KR101581440B1 - 비피도박테리움 롱검 ｒｄ４７, 비피도박테리움 롱검 유래 갈락토시다아제의 생산방법 및 이를 이용한 갈락토올리고당의 제조방법 - Google Patents

비피도박테리움 롱검 ｒｄ４７, 비피도박테리움 롱검 유래 갈락토시다아제의 생산방법 및 이를 이용한 갈락토올리고당의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 갈락토시다아제를 대량 생산하는 균주, 갈락토시다아제를 대량 생산하는 방법, 이를 이용하여 갈락토올리고당을 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 의할 경우 갈락토오즈를 대량으로 생산할 수 있고, 프리바이오틱스로 사용될 수 있는 갈락토올리고당을 대량 제조할 수 있다.

Description

비피도박테리움 롱검 ＲＤ４７, 비피도박테리움 롱검 유래 갈락토시다아제의 생산방법 및 이를 이용한 갈락토올리고당의 제조방법{Bifidobacterium longum RD 47, method for production of galactosidase from Bifidobacterium longum and galactooligosaccharide therefrom}
본 발명은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) RD 47, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)으로부터 갈락토시다아제를 대량 생산하는 방법 및 이를 이용하여 갈락토올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.
장내 균총의 불균형을 개선하여 질병을 예방하고자 하는 다양한 시도들 중 하나로 유산균을 주축으로 한 프로바이오틱 미생물의 건강 기능성을 검증하고, 이를 기능성 원료로 사용하는 연구들이 진행되어 왔다. 특히, 프로바이오틱 미생물의 성장을 촉진하고 이들 균주의 대사 활성을 높이는 역할을 하는 프리바이오틱스(prebiotics)의 개발 및 특정 프리-프로바이오틱스의 조합을 통해 프로바이오틱스의 건강 기능성의 극대화를 꾀하고자 하는 신바이오틱스(synbiotics) 개념 역시 다양한 식품소재를 통해 활용되고 있다. 그러나, 각 개인이 가진 장내 프로바이오틱 미생물의 프로파일은 저마다 고유하여 기능성 프로바이오틱 제재의 섭취기간 동안 변화된 장내 균총은 섭취가 끝난 후에 본래의 조성으로 되돌아가는 경향을 보인다. 이는 프로바이오틱 균주의 정착 과정에서 면역 관용을 결정짓는 유전적 인자와 개인 특유의 환경조건, 식이습관 등이 복합적으로 작용한 것인데, 이와 같은 요소들은 프리-프로바이오틱 제재의 효과에 큰 영향을 미친다.
현재, GRAS에 속하는 대표적인 유익균인 프로바이오틱스(probiotics) 균주와 이들 균주의 성장을 선택적으로 증가시키는 작용을 할 수 있는 다양한 프리바이오틱스(prebiotics) 제재들이 기능성 식품으로 사용되고 있다.
깁슨(Gibson)과 로버프로이드(Roberfroid)는 프로바이오틱스와 프리바이오틱스의 혼합물로서, 신바이오틱스(synbiotics)를 제시하였는데, 이는 프리바이오틱스가 프로바이오틱 균주의 성장 촉진과 대사의 활성화를 통해 장관 내 생존과 정착을 증진시킴으로써 숙주에 유익한 영향을 미치게 하기 위한 것이다.
각 개인의 장내 균총 프로파일이 연령과 식이, 약물과 항생제의 섭취, 스트레스 등의 변화에 따라 변화함을 감안하여, 본래 자신이 가지고 있는 비피도박테리아 또는 락토바실러스 균주와 이를 활성화할 수 있는 종 특이적(species-specific) 프리바이오틱스를 발굴함으로써 인체적합성 맞춤형 신바이오틱스 제재로 활용할 수 있다.
기본적으로 프리바이오틱스는 인간의 장내 효소로는 분해가 되지 않고 위산이나 담즙산에 대한 저항성이 강해 장까지 분해되지 않고 이동하여, 비피도박테리아 또는 락토바실러스와 같은 특정 균주의 성장을 선택적으로 도울 수 있는 물질이어야 한다. 이와 같은 물질을 통해 이들 물질을 선택적으로 이용할 수 있는 특정 균주가 인간이 가지지 않은 당 관련 가수분해 효소를 많이 생산함으로써 프리바이오틱스를 높은 수율로 이용할 수 있고, 다른 균주와의 경쟁에서 우세할 수 있기 때문이다.
일반적인 올리고당의 경우, 비피도박테리아 또는 락토바실러스에 해당하는 대부분의 균주의 성장에 영향을 미치며, 종-특이성을 갖지 않는다. 따라서, 체 내 소화효소에 의해 소화되지 않으며, 장내 비피도박테리아 또는 락토바실러스에 의해 특이적으로 분해될 수 있는 프리바이오틱스, 즉 올리고당의 개발이 요구되는 것이다.
삭제
J. Agric. Food Chem., Vol.55, pp.2225-2230(2007.)에는, 베타-갈락토시다아제를 이용하여 유당(lactose)으로부터 갈락토올리고당을 생산하는 방법이 기재되어 있다.
본 발명에서는 프리바이오틱스인 갈락토올리고당의 제조방법을 개발하여 제공하고자 하며, 아울러 이와 같은 반응에 사용되는 갈락토시다아제를 대량으로 생산하는 방법을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 본 발명의 제1형태로, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) RD 47을 제공한다. 하기 본 발명의 실험에 의할 경우, 다른 비피도박테리움 균주에 비해 본 발명의 RD 47 균주를 이용할 경우, 균체 내 갈락토시다아제의 활성이 높고, 갈락토올리고당의 합성능력이 가장 우수한 것으로 나타났다.
한편, 본 발명은 본 발명의 제2형태로, 라피노오즈가 첨가된 배지에서 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주를 배양하고, 배양 후 균주로부터 갈락토시다아제를 회수하는 것을 특징으로 하는 갈락토시다아제의 생산방법을 제공한다. 본 발명의 제2형태인 갈락토시다아제의 생산방법은 탄소원으로 라피노오즈를 사용하는 것을 특징으로 하는데, 라피노오즈(raffinose)를 탄소원으로 배지에 첨가할 경우, 다른 탄소원을 배지에 첨가하는 것에 비해 갈락토시다아제의 활성이 높게 나타났다.
본 발명의 갈락토시다아제의 생산방법에 있어서, 상기 배지는 필요에 의해 락토오즈 또는 갈락토오즈를 추가로 포함할 수 있다. 기본적으로 탄소원으로 라피노오즈를 첨가할 때 갈락토시다아제의 활성이 높게 나타났으나, 라피노오즈에 락토오즈 또는 갈락토오즈를 첨가할 경우에도 활성이 높게 나타났기 때문이다.
본 발명의 갈락토시다아제의 생산방법에 있어서, 상기 배지는 바람직하게 탄소원이 제거된 MRS 배지일 수 있다. 즉, 본 발명의 배지는 바람직하게 탄소원이 제거된 MRS 배지에 탄소원으로 라피노오즈를 포함하는 것일 수 있는 것이다. 또한, 더욱 바람직하게 락토오즈 또는 갈락토오즈를 추가로 포함할 수 있는 것이다. MRS 배지는 유산균의 생육에 사용되는 기본 배지로 이 배지에 대해서는 이미 많이 알려져 있으므로, 이에 대한 구체적인 기재는 생략하기로 한다. 다만, 본 발명에서는 상기 MRS 배지에서 탄소원을 제거하고, 새로운 탄소원으로 라피노오즈 또는 '라피노오즈+락토오즈' 또는 '라피노오즈+갈락토오즈'를 첨가하는 것이다.
본 발명의 제2형태에 있어서, 상기 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)은, 일 예로 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) RD 47일 수 있다.
한편, 본 발명은 본 발명의 제3형태로, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) RD 47 유래의 갈락토시다아제 또는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) RD 47 균체 내액을 조효소액으로 하여 기질인 갈락토오즈와 반응시키는 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제3형태는 호모 갈락토올리고당의 제조방법을 제공하는데, '비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) RD 47 유래의 갈락토시다아제와 기질인 갈락토오즈를 반응시키는 것' 또는 '비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) RD 47 균체 내액을 조효소액으로 하여 기질인 갈락토오즈를 반응시키는 것'을 특징으로 한다. 본 발명의 제3형태와 같이, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) RD 47 유래의 갈락토시다아제를 사용할 경우, 갈락토오즈만으로 구성된 호모 갈락토올리고당(호모-GOS)이 제조된다 (하기 실시예 3 및 4 참조). 다이(di) 또는 트리(tri) 갈락토올리고당이 많이 생산되었으나, DP 4 이상의 갈락토올리고당도 생성됨을 확인할 수 있었다.
본 발명의 제3형태인 갈락토올리고당의 제조방법에 있어서, 상기 갈락토시다아제와 갈락토오즈의 첨가비율은 바람직하게 2:1이고, 이때 갈락토오즈는 70%(w/v) 갈락토오즈 수용액인 것일 수 있다.
한편, 본 발명은 본 발명의 제4형태로, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 유래의 갈락토시다아제 또는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균체 내액을 조효소액으로 하여 기질인 갈락토오즈와 반응시키고 반응액을 회수하는 단계 (a); 상기 단계 (a)에서 회수한 반응액을 고체상 추출법(solid phase extration)에 의해 갈락토올리고당을 분리할 수 있는 카트리지에 로딩하는 단계 (b); 상기 단계 (b) 후, 카트리지에 정제수를 흘려주는 단계 (c); 및, 상기 단계 (c) 후, 메탄올수용액을 흘려주어 갈락토올리고당을 용출시키는 단계 (d); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 정제방법을 제공한다.
본 발명의 갈락토올리고당의 정제방법은 반응액을 카트리지에 로딩한 후, 용매로 용출하기 전에 정제수를 흘려주는 것을 특징으로 하는데, 이와 같은 과정을 통해 반응액 중 존재하는 염(salt) 및 미반응 갈락토오즈가 카트리지로부터 씻겨 내려간다. 따라서, 최종 용출액 중 갈락토올리고당의 순도를 현저히 높일 수가 있는 것이다.
본 발명의 제4형태는 갈락토올리고당을 정제하는 방법에 관한 것으로, 기본적으로 SPE(solid phase extraction) 방법으로 알려져 있는 고체상 추출법을 사용한다. 고체상 추출법을 사용할 경우 타겟 물질(본 발명에서는 갈락토올리고당)을 분리할 수 있는 카트리지를 사용한다. 고체상 추출법(SPE)에서 타겟물질과 오염물질(비목적물질)의 분리는 극성차에 의해 수행될 수 있는데, 경우에 따라, 분자량 또는 이온 결합력에 의해 분리될 수 있다. 상기와 같은 분리 원리의 선택에 따라 적절한 카트리지가 선택될 수 있다. 일 예로, 극성차를 이용할 경우, 타겟물질이 비극성이면 카트리지를 비극성 물질로 채워 타겟물질이 카트리지에 일단 결합되게 하고, 이후 카트리지보다 더 강한 비극성도를 갖는 용매를 흘러주어 타겟물질을 용출시켜 분리하는 것이다. 다만, 이상과 같은 분리 원리 및 분리 방법은 SPE를 포함하는 크로마토그래피 적용 기술분야에서는 주지 및 공지된 사실이므로 이에 대한 구체적 설명은 생략하기로 한다.
본 발명의 제4형태인 갈락토올리고당의 정제방법에 있어서, 상기 메탄올수용액은, 일 예로 15%(v/v) 메탄올 수용액일 수 있다. 15%(v/v) 메탄올 수용액을 사용하여 용출시킬 경우, 트리-갈락토올리고당(tri-galactooligosaccharide)을 순수하게 분리할 수 있다.
본 발명의 제4형태인 갈락토올리고당의 정제방법에 있어서, 상기 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)은 일 예로 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) RD 47일 수 있다.
본 발명에 의할 경우, 비피도박테리움 롱검으로부터 갈락토시다아제를 대량으로 생산할 수 있고, 프리바이오틱스로 사용될 수 있는 갈락토올리고당을 대량 제조할 수 있다.
도 1은 여러 균주를 대상으로 하여 갈락토올리고당 합성능을 비교한 실험결과이다. 1번: Lactobacillus bulgaricus KCTC 3128, 2번: Lactobacillus bulgaricus KCTC 3118, 3번이 Bifidobacteriumlongum RD 47, 4번 Bifidobacterium longum subspp . infantis , 5번 Bifidobacterium bifidum, 6번 Lactobacillus bulgaricus KCTC 3128.
도 2는 배지에 첨가되는 탄소원의 종류에 따른 균주 내 갈락토시다아제의 활성을 보여주는 결과이다.
도 3은 배지에 첨가되는 탄소원의 종류에 따른 갈락토올리고당의 생성량 및 생성 패턴을 보여주는 결과이다.
도 4는 효소 및 기질 농도를 달리하여 호모-GOS의 합성량을 비교한 실험결과이다. 1번 갈락토오즈 + 락토오즈 ; 2번~6번 효소 : 갈락토오즈 = 1:1,2,3,4,6 ; 7번~11번 효소 : 갈락토오즈 =2:1,3,4,6,8 ; 12번~15번 효소 : 갈락토오즈 =4:3,4,6,8 ; 16번~21번 효소: 갈락토오즈 = 8:1:2:3:4:6:8.
도 5는 염과 갈락토오즈가 제거되고 순수한 올리고당 혼합물이 수득됨을 보여주는 TLC 사진 결과이다.
도 6은 15%(v/v) 메탄올수용액을 추출용매로 사용하였을 때, 트리-갈락토올리고당만이 순수하게 분리됨을 보여주는 TLC 사진 결과이다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 실시예 1: 갈락토올리고당 ( GOS , galactooligosaccharide ) 합성능력이 우수한 균주 선정]
1) 대상 균주 선정
건강한 한국인의 장내에서 분리한 유산균 락토바실러스(Lactobacillus), 비피도박테리움(Bifidobaterium spp.)을 대상으로 스크리닝을 통해 합성능력이 우수한 균주를 선별하고자 하였다.
2) 균주 배양법
MRS 액체배지에 L-시스테인(cysteine) 0.05%(w/v)를 넣어, 121℃에서 15분간 고온가압멸균을 시킨 다음, 식히고 배지에 1%(v/v)의 양만큼 균을 접종하여, 37℃에서 혐기배양하였다. 15~18시간 동안 배양 후 같은 방식으로 2번 계대하여 활성화시켰다.
3) 조효소 추출액 제조
상기에서 각각 활성화된 균을 13,000 rpm에서 5분간 원심분리를 한 뒤, 배양액을 회수하고, 셀-다운(cell-down)된 균체는 멸균한 포스페이트 버퍼(phosphate Buffer, pH 6.6)로 풀어주는 작업을 2회 하여, 균체의 당성분을 모두 씻어주었다. 이후, 균체를 소니케이터(sonicator)로 앰플리튜드(amplitude) 30%, 1 sec pulse on-1 sec pulse off를 하여 10분간 깨어준 뒤, 13,000 rpm에서 10 분간 원심분리를 하여 세포 내액과 균벽을 분리하여 각 균주의 배양액, 균체 세포벽, 균체 내액 샘플을 각각 제조하였다.
4) 효소 활성 테스트
당 분해 및 올리고당 합성 능력을 확인하기 보기 위해 효소액으로 상기에서 추출한 각 샘플(각 균주의 배양액, 균체 세포벽, 균체 내액)과 0.22 um로 여과한 갈락토오즈 용액을 혼합하여 37℃에서 배양(shake incubation)을 한 뒤, 시간대별(6, 12, 24, 36, 48 hr) 분획물을 만들고, 100℃의 끓인 물에서 5분간 넣어 반응을 정지시켰다. 이후, TLC로 정성 분석하였다.
그 결과, 여러 균주의 샘플 중 RD 47 (Bifidobacterium longum spp.) 균주의 세포 내액이 같은 조건 하의 다른 유산균들에 비해, 갈락토시다아제의 활성이 높고, GOS(galactooligosaccharide) 합성능력이 가장 우수한 것으로 나타났다. 도 1은 여러 균주를 대상으로 하여 갈락토올리고당 합성능을 비교한 실험결과이다. 1번: Lactobacillus bulgaricus KCTC 3128, 2번: Lactobacillus bulgaricus KCTC 3118, 3번이 Bifidobacteriumlongum RD 47, 4번 Bifidobacterium longum subspp . infantis, 5번 Bifidobacterium bifidum, 6번 Lactobacillus bulgaricus KCTC 3128.
이에 이 균주를 2013년 10월 18일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하였고, 기탁번호 KCCM11461P를 부여받았다.
[ 실시예 2: 배지 첨가 탄소원의 종류에 따른 GOS 합성 조건 최적화]
본 실시예에서는 배지에 첨가되는 탄소원의 종류에 따른 효소 활성을 비교하고자 하였다. 즉, 균주로 상기에서 선별한 RD 47를 선택하고, 배지에 첨가되는 탄소원의 종류에 따른 균체 내액(조효소 추출액)의 효소 활성을 비교하였다.
실험을 위해, 기존 비피더스 배양 배지였던 MRS의 조성에서 당을 뺀 조성을 기본으로 하여 여기에 다양한 탄소원을 첨가하여 실험을 위한 배지를 조성하였다. 본 발명에서 실험을 위해 변형된 MRS 배지{기존 MRS (difco) 배지에서 탄소원에 해당하는 덱스트란(배지의 2%를 구성)을 제외한 나머지 성분}의 구성표는 아래 표 1(1L 기준)과 같았다.
Proteose peptone NO.3 10g
Beef extract 10g
Yeast extract 5g
Sodium acetate 5g
Tween 80 1g
Dipotassium phosphate 2g
Ammonium citrate 2g
Magnesium sulfate 0.1g
Manganese sulfate 0.05g
L-cysteine 0.5g
탄소원이 제거된 위 구성에 첨가되는 탄소원의 종류는 아래와 같이 하였다. 2% 글루코오즈(glucose), 2% 말토오즈(maltose), 2% 락토오즈(lactose), 2% 갈락토오즈(galactose), 2% 라피노오즈(raffinose), 1% 라피노오즈+1% 락토오즈 [ R+L], 1% 라피노오즈 + 1% 갈락토오즈 [R+G]. 이때, '%'는 '%(w/v)'이다.
실험결과는 도 2와 같이 나타났다. 탄소원으로 2% 라피노오즈를 첨가한 배지, 1% 라피노오즈+1% 락토오즈 [R+L] 배지, 1% 라피노오즈 + 1% 갈락토오즈 [R+G] 배지가 균체 내 알파- 및 베타-갈락토시다아제의 활성이 높게 나타났다.
또한, 도 3에서 보듯이, 갈락토올리고당의 생산에 있어서도, 라피노오즈, 라피노오즈+락토오즈, 라피노오즈+갈락토오즈 첨가 배지에서 다른 배지에 비해 상대적으로 균체 내 알파- 및 베타-갈락토시다아제의 활성이 높게 나타남을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 3: 호모- GOS 합성 조건의 최적화]
본 실시예에서는 효소와 기질의 첨가 비율에 따른 합성 조건 최적화를 이루고자 하였다. 본 실시예에서 사용된 조효소 추출액은 상기 실시예 1에서 수득한 RD 47 균주(배지 내 탄소원은 라피노오즈를 사용함)의 세포 내액이다.
실험결과, 효소 및 기질 농도에 따른 여러 반응 조건 중 아래의 반응 조건에서 호모-GOS의 합성량이 가장 많음을 확인할 수 있었다. 도 4는 효소 및 기질 농도에 따른 호모-GOS의 합성량을 비교한 실험결과이다. 도 4에서, 1번 갈락토오즈 + 락토오즈 ; 2번~6번 효소 : 갈락토오즈 = 1:1,2,3,4,6 ; 7번~11번 효소 : 갈락토오즈 =2:1,3,4,6,8 ; 12번~15번 효소 : 갈락토오즈 =4:3,4,6,8 ; 16번~21번 효소: 갈락토오즈 = 8:1:2:3:4:6:8.
조건 내용
pH phosphate buffer (pH6.7)
온도 (℃) 37
효소: 기질 비율 효소 : 70%(w/v) galactose = 2:1
시간 18hr
[ 실시예 4: 호모- GOS 의 분리 정제]
본 실시예에서는 SPE(Solid Phase Extraction)을 통해 간단하고 빠르게 갈락토올리고당 분리하고자 하였다.
카트리지로 'graphitized non-porous carbon SPE(ENVI-Carb, supleco)'을 선정하고, 본격적인 실험 전에 카트리지 2배 부피의 100% 메탄올을 흘려 활성화시켰다. 이후, 상기 실시예 3에서 수득된 샘플을 로딩한 후, 정제수로 씻어내려 오염(비목적) 물질을 제거한 다음 메탄올로 농도 구배를 주어 원하는 목적 물질을 분리하기 위해 각각의 농도에 따른 분획을 받았다. 분획은 TLC로 분석하였다.
실험결과, 1ml 샘플을 로딩한 다음, 정제수 4ml 내리면 염(salt)과 갈락토오즈 제거되고, 순수한 올리고당 혼합물 (mixture)이 얻어짐을 확인할 수 있었다. 도 5는 염과 갈락토오즈가 제거되고 순수한 올리고당 혼합물이 수득됨을 보여주는 TLC 사진 결과이다.
한편, 카트리지에 결합된 갈락토올리고당을 용출하기 위해 용출용매로 15%(v/v) 메탄올수용액을 내리면 트리-갈락토올리고당만이 순수하게 분리됨을 확인할 수 있었다. 도 6은 15%(v/v) 메탄올수용액을 추출용매로 사용하였을 때, 트리-갈락토올리고당만이 순수하게 분리됨을 보여주는 TLC 사진 결과이다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11461P 20131018

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  6. 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) RD 47 (KCCM 11461P) 유래의 갈락토시다아제를 사용하거나, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) RD 47 (KCCM 11461P) 균체 내액을 조효소액으로 사용하여, 기질인 갈락토오즈와 반응시키는 것을 특징으로 하는 호모(homo) 갈락토올리고당의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 갈락토시다아제와 갈락토오즈의 첨가비율은,
    2:1이고, 이때 갈락토오즈는 70%(w/v) 갈락토오즈 수용액인 것을 특징으로 하는 호모(homo) 갈락토올리고당의 제조방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol.58, pp.439-445(2002.)
Enzyme Microb. Technol., Vol.23, pp.101-106(1998.)
J. Agric. Food Chem., Vol.55, pp.2225-2230(2007.)*
한유리, 서울대학교 대학원, 식품영양학과, 석사학위논문(2013.02.)*

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