JP6152554B2 - Ｄｎａ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体、その製造方法及び用途 - Google Patents
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Description
本発明は、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体に関するものであり、更に詳しくは、ＤＮＡ合成酵素を繰り返し利用可能な形態で安定に固定化した、新規ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体、その製造方法、及びその高耐久性部材などとしての用途に関するものである。
本発明は、より具体的には、シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に固定化されたＤＮＡ合成酵素を反応基質の核酸（ＤＮＡ）の増幅反応に適用する手法を中核とする技術であり、本手法では、シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔にＤＮＡ分子の非特異的吸着を抑制しながらＤＮＡ合成酵素を選択的に固定化することができ、更に、シリカ系ナノ空孔材料の中心細孔直径の違いによって、各種ＤＮＡ合成酵素の固定化状態の適正化と、並びに該ＤＮＡ合成酵素のＤＮＡ増幅活性を高度に制御可能にするものである。
本発明は、環境微生物並びに生体の遺伝子診断、及び各種病原因子の検出などに向けた、微量の基質ＤＮＡ、例えば、難培養性微生物の一細胞ゲノムＤＮＡ、を対象とした、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）、等温ＤＮＡ増幅（ＬＡＭＰ法）、Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ法）、又は、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＭＤＡ法）などの分野における高効率のＤＮＡ増幅手法に関する新技術を提供するものである。
地球環境レベルでは、未知の生物種による生態系の存在、特に目に見えない微生物レベルで、人工的な培養条件下では増殖不能な難培養性微生物の解析の必要性が示唆されている。例えば、微生物のゲノム解析では、究極的には一細胞から人工的にゲノムＤＮＡを増幅させた後にＤＮＡ情報を解析する必要がある。
しかしながら、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）などＤＮＡ合成酵素を用いたＤＮＡ増幅法では、精製酵素試料に付随的に含有されている微量のＤＮＡ不純物が目的の遺伝子のみの特異的な増幅を阻害する場合が多い。また、一般に使用されているＤＮＡ合成酵素は、再利用における耐久性が低いために、極微量の基質ＤＮＡを対象とした多段階のＤＮＡ増幅反応プロセスでは、安定的かつ確実的な増幅が困難である。
このような問題を克服するためには、簡便な手法により、微量のＤＮＡ不純物を排除でき、更に、ＤＮＡ合成酵素の酵素活性を安定的に持続させるための耐久性機能を付与できる新しい技術の提案・開発が不可欠であると考えられる。
酵素及び蛋白質の耐久性向上における先行技術として、シリカ系ナノ空孔材料、例えば、ＭＣＭ、ＳＢＡ、ＦＳＭ型などのシリカ系ナノ空孔材料の細孔内部に蛋白質を吸着させ、活性を保持させる人工的な蛋白質複合体に関する報告が存在する（特許文献１）。しかしながら、既往の研究では、シリカ系ナノ空孔材料の細孔内部にＤＮＡ合成酵素を固定化するという、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体に関する研究成果については未だ報告がない。
ＤＮＡ合成酵素の固定化に関する従来技術では、例えば、多孔性チタニア膜や金表面処理ガラス基板などにＤＮＡ合成酵素を固定化し、酵素活性を高効率に発現させることなどの特徴を有する固定化酵素の開発が行われている（非特許文献１、２）。しかしながら、当該技術では高温下での繰り返し使用による酵素の失活が問題視されている。更に、どちらの技術も反応基質に一本鎖ＤＮＡを適用しており、二本鎖ＤＮＡを出発材料としたＤＮＡ増幅反応に関する研究成果については未だ報告がない。
そのため、当技術分野においては、ＤＮＡ合成酵素に耐久性機能を付与し、また、繰り返し使用可能な形態で安定的に固定化でき、更に、これと同時に、ＤＮＡ不純物の系外排除機能、すなわち、ＤＮＡ分子の非特異的吸着を抑制できる、ＤＮＡ合成酵素の固定化担体の提案・開発が強く要請されていた。
Ｍ．Ｇ．Ｂｅｌｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ，ｖｏｌ．６，ｐｐ．１２２１−１２２５（２０１２）
Ｇ．Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．４１９，ｐｐ．２０５−２１０（２０１１）
従来の酵素の固定化手法では、ＤＮＡ合成酵素と固定化担体との相互作用により酵素活性が低下する、あるいは、反応基質が非特異的に担体表面に吸着することで反応が阻害される、といった問題点があった。従って、極微量の基質ＤＮＡを高精度に増幅させる場合には、ＤＮＡを吸着せずに、ＤＮＡ合成酵素のみを選択的かつ安定的に固定化できる担体が必要である。
本発明は、前記従来技術の課題に鑑みて創出されたものであり、ＤＮＡ合成酵素の固定化とＤＮＡ分子の非特異的吸着の抑制を同時に達成可能な酵素の固定化担体として、シリカ系ナノ空孔材料を適用し、酵素反応における繰り返し使用においてもシリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔にＤＮＡ合成酵素を安定に吸着、固定化、保持でき、かつ、ＤＮＡ合成能を安定に発現できる、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体、その製造方法、及び、その用途を提供することを目的とするものである。
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に酵素反応により反応基質である核酸（ＤＮＡ）を増幅させるＤＮＡ増幅活性を有するＤＮＡ合成酵素の全体あるいは一部分を備える酵素内包複合体であって、
前記シリカ系ナノ空孔材料が、（１）ＦＳＭ又はＳＢＡ型メソポーラスシリカであり、（２）その中心細孔直径が２〜５０ｎｍであり、（３）全細孔容積が０．１〜２．０ｍＬ／ｇであり、（４）比表面積が２００〜１５００ｍ ２ ／ｇであり、
前記酵素反応が、環状及び直鎖状、又は、一本鎖及び二本鎖の基質ＤＮＡを対象とした、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）、等温ＤＮＡ増幅（ＬＡＭＰ法）、Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ法）、又は、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＭＤＡ法）、であり、
酵素反応前後において、前記ＤＮＡ合成酵素の全体あるいは一部分が酵素活性部位を露出させた形態で、前記シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に吸着、固定されていて、上記酵素内包複合体が反応基質である核酸（ＤＮＡ）と相互作用を示し、酵素活性を発現できる複合化状態にある構造を有することを特徴とするＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体。
（２）前記シリカ系ナノ空孔材料が、ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）、ＦＳＭ−２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：１０．６ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：２４．５ｎｍ）、である、前記（１）に記載のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体。
（３）前記シリカ系ナノ空孔材料が、該材料に固定化したＤＮＡ合成酵素と反応基質（ＤＮＡ）を溶液中で相互作用させた場合、該材料へのＤＮＡ分子の非特異的吸着を抑制することができ、かつ、ＤＮＡ合成酵素を選択的に固定化することができる、前記（１）又は（２）に記載のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体。
（４）前記酵素が、耐熱性を有するＤＮＡ合成酵素である、前記（１）に記載のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体。
（５）前記（１）から（４）のいずれか一項に記載のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を製造する方法であって、
シリカ系ナノ空孔材料のＦＳＭ又はＳＢＡ型メソポーラスシリカ細孔に、ＤＮＡ合成酵素の全体あるいは一部分を吸着させ、該シリカ細孔に固定させることにより、反応基質である核酸（ＤＮＡ）と相互作用を示し、酵素活性を発現できる複合化状態にある構造を有する酵素内包複合体を作製することを特徴とするＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造方法。
（６）シリカ系ナノ空孔材料の中心細孔直径の違いにより、分子サイズの異なる各種ＤＮＡ合成酵素の固定化状態の適正化を行い、かつ、ＤＮＡ合成酵素の活性発現によるＤＮＡ増幅活性の程度を制御する、前記（５）に記載のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造方法。
（７）前記（１）から（４）のいずれか一項に記載のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体からなるＤＮＡ増幅活性を有するＤＮＡ増幅用部材であって、
ＤＮＡ合成反応における繰り返し使用においても、酵素がシリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に吸着、固定、保持され、かつ、ＤＮＡ合成能を持続して発現する耐久性を有することを特徴とするＤＮＡ合成酵素内包耐久性部材。
（８）前記（１）から（４）のいずれか一項に記載のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いて、前記（１）に記載の酵素反応のいずれかにより反応基質である核酸（ＤＮＡ）を増幅させることを特徴とする、ＤＮＡの増幅方法。
（１）シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に酵素反応により反応基質である核酸（ＤＮＡ）を増幅させるＤＮＡ増幅活性を有するＤＮＡ合成酵素の全体あるいは一部分を備える酵素内包複合体であって、
前記シリカ系ナノ空孔材料が、（１）ＦＳＭ又はＳＢＡ型メソポーラスシリカであり、（２）その中心細孔直径が２〜５０ｎｍであり、（３）全細孔容積が０．１〜２．０ｍＬ／ｇであり、（４）比表面積が２００〜１５００ｍ ２ ／ｇであり、
前記酵素反応が、環状及び直鎖状、又は、一本鎖及び二本鎖の基質ＤＮＡを対象とした、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）、等温ＤＮＡ増幅（ＬＡＭＰ法）、Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ法）、又は、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＭＤＡ法）、であり、
酵素反応前後において、前記ＤＮＡ合成酵素の全体あるいは一部分が酵素活性部位を露出させた形態で、前記シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に吸着、固定されていて、上記酵素内包複合体が反応基質である核酸（ＤＮＡ）と相互作用を示し、酵素活性を発現できる複合化状態にある構造を有することを特徴とするＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体。
（２）前記シリカ系ナノ空孔材料が、ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）、ＦＳＭ−２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：１０．６ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：２４．５ｎｍ）、である、前記（１）に記載のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体。
（３）前記シリカ系ナノ空孔材料が、該材料に固定化したＤＮＡ合成酵素と反応基質（ＤＮＡ）を溶液中で相互作用させた場合、該材料へのＤＮＡ分子の非特異的吸着を抑制することができ、かつ、ＤＮＡ合成酵素を選択的に固定化することができる、前記（１）又は（２）に記載のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体。
（４）前記酵素が、耐熱性を有するＤＮＡ合成酵素である、前記（１）に記載のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体。
（５）前記（１）から（４）のいずれか一項に記載のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を製造する方法であって、
シリカ系ナノ空孔材料のＦＳＭ又はＳＢＡ型メソポーラスシリカ細孔に、ＤＮＡ合成酵素の全体あるいは一部分を吸着させ、該シリカ細孔に固定させることにより、反応基質である核酸（ＤＮＡ）と相互作用を示し、酵素活性を発現できる複合化状態にある構造を有する酵素内包複合体を作製することを特徴とするＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造方法。
（６）シリカ系ナノ空孔材料の中心細孔直径の違いにより、分子サイズの異なる各種ＤＮＡ合成酵素の固定化状態の適正化を行い、かつ、ＤＮＡ合成酵素の活性発現によるＤＮＡ増幅活性の程度を制御する、前記（５）に記載のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造方法。
（７）前記（１）から（４）のいずれか一項に記載のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体からなるＤＮＡ増幅活性を有するＤＮＡ増幅用部材であって、
ＤＮＡ合成反応における繰り返し使用においても、酵素がシリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に吸着、固定、保持され、かつ、ＤＮＡ合成能を持続して発現する耐久性を有することを特徴とするＤＮＡ合成酵素内包耐久性部材。
（８）前記（１）から（４）のいずれか一項に記載のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いて、前記（１）に記載の酵素反応のいずれかにより反応基質である核酸（ＤＮＡ）を増幅させることを特徴とする、ＤＮＡの増幅方法。
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、規則性細孔を有するシリカ系ナノ空孔材料（メソポーラスシリカ）のシリカ細孔にＤＮＡ合成酵素を固定化して複合化することにより、シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔のナノ空孔を反応場とした高効率・長寿命のＤＮＡ増幅システムを構築し、提供するものである。本発明では、分子サイズの異なる種々のＤＮＡ合成酵素を、各々に対応したサイズのシリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔のナノ空孔に内包化することでＤＮＡ合成酵素を安定に配列化でき、それにより、耐熱性や耐久性など酵素機能を向上させることを可能とするものである。
本発明は、規則性細孔を有するシリカ系ナノ空孔材料（メソポーラスシリカ）のシリカ細孔にＤＮＡ合成酵素を固定化して複合化することにより、シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔のナノ空孔を反応場とした高効率・長寿命のＤＮＡ増幅システムを構築し、提供するものである。本発明では、分子サイズの異なる種々のＤＮＡ合成酵素を、各々に対応したサイズのシリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔のナノ空孔に内包化することでＤＮＡ合成酵素を安定に配列化でき、それにより、耐熱性や耐久性など酵素機能を向上させることを可能とするものである。
本発明では、これらＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の繰り返し使用による連続的なＤＮＡ増幅を実現し、例えば、難培養性微生物のゲノム解析に代表されるような、一細胞の微量ゲノムＤＮＡからの安定なＤＮＡ増幅法を確立することを可能とするものである。
本発明は、シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔にＤＮＡ合成能を有する酵素（ＤＮＡ合成酵素）の全体あるいは一部分を備える酵素内包複合体であって、酵素反応前後においてＤＮＡ合成酵素が前記シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に安定に固定されており、上記酵素内包複合体が反応基質である核酸（ＤＮＡ）と相互作用を示し、酵素活性を安定に発現できるような複合化状態にあることを特徴とするものである。
本発明において、シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔にＤＮＡ合成酵素の全体あるいは一部分を備える酵素内包複合体とは、多様な分子サイズ・形状のＤＮＡ合成酵素を対象とした固定化において、シリカ系ナノ空孔材料の細孔径すなわち中心細孔直径の違いによって、各種ＤＮＡ合成酵素の固定化状態を制御できるものを意味し、また、この固定化状態を適正化することにより、ＤＮＡ合成酵素のＤＮＡ増幅活性を制御可能にするものであることを意味する。
また、本発明において、上記酵素内包複合体が反応基質である核酸（ＤＮＡ）と相互作用を示し、酵素活性を安定に発現できるような複合化状態にあるとは、酵素反応の前後においてＤＮＡ合成酵素が前記シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に安定にかつ持続的に固定されており、更に、繰り返し使用が可能に複合化されていることを意味する。
本発明のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体は、固定化されているＤＮＡ合成酵素部分が反応基質であるＤＮＡ分子と相互作用することが可能である一方、ｐＨ値が４から８の範囲にある反応溶液において、該シリカ系ナノ空孔材料へのＤＮＡ分子の非特異的吸着を完全に抑制することが可能である。
一般に、シリカ系ナノ空孔材料とは、ＭＣＭ、ＳＢＡ、ＦＳＭ、ＫＩＴ、また、ＨＯＭ型などのシリカ系ナノ空孔材料のことを意味する。本発明においては、上記シリカ系ナノ空孔材料として、例えば、ケイ素原子と酸素原子を必須成分として含む化合物の多孔体であり、細孔サイズがメソ孔であり、その中心細孔直径が２〜５０ｎｍであり、全細孔容積が０．１〜２．０ｍＬ／ｇであり、比表面積が２００〜１５００ｍ２／ｇであること、で特徴付けられる特定のシリカ系ナノ空孔材料が用いられるが、その他にも、ヘキサゴナル、又は、キュービックなどの規則的細孔配列構造を有するシリカ系ナノ空孔材料が好適なものとして例示される。
次に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）用の高耐熱性ＤＮＡ合成酵素を代表例として、本発明を更に詳細に説明する。ＤＮＡ合成酵素は、ＰＣＲ用の酵素に限定されるものではなく、任意のＤＮＡ配列、又は、特定の遺伝子配列を合成、増幅する能力を有する酵素であれば、その種類に制限されることなく、本発明を適用することが可能である。また、後記の実施例では、長さが１００塩基対（ｂｐ）の二本鎖ＤＮＡを基質ＤＮＡとして用いているが、本発明における反応基質のＤＮＡとは、この長さに限定されるものではなく、また、環状及び直鎖状、又は、一本鎖及び二本鎖などの適宜のＤＮＡが適用可能である。
次に、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造について説明する。本発明では、例えば、一例を示して説明すると、ＤＮＡ合成酵素、二本鎖ＤＮＡ、また、ｄＮＴＰｓを含んだ緩衝溶液４２．５μＬと、シリカ系ナノ空孔材料の粉末０．５ｍｇとを混合し、遠心分離を行うことにより、沈殿物として、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を製造することができる。
ここで、シリカ系ナノ空孔材料として、好適には、例えば、中心細孔直径の異なる７種類のシリカ系ナノ空孔材料の、ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）、ＦＳＭ−２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：１０．６ｎｍ）、ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）、ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：２４．５ｎｍ）、を用いることができる。後記する酵素反応中及び反応後において、ＤＮＡ合成酵素はシリカ系ナノ空孔材料から脱離せずに強固に固定化状態を保持することができ、その固定化率は、ナノ空孔材料の中心細孔直径に依存せず、酵素の全量を吸着させることが可能である。
次に、上記ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）は、例えば、上記ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の溶液に、更に、２種類のプライマーＤＮＡを含んだ水溶液７．５μＬを添加することによって開始させることができる。上記全ての種類のナノ空孔材料について、反応後にＤＮＡ増幅産物の存在が認められるが、シリカ系ナノ空孔材料の中心細孔直径の違いによって、該ＤＮＡ合成酵素の固定化状態、及び、ＤＮＡ増幅活性を制御することが可能である。
また、本発明は、上記一度目の酵素反応後に、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を回収し、繰り返し使用したとしても、ＤＮＡ合成酵素をシリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に安定に吸着、保持でき、この際、ＤＮＡ合成酵素のＤＮＡ合成能を安定的かつ持続的に発現できることを特徴とする、ＤＮＡ合成酵素内包高耐久性部材を提供するものである。
本発明では、シリカ系ナノ空孔材料と耐熱性を有するＤＮＡ合成酵素との複合材料を用いたバッチ式ＰＣＲにおいて、一例として、１００塩基対のＤＮＡを鋳型としたＤＮＡ増幅反応を試みた。具体的には、細孔径の異なる７種類のシリカ系ナノ空孔材料の、ＦＳＭ及びＳＢＡ型メソポーラスシリカ（細孔径：２．６ｎｍ、４．２ｎｍ、５．４ｎｍ、７．１ｎｍ、１０．６ｎｍ、１８．５ｎｍ、２４．５ｎｍ）、を合成し、これらシリカ材料に対するＰＣＲ用ＤＮＡ合成酵素（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）の吸着挙動を解析するとともに、固定化酵素によるＤＮＡ増幅反応を評価した。
その結果、ＤＮＡ合成酵素はいずれのシリカ系ナノ空孔材料に対しても強固に吸着しており、また、ＦＳＭ及びＳＢＡ型メソポーラスシリカどちらの場合も、シリカ系ナノ空孔材料の細孔径が小さいほどＤＮＡの増幅活性が増大することが分かった。次に、ＤＮＡ合成酵素をシリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に固定化した当該固定化酵素の繰り返し使用による耐久性試験を実施した結果、ＤＮＡの増幅効率は徐々に低下したものの、４度の繰り返し反応において耐久性を示した。また、１本鎖ＤＮＡよりも２本鎖ＤＮＡを鋳型とした場合に、より良好なＤＮＡの増幅が検出された。
以上の結果から、シリカ系ナノ空孔材料の細孔径が小さいほどＤＮＡの増幅活性が増大することから、ＤＮＡ合成酵素の反応活性はシリカ系ナノ空孔材料の細孔径の違いによってＤＮＡ増幅の程度を制御することが可能であり、また、本ＤＮＡ合成酵素が繰り返し利用可能な状態でシリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に安定に固定化されていることが示された。
本発明は、ＤＮＡ合成酵素を繰り返し利用可能な状態でシリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に安定に固定化した、新規なＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体、その製造方法及び用途を提供するものである。本発明は、より具体的には、シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に固定化されたＤＮＡ合成酵素を二本鎖ＤＮＡの増幅反応に適用することが可能な手法を中核とする技術であり（図１）、本手法では、ＤＮＡ分子の非特異的吸着を抑制しながら酵素を選択的に固定化することができ、更に、シリカ系ナノ空孔材料の細孔径の違いによってＤＮＡ合成酵素のＤＮＡの増幅活性を高度に制御することを可能にするものである（図２）。
本発明の応用分野としては、例えば、環境及び健康の診断などを対象とした、微量サンプル、例えば、難培養性微生物の一細胞ゲノムＤＮＡ、からの高効率のＤＮＡ増幅手法が挙げられ、更に、本発明は、環境微生物並びに生体の遺伝子診断、及び各種病原因子の検出などに向けた、微量の基質ＤＮＡを対象とした、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）、等温ＤＮＡ増幅（ＬＡＭＰ法）、Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ法）、又は、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＭＤＡ法）などにおける高効率のＤＮＡ増幅手法として適用可能である。
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）酵素反応前後において、シリカ系ナノ空孔材料の細孔内部にＤＮＡ合成酵素の全体あるいは一部分を、酵素活性部位を露出させた形態で安定に吸着させ、固定化したＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を提供することができる。
（２）該固定化酵素は、反応基質の核酸（基質ＤＮＡ）と相互作用を示し、酵素活性を安定に発現できるような複合化形態を有している。
（３）シリカ系ナノ空孔材料に固定化したＤＮＡ合成酵素と反応基質（ＤＮＡ）を溶液中で相互作用させた場合、該シリカ系ナノ空孔材料へのＤＮＡ分子の非特異的吸着を抑制でき、また、ＤＮＡ合成酵素を選択的に固定化することができる。
（４）シリカ系ナノ空孔材料による、前記ＤＮＡの非特異的吸着の抑制効果により、精製酵素試料に付随的に含有される微量のＤＮＡ不純物を排除することが可能となり、その結果、極微量の反応基質、例えば、難培養性微生物の一細胞ゲノムＤＮＡ、を対象とした、高精度のＤＮＡ増幅手法を提供することができる。
（５）シリカ系ナノ空孔材料の中心細孔直径の違いによって、分子サイズの異なる各種ＤＮＡ合成酵素の固定化を適正に行うことができ、更に、該ＤＮＡ合成酵素のＤＮＡ増幅活性を高度に制御することができる。
（６）酵素反応後の遠心分離操作により、ＤＮＡ増幅産物とＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を容易に分離、回収することが可能となる。
（７）前記遠心分離操作の際に、任意の緩衝溶液、又は反応溶液に容易に交換可能であり、更に、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の繰り返し使用における、安定的な酵素固定化状態の保持と、高い反応性を持続させる高い耐久性を有するＤＮＡ合成酵素内包耐久部材を提供することができる。
（１）酵素反応前後において、シリカ系ナノ空孔材料の細孔内部にＤＮＡ合成酵素の全体あるいは一部分を、酵素活性部位を露出させた形態で安定に吸着させ、固定化したＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を提供することができる。
（２）該固定化酵素は、反応基質の核酸（基質ＤＮＡ）と相互作用を示し、酵素活性を安定に発現できるような複合化形態を有している。
（３）シリカ系ナノ空孔材料に固定化したＤＮＡ合成酵素と反応基質（ＤＮＡ）を溶液中で相互作用させた場合、該シリカ系ナノ空孔材料へのＤＮＡ分子の非特異的吸着を抑制でき、また、ＤＮＡ合成酵素を選択的に固定化することができる。
（４）シリカ系ナノ空孔材料による、前記ＤＮＡの非特異的吸着の抑制効果により、精製酵素試料に付随的に含有される微量のＤＮＡ不純物を排除することが可能となり、その結果、極微量の反応基質、例えば、難培養性微生物の一細胞ゲノムＤＮＡ、を対象とした、高精度のＤＮＡ増幅手法を提供することができる。
（５）シリカ系ナノ空孔材料の中心細孔直径の違いによって、分子サイズの異なる各種ＤＮＡ合成酵素の固定化を適正に行うことができ、更に、該ＤＮＡ合成酵素のＤＮＡ増幅活性を高度に制御することができる。
（６）酵素反応後の遠心分離操作により、ＤＮＡ増幅産物とＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を容易に分離、回収することが可能となる。
（７）前記遠心分離操作の際に、任意の緩衝溶液、又は反応溶液に容易に交換可能であり、更に、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の繰り返し使用における、安定的な酵素固定化状態の保持と、高い反応性を持続させる高い耐久性を有するＤＮＡ合成酵素内包耐久部材を提供することができる。
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
本実施例では、２次元ヘキサゴナルの細孔配列構造を有していて、細孔径の異なる各種シリカ系ナノ空孔材料の合成を行った。
（１）合成例１
ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド（３．２ｇ）、或いは、ドコシルトリメチルアンモニウムクロライド（４．２４ｇ）を、７０℃の水１００ミリリットルに添加し、溶解後、カネマイト５ｇを更に添加し、７０℃に加熱しながら、ホモミキサーで３時間撹拌した。これに、２規定塩酸を約１時間かけて添加し、ｐＨ８．５の状態で、約３時間撹拌した。
（１）合成例１
ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド（３．２ｇ）、或いは、ドコシルトリメチルアンモニウムクロライド（４．２４ｇ）を、７０℃の水１００ミリリットルに添加し、溶解後、カネマイト５ｇを更に添加し、７０℃に加熱しながら、ホモミキサーで３時間撹拌した。これに、２規定塩酸を約１時間かけて添加し、ｐＨ８．５の状態で、約３時間撹拌した。
これを、吸引濾過した後、７０℃の熱水に再分散して濾過する工程を４回繰り返してから風乾した。これを、４５℃で３日間乾燥した後、５５０℃で６時間焼成することにより、中心細孔直径の異なるシリカ系ナノ空孔材料（ＦＳＭ；界面活性剤の種類が、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド、また、ドコシルトリメチルアンモニウムクロライドの場合）を得た。中心細孔直径は、各々２．６ｎｍ（ＦＳＭ−１６）、また、４．２ｎｍ（ＦＳＭ−２２）、であった。
（２）合成例２
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ１２３［ＢＡＳＦ社製］（１０ｇ）を、水３００ミリリットルに添加し、３５℃で一晩撹拌し溶解させた後、これに、塩酸２１．８７ｇ及びオルトケイ酸テトラエチル２１．３２ｇを更に添加し、ホットスターラーを用いて３５℃に加熱しながら、約２０時間撹拌した。これを、異なる合成温度（ａ：３５℃、ｂ：８０℃、又は、ｃ：１３０℃）で２４時間静置した。
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ１２３［ＢＡＳＦ社製］（１０ｇ）を、水３００ミリリットルに添加し、３５℃で一晩撹拌し溶解させた後、これに、塩酸２１．８７ｇ及びオルトケイ酸テトラエチル２１．３２ｇを更に添加し、ホットスターラーを用いて３５℃に加熱しながら、約２０時間撹拌した。これを、異なる合成温度（ａ：３５℃、ｂ：８０℃、又は、ｃ：１３０℃）で２４時間静置した。
これを、吸引濾過した後、７０℃の熱水に再分散して濾過する工程を４回繰り返してから風乾した。これを、４５℃で３日間乾燥した後、時間あたり１０５℃の速度で５５０℃まで昇温させ、更に、これを、５５０℃で１０時間焼成することにより、中心細孔直径の異なるシリカ系ナノ空孔材料（ＳＢＡ−１５）を得た。合成温度がａ、ｂ、ｃの場合、中心細孔直径は、各々ａ：５．４ｎｍ、ｂ：７．１ｎｍ、また、ｃ：１０．６ｎｍ、であった。
（３）合成例３
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ１２３（４ｇ）を、水１２０ミリリットルに添加し、更に、これに塩化カリウム６．０８ｇを添加し、常温で１時間撹拌し溶解させた後、これに、塩酸２３．６ｇ及びメシチレン３ｇを更に添加し、常温で２時間撹拌した。これに、オルトケイ酸テトラエチル８．５ｇを更に添加し、１０分間激しく撹拌した後、３５℃で２４時間静置した。これを、異なる合成温度（ａ：１００℃、また、ｂ：１３０℃）で２４時間静置した。
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ１２３（４ｇ）を、水１２０ミリリットルに添加し、更に、これに塩化カリウム６．０８ｇを添加し、常温で１時間撹拌し溶解させた後、これに、塩酸２３．６ｇ及びメシチレン３ｇを更に添加し、常温で２時間撹拌した。これに、オルトケイ酸テトラエチル８．５ｇを更に添加し、１０分間激しく撹拌した後、３５℃で２４時間静置した。これを、異なる合成温度（ａ：１００℃、また、ｂ：１３０℃）で２４時間静置した。
これを、吸引濾過した後、７０℃の熱水に再分散して濾過する工程を４回繰り返してから風乾した。これを、４５℃で３日間乾燥した後、時間あたり１０５℃の速度で５５０℃まで昇温させ、更に、これを、５５０℃で１０時間焼成することにより、中心細孔直径の異なるシリカ系ナノ空孔材料（ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）を得た。合成温度がａ、ｂの場合、中心細孔直径は、各々ａ：１８．５ｎｍ、また、ｂ：２４．５ｎｍ、であった。
本実施例では、実施例１で作製した各種シリカ系ナノ空孔材料に対するＤＮＡ合成酵素の固定化と酵素活性の評価を行った。図１に、シリカ系ナノ空孔材料（メソポーラスシリカ）の規則性細孔（シリカ細孔）に固定化したＤＮＡ合成酵素を備えたＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体と反応基質（ＤＮＡ）が相互作用して、ＤＮＡが増幅される様子を模式的に示した説明図を示す。
（１）ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造
シリカ系ナノ空孔材料には、中心細孔直径の異なる７種類のシリカ系ナノ空孔材料：１）ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）、２）ＦＳＭ−２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）、３）ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）、４）ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ）、５）ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：１０．６ｎｍ）、６）ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）、７）ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：２４．５ｎｍ）、を使用し、また、ＤＮＡ合成酵素には、ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ（タカラバイオ製、分子量：約９４ｋＤ）を用いた。
シリカ系ナノ空孔材料には、中心細孔直径の異なる７種類のシリカ系ナノ空孔材料：１）ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）、２）ＦＳＭ−２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）、３）ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）、４）ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ）、５）ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：１０．６ｎｍ）、６）ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）、７）ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：２４．５ｎｍ）、を使用し、また、ＤＮＡ合成酵素には、ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ（タカラバイオ製、分子量：約９４ｋＤ）を用いた。
ＤＮＡ合成酵素を固定化したシリカ系ナノ空孔材料粒子の製造には、ＤＮＡ合成酵素（５ｕｎｉｔｓ）、二本鎖ＤＮＡ（５ｎｇ、１００塩基対（ｂｐ）、５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＡＡＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＣ）、また、ｄＮＴＰｓ（各々２０ｎｍｏｌ）、を含んだ緩衝溶液４２．５μＬと、シリカ系ナノ空孔材料粉末０．５ｍｇとを混合し、遠心分離を行い、最終的にＤＮＡ合成酵素をシリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に固定化した複合体である、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を得た。
（２）ＤＮＡ合成活性の評価
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）における、上記ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体のＤＮＡ合成活性について調べた。酵素反応は、上記ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の溶液に、更に、各々３７．５ｐｍｏｌの２種類のプライマーＤＮＡ（Ｔ７ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ、２０ｍｅｒ、５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ、及び、ＳＰ６ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ、１９ｍｅｒ、５’−ＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ）を含んだ水溶液７．５μＬを添加することによって開始した。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）における、上記ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体のＤＮＡ合成活性について調べた。酵素反応は、上記ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の溶液に、更に、各々３７．５ｐｍｏｌの２種類のプライマーＤＮＡ（Ｔ７ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ、２０ｍｅｒ、５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ、及び、ＳＰ６ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ、１９ｍｅｒ、５’−ＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ）を含んだ水溶液７．５μＬを添加することによって開始した。
反応条件は、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５０℃で６０秒間、７２℃で３０秒間の温度サイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で５分間の加熱反応とし、本反応には、ＰＣＲ装置（バイオラッド製、ｉＣｙｃｌｅｒ）を使用した。また、反応後のＤＮＡ増幅産物は、１５％ ＴＢＥ−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、蛍光色素ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉによるゲル染色後に、蛍光イメージアナライザー（ＦＵＪＩＦＩＬＭ製、ＦＬＡ−５１００）を用いて解析した。
図２に、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体によるＤＮＡ増幅産物の解析結果を示す。図中、Ｍは、ＤＮＡ分子サイズマーカー、ＰＣは、シリカ系ナノ空孔材料に固定化していない遊離のＤＮＡ合成酵素の場合、ＮＣは、未固定ＤＮＡ合成酵素にプライマーＤＮＡを添加していない場合、である。
また、図中、マル１から７は、中心細孔直径の異なる各種シリカ系ナノ空孔材料の、１：ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）、２：ＦＳＭ−２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）、３：ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）、４：ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ）、５：ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：１０．６ｎｍ）、６：ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）、７：ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：２４．５ｎｍ）、に固定化したＤＮＡ合成酵素の場合、である。
図より、全ての種類のシリカ系ナノ空孔材料について、ＤＮＡ増幅産物の存在が認められ、これは、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体がＤＮＡ合成活性を有していることを示している。また、シリカ系ナノ空孔材料がＦＳＭ、ＳＢＡ型どちらの場合にも、該シリカ系ナノ空孔材料の中心細孔直径が小さくなる程、ＤＮＡ増幅活性が増大した。このことは、シリカ系ナノ空孔材料の中心細孔直径の違いによって、該ＤＮＡ合成酵素のＤＮＡ増幅活性を制御できることを示唆している。
本実施例では、実施例２で使用したＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体におけるＤＮＡ合成酵素の固定化挙動について評価を行った。図３の左図（ａ）及び右図（ｂ）に、ＤＮＡ増幅反応後の上清と、反応後のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の沈殿物にＳＤＳ−サンプルＢｕｆｆｅｒを添加し、９５℃で１０分間加熱した後の上清とを、各々、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（４−１５％ ＴＧＸ−ポリアクリルアミドゲル）を用いて電気泳動し、蛍光色素Ｏｒｉｏｌｅによるゲル染色後に、蛍光イメージアナライザー（ＦＵＪＩＦＩＬＭ製、ＦＬＡ−５１００）で解析した結果を示す。
また、図中、Ｍは、タンパク質分子量マーカー、また、マル１から７は、中心細孔直径の異なる各種シリカ系ナノ空孔材料の、１：ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）、２：ＦＳＭ−２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）、３：ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）、４：ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ）、５：ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：１０．６ｎｍ）、６：ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）、７：ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：２４．５ｎｍ）、に固定化したＤＮＡ合成酵素の場合、である。
図３の左図（ａ）より、全ての種類のシリカ系ナノ空孔材料について、ＤＮＡ合成酵素の存在は認められなかった。一方、図３の右図（ｂ）より、全ての種類のシリカ系ナノ空孔材料について、ＤＮＡ合成酵素（分子量：約９４ｋＤ）の存在が認められた。
以上の結果より、酵素反応中及び反応後において、ＤＮＡ合成酵素はシリカ系ナノ空孔材料から脱離せずに強固に固定化状態を保持しており、その固定化率は、シリカ系ナノ空孔材料の中心細孔直径に依存せず、酵素の全量が吸着していることが判明した。
本実施例では、実施例２と同様の反応において、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の４度の繰り返し使用における耐久性について評価を行った。ＤＮＡ合成酵素を固定化したシリカ系ナノ空孔材料粒子は、一度目の反応後に遠心分離によって回収すると共に上清を除去し、そこに、ＤＮＡ合成酵素を含んでいない、実施例２に記載の反応溶液を添加することによって、二度目の反応を開始した。三度目、及び、四度目の実験操作も同様の手順で行った。実験結果を図４に示す。
図中、（ａ）−（ｄ）は、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を繰り返し使用した場合、（ａ）：一度目、（ｂ）：二度目、（ｃ）：三度目、（ｄ）：四度目である。また、図中、マル１から７は、中心細孔直径の異なる各種シリカ系ナノ空孔材料の、１：ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）、２：ＦＳＭ−２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）、３：ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）、４：ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ）、５：ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：１０．６ｎｍ）、６：ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）、７：ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：２４．５ｎｍ）、に固定化したＤＮＡ合成酵素の場合、である
図より、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の繰り返し使用における、一から四度目の使用時、全てにおいて、どの種類のシリカ系ナノ空孔材料に関しても、ＤＮＡ増幅産物の存在が認められた。このことは、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体が、繰り返し使用においても、酵素をシリカ系ナノ空孔材料の細孔内に安定に吸着、保持でき、この際、酵素のＤＮＡ合成能を安定的かつ持続的に発現できることを示している。
本実施例では、表面化学修飾及び未修飾のシリカ系ナノ空孔材料（ＳＢＡ−１５）に対する反応基質ＤＮＡ（λ−ＤＮＡ）の吸着挙動の評価を行った。ＳＢＡ−１５に対するλ−ＤＮＡの吸着量は、紫外可視分光光度計（モレキュラーデバイス製、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２ｅ）を用いて、吸着操作後の上清におけるＤＮＡの吸光度（吸収ピーク波長：２６０ｎｍ）を測定することによって評価した。
図５の左図（Ａ）及び右図（Ｂ）に、細孔内壁にアミノ基を修飾したＳＢＡ−１５（中心細孔直径：６．２ｎｍ）、及び、未修飾のＳＢＡ−１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ）に濃度の異なるλ−ＤＮＡ（０．１、０．０５、また、０．０１ｍｇ／ｍＬ）をｐＨの異なる３種類の緩衝溶液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８）、２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ ６）、２０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４）、の中で相互作用させた場合のλ−ＤＮＡの吸着量を示す。
図中、（Ａ）は、細孔内壁にアミノ基を修飾したＳＢＡ−１５（中心細孔直径：６．２ｎｍ）に濃度の異なる基質ＤＮＡ（ｃ：０．１ｍｇ／ｍＬ、ｄ：０．０５ｍｇ／ｍＬ、ｅ：０．０１ｍｇ／ｍＬ）を相互作用させた場合、また、（Ｂ）は、未修飾のＳＢＡ−１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ）に濃度の異なる基質ＤＮＡ（ｆ：０．１ｍｇ／ｍＬ、ｇ：０．０５ｍｇ／ｍＬ、ｈ：０．０１ｍｇ／ｍＬ）を相互作用させた場合、である。
図５の縦軸は、１０ｍｇのＳＢＡ−１５に対するλ−ＤＮＡの吸着量（ｍｇ）を、横軸は、λ−ＤＮＡを分散している緩衝溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８）、２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ ６）、また、２０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４））、のｐＨを示している。
図５の左図（Ａ）より、どのｐＨ値においても、ＤＮＡ濃度に依存して、ＳＢＡ−１５に対するλ−ＤＮＡの吸着量は増大した。一方、図５の右図（Ｂ）より、どのｐＨ値、どのＤＮＡ濃度においても、ＳＢＡ−１５に対するλ−ＤＮＡの吸着は全く認められなかった。
以上の結果より、未修飾のシリカ系ナノ空孔材料には、ＤＮＡ分子の非特異的吸着を抑制する効果が認められ、また、これと実施例３における実験結果と併せると、ＤＮＡ分子を吸着させず、ＤＮＡ合成酵素を選択的に固定化できる効果があることが判明した。
以上詳述したように、本発明は、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体、その製造方法及び用途に係るものであり、本発明によれば、酵素反応前後において、シリカ系ナノ空孔材料へのＤＮＡ分子の非特異的吸着を抑制しながら、シリカ系ナノ空孔材料の細孔内部にＤＮＡ合成酵素を選択的かつ安定的に固定させることができ、更に、該固定化酵素が反応基質の核酸（基質ＤＮＡ）と相互作用を示し、ＤＮＡ増幅反応における酵素活性を安定に発現できるような複合化形態にある、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を提供することができる。
シリカ系ナノ空孔材料による、前記ＤＮＡの非特異的吸着の抑制効果により、精製酵素試料に付随的に含有される微量のＤＮＡ不純物を排除することが可能となり、その結果、極微量の基質ＤＮＡ、例えば、難培養性微生物の一細胞ゲノムＤＮＡ、を対象とした、新規の高精度ＤＮＡ増幅手法として利用することを可能とする。
本発明のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造方法によれば、シリカ系ナノ空孔材料の中心細孔直径の違いによって、分子サイズの異なる各種ＤＮＡ合成酵素の固定化状態の適正化を行うことができ、更に、該酵素のＤＮＡ増幅活性を高度に制御することができる。この効果を利用することで、例えば、サブユニット構造を有する巨大なＤＮＡ合成酵素を対象とした固定化酵素の調製が可能となる。
また、本発明のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体は、繰り返し使用における、安定的な酵素固定化状態の保持及び高い反応持続性を有するため、例えば、安定性の低いＤＮＡ合成酵素の再利用など、高耐久性部材としての用途に関する新技術を提供することができる。
更に、本発明は、環境微生物並びに生体の遺伝子診断、及び各種病原因子の検出などに向けた、微量の基質ＤＮＡを対象とした、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）、等温ＤＮＡ増幅（ＬＡＭＰ法）、Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ法）、又は、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＭＤＡ法）などにおける高効率のＤＮＡ増幅手法として適用可能である。
Claims (8)
- シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に酵素反応により反応基質である核酸（ＤＮＡ）を増幅させるＤＮＡ増幅活性を有するＤＮＡ合成酵素の全体あるいは一部分を備える酵素内包複合体であって、
前記シリカ系ナノ空孔材料が、（１）ＦＳＭ又はＳＢＡ型メソポーラスシリカであり、（２）その中心細孔直径が２〜５０ｎｍであり、（３）全細孔容積が０．１〜２．０ｍＬ／ｇであり、（４）比表面積が２００〜１５００ｍ ２ ／ｇであり、
前記酵素反応が、環状及び直鎖状、又は、一本鎖及び二本鎖の基質ＤＮＡを対象とした、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）、等温ＤＮＡ増幅（ＬＡＭＰ法）、Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ法）、又は、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＭＤＡ法）、であり、
酵素反応前後において、前記ＤＮＡ合成酵素の全体あるいは一部分が酵素活性部位を露出させた形態で、前記シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に吸着、固定されていて、上記酵素内包複合体が反応基質である核酸（ＤＮＡ）と相互作用を示し、酵素活性を発現できる複合化状態にある構造を有することを特徴とするＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体。 - 前記シリカ系ナノ空孔材料が、ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）、ＦＳＭ−２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：１０．６ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：２４．５ｎｍ）、である、請求項１に記載のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体。
- 前記シリカ系ナノ空孔材料が、該材料に固定化したＤＮＡ合成酵素と反応基質（ＤＮＡ）を溶液中で相互作用させた場合、該材料へのＤＮＡ分子の非特異的吸着を抑制することができ、かつ、ＤＮＡ合成酵素を選択的に固定化することができる、請求項１又は２に記載のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体。
- 前記酵素が、耐熱性を有するＤＮＡ合成酵素である、請求項１に記載のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体。
- 請求項１から４のいずれか一項に記載のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を製造する方法であって、
シリカ系ナノ空孔材料のＦＳＭ又はＳＢＡ型メソポーラスシリカ細孔に、ＤＮＡ合成酵素の全体あるいは一部分を吸着させ、該シリカ細孔に固定させることにより、反応基質である核酸（ＤＮＡ）と相互作用を示し、酵素活性を発現できる複合化状態にある構造を有する酵素内包複合体を作製することを特徴とするＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造方法。 - シリカ系ナノ空孔材料の中心細孔直径の違いにより、分子サイズの異なる各種ＤＮＡ合成酵素の固定化状態の適正化を行い、かつ、ＤＮＡ合成酵素の活性発現によるＤＮＡ増幅活性の程度を制御する、請求項５に記載のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造方法。
- 請求項１から４のいずれか一項に記載のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体からなるＤＮＡ増幅活性を有するＤＮＡ増幅用部材であって、
ＤＮＡ合成反応における繰り返し使用においても、酵素がシリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に吸着、固定、保持され、かつ、ＤＮＡ合成能を持続して発現する耐久性を有することを特徴とするＤＮＡ合成酵素内包耐久性部材。 - 請求項１から４のいずれか一項に記載のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いて、請求項１に記載の酵素反応のいずれかにより反応基質である核酸（ＤＮＡ）を増幅させることを特徴とする、ＤＮＡの増幅方法。
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