TWI659107B - 4’-gl高純度組成物之調製法 - Google Patents
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Abstract
本發明係以比以往更簡便之方法,獲得4’-GL之純度高、可使用作為各種分析用標準品之組成物。
本發明係一種4’-GL高純度組成物之調製法,其特徵係包含以下步驟(A)及(B)。
(A)將含4’-GL之半乳寡糖(galactooligosaccharide)供於活性碳管柱層析中,使用有機溶劑水溶液予以階段溶出,且於該階段溶出中,每增加一次溶出次數,使用有機溶劑之濃度比其前次溶出時更高之有機溶劑水溶液之步驟,(B)將有機溶劑添加於步驟(A)中最終溶出之溶出份,使4’-GL結晶化之步驟。
Description
本發明係關於自含4’-GL(4’-半乳糖乳糖:Galβ1-4Galβ1-4Glc)之半乳寡糖(galactooligosaccharide)調製以高純度含有4’-GL之組成物之方法。
4’-GL已知係為可促進腸內之益生菌(Bifido bacteria)增生之半乳寡糖之主成分。且,該4’-GL係用於半乳寡糖分析時之指標。
該含4’-GL之半乳寡糖於工業上係以乳糖作為原料,利用藉由β-半乳糖酶(galactosidase)之轉移反應而生產,但於未進行純化步驟等時,一般為半乳糖本身之純度低者。
迄今作為純化寡糖以提高純度之技術已報導有例如特徵為使用於具有羥基之高分子中導入羧基甲基之高分子作為層析填充劑之葡糖胺寡糖之純化法(專利文獻1),但並未報導純化半乳寡糖而提高半乳寡糖之成分中之4’-GL純度之方法,並非作成4’-GL之標準品者,甚至並非純度高者。
〔專利文獻1〕日本特公平6-55766號公報
據此,本發明之課題係提供一種簡便‧低價獲得4’-GL之純度高,可使用作為各種分析用之標準品之組成物的方法。
本發明人等為解決上述課題而積極研究之結果,發現藉由組合使用有機溶劑之階段溶出與結晶化,而獲得4’-GL之純度高之組成物,因而完成本發明。
亦即,本發明係一種4’-半乳糖乳糖(4’-GL)高純度組成物之調製法,其特徵係包含以下步驟(A)及(B)。
(A)將含4’-GL之半乳寡糖供於活性碳管柱層析中,使用有機溶劑水溶液階段溶出,且於該階段溶出中,每增加一次溶出次數,使用有機溶劑之濃度比其前次溶出時更高之有機溶劑水溶液之步驟,(B)將有機溶劑添加於步驟(A)中最終溶出之溶出份,使4’-GL結晶化之步驟。
又,本發明係藉由上述調製法獲得之4’-GL高純度組成物。
本發明之4’-GL高純度組成物之調製法可藉由組合使用有機溶劑之階段溶出與結晶化,以簡便之方法低價地自含4’-GL之半乳寡糖調製高純度含有4’-GL之組成物。
且,藉由本發明之4’-GL高純度組成物之調製法獲得之4’-GL高純度組成物可使用作為各種分析用之標準品。
本發明之4’-GL高純度組成物之調製法(以下稱為「本發明調製法」)之步驟(A)係將含4’-GL之半乳寡糖供於活性碳管柱層析中,使用有機溶劑水溶液予以階段溶出,且於該階段溶出中,每增加一次溶出次數,使用有機溶劑之濃度比其前次溶出時更高之有機溶劑水溶液之步驟。
上述含4’-GL之半乳寡糖只要是半乳寡糖中含有4’-GL者即無特別限制,列舉為例如利用藉由β-半乳糖酶之轉移反應而生產之半乳寡糖等。
具體而言,利用藉由β-半乳糖酶之轉移反應生產含4’-GL之半乳寡糖時,只要能使β-半乳糖酶或能產
生β-半乳糖酶之微生物作用於乳糖即可,較好於為了提高半乳寡糖中之3糖之比例時,只要組合β-半乳糖酶與糖同化性(assimilation)之微生物並作用即可。
產生β-半乳糖酶之微生物列舉為例如乳酸克
魯維酵母(Kluyveromyces lactis)等之克魯維酵母屬之微生物,獨特擲孢酵母(Sporobolomyces singularis)等之擲孢酵母屬之微生物等。此外,亦可例舉出嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、乳鏈球菌(Streptococcus lactis)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、萊氏乳桿菌(Lactobacillus leichmannii)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、短桿菌(Bacillus brevis)、嗜熱脂肪桿菌(Bacillus stearothermophilus)、兩叉雙歧乳桿菌(Bifidobacterium bifidum)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)等。該等微生物中以擲孢酵母屬之微生物較佳,更好為獨特擲孢酵母(Sporobolomyces singularis),最好為本申請人等所報導之獨特擲孢酵母ISK-##2B6。又,獨特擲抱酵母ISK-##2B6為本申請人已於2002年4月10日寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心(〒 305-8566,茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6(又,前述專利生物寄存中心自平成25年4月1日以後新名稱為獨立行政法人製品評價技術基礎機構專利生物寄
存中心,新地址遷移至〒 292-0818千葉縣木更津市kazusa鎌足2丁目5番地8120室))以FERM P-18817予以寄存。且,作為獨特擲孢酵母,亦可較好地使用獨特擲孢酵母ISK-##2B6的母株之獨特擲孢酵母JCM5356,該菌株可自理化學研究所生物資源中心(〒 305-0074,茨城縣筑波市高野台3-1-1)有償獲得。該等微生物可單獨使用1種,亦可2種以上組合使用。
上述糖同化物之微生物列舉為例如一般作為
麵包酵母而市售之啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或單孢啤酒酵母(Saccharomyces unisporous)等。該等微生物可單獨使用一種,亦可組合2種以上使用。且,糖同化性之微生物所同化之糖並無特別限制,但為了提高半乳寡糖中之3糖之比例,較好為能使蔗糖同化之微生物。
使用上述微生物生成含4’-GL之半乳寡糖之
條件並無特別限制,列舉為例如將溶解有乳糖之水加溫至40℃左右,添加能產生β-半乳糖酶之微生物及視需要之糖同化性微生物,邊攪拌邊培養1天左右之條件等。能產生β-半乳糖酶之微生物之添加量並未特別限定者,只要例如以使相對於乳糖1kg,β-半乳糖酶活性成為100~600U之方式添加即可。又,糖同化性之微生物添加量亦未特別限制,只要例如以使相對於乳糖1kg,以該微生物之乾燥粉體計,成為0.0001~10質量%(1×107~1×1012cfu)之方式添加即可。β-半乳糖酶活性之測定方法與後述之製造例相同。且,該半乳寡糖之生成反應藉由例如加溫至85℃左
右,於該溫度維持10分鐘左右即可完成。又,反應結束後,較好藉離心分離或過濾去除菌體。
活性碳管柱層析只要於填充有活性碳之管柱
中,負載含4’-GL之半乳寡糖,使用有機溶劑水溶液對其階段溶出即可。
填充於上述管柱中之活性碳種類並未特別限
制,可為例如粉末、顆粒、破碎狀態者。又,於管柱中填充活性碳之方法並未特別限制,只要例如將活性碳添加於水中作成漿液者填充於管柱中並靜置即可。再者,填充於管柱中之活性碳之量並未特別限制,例如為所使用之管柱內容量之1/3至1/4之量。所使用之管柱材質並未特別限制,例如可使用玻璃製、塑膠製等之管柱,其直徑及高度亦未特別限制,例如可使用直徑為2~15cm,高度為30~100cm之管柱。
使用有機溶劑之階段溶出係藉由於每增加一
次溶出次數,使用有機溶劑之濃度比其前次溶出時更高之有機溶劑水溶液而進行。具體而言,首先將水通入活性碳管柱中進行洗淨。接著,通入有機溶劑水溶液,隨後,通入有機溶劑之濃度比其前次溶出時更高之有機溶劑水溶液。將該有機溶劑水溶液通入活性碳管柱之操作於以濃度不同之有機溶劑水溶液進行2次以上時稱為階段溶出,較佳通入次數為2次。且,1次溶出(通入操作)中所用之有機溶劑水溶液之量並未特別限制,例如為所使用之活性碳體積之2~6倍量。再者,階段溶出速度亦未特別限制,
例如為溶出液之液面以2~6cm/min移動之速度。
上述步驟(A)所用之有機溶劑種類並未特別
限制,但較好為具有極性之有機溶劑,更好為碳數1~3之醇,最好為甲醇。該有機溶劑之濃度較好為5~40質量%(以下簡稱「%」),最好為10~30%。
具體而言,使用有機溶劑水溶液之階段溶出
較好以有機溶劑之濃度為5~25%之有機溶劑水溶液、10~40%之有機溶劑水溶液之順序進行,更好以有機溶劑之濃度為10~20%之有機溶劑水溶液、15~30%之有機溶劑水溶液之順序進行,最好以有機溶劑之濃度為15~20%之有機溶劑水溶液、20~30%之有機溶劑水溶液之順序進行。
於上述各操作之間,亦可進行利用過濾、離
心分離、減壓等之濃縮或稀釋。又,該步驟(A)中最終溶出之溶出份可直接使用,但較好進行濃縮,使固體成分乾燥。
藉由以上說明之步驟(A),將半乳寡糖中所
含之3糖特異地溶出。又,半乳寡糖中之3糖比例可藉後述製造例中所記載之方法測定。
本發明調製法之步驟(B)係將有機溶劑添加
於步驟(A)中最終溶出之溶出份,使4’-GL結晶化之步驟。
上述步驟(B)所用之有機溶劑種類並未特別
限制,但較好為可與水混合之有機溶劑。可與水混合之有
機溶劑較好為自甲醇、丙酮及乙醇選出之1種以上,最好為甲醇。該有機溶劑之添加量並未特別限制,例如可為結晶化所用之溶出份之水分量(體積)之10~30倍量。添加之有機溶劑濃度並未特別限制,但較好使用濃度約100%者。
4’-GL之結晶化係藉由對步驟(A)中最終溶
出之溶出份添加有機溶劑並靜置等而進行。又,該結晶化時,於靜置前亦可藉超音波等使結晶易於析出。
以上說明之步驟(B)中,3糖以外之糖(單
糖、2糖及4糖等)不會結晶化,僅3糖會結晶化。半乳寡糖中之3糖中,存在有4’-GL或Galβ1-4Galβ1-3Glc等之異構物,於步驟(B)中,由於使3糖異構物中4’-GL結晶化之比例提高,故可提高3糖異構物中4’-GL之比例(純度)。又,3糖異構物中4’-GL之比例可藉後述實施例中記載之方法測定。
於該步驟(B)之後,亦可對結晶化之4’-GL
高純度組成物以結晶化所用之有機溶劑進行洗淨、乾燥等。
由上述本發明之調製法獲得之組成物係4’-GL
為高濃度,較好為組成物中所含之3糖異構物中之4’-GL含量含90%以上之組成物,更好含94%以上,又更好含95%以上者。由本發明之調製法獲得之4’-GL高純度組成物之固體成分為95%以上,於結晶化步驟中,3糖異構物以外之糖(單糖、2糖及4糖)並未結晶化。因此,該組
成物中之固體成分全部為3糖異構物,故組成物中之4’-GL含量可藉由「該組成物中之固體成分×3糖異構物中之4’-GL比例」求出。且,該組成物以4’-GL於組成物之含量計為含88%以上者,較好含90%以上,更好含92%以上,又更好含95%以上者。
該所得之4’-GL高純度組成物可使用作為例
如各種分析用之標準品,此外,亦可作為飲食品、醫藥品等之原料。
以下,列舉製造例、實施例詳細說明本發明,但本發明不受該等實施例之任何限制。
將乳糖2kg以80℃熱水2.7kg溶解後,冷卻至40℃,以恆溫槽保持該溫度。於其中添加獨特擲孢酵母(Sporobolomyces singularis)YIT10047(ISK-##2B6)(FERM P-18817)之菌體液(β-半乳糖酶活性:4000U/kg)157g與啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(ORIENTAL酵母(股)製:普通酵母)63g(6.3×1011cfu),邊攪拌22小時邊保持在40℃進行反應。反應停止係於升溫至85℃後,於該溫度保持10分鐘而進行。反應結束後,對反應液進行離心分離(12,000×g,
30min),去除反應所用之菌體獲得糖液。針對所得糖液(製造品)藉由以下條件之尺寸排除HPLC進行分析,自面積百分率進行糖鏈長別組成解析。其結果示於表1。
獨特擲孢酵母YIT10047(ISK-##2B6)(FERM P-18817)之菌體液之β-半乳糖酶活性(U)係以與國際公開第2012/141244號公報所記載之測定方法相同之方法測定。
裝置:島津prominence UFLC
管柱:SUGAR KS-802(8.0 ×300mm)(昭和電工(股)製)
管柱溫度:80℃
注入量:10μL
移動相:純化水
分析時間:30min
流速:0.5mL/min
檢測:示差折射率
由以上結果可知組合獨特擲孢酵母與糖同化
性之乳酸克魯維酵母時,由獨特擲孢酵母與源自乳酸克魯維酵母之β-半乳糖酶作用而得之市售品之半乳寡糖之3糖含量亦變高。
溶出條件之檢討(1):將製造例1所調製之糖液使用蒸發器濃縮,獲得Bx為72.3之濃縮糖液。分取該濃縮糖液之1.3g,以水進行稀釋成25mL。依據常用方法填充活性碳(和光純藥工業(股)製,層析用)25mL準備開放管柱層析器(管柱直徑:2cm,高度:30cm),負載稀釋糖液。針對負載該稀釋糖液之管柱,如以下表2所記載,以純化水洗淨管柱後,以單次溶出或階段溶出進行糖類之溶出。又,各溶出所用之溶劑為100mL。洗淨、溶出所需之時間於各階段為10分鐘左右。且,洗淨、溶出係以純化水、溶出液之液面以5cm/min下降之速度進行。
回收表2之單次溶出之第一次溶出所得之溶
出液與階段溶出1之第二次溶出所得之溶出液,以蒸發器減壓下進行濃縮。將所得溶出液調整成適度濃度,通過0.45μm之過濾器,使濾液藉由以與製造例1相同條件之尺寸排除HPLC分析,由面積百分率進行各溶出液之糖鏈長別組成解析。由前述糖鏈長別組成解析結果求得全糖中之3糖比例。其結果示於表2。
由以上結果可知利用階段溶出,可特異地溶
出3糖。
溶出條件之檢討(2):於實施例1之階段溶出1中,除了將甲醇水溶液之濃度如以下表3所記載般變更以外,同樣進行糖類之溶出。且與實施例1同樣求出全糖中3糖之比例。其結果彙整示於表3。
由以上結果可知溶出第一次之甲醇水溶液之
甲醇濃度為5~25%,溶出第二次之甲醇水溶液之甲醇濃度為10~40%時,溶出第二次之溶出液中之3糖比例為80%以上。尤其可知,溶出第一次之甲醇水溶液之甲醇濃度為10~20%,溶出第二次之甲醇水溶液之甲醇濃度為15~30%時,溶出第二次之溶出液中之3糖比例為90%以上。再者可知,溶出第一次之甲醇水溶液之甲醇濃度為15~20%,溶出第二次之甲醇水溶液之甲醇濃度為20~30%時,溶出第二次之溶出液中之3糖比例提高,為95%以上。
結晶化條件之檢討(1):
將與製造例1同樣調製之糖液使用蒸發器減壓下濃縮,獲得Bx為72.3之濃縮糖液。分取該濃縮糖液之22.1g,以純化水進行稀釋成400mL。依據常用方法填充活性碳(和光純藥工業(股)製,層析用)400mL準備開放管柱層析器(管柱直徑:6cm,高度:40cm),負載稀
釋糖液。針對負載該稀釋糖液之管柱,以純化水洗淨後,以15%甲醇水溶液、20%甲醇水溶液之順序與實施例1之階段溶出1同樣進行糖類之溶出。又,各溶出所用之溶劑為1600mL。進而,該溶出所得之溶出液以蒸發器減壓下濃縮後,在乾燥器內減壓乾燥,獲得濃縮物2.3g(固體成分2.3g)。
將上述濃縮物溶解於2.5mL純化水中。於該
溶液中邊攪拌下邊逐次少量添加甲醇50mL直至甲醇之終濃度為95.2%(v/v),對其施加超音波促進結晶之形成後,在室溫靜置隔夜。生成之結晶以附過濾器之漏斗過濾,以甲醇洗淨結晶後,在乾燥器內乾燥。為了確認因結晶化之3糖異構物中之4’-GL濃度變化,藉以下方法對含4’-GL之3糖異構物定量,求出3糖異構物中之4’-GL比例。且,亦求出4’-GL以外之3糖之異構物之比例。又,結晶化前之濃縮物之3糖異構物中之4’-GL之比例及4’-GL以外之3糖異構物之比例亦以同樣方法求出。其結果示於表4。
將試料約5mg取至螺旋口試驗管中,以蒸發器減壓下濃縮,濃縮後,於乾燥器內減壓乾燥。對於經乾燥之試料添加包含約50當量之2-胺基吡啶之200μL乙酸溶液,在90℃加熱反應1小時。於反應液中添加250μL之調製成195mg/mL(乙酸)之硼烷-二甲基胺試藥,在80℃還
原50分鐘,獲得PA化衍生物。將PA化衍生物移至50mL Falcon試管中,以純化水稀釋至約25mL。於該稀釋液中添加1M氫氧化鈉水溶液,將pH調整至弱酸性~中性。使用MICRO ACILYZER S1(旭化成(股)製)進行透析處理。條件係透析膜為AC-120-10(ASTOM(股)製),電極液為0.5%硝酸鈉水溶液及結束設定設為0A。
本處理液以蒸發器減壓下濃縮後,以乾燥器減壓乾燥。將樣品溶解於純化水中,通過0.45μm過濾器以HPLC分析濾液。為了觀察PA化試藥之殘渣,自分析開始後22分鐘以後所檢測出之波峰面積百分率,求出3糖異構物中4’-GL之比例。且,亦求出4’-GL以外之3糖異構物之比例。4’-GL之波峰於開始分析後26.8分鐘後出現,Galβ1-4Galβ1-3Glc之波峰於開始分析後41.2分鐘後出現。
裝置:島津prominence UFLC
管柱:PEGASIL ODS SP300(4.6mm ×250mm)(SENSHU科學製)
管柱溫度:25℃
注入量:10μL
移動相:0.2M檸檬酸鈉緩衝液(pH5.7)
分析時間:70min
流速:0.5mL/min
檢測:UV(310nm)
由以上結果可知,藉由使用甲醇之結晶化,
可使3糖異構物中之4’-GL之純度提高。且,所得之結晶係95%以上為固體成分,於結晶化步驟中3糖異構物以外之糖並未結晶化。因此,該結晶中之固體成分全部為3糖異構物,因此組成物中之4’-GL比例成為(95%×95.8%=)91%以上。
結晶化條件之檢討(2):
將與製造例1同樣調製之糖液使用蒸發器減壓下濃縮,獲得Bx為72.3之濃縮糖液。分取該濃縮糖液120g,以純化水進行稀釋成2000mL。依據常用方法填充活性碳(和光純藥工業(股)製,層析用)2000mL準備開放管柱層析器(管柱直徑:9cm,高度:80cm),負載稀釋糖液。針對負載該稀釋糖液之管柱,以純化水洗淨,以15%甲醇水溶液、20%甲醇水溶液之順序與實施例1之階段溶出1同樣進行糖類之溶出。又,各溶出所用之溶劑為8000mL。進而,該溶出所得之溶出液以蒸發器減壓下濃縮後,在乾燥器內減壓乾燥,獲得濃縮物12.5g(固體成
分12.5g)。
將上述濃縮物溶解於12.5mL純化水中,分成
各2.5mL。邊攪拌邊於其中逐次少量添加可與水混合之溶劑的丙酮或乙醇各50mL,直至終濃度成為95.2%(v/v)。隨後,對其施加超音波,促進結晶形成,於室溫靜置隔夜。生成之結晶以附過濾器之漏斗過濾,以各結晶時所使用之有機溶劑洗淨結晶後,於乾燥器內乾燥。為了確認因結晶化而3糖異構物中之4’-GL濃度之變化,與實施例3同樣對含4’-GL之3糖異構物定量,求出3糖異構物中之4’-GL比例。其結果示於表5。且,於實施例3所示之使用甲醇結晶化時之3糖異構物中之4’-GL之比例再次示於表5。
由以上結果可知,使用丙酮、乙醇時,與甲醇同樣因結晶化使3糖異構物中之4’-GL純度變高。然而,結晶化後之3糖異構物中之4’-GL比例於使用甲醇時最高。使用丙酮、乙醇時,所得結晶亦係95%以上為固體成分,於結晶化步驟中3糖異構物以外之糖並未結晶化。因此,由於該結晶中之固體成分全部為3糖異構物,故組
成物中4’-GL之比例成為(95%×94.4%=)89.6%以上。
以其他菌株之檢討
代替獨特擲孢酵母YIT10047(ISK-##2B6)之菌體液,β-半乳糖酶活性係使用與製造例1所用之獨特擲孢酵母YIT10047之菌體液同等之量的獨特擲孢酵母JCM5356之菌體液以外,與製造例1同樣調製糖液,以與實施例1之階段溶出1同樣之條件進行階段溶出,與實施例3同樣條件使4’-GL結晶化。結果,可獲得3糖中之4’-GL比例為95%以上之結晶。且,所得結晶係95%以上為固體成分,於結晶化步驟中3糖異構物以外之糖未結晶化。因此,由於該結晶中之固體成分全部為3糖異構物,故組成物中4’-GL之比例成為(95%×95%=)90.3%以上。
使用本發明之4’-GL高純度組成物之調製法時,可藉簡便方法獲得4’-GL高純度組成物。而且,以該調製法所得之4’-GL高純度組成物除了可使用作為各種分析用之標準品以外,亦可作為飲食品、醫藥品等之原料。
Claims (5)
- 一種4’-半乳糖乳糖(4’-GL)高純度組成物之調製法,其特徵係包含以下步驟(A)及(B):(A)將含4’-GL之半乳寡糖(galactooligosaccharide)供於活性碳管柱層析中,使用有機溶劑水溶液進行階段溶出,且於該階段溶出中,每增加一次溶出次數,使用有機溶劑之濃度比前次溶出時更高之有機溶劑水溶液之步驟,(B)將有機溶劑添加於步驟(A)中最終溶出之溶出份,使4’-GL結晶化之步驟,其中,依次以有機溶劑的濃度為10~20質量%的有機溶劑水溶液、15~30質量%的有機溶劑水溶液來進行步驟(A)的階段溶出。
- 如請求項1之4’-GL高純度組成物之調製法,其步驟(A)之階段溶出係依有機溶劑之濃度為15~20質量%之有機溶劑水溶液、20~30質量%之有機溶劑水溶液之順序進行者。
- 如請求項1或2之4’-GL高純度組成物之調製法,其中步驟(A)中使用之有機溶劑為甲醇。
- 如請求項1或2之4’-GL高純度組成物之調製法,其中步驟(B)中使用之有機溶劑係由甲醇、丙酮及乙醇選出之一種以上。
- 如請求項1或2之4’-GL高純度組成物之調製法,其中步驟(A)中使用之含4’-GL之半乳寡糖係使用獨特擲孢酵母(Sporobolomyces singularis)及啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生成者。
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