CN103709323A - 一种肝靶向温敏微球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肝靶向温敏微球及其制备方法，属于功能高分子材料领域，特别涉及药物缓释及靶向给药材料及其制备方法，该材料温度响应范围为25℃-37℃，微球粒径在500nm左右，可由下述方法制得：将甘草次酸(GA)经乙二胺、丙烯酸(AAc)改性生成乙烯基单体；以过硫酸铵(APS)为引发剂，N，N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)为交联剂，通过半连续无皂乳液聚合法，制备肝靶向性温敏微球。本发明所述制备方法工艺流程简单，实验条件温和，不需要特殊设备，投资成本低，具有良好的可操作性，且所用试剂均为常规试剂，反应残余物容易去除，便于工业化实施。
Description
技术领域
本发明涉及一种功能高分子材料技术，特别涉及一种肝靶向温敏微球及其制备方法。
背景技术
肝脏是人体最大的实体器官，对维持生命和内环境的稳定起着举足轻重的作用。然而，肝癌、急性肝衰竭等疾病严重危胁人类的健康，我国更是世界上肝病的高发区，每年因肝病死亡的人数超过10万，发病率占全球的50％以上。因此，肝脏疾病的治疗成为目前医药卫生领域的重中之重。肝脏疾病药物治疗手段主要是使药物分子到达病变部位，杀灭致病病毒，修复受损组织，但传统的化疗方式，化疗药物无选择性，在杀伤癌细胞的同时会杀死周围非病患细胞，并且半衰期短，易与血浆蛋白接触而失活，易受生物屏障作用较难进入实体瘤，从而导致药效降低，治疗效果毒副作用太大。靶向给药是将治疗药物与靶向载体相结合，在载体的导向下把药物运送到靶器官或靶细胞，使药物有选择地集中于人体的病变部位，减少用药剂量和给药次数，降低毒副作用，提高疗效【Hana K.，E.，Karel U..European Journalof Pharmaceutical Science，2009，37：405】。甘草次酸(GA)存在于甘草的根、茎部，无毒，资源丰富，在传统中药处方中应用极其广泛，研究表明，肝实质细胞膜表面还存在GA的受体，GA与肝细胞的结合位点具有高度特异性、饱和性和蛋白质性质，脂质体经GA修饰后具有良好的趋肝性和肝细胞靶向性，可在肝脏高度蓄积，广泛应用于肝脏疾病的治疗和肝脏保护中【Zhang J.，Zhang Q.，Chen X.，et al..Glycoconjugate Journal，2003，19：423】。Tian等研究了99mTc标记的甘草次酸-聚乙二醇／壳聚糖复合纳米粒在大鼠体内的分布行为，研究结果表明，该纳米粒子在肝脏高度富集，并且包封治疗药物后所得的给药系统能有效抑制荷瘤裸鼠的肝癌生长【Tian Q.，Zhang C N.，et al..Biomaterial，2010，31：4748】；Mao等以乙醇注入法制备了表面修饰有GA的脂质体纳米粒，大鼠肝脏内吞实验表明对该纳米粒子的摄取量显著提高【Mao SJ.，Bi Y Q.，et a1..Pharmazie，2007，62：614】。
肝病药物疗法过程中的传统给药方法，受药体系内药物浓度忽高忽低，不易控制，毒副作用大，药物半衰期短，作用率低，而如果将治疗药物包封于天然或合成高分子材料内，形成药物控释系统，则可以控制药物在体内的释放速率，使药物在较长时间内以恒定的浓度释放，可提高药物利用率，减小毒副作用和用药次数。纳米粒子由于其独特的小尺寸效应，可有效消除特殊生物屏障对药物作用的限制，在药剂学领域也得到广泛应用。如Cho等合成了聚乙二醇-聚谷氨酸苄酯嵌段共聚物，形成150nm胶束，考察了该胶束对阿霉素的包封和释放行为，结果表明具有明显缓释效应【Jeong Y I.，Cho K O.，et a1..Intemational Journal ofPharmaceutics，2009，365：150】。温敏性聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)，由于其独特的温度响应性，在生物大分子的分离浓缩、酶的包埋以及药物控释系统的应用越来越受到人们的关注。PNIPAAm分子内存在亲水基团(酰胺基)和疏水基团(异丙基)，其水溶液的较低临界溶解温度(LCST)为32℃，当温度低于32℃时，PNIPAAm分子链呈伸展状态，亲水基团暴露，表现亲水性，当温度高于32℃时，PNIPAAm分子链收缩，疏水基团暴露，表现疏水性，在温敏控释药物系统，当温度低于LCST时吸附药物，而在高于LCST时释放药物。
综上所述，本发明结合GA的肝靶向性和PNIPAAm的温度响应性，设计一种具有特异靶向性的智能释药系统，采用半连续无皂乳液聚合法，制备肝靶向温敏微凝胶，一方面利用微凝胶的小尺寸效应和肝细胞特异结合性，实现靶向给药和跨越生物屏障，另一方面，利用高分子的缓释效果和PNIPAAm的温度响应性，实现药物智能释放。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有肝靶向性的药物控释智能载体，该材料可包封抗癌药物，对肝细胞具有靶向性，可控制药物释放速率及浓度，温度响应范围为25℃-37℃，微球直径在500nm左右。本发明肝靶向性温敏微球可由以下方法制得：
(1)甘草次酸氨基化改性
将甘草次酸(GA)溶于四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入1～3g DCC，搅拌30min，加入N-羟基丁二酰亚胺(SuOH)，GA与SuOH的质量比为3～5：1g，溶液浓度为0.1～0.5g／mL，在-10℃下继续搅拌2～4h，然后在不高于20℃的室温下搅拌15～20h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)。将GSE溶于DMF，溶液浓度为0.05～0.1g／mL，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到乙二胺(EDA)中，GSE与EDA摩尔比为1：20～40mol，混合液在50℃～80℃下反应20～30h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。
(2)甘草次酸乙烯基单体(GAA)的合成
将GA-NH2溶于DMF中，溶液浓度为0.1～0.5g／mL，加入AAc，GA-NH2与AAc质量比为4～6：1g，用氮气保护，再加入0.01～0.03g sulfo-NHS活化剂和0.05～0.1g EDC缩合剂，室温下反应20～30h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(GAA)。
(3)肝靶向性温敏微球的制备
称取0～0.5g GAA单体溶解于5ml无水乙醇，0.5～1.0g NIPAAm和0.1～0.2g MBA溶解于75ml二次蒸馏水中，另取75ml二次蒸馏水，将0.01～0.03gAPS溶解。将溶解有GAA单体的乙醇溶液加入三口烧瓶中，电磁搅拌，温度控制在25℃，然后依次加入10％体积的APS水溶液(约7.5ml)和10％体积的(NIPAAm和MBA混合溶液，约7.5ml)，全程氮气除氧，在10～30min内将温度升至60～80℃，再用两个滴液漏斗，同步将两种剩余溶液缓慢滴加入三口烧瓶，1～3h内滴加完，反应2～5h。停止通氮气，保温1～5h后，倒入烧杯中，超声20min，静置，12000r／min转速下离心30min，除去上清液，加入纯水，再次超声分离，再次离心，循环3次后将纯化好的微凝胶转移入玻璃培养皿，放置于冷冻干燥机得微凝胶粉末。
本发明的目的也在于提供一种肝靶向性温敏微球的制备方法，制备方法包括以下步骤：
(1)甘草次酸氨基化改性
将甘草次酸(GA)溶于四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入1～3g DCC，搅拌30min，加入N-羟基丁二酰亚胺(SuOH)，GA与SuOH的质量比为3～5：1g，溶液浓度为0.1～0.5g／mL，在-10℃下继续搅拌2～4h，然后在不高于20℃的室温下搅拌15～20h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)。将GSE溶于DMF，溶液浓度为0.05～0.1g／mL，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到乙二胺(EDA)中，GSE与EDA摩尔比为1：20～40mol，混合液在50℃～80℃下反应20～30h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。
(2)甘草次酸乙烯基单体(GAA)的合成
将GA-NH2溶于DMF中，溶液浓度为0.1～0.5g／mL，加入AAe，GA-NH2与AAc质量比为4～6：1g，用氮气保护，再加入0.01～0.03g sulfo-NHS活化剂和0.05～0.1g EDC缩合剂，室温下反应20～30h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(GAA)。
(3)肝靶向性温敏微球的制备
称取0～0.5g GAA单体溶解于5ml无水乙醇，0.5～1.0g NIPAAm和0.1～0.2g MBA溶解于75ml二次蒸馏水中，另取75ml二次蒸馏水，将0.01～0.03gAPS溶解。将溶解有GAA单体的乙醇溶液加入三口烧瓶中，电磁搅拌，温度控制在25℃，然后依次加入10％体积的APS水溶液(约7.5ml)和10％体积的(NIPAAm和MBA混合溶液，约7.5ml)，全程氮气除氧，在10～30min内将温度升至60～80℃，再用两个滴液漏斗，同步将两种剩余溶液缓慢滴加入三口烧瓶，1～3h内滴加完，反应2～5h。停止通氮气，保温1～5h后，倒入烧杯中，超声20min，静置，12000r／min转速下离心30min，除去上清液，加入纯水，再次超声分离，再次离心，循环3次后将纯化好的微凝胶转移入玻璃培养皿，放置于冷冻干燥机得微凝胶粉末。
有益效果：本发明所设计的肝靶向性温敏微球是一种具有多功能协同作用的药物载体，GA的肝靶向性和微球的小尺寸效应，可实现靶向给药和辅助药物分子跨越生物屏障，PNIPAAm的温度响应性可实现药物智能释放，控制药物释放速率及浓度，可在肝病药物治疗领域得到广泛应用。本发明所述制备方法工艺流程简单，实验条件温和，不需要特殊设备，投资成本低，具有良好的可操作性，且所用试剂均为常规试剂，反应残余物容易去除，便于工业化实施。
具体实施方式
以下给出本发明的具体实施例，但本发明不受实施例的限制。
实例1：
(1)甘草次酸氨基化改性
将2.895g甘草次酸(GA)溶于30mL四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入1.77g DCC，搅拌30min，加入0.71g SuOH，在-10℃下继续搅拌3h，然后在不高于20℃的室温下搅拌18h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)。将1.015g GSE溶于15mL DMF，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到3.5mL乙二胺(EDA)中，混合液在60℃下反应24h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。
(2)甘草次酸乙烯基单体(GAA)的合成
将5g GA-NH2溶于20mL DMF中，加入1mL AAc，用氮气保护，再加入0.01g sulfo-NHS活化剂和0.07g EDC缩合剂，室温下反应24h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(GAA)。
(3)肝靶向性温敏微球的制备
称取0.1g GAA单体溶解于5ml无水乙醇，0.9g NIPAAm和0.1g MBA溶解于75ml二次蒸馏水中，另取75ml二次蒸馏水，将0.015g APS溶解。将溶解有GAA单体的乙醇溶液加入三口烧瓶中，电磁搅拌，温度控制在25℃，然后依次加入10％体积的APS水溶液(约7.5ml)和10％体积的(NIPAAm和MBA混合溶液，约7.5ml)，全程氮气除氧，在10min内将温度升至70℃，再用两个滴液漏斗，同步将两种剩余溶液缓慢滴加入三口烧瓶，1h内滴加完，反应3h。停止通氮气，保温2h后，倒入烧杯中，超声20min，静置，12000r／min转速下离心30min，除去上清液，加入纯水，再次超声分离，再次离心，循环3次后将纯化好的微凝胶转移入玻璃培养皿，放置于冷冻干燥机得微凝胶粉末。
实例2：
(1)甘草次酸氨基化改性
将5.79g甘草次酸(GA)溶于30mL四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入3g DCC，搅拌30min，加入1.16g SuOH，在-10℃下继续搅拌4h，然后在不高于20℃的室温下搅拌20h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)。将2.03g GSE溶于20mL DMF，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到7mL乙二胺(EDA)中，混合液在80℃下反应20h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。
(2)甘草次酸乙烯基单体(GAA)的合成
将5gGA-NH2溶于20mLDMF中，加入1mLAAc，用氮气保护，再加入0.01g sulfo-NHS活化剂和0.07g EDC缩合剂，室温下反应20h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(GAA)。
(3)肝靶向性温敏微球的制备
称取0.3g GAA单体溶解于5ml无水乙醇，0.7g NIPAAm和0.1g MBA溶解于75ml二次蒸馏水中，另取75ml二次蒸馏水，将0.015g APS溶解。将溶解有GAA单体的乙醇溶液加入三口烧瓶中，电磁搅拌，温度控制在25℃，然后依次加入10％体积的APS水溶液(约7.5ml)和10％体积的(NIPAAm和MBA混合溶液，约7.5ml)，全程氮气除氧，在10min内将温度升至70℃，再用两个滴液漏斗，同步将两种剩余溶液缓慢滴加入三口烧瓶，1h内滴加完，反应2h。停止通氮气，保温3h后，倒入烧杯中，超声20min，静置，12000r／min转速下离心30min，除去上清液，加入纯水，再次超声分离，再次离心，循环3次后将纯化好的微凝胶转移入玻璃培养皿，放置于冷冻干燥机得微凝胶粉末。
实验3：
(1)甘草次酸氨基化改性
将2.895g甘草次酸(GA)溶于30mL四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入3g DCC，搅拌30min，加入0.71g SuOH，在-10℃下继续搅拌3h，然后在不高于20℃的室温下搅拌18h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)。将2.03g GSE溶于20mL DMF，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到9.3g乙二胺(EDA)中，混合液在50℃下反应30h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。
(2)甘草次酸乙烯基单体(GAA)的合成
将5g GA-NH2溶于30mL DMF中，加入1mLAAc，用氮气保护，再加入0.03g sulfo-NHS活化剂和0.05g EDC缩合剂，室温下反应30h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(GAA)。
(3)肝靶向性温敏微球的制备
称取0.5g GAA单体溶解于5ml无水乙醇，0.5g NIPAAm和0.1g MBA溶解于75ml二次蒸馏水中，另取75ml二次蒸馏水，将0.015g APS溶解。将溶解有GAA单体的乙醇溶液加入三口烧瓶中，电磁搅拌，温度控制在25℃，然后依次加入10％体积的APS水溶液(约7.5ml)和10％体积的(NIPAAm和MBA混合溶液，约7.5ml)，全程氮气除氧，在10min内将温度升至70℃，再用两个滴液漏斗，同步将两种剩余溶液缓慢滴加入三口烧瓶，1h内滴加完，反应2h。停止通氮气，保温2h后，倒入烧杯中，超声20min，静置，12000r／min转速下离心30min，除去上清液，加入纯水，再次超声分离，再次离心，循环3次后将纯化好的微凝胶转移入玻璃培养皿，放置于冷冻干燥机得微凝胶粉末。
实例4：
(1)甘草次酸氨基化改性
将5.79g甘草次酸(GA)溶于30mL四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入1.77g DCC，搅拌30min，加入1.42g SuOH，在-10℃下继续搅拌2h，然后在不高于20℃的室温下搅拌20h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)。将2.03g GSE溶于15mL DMF，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到7mL乙二胺(EDA)中，混合液在60℃下反应24h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。
(2)甘草次酸乙烯基单体(GAA)的合成
将3g GA-NH2溶于10mL DMF中，加入0.6mL AAc，用氮气保护，再加入0.01gsulfo-NHS活化剂和0.05g EDC缩合剂，室温下反应24h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(GAA)。
(3)肝靶向性温敏微球的制备
称取0.5g GAA单体溶解于5ml无水乙醇，0.5g NIPAAm和0.2g MBA溶解于75ml二次蒸馏水中，另取75ml二次蒸馏水，将0.03g APS溶解。将溶解有GAA单体的乙醇溶液加入三口烧瓶中，电磁搅拌，温度控制在25℃，然后依次加入10％体积的APS水溶液(约7.5ml)和10％体积的(NIPAAm和MBA混合溶液，约7.5ml)，全程氮气除氧，在20min内将温度升至80℃，再用两个滴液漏斗，同步将两种剩余溶液缓慢滴加入三口烧瓶，2h内滴加完，反应4h。停止通氮气，保温3h后，倒入烧杯中，超声20min，静置，12000r／min转速下离心30min，除去上清液，加入纯水，再次超声分离，再次离心，循环3次后将纯化好的微凝胶转移入玻璃培养皿，放置于冷冻干燥机得微凝胶粉末。
实例5：
(1)甘草次酸氨基化改性
将2.895g甘草次酸(GA)溶于30mL四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入1.77g DCC，搅拌30min，加入0.965g SuOH，在-10℃下继续搅拌2h，然后在不高于20℃的室温下搅拌15h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)。
将1.015g GSE溶于15mLDMF，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到2.3mL乙二胺(EDA)中，混合液在80℃下反应20h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。
(2)甘草次酸乙烯基单体(GAA)的合成
将3g GA-NH2溶于20mLDMF中，加入0.5mLAAc，用氮气保护，再加入0.01g sulfo-NHS活化剂和0.05EDC缩合剂，室温下反应30h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(GAA)。
(3)肝靶向性温敏微球的制备
称取0.3g GAA单体溶解于5ml无水乙醇，0.7g NIPAAm和0.1g MBA溶解于75ml二次蒸馏水中，另取75ml二次蒸馏水，将0.02g APS溶解。将溶解有GAA单体的乙醇溶液加入三口烧瓶中，电磁搅拌，温度控制在25℃，然后依次加入10％体积的APS水溶液(约7.5ml)和10％体积的(NIPAAm和MBA混合溶液，约7.5ml)，全程氮气除氧，在10～30min内将温度升至60℃，再用两个滴液漏斗，同步将两种剩余溶液缓慢滴加入三口烧瓶，2h内滴加完，反应5h。停止通氮气，保温5h后，倒入烧杯中，超声20min，静置，12000r／min转速下离心30min，除去上清液，加入纯水，再次超声分离，再次离心，循环3次后将纯化好的微凝胶转移入玻璃培养皿，放置于冷冻干燥机得微凝胶粉末。
实例6：
(1)甘草次酸氨基化改性
将5.79g甘草次酸(GA)溶于30mL四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入1.77g DCC，搅拌30min，加入1.16g SuOH，在-10℃下继续搅拌4h，然后在不高于20℃的室温下搅拌15h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)。将2.03g GSE溶于15mL DMF，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到4.7mL乙二胺(EDA)中，混合液在80℃下反应20h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。
(2)甘草次酸乙烯基单体(GAA)的合成
将3g GA-NH2溶于10mL DMF中，加入0.75mL AAc，用氮气保护，再加入0.03gsulfo-NHS活化剂和0.1g EDC缩合剂，室温下反应20h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(GAA)。
(3)肝靶向性温敏微球的制备
称取0.1g GAA单体溶解于5ml无水乙醇，0.9g NIPAAm和0.15g MBA溶解于75ml二次蒸馏水中，另取75ml二次蒸馏水，将0.03gAPS溶解。将溶解有GAA单体的乙醇溶液加入三口烧瓶中，电磁搅拌，温度控制在25℃，然后依次加入10％体积的APS水溶液(约7.5ml)和10％体积的(NIPAAm和MBA混合溶液，约7.5ml)，全程氮气除氧，在30min内将温度升至80℃，再用两个滴液漏斗，同步将两种剩余溶液缓慢滴加入三口烧瓶，3h内滴加完，反应4h。停止通氮气，保温4h后，倒入烧杯中，超声20min，静置，12000r／min转速下离心30min，除去上清液，加入纯水，再次超声分离，再次离心，循环3次后将纯化好的微凝胶转移入玻璃培养皿，放置于冷冻干燥机得微凝胶粉末。
实例7：
(1)甘草次酸氨基化改性
将2.895g甘草次酸(GA)溶于30mL四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入1.77g DCC，搅拌30min，加入0.579g SuOH，在-10℃下继续搅拌4h，然后在不高于20℃的室温下搅拌20h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)。将1.015g GSE溶于20mL DMF，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到4.7mL乙二胺(EDA)中，混合液在50℃下反应30h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。
(2)甘草次酸乙烯基单体(GAA)的合成
将8g GA-NH2溶于20mLDMF中，加入2mLAAc，用氮气保护，再加入0.03g sulfo-NHS活化剂和0.1g EDC缩合剂，室温下反应20h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(GAA)。
(3)肝靶向性温敏微球的制备
称取0.3g GAA单体溶解于5ml无水乙醇，0.7g NIPAAm和0.2g MBA溶解于75ml二次蒸馏水中，另取75ml二次蒸馏水，将0.02gAPS溶解。将溶解有GAA单体的乙醇溶液加入三口烧瓶中，电磁搅拌，温度控制在25℃，然后依次加入10％体积的APS水溶液(约7.5ml)和10％体积的(NIPAAm和MBA混合溶液，约7.5ml)，全程氮气除氧，在20min内将温度升至60℃，再用两个滴液漏斗，同步将两种剩余溶液缓慢滴加入三口烧瓶，2h内滴加完，反应2h。停止通氮气，保温1h后，倒入烧杯中，超声20min，静置，12000r／min转速下离心30min，除去上清液，加入纯水，再次超声分离，再次离心，循环3次后将纯化好的微凝胶转移入玻璃培养皿，放置于冷冻干燥机得微凝胶粉末。
实例8：
(1)甘草次酸氨基化改性
将2.895g甘草次酸(GA)溶于30mL四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入1g DCC，搅拌30min，加入0.579g SuOH，在-10℃下继续搅拌2h，然后在不高于20℃的室温下搅拌15h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)。将1.015g GSE溶于10mL DMF，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到3.5mL乙二胺(EDA)中，混合液在80℃下反应30h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。
(2)甘草次酸乙烯基单体(GAA)的合成
将8g GA-NH2溶于40mL DMF中，加入1.8mL AAc，用氮气保护，再加入0.03gsulfo-NHS活化剂和0.1g EDC缩合剂，室温下反应24h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(GAA)。
(3)肝靶向性温敏微球的制备
称取0.5g GAA单体溶解于5ml无水乙醇，0.5g NIPAAm和0.2g MBA溶解于75ml二次蒸馏水中，另取75ml二次蒸馏水，将0.015g APS溶解。将溶解有GAA单体的乙醇溶液加入三口烧瓶中，电磁搅拌，温度控制在25℃，然后依次加入10％体积的APS水溶液(约7.5ml)和10％体积的(NIPAAm和MBA混合溶液，约7.5ml)，全程氮气除氧，在15min内将温度升至80℃，再用两个滴液漏斗，同步将两种剩余溶液缓慢滴加入三口烧瓶，2h内滴加完，反应3h。停止通氮气，保温3h后，倒入烧杯中，超声20min，静置，12000r／min转速下离心30min，除去上清液，加入纯水，再次超声分离，再次离心，循环3次后将纯化好的微凝胶转移入玻璃培养皿，放置于冷冻干燥机得微凝胶粉末。
Claims (9)
1.一种肝靶向温敏微球及其制备方法，其特征在于所述肝靶向温敏微球具有药物控释作用和肝细胞靶向性，温度响应范围为25℃～37℃，粒径在500nm左右，可实现抗癌药物的智能释放及靶向给药，所述肝靶向性温敏微球可由下述方法制得：
(1)甘草次酸氨基化改性
将甘草次酸(GA)溶于四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入1～3g DCC，搅拌30min，加入N-羟基丁二酰亚胺(SuOH)，GA与SuOH的质量比为3～5：1g，溶液浓度为0.1～0.5g/mL，在-10℃下继续搅拌2～4h，然后在不高于20℃的室温下搅拌15～20h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)，将GSE溶于DMF，溶液浓度为0.05～0.1g／mL，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到乙二胺(EDA)中，GSE与EDA摩尔比为1：20～40mol，混合液在50℃～80℃下反应20～30h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)；
(2)甘草次酸乙烯基单体(GAA)的合成
将GA-NH2溶于DMF中，溶液浓度为0.1～0.5g／mL，加入AAc，GA-NH2与AAc质量比为4～6：1g，用氮气保护，再加入0.01～0.03g sulfo-NHS活化剂和0.05～0.1g EDC缩合剂，室温下反应20～30h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(GAA)；
(3)肝靶向性温敏微球的制备
称取0～0.5g GAA单体溶解于5ml无水乙醇，0.5～1.0gNIPAAm和0.1～0.2g MBA溶解于75ml二次蒸馏水中，另取75ml二次蒸馏水，将0.01～0.03gAPS溶解，将溶解有GAA单体的乙醇溶液加入三口烧瓶中，电磁搅拌，温度控制在25℃，然后依次加入10％体积的APS水溶液(约7.5ml)和10％体积的(NIPAAm和MBA混合溶液，约7.5ml)，全程氮气除氧，在10～30min内将温度升至60～80℃，再用两个滴液漏斗，同步将两种剩余溶液缓慢滴加入三口烧瓶，1～3h内滴加完，反应2～5h，停止通氮气，保温1～5h后，倒入烧杯中，超声20min，静置，12000r／min转速下离心30min，除去上清液，加入纯水，再次超声分离，再次离心，循环3次后将纯化好的微凝胶转移入玻璃培养皿，放置于冷冻干燥机得微凝胶粉末。
2.根据权利要求1所述的肝靶向性温敏微球，其特征在于所述肝靶向性温敏微球具有药物控释作用和肝靶向性，温度响应范围为25℃～37℃，粒径在500nm左右，可实现抗癌药物的智能释放及靶向给药。
3.一种肝靶向温敏微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)甘草次酸氨基化改性
将甘草次酸(GA)溶于四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入1～3g DCC，搅拌30min，加入N-羟基丁二酰亚胺(SuOH)，GA与SuOH的质量比为3～5：1g，溶液浓度为0.1～0.5g／mL，在-10℃下继续搅拌2～4h，然后在不高于20℃的室温下搅拌15～20h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)，将GSE溶于DMF，溶液浓度为0.05～0.1g／mL，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到乙二胺(EDA)中，GSE与EDA摩尔比为1：20～40mol，混合液在50℃～80℃下反应20～30h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)；
(2)甘草次酸乙烯基单体(GAA)的合成
将GA-NH2溶于DMF中，溶液浓度为0.1～0.5g／mL，加入AAc，GA-NH2与AAc质量比为4～6：1g，用氮气保护，再加入0.01～0.03g sulfo-NHS活化剂和0.05～0.1g EDC缩合剂，室温下反应20～30h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(GAA)；
(3)肝靶向性温敏微球的制备
称取0～0.5g GAA单体溶解于5ml无水乙醇，0.5～1.0g NIPAAm和0.1～0.2g MBA溶解于75ml二次蒸馏水中，另取75ml二次蒸馏水，将0.01～0.03gAPS溶解，将溶解有GAA单体的乙醇溶液加入三口烧瓶中，电磁搅拌，温度控制在25℃，然后依次加入10％体积的APS水溶液(约7.5ml)和10％体积的(NIPAAm和MBA混合溶液，约7.5ml)，全程氮气除氧，在10～30min内将温度升至60～80℃，再用两个滴液漏斗，同步将两种剩余溶液缓慢滴加入三口烧瓶，1～3h内滴加完，反应2～5h，停止通氮气，保温1～5h后，倒入烧杯中，超声20min，静置，12000r／min转速下离心30min，除去上清液，加入纯水，再次超声分离，再次离心，循环3次后将纯化好的微凝胶转移入玻璃培养皿，放置于冷冻干燥机得微凝胶粉末。
4.根据权利要求1，3所述一种肝靶向性温敏微球的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)与乙二胺(EDA)摩尔比为1：20～40mol，反应温度为50℃～80℃。
5.根据权利要求1，3所述一种肝靶向性温敏微球的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)与丙烯酸(AAc)质量比为4～6：1g。
6.根据权利要求1，3所述一种肝靶向性温敏微球的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中GAA与(GA+NIPAAm)的质量比为0～0.5：1g。
7.根据权利要求1，3所述一种肝靶向性温敏微球的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中反应温度为60℃～80℃。
8.根据权利要求1，3所述一种肝靶向性温敏微球的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中反应时间为2～5h。
9.根据权利要求1，3所述一种肝靶向性温敏微球的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中10～30min内将温度升至60～80℃。
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