JP6279607B2 - 走査型プローブ顕微鏡を制御するための方法及び装置 - Google Patents
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Description
−先端がサンプルに向かって移動する方向に沿った第1の方向(Z軸)に沿った、ナノスキャナーの伸張の監視する工程、及び
−ナノスキャナーの伸長が閾値より大きい又は小さい場合、付加アクチュエーターを用いて、第1の方向に沿ってプローブの高さを調節する工程
−表面のある点における、第2の方向と当該点の垂線との現在の角度を監視する工程、ここでプローブは当該点に向かって第2の方向に沿って移動している
−付加アクチュエーター及び少なくとも第2の付加アクチュエーターを、現在の角度が予め設定された所望の角度に近づくように制御する工程、ここで、特に、所望の角度はゼロである
a)サンプルのフォースカーブを測定する工程、ここでフォースカーブは接近カーブ及び収縮カーブを含む、
b)フォースカーブの最適なベースライン部分を検出する工程、
c)任意に、フォースカーブにおける接触点を検出する工程、
d)最適なベースライン部分と接近カーブ及び/又は収縮カーブとを、特に接触点の近傍にて比較する工程、及び
e)接近カーブ及び/又は収縮カーブと最適なベースライン部分との比較に基づいて、下記のうち1つを調節する工程
・プローブの高さ(垂直方向の位置)
・プローブの平行方向の位置(水平方向の位置) 又は
・角度
−ある点における、方向とサンプル表面の垂線との現在の角度を監視する工程、ここで、プローブは当該方向に沿ってサンプルに向かって移動している
−第1の付加アクチュエーター及び少なくとも第2の付加アクチュエーターを、上記現在の角度が予め設定された所望の角度に接近するように制御する工程、ここで特に所望の角度はゼロである
−当該先端を第1の方向に沿ってサンプルに向かって移動させるように構成されるプローブであって、サンプルと相互作用するための先端を有するプローブ、及び
−サンプル又はプローブを保持するためのナノスキャナー
ここで、走査型プローブ顕微鏡装置は、上述の第1の方向に沿った、ナノスキャナーの伸長を監視する手段と、プローブの高さを第1の方向に沿って調節するアクチュエーターと、アクチュエーターを制御する制御手段と、を含む。ここで、制御手段は、ナノスキャナーの伸長が予め設定可能な閾値より小さい又は大きい場合に、プローブの高さを調節するためにアクチュエーターを制御するように構成される。
図1は、上部降下機構における本発明の実施態様の仕組みを示す。ピエゾ素子1は、カンチレバー2に直接連結される。ピエゾ素子1が第1の方向Rに最大伸長し、かつカンチレバー先端21とサンプル4表面との接触が失われた場合、制御手段31は、外部モーター3(アクチュエーター)を動かし始め、ピエゾ素子1の伸長が所望の伸長となるまで、第1の方向に沿ってカンチレバー先端21を表面へと降下させる。ピエゾ素子1が最大収縮し、かつカンチレバー先端21がサンプル表面4に所望でない力で押し込まれている場合、制御手段31は、外部モーター3を動かし始めてカンチレバー2を第1の方向Rに沿って上昇させ、ピエゾ素子1が所望の伸長となるようにする。
図2は、下部上昇機構における本発明の別の実施態様の仕組みを示す。ここではピエゾ素子は、サンプルホルダー41に直接連結される。そして、カンチレバー2はカンチレバーホルダー25に連結されている。
図3は、第1の方向Rに沿ったピエゾの垂直移動の仕組みを示す。ピエゾ素子1は、最大伸張12及び最大収縮11によって特徴づけられる。これら状態の間に、最適動作範囲13及び非最適動作範囲14に分割することができるピエゾ素子の動作範囲が存在する。第1の閾値15は、最適動作範囲13と非最適動作範囲14との境界の、最大収縮11側に位置している。第2の閾値16は、最適動作範囲13と非最適動作範囲14との境界の、最大伸張12側に位置している。
図4は、本発明の一実施態様における仕組みを示す。この実施態様は、角度調節に関し、カンチレバー2、特にカンチレバー2の先端21の移動方向R2と、サンプル4表面との間の角度αが測定される。
1)線形ベースラインのスコア(点数)
たわみの値は、ばね定数、たわみ易さ、組織の硬さなどの、システムの様々なパラメーターに依存するので、たわみのカーブ全体をその最大値を用いて除算することによって、リスケールすることが重要である。この新しいカーブのノイズは、信号対雑音手段によって最もよく理解することができる。
全体のスコアは、各スコアを合わせたものであり、以下の式によって得られる。
1)に述べた方法が、非線形の、実際のベースラインのスコア付けに使用される。このベースラインは、その全体を直線にフィットさせることもできる(全体のスコアが得られる)し、任意の数nの断片に分割することもできる(n個のサブスコアが得られる)。これらのサブスコアは、例えば平均をとることで、全体のスコアに使用することができる。
1.フォースカーブを、その最大値を目標値(setpoint)に合わせることによって、Y軸上でシフトさせる。
2.非接触領域のみを保有するために、シフトされたフォースカーブから、目標値に対する百分率分の末端が切取られる(たわみ切取りと称する)[例えば、10%]。
3.さらに、たわみが小さい接触領域部分を除いて非接触領域のみを保有するために、上記保有されたデータの末端から、全セットの百分率[例えば、10%]分が切取られる(ピエゾ切取りと称する)。この時点で保有されたデータセットを、非接触領域と想定する。
4.この保有されたデータセットは、同じ長さの断片又は様々な長さの断片を用いて分析することができる。
5.同じ長さ[例えば、保有されたデータセットの20%]の断片の場合、上記想定非接触領域の各点が、ベースラインのスコア付けに従って上述のように分析された所与の数の点を有する1断片にアタッチ(結合)される。全体に対するスコアは、全断片に対するスコアとなり、最良の断片は、最も低いスコアを有するものである。
6.様々な長さの断片の場合、始まりの断片長(例えば0.1)、断片乗数(例えば2)及び最大の断片長(例えば0.6)が定義される。工程5は、始まりの断片長から開始され、そして上記最大断片長が次の断片の長さより小さくなるまで、次の断片=前の断片*断片乗数(NewSegment=OldSegment*SegmentMultiplier)が繰り返される。すべての断片のうち、最良の断片は最も低いスコアを有するものである。より大きな断片がより高いMSEを持つ傾向にあるので、より大きな断片のスコアに因数k<1を掛ける。ここで、kは、断片長を2倍にするとMSEが20%高くなるように算出することができる。全体のスコアは、最良の断片長を有するすべてのセグメントのスコアの平均である。
7.最良の断片の左側部分の値が切り取られて、直線に近似される。結果として生じた切片は、データセットから除かれる。その結果、ベースラインはたわみゼロの位置に置かれる。希望とあれば、傾きを全データセットから除去(傾き補正)してもよい。
概要は、吸着部分及び鋸歯状に乱れた部分の無視、及び、ベースラインにおけるたわみと、初めの接触から遠く離れ、かつ大きなたわみを有する接触領域のいくつかの点と、を用いたカーブの再構築である。物理的背景(例えばヘルツ押し込み)又はエンピリカルな(つまり実績・経験に基づく)係数を用いたべき関数の使用によって、接触領域は近似され再構築される。図11はその一般概念を示す。
1.ベースラインの解析及び切取りが、他の手段(例えばベースラインスコア付け)によって行われる。そして、全てのデータセットがシフトされ、たわみゼロの位置に置かれる。
2.最大たわみ値に対する百分率(例えば50%)及び大きなたわみを有する点が、カーブ全体を再構築するためのデータセットとして使用される。
3.上述の残されたデータが、予め設定されたアルファ値を用いてべき関数に当てはめられ、再構築されたカーブ(モデルフィッティング、発明の詳細な説明を参照)が得られる。アルファは1.5又は2(ヘルツによって提案されたように)のどちらにも設定することができる。又は、アルファは材料パラメーター(エンピリカルな一覧表に基づく)とすることもできる。
4.モデルフィッティングによって、最大たわみ時の弾性係数、押し込み及び傾きを計算することができる。
カンチレバーの相異なる部分でサンプルの押し込みをしている間に記録されたフォースカーブは、図15(中央のパネル、下段のパネル)に示されるように、最終的な結果を実質的に偏らせる可能性がある。接近カーブ及び収縮カーブは、互いに反対で、かつ実際の接触領域から大きく外れて増加するたわみ値を表している。これは次のアプローチを組み合わせることにより検知される:
a.フォースカーブ再構築アプローチによって算出された接触点と、0未満のたわみ値を有する最初の点(右手側から探す)とが比較される。乱れのないカーブのセットにおいては、これら2点は互いに近くにあるべきである。
b.接近カーブ及び収縮カーブは共に、ゆっくりとしたたわみの増加を示し(カンチレバーの接触によって乱される)、その結果として接触領域は通常よりも大きくなり、結果として生じるたわみの偏位は反対方向になる。これは、接近カーブと、収縮カーブの負の部分との比較によって認識される。
c.接近及び収縮カーブの間の領域が、ベースラインの変化のない部分(図13、枠で囲った領域)において測定された値よりも大きい時、特に、最適なベースライン部分は変化のないベースラインの断片(最良部分)である可能性がある。
d.カンチレバーの接触(たわみのゆっくりとした増加)と実際の先端接触(急激な増加をともなう乱れのないフォースカーブ)との間に転換点があるので、カーブの第1番目の導関数と第2番目の導関数とは、不連続となる。
1.フォースカーブの最適なベースライン部分の検出(上記参照);
2.フォースカーブの接触点の検出(上記参照);
3.分離が接触点近くのベースライン断片内にある場合、カンチレバーの先端以外の部分による押し込みがあると検出される。分離が見られる断片における接近フォースカーブが線形挙動を示す場合、カンチレバー背部による押し込みがある。分離が見られる断片における接近フォースカーブが線形挙動を示さない場合、カンチレバー前部による押し込みがある。
4.カンチレバー前部による押し込みがあると検出された場合、カンチレバーは引き戻され、かつカンチレバーの軸(サンプル表面と平行)に沿って前方に移動されて、その状態で押し込みサイクルが行われる。この工程は、フォースカーブがカンチレバーの前部による押し込みに特異的な特徴を示さなくなるまで、繰り返される。
5.カンチレバー背部による押し込みがあると検出された場合、カンチレバーは引き戻され、かつカンチレバー軸に沿って後方に移動されて、この状態で押し込みサイクルが行われる。この工程は、フォースカーブがカンチレバー背部による押し込みに特異的な特徴を示さなくなるまで、繰り返される。
最適でない押し込みサイクルは、最終結果に影響を及ぼす。多くの場合粗面を有する生物学的なサンプルの場合、このことが実質的に問題となる。図15は、先端の接近が非最適である場合のフォースカーブの例を示す。
1.フォースカーブの最適なベースライン部分の検出(上記参照)。
2.フォースカーブの接触点の検出(上記参照)。
3.フォースカーブの分析。このフォース−ディスタンスカーブは、当該カーブの様々な量が各セグメントによって包含されるよう、フォースカーブの接触点(図5のx0、y0)から始まる複数の断片に分割される。これら断片は、標準的な単一材料のたわみという仮定の下でフィッティングされる。段階間の転換点においては(図5のx1、y1)、RMSEは増加し、もはや単一材料という仮定が妥当とはいえなくなる。従って、新しい段階の始まりは、x0からx1及びx1からxnの間に位置する各断片のRMSEの比較によって認知される。第2の段階に対しても、転換点x1(新しい材料の始点)を新しい接触点として使用して、同じアルゴリズムが適用される。xnに到達するまで、このサイクルが繰り返される(図5)。
4.フォトダイオードからの垂直及び水平の信号が記録される。
5.フォースカーブの接近及び/又は収縮部分に、2つ、3つ又はそれより多い、区別可能な段階がある場合は(例えば、図5に示されるフォースカーブにおいて、青色で示される接近たわみの断片には2つの段階がある)、先端による押し込みが最適でないと認定され、フォトダイオードの水平セグメントからのシグナルに基づいて角度が修正され、特徴的な性質がなくなるまで調節工程が繰り返される。
押し込みサイクルは、サイクルの終わりに先端がサンプルとの接触から離れることができるような十分な長さを有する必要がある(例えば、収縮フォースカーブは、変化のないベースライン部分で終了すべきである)。そうでなければ、次の押し込みサイクルはサンプルと先端とが接触した状態で始まってしまう。図12はベースラインの検出及びリアルタイムの押し込みサイクル最適化を示す。
1.フォースカーブを、サブスコアのためのベースライン検出アルゴリズムを用いて解析する(上記参照)。
2.そのサブスコアに基づいて、変化のない領域の範囲が検出される(図13における赤い長方形)。
3.第1番目の/始めのベースライン断片が、変化のない(例えば、吸着がなく水平)ものであるとスコア付けされ、ベースライン断片が500nmより大きく、かつ直前3回以内の押し込みサイクルにおいて距離に900nmまでの減少傾向がない場合、カンチレバーは調節されない。
4.第1番目の/始めのベースライン断片が変化のない(例えば、吸着がなく水平)ものであるとスコア付けされ、ベースライン断片が500nmより大きく、かつ直前3回以内の押し込みサイクルにおいて距離に900nmまでの減少傾向がある場合、押し込み距離は、直前3回の押し込みサイクルの減少部分の平均値だけ、増加される。
5.第1番目の/始めのベースライン断片が変化を有する(例えば、吸着を伴い水平でない)ものであるとスコア付けされた場合、又は、500nmより小さい場合、妥当性確認のために、現在の点で押し込みサイクルが繰り返される。確認後、ベースライン断片が変化を有するものであるとスコア付けされた場合は、押し込み距離は500nmまで増加され、一方、確認後のベースライン断片が変化を有さないものであるとスコア付けされた場合には、カンチレバーは調節されない。
6.検出された750nmより大きいベースライン全てについて、第1番目の/始めのベースライン断片が750nmの長さになるよう、押し込みサイクルの距離が減少される。
1 ピエゾ素子
11 最大収縮
12 最大伸長
13 最適動作範囲
14 非最適動作範囲
15 カンチレバー上昇の閾値
16 カンチレバー下降の閾値
2 カンチレバー
21 カンチレバー先端
22 レーザー
23 鏡
24 フォトダイオード
25 カンチレバーホルダー
3 モーター
31 制御部
32 第2のモーター(第2の付加アクチュエーター)
33 第3のモーター(第3の付加アクチュエーター)
34 アクチュエーター制御部
4 サンプル
41 サンプルホルダー
51 第2の方向に沿った軸
52 垂線に沿った軸
53 サンプル表面の点(51及び53の交点)
R 第1の方向
R2 第2の方向
N 垂線
α 51と53との間の角度
Claims (11)
- サンプル(4)と相互作用するための先端(21)を有するプローブ(2)と、前記サンプル(4)又は前記プローブ(2)を保持するためのナノスキャナー(1)と、を含む走査型プローブ顕微鏡を制御する方法であって、
前記先端(21)が前記サンプル(4)に向かって移動する方向に沿った第1の方向(R)に沿った、前記ナノスキャナー(1)の伸張を監視する工程、及び、
前記ナノスキャナー(1)の伸長が最大収縮側の第1の閾値より小さい場合又は最大伸長側の第2の閾値より大きい場合、付加アクチュエーター(3)を用いて、前記第1の方向(R)に沿って前記プローブ(2)の高さを調節する工程
を含み、更に下記工程を含む、方法。
a)前記サンプルの、接近カーブ及び収縮カーブを含むフォースカーブを測定する工程、
b)前記フォースカーブの最適なベースライン部分を検出する工程、
d)前記最適なベースライン部分と前記接近カーブ及び/又は前記収縮カーブとを、比較する工程、及び
e)前記工程d)の比較に基づいて、下記のうち1つを調節する工程
・前記プローブの前記高さ、
・前記プローブの水平方向の位置、又は
・角度(α)
ここで、前記角度(α)は、表面の点(53)において、第2の方向(R2)と前記サンプル(4)の表面の垂線(N)との間の角度として監視され、前記付加アクチュエーター(3)及び少なくとも第2の付加アクチュエーター(32)を、前記角度(α)を予め設定された望ましい角度に近づけるよう制御し、ここで、前記監視において、前記プローブ(2)は前記第2の方向(R2)に沿って前記点(53)に向かって移動しており、前記望ましい角度は特に、ゼロである。 - 前記方法が、さらにc)前記フォースカーブの接触点を検出する工程を含み、かつ、前記工程c)が前記工程b)および前記工程d)の間に含まれる、請求項1に記載の方法。
- 前記工程d)が、d)前記最適なベースライン部分と前記接近カーブ及び/又は前記収縮カーブとを、前記接触点の近傍において比較する工程である、請求項2に記載の方法。
- 前記ナノスキャナー(1)はピエゾ素子である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プローブ(2)はカンチレバーである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プローブ(2)の高さの調節は、前記プローブ(2)を下降させる若しくは上昇させること、又は前記サンプル(4)を下降させる若しくは上昇させることによって行われる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記高さは、前記ナノスキャナー(1)がその最大伸張の20%以下の伸張又は80%以上の伸張を示した時に調節される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記高さは、前記ナノスキャナー(1)の最大伸張の10%から30%まで、前記プローブ(2)又は前記サンプル(4)を下降させる又は上昇させることで調節される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ナノスキャナー(1)が、
前記ナノスキャナーの最大伸張より50nm、100nm、200nm、500nm、1μm又は2μmより小さい、又は、
前記ナノスキャナーの最大収縮より50nm、100nm、200nm、500nm、1μm又は2μmより大きい
伸張を示した時は、必ず前記高さが調節される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。 - 前記プローブ(2)又は前記サンプル(4)を50nmから3μmの範囲の距離で下降させる又は上昇させることによって、前記高さを調節する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記付加アクチュエーター(3)、前記第2の付加アクチュエーター(32)、及び第3の付加アクチュエーター(33)を制御することで、前記現在の角度(α)を予め設定された望ましい角度に近づける、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
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