JP2010159225A - テアンデロース含有シロップ - Google Patents
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Abstract
【課題】
フラクトオリゴ糖生産菌であるオーレオバシジウムsp.ATCC20524株を含む培地で培養すると、α−グルコシルトランスフェラーゼとβ−フラクトシルトランスフェラーゼ両方の酵素を含む粗酵素が生産される。生産される素酵素中のβ−フラクトシルトランスフェラーゼ活性が高いため、テアンデロースの収率が著しく低下し、テアンデロースの工業的生産に用いることができない。
【解決手段】
オーレオバシジウムsp.ATCC20524株を培養して得られたα−グルコシルトランスフェラーゼとβ−フラクトシルトランスフェラーゼ両方の酵素を含む粗酵素を加熱処理することで、該粗酵素の中のβ−フラノシダーゼ活性を著しく抑制せしめた後、該加熱処理酵素溶液を、しょ糖とマルトース両方を含む基質と反応させテアンデロースを多く生成せしめる。
【選択図】なし
フラクトオリゴ糖生産菌であるオーレオバシジウムsp.ATCC20524株を含む培地で培養すると、α−グルコシルトランスフェラーゼとβ−フラクトシルトランスフェラーゼ両方の酵素を含む粗酵素が生産される。生産される素酵素中のβ−フラクトシルトランスフェラーゼ活性が高いため、テアンデロースの収率が著しく低下し、テアンデロースの工業的生産に用いることができない。
【解決手段】
オーレオバシジウムsp.ATCC20524株を培養して得られたα−グルコシルトランスフェラーゼとβ−フラクトシルトランスフェラーゼ両方の酵素を含む粗酵素を加熱処理することで、該粗酵素の中のβ−フラノシダーゼ活性を著しく抑制せしめた後、該加熱処理酵素溶液を、しょ糖とマルトース両方を含む基質と反応させテアンデロースを多く生成せしめる。
【選択図】なし
Description
本発明はオーレオバシジウムsp.ATCC20524株、および同株が高生産するα−グルコシルトランスフェラーゼを用いたテアンデロースの製造法に関する。
テアンデロースは、しょ糖のグルコース残基の6位にグルコース基の1位がα−グルコシド結合した三糖類で、少量ながら蜂蜜や甘蔗糖蜜に含まれており、う蝕誘発性を抑える作用、およびビフィズス菌の増殖効果がある有望なオリゴ糖である。
テアンデロースの従来の製造法として、アスペルギルス・アワモリおよびアスペルギルス・フォエニシスの糖転移酵素を用いる方法(特許文献1)、バチルス属のしょ糖転移酵素を用いる方法(特許文献2)、ムコール・ジャパニカスの糖転移酵素を用いる方法(特許文献3)が知られている。
しかしながら、特許文献1、特許文献2、および特許文献3の方法では産業的には生産し得るものの安価に大量生産することはできない。
β−フラクトシルトランスフェラーゼ高生産菌であるオーレオバシジウムsp.ATCC20524株をマルトースあるいはマルトトリオースあるいはマルトテトラオースあるいは可溶性澱粉を含む培地で培養すると、α−グルコシルトランスフェラーゼとβ−フラクトシルトランスフェラーゼ両方の酵素を含む粗酵素が生産される。生産される素酵素中のβ−フラクトシルトランスフェラーゼ活性が高いため、テアンデロースの収率が著しく低下し、テアンデロースの工業的生産に用いることができない。
α−グルコシルトランスフェラーゼとβ−フラクトシルトランスフェラーゼ両方を含む粗酵素をしょ糖とマルトース両方を含む基質と反応させると、粗酵素中のβ−フラクトシルトランスフェラーゼはしょ糖を基質にしてフラクトオリゴ糖を生成し、α−グルコシルトランスフェラーゼがしょ糖とマルトースを基質にしてテアンデロースを生成することを阻害する。
こうした問題を解決し、安価に大量生産できる製造法の開発が望まれている。本発明は微生物が高生産するα−グルコシダーゼを用いるテアンデロースの製造法に関する。
前記課題を解決するため鋭意検討するなかで、オーレオバシジウムsp.ATCC20524株をマルトースあるいはマルトトリオースあるいはマルトテトラオースあるいは可溶性澱粉を含む培地で培養して得られたα−グルコシルトランスフェラーゼとβ−フラクトシルトランスフェラーゼ両方の酵素を含む粗酵素を加熱処理することで、該粗酵素の中のβ−フラノシダーゼは著しく活性が低下し、かつα−グルコシダーゼは活性が低下しないことを見い出した。
加熱処理によりβ−フラクトシルトランスフェラーゼ活性が著しく低下した処理粗酵素溶液を、しょ糖とマルトース両方を含む基質と反応させるとフラクトオリゴ糖の生成が抑えられ、加熱処理をしていないα−グルコシルトランスフェラーゼとβ−フラクトシルトランスフェラーゼ両方の酵素を含む粗酵素溶液をしょ糖とマルトース両方を含む基質と反応させた場合よりもテアンデロースが多く生成された。
本発明の基質溶液は、しょ糖とマルトースの両方を含むものをいい、しょ糖とマルトースを合せた糖質濃度は完全に糖質が溶解する濃度であれば問題なく、10〜70重量%、好ましくは20〜60重量%、さらに好ましくは50重量%前後である。基質溶液におけるしょ糖とマルトースの比は10:1〜1:10の範囲が可能である。基質溶液のpHは3〜7が可能で、4.5〜5.0が好ましい。反応温度は、20〜70℃であれば可能で、50〜65℃が好ましい。
本発明のα−グルコシルトランスフェラーゼとは、マルトースのグルコシド結合が切れて生じるグルコース残基を、しょ糖のグルコース残基の6位の炭素に結合させ、α−グルコシド結合で結合した三糖テアンデロースを生成する作用を有する菌体または菌体抽出物を意味する。菌体とは、培養したオーレオバシジウムsp.ATCC20524株を含む培養液、および培養液からオーレオバシジウムsp.ATCC20524株の菌体を常法により一旦分離した菌体の両方を意味する。菌体抽出物とは、菌体を常法により破壊して得られた上述のグルコシル基転移活性を有する部分精製酵素、さらに必要に応じて公知の方法で精製された上述のグルコシル基転移活性を有する酵素を意味する。
本α−グルコシルトランスフェラーゼは、オーレオバシジウムsp.ATCC20524株を培養することによって得る事ができる。該菌株は独立行政法人産業技術総合研究所?特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1丁目1番1号?中央第6)に受託番号FERM?P−4257として寄託されている。
本発明によれば、オーレオバシジウムsp.ATCC20524株の生産するα−グルコシルトランスフェラーゼをしょ糖とマルトースを含む基質溶液に作用させることにより、う蝕誘発性を抑える作用、およびビフィズス菌の増殖効果のあるテアンデロースを工業的に安価に生産できる。
本発明において使用できる培地としては、次の掲げるものがある。例えば、炭素源としては、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、可溶性澱粉などを、窒素源としては、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウムなどの無機物、およびペプトン、コーンスチープリカー、コーングルテンミールなどの有機物を用いることができる。その他、微量の無機金属類、ビタミン類、成長促成因子を、例えばチアミン、ビオチンを含む粉末酵母などを添加してもよい。これらの培地成分は該菌株の成育を阻害しない濃度であればよく、炭素源は通常0.5〜15.0重量%用いるのが適当である。窒素源は通常0.1〜2.5重量%用いるのが適当である。培地は通常pH5.5〜7.5、好ましくはpH6.5〜7.0に調整し、滅菌して使用する。培養温度の範囲は該菌株が生育し得る温度であればよく、通常20〜30℃が適当である。該菌株を液体培養する場合は、振とう培養または通気攪拌培養するのが好ましい。培養時間は種々の培養条件によって異なるが、振とう培養または通気攪拌培養の場合は、2〜5日間、このましくは2〜3日間が適当である。
オーレオバシジウムsp.ATCC20524株が産生するα−グルコシルトランスフェラーゼは、菌体そのもの、または菌体処理物としてもテアンデロースの製造に使用することができる。
菌体そのものとしては、培養されたオーレオバシジウムsp.ATCC20524株を集菌し蒸留水で洗浄後再び集菌した菌体を使用することができる。菌体処理物としては、細胞壁分解酵素処理して得られる菌体溶解産物を使用することができる。
オーレオバシジウムsp.ATCC20524株において生産されるα−グルコシルトランスフェラーゼの分離は、細胞壁分解酵素で細胞壁を破壊することにより実施できる。その後、適宜ろ過または遠心分離することにより、粗酵素溶液を得ることができる。この粗酵素溶液は必要に応じて限外ろ過による濃縮または硫安塩析法、溶媒沈殿法、透析法などの公知の方法を適用して精製してもよい。
また、当該粗酵素溶液および粗酵素は、イオン交換クロマトグラフィーによる吸着および溶出、分子量の差によるゲル濾過法など一般的酵素精製法を適宜選択、組み合わせて精製することもできる。
本発明のα−グルコシルトランスフェラーゼの活性は、例えば、マルトースを基質とした酵素活性測定によって調べることができる。つまり、マルトースを含有する溶液に、試料を添加し、単位時間当たりに遊離したD−グルコースを量をグルコース定量キット(グルコーステスト和光純薬工業株式会社)により調べることによって決定することができる。本明細中においてα−グルコシルトランスフェラーゼ活性1単位(U)とは、1分間に1マイクロモルのD−グルコースを生成する酵素量と定義した。
本発明を以下に実施例をあげて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
(実施例1)培養
オーレオバシジウムsp.ATCC20524株を100mlのマルトースH培地(マルトース25g、粉末酵母7.5g、硝酸ナトリウム1.0g、リン酸水素二カリウム1.0gを蒸留水に溶解してpH7.0に調整し1Lとする)を含む300ml三角フラスコの中で29℃で2日間振盪培養した。同培養液100mlを20Lの前記マルトースH培地を入れたジャーファーメンターに移植して、29℃で2日間培養した。培養終了後、ろ過により集菌し、蒸留水で洗浄後再び集菌し、湿菌体重量および乾燥菌体重量を計測した。
オーレオバシジウムsp.ATCC20524株を100mlのマルトースH培地(マルトース25g、粉末酵母7.5g、硝酸ナトリウム1.0g、リン酸水素二カリウム1.0gを蒸留水に溶解してpH7.0に調整し1Lとする)を含む300ml三角フラスコの中で29℃で2日間振盪培養した。同培養液100mlを20Lの前記マルトースH培地を入れたジャーファーメンターに移植して、29℃で2日間培養した。培養終了後、ろ過により集菌し、蒸留水で洗浄後再び集菌し、湿菌体重量および乾燥菌体重量を計測した。
(実施例2)α−グルコシダーゼの抽出
0.075MのMcIlvaine緩衝液(pH5.0)100mlにオーレオバシジウムsp.ATCC20524株乾燥菌体5g、およびキタラーゼ(2000U/g和光純薬)20mgを加えて40℃で150分間処理した。処理溶液を遠心分離した。その上精約100mlを氷冷しながら硫酸アンモニウム56.1gを徐々に加えた。遠心分離を行ない沈殿を得た。この沈殿物を0.075MのMcIlvaine緩衝液(pH5.0)50mlに懸濁し、0.075MのMcIlvaine緩衝液(pH5.0)を用いて透析した。
0.075MのMcIlvaine緩衝液(pH5.0)100mlにオーレオバシジウムsp.ATCC20524株乾燥菌体5g、およびキタラーゼ(2000U/g和光純薬)20mgを加えて40℃で150分間処理した。処理溶液を遠心分離した。その上精約100mlを氷冷しながら硫酸アンモニウム56.1gを徐々に加えた。遠心分離を行ない沈殿を得た。この沈殿物を0.075MのMcIlvaine緩衝液(pH5.0)50mlに懸濁し、0.075MのMcIlvaine緩衝液(pH5.0)を用いて透析した。
次に、この粗酵素溶液50mlの体積が10mlに減るまで分画分子量10000の限外ろ過膜で限外ろ過を行なった。10mlの粗酵素溶液に40mlの0.025Mの酢酸緩衝液(pH4.5)を加えて同様に限外ろ過を行なった。この作業を3回繰り返し0.075MのMcIlvaine緩衝液(pH5.0)を25mM酢酸緩衝液(pH4.5)に変換し、粗酵素溶液10mlを得た。これを以下に述べる精製操作に供した。
(実施例3)酵素の精製
実施例2で得られた粗酵素溶液10mlを、SPセファロースファストフローカラム(陰イオン交換カラムGEヘルスケア社)で、25mM酢酸緩衝液(pH4.5)を用いて分画した。α−グルコシダーゼ活性のある画分溶液175mlの体積が10mlになるまで分画分子量10000の限外ろ過膜で限外ろ過を行なった。
実施例2で得られた粗酵素溶液10mlを、SPセファロースファストフローカラム(陰イオン交換カラムGEヘルスケア社)で、25mM酢酸緩衝液(pH4.5)を用いて分画した。α−グルコシダーゼ活性のある画分溶液175mlの体積が10mlになるまで分画分子量10000の限外ろ過膜で限外ろ過を行なった。
(実施例4)テアンデロースの製造
シュクロース15g、マルトース10gを含む0.075MのMcIlvaine緩衝液(pH5.0)50mlにオーレオバシジウムsp.ATCC20524株乾燥菌体1gを加えて、65℃で30分反応させた。反応液を100℃で10分間加熱処理したのち、遠心分離によって上精を得た。得られた反応液上精を下記分析条件で高速液体クロマトグラフィー装置を使って分析した結果、3.43gのテアンデロースの生成が認められた(図1)。
シュクロース15g、マルトース10gを含む0.075MのMcIlvaine緩衝液(pH5.0)50mlにオーレオバシジウムsp.ATCC20524株乾燥菌体1gを加えて、65℃で30分反応させた。反応液を100℃で10分間加熱処理したのち、遠心分離によって上精を得た。得られた反応液上精を下記分析条件で高速液体クロマトグラフィー装置を使って分析した結果、3.43gのテアンデロースの生成が認められた(図1)。
(分析条件)HPLCカラム:東ソー株式会社製?amido−80(4.6×250mm)
溶離液:アセトニトリル:水=70:30、流速?:1.0ml/minカラムオーブン温度?:80℃、検出器:示差屈折計
溶離液:アセトニトリル:水=70:30、流速?:1.0ml/minカラムオーブン温度?:80℃、検出器:示差屈折計
(実施例5)フラクトオリゴ糖の生成抑制
40mlの0.075MのMcIlvaine緩衝液(pH5.0)に3gのオーレオバシジウムsp.ATCC20524株乾燥菌体を懸濁した。懸濁液を2mlずつマイクロチューブに分注して、各温度(45,55,60,65,70,75℃)で10分間インキュベートした。その後、すぐに氷冷した。
40mlの0.075MのMcIlvaine緩衝液(pH5.0)に3gのオーレオバシジウムsp.ATCC20524株乾燥菌体を懸濁した。懸濁液を2mlずつマイクロチューブに分注して、各温度(45,55,60,65,70,75℃)で10分間インキュベートした。その後、すぐに氷冷した。
各温度で処理した菌体懸濁液0.5mlを、しょ糖1.5gおよびマルトース1gを含む0.075MのMcIlvaine緩衝液(pH5.0)4.5mlに加えて65℃で30分間反応させた。反応液を100℃で10分間加熱処理したのち、遠心分離によって上精を得た。得られた反応液上精を高速液体クロマトグラフィー装置を使って分析した(表1)。熱処理により、フラクトオリゴ糖であるケストースの生成が抑えられたことを確認した。
(表1)は温度処理しない場合のテアンデロース生成量を100とした時の、各条件でのテ
アンデロースとケストースの生成量を相対値で示す。
アンデロースとケストースの生成量を相対値で示す。
本発明は、抗う蝕性、ビフィズス因子を持つ甘味料として知られるテアンデロースを安価に効率よく製造するための新規な方法に関するものである。
Claims (4)
- しょ糖とマルトースの含有量10〜70重量%で、それらの比率が10:1〜1:10の溶液の少なくとも一部がα−グルコシルトランスフェラーゼによりテアンデロースに変換されたテアンデロースとフラクトオリゴ糖の比率が15:1から15:30であるテアンデロース含有シロップ。
- オーレオバシジウムsp.ATCC20524株をα−1,4結合よりなるグルコースのオリゴ糖または多糖を含む培地で培養することにより得られるα−グルコシルトランスフェラーゼとβ−フラクトシルトランスフェラーゼとを含む粗酵素を加熱処理し、該粗酵素に含まれるβ−フラクトシルトランスフェラーゼ活性を10〜70重量%、好ましくは20〜60重量%、さらに好ましくは50重量%前後である。基質溶液におけるしょ糖とマルトースの比は10:1〜1:10抑制させることを特徴とするテアンデロース生成酵素の製造法。
- しょ糖とマルトースを含む基質溶液に請求項2のテアンデロース生成酵素を反応せしめることを特徴とするテアンデロース含有シロップの製造法。
- オーレオバシジウムsp.ATCC20524株を培養する培地に含まれるα−1,4結合よりなるグルコースのオリゴ糖または多糖が、マルトテトラオース、あるいはマルトトリオース、あるいはマルトース、あるいは可溶性澱粉を含む培地である請求項1のテアンデロース生成酵素の製造法。
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