CN106459117B - 4’-gl高纯度组合物的制备方法 - Google Patents

4’-gl高纯度组合物的制备方法 Download PDF

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Abstract

用比以往更简便的方法得到4’‑GL的纯度高、能够用作各种分析用的标准品的组合物。一种4’‑GL高纯度组合物的制备方法，其特征在于：包括以下的工序(A)和工序(B)。工序(A)：将含有4’‑GL的低聚半乳糖供于活性炭柱层析，使用有机溶剂水溶液进行梯度洗脱，在该梯度洗脱中，每次增加洗脱次数时，使用有机溶剂的浓度比前一次洗脱时的浓度还高的有机溶剂水溶液；工序(B)：向在工序(A)中最终洗脱而得到的级分中添加有机溶剂，对4’‑GL进行结晶化。

Description

4’-GL高纯度组合物的制备方法
技术领域
本发明涉及由含有4’-GL(4’-半乳糖基乳糖：Galβ1-4Galβ1-4Glc)的低聚半乳糖来制备以高纯度含有4’-GL的组合物的方法。
背景技术
已知4’-GL是能够促进肠内的双歧杆菌的增殖的低聚半乳糖的主要成分。另外，该4’-GL用作分析低聚半乳糖时的指标。
含有该4’-GL的低聚半乳糖在工业上以乳糖为原料并利用通过β-半乳糖苷酶的转化反应而生产，在不进行纯化工序等的情况下，通常低聚半乳糖本身的纯度很低。
一直以来，作为对低聚糖进行纯化来提高纯度的技术，例如报告有葡萄糖胺寡糖的纯化方法，其特征在于：将在具有羟基的高分子中导入羧甲基后的高分子用作色谱填充剂(专利文献1)；但并未报告：对低聚半乳糖进行纯化，从而提高在低聚半乳糖的成分当中4’-GL的纯度的方法，就连作为4’-GL的标准品的物质也不是纯度很高的物质。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特公平6-55766号公报
发明内容
发明要解决的问题
因此，本发明的课题是提供简便且廉价地得到4’-GL的纯度高、能够用作各种分析用的标准品的组合物的方法。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入广泛的研究，结果发现通过组合使用了有机溶剂的梯度洗脱和结晶化，从而可以得到4’-GL的纯度高的组合物，因而完成了本发明。
即，本发明是4’-GL高纯度组合物的制备方法，其特征在于包括以下的工序(A)和工序(B)。
工序(A)：将含有4’-GL的低聚半乳糖供于活性炭柱层析，使用有机溶剂水溶液进行梯度洗脱，在该梯度洗脱中，每次增加洗脱次数时，使用有机溶剂的浓度比前一次洗脱时的浓度还高的有机溶剂水溶液。
工序(B)：向在工序(A)中最终洗脱而得到的级分中添加有机溶剂，对4’-GL进行结晶化。
另外，本发明是根据上述制备方法得到的4’-GL高纯度组合物。
发明的效果
本发明的4’-GL高纯度组合物的制备方法能够通过组合使用了有机溶剂的梯度洗脱和结晶化，从而能够以简便的方法廉价地由含有4’-GL的低聚半乳糖制备以高纯度含有4’-GL的组合物。
另外，根据本发明的4’-GL高纯度组合物的制备方法而得到的4’-GL高纯度组合物能够作为各种分析用的标准品使用。
具体实施方式
本发明的4’-GL高纯度组合物的制备方法(以下称为“本发明制备方法”)的工序(A)是如下工序：将含有4’-GL的低聚半乳糖供于活性炭柱层析，使用有机溶剂水溶液进行梯度洗脱，在该梯度洗脱中，每次增加洗脱次数时，使用有机溶剂的浓度比前一次洗脱时的浓度还高的有机溶剂水溶液。
上述含有4’-GL的低聚半乳糖只要是在低聚半乳糖中含有4’-GL的物质就没有特别限定，例如可以举出：利用通过β-半乳糖苷酶的转化反应而生成的低聚半乳糖等。
具体而言，在利用通过β-半乳糖苷酶的转化反应来生成含有4’-GL的低聚半乳糖时，只要使β-半乳糖苷酶、生成β-半乳糖苷酶的微生物作用于乳糖即可，优选的是，为了提高低聚半乳糖中的三糖的比率，只要组合β-半乳糖苷酶和糖同化性的微生物并使其起作用即可。
作为生成β-半乳糖苷酶的微生物，例如可以举出：乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)等克鲁维酵母(Kluyveromyces.)属的微生物、独特掷孢酵母(Sporobolomyces Singularis)等掷孢酵母(Sporobolomyces.)属的微生物等。另外，还可以举出：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、乳链球菌(streptococcus lactis)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、赖氏乳杆菌(Lactobacillus leichmannii)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、两歧双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、长双岐杆菌(Bifidobacterium longum)、青春型双歧杆菌等(Bifidobacterium adolescentis)。这些微生物当中优选掷孢酵母属的微生物，更优选独特掷孢酵母，特别优选为本申请人等报告的独特掷孢酵母ISK-##2B6。需要说明的是，独特掷孢酵母ISK-##2B6是本申请人已于2002年4月10日以FERM P-18817保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(〒305-8566茨城县筑波市东1丁目1番1中央第6(需要说明的是，前述专利生物保藏中心是平成25年4月1日开始新名称独立行政法人产品评价技术基础机构专利生物保藏中心，新住所迁移至〒292-0818千叶县木更津市上总镰足2丁目5番8 120号室。))。另外，作为独特掷孢酵母，可以适宜使用上述独特掷孢酵母ISK-##2B6的亲株的独特掷孢酵母JCM5356，该菌株可从理化学研究所生物资源中心(〒305-0074日本国茨城县筑波市高野台3-1-1)买到。这些微生物可以单独使用1种也可以组合2种以上使用。
作为上述糖同化性的微生物，例如可以举出：通常作为面包酵母市售的酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)、单孢酿酒酵母(Saccharomyces unisporus)等。这些微生物可以单独使用1种也可以组合2种以上使用。另外，糖同化性的微生物所同化的糖没有特别限定，为了提高低聚半乳糖中的三糖的比率而优选为对葡萄糖进行同化的微生物。
作为使用上述微生物来生成含有4’-GL的低聚半乳糖的条件，没有特别限定，例如可以举出：向将使乳糖溶解而得到的水加热至40℃左右的液体中添加生成β-半乳糖苷酶的微生物以及根据所需添加糖同化性的微生物，一边搅拌一边培养1天左右的条件等。生成β-半乳糖苷酶的微生物的添加量没有特别限定，例如，只要以相对于乳糖1kg、β-半乳糖苷酶活性成为100～600U的方式添加即可。另外，糖同化性的微生物的添加量也没有特别限定，例如，作为该微生物的干燥粉体，以相对于乳糖1kg成为0.0001～10质量％(1×107～1×1012cfu)的方式添加即可。β-半乳糖苷酶活性的测定方法与后述的制造例相同。需要说明的是，该低聚半乳糖的生成反应可以通过例如加热至85℃左右并将其维持10分钟左右而使反应结束。另外，反应结束后优选通过离心分离、过滤除去菌体。
关于活性炭柱层析，在填充了活性炭的柱中负载含有4’-GL的低聚半乳糖，使用有机溶剂水溶液对其进行梯度洗脱即可。
在上述柱中填充的活性炭的种类没有特别限定，为例如粉末、颗粒、破碎状态的活性炭。另外，在柱中填充活性炭的方法没有特别限定，例如将在活性炭中添加水而制成的浆料填充至柱中，进行静置即可。进而，在柱中填充的活性炭的量没有特别限定，例如为使用的柱的内容量的1/3～1/4量。使用的柱的材质没有特别限定，例如可以使用玻璃制、塑料制等的柱，其直径和高度也没有特别限定，例如可以使用直径为2～15cm、高度为30～100cm的柱。
使用了有机溶剂的梯度洗脱通过每次增加洗脱次数时使用有机溶剂的浓度比前一次洗脱时的浓度还高的有机溶剂水溶液来进行。具体而言，首先，将水通入活性炭柱中进行清洗。其次，通入有机溶剂水溶液，之后通入有机溶剂的浓度比前一次洗脱时的浓度还高的有机溶剂水溶液。用浓度不同的有机溶剂水溶液进行2次以上将该有机溶剂水溶液通入活性炭柱中的操作称为梯度洗脱，优选的通液次数为2次。另外，在1次洗脱(通液操作)中使用的有机溶剂水溶液的量没有特别限定，例如是所使用的活性炭体积的2～6倍量。进而，梯度洗脱的速度也没有特别限定，例如为洗脱液的液面以2～6cm/分钟移动的速度。
在上述工序(A)中使用的有机溶剂的种类没有特别限定，优选为具有极性的有机溶剂，更优选为碳数1～3的醇，特别优选为甲醇。作为该有机溶剂的浓度优选为5～40质量％(以下简称为“％”)、特别优选为10～30％。
具体而言，使用有机溶剂水溶液的梯度洗脱优选为依次进行有机溶剂的浓度为5～25％的有机溶剂水溶液、10～40％的有机溶剂水溶液的洗脱；更优选为依次进行有机溶剂的浓度为10～20％的有机溶剂水溶液、15～30％的有机溶剂水溶液的洗脱；特别优选为依次进行有机溶剂的浓度为15～20％的有机溶剂水溶液、20～30％的有机溶剂水溶液的洗脱。
在上述各操作之间可以进行过滤、离心分离、通过减压等的浓缩、稀释。另外，对于在该工序(A)中最终洗脱而得到的级分而言，可以保持原样，但优选预先进行浓缩而使固体成分干固。
通过以上说明的工序(A)而特异性地洗脱低聚半乳糖中所含的三糖。需要说明的是，低聚半乳糖中的三糖的比率可以通过后述的制造例中所述的方法进行测定。
本发明制备方法的工序(B)是向在工序(A)中最终洗脱而得到的级分中添加有机溶剂，对4’-GL进行结晶化的工序。
在上述工序(B)中使用的有机溶剂的种类没有特别限定，优选可与水混合的有机溶剂。作为可与水混合的有机溶剂，优选为选自甲醇、丙酮和乙醇中的1种以上，特别优选甲醇。该有机溶剂的添加量没有特别限定，例如为结晶化中使用的级分的水分量(体积)的10～30倍量。添加的有机溶剂的浓度没有特别限定，优选使用浓度为约100％的有机溶剂。
4’-GL的结晶化通过向在工序(A)中最终洗脱而得到的级分中添加有机溶剂，进行静置等来进行。需要说明的是，在进行该结晶化时也可以在静置前用超声波等进行使晶体易于析出的操作。
以上说明的工序(B)中除了三糖以外的糖(单糖、二糖和四糖等)不结晶化，仅三糖结晶化。低聚半乳糖中的三糖中存在4’-GL、Galβ1-4Galβ1-3Glc等异构体，在工序(B)中，由于在三糖异构体中4’-GL结晶化的比率也高，所以能够提高三糖异构体中的4’-GL的比率(纯度)。需要说明的是，三糖异构体中的4’-GL的比率可以通过后述的实施例中所述的方法进行测定。
在该工序(B)之后，也可以用结晶化中使用的有机溶剂对结晶化后的4’-GL高纯度组合物进行清洗、干燥等。
由上述本发明制备方法得到的组合物是以高纯度含有4’-GL的组合物，作为组合物中所含的三糖异构体中的4’-GL的含量，优选含有90％以上、优选含有94％以上、更优选含有95％以上。由本发明制备方法得到的4’-GL高纯度组合物的固体成分为95％以上，结晶化工序中除了三糖异构体以外的糖(单糖、二糖和四糖等)不结晶化。因此，该组合物中的固体成分全部为三糖异构体，所以组合物中的4’-GL的含量可以通过“组合物的固体成分×三糖异构体中的4’-GL的比率”而求出。另外，该组合物是以4’-GL作为组合物中的含量含有88％以上的物质、优选为含有90％以上、更优选为含有92％以上、进而优选为含有95％以上的物质。
由此得到的4’-GL高纯度组合物例如能够作为各种分析用的标准品使用，除此之外还能够用作饮食品、药品等的原料。
实施例
以下列举制造例、实施例来详细说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。
制造例1
糖液的制备：
用80℃的热水2.7kg溶解乳糖2kg，之后冷却至40℃，在恒温槽中保持该温度。向其添加独特掷孢酵母YIT10047(ISK-##2B6)(FERM P-18817)的菌体液(β-半乳糖苷酶活性：4000U/kg)157g和酿酒酵母(Oriental Yeast Co.,Ltd.制造：Regular Yeast)63g(6.3×1011cfu)，一边搅拌一边保持在40℃、22小时进行了反应。反应停止通过升温至85℃后将该温度保持10分钟来进行。反应结束后，对反应液进行离心分离(12000×g、30分钟)，除去用于反应的菌体而得到糖液。对于得到的糖液(制造品)而言，利用下述条件的尺寸排阻HPLC进行分析，基于面积百分比进行糖链长度不同的组成解析。其结果示于表1。
＜独特掷孢酵母的菌体液的β-半乳糖苷酶活性测定方法＞
独特掷孢酵母YIT10047(ISK-##2B6)(FERM P-18817)的菌体液的β-半乳糖苷酶活性(U)通过与国际公开第2012/141244号公报所述的测定方法相同的方法进行测定。
＜HPLC条件＞
装置：岛津prominence UFLC
柱：SUGAR KS-802(8.0φ×300mm)(昭和电工株式会社制造)
柱温度：80℃
进样量：10μL
流动相：纯化水
分析时间：30分钟
流速：0.5mL/分钟
检测：示差折光率
[表1]
*1：Yakult Pharmaceutical Ind.Co.,Ltd.制造的低聚半乳糖。使独特掷孢酵母的菌体液和源自乳酸克鲁维酵母的β-半乳糖苷酶作用于乳糖而制造。
根据以上的结果，可知的是：与使独特掷孢酵母和源自乳酸克鲁维酵母的β-半乳糖苷酶作用而得到的市售品的低聚半乳糖相比，独特掷孢酵母与糖同化性的酿酒酵母组合时的三糖的含量还高。
实施例1
洗脱条件的研究(1)：
使用蒸发器对制造例1中制备的糖液进行浓缩，得到Bx为72.3的浓缩糖液。分取该浓缩糖液的1.3g，以成为25mL的方式用纯化水进行稀释。准备按常规方法填充了活性炭(和光纯药工业株式会社制造、色谱用)25mL的开管柱色谱(柱的直径：2cm、高度：30cm)，负载了稀释糖液。对于负载了该稀释糖液的柱如下述表2所述，用纯化水清洗柱之后，用单次洗脱或梯度洗脱进行糖类的洗脱。需要说明的是，在各洗脱中使用的溶剂为100mL。清洗、洗脱所需时间为每个梯度10分钟左右。另外，清洗、洗脱用纯化水且洗脱液的液面以5cm/分钟下降的速度来进行。
对表2的单次洗脱的第一次洗脱中得到的洗脱液和梯度洗脱1的第二次洗脱中得到的洗脱液进行回收，用蒸发器进行了减压下浓缩。将得到的洗脱液调节至适宜的浓度并通过0.45μm的过滤器，利用与制造例1条件相同的尺寸排阻HPLC来分析滤液，基于面积百分比进行各洗脱液的糖链长不同的组成解析。基于前述糖链长度不同的组成解析的结果求出全部糖中的三糖的比率。其结果示于表2。
[表2]
清洗 第一次洗脱 第二次洗脱 全部糖中的三糖的比率
单次洗脱 纯化水 20％甲醇水溶液 无 70.59％
梯度洗脱1 纯化水 15％甲醇水溶液 20％甲醇水溶液 95.72％
基于以上的结果，可知的是通过梯度洗脱特异性地洗脱三糖。
实施例2
洗脱条件的研究(2)：
在实施例1的梯度洗脱1中，如以下的表3所述变更甲醇水溶液的浓度，除此以外相同地进行糖类的洗脱。另外，与实施例1相同地求出全部糖中的三糖的比率。其结果一同示于表3。
[表3]
清洗 第一次洗脱 第二次洗脱 全部糖中的三糖的比率
梯度洗脱2 纯化水 5％甲醇水溶液 10％甲醇水溶液 83.07％
梯度洗脱3 纯化水 10％甲醇水溶液 15％甲醇水溶液 94.06％
梯度洗脱1 纯化水 15％甲醇水溶液 20％甲醇水溶液 95.72％
梯度洗脱4 纯化水 20％甲醇水溶液 30％甲醇水溶液 95.47％
梯度洗脱5 纯化水 25％甲醇水溶液 40％甲醇水溶液 86.24％
根据以上的结果，可知的是：第一次洗脱的甲醇水溶液的甲醇浓度为5～25％、第二次洗脱的甲醇水溶液的甲醇浓度为10～40％的情况下，第二次洗脱的洗脱液中的三糖的比率为80％以上。特别是，可知的是：第一次洗脱的甲醇水溶液的甲醇浓度为10～20％、第二次洗脱的甲醇水溶液的甲醇浓度为15～30％的情况下，第二次洗脱的洗脱液中的三糖的比率为90％以上。进而，可知的是：第一次洗脱的甲醇水溶液的甲醇浓度为15～20％、第二次洗脱的甲醇水溶液的甲醇浓度为20～30％的情况下，第二次洗脱的洗脱液中的三糖的比率高达95％以上。
实施例3
结晶化条件的研究(1)：
用蒸发器对与制造例1相同地方式制备的糖液进行减压下浓缩，得到Bx为72.3的浓缩糖液。分取该浓缩糖液22.1g，以成为400mL的方式用纯化水进行稀释。准备按常规方法填充了活性炭(和光纯药工业株式会社制造、色谱用)400mL后的开管柱色谱(柱的直径：6cm、高度：40cm)，负载稀释糖液。对于负载了该稀释糖液的柱用纯化水清洗之后，依次用15％甲醇水溶液、20％甲醇水溶液与实施例1的梯度洗脱1相同地进行了糖类的洗脱。需要说明的是，在各洗脱中使用的溶剂为1600mL。进而，用蒸发器对该洗脱中得到的洗脱液进行减压下浓缩，之后在干燥器内使其减压干固，得到浓缩物2.3g(固体成分2.3g)。
将上述浓缩物溶解于2.5mL的纯化水中。一边搅拌一边向该溶液中以甲醇的最终浓度为95.2％(v/v)的方式每次少量地添加甲醇50mL，对其施加超声波，促进晶体的形成，之后在室温下静置一夜。用带过滤器的漏斗过滤生成的晶体，用甲醇清洗晶体，之后在干燥器内使其干燥。为了确认由结晶化所带来的三糖异构体中的4’-GL浓度的变化，通过以下的方法对含有4’-GL的三糖的异构体进行定量，求出了三糖异构体中的4’-GL的比率。另外，还求出了除了4’-GL以外的三糖的异构体的比率。需要说明的是，结晶化前的浓缩物的三糖异构体中的4’-GL的比率与除了4’-GL以外的三糖的异构体的比率通过相同的方法求得。其结果示于表4。
＜4’-GL的定量法＞
将约5mg试样放入螺旋盖试管中，用蒸发器进行减压下浓缩，浓缩后在干燥器内使其减压干固。添加相对于干固后的试样约50当量的含有2-氨基吡啶的200μL醋酸溶液，90℃、1小时使其加热反应。在反应液中添加制成195mg/mL(醋酸)后的二甲胺硼烷试剂250μL，80℃还原50分钟，得到PA化衍生物。将PA化衍生物移至50mL Falcon管(Falcon tube)中，用纯化水稀释至约25mL。向该稀释液中添加1M氢氧化钠水溶液，将pH调节至弱酸性～中性。使用MICRO-ACILYZER-S1(旭化成株式会社制造)进行透析处理。条件是将透析膜设为AC-120-10(株式会社Astom制造)、将电极液设为0.5％硝酸钠水溶液以及将结束设定为0A。用蒸发器对本处理液进行减压下浓缩，之后用干燥器进行减压干固。将样品溶解于纯化水中，将通过0.45μm过滤器后的滤液利用HPLC进行分析。为了观察PA化试剂的残渣，基于从分析开始至22分钟以后所检测出的峰面积的百分率求出了三糖异构体中的4’-GL的比率。另外，还求出了除了4’-GL以外的三糖异构体的比率。4’-GL的峰出现在从分析开始起26.8分钟后，Galβ1-4Galβ1-3Glc的峰出现在从分析开始起41.2分钟后。
＜HPLC条件＞
装置：岛津prominence UFLC
柱：PEGASIL ODS SP300(4.6mmφ×250mm)(Senshu Scientific co.，ltd.制造)
柱温度：25℃
进样量：10μL
流动相：0.2M柠檬酸钠缓冲液(pH5.7)
分析时间：70分钟
流速：0.5mL/分钟
检测：UV(310nm)
[表4]
三糖的异构体 结晶化前 结晶化后
Galβ1-4Galβ1-4Glc(4’-GL) 90.0％ 95.8％
Galβ1-4Galβ1-3Glc 6.8％ 1.7％
其它 3.2％ 2.5％
根据以上的结果，可知的是：通过使用了甲醇的结晶化能够提高三糖异构体中的4’-GL的纯度。另外，得到的晶体的95％以上为固体成分，结晶化工序中除了三糖异构体以外的糖未结晶化。因此，该晶体中的固体成分全部为三糖异构体，所以组合物中的4’-GL的比率为(95％×95.8％＝)91％以上。
实施例4
结晶化条件的研究(2)：
用蒸发器对与制造例1相同地方式制备的糖液进行减压下浓缩，得到Bx为72.3的浓缩糖液。分取该浓缩糖液120g，以成为2000mL的方式用纯化水进行稀释。准备按常规方法填充了活性炭(和光纯药工业株式会社制造、色谱用)2000mL后的开管柱色谱(柱的直径：9cm、高度：80cm)，负载稀释糖液。对于负载了该稀释糖液的柱用纯化水清洗之后，依次用15％甲醇水溶液、20％甲醇水溶液与实施例1的梯度洗脱1相同地进行糖类的洗脱。需要说明的是，在各洗脱中使用的溶剂为8000mL。进而，用蒸发器对该洗脱中得到的洗脱液进行减压下浓缩，之后在干燥器内使其减压干固，得到浓缩物12.5g(固体成分12.5g)。
将上述浓缩物溶解于12.5mL的纯化水中，并分成每个2.5mL。一边搅拌一边以最终浓度为95.2％(v/v)的方式向其中每次少量地添加作为可与水混合的溶剂的丙酮或乙醇各50mL。之后，对其施加超声波，促进晶体的形成，在室温下静置一夜。用带过滤器的漏斗过滤生成的晶体，分别用结晶化时使用的有机溶剂对晶体进行清洗，之后在干燥器内使其干燥。为了确认由结晶化所带来的三糖异构体中的4’-GL浓度的变化，与实施例3相同地对含有4’-GL的三糖的异构体进行定量，求出三糖异构体中的4’-GL的比率。其结果示于表5。另外，实施例3中所示的、使用甲醇进行结晶化时的三糖异构体中的4’-GL的比率也再次示于表5。
[表5]
根据以上的结果，可知的是：若使用丙酮、乙醇，则与甲醇相同地通过结晶化使三糖异构体中的4’-GL的纯度提高。然而，结晶化后的三糖异构体中的4’-GL的比率在使用了甲醇的情况下最高。使用了丙酮、乙醇的情况也是得到的晶体的95％以上为固体成分，结晶化工序中除了三糖异构体以外的糖未结晶化。因此，该晶体中的固体成分全部为三糖异构体，所以组合物中的4’-GL的比率为(95％×94.4％＝)89.6％以上。
实施例5
用其它菌株的研究
代替独特掷孢酵母YIT10047(ISK-##2B6)的菌体液，使用β-半乳糖苷酶活性与制造例1中使用的独特掷孢酵母YIT10047的菌体液同等的量的独特掷孢酵母JCM5356的菌体液，除此以外与制造例1相同地制备糖液，用与实施例1的梯度洗脱1相同的条件进行梯度洗脱，在与实施例3相同的条件下对4’-GL进行结晶化。其结果，能够得到三糖中的4’-GL的比率为95％以上的晶体。另外，得到的晶体的95％以上为固体成分，结晶化工序中除了三糖异构体以外的糖未结晶化。因此，该晶体中的固体成分全部为三糖异构体，所以组合物中的4’-GL的比率为(95％×95％＝)90.3％以上。
产业上的可利用性
若使用本发明的4’-GL高纯度组合物的制备方法，则能够通过简便的方法得到4’-GL高纯度组合物。另外，用该制备方法得到的4’-GL高纯度组合物除了能够作为各种分析用的标准品使用之外，还能够用作饮食品、药品等的原料。

Claims (4)

1.一种4’-半乳糖基乳糖即4’-GL高纯度组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下的工序(A)和工序(B)，
工序(A)：将含有4’-GL的低聚半乳糖供于活性炭柱层析，使用有机溶剂水溶液进行梯度洗脱，在该梯度洗脱中，每次增加洗脱次数时，使用有机溶剂的浓度比前一次洗脱时的浓度还高的有机溶剂水溶液；
工序(B)：向在工序(A)中最终洗脱而得到的级分中添加有机溶剂，对4’-GL进行结晶化；
其中，依次以有机溶剂的浓度为10～20质量％的有机溶剂水溶液、15～30质量％的有机溶剂水溶液来进行工序(A)的梯度洗脱，工序(A)中使用的有机溶剂为甲醇。
2.根据权利要求1所述的4’-GL高纯度组合物的制备方法，其中，依次以有机溶剂的浓度为15～20质量％的有机溶剂水溶液、20～30质量％的有机溶剂水溶液来进行工序(A)的梯度洗脱。
3.根据权利要求1或2所述的4’-GL高纯度组合物的制备方法，其中，工序(B)中使用的有机溶剂为选自甲醇、丙酮和乙醇中的1种以上。
4.根据权利要求1或2所述的4’-GL高纯度组合物的制备方法，其中，工序(A)中使用的含有4’-GL的低聚半乳糖是使用独特掷孢酵母(Sporobolomyces singularis)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)而生成的物质。
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