JP6170908B2

JP6170908B2 - 新規アプリシアトキシン誘導体及びそれを含有する抗がん剤

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Publication number: JP6170908B2
Application number: JP2014511223A
Authority: JP
Inventors: 一浩入江; 将之菊森; 弘明蒲池; 亮柳田; 優中川
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Filing date: 2013-04-16
Publication date: 2017-07-26
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Description

本発明は、発がんプロモーターとして知られる海洋生物由来のアプリシアトキシンの骨格構造を利用した単純化アナログから開発され、プロテインキナーゼＣアイソザイム活性化能とヒトがん細胞増殖抑制活性を有しつつ、発がん促進作用を持たない、新規アプリシアトキシン誘導体に関するものである。

プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は、細胞内伝達物質の鍵酵素であり、発がん、アルツハイマー病、エイズ等の難治性疾患の治療薬の標的酵素として注目されている。同時に、ホルボールエステルなどの発がん促進物質（発がんプロモーター）の主要なターゲットでもある。

発がんプロモーターは、発がん物質（イニシエーター）により遺伝子レベルで障害を受けた潜在的腫瘍細胞をクローナルに増殖させ、最終的にがん細胞へと誘導する（発がん促進作用を有する）化学物質の総称である。天然に存在する発がんプロモーターとしては、トウダイグサ科の植物由来のＴＰＡ（12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate）に代表されるホルボールエステル類、インゲノール−３−ベンゾエート（ingenol 3-benzoate）に代表されるインゲノールエステル類、放線菌由来のテレオシジンＢ−４（teleocidine B-4）に代表されるテレオシジン類、海洋生物であるアメフラシの消化管から単離されたアプリシアトキシン（aplysiatoxin，以下「ＡＴＸ」）とその脱臭素体であるデブロモアプリシアトキシン（debromo-ATX，以下「ＤＡＴ」）等が知られている。発がんプロモーターは、ＰＫＣのＣ１ドメインにナノモルオーダーで結合することによって強力に活性化することが知られており、ＰＫＣの異常活性化は発がんプロモーションと密接に関係している。

一方、ブリオスタチン（Bryostatin，以下「Ｂｒｙｏ」）類は、複雑な２０員環ラクトン構造を有する天然物群であり、現在までに２０種類が発見され、そのうちＢｒｙｏ−１〜１８，２０の合計１９種類が同定されており、その中でも１９８２年にＰｅｔｔｉｔらによってフサコケムシ（bugula neritina）から単離・構造決定されたＢｒｙｏ−１は、発がん促進活性を持たないＰＫＣ活性化剤であることから、抗がん剤としてｐｈａｓｅＩＩの臨床試験が米国で行われている。現在のところ、発がんプロモーション活性が低いＰＫＣリガンドとして天然物由来のものは、Ｂｒｙｏ類のみが知られている。しかしながら、Ｂｒｙｏ類は、天然からの単離収率が１０^−４〜１０^−７％と極めて低く、フサコケムシの大量養殖が試みられているものの未だ実用化には至っていない。また、Ｂｒｙｏ−１の生合成遺伝子の単離も試みられているが成功例は報告されていない。さらに、Ｂｒｙｏ−１は上述のように複雑な構造を有しており、全合成に４０段階程度と多段階を要し、しかも高度な技術を要する合成段階が多いことからも、その作用機構の解析や抗がん剤としての構造最適化の研究はあまり進んでいない。

本発明者らは、Ｂｒｙｏ−１よりも構造がシンプルなＰＫＣリガンドであるＡＴＸの骨格を利用して、合成が容易であり大量供給が可能なＢｒｙｏ−１の代替化合物を開発する試みを行ってきている。開発に際して指標としたのは、がん細胞のアポトーシスに関わるＰＫＣアイソザイムの一種であるＰＫＣδの２つのＣ１ドメイン（Ｃ１Ａ，Ｃ１Ｂ）に対する結合選択性である。これまで本発明者らは、Ｂｒｙｏ−１がＰＫＣδのＣ１Ａ及びＣ１Ｂの両方に結合するのに対して、ＴＰＡに代表される発がんプロモーターは、Ｃ１Ｂに選択的に結合することを見出してきた（非特許文献１参照）。そこで、ＰＫＣδのＣ１ドメイン選択性を指標とした天然発がんプロモーターのスクリーニングを行ったところ、ＡＴＸが、Ｂｒｙｏ−１と同様にＣ１Ａドメインに比較的強く結合することを明らかにしてきている。

一般に、ＴＰＡのような分子疎水性の高いＰＫＣリガンド（ＣｌｏｇＰ：６以上）は、強力な発がんプロモーター活性を示す。一方、Ｂｒｙｏ−１の分子疎水性度は、発がんプロモーターと比べて低い（ＣｌｏｇＰ：２．４）値を示し、ＡＴＸも天然発がんプロモーターの中で比較的分子疎水性度が低く（ＣｌｏｇＰ：４．２）、且つマクロラクトン構造を有する点でＢｒｙｏ−１に類似している。また、ＡＴＸの脱臭素体であるＤＡＴ（ＣｌｏｇＰ：３．０）は、ＡＴＸと同等のＰＫＣ結合能を示す一方、発がん促進活性がＡＴＸよりも明らかに低いことが分かっている（非特許文献２，３参照）。これらの知見から、分子疎水性度の低いＡＴＸアナログが、Ｂｒｙｏ−１特有の生理活性を示すＰＫＣリガンドとなる可能性が高いと考えられた。

Ｎａｋａｇａｗａ，Ｙ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００９，１３１，ｐ．７５７３−７５７９Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８３，２２２，ｐ．１２４２−１２４４Ｓｕｇａｎｕｍａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１９８４，５，ｐ．３１５−３１８

また本発明者らは、前掲非特許文献１において、ＡＴＸの単純化アナログである化合物Ａｐｌｏｇ−１を始めとする数種の誘導体を合成し、このＡｐｌｏｇ−１等のＡＴＸ誘導体が弱いヒトがん細胞増殖抑制活性を示すことを報告している。しかしながら、これまでに得られたＡｐｌｏｇ−１等のＡＴＸ誘導体は、ＰＫＣアイソザイム、特に発がんの抑制に関わるＰＫＣδに対する結合能（結合阻害定数Ｋ_ｉ）が７〜１０ｎＭ程度と低く、ヒトがん細胞増殖抑制活性もＢｒｙｏ−１と同程度であって、さほど高いといえるものではなかった。ＡＴＸをリード化合物として、抗がん剤を開発するうえで問題となるのは、ＰＫＣδへの結合活性を高く維持したまま、如何にして発がんプロモーション活性を消失させるかということであるが、ＡＴＸの発がんプロモーション作用が、ＡＴＸの構造のどの部分に起因しているのかは不明であった。

そこで本発明者らは、ＡＴＸの単純化アナログの新規創出を鋭意進め、ＰＫＣδに対する結合能やヒトがん細胞増殖抑制活性がＢｒｙｏ−１と同等以上に高く、しかもＢｒｙｏ−１よりも合成の容易なＡＴＸの単純化アナログを見出し、ひいては抗がん剤を始めとする医薬の創成に繋げることを目的として、本発明に至ったものである。

すなわち本発明のアプリシアトキシン誘導体は、次の構造式（Ｉ）で示される新規アプリシアトキシン誘導体を基礎としたものである。

ただし、構造式（Ｉ）中、Ｒ^１は、水素原子又は水酸基、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５はそれぞれ独立して水素原子又はメチル基、Ｒ^６は水素原子、ハロゲン原子、アセチルアミノ基、水酸基、又は置換基を有していてもよい炭素数１〜５のアルキル基で、それぞれ表される。Ｒ^６がアルキル基で表される場合、炭素数が６を超えるアルキル基では水溶性が極めて低くなるためあまり有用とはいえず、炭素数は１〜５のアルキル基（メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、２−メチルブチル、１−メチルブチル、ネオペンチル、１，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピルの何れか）であることが望ましい。また、Ｒ^６がアルキル基である場合に適した置換基としては、カルボキシル基又はアミノ基を挙げることができるが、その他、塩を形成できる一般的な置換基とすることも可能である。構造式（Ｉ）の化合物と形成し得る塩としては、酸性基が存在する場合には、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等の金属塩、又はアンモニウム塩、メチルアンモニウム塩、ジメチルアンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩、ジシクロヘキシルアンモニウム塩等のアンモニウム塩を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。塩基性基が存在する場合には、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の鉱酸塩、あるいはメタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、マンデル酸塩、ケイ皮酸塩、乳酸塩等の有機酸塩を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。以下、塩について言及する場合は、上記と同様である。本発明を医薬として用いる場合には、これらのうち薬理学的又は製薬的に許容される塩を用いるのが好適である。本明細書では、構造式（Ｉ）中、側鎖の芳香環部分を除く母核及び側鎖部分を本発明では「１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ」と称することとする。

これらのうち、本発明は構造式（Ｉ）中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５が全て水素原子で表され、Ｒ^６がメタ位の水酸基で表される次の構造式（ＩＩ）で示される新規アプリシアトキシン誘導体又はその医薬上許容される塩である。

構造式（ＩＩ）で示したＡＴＸ誘導体は、前述したＡＴＸ誘導体Ａｐｌｏｇ−１（後述）における１０位のＣにメチル基を導入した構造と同等であるので、以下、本明細書においては「１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１」と称する。

また本発明は、構造式（Ｉ）中、Ｒ^１が水酸基、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４がメチル基、Ｒ^５が水素原子、Ｒ^６がメタ位の水酸基で表される次の構造式（ＩＩＩ）で示される新規アプリシアトキシン誘導体又はその医薬上許容される塩である。

構造式（ＩＩＩ）で示したＡＴＸ誘導体は、前述したＡＴＸ脱臭素体（デブロモアプリシアトキシン，ＤＡＴ）における１５位のＣに結合したメトキシ基を除去した構造と同等であるので、以下、本明細書においては「Ｄｅ−ＯＭｅ−ＤＡＴ」と称する（Ｍｅはメチル基を示す）。

ここで化合物（Ｉ），（ＩＩ），（ＩＩＩ）との比較のために、以下に、ＡＴＸ（ＩＶ）、ＤＡＴ（Ｖ）、Ａｐｌｏｇ−１（ＶＩ）の構造式を示す。

試験の結果、後段で詳述するように、１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１は、ＰＫＣδへの結合能がＡｐｌｏｇ−１よりも約２０倍高く（結合阻害定数Ｋ_ｉ＝０．４ｎＭ）、Ｂｒｙｏ−１と同等であることが分かった。さらに、１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１は、Ｂｒｙｏ−１よりも高いがん細胞増殖抑制活性を有していることが分かった。また、Ｄｅ−ＯＭｅ−ＤＡＴは、ＰＫＣδへの結合能がＤＡＴや１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１と同程度であることも分かった。さらに、予備的な試験では、Ｄｅ−ＯＭｅ−ＤＡＴは、発がん促進活性がＤＡＴよりも顕著に低い一方で、がん細胞増殖抑制活性が顕著に高いことも見出している。さらにまた、これら新規アプリシアトキシン誘導体のうち１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１は、比較的難易度の低い合成反応のみからなる２５段階以下のステップで全合成可能であることから、Ｂｒｙｏ−１よりも全合成による入手が容易であるといえる。

以上の事実とこれまでに合成した各種ＡＴＸ誘導体の生理活性試験の結果から、Ａｐｌｏｇ−１の１０位にメチル基を導入することで、アポトーシスに関与しているＰＫＣδに極めて高い結合能を示し、Ｂｒｙｏ−１よりも顕著に高いがん細胞増殖抑制活性を示す一方で、発がん促進活性を殆ど示さないことを見出した。また、ＡＴＸから臭素原子と１５位のメトキシ基を除去することにより発がん促進活性が顕著に低下する一方で、がん細胞増殖抑制活性が顕著に増大することも見出した。以上のことから、１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１とＤｅ−ＯＭｅ−ＤＡＴ、並びに構造式（Ｉ）で示したＡＴＸ誘導体は、その生理活性から、特に１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１はＢｒｙｏ−１と比較した場合の合成の容易さから、Ｂｒｙｏ−１に代わる新しく優れた抗がん剤シードとなり、また抗がん剤のみならず抗エイズ剤や抗アルツハイマー病薬のシーズとして期待できるものである。

上述した新規ＡＴＸ誘導体（一般式（Ｉ））、１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１（構造式（ＩＩ））、及びＤｅ−ＯＭｅ−ＤＡＴ（構造式（ＩＩＩ））は、ＰＫＣδに対する結合能やヒトがん細胞増殖抑制活性がＢｒｙｏ−１よりも高い一方で、発がんプロモーション活性が極めて低く、しかもＢｒｙｏ−１よりも工程数及び各反応の容易性から全合成の容易な化合物であることから入手が容易である。したがって、Ｂｒｙｏ−１に代わる新しい抗がん剤シードとして十分期待できる程度に有用であり、また抗エイズ剤や抗アルツハイマー病薬のシーズとしても有用なものとなり得る。

以下に、本発明に係る新規ＡＴＸ誘導体の合成例及び生理活性試験例を、他のＡＴＸ誘導体の試験例と比較して示す。

＜１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１の合成例＞
構造式（ＩＩ）で示された１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１の全合成について、下記のスキームを参照して説明する。まず、既知のアルデヒド１に対し、Ｂｒｏｗｎの不斉クロチル化反応を行いホモアリルアルコール２へと誘導した。^１ＨＮＭＲより、ジアステレオ選択性は９０％以上であることを確認した。また、ホモアリルアルコール２の２級水酸基の絶対的立体はモッシャー法により確認し、エナンチオ選択性も９０％以上であることを確認した。続いて、ホモアリルアルコール２の２級水酸基をＢｏｃ化し、Ｓｍｉｔｈらの方法によりヨードカーボネートへと誘導した後、アルカリメタノール分解を行いエポキシド３とした。このエポキシド３について、ＮａＯＭｅ処理によりカーボネートを除去した後、２級水酸基をＭＰＭで保護し、エポキシド４を得た。以上の工程を、次式スキーム１−１として示す。

続いて、エポキシド４とジチアン５のカップリングを行ったところ、反応が効率よく進行しカップリング体６が得られた。次にカップリング体６に対し脱水条件下でＤＤＱ処理し、ベンジリデンアセタールを形成した後、ＴＢＳ基を脱保護し、１級水酸基を酸化してアルデヒド７とした。このアルデヒド７に対し、丸岡の不斉アリル化反応を行った後、ベンジリデンアセタールを酸加水分解し、トリオール８へと誘導した。続いて、ジチアンの加水分解を行い、望むスピロケタール９を単離精製した。スピロケタール９の異性体の生成は極少量であったため、異性体の単離は行っていない。１１位の不斉メチル基がｅｑｕａｔｏｒｉａｌに位置することがスピロケタールの形成に有利であるため、望むスピロケタール９が優先的に生成したと考えられる。なお、スピロケタール９の立体配置についてはＮＯＥにより確認した。以上の工程を、次式スキーム１−２として示す。

スピロケタール９と別途調製したカルボン酸１０（前掲、非特許文献１参照）とのエステル縮合は山口法により効率よく行うことができた。得られたエステル縮合体１１のＭＰＭ基をＴＥＳ基に付け替えた後、オレフィンの酸化開裂を行い、カルボン酸１２を得た。最後に、ＴＥＳ基の脱保護、山口法によるマクロラクトン化、２つのＢｎ基の脱保護を行い、目的とする１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１を得た。以上の工程を、次式スキーム１−３として示す。１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１は、アルデヒド１を出発物質として、リニアで２０段階、０．８５％の収率で得られた。

１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１の化学分析結果は下表１の通りである。

＜Ｄｅ−ＯＭｅ−ＤＡＴの合成例＞
構造式（ＩＩＩ）で示されたＤｅ−ＯＭｅ−ＤＡＴの合成について、下記のスキーム２を参照して説明する。Ｄｅ−ＯＭｅ−ＤＡＴは、全合成には複雑で多数の工程が必要であるため、天然物であるＤＡＴから１ステップで合成した。すなわち、ＤＡＴを酢酸エチルに溶解し、撹拌しつつ水酸化パラジウム−炭素と水素雰囲気下で接触させ、減圧下で濾過し、ＨＰＬＣ（column: AM-323(YMC); solvent: 80% MeCN/H₂0; flow rate 3.0
mL/min; UV detector: 254nm; retention time: 17.1 min）にて分取することで、ＤＡＴから１５位のメトキシ基を除去したＤｅ−ＯＭｅ−ＤＡＴを単離精製した。

Ｄｅ−ＯＭｅ−ＤＡＴの化学分析結果は下表２の通りである。

１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１及びＤｅ−ＯＭｅ−ＤＡＴの生理活性試験との比較のため、前述した化合物Ｂｒｙｏ−１、ＡＴＸ、ＤＡＴ、Ａｐｌｏｇ−１の他、Ａｐｌｏｇ−１の４位のＣに不斉メチル基を導入した次の構造式（ＶＩＩ）で表す化合物４−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１、並びに後述するその他の化合物を利用した。

４−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１は、既知のエポキシド１３と、岸らのＡＴＸの全合成において実績のある不斉メチル基を有する既知のジチアン１４とを用い、詳述しないが次式のスキームの通り１５段階、収率２．４％で得たものである。４−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１は、１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１と不斉メチル基の位置が異なっている。

＜がん細胞増殖抑制活性試験＞
１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１及びＤｅ−ＯＭｅ−ＤＡＴについて、Ｂｒｙｏ−１、ＤＡＴ、Ａｐｌｏｇ−１及び４−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１と比較して、矢守によって確立された３９種類のヒトがん細胞パネルを用いた増殖抑制活性試験（Ｙａｍｏｒｉ，Ｔ．ｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．，１９９９，５９，ｐ．４０４２−４０４９）を行った。下記表３は、そのうち５種類のがん細胞（乳がん細胞２種類、結腸がん細胞１種類、肺がん細胞２種類）に対する結果について抜粋して示したものである。表中、ＧＩ_５０値は、コントロールと比べて細胞増殖を５０％阻害する薬剤の濃度を示している。

上記表３の結果から、ほとんどのがん細胞において、Ａｐｌｏｇ−１と４−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１の増殖抑制活性はほとんど変わらず、Ｂｒｙｏ−１と同程度であったのに対し、１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１はＡｐｌｏｇ−１と比較して、数種のがん細胞に対して１オーダー高い増殖抑制活性を示し、ＤＡＴと同程度若しくはそれ以上であった。４−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１と１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１の分子疎水性度は同等であることから、ＡＴＸの単純化アナログ類のがん細胞増殖抑制活性は、単に分子疎水性度のみに依存するのではないことが明らかとなった。また、１０位の不斉メチル基は、がん細胞増殖抑制活性に重要であることが判明した。さらに、Ｄｅ−ＯＭｅ−ＤＡＴについては、１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１と同程度ないし若干強い増殖抑制活性を示した。

＜発がんプロモーション活性及び抗発がんプロモーション活性試験＞
１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１について、ＴＰＡ、Ｂｒｙｏ−１、ＤＡＴ、Ａｐｌｏｇ−１及び４−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１と比較して、発がんプロモーション活性及び抗発がんプロモーション活性を、ｉｎｖｉｔｒｏ評価系の１つであるＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒｖｉｒｕｓ早期抗原（ＥＢＶ−ＥＡ）誘導試験を行い評価した（ＴＰＡについては発がんプロモーション活性試験のみにおいて比較のために用いた）。下記表４は、発がんプロモーション活性試験の結果を示し、下記表５は抗発がんプロモーション活性試験の結果を示している。

発がんプロモーション活性については、発がんプロモーターであるＴＰＡとＤＡＴは、１００ｎＭ〜１０μＭにおいてＥＡを顕著に誘導するのに対し（２５〜３０％）、Ｂｒｙｏ−１とＡｐｌｏｇ−１はこれらの濃度域においてもＥＡをほとんど誘導しないことが既に明らかになっている。発がんプロモーション活性試験では、４−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１と１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１は、Ｂｒｙｏ−１及びＡｐｌｏｇ−１と同様にＥＡ誘導をほとんど示さなかった。また、抗発がんプロモーション活性については、ＤＡＴはＴＰＡによるＥＡ誘導をほとんど抑制しないのに対し、４−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１と１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１は、ＴＰＡによるＥＡ誘導をＢｒｙｏ−１及びＡｐｌｏｇ−１と同様に顕著に抑制した。これらの結果より、４位と１０位の不斉メチル基は発がんプロモーション活性に関与しない可能性が示唆された。

より強いがん細胞増殖抑制活性を示した１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１について、予備的に１０匹のＩＣＲマウスを用いて皮膚発がん２段階試験を行っている。試験では、ＩＣＲマウスの背中に１００μｇの発がん剤（ＤＭＢＡ）を投与後、週２回、１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１を塗布した。ＴＰＡあるいはＤＡＴを１．７ｎｍｏｌずつ塗布したものでは、顕著に腫瘍が形成された。１００％のマウスに腫瘍を発生させるＴＰＡ量の５倍量である８．５ｎｍｏｌの１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１を塗布したところ、塗布後２０週目においても全く腫瘍を発生させなかった。この結果より、特に１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１は、ＡＴＸの骨格を有しているが発がんプロモーション活性が殆どないことから、抗がん剤として大いに期待できるものであるといえる。

＜ＰＫＣアイソザイム結合選択性試験＞
以上のような生理活性発現機構に関する知見を得るため、１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１及びＤｅ−ＯＭｅ−ＤＡＴについて、ＤＡＴ、Ｂｒｙｏ−１、Ａｐｌｏｇ−１、４−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１を比較対象として、ＰＫＣＣ１ドメインに対する結合能をＰＫＣＣ１ペプチドに対する［^３Ｈ］ｐｈｏｒｂｏｌ１２，１３−ｄｉｂｕｔｙｒａｔｅ（ＰＤＢｕ）結合阻害試験により、結合阻害定数Ｋ_ｉ値を求めることで評価した。ＰＫＣＣ１ペプチドは、ＰＫＣアイソザイムのＣ１ドメインを化学合成し、亜鉛を用いてフォールディングさせたものである。これらのペプチドは全長のＰＫＣと同様の強さで発がんプロモーターと結合することが既に確認されている。Ｋ_ｉ値の算出には、実験により求めた［^３Ｈ］ＰＤＢｕの特異的結合を５０％阻害する濃度（ＩＣ_５０）、並びに進藤らにより報告されている各ＰＫＣＣ１ペプチドに対する［^３Ｈ］ＰＤＢｕの解離定数（Ｋ_ｄ）を用いた（Ｓｈｉｎｄｏ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００１，９，ｐ．２０７３−２０８１）。試験結果を下記表６に示す。

ＰＫＣアイソザイム結合選択性試験の結果、発がんプロモーターであるＰＤＢｕ及びＤＡＴは、ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌＰＫＣ（ｃＰＫＣ）アイソザイム（α，β，γ）及びｎｏｖｅｌＰＫＣ（ｎＰＫＣ）アイソザイム（δ，ε，η，θ）の両方に同程度の強さで結合した。それに対して、１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１とＤｅ−ＯＭｅ−ＤＡＴは、Ｂｒｙｏ−１とＡｐｌｏｇ−１と同様に、ｎＰＫＣアイソザイムに対する結合選択性を示し、それらの結合能は、全てのＰＫＣアイソザイムにおいてＡｐｌｏｇ−１より約１０倍若しくはそれ以上高かった。一方、４−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１は、ｎＰＫＣアイソザイムに対する結合選択性がＡｐｌｏｇ−１よりも低かった。以上の結果より、Ａｐｌｏｇ−１と１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１及びＤｅ−ＯＭｅ−ＤＡＴにおいては、構造の単純化によって、発がんプロモーションに関わるｃＰＫＣに対する結合能が弱められたことにより、特異な生理活性を発現している可能性が示唆された。さらに、１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１及びＤｅ−ＯＭｅ−ＤＡＴのＰＫＣδへの結合能はＢｒｙｏ−１と同等であるにも関わらず、Ｂｒｙｏ−１よりも高いがん増殖抑制活性を示したことは、１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１及びＤｅ−ＯＭｅ−ＤＡＴのがん細胞増殖抑制機構にＰＫＣδ以外の標的分子が関与していることを示唆している。

＜Ａｐｌｏｇ−１の側鎖の誘導体化と生理活性＞
構造式（Ｉ）のＡＴＸ誘導体、ＡＴＸ、ＤＡＴ、Ａｐｌｏｇ−１に共通のフェノール環部分の修飾による生理活性の変化を調べるため、Ａｐｌｏｇ−１のフェノール環部分について、下式のように１７位、１９位及び２１位に様々な置換基を導入した。また、１８位のフェノール性水酸基のメチル化は、下式のようにＴＭＳジアゾメタンを用いて行った。

代表例として、上記式中、２１位に臭素原子を導入した化合物２１−Ｂｒ−Ａｐｌｏｇ−１（上記構造式（ＶＩＩＩ））のＰＫＣδ−Ｃ１ドメイン結合選択性試験結果を下表７に、抗発がんプロモーション活性試験結果を下表８に、細胞増殖抑制活性試験結果を下表９に示す。各試験方法は、１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１に関する各試験方法と同様である。

Ａｐｌｏｇ−１の２１位への臭素原子の導入により、２１−Ｂｒ−Ａｐｌｏｇ−１は、Ａｐｌｏｇ−１と比べて約２倍高いＰＫＣδ結合能を示し、Ａｐｌｏｇ−１よりもがん細胞増殖抑制活性が増強した（図９：縦軸のＧＩ_５０値は、コントロールと比べて細胞増殖を５０％阻害する薬剤の濃度を示している）。一方で、２１−Ｂｒ−Ａｐｌｏｇ−１のｉｎｖｉｔｒｏでの発がん促進活性はＡｐｌｏｇ−１よりも低かった。ただし、抗発がん促進活性はＡｐｌｏｇ−１と比較して低下した（図８：縦軸は早期抗原を誘導した細胞の割合%を示す）。さらに、２１−Ｂｒ−Ａｐｌｏｇ−１は、ｉｎｖｉｖｏでも発がん促進活性を示さないことを、１０匹のＩＣＲマウスを用いた発がん２段階試験で確認している（ＴＰＡの５倍量塗布）。

また、Ａｐｌｏｇ−１のフェノール環部分における各種置換体のがん細胞増殖抑制活性をまとめたものを下表１０に示す。下表の縦軸は、３９種類のヒトがん細胞に対する増殖抑制活性−ｌｏｇＩＧ_５０値の平均値を示しており、横軸は、各化合物の分子疎水性度の実測値（逆相系ＨＰＬＣを用いた保持時間より決定）を示している。

上記表中、各化合物に共通のＡ部は、Ａｐｌｏｇ−１の側鎖フェノール環部分以外と同じ構造であり、次式（Ｘ）で表される。換言すれば、前述した構造式（Ｉ）の母核及び側鎖部分からなる１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇにおいて、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５が全て水素原子、Ｒ^６がメタ位の水酸基で、さらに１０位のメチル基を除去したものと同等の構造である。

この結果は、Ａｐｌｏｇ−１のがん細胞増殖抑制活性は、分子疎水性度の変化に支配されていることを示しており、ＬｏｇＰ値４前後が活性の最大値であった。このことから、Ａｐｌｏｇ−１の活性はほぼ飽和しており、さらに活性を挙げるためには、ジオリド部分の構造変換が必要であることが明らかとなった。

さらに、上式（Ｘ）で示したＡ部の側鎖に結合するベンゼン環に関し、フェノール性水酸基が結合する位置の相違による生理活性の変化について調べた。用いた化合物は、ベンゼン環のメタ位に水酸基が結合した化合物としてＡｐｌｏｇ−１、パラ位に水酸基が結合した化合物として下式（ＸＩ）で示される化合物１５である。Ａｐｌｏｇ−１と化合物１５のＰＫＣアイソザイム結合選択性試験結果を下表１１に、ヒトがん細胞増殖抑制活性試験結果を下表１２に示す。下表に示される各試験は、何れも上述した同様の試験と同じ方法により行っている。また、表１２では、３９種類のヒトがん細胞について行ったヒトがん細胞増殖抑制活性試験のうち、上述した５種類のがん細胞（乳がん細胞２種類、結腸がん細胞１種類、肺がん細胞２種類）に加えて、３種類のがん細胞（黒色腫１種類、胃がん２種類）についての結果を示している。

表１１及び表１２から明らかなように、Ａｐｌｏｇ−１と化合物１５のＰＫＣδ結合能はほとんど同等であり、またがん細胞の種類を問わず増殖抑制活性はほとんど同等であることが分かった。このことから、式（Ｘ）で示したＡ部の側鎖に結合するベンゼン環に対するフェノール性水酸基の位置は、これらの生理活性にはほぼ影響しないという結果が得られた。

以上の諸結果より、ＰＫＣδに対する選択的結合能が高く、発がんプロモーション活性が極めて低いにも関わらず、ヒトがん細胞増殖抑制活性が高いという条件を満たす化合物ＡＴＸ誘導体においては、構造式（Ｉ）で示される化合物中、１０位に不斉メチル基が導入されること、１５位にメトキシ基が結合しないことが必須の条件であり、母核においてＲ^１は水素原子又は水酸基の何れでもよく、Ｒ^２及びＲ^３はそれぞれ水素原子又はメチル基の何れでもよく、側鎖においてＲ^４、Ｒ^５は水素原子又はメチル基の何れでもよく、ベンゼン環においてＲ^６は、水素原子、ハロゲン原子、アセチルアミノ基、水酸基、又は置換基を有していてもよい炭素数１〜５のアルキル基の何れかでよい、という構造が導かれた。特にＲ^６が水酸基の場合は、ベンゼン環のうちどの炭素に水酸基が結合していてもよい、ということも明らかとなった。このような新規ＡＴＸ誘導体の中でも特に、１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１とＤｅ−ＯＭｅ−ＤＡＴは、顕著に優れた生理活性を示した。さらに、本発明の構造式（Ｉ）で示されるＡＴＸ誘導体又はその塩、すなわち１０−Ｍｅ−Ａｐｌｏｇ−１とその塩は、比較的容易な２０程度の工程で全合成することができる。よって本発明は、Ｂｒｙｏ−１に代わる新しい抗がん剤となり得るものであり、抗エイズ剤や抗アルツハイマー病薬のシーズとしても有用なものとなり得る。

本発明のＡＴＸ誘導体を抗がん剤として投与する場合には、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉末剤、顆粒剤、液剤等として経口投与することができる可能性があり、また、注射剤、座剤、塗布剤等として非経口投与することができる可能性があり、これらの製剤は、本発明のＡＴＸ又はその薬学上許容し得る塩を用い、常法に従って調製することができる。この場合、一般的な補形薬、賦形剤、添加剤並びに通常の製剤担体を調剤に用いることができる。

本発明の新規ＡＴＸ誘導体は、Ｂｒｙｏ−１に代わる新たな抗がん剤、抗エイズ剤、抗アルツハイマー薬等のシーズとして極めて有益なものとなり得る。

Claims

式（ＩＩ）

で表される新規アプリシアトキシン誘導体、又はその医薬上許容される塩。
式（ＩＩＩ）

で表される新規アプリシアトキシン誘導体、又はその医薬上許容される塩。
請求項１又は２の何れかに記載の新規アプリシアトキシン誘導体又はその医薬上許容される塩のうち何れか１種又は複数種を有効成分として含有する抗がん剤。