JP6348974B2 - 4’−gl高純度組成物の調製法 - Google Patents
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Description
(A)4’−GLを含むガラクトオリゴ糖を活性炭カラムクロマトグラフィーに供し、有機溶媒水溶液を用いて段階溶出し、当該段階溶出において、溶出回数を重ねるごとに、直前の溶出時よりも有機溶媒の濃度が高い有機溶媒水溶液を用いる工程
(B)工程(A)で最終的に溶出された画分に有機溶媒を添加し、4’−GLを結晶化する工程
糖液の調製:
乳糖2kgを80℃の熱水2.7kgで溶解後、40℃まで冷却し、恒温槽でその温度を保った。これにスポロボロマイセス・シンギュラリス YIT10047(ISK−##2B6)(FERM P−18817)の菌体液(β−ガラクトシダーゼ活性:4000U/kg)157gとサッカロマイセス・セレビシエ(オリエンタル酵母(株)製:レギュラーイースト)63g(6.3×1011cfu)を添加し、撹拌しながら22時間、40℃に保って反応を行った。反応停止は85℃まで昇温後、その温度を10分間保って行った。反応終了後、反応液に対して遠心分離(12,000×g、30min)を行い、反応に用いた菌体を除去して糖液を得た。得られた糖液(製造品)について、以下の条件のサイズ排除HPLCにより分析し、面積百分率から糖鎖長別組成解析を行った。その結果を表1に示した。
スポロボロマイセス・シンギュラリス YIT10047(ISK−##2B6)(FERM P−18817)の菌体液のβ−ガラクトシダーゼ活性(U)は、国際公開第2012/141244号公報に記載の測定方法と同様の方法で測定した。
装置:島津prominence UFLC
カラム:SUGAR KS−802(8.0φ×300mm)(昭和電工(株)製)
カラム温度:80℃
注入量:10μL
移動相:精製水
分析時間:30min
流速:0.5mL/min
検出:示差屈折率
溶出条件の検討(1):
製造例1で調製した糖液を、エバポレーターを用いて濃縮し、Bxが72.3の濃縮糖液を得た。この濃縮糖液の1.3gを分取し、25mLとなるように水で希釈を行った。活性炭(和光純薬工業(株)製、クロマトグラフ用)25mLを常法に従って充填したオープンカラムクロマトグラフィー(カラムの直径:2cm、高さ:30cm)を準備し、希釈糖液を負荷した。この希釈糖液を負荷したカラムについて、以下の表2に記載の通り、精製水でカラムを洗浄した後、単回溶出または段階溶出で糖類の溶出を行った。なお、各溶出に用いた溶媒は100mLである。洗浄、溶出に要した時間は、各段階で10分程度である。また、洗浄、溶出は精製水、溶出液の液面が5cm/minで下がっていく速度で行った。
溶出条件の検討(2):
実施例1の段階溶出1において、メタノール水溶液の濃度を以下の表3に記載の通りに変更する以外は同様にして糖類の溶出を行った。また、実施例1と同様にして全糖中の3糖の割合を求めた。その結果を表3にあわせて示した。
結晶化条件の検討(1):
製造例1と同様にして調製した糖液を、エバポレーターで減圧下濃縮し、Bxが72.3の濃縮糖液を得た。この濃縮糖液22.1gを分取し、400mLとなるように精製水で希釈を行った。活性炭(和光純薬工業(株)製、クロマトグラフ用)400mLを常法に従って充填したオープンカラムクロマトグラフィー(カラムの直径:6cm、高さ:40cm)を準備し、希釈糖液を負荷した。この希釈糖液を負荷したカラムについて、精製水で洗浄した後、15%メタノール水溶液、20%メタノール水溶液の順で実施例1の段階溶出1と同様にして糖類の溶出を行った。なお、各溶出に用いた溶媒は1600mLである。更に、この溶出で得られた溶出液を、エバポレーターで減圧下濃縮した後、デシケーター内で減圧乾固させ、濃縮物2.3g(固形分2.3g)を得た。
試料約5mgをねじ口試験管に取り、エバポレーターで減圧下濃縮し、濃縮後、デシケーター内で減圧乾固させた。乾固させた試料に対して約50当量の2−アミノピリジンを含む200μL酢酸溶液を添加し、90℃、1時間加熱反応させた。反応液に195mg/mL(酢酸)に調製したボラン−ジメチルアミン試薬を250μL添加し、80℃、50分間還元し、PA化誘導体を得た。PA化誘導体を50mLファルコンチューブに移し、精製水で約25mLに希釈した。この希釈液に1M水酸化ナトリウム水溶液を添加し、pHを弱酸性〜中性に調整した。マイクロアシライザーS1(旭化成(株)製)を用いて透析処理した。条件は透析膜をAC−120−10((株)アストム製)、電極液を0.5%硝酸ナトリウム水溶液および終了設定を0Aとした。本処理液をエバポレーターで減圧下濃縮した後、デシケーターで減圧乾固した。サンプルを精製水に溶解し、0.45μmフィルターに通したろ液をHPLCで分析した。PA化試薬の残渣が観察されるため、分析開始から22分以降に検出されたピーク面積の百分率から、3糖異性体中の4’−GLの割合を求めた。また、4’−GL以外の3糖異性体の割合も求めた。4’−GLのピークは分析開始から26.8分後に出現し、Galβ1−4Galβ1−3Glcのピークは分析開始から41.2分後に出現した。
装置:島津prominence UFLC
カラム:PEGASIL ODS SP300(4.6mmφ×250mm
)((株)センシュー科学製)
カラム温度:25℃
注入量:10μL
移動相:0.2M クエン酸ナトリウム緩衝液(pH5.7)
分析時間:70min
流速:0.5mL/min
検出:UV(310nm)
結晶化条件の検討(2):
製造例1と同様にして調製した糖液を、エバポレーターで減圧下濃縮し、Bxが72.3の濃縮糖液を得た。この濃縮糖液120gを分取し、2000mLとなるように精製水で希釈を行った。活性炭(和光純薬工業(株)製、クロマトグラフ用)2000mLを常法に従って充填したオープンカラムクロマトグラフィー(カラムの直径:9cm、高さ:80cm)を準備し、希釈糖液を負荷した。この希釈糖液を負荷したカラムについて、精製水で洗浄し、15%メタノール水溶液、20%メタノール水溶液の順で実施例1の段階溶出1と同様にして糖類の溶出を行った。なお、各溶出に用いた溶媒は8000mLである。更に、この溶出で得られた溶出液を、エバポレーターで減圧下濃縮した後、デシケーター内で減圧乾固させ、濃縮物12.5g(固形分12.5g)を得た。
別菌株での検討
スポロボロマイセス・シンギュラリス YIT10047(ISK−##2B6)の菌体液に代えて、β−ガラクトシダーゼ活性が、製造例1で用いたスポロボロマイセス・シンギュラリス YIT10047の菌体液と同等となる量のスポロボロマイセス・シンギュラリスJCM5356の菌体液を用いた以外は、製造例1と同様に糖液を調製し、実施例1の段階溶出1と同様の条件で段階溶出し、実施例3と同様の条件で4’−GLを結晶化した。その結果、3糖中の4’−GLの割合が95%以上である結晶を得ることができた。また、得られた結晶は95%以上が固形分であり、結晶化工程では3糖異性体以外の糖は結晶化しなかった。したがって、当該結晶中の固形分の全てが3糖異性体であるため、組成物中の4’−GLの割合は、(95%×95%=)90.3%以上となる。
以 上
Claims (3)
- 以下の工程(A)および(B)を含むことを特徴とする4'−ガラクトシルラクトース(4’−GL)の含有量が92%以上である、4’−GL高純度組成物の調製法。
(A)4’−GLを含むガラクトオリゴ糖を活性炭カラムクロマトグラフィーに供し、メタノールの濃度が10〜20質量%のメタノール水溶液、メタノールの濃度が15〜30質量%のメタノール水溶液の順でメタノール水溶液を用いて段階溶出し、当該段階溶出において、溶出回数を重ねるごとに、直前の溶出時よりもメタノールの濃度が高いメタノール水溶液を用いる工程
(B)工程(A)で最終的に溶出された画分にメタノール、アセトンおよびエタノールから選ばれる1種以上を添加し、4’−GLを結晶化する工程 - 組成物中の4’−GLの含有量が95%以上である、請求項1記載の4’−GL高純度組成物の調製法。
- 工程(A)で用いる4’−GLを含むガラクトオリゴ糖が、スポロボロマイセス・シンギュラリスおよびサッカロマイセス・セレビシエを用いて生成されたものである請求項1または2に記載の4’−GL高純度組成物の調製法。
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