みとしてではなく、それぞれの数値パラメータは、少なくとも、報告された重要な数字の数を考慮し、通常の丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。本発明の広範な範囲を示す数値範囲およびパラメータが近似値であるにもかかわらず、具体例に示される数値はできるだけ正確に報告される。しかしながら、どんな数値もそれぞれの試験測定で見られる標準偏差に必然的に由来する特定の誤差を本質的に含む。

本発明を説明する文脈（特に以下に示す特許請求の範囲の文脈）で使用される「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」の用語および類似の指示対象は、ここで別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数と複数の両方を包含するものと解釈される。ここでの数値範囲の記載は、その範囲内にある個々の値を別々に指している簡単な方法としての役割を果たすことを目的としているにすぎない。ここで別段の指示がない限り、個々の値は、ここで個々に記載されるかのように、明細書中に組み込まれる。ここに記載される全ての方法は、ここで別段の指示がないか、またはそうでなければ文脈によって明らかに矛盾しない限り、適切な任意の順番で行うことができる。あらゆる全ての実施例、またはここに提供される例示的な文言（例えば「ｓｕｃｈ ａｓ」）の使用は、本発明を十分に説明することだけを目的とするものであり、他の形で請求される本発明の範囲に限定を課すものではない。明細書中の用語は、本発明の実践に必須の任意の請求されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。

本開示では代替物のみと「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」とを示す定義がサポートされているが、特許請求の範囲における「または（ｏｒ）」の使用は、明示的に代替物のみを示していたり、または代替物が相互排他的でない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味するように使用される。

ここに記載される本発明の代替の要素または実施の形態のグループ化は限定されるものとして解釈されない。各グループのメンバーは、個々において、または当該グループの他のメンバーもしくはここで見られる他の要素との任意の組み合わせにおいて示してもよく、特許請求の範囲としてもよい。グループの１または複数のメンバーを、利便性および／または特許性の理由でグループに含めてもよいし、グループから削除してもよいことは認識され得ることである。このような包含または削除が起こる場合、明細書は、修正されたグループを包含するものとみなされ、従って、添付の特許請求の範囲において使用される全てのマーカッシュグループの記載を満たす。

本発明の好ましい実施の形態は、本発明者が知っている本発明を行うための最良の形態を含めてここに記載される。当然、これらの好ましい実施の形態の変形は、前述の記載を読むことで、当業者にとって明らかになるだろう。本発明者は当業者が適切にこのような変形を用いることを予測しており、本発明者は本発明についてここに具体的に記載される以外の方法で実践される発明についても意図している。従って、本発明は適用法で認められるように、ここに添付された特許請求の範囲に記載される主題の全ての変形および同等物を含む。さらに、その全ての可能な変形における上述の要素の任意の組み合わせが、ここで別段の指示がないか、またはそうでなければ文脈によって明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。

ここに記載される具体的な実施の形態は、特許請求の範囲において、「〜からなる」または「本質的に〜からなる」との用語を使用することで、さらに限定してもよい。特許請求の範囲で使用された場合、補正毎での作成または追加で、「〜からなる」との移行用語は、特許請求の範囲において特定されていない、任意の要素、工程または成分を除外する。「本質的に〜からなる」との移行用語は、特定された材料または工程について請求項の範囲を限定するが、それは基本的なものおよび新規特徴（１または複数）に実質的に影響を与えないものである。そのように請求項での本発明の実施の形態は、本質的または明示的にここに記載されており、対応している。

さらに、ここに開示される本発明の実施の形態は本発明の原則を例示していると理解されるべきである。採用できる他の変更は本発明の範囲内にある。そのため、例として、限定されることはないが、本発明の代わりの構成をここでの教示に従って利用してもよい。従って、本発明は、正確に示され記載されているものに限定されない。

（関連する出願）
本出願は、２０１３年９月１９日に提出された米国仮特許出願第６１／８８００３６号の利益を主張しており、その全体の記載は参照によりここに組み込まれる。

（付記）
（付記１）
少なくとも１つの官能基を含む少なくとも１つのモノマー、および、
少なくとも１つの架橋剤、を含み、
約４０μｍと約１２００μｍとの間の直径を有しており、加水分解または酵素作用による分解を受け易い、
ポリマー粒子。

（付記２）
前記ポリマー粒子は、約７５μｍと約１２００μｍとの間の直径を有する、付記１に記載のポリマー粒子。

（付記３）
前記少なくとも１つの官能基は、アクリレート、アクリルアミド、メタクリレートまたはメタクリルアミドである、付記１に記載のポリマー粒子。

（付記４）
前記少なくとも１つのモノマーは、イオン化可能な官能基を含む、付記１に記載のポリマー粒子。

（付記５）
前記イオン化可能な官能基は、塩基性である、付記４に記載のポリマー粒子。

（付記６）
前記イオン化可能な官能基は、酸性である、付記４に記載のポリマー粒子。

（付記７）
前記少なくとも１つの架橋剤は、少なくとも２つの官能基を含む、付記１に記載のポリマー粒子。

（付記８）
前記架橋剤は、加水分解または酵素作用による分解を受け易い少なくとも１つの結合を含む、付記１に記載のポリマー粒子。

（付記９）
前記架橋剤は、ビス−グリシジルアミノアルコールである、付記８に記載のポリマー粒子。

（付記１０）
前記架橋剤は、

、

、

、

、

、

、

、または、

、であり、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆは、それぞれ独立して、１から２０である、付記８に記載のポリマー粒子。

（付記１１）
前記少なくとも１つの結合は、エステル、チオエステル、カーボネート、マトリクスメタロプロテイナーゼにより切断可能なペプチド、マトリクスコラゲナーゼにより切断可能なペプチド、マトリクスエラスターゼにより切断可能なペプチド、マトリクスカテプシンにより切断可能なペプチド、または、それらの組み合わせである、付記８に記載のポリマー粒子。

（付記１２）
エステル、チオエステル、カーボネート、マトリクスメタロプロテイナーゼにより切断可能なペプチド、マトリクスコラゲナーゼにより切断可能なペプチド、マトリクスエラスターゼにより切断可能なペプチド、および、マトリクスカテプシンにより切断可能なペプチドから選択される第２の結合を含む第２の架橋剤を含む、付記１１に記載のポリマー粒子。

（付記１３）
前記ポリマー粒子は、生分解性である、付記１に記載のポリマー粒子。

（付記１４）
前記ポリマー粒子は、移植後約１ヶ月以内に、実質的に分解される、付記１に記載のポリマー粒子。

（付記１５）
前記少なくとも１つのモノマーはジメチルアクリルアミドであり、前記少なくとも１つの架橋剤はビス−グリシジルアミノアルコールである、付記１１に記載のポリマー粒子。

（付記１６）
前記少なくとも１つのモノマーはアクリルアミドであり、前記少なくとも１つの架橋剤は二官能性メタクリロイル−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＡＥＥ−メタクリレートである、付記１１に記載のポリマー粒子。

（付記１７）
少なくとも１つの官能基を含む少なくとも１つのモノマーと、加水分解または酵素作用による分解を受け易い少なくとも１つの架橋剤と、開始剤とを含むプレポリマー溶液を油中において反応させること、および、
約４０μｍと約１２００μｍとの間の直径を有するポリマー粒子を形成させること、を含む、ポリマー粒子を製造する方法。

（付記１８）
前記油は、鉱油である、付記１７に記載の方法。

（付記１９）
前記開始剤は、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンである、付記１７に記載の方法。

（付記２０）
前記ポリマー粒子は、少なくとも約０．９０の真円度を有する、付記１７に記載の方法。

（付記２１）
前記少なくとも１つの官能基は、アクリレート、アクリルアミド、メタクリレートまたはメタクリルアミドである、付記１７に記載の方法。

（付記２２）
前記少なくとも１つの架橋剤は、ビス−グリシジルアミノアルコールである、付記１７に記載の方法。

（付記２３）
前記少なくとも１つの架橋剤は、

、

、

、

、

、

、

、または、

、であり、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆは、それぞれ独立して、１から２０である、付記１７に記載の方法。

（付記２４）
前記ポリマー粒子は、生分解性である、付記１７に記載の方法。

（付記２５）
前記ポリマー粒子は、移植後約６ヶ月以内に、実質的に分解される、付記２４に記載の方法。

（付記２６）
前記少なくとも１つのモノマーはアクリルアミドであり、前記少なくとも１つの架橋剤はビス−グリシジルアミノアルコールである、付記２４に記載の方法。

（付記２７）
前記少なくとも１つのモノマーはアクリルアミドであり、前記少なくとも１つの架橋剤は二官能性メタクリロイル−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＡＥＥ−メタクリレートである、付記２４に記載の方法。

Claims (23)

1. 少なくとも１つの官能基を含む少なくとも１つのモノマー、および、
   少なくとも１つの架橋剤、を含み、
   前記少なくとも１つの架橋剤は、ビス−グリシジルアミノアルコール、二官能性メタクリロイル−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＡＥＥ−メタクリレート、
   

   

   、
   

   

   、
   

   

   、
   

   

   、
   

   

   、
   

   

   、
   

   

   、または、
   

   

   （式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆは、それぞれ独立して、１から２０である）
   であり、
   ４０μｍと１２００μｍとの間の直径を有しており、加水分解または酵素作用による分解を受け易い、
   ポリマー粒子。
2. 少なくとも１つの官能基を含む少なくとも１つのモノマー、および、
   少なくとも１つの架橋剤、を含み、
   前記架橋剤は、加水分解または酵素作用による分解を受け易い少なくとも１つの結合を含み、
   前記少なくとも１つの結合は、エステル、チオエステル、カーボネート、マトリクスメタロプロテイナーゼにより切断可能なペプチド、マトリクスコラゲナーゼにより切断可能なペプチド、マトリクスエラスターゼにより切断可能なペプチド、マトリクスカテプシンにより切断可能なペプチド、または、それらの組み合わせであり、
   前記少なくとも１つのモノマーはジメチルアクリルアミドであり、前記少なくとも１つの架橋剤はビス−グリシジルアミノアルコールであり、
   ４０μｍと１２００μｍとの間の直径を有しており、加水分解または酵素作用による分解を受け易い、
   ポリマー粒子。
3. 少なくとも１つの官能基を含む少なくとも１つのモノマー、および、
   少なくとも１つの架橋剤、を含み、
   前記架橋剤は、加水分解または酵素作用による分解を受け易い少なくとも１つの結合を含み、
   前記少なくとも１つの結合は、エステル、チオエステル、カーボネート、マトリクスメタロプロテイナーゼにより切断可能なペプチド、マトリクスコラゲナーゼにより切断可能なペプチド、マトリクスエラスターゼにより切断可能なペプチド、マトリクスカテプシンにより切断可能なペプチド、または、それらの組み合わせであり、
   前記少なくとも１つのモノマーはアクリルアミドであり、前記少なくとも１つの架橋剤は二官能性メタクリロイル−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＡＥＥ−メタクリレートであり、
   ４０μｍと１２００μｍとの間の直径を有しており、加水分解または酵素作用による分解を受け易い、
   ポリマー粒子。
4. 前記ポリマー粒子は、７５μｍと１２００μｍとの間の直径を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリマー粒子。
5. 前記少なくとも１つの官能基は、アクリレート、アクリルアミド、メタクリレートまたはメタクリルアミドである、請求項１に記載のポリマー粒子。
6. 前記少なくとも１つのモノマーは、イオン化可能な官能基を含む、請求項１に記載のポリマー粒子。
7. 前記イオン化可能な官能基は、塩基性である、請求項６に記載のポリマー粒子。
8. 前記イオン化可能な官能基は、酸性である、請求項６に記載のポリマー粒子。
9. 前記少なくとも１つの架橋剤は、少なくとも２つの官能基を含む、請求項１に記載のポリマー粒子。
10. 前記架橋剤は、加水分解または酵素作用による分解を受け易い少なくとも１つの結合を含む、請求項１に記載のポリマー粒子。
11. 前記少なくとも１つの結合は、エステル、チオエステル、カーボネート、マトリクスメタロプロテイナーゼにより切断可能なペプチド、マトリクスコラゲナーゼにより切断可能なペプチド、マトリクスエラスターゼにより切断可能なペプチド、マトリクスカテプシンにより切断可能なペプチド、または、それらの組み合わせである、請求項１０に記載のポリマー粒子。
12. エステル、チオエステル、カーボネート、マトリクスメタロプロテイナーゼにより切断可能なペプチド、マトリクスコラゲナーゼにより切断可能なペプチド、マトリクスエラスターゼにより切断可能なペプチド、および、マトリクスカテプシンにより切断可能なペプチドから選択される第２の結合を含む第２の架橋剤を含む、請求項１１に記載のポリマー粒子。
13. 前記ポリマー粒子は、生分解性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリマー粒子。
14. 前記ポリマー粒子は、移植後１ヶ月以内に、分解される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリマー粒子。
15. 少なくとも１つの官能基を含む少なくとも１つのモノマーと、加水分解または酵素作用による分解を受け易い少なくとも１つの架橋剤と、開始剤とを含むプレポリマー溶液を油中において反応させること、および、
    ４０μｍと１２００μｍとの間の直径を有するポリマー粒子を形成させること、を含み、
    前記少なくとも１つの架橋剤は、ビス−グリシジルアミノアルコール、二官能性メタクリロイル−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＡＥＥ−メタクリレート、
    

    

    、
    

    

    、
    

    

    、
    

    

    、
    

    

    、
    

    

    、
    

    

    、または、
    

    

    
    （式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆは、それぞれ独立して、１から２０である）
    である、
    ポリマー粒子を製造する方法。
16. 少なくとも１つの官能基を含む少なくとも１つのモノマーと、加水分解または酵素作用による分解を受け易い少なくとも１つの架橋剤と、開始剤とを含むプレポリマー溶液を油中において反応させること、および、
    ４０μｍと１２００μｍとの間の直径を有するポリマー粒子を形成させること、を含み、
    前記開始剤は、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンである、
    ポリマー粒子を製造する方法。
17. 少なくとも１つの官能基を含む少なくとも１つのモノマーと、加水分解または酵素作用による分解を受け易い少なくとも１つの架橋剤と、開始剤とを含むプレポリマー溶液を油中において反応させること、および、
    ４０μｍと１２００μｍとの間の直径を有するポリマー粒子を形成させること、を含み、
    前記ポリマー粒子は、生分解性であり、
    前記少なくとも１つのモノマーはアクリルアミドであり、前記少なくとも１つの架橋剤はビス−グリシジルアミノアルコールである、
    ポリマー粒子を製造する方法。
18. 少なくとも１つの官能基を含む少なくとも１つのモノマーと、加水分解または酵素作用による分解を受け易い少なくとも１つの架橋剤と、開始剤とを含むプレポリマー溶液を油中において反応させること、および、
    ４０μｍと１２００μｍとの間の直径を有するポリマー粒子を形成させること、を含み、
    前記ポリマー粒子は、生分解性であり、
    前記少なくとも１つのモノマーはアクリルアミドであり、前記少なくとも１つの架橋剤は二官能性メタクリロイル−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＡＥＥ−メタクリレートである、
    ポリマー粒子を製造する方法。
19. 前記油は、鉱油である、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記ポリマー粒子は、少なくとも０．９０の真円度を有する、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記少なくとも１つの官能基は、アクリレート、アクリルアミド、メタクリレートまたはメタクリルアミドである、請求項１５または１６に記載の方法。
22. 前記ポリマー粒子は、生分解性である、請求項１５または１６に記載の方法。
23. 前記ポリマー粒子は、移植後６ヶ月以内に、分解される、請求項２２に記載の方法。

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