JP6714251B2 - 極微量核酸の増幅方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いた微量核酸増幅方法の改良技術に関する。更に詳しくは、ＤＮＡ合成酵素とシリカ系ナノ空孔材料とを複合体化する過程で、積極的にＤＮＡ合成酵素とウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）との複合体化を促進させたＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体の形成方法、及び当該ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いることによる、数分子レベルの鋳型ＤＮＡを対象とすることができる極微量ＤＮＡの増幅技術に関するものである。

ＤＮＡ配列の解析に基づいた、環境試料、病気・健康、又、犯罪捜査などに向けた遺伝子診断では、対象となる試料が希少な試料であることから、極めて微量のＤＮＡ、究極的には１分子レベルのＤＮＡを対象とした、迅速かつ簡便な解析法が求められており、そのような解析を可能とする極微量の核酸増幅技術の開発が必要である。
すなわち、簡便な手法により、非特異的ＤＮＡ増幅反応を抑制でき、その結果、極微量の基質ＤＮＡの特異的かつ高感度の増幅を可能にし、更に、反応溶液中のＤＮＡ増幅産物を容易に回収可能である、新しい技術の提案・開発が切望されている。

迅速かつ簡便な核酸増幅法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）などＤＮＡ合成酵素を用いたＤＮＡ増幅法が考えられるが、従来のＰＣＲ法等の核酸の増幅技術では、反応系外から偶然に混入した標的ＤＮＡとは異なる微量のＤＮＡ、又は、プライマー等に由来した非特異的ＤＮＡ増幅、といった問題点があったため、数分子レベルの極微量ＤＮＡの特異的かつ高感度の増幅は困難であった。一般に、ＰＣＲ法の場合、５０μＬの反応系での基質ＤＮＡ量は１ｎｇ（１０の７乗分子）のオーダーが必要であるとされ、検出限界値は１０ｐｇ（１０の５乗分子）のオーダー程度といわれている。

１分子レベルからのＤＮＡ増幅における先行技術として、微量遺伝子の正確な定量を可能にするとされる、デジタルＰＣＲ法が提案されている。本法は、具体的には、タイタープレートのウェル内で核酸試料を１分子レベルまで限界希釈した後にＰＣＲを行い、蛍光検出によりＤＮＡ増幅産物の絶対量を評価する技術である（非特許文献１）。更に近年では、微小液滴（エマルジョン）を利用したデジタルＰＣＲ装置の開発が進展している（非特許文献２）。
しかしながら、前記デジタルＰＣＲ法によっても、反応系外から偶然に混入した標的ＤＮＡとは異なる微量のＤＮＡ、又は、プライマー等に由来した非特異的ＤＮＡ増幅の問題が指摘されている。また、本法は元来、主として、遺伝子の発現量を評価するための技術であり、液滴などからＤＮＡ増幅産物を容易に回収する技術は確立されていない。

一方、従来から、ＭＣＭ、ＳＢＡ、ＦＳＭ型などのシリカ系ナノ空孔材料の細孔内部に蛋白質を吸着させ、活性を保持させる人工的な蛋白質複合体に関するタンパク質固定化技術を酵素に適用して、酵素をこれらシリカ系ナノ空孔材料の細孔内部に固定化し、基質と反応させる方法が知られていた（特許文献１、２、非特許文献３）。本発明者らは、最近、微量のＤＮＡを選択的に増幅するために、当該シリカ系ナノ空孔材料を用い、ＤＮＡ合成酵素をシリカ系ナノ空孔材料に固定化して複合体化したＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を製造し、標的の微量ＤＮＡを増幅する方法を開発し、特許出願した（特許文献３、非特許文献４）。しかし、当該手法を用いることで、１ｎｇレベルの微量ＤＮＡの増幅までは選択的に行えることが確認できたが、さらに極微量のＤＮＡ試料に適用することは困難であった。

また、ＤＮＡ合成酵素の固定化に関する従来技術としては、他に、多孔性チタニア膜や金表面処理ガラス基板などにＤＮＡ合成酵素を固定化し、酵素活性を高効率に発現させることなどの特徴を有する固定化酵素の開発が行われている（非特許文献５、６、７）が、当該技術を、微量ＤＮＡを対象としたＤＮＡ増幅反応に適用した報告例は存在しない。

そのため、従来のＤＮＡ合成酵素を用いたＤＮＡ増幅法において、さらにＤＮＡ増幅反応中の副反応を極力抑制し、かつＤＮＡ増幅反応環境を至適化する技術を開発することで、ＤＮＡ増幅反応の特異性及び感度を高め、数分子レベルの極微量ＤＮＡにも適用できる高精度のＤＮＡ増幅法の提供が強く要請されていた。

ところで、近年、特に特異性が重要視される診断技術などの分野で、等温で鎖置換活性を有するＤＮＡ合成酵素の一種類のみで増幅反応させるＬＡＭＰ法が、核酸の迅速、簡易、精確な増幅・検出方法として注目されている（非特許文献８）。
しかし、ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲ法と比較してより深刻な鋳型汚染（コンタミネーション）によって、陰性コントロール実験における非特異的ＤＮＡ増幅が起こる場合が多々あり、増幅された標的遺伝子配列の有無の正確な判定が困難となる場合がある（非特許文献９）。
そのため、ＬＡＭＰ法によるＤＮＡ増幅反応において、コンタミネーションによる副反応を抑制し、かつＤＮＡ増幅反応環境を至適化するための技術開発が切望されていた。

特許第４７８５１７４号公報 特開２０００−１３９４５９号公報 特開２０１４−１０３９２４号公報（平成２６年６月９日公開） 特許第４９６３１１７号公報

Ｂ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９６，ｐｐ．９２３６−９２４１（１９９９） Ｍ．Ｂａｋｅｒ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．９，ｐｐ．５４１−５４４（２０１２） 豊田研究所Ｒ＆Ｄレビュー Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．２（２００１．６）第５７−６２ 松浦俊一ら、ナノ空孔反応場を利用した高効率ＤＮＡ増幅システムの構築、分子生物学会講演要旨集（２０１２年１２月１１日） Ｍ．Ｇ．Ｂｅｌｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ，ｖｏｌ．６，ｐｐ．１２２１−１２２５（２０１２） Ｇ．Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．４１９，ｐｐ．２０５−２１０（２０１１） Ｇ．Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．４３２，ｐｐ．１３９−１４１（２０１３） ウイルス Ｖｏｌ．５４，Ｎｏ．１，ｐｐ．１０７−１１２（２００４） モダンメディア Ｖｏｌ．５４，Ｎｏ．１０，ｐｐ．２８３−３０１（２００８） 豊田研究所Ｒ＆Ｄレビュー Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．２（１９９４．６）第１１−２２頁 Ｔ．Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，ｖｏｌ．１９，ｐｐ．５１１−５２７（２００９） Ｓ．Ｉｎａｇａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，ｐｐ．６８０−６８２（１９９３） Ｄ．Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２７９，ｐｐ．５４８−５５２（１９９８） Ｎ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ Ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ Ｍａｔｅｒ．，ｖｏｌ．９１，ｐｐ．１５６−１６０（２００６）

本発明は、本発明者らが以前に開発したＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いた微量ＤＮＡを増幅させる手法（特許文献３、非特許文献４）を改良して、より極微量の基質ＤＮＡを標的として、高精度に増幅させる手法を提供するものである。具体的には、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体のＤＮＡ合成反応環境を整え、ＤＮＡ増幅反応中にＤＮＡ合成酵素と相互作用する各種反応基質（ＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰｓ）に影響を与えることなく、過剰量のプライマーなどに起因する非特異的ＤＮＡ増幅反応を極力抑制し、酵素周辺における前記の反応基質濃度の至適化を極限まで高める極微量ＤＮＡ増幅に適用可能なＤＮＡ増幅方法、及び当該方法に用いる、改良されたＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造方法を提供することにある。
また、ＬＡＭＰ法におけるコンタミネーションを防ぎ、かつより効率的に高精度なＤＮＡ増幅反応を行わせるための技術を提供することも目的とする。

本発明者らは、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いた微量ＤＮＡの増幅方法（特許文献３、非特許文献４）のＤＮＡ増幅反応中の副反応を抑制するために、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体から、固定化操作などで混入したＤＮＡ夾雑物などを、緩衝液による洗浄工程によって除去しようと想起した。その際、一般の固定化酵素の洗浄法に従えば、通常のリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液などの緩衝液を用いることになるが、本発明者らは、ＤＮＡ増幅反応においてＤＮＡ合成酵素の安定化及びプラスチック容器内壁への付着防止等を促すことで知られている、血清アルブミンによる酵素の安定化とシリカ系ナノ空孔材料の規則性細孔表面へのＤＮＡ吸着抑制効果を期待して、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有させた緩衝液を用いることを思いついた。しかし、ＢＳＡは、確かに酵素の安定化とＤＮＡ吸着抑制効果も高いが、シリカ系ナノ空孔材料の疎水性表面へ吸着してしまう特性のために、せっかくシリカ系ナノ空孔材料に吸着させたＤＮＡ合成酵素までをも競合吸着によって系外に排除してしまうことが懸念される。そればかりか、ＢＳＡ精製品に含まれている微量の核酸に由来した非特異的ＤＮＡ増幅が、数分子レベルの極微量ＤＮＡの選択的な増幅を阻害する可能性もあった。

そのような重大な懸念材料があったにもかかわらず、本発明者らはあえて、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体に対して、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有させた緩衝液による洗浄工程を行い、回収してＤＮＡ増幅反応に供してみたところ、驚くべきことに、副反応が抑制され、かつ増幅反応の効率も高まる、という実験結果を得ることができた。
そこで、さらに増幅反応の精度を高めるために、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体とＢＳＡとの複合体化を促進すべく、ＤＮＡ合成酵素のシリカ系ナノ空孔材料への固定化操作時においても、積極的にＢＳＡ含有緩衝液中での固定化を行った。また、固定化後のＢＳＡ含有緩衝液による洗浄及び回収工程を複数回繰り返した。このように、確実に「ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体」を形成させた後に、典型的なＰＣＲ法による基質ＤＮＡの増幅反応を行ったところ、ｐｇレベル、さらには数分子レベルという極微量の基質ＤＮＡの場合も特異的で感度の良い増幅に成功した。
基質ＤＮＡとして、１００塩基対の二本鎖及び一本鎖の直鎖ＤＮＡと共に、環状プラスミドＤＮＡ（Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０）に挿入した４種類の長鎖ＤＮＡ（６１６、１２７２、２５６６、５０２７塩基対）を用いてＤＮＡ増幅実験を行ったところ、これらの特異的、高感度のＤＮＡ増幅効果は、基質ＤＮＡが環状でも一本鎖もしくは二本鎖の直鎖ＤＮＡでも、短鎖でも長鎖ＤＮＡであっても変わらない。さらに、反応系中に標的の基質ＤＮＡと共にバックグラウンドＤＮＡを混入させた状態での極微量ＤＮＡの選択的な増幅にも成功した。
また、シリカ系ナノ空孔材料のＦＳＭ、ＳＢＡ、及びＳＢＡ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅのそれぞれについての好ましい細孔径の範囲を見いだした。あわせて、各シリカ系ナノ空孔材料の種類に応じたＢＳＡ含有洗浄液中に含有される塩の最適な組成を検討し、シリカ系ナノ空孔材料ごとに、反応系中のバックグラウンドＤＮＡの反応系外への排除能の高い最適な塩組成を確定することができた。

本発明者らは、以前、リパーゼをシリカ系ナノ空孔材料に固定化してマイクロ流体デバイスに担持させたマイクロリアクターを開発した（特許文献４）。当該リパーゼ−シリカ系ナノ空孔材料複合体担持マイクロリアクターの系では、酵素反応生成物が速やかに系外に排出されるので、副反応も抑えられ反応効率が高まる。その上、当該マイクロリアクターは繰り返し使用が可能となる。
本発明者らは、ＬＡＭＰ法によるＤＮＡ増幅法におけるコンタミネーション抑制のために、このマイクロリアクター技術を適用することを着想した。そこで、ＬＡＭＰ法用のＤＮＡ合成酵素（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）を、シリカ系ナノ空孔材料を担持したマイクロ流体デバイスに固定化して、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体担持マイクロリアクターを調製した。
具体的には、シリカ系ナノ空孔材料を担持したマイクロ流路内部に、ＬＡＭＰ法用のＤＮＡ合成酵素と共に標的ＤＮＡと蛍光試薬を含む緩衝液を充填してＤＮＡ合成酵素を固定化した。マイクロ流路内部を６５℃に加温して、標的鋳型ＤＮＡ及びプライマーセットを含むＬＡＭＰ法試薬反応液を連続的に送液し、ＤＮＡ増幅産物含有溶液を２５μＬずつ９回回収したところ、増幅反応中のコンタミネーションを抑制することができ、かつ標的ＤＮＡの増幅感度を向上できた。そして、９回目の回収溶液でもＤＮＡ増幅効果の低下は見られなかった。これはマイクロ流路内の酵素複合体にとっては、連続して９回分の新たな試薬反応液と接触し相互作用を行ったことであり、酵素複合体の９回繰り返し使用ということもできる。すなわち前記マイクロリアクターに適用したＬＡＭＰ法用酵素複合体は９回もの繰り返し使用によっても、その増幅効果が低下しないという優れた性能を確認した。

以上のように、本発明は、ＤＮＡ合成酵素を当該シリカ系ナノ空孔材料担体に固定化する際に、ＢＳＡ含有溶液中での固定化を行い、次いで、ＢＳＡ含有洗浄液により１回以上の洗浄工程及び遠心分離による回収工程を施すことにより、シリカ系ナノ空孔材料担体と結合するＤＮＡ合成酵素に対して積極的にＢＳＡとの複合体を形成させるというＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造方法を提供する。そのことにより、ＤＮＡ増幅反応中での副反応を極力抑え、かつＤＮＡ増幅反応の特異性及び感度を高めることができたことで、はじめて数分子レベルという極微量のＤＮＡ試料を、特異的かつ高感度に増幅させることに成功した。
また、ＤＮＡ合成酵素と相互作用させるシリカ系ナノ空孔材料をその種類に合わせた最適な細孔サイズに調製して、ＤＮＡ酵素周辺環境を整えることで、特異性及び感度が高められることを見いだし、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造工程においてＢＳＡ含有洗浄液として用いる緩衝液における最適な塩組成を確定することができた。

さらに、ＬＡＭＰ法用のＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を担持させたマイクロリアクターを用いることで、コンタミネーションによるＤＮＡ増幅反応中の副反応を極力抑制でき、かつ至適ＤＮＡ増幅反応条件を設定することで、ＤＮＡ増幅反応の特異性及び感度を高めることができるようになった。また、当該マイクロリアクターに担持された複合体は複数回繰り返し使用しても、感度が低下しないという優れた性能を発揮することも見いだされた。
以上の知見を得たことで、本発明を完成した。

すなわち、上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
〔１〕 ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造方法であって、
（１）シリカ系ナノ空孔材料に対してＤＮＡ合成酵素を含む緩衝液を接触させ、シリカ細孔内にＤＮＡ合成酵素を吸着させる工程、
（２）得られた沈殿物を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む緩衝溶液に１回以上再懸濁し、遠心分離により回収する工程を設けることを特徴とする、製造方法。
〔２〕 工程（１）で用いる緩衝液が、ＢＳＡを含む緩衝溶液である、前記〔１〕に記載の製造方法。
〔３〕 シリカ系ナノ空孔材料が、ＦＳＭ、ＳＢＡ、及びＳＢＡ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅのいずれかから選択される、前記〔１〕又は〔２〕に記載の製造方法。
〔４〕 選択されたＦＳＭの中心細孔直径が２〜４ｎｍであるか、選択されたＳＢＡの中心細孔直径が４〜９ｎｍであるか、又は選択されたＳＢＡ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅの中心細孔直径が１０〜２０ｎｍである、前記〔３〕に記載の製造方法。
〔５〕 シリカ系ナノ空孔材料がＦＳＭであって、少なくとも工程（２）で用いるＢＳＡを含む緩衝溶液が、さらにマグネシウム塩及び界面活性剤を含有している、前記〔３〕又は〔４〕に記載の製造方法。
〔６〕 工程（１）で用いるＤＮＡ合成酵素を含む緩衝液が、ＢＳＡと共に、マグネシウム塩及び界面活性剤を含有している緩衝液である前記〔５〕に記載の製造方法。
〔７〕 シリカ系ナノ空孔材料がＳＢＡ又はＳＢＡ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅであって、少なくとも工程（２）で用いるＢＳＡを含む緩衝溶液が、マグネシウム塩を含有せず、界面活性剤を含有している、前記〔３〕又は〔４〕に記載の製造方法。
〔８〕 工程（１）で用いるＤＮＡ合成酵素を含む緩衝液が、ＢＳＡを含み、かつマグネシウム塩を含有せず、界面活性剤を含有している緩衝液である前記〔７〕に記載の製造方法。
〔９〕 前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の製造方法によって製造されたＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体。
〔１０〕 標的ＤＮＡを、ＢＳＡを含有する緩衝液内で、標的ＤＮＡの増幅用プライマー及びｄＮＴＰｓと共に、前記〔９〕に記載のＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体を作用させることで増幅させることを特徴とする、標的ＤＮＡの増幅方法。
〔１１〕 被検試料中の標的ＤＮＡの検出又は同定する方法であって、下記の（１）〜（３）からなる方法；
（１）被検試料をＢＳＡを含有する緩衝液で希釈する工程、
（２）前記〔９〕に記載のＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体を標的ＤＮＡの増幅用プライマー及びｄＮＴＰｓと共に作用させて、標的ＤＮＡを増幅する工程、
（３）標的ＤＮＡを検出する工程。
〔１２〕 被検試料中の標的ＤＮＡの含有量が、０．０１ｆｇ／ｍｌ〜１．０μｇ／ｍｌである、前記〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕 ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体がマイクロ流路内部に担持されたマイクロリアクターであって、
前記ＤＮＡ合成酵素が、ＬＡＭＰ法によるＤＮＡ増幅反応に用いるためのＤＮＡ合成酵素であり、かつ当該酵素がシリカ系ナノ空孔材料の細孔内部に固定化されてＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を形成していることを特徴とするマイクロリアクター。
〔１４〕 マイクロ流路内部に担持された前記ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体に対してさらにＢＳＡが吸着されており、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体を形成していることを特徴とする前記〔１３〕に記載のマイクロリアクター。
〔１５〕 シリカ系ナノ空孔材料が、ＦＳＭ、ＳＢＡ、及びＳＢＡ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅのいずれかから選択される、前記〔１３〕又は〔１４〕に記載のマイクロリアクター。
〔１６〕 ＬＡＭＰ法を用いた核酸の増幅方法であって、下記の（１）〜（５）の工程を含む方法；
（１）前記〔１３〕又は〔１４〕に記載のマイクロリアクターのマイクロ流路内を緩衝液で洗浄する工程、
（２）流路内部が６５℃になるように加温する工程、
（３）標的核酸を含むか又は含む可能性のある核酸試料及び標的核酸増幅用プライマーセットを含む反応溶液を送液する工程、
（４）流路内部で標的核酸を等温核酸増幅させる工程、
（５）得られた核酸増幅産物を含有する溶液を順次連続的に回収する工程。
〔１７〕 核酸増幅産物を回収後、さらに（１）〜（５）の工程を繰り返す、前記〔１６〕に記載の方法。

本発明は、ＤＮＡ合成酵素を当該シリカ系ナノ空孔材料担体に固定化する際、及び／又は洗浄工程において、ＢＳＡを含有させた緩衝液を積極的に使用することで、シリカ系ナノ空孔材料担体と結合するＤＮＡ合成酵素に対して積極的にＢＳＡとの複合体を形成させ、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体を提供するものである。そのことにより、ＤＮＡ増幅反応中での副反応を極力抑え、かつＤＮＡ増幅反応の特異性及び感度を高めることができ、はじめて数分子レベルという極微量のＤＮＡ試料を、特異的かつ高感度に増幅させることに成功した。これらの特異的、高感度のＤＮＡ増幅効果は、基質ＤＮＡが環状でも一本鎖もしくは二本鎖の直鎖ＤＮＡでも、短鎖でも長鎖ＤＮＡであっても変わらず、かつ反応系中にバックグラウンドＤＮＡが混入していても選択的な増幅が可能であることを実証した。
また、ＤＮＡ合成酵素と相互作用させるシリカ系ナノ空孔材料の種類ごとに、ＤＮＡ増幅反応の特異性及び感度を高めるための最適な細孔サイズ、ＢＳＡ含有洗浄液中の最適な塩組成を確定することができた。
また、ＬＡＭＰ法用のＤＮＡ合成酵素を、シリカ系ナノ空孔材料複合体を担持させたマイクロリアクターに固定化して用いることで、ＬＡＭＰ法におけるコンタミネーションによるＤＮＡ増幅反応中の副反応を極力抑制でき、ＤＮＡ増幅反応の特異性及び感度を高めることができた。しかも当該マイクロリアクターに担持された複合体は複数回繰り返し使用しても、ＬＡＭＰ法によるＤＮＡ増幅能が低下しないという優れた性能を発揮する。

シリカ系ナノ空孔材料（メソポーラスシリカ）の規則性細孔（シリカ細孔）表面への反応基質ＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰｓの吸着抑制により、シリカ細孔に固定化したＤＮＡ合成酵素及びＢＳＡを備えたＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体と適量の反応基質（ＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰｓ）が相互作用し、更に、酵素反応環境の至適化により非特異的ＤＮＡ増幅を抑制できるようになった結果、微量ＤＮＡが特異的かつ高感度に増幅される様子を模式的に示す説明図である。 ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体の調製方法及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）の開始までの手順を模式的に示す説明図である。 遊離のＤＮＡ合成酵素及び７種類のシリカ系ナノ空孔材料に固定化したＤＮＡ合成酵素を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）後のＤＮＡ増幅産物（分子サイズ：１００塩基対）をポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析し、酵素活性を評価した結果である。図中、（ａ）は、１００塩基対の二本鎖ＤＮＡを基質ＤＮＡとした用いた場合、また、（ｂ）は、１００塩基の一本鎖ＤＮＡを基質ＤＮＡとした用いた場合、である。 反応溶液５０μＬ中の基質ＤＮＡ（１００塩基対の二本鎖ＤＮＡ）量を５ｎｇから０．０５ｆｇの範囲で段階的に希釈し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を実施した後にＤＮＡ増幅産物（分子サイズ：１００塩基対）をポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析し、酵素活性を評価した結果である。図中、（ａ）は、遊離のＤＮＡ合成酵素を利用した場合、また、（ｂ）は、ＤＮＡ合成酵素−ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（細孔径：２．６ｎｍ）複合体を利用した場合、である。 １００塩基対の二本鎖ＤＮＡ（５ｆｇ）を基質ＤＮＡとした、異なるサイクル数でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を実施した後にＤＮＡ増幅産物（分子サイズ：１００塩基対）をポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析し、酵素活性を評価した結果である。図中、（ａ）は、遊離のＤＮＡ合成酵素及びＤＮＡ合成酵素−ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（細孔径：２．６ｎｍ）複合体を用いた場合、また、（ｂ）は、基質ＤＮＡのみを含まない遊離のＤＮＡ合成酵素反応溶液を用いた場合、である。 環状プラスミドＤＮＡ（Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０、２７３６塩基対）に挿入した４種類の長鎖ＤＮＡ（６１６、１２７２、２５６６、５０２７塩基対）を遊離のＤＮＡ合成酵素を用いて増幅し、各々のＤＮＡ増幅産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果である。 ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）後のＤＮＡ増幅産物をアガロースゲル電気泳動で解析し、酵素活性を評価した結果である。図中、（ａ）−（ｄ）は、環状プラスミドＤＮＡ（Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０、２７３６塩基対）に挿入した４種類の長鎖ＤＮＡ（６１６、１２７２、２５６６、５０２７塩基対）を対象に増幅した場合、（ａ）：約８００塩基対、（ｂ）：約１５００塩基対、（ｃ）：約２８００塩基対、（ｄ）：約５２００塩基対、の場合である。また、図中、（ｅ）は、（ａ）−（ｄ）におけるＤＮＡ増幅効率の違いを示す図である。 反応溶液５０μＬ中の基質ＤＮＡ（６１６塩基対のＤＮＡが挿入された環状プラスミドＤＮＡ（Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０））量を１ｎｇから０．０１ｆｇの範囲で段階的に希釈し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を実施した後にＤＮＡ増幅産物（分子サイズ：約８００塩基対）をアガロースゲル電気泳動で解析し、酵素活性を評価した結果である。図中、（ａ）は、遊離のＤＮＡ合成酵素を利用した場合、また、（ｂ）は、ＤＮＡ合成酵素−ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（細孔径：２．６ｎｍ）複合体を利用した場合、である。 ６１６塩基対のＤＮＡが挿入された環状プラスミドＤＮＡ（Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０、０．０１ｆｇ）を基質ＤＮＡとした、遊離のＤＮＡ合成酵素及び７種類のシリカ系ナノ空孔材料に固定化したＤＮＡ合成酵素を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を実施した後にＤＮＡ増幅産物（分子サイズ：約８００塩基対）をアガロースゲル電気泳動で解析し、酵素活性を評価した結果である。 ＤＮＡ合成酵素（１ｕｎｉｔ）を含んだ、反応組成の異なる８種類のＰＣＲ用緩衝溶液を用いて、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体前駆体を得、次に、バックグラウンドＤＮＡとして、６１６塩基対のＤＮＡが挿入された環状プラスミドＤＮＡ（３３５４塩基対、１ｎｇ）を添加し、続いて、同ＰＣＲ用緩衝溶液１００μＬを用いて前記複合体を洗浄した後、１２７２塩基対のＤＮＡが挿入された標的となる環状プラスミドＤＮＡ（４０１０塩基対、１ｎｇ）を含んだ前記ＰＣＲ用緩衝溶液５０μＬを添加することによってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を実施した後にＤＮＡ増幅産物（分子サイズ：約１５００塩基対）をアガロースゲル電気泳動で解析し、酵素活性を評価した結果である。図中、（ａ）は、ＦＳＭ−２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）に固定化したＤＮＡ合成酵素の場合、（ｂ）は、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）に固定化したＤＮＡ合成酵素の場合、である。 ６１６塩基対のＤＮＡが挿入された環状プラスミドＤＮＡ（３３５４塩基対、０．１ｐｇ）をバックグラウンドＤＮＡとして含んだＤＮＡ合成酵素（１ｕｎｉｔ）を含んだ、反応組成の異なる８種類のＰＣＲ用緩衝溶液を用いて、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体前駆体を得、続いて、同ＰＣＲ用緩衝溶液１００μＬを用いて前記複合体を洗浄した後、１２７２塩基対のＤＮＡが挿入された標的となる環状プラスミドＤＮＡ（４０１０塩基対、０．１ｐｇ）を含んだ前記ＰＣＲ用緩衝溶液５０μＬを添加することによってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を実施した後にＤＮＡ増幅産物（分子サイズ：約１５００塩基対）をアガロースゲル電気泳動で解析し、酵素活性を評価した結果である。図中、（ａ）は、ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）に固定化したＤＮＡ合成酵素の場合、（ｂ）は、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）に固定化したＤＮＡ合成酵素の場合、また、（ｃ）は、ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）に固定化したＤＮＡ合成酵素の場合、である。 ＤＮＡ合成酵素−ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）複合体をガラス製流路に担持したマイクロ流体デバイスを示す説明図である。図中、（ａ）は、マイクロ流体デバイスの上面図及びマイクロ流路の寸法を示す図であり、（ｂ）は、該マイクロ流体デバイスを上面から見た時の写真であり、また、（ｃ）は、マイクロ流路を加温した場合の赤外線サーモグラフ画像、である。 コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）ゲノムＤＮＡを基質ＤＮＡとした、遊離のＤＮＡ合成酵素及びＤＮＡ合成酵素−ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）複合体を用いた等温ＤＮＡ増幅（ＬＡＭＰ法）を実施した後に、蛍光標識されたＤＮＡ増幅産物の蛍光強度を測定し、酵素活性を評価した結果である。図中、（ａ）は、バッチ式反応にて、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）に固定化したＤＮＡ合成酵素を繰り返し使用した場合、また、（ｂ）は、ＤＮＡ合成酵素−ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）複合体を流路に担持したマイクロ流体デバイスを用いて、流通式の連続反応を行った場合、である。 ＢＳＡを０．００１％含有する反応溶液５０μＬ中の基質ＤＮＡ（１２７２塩基対のＤＮＡが挿入された環状プラスミドＤＮＡ（Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０））量を１ｎｇから０．０１ｆｇの範囲で段階的に希釈し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を実施した後にＤＮＡ増幅産物（分子サイズ：約１５００塩基対）をアガロースゲル電気泳動で解析し、酵素活性を評価した結果である。図中、（ａ）は、遊離のＤＮＡ合成酵素を利用した場合、また、（ｂ）は、ＤＮＡ合成酵素−ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（細孔径：２．６ｎｍ）複合体を利用した場合、である。 １２７２塩基対のＤＮＡが挿入された環状プラスミドＤＮＡ（Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０、０．１ｆｇ）を基質ＤＮＡとした、遊離のＤＮＡ合成酵素及び７種類のシリカ系ナノ空孔材料に固定化したＤＮＡ合成酵素を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を実施した後にＤＮＡ増幅産物（分子サイズ：約１５００塩基対）をアガロースゲル電気泳動で解析し、酵素活性を評価した結果である。 ６１６塩基対のＤＮＡが挿入された環状プラスミドＤＮＡ（３３５４塩基対、０．１ｆｇ）をバックグラウンドＤＮＡとして含んだＤＮＡ合成酵素（１ｕｎｉｔ）を含んだ、反応組成の異なる４種類のＰＣＲ用緩衝溶液（図１１のレーン(1)、(3)、(5)、(7)の反応組成）を用いて、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体前駆体を得、続いて、同ＰＣＲ用緩衝溶液１００μＬを用いて前記複合体を洗浄した後、１２７２塩基対のＤＮＡが挿入された標的となる環状プラスミドＤＮＡ（４０１０塩基対、０．１ｆｇ）を含んだ前記ＰＣＲ用緩衝溶液５０μＬを添加することによってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を実施した後にＤＮＡ増幅産物（分子サイズ：約１５００塩基対）をアガロースゲル電気泳動で解析し、酵素活性を評価した結果である。図中、（ａ）は、電気泳動像、また、（ｂ）は、バックグラウンドＤＮＡと標的ＤＮＡの増幅の有無を＋、−で表示し、図１１の実験結果と共にまとめた表、である。

１．本発明において用いる「シリカ系ナノ空孔材料」について
（１−１）シリカ系ナノ空孔材料（メソポーラスシリカ）の種類
本発明で固定化酵素担体として用いるシリカ系ナノ空孔材料（メソポーラスシリカ）は、二酸化ケイ素（シリカ）を材質とする、均一な細孔を持つ多孔質材料であって、細孔の中心細孔直径が２〜５０ｎｍ（メソ孔：ＩＵＰＡＣ）であり、一般的には、全細孔容積が０．１〜２．０ｍｌ／ｇで、比表面積が２００〜１５００ｍ^２／ｇである（非特許文献１２など）。メソポーラスシリカ内の細孔を規則的に形成させるための一般的合成方法には、(ａ)液晶の鋳型法と（ｂ）シート変形法の２種類あり、（ａ）では、界面活性剤をシリカ又はケイ酸ソーダと混和して縮合による自己組織化させ、焼成により界面活性剤を除去するのに対して、（ｂ）では界面活性剤を層状のカネマイト（ＮａＨＳｉ_２Ｏ_３・３Ｈ_２Ｏ）に添加してイオン交換によりシート変形を起こさせてハニカム構造を形成させ界面活性剤を焼成除去する方法（非特許文献１１）がある。（ａ）の方法で得られる典型的なものとして、「ＭＣＭ（ＭＣＭ−４１など）」、「ＳＢＡ（ＳＢＡ−１５）」などがあり、（ｂ）の方法で得られる典型的なものとして、「ＦＳＭ（ＦＳＭ−１６など）」などがある。両法で得られる「シリカ系ナノ空孔材料」は、いずれも通常ハニカム構造の「ヘキサゴナル」型結晶構造を有している。（ａ）の方法で得られる「ＭＣＭ」及び「ＳＢＡ」などでは、「キュービック」型の結晶構造を採ることもある。
本発明において用いられる「シリカ系ナノ空孔材料」は、上記いずれかの手法で合成された規則的な細孔構造を有する「シリカ系ナノ空孔材料」であり、より好ましくは、「ＦＳＭ」「ＳＢＡ」又は「ＭＣＭ」であり、特に好ましくは「ＦＳＭ」、「ＳＢＡ」又は「ＳＢＡ」の合成過程で界面活性剤と共に膨張剤を混和して細孔径を拡大させた「ＳＢＡ−ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ」である。

（１−２）本発明で用いたシリカ系ナノ空孔材料の合成方法
本発明の実施例では、典型的な規則的な細孔構造を有する「シリカ系ナノ空孔材料」のうち、上記（ｂ）のタイプの典型的な「ＦＳＭ（ＦＳＭ−１６、２２）」及び上記（ａ）のタイプの典型的な「ＳＢＡ（ＳＢＡ−１５）」と共に、細孔径を拡大させた「ＳＢＡ（ＳＢＡ−１５） ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ」を用い、「ＦＳＭ」は、稲垣らの方法（非特許文献１２）、「ＳＢＡ」は、Ｚｈａｏらの方法（非特許文献１３）、「ＳＢＡ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ」は、Ｗａｎｇらの方法（非特許文献１４）の記載をそれぞれ参考にして合成した。
具体的には、「ＦＳＭ」は、カチオン性界面活性剤を鋳型として用い、層状ケイ酸塩であるカネマイトをシリカ源とした、弱アルカリ性溶液でのシリカの脱水重縮合反応を行い、焼成により界面活性剤を除去する方法により得、「ＳＢＡ（ＳＢＡ−１５）」は、非イオン性界面活性剤を鋳型として用い、オルトケイ酸テトラエチルをシリカ源とした、酸性溶液でのシリカの脱水重縮合反応を行い、焼成により界面活性剤を除去する方法により得、また、「ＳＢＡ（ＳＢＡ−１５） ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ」は、非イオン性界面活性剤を鋳型として用い、オルトケイ酸テトラエチルをシリカ源とした膨張剤（メシチレン）存在下及び酸性溶液でのシリカの脱水重縮合反応を行い、焼成により界面活性剤を除去する方法により得た。

（１−３）シリカ系ナノ空孔材料の細孔径について
シリカ系ナノ空孔材料の一般的な細孔径は、中心細孔直径で２〜５０ｎｍ（メソ孔）である。そのうち、好ましい細孔径の数値範囲はそれぞれで異なっており、例えば、ＦＳＭの場合、中心細孔直径は２〜４ｎｍ、好ましくは２〜３ｎｍの範囲であり、特にＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）が好適である。ＳＢＡの場合は、中心細孔直径は４〜１１ｎｍ、好ましくは４〜９ｎｍ、より好ましくは５〜８ｎｍの範囲であり、特にＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）及びＳＢＡ−１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ）が好適である。ＳＢＡ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅの場合は、中心細孔直径は１０〜２０ｎｍ、好ましくは１３〜１９ｎｍ、より好ましくは１５〜１９ｎｍの範囲であり、特にＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）が好適である。

２．本発明の「ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料」複合体の製造方法
次に、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料と共にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を備える、本発明のＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造について説明する。

（２−１）ＤＮＡ合成酵素のシリカ系ナノ空孔材料への固定化
本発明において、ＤＮＡ合成酵素のシリカ系ナノ空孔材料への固定化方法は、通常の酵素固定化方法が適用でき、ＤＮＡ合成酵素及び緩衝溶液を、シリカ系ナノ空孔材料粉末とを混合することで、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の前駆体を沈殿物として得ることができる。その際、本発明においては、固定化用の緩衝液として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有させた緩衝液を用いることが好ましい。例えば、ＤＮＡ合成酵素を、ＢＳＡを０．００１％含んだ緩衝溶液５０μＬ中に溶解又は懸濁させた後、シリカ系ナノ空孔材料の粉末０．５ｍｇと混合して１秒程度室温で攪拌し、５〜１０分間氷上で静置した後、５秒程度室温で攪拌し、遠心分離を行うことにより、沈殿物として、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の前駆体を得ることができる。
固定化用の緩衝液として用いるＢＳＡ含有緩衝液は、ＢＳＡが０．０００１〜０．１質量％、好ましくは０．００１〜０．０１質量％配合されている緩衝液が好ましく、固定化後の沈殿物に対して行う洗浄工程で用いるＢＳＡ含有洗浄用緩衝液と同一の組成であることがより好ましい。また、ＤＮＡ増幅工程で用いる反応媒体用のＢＳＡ含有緩衝液と同一の組成であってもよい。
そのような緩衝液は、一般的なリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液など無機塩緩衝液、又はトリス塩酸緩衝液などの有機物含有緩衝液、生理食塩水に、ＢＳＡを０．０００１〜０．１質量％、好ましくは０．００１〜０．０１質量％配合することで調製できる。また、市販のＤＮＡ合成用反応液（東洋紡社製など）として市販されているＢＳＡ含有緩衝液を利用して用いることもできる。特に、シリカ系ナノ空孔材料としてＦＳＭを用いる場合には、塩化マグネシウムなどのマグネシウム塩及び界面活性剤が存在していることが好ましいので、ＤＮＡ増幅開始のために必須のマグネシウム塩及び界面活性剤が含まれている市販ＤＮＡ合成用反応液をそのまま用いることができる。しかし、シリカ系ナノ空孔材料としてＳＢＡ又はＳＢＡ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅを用いる場合には、界面活性剤は含まれている方がよいが、マグネシウム塩を含有していない方が良いため、市販ＤＮＡ合成用反応液は用いずに、ＢＳＡと共に必要な塩類を配合して調製することが好ましい。
ここで、本発明のＢＳＡ含有緩衝液中に配合される界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、Ｂｒｉｊ３５及びＴｗｅｅｎ２０など、エーテル型及びエステルエーテル型非イオン性界面活性剤が好ましく、特にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００が好ましく用いられる。配合割合としては、緩衝液全量に対して０．０１〜０．５質量％、好ましくは０．０５〜０．１質量％配合されることが好ましく、単独もしくは２種類の以上の界面活性剤を併用することができる。
なお、本発明では、最も入手しやすい血清アルブミンとしてＢＳＡを用いているが、様々な物質に対する吸着特性は、哺乳類由来のアルブミンであればほぼ同等の特性を示すことから、ＢＳＡに代えてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）など、他の哺乳類由来の血清アルブミンを用いることもできる。

（２−２）ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造
本発明においては、次いで、沈殿物として得られたＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の前駆体を、ＢＳＡを含んだ緩衝溶液で再懸濁する工程を含む洗浄処理を施し、上清を除去してＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体を製造する。当該洗浄工程は１回でも良いが、ＢＳＡの濃度が低い場合などは２回以上行うことが好ましい。例えば、ＢＳＡを０．００１％含有する緩衝溶液１００μＬで該沈殿物を再懸濁することにより洗浄を行い、遠心分離後に上清を完全に除去する。必要に応じ、これらの工程を繰り返す。

ここで、洗浄に用いるＢＳＡ含有緩衝液は、ＤＮＡ合成酵素をシリカ系ナノ空孔材料に固定化する際に用いるＢＳＡ含有緩衝液と、同一の組成であることが好ましいが、異なっていても良い。両者ともＤＮＡ合成酵素反応の際に用いるＢＳＡ含有反応液と同一組成の緩衝液を用いることもできる。
本発明の洗浄工程で用いるＢＳＡ含有緩衝液は、一般的なリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液など無機塩緩衝液、又はトリス塩酸緩衝液などの有機物含有緩衝液、生理食塩水に、ＢＳＡを０．０００１〜０．１質量％、好ましくは０．００１〜０．０１質量％又はさらに界面活性剤を０．０１〜０．５質量％、好ましくは０．０５〜０．１質量％配合することで調製できる。また、市販のＤＮＡ合成用反応液（東洋紡社製など）として市販されているＢＳＡ含有緩衝液を用いることもできるが、これら緩衝液中の最適な塩組成は、シリカ系ナノ空孔材料の種類によって異なるため、ＢＳＡと共に緩衝作用のある塩類を配合して調製することが好ましい。ここで、用いられる界面活性剤の種類及び好ましい配合割合は、（２−１）で述べたと同様である。
具体的には、ＦＳＭの場合は、ＢＳＡと共に界面活性剤の他、さらに塩化マグネシウムなどのマグネシウム塩が１〜５ｍＭ、好ましくは１〜３．５ｍＭ存在することが好ましいため、ＤＮＡ増幅用に市販されているＤＮＡ合成用反応液をそのまま用いることができる。例えば、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化カリウム、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ ＢＳＡ、１ｍＭ 塩化マグネシウムの組成の緩衝液を用いることができる。
一方、ＳＢＡの場合は、界面活性剤の配合は好ましいが、マグネシウム塩の存在は好ましくないため、ＢＳＡ及び他の緩衝液成分により調製することが好ましい。例えば、０．０００１〜０．１質量％、好ましくは０．００１〜０．０１質量％のＢＳＡ及び０．０１〜０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に対して、１０〜１５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７〜９）、２〜１０ｍＭの硫酸アンモニウム、５〜１５ｍＭの塩化カリウムなどの塩類を組み合わせて調製した緩衝液を用いることができる。
同様に、ＳＢＡ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅの場合もマグネシウム塩の存在は好ましくないため、ＳＢＡの場合と同様に、ＢＳＡ及び他の緩衝液成分により調製することが好ましい。

洗浄後の沈殿物は、１０００〜１５００Ｇ、２５秒間などの遠心分離処理を行い、上清と分離し、「ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体」として回収する。
必要に応じて、上記洗浄工程、及び遠心分離工程を繰り返す。

（２−３）本発明で用いるＤＮＡ合成酵素について
本発明において対象とするＤＮＡ増幅方法は、典型的には汎用的でかつ最も簡便なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）であるが、等温ＤＮＡ増幅法（ＬＡＭＰ法）、Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ法）、及びＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＭＤＡ法）などにも適用可能である。
したがって、本発明で用いることのできるＤＮＡ合成酵素としては、ＰＣＲ用の酵素に限定されるものではなく、任意のＤＮＡ配列、又は、特定の遺伝子配列を合成、増幅する能力を有する酵素であれば、その種類に制限されることなく、本発明を適用することが可能である。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）用のＤＮＡ合成酵素としては、本発明の実施例で用いた高耐熱性ＤＮＡ合成酵素であるＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの他、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。他に、ＭＤＡ法、ＲＣＡ法、ＬＡＭＰ法には、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼなどを用いることができる。

３．本発明における極微量ＤＮＡの増幅方法
本発明における「ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体」は、従来のＤＮＡ増幅方法（ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＲＣＡ法、又はＭＤＡ法など）で用いるＤＮＡ合成酵素に対してシリカ系ナノ空孔材料への特有な固定化処理により「ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体」の状態で固定化された「固定化ＤＮＡ合成酵素」であるといえるから、本発明の「ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体」は、通常の固定化ＤＮＡ合成酵素の場合と同様に、一般的なＤＮＡ増幅方法で用いるＤＮＡ合成酵素に適宜代替して用いることができる。
したがって、本発明のＤＮＡ増幅の増幅手段自体は、基本的には従来からのＤＮＡ増幅方法、特に固定化ＤＮＡ合成酵素を用いたＤＮＡ増幅方法での増幅手段をそのまま適用することができ、増幅の対象となる標的ＤＮＡの種類も同様である。
本発明における極微量ＤＮＡの増幅方法においては、ＤＮＡ増幅に際し、当該「ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体」を用い、かつＤＮＡ合成用反応液として、ＢＳＡ含有緩衝液を用いることを特徴としており、そのことにより標的ＤＮＡの量が極微量、特に被検試料中のＤＮＡ含有量が極微量の場合であっても副反応を抑制し、標的ＤＮＡを特異的、かつ高感度で増幅できる。
すなわち、本発明の対象とするＤＮＡ増幅方法は、ＰＣＲ法に限られるものではないが、以下の説明では、主に典型的なＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ法を用いた場合について、詳細に説明する。

（３−１）標的ＤＮＡについて
本発明における反応基質のＤＮＡとしては、その塩基長さが限定されるものではなく、また、環状及び直鎖状、又は、一本鎖及び二本鎖などの適宜のＤＮＡが適用可能である。
二本鎖ＤＮＡの場合、既知のＤＮＡ増幅用プラスミドのクローニングサイトに標的ＤＮＡを挿入してＰＣＲ増幅法を用いて増幅することが好ましい。
また、下記（３−３）において詳細に述べるが、本発明では数分子レベルの極微量の基質ＤＮＡであっても増幅可能であり、夾雑物の多い環境試料、血液など生体由来試料、病原微生物など細胞由来試料中の極微量の標的ＤＮＡの増幅も可能である。例えば、試料１ｍｌ中に０．０１ｆｇ〜０．１ｐｇ含まれている極微量ＤＮＡの増幅を対象とすることができ、この値は、環境試料、生体試料中の１ｍｌ中に１〜１０個レベルという極微量含まれる病原菌由来ＤＮＡが検出できることを意味する。
したがって、本発明の標的ＤＮＡというとき、一般的にＤＮＡ増幅の対象とする基質ＤＮＡの他、被検試料中に極微量含まれている検出又は同定の対象となるＤＮＡを指す。

（３−２）本発明における極微量ＤＮＡの増幅方法
本発明は、標的ＤＮＡ又は標的ＤＮＡを含む各種試料に対して、ＢＳＡを含有する緩衝液内で、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体と接触した状態でＤＮＡ増幅反応を行わせることを特徴とする。例えば、上記ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）は、上記ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体の沈殿物に、反応基質ＤＮＡ、２種類のプライマー、ｄＮＴＰｓ、ＢＳＡを含んだ酵素反応溶液５０μＬを添加した後、該沈殿物を再懸濁することによって開始させることができる。本発明では、前記の洗浄工程により、遺伝子組換えＤＮＡ合成酵素の精製品に含有されることがある宿主由来の夾雑ＤＮＡや、反応系外から偶然に混入した標的ＤＮＡとは異なる核酸が極力取り除かれているため、微量の標的ＤＮＡを特異的に増幅することができる。
ここで用いるＢＳＡを含んだ酵素反応溶液は、ＢＳＡを０．０００１〜０．１質量％含有していることが好ましく、より好ましくは０．００１〜０．０１質量％含有する。上述のごとく、洗浄液として用いたＢＳＡ含有緩衝液又は固定化に用いたＢＳＡ含有緩衝液と同一の組成の緩衝液を用いることができる場合があるが、ＤＮＡ増幅開始のために二価の陽イオンは必須なので、洗浄液でマグネシウム塩が配合されなかった場合でも、ここではマグネシウム塩を少なくとも１〜５ｍＭは配合する。ＤＮＡ増幅効率を考えれば、市販のＤＮＡ合成用反応液のうちでＢＳＡを含有している反応液がある（例えば東洋紡社製ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ用反応液）ので、このようなＢＳＡ含有反応液が、最もＤＮＡ増幅効率が高いと考えられ、本発明の反応液として好ましく用いることができる。
そのような調製例としては、０．０００１〜０．１質量％好ましくは０．００１〜０．０１質量％のＢＳＡと共に、塩化マグネシウムなどのマグネシウム塩が１〜５ｍＭ、好ましくは１〜３．５ｍＭ 及び０．０１〜０．５％などのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などの界面活性剤が存在することが好ましい。例えば、１０〜１５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７〜９）、２〜１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、５〜１５ｍＭ 塩化カリウム、０．０１〜０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．０００１〜０．１質量％、好ましくは０．００１〜０．０１質量％のＢＳＡ、５〜１５ｍＭの塩化マグネシウムなどが配合されたＢＳＡ含有緩衝液が例示できる。

（３−３）試料中の極微量ＤＮＡの検出及び同定方法
本発明の極微量ＤＮＡの増幅方法は、特異性及び感度の高い増幅が可能なため、血液生体試料中に混入しているウイルス、病原菌由来のＤＮＡ検出、環境試料中にわずかに含まれる標的ＤＮＡの検出、難培養性微生物の一細胞ゲノムＤＮＡ等を対象とした未知の塩基配列解析のためのＤＮＡ増幅、又、犯罪捜査などのＤＮＡ鑑定など多くの夾雑物中の極微量ＤＮＡの検出、同定においてきわめて有効である。
本発明における極微量ＤＮＡの検出及び同定方法において、対象とする被検試料中のＤＮＡ含有量は、１．０μｇ／ｍｌ以下であり、標的ＤＮＡの検出限界量は０．０１ｆｇ／ｍｌである。好ましくは０．０５ｆｇ／ｍｌ〜０．２μｇ／ｍｌであり、より好ましくは、０．１ｆｇ〜０．５ｐｇ／ｍｌ、特に好ましくは、０．２ｆｇ〜０．１ｐｇ／ｍｌである。
また、具体的な被検試料中の標的ＤＮＡの検出及び同定する方法は、以下の通りである。
（１）被検試料をＢＳＡを含有する緩衝液で希釈する工程、
被検試料をそのままＤＮＡ増幅工程に供することもできるが、ＢＳＡを含有する緩衝液で希釈することが好ましい。
ここで、ＢＳＡを含有する緩衝液としては、市販のＤＮＡ合成用反応液のうちのＢＳＡを含有している反応液（例えば東洋紡社製ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ用反応液）を用いることができる。市販ＤＮＡ合成用反応液をそのまま使用することが好ましい。または、０．０００１〜０．１質量％、好ましくは０．００１〜０．０１質量％のＢＳＡ及び０．０１〜０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に対して、ＤＮＡ増幅開始のためのマグネシウム塩１〜５ｍＭと共に、１０〜１５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７〜９）、２〜１０ｍＭの硫酸アンモニウム、５〜１５ｍＭの塩化カリウムなどの塩類を組み合わせて調製した緩衝液により希釈する。その際の希釈率は、１０分の１から１００分の１が好ましい。
（２）本発明の前述のＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体を標的ＤＮＡの増幅用プライマー及びｄＮＴＰｓと共に作用させて、標的ＤＮＡを増幅する工程、
具体的には、本発明のＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔複合体と共に、標的ＤＮＡ増幅用のプライマーＤＮＡ、ｄＮＴＰｓを、前記被検試料のＰＣＲ用緩衝溶液希釈液（例えば５０μＬ）に対して添加した後、Ｖｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒ等を用いて約５秒間室温で攪拌し、反応を開始させることができる。
（３）標的ＤＮＡを検出する工程
ここで、本発明のＤＮＡ増幅法を適用して、特異的に増幅されたＤＮＡが、標的ＤＮＡであることを確認するための方法としては、一般的なＤＮＡ同定方法が適用できるが、例えば以下の方法を例示することができる。
（ａ）配列特異的なプライマーＤＮＡを適用することにより得られる、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）及び等温ＤＮＡ増幅法（ＬＡＭＰ法）等における標的ＤＮＡの特異的増幅産物を電気泳動、濁度及び蛍光測定等で解析する方法
（ｂ）リアルタイムＰＣＲ法等において、ＤＮＡを染色するための蛍光物質にインターカレーターを使用する方法及びＴａｑＭａｎプローブ等を用いたプローブ法により検出する方法
（ｃ）ＤＮＡシーケンサー等を用いて、ＰＣＲ、Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ法）、及びＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＭＤＡ法）で増幅されたＤＮＡの塩基配列を解析する方法
（ｄ）ＰＣＲ―制限酵素断片長多型法（ＰＣＲ―Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ法））及びＤＮＡマイクロアレイ法等により、標的ＤＮＡを検出する方法

（３−４）ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体の繰り返し使用について
本発明のＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体は、上述の洗浄工程および回収方法によっても、酵素をシリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に安定に吸着、固定、保持でき、任意の緩衝溶液、又は、環状及び直鎖状、一本鎖及び二本鎖など適宜の基質ＤＮＡを含んだ反応溶液に容易に交換可能であるため、微量ＤＮＡの増幅反応における該複合体の複数回の繰り返し使用ができる。
該複合体の繰り返し使用の対象となるＤＮＡ増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）の他、等温ＤＮＡ増幅法（ＬＡＭＰ法）、Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ法）、及びＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＭＤＡ法）などである。また、従来のバッチ式反応に加え、マイクロ流体デバイス等を利用した流通式反応において該複合体を繰り返し使用することができる。

４．ＬＡＭＰ法用ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体担持マイクロリアクター
本発明者らが以前開発した、シリカ系ナノ空孔材料を担持させたマイクロ流体デバイス（特許文献４）を用い、ＬＡＭＰ法用のＤＮＡ合成酵素（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ；非特許文献８など）を固定化して、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体担持マイクロリアクターを調製する。
ここで、マイクロ流体デバイス内に担持させるシリカ系ナノ空孔材料としては、前記（１−１）で示した二酸化ケイ素（シリカ）を材質とする、中心細孔直径が２〜５０ｎｍ（メソ孔：ＩＵＰＡＣ）の均一な細孔を持つ多孔質材料であって、「ＦＳＭ」「ＳＢＡ」又は「ＳＢＡ」の合成過程で界面活性剤と共に膨張剤を混和して細孔径を拡大させた「ＳＢＡ−ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ」が好ましい。

シリカ系ナノ空孔材料をマイクロ流路内に担持させる方法としては、特許文献４に記載された通りであり、ＳＢＡ粒子などのシリカ系材料粒子を、ガラス又はプラスチック基板に設けられたマイクロ流路表面を形成するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）層上で硬化させることで、直接均一な細孔を形成させながら、ＰＤＭＳ層表面と共有結合させる。
例えば、厚みが約１ｍｍ程度のガラス基板の一部にマスクを施し、フッ酸によるエッチングにより形成した溝に取り付けられたＰＤＭＳ層表面を有するガラス基板表面にナノ空孔材料（ＳＢＡ）粒子を堆積させ、これを約８５℃程度の温度で数時間静置して硬化させることで、ガラス基板表面にナノ空孔材料ＳＢＡを担持させる。圧縮空気を吹き付けて、非特異的に吸着したナノ空孔材料ＳＢＡ粒子を除去後、ＰＤＭＳ膜を上から貼りシールする。

本発明のＬＡＭＰ法用ＤＮＡ合成酵素−ナノ空孔材料複合体担持マイクロリアクターは、以下の様に調製される。
シリカ系ナノ空孔材料を担持したマイクロ流路内部に、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼと共に蛍光試薬を含む緩衝液、あるいは、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼと共に標的ＤＮＡと蛍光試薬を含む緩衝液を充填することで固定化できる。次いで、マイクロ流路内部をＬＡＭＰ法での反応温度（６５℃）に加温し、標的ＤＮＡ及びプライマーセットを含むＬＡＭＰ法試薬反応液を送液し、流路内で等温での核酸増幅（ＬＡＭＰ法）を行い、得られた増幅ＤＮＡ産物含有溶液を連続的に回収する。

なお、ＤＮＡ合成酵素−ナノ空孔材料複合体を担持させたマイクロリアクターは、使用に際してまず緩衝液で流路内を洗浄してから用いる。その際の緩衝液中には、０．００１％程度のＢＳＡを含有させておくことが好ましい。複数回の洗浄工程を設けることで、ＤＮＡ合成酵素−ナノ空孔材料複合体がＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−ナノ空孔材料複合体となり、当該複合体が担持されたマイクロリアクターが提供される。

当該マイクロリアクターをＬＡＭＰ法に適用した場合の効果は極めて大きく、増幅反応中のコンタミネーションを抑制し、標的ＤＮＡの増幅感度を大幅に向上できるばかりでなく、当該マイクロリアクターに担持された複合体は、連続的な試薬反応液との相互作用において、９回目の接触後の回収溶液でも比活性の低下は全くないという驚くべき性能を有する（図１３ｂ）。これはマイクロ流路内の酵素複合体にとっては、連続して９回分の新たな試薬反応液と接触し相互作用を行うことができることであるから、ＬＡＭＰ法用酵素複合体の９回繰り返し使用と表現することができる。当該９回の繰り返し使用に亘るＤＮＡ増幅活性の維持効果からみて、仮に試薬反応液の連続的な送液を中断し、緩衝液での洗浄を挿んで新たな連続的送液を行うマイクロリアクターの繰り返し使用に際しても、その効果に変わりがないことが十分に示唆される。

次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。

（合成例）シリカ系ナノ空孔材料の合成
本実施例で用いる、２次元ヘキサゴナルの細孔配列構造を有していて、細孔径の異なる各種シリカ系ナノ空孔材料（「ＦＳＭ」、「ＳＢＡ」、及び「ＳＢＡ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ」）を、それぞれ複数種類合成した。

（合成例１）ＦＳＭ−１６、−２２の合成
稲垣らの方法（非特許文献１２）を参考にして、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド（３．２ｇ、東京化成工業社製）、或いは、ドコシルトリメチルアンモニウムクロライド（４．２４ｇ、ライオン・アクゾ社製）を、７０℃の水１００ミリリットルに添加し、溶解後、カネマイト（トクヤマシルテック社製）５ｇを更に添加し、７０℃に加熱しながら、ホモミキサーで３時間撹拌した。これに、２規定塩酸を約１時間かけて添加し、ｐＨ８．５の状態で、約３時間撹拌した。

これを、吸引濾過した後、７０℃の熱水に再分散して濾過する工程を４回繰り返してから風乾した。これを、４５℃で３日間乾燥した後、５５０℃で６時間焼成することにより、中心細孔直径の異なるシリカ系ナノ空孔材料（ＦＳＭ；界面活性剤の種類が、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド、また、ドコシルトリメチルアンモニウムクロライドの場合）を得た。中心細孔直径は、各々２．６ｎｍ（ＦＳＭ−１６）、また、４．２ｎｍ（ＦＳＭ−２２）、であった。

（合成例２）ＳＢＡ−１５の合成
Ｚｈａｏらの方法（非特許文献１３）を参考にして、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ１２３（ポリオキシエチレン（42）ポリオキシプロピレン（67）グリコール［ＢＡＳＦ社製］）（１０ｇ）を、水３００ミリリットルに添加し、３５℃で一晩撹拌し溶解させた後、これに、塩酸２１．８７ｇ及びオルトケイ酸テトラエチル（和光純薬工業社製）２１．３２ｇを更に添加し、ホットスターラーを用いて３５℃に加熱しながら、約２０時間撹拌した。これを、異なる合成温度（ａ：３５℃、ｂ：８０℃、又は、ｃ：１３０℃）で２４時間静置した。

これを、吸引濾過した後、７０℃の熱水に再分散して濾過する工程を４回繰り返してから風乾した。これを、４５℃で３日間乾燥した後、時間あたり１０５℃の速度で５５０℃まで昇温させ、更に、これを、５５０℃で１０時間焼成することにより、中心細孔直径の異なるシリカ系ナノ空孔材料（ＳＢＡ−１５）を得た。合成温度がａ、ｂ、ｃの場合、中心細孔直径は、各々ａ：５．４ｎｍ、ｂ：７．１ｎｍ、また、ｃ：１０．６ｎｍ、であった。

（合成例３）ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅの合成
Ｗａｎｇらの方法（非特許文献１４）を参考にして、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ１２３（４ｇ）を、水１２０ミリリットルに添加し、更に、これに塩化カリウム（和光純薬工業社製）６．０８ｇを添加し、常温で１時間撹拌し溶解させた後、これに、塩酸（和光純薬工業社製）２３．６ｇ及びメシチレン（和光純薬工業社製）３ｇを更に添加し、常温で２時間撹拌した。これに、オルトケイ酸テトラエチル８．５ｇを更に添加し、１０分間激しく撹拌した後、３５℃で２４時間静置した。これを、異なる合成温度（ａ：１００℃、また、ｂ：１３０℃）で２４時間静置した。

これを、吸引濾過した後、７０℃の熱水に再分散して濾過する工程を４回繰り返してから風乾した。これを、４５℃で３日間乾燥した後、時間あたり６０℃の速度で５００℃まで昇温させ、更に、これを、５００℃で６時間焼成することにより、中心細孔直径の異なるシリカ系ナノ空孔材料（ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）を得た。合成温度がａ、ｂの場合、中心細孔直径は、各々ａ：１８．５ｎｍ、また、ｂ：２４．５ｎｍ、であった。

（実施例１）ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造及び酵素反応
本実施例では、前記合成例で作製した各種シリカ系ナノ空孔材料に対するＤＮＡ合成酵素の固定化と酵素活性の評価を行った。図１に、シリカ系ナノ空孔材料（メソポーラスシリカ）の規則性細孔（シリカ細孔）表面への反応基質ＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰｓの吸着抑制により、シリカ細孔に固定化したＤＮＡ合成酵素及びＢＳＡを備えたＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体と適量の反応基質（ＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰｓ）が相互作用し、更に、酵素反応環境の至適化により非特異的ＤＮＡ増幅を抑制できるようになった結果、微量ＤＮＡが特異的かつ高感度に増幅される様子を模式的に表した説明図を示す。

（１−１）ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造
シリカ系ナノ空孔材料には、中心細孔直径の異なる７種類のシリカ系ナノ空孔材料：１）ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）、２）ＦＳＭ−２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）、３）ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）、４）ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ）、５）ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：１０．６ｎｍ）、６）ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）、７）ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：２４．５ｎｍ）、を使用し、また、ＤＮＡ合成酵素には、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製、分子量：約８６〜９２ｋＤ）を用いた。

図２に、ＤＮＡ合成酵素及びＢＳＡを固定化したシリカ系ナノ空孔材料粒子の製造法を示す。基本的な実験操作としては、ＤＮＡ合成酵素（１〜２．５ｕｎｉｔｓ）を含んだＰＣＲ用緩衝溶液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８）、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化カリウム、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ ＢＳＡ、１ｍＭ 塩化マグネシウム）５０μＬと、シリカ系ナノ空孔材料粉末０．５ｍｇとを、Ｖｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒを用いて約１秒間室温で混合し、５〜１０分間氷上で静置した後、再び、Ｖｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒを用いて約５秒間室温で攪拌し、遠心分離を行い、上清を全て除去することによって、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体前駆体を得た。続いて、前記ＰＣＲ用緩衝溶液１００μＬを添加し、Ｖｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒを用いて約５秒間室温で攪拌し、前記ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体前駆体を再懸濁した後、遠心分離を行い、上清を全て除去し、最終的にＤＮＡ合成酵素及びＢＳＡをシリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に固定化した複合体である、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体を得た。

（１−２）ＤＮＡ合成活性の評価（基質ＤＮＡが１００塩基対の直鎖状ＤＮＡの場合）
基質ＤＮＡとして１００塩基対の直鎖状二本鎖ＤＮＡ及び１００塩基の直鎖状一本鎖ＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）における、上記ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体のＤＮＡ合成活性について調べた。酵素反応は、上記ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体の沈殿物（酵素：２．５ｕｎｉｔｓ）に、ｐｃＤＮＡ３プラスミドベクターのポリリンカー部位の一部配列である直鎖状ＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡの場合：５ｎｇ、一本鎖ＤＮＡの場合：２．５ｎｇ、１００塩基対（ｂｐ）、５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＡＡＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＣ：配列番号１）、また、ｄＮＴＰｓ（各々２０ｎｍｏｌ）、各々２０ｐｍｏｌの２種類のプライマーＤＮＡ（Ｔ７ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ、２０ｍｅｒ、５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ：配列番号２、及び、ＳＰ６ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ、１９ｍｅｒ、５’−ＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ：配列番号３）、また、ｄＮＴＰｓ（各々２０ｎｍｏｌ）、を含んだ前記ＰＣＲ用緩衝溶液５０μＬを添加することによって開始した。また、前記直鎖状二本鎖ＤＮＡを用いた実験操作において、段階的に希釈した基質ＤＮＡ量（５ｎｇ、０．５ｎｇ、０．０５ｎｇ、５ｐｇ、０．５ｐｇ、０．０５ｐｇ、５ｆｇ、０．５ｆｇ、０．０５ｆｇ）を用い、微量ＤＮＡを鋳型とした活性評価を行った。

反応条件は、９４℃で１分間の加熱の後、９８℃で１０秒間、５０℃で３０秒間、７４℃で３０秒間の温度サイクルを１５〜５５回繰り返すこととし、本反応には、ＰＣＲ装置（バイオラッド社製、ｉＣｙｃｌｅｒ）を使用した。また、反応後のＤＮＡ増幅産物は、１５％ ＴＢＥ−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、蛍光色素ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉによるゲル染色後に、蛍光イメージアナライザー（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製、ＦＬＡ−５１００）を用いて解析した。

（１−３）ＤＮＡ合成活性の評価（基質ＤＮＡが環状プラスミドＤＮＡの場合）
基質ＤＮＡとしてλ−ファージＤＮＡ由来のアデニン（Ａ）を末端に１塩基付加された長さの異なるＰＣＲ増幅産物（配列番号４（６１６ｂｐ）、配列番号５（１２７２ｂｐ）、配列番号６（２５６６ｂｐ）、配列番号７（５０２７ｂｐ））をＴ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０（配列番号８（２７３６ｂｐ、タカラバイオ社製））に挿入した４種類の環状プラスミドＤＮＡ（３３５４ｂｐ、４０１０ｂｐ、５３０４ｂｐ、７７６５ｂｐ）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）における、上記ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体のＤＮＡ合成活性について調べた。酵素反応は、上記ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体の沈殿物（酵素：１ｕｎｉｔ）に、上記の環状プラスミドＤＮＡ（１ｎｇ）、また、ｄＮＴＰｓ（各々１０ｎｍｏｌ）、各々１０ｐｍｏｌの２種類のプライマーＤＮＡ（Ｍ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ、２４ｍｅｒ、５’−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ：配列番号９、及び、Ｍ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ、２４ｍｅｒ、５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ：配列番号１０）、また、ｄＮＴＰｓ（各々２０ｎｍｏｌ）を含んだ前記ＰＣＲ用緩衝溶液５０μＬを添加することによって開始した。また、前記環状プラスミドＤＮＡを用いた実験操作において、段階的に希釈した基質ＤＮＡ量（１ｎｇ、０．１ｎｇ、０．０１ｎｇ、１ｐｇ、０．１ｐｇ、０．０１ｐｇ、１ｆｇ、０．１ｆｇ、０．０１ｆｇ）を用い、微量ＤＮＡを鋳型とした活性評価を行った。更に、前記環状プラスミドＤＮＡ（バックグラウンドＤＮＡ）１ｎｇあるいは０．１ｐｇ及びＤＮＡ合成酵素（１ｕｎｉｔ）を含んだ、反応組成の異なる８種類の緩衝溶液を用いて、ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体前駆体を得、続いて、同緩衝溶液１００μＬを用いて前記複合体を洗浄した後、前記環状プラスミドＤＮＡ（４０１０塩基対）１ｎｇあるいは０．１ｐｇを含んだ前記ＢＳＡ含有ＰＣＲ用緩衝溶液５０μＬを添加することによって酵素反応を開始し、バックグラウンドＤＮＡの洗浄及び標的ＤＮＡの増幅評価を行った。

反応条件は、９５℃で１分間の加熱の後、９８℃で１５秒間、６５℃で５秒間、７４℃で３０秒間の温度サイクルを２５回、又は、３５回繰り返し、最後に７４℃で１分間の加熱反応とし、本反応には、ＰＣＲ装置（バイオラッド社製、ｉＣｙｃｌｅｒ）を使用した。また、反応後のＤＮＡ増幅産物は、１〜２％ アガロースゲルを用いて電気泳動し、蛍光色素ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉによるゲル染色後に、蛍光イメージアナライザー（ＦＵＪＩＦＩＬＭ製、ＦＬＡ−５１００）を用いて解析した。

（実施例２）直鎖状ＤＮＡを対象としたＤＮＡ増幅（副反応抑制効果の検証）
図３の左図（ａ）及び右図（ｂ）に、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体による、１００塩基対（配列番号１）の直鎖状二本鎖ＤＮＡ及び１００塩基（配列番号１）の直鎖状一本鎖ＤＮＡを基質ＤＮＡとして用い、温度サイクルを１５回繰り返した場合のＤＮＡ増幅産物の解析結果を示す。図中、Ｍは、ＤＮＡ分子サイズマーカー、ＰＣは、シリカ系ナノ空孔材料に固定化していない遊離のＤＮＡ合成酵素の場合、ＮＣは、遊離のＤＮＡ合成酵素に基質ＤＮＡを添加せず、プライマーＤＮＡを添加した場合、である。

また、図中、マル１から７は、中心細孔直径の異なる各種シリカ系ナノ空孔材料の、１：ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）、２：ＦＳＭ−２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）、３：ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）、４：ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ）、５：ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：１０．６ｎｍ）、６：ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）、７：ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：２４．５ｎｍ）、に固定化したＤＮＡ合成酵素の場合、である。

図３（ａ）（ｂ）より、全ての種類のシリカ系ナノ空孔材料について、ＤＮＡ増幅産物の存在が認められ、これは、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体がＤＮＡ合成活性を有していることを示している。また、直鎖状の鋳型ＤＮＡの種類が一本鎖、二本鎖、どちらの場合においても、固定化していない遊離のＤＮＡ合成酵素を利用した場合では、目的のＤＮＡ増幅産物以外に非特異的ＤＮＡ増幅産物であるプライマーダイマーの増幅が認められたが、固定化ＤＮＡ合成酵素では、７種類全てのシリカ系ナノ空孔材料において、目的のＤＮＡ増幅産物が同程度に合成され、更に、プライマーダイマーの著しい増幅抑制が示された。

（実施例３）直鎖状ＤＮＡを対象としたＤＮＡ増幅（微量ＤＮＡの増幅反応の評価）
図４の左図（ａ）及び右図（ｂ）に、反応溶液５０μＬ中の基質ＤＮＡ（１００塩基対の二本鎖ＤＮＡ）量を５ｎｇから０．０５ｆｇの範囲で段階的に希釈し、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体による、温度サイクル１５回のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を実施した後のＤＮＡ増幅産物の解析結果を示す。図中、Ｍは、ＤＮＡ分子サイズマーカー、ＮＣは、シリカ系ナノ空孔材料に固定化していない遊離のＤＮＡ合成酵素に基質ＤＮＡを添加せず、プライマーＤＮＡを添加した場合、である。図中、（ａ）は、遊離のＤＮＡ合成酵素を利用した場合、また、（ｂ）は、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）複合体を利用した場合、である。

また、図中、マル１から９は、反応溶液５０μＬ中の基質ＤＮＡ量を、１：５ｎｇ、２：０．５ｎｇ、３：０．０５ｎｇ、４：５ｐｇ、５：０．５ｐｇ、６：０．０５ｐｇ、７：５ｆｇ、８：０．５ｆｇ、９：０．０５ｆｇ、に段階的に希釈し、ＤＮＡ増幅活性の評価を行った場合、である。

図４（ａ）（ｂ）より、遊離のＤＮＡ合成酵素を利用した場合では５ｐｇまでの増幅が示され、固定化ＤＮＡ合成酵素の場合ではプライマーダイマー形成の抑制が認められたと共に０．０５ｐｇまでの増幅が示された。これらの実験結果は、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体が副反応抑制能を有している結果、ＤＮＡ増幅活性が向上した可能性を示している。

また、図５の左図（ａ）及び右図（ｂ）に、図４（ｂ）で増幅が認められなかった５ｆｇの基質ＤＮＡからの増幅において、ＰＣＲのサイクル数を更に１０サイクルずつ５５サイクルまで追加した場合のＤＮＡ増幅産物の解析結果を示す。図中、Ｍは、ＤＮＡ分子サイズマーカー、図中、（ａ）のＰＣは、シリカ系ナノ空孔材料に固定化していない遊離のＤＮＡ合成酵素の場合、ＦＳＭ−１６は、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）複合体を利用した場合、また、（ｂ）のＮＣは、シリカ系ナノ空孔材料に固定化していない遊離のＤＮＡ合成酵素に基質ＤＮＡを添加せず、プライマーＤＮＡを添加した場合、である。また、図中の数字は、ＰＣＲのサイクル数を示している。

図５（ａ）（ｂ）より、ＰＣ及びＮＣでは、全ての温度サイクルにおいて非特異的ＤＮＡ増幅が示された。一方、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−ＦＳＭ−１６複合体では、ＰＣＲのサイクル数を更に２０サイクル追加した３５サイクルで、非特異的ＤＮＡ増幅の少ない標的ＤＮＡの選択的な増幅が認められたことより、５ｆｇの微量ＤＮＡからの増幅が可能であることが示された。

以上の結果から、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体には、ＤＮＡ増幅反応におけるプライマーダイマー等の非特異的ＤＮＡ増幅産物の形成を抑制する効果が有り、この効果によって、従来の遊離酵素を用いたＤＮＡ増幅反応で必要とされる基質ＤＮＡ量よりも更に微量の基質ＤＮＡから増幅できることが分かった。すなわち、シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔は、ＤＮＡ増幅反応における副反応抑制場として好適であることが判明した。

図６に、ＤＮＡ増幅対象となる配列番号４〜７に示される長さの異なるＤＮＡ（６１６、１２７２、２５６６、５０２７塩基対）をＴ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０（配列番号８）に挿入した４種類の環状プラスミドＤＮＡ（３３５４、４０１０、５３０４、７７６５塩基対）１ｎｇを用いた、シリカ系ナノ空孔材料複合体に固定化していない遊離のＤＮＡ合成酵素（１ｕｎｉｔ）によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を実施した後のＤＮＡ増幅産物の解析結果を示す。図中、Ｍは、ＤＮＡ分子サイズマーカー、Ａは、６１６塩基対を挿入した環状プラスミドＤＮＡ（３３５４塩基対）を鋳型にしたＤＮＡ増幅産物（約８００塩基対）、Ｂは、１２７２塩基対を挿入した環状プラスミドＤＮＡ（４０１０塩基対）を鋳型にしたＤＮＡ増幅産物（約１５００塩基対）、Ｃは、２５６６塩基対を挿入した環状プラスミドＤＮＡ（５３０４塩基対）を鋳型にしたＤＮＡ増幅産物（約２８００塩基対）、Ｄは、５０２７塩基対を挿入した環状プラスミドＤＮＡ（７７６５塩基対）を鋳型にしたＤＮＡ増幅産物（約５２００塩基対）、である。

図７の（ａ）−（ｄ）に、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体による、環状プラスミドＤＮＡ（Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０、配列番号８）に挿入した配列番号４〜７に示される４種類の長鎖ＤＮＡ（６１６、１２７２、２５６６、５０２７塩基対）を基質ＤＮＡとして用い、温度サイクルを２５回繰り返した場合のＤＮＡ増幅産物の解析結果を示す。図中、Ｍは、ＤＮＡ分子サイズマーカー、ＰＣは、シリカ系ナノ空孔材料に固定化していない遊離のＤＮＡ合成酵素の場合、である。図中、（ａ）は、約８００塩基対のＤＮＡを増幅した場合、（ｂ）は、約１５００塩基対のＤＮＡを増幅した場合、（ｃ）は、約２８００塩基対のＤＮＡを増幅した場合、また、（ｄ）は、約５２００塩基対のＤＮＡを増幅した場合、である。また、図中、（ｅ）は、各種ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体におけるＤＮＡ増幅効率の程度を、◎（増幅：大）、○（増幅：中）、▲（増幅：小）、×（増幅：無し）、を用いた表示した表である。

また、図中、マル１から７は、中心細孔直径の異なる各種シリカ系ナノ空孔材料の、１：ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）、２：ＦＳＭ−２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）、３：ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）、４：ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ）、５：ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：１０．６ｎｍ）、６：ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）、７：ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：２４．５ｎｍ）、に固定化したＤＮＡ合成酵素の場合、である。

図７（ａ）−（ｅ）より、ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：２４．５ｎｍ）以外の６種類のシリカ系ナノ空孔材料について、ＤＮＡ増幅産物の存在が認められた。しかし、２５６６塩基対が挿入された環状プラスミドＤＮＡの場合、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：１０．６ｎｍ）に固定化したＤＮＡ合成酵素で増幅が認められず、また、５０２７塩基対が挿入された環状プラスミドＤＮＡの場合、ＦＳＭ−２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）及びＳＢＡ−１５（中心細孔直径：１０．６ｎｍ）に固定化したＤＮＡ合成酵素で増幅が認められなかった。また、シリカ系ナノ空孔材料がＦＳＭ、ＳＢＡ型どちらの場合にも、該シリカ系ナノ空孔材料の中心細孔直径が小さくなる程、ＤＮＡ増幅活性が増大する傾向が認められ、ＦＳＭの場合、特にＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）が好適であり、ＳＢＡの場合は、特にＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）、次いで、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ）が好適であり、また、ＳＢＡ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅの場合は、ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）が好適であった。以上の結果は、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体が、環状プラスミドＤＮＡの６００〜５０００塩基対の長さの異なる挿入ＤＮＡを対象とした増幅活性を有しており、また、シリカ系ナノ空孔材料の中心細孔直径の違いによって、該ＤＮＡ合成酵素のＤＮＡ増幅活性を制御できることを示唆している。

（実施例４）環状ＤＮＡを対象としたＤＮＡ増幅（極微量ＤＮＡの増幅反応の評価）
図８の左図（ａ）及び右図（ｂ）に、反応溶液５０μＬ中の基質ＤＮＡ（配列番号４の６１６塩基対のＤＮＡが挿入された環状プラスミドＤＮＡ（Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０））量を１ｎｇから０．０１ｆｇの範囲で段階的に希釈し、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体による、温度サイクル２５回のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を実施した後のＤＮＡ増幅産物（分子サイズ：約８００塩基対）の解析結果を示す。図中、Ｍは、ＤＮＡ分子サイズマーカー、ＮＣは、シリカ系ナノ空孔材料に固定化していない遊離のＤＮＡ合成酵素に基質ＤＮＡを添加せず、プライマーＤＮＡを添加した場合、である。図中、（ａ）は、遊離のＤＮＡ合成酵素を利用した場合、また、（ｂ）は、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）複合体を利用した場合、である。

また、図中、マル１から９は、反応溶液５０μＬ中の基質ＤＮＡ量を、１：１ｎｇ、２：０．１ｎｇ、３：０．０１ｎｇ、４：１ｐｇ、５：０．１ｐｇ、６：０．０１ｐｇ、７：１ｆｇ、８：０．１ｆｇ、９：０．０１ｆｇ、に段階的に希釈し、ＤＮＡ増幅活性の評価を行った場合、である。

図８（ａ）より、遊離のＤＮＡ合成酵素を利用した場合では０．０１ｎｇまでの増幅が示され、それ以降、１ｐｇ以下の基質ＤＮＡ量では、非特異的ＤＮＡ増幅が顕著に進行するようになった。一方、図８（ｂ）より、固定化ＤＮＡ合成酵素の場合では非特異的ＤＮＡ増幅の著しい抑制効果が認められたと共に、０．１〜０．０１ｆｇの極微量ＤＮＡの増幅が示された。これらの実験結果は、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体が副反応抑制能を有している結果、極めて微量の基質ＤＮＡ（０．０１ｆｇ＝２．７分子）、すなわち、数分子のＤＮＡからの増幅活性が向上した可能性を示している。

（実施例５）環状ＤＮＡを対象としたＤＮＡ増幅（極微量ＤＮＡの増幅反応における細孔径の影響）
また、図９に、図８（ｂ）のマル９の反応条件（基質ＤＮＡ量：０．０１ｆｇ）を用いた、遊離のＤＮＡ合成酵素及び７種類のシリカ系ナノ空孔材料に固定化したＤＮＡ合成酵素を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）において、ＰＣＲのサイクル数を更に１０サイクル追加し、３５サイクルとした場合のＤＮＡ増幅産物（分子サイズ：約８００塩基対）の解析結果を示す。図中、Ｍは、ＤＮＡ分子サイズマーカー、ＰＣは、シリカ系ナノ空孔材料に固定化していない遊離のＤＮＡ合成酵素の場合、また、ＮＣは、遊離のＤＮＡ合成酵素に基質ＤＮＡを添加せず、プライマーＤＮＡを添加した場合、である。

また、図中、マル１から７は、中心細孔直径の異なる各種シリカ系ナノ空孔材料の、１：ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）、２：ＦＳＭ−２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）、３：ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）、４：ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ）、５：ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：１０．６ｎｍ）、６：ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）、７：ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：２４．５ｎｍ）、に固定化したＤＮＡ合成酵素の場合、である。

図９より、ＰＣ及びＮＣでは、どちらも非特異的ＤＮＡ増幅が示され、標的ＤＮＡの増幅が認められなかった。一方、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体では、７種類のシリカ系ナノ空孔材料のうち、４種類において、数分子レベルの極微量ＤＮＡ（０．０１ｆｇ＝２．７分子）からの特異的な増幅が認められた。具体的には、ＦＳＭ−２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：１０．６ｎｍ）、また、ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：２４．５ｎｍ）に固定化したＤＮＡ合成酵素では、非特異的ＤＮＡ増幅が示されなかったものの、標的のＤＮＡ増幅産物を得ることができず、ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ）、また、ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）に固定化したＤＮＡ合成酵素では、特異的なＤＮＡ増幅産物が明瞭に示された。ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）では、標的ＤＮＡの増幅が示されたものの、標的ＤＮＡより下流に非特異的ＤＮＡ増幅が示された。

以上の結果から、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体には、環状プラスミドＤＮＡを鋳型とした長鎖ＤＮＡの増幅反応において、非特異的ＤＮＡ増幅を著しく抑制する効果が有り、この効果によって、従来の遊離酵素を用いたＤＮＡ増幅反応で必要とされる基質ＤＮＡ量よりも更に１００万分の１の微量の基質ＤＮＡ、すなわち、数分子レベルの基質ＤＮＡから増幅できることが分かり、シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔は、ＤＮＡ増幅反応における副反応抑制場として好適であることが判明した。また、各々のタイプのシリカ系ナノ空孔材料において、微量ＤＮＡ増幅に最適な細孔径が異なったことから、極微量ＤＮＡの増幅における固定化ＤＮＡ合成酵素の反応活性はシリカ系ナノ空孔材料の細孔径の違いによって制御できる可能性が示唆された。

（実施例６）環状ＤＮＡを対象としたＤＮＡ増幅（バックグラウンドＤＮＡの反応系外への排除能の検証）
図１０の左図（ａ）及び右図（ｂ）に、ＤＮＡ合成酵素（１ｕｎｉｔ）を含んだ、反応組成の異なる８種類のＰＣＲ用緩衝溶液を用いて、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体前駆体を得、次に、バックグラウンドＤＮＡとして、配列番号４に示される６１６塩基対のＤＮＡが挿入された環状プラスミドＤＮＡ（３３５４塩基対、１ｎｇ）を添加し、続いて、同ＰＣＲ用緩衝溶液１００μＬを用いて前記複合体を洗浄した後、１２７２塩基対のＤＮＡが挿入された標的となる環状プラスミドＤＮＡ（４０１０塩基対、１ｎｇ）を含んだ前記ＰＣＲ用緩衝溶液５０μＬを添加することによって酵素反応を開始し、温度サイクルを２５回繰り返した場合のＤＮＡ増幅産物の解析結果を示す。図中、（ａ）は、ＦＳＭ−２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）に固定化したＤＮＡ合成酵素の場合、（ｂ）は、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）に固定化したＤＮＡ合成酵素の場合、である。

また、図中、Ｍは、ＤＮＡ分子サイズマーカー、マル１と５は、酵素固定化用及びバックグラウンドＤＮＡの洗浄用の緩衝溶液の組成として、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８）、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化カリウム、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ ＢＳＡであり、マル２と６は、緩衝溶液の組成として、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８）であり、マル３と７は、緩衝溶液の組成として、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８）、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化カリウム、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００であり、また、マル４と８は、緩衝溶液の組成として、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８）、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化カリウム、０．００１％ ＢＳＡである、場合である。また、図中、マル１から４は、前記緩衝溶液に１ｍＭ 塩化マグネシウムを含んでいる場合、マル５から８は、前記緩衝溶液に１ｍＭ 塩化マグネシウムを含んでいない場合、である。

図１０（ａ）より、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−ＦＳＭ−２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）複合体の場合には、マル１の緩衝溶液を用いた場合においてのみＤＮＡ増幅反応の進行が認められ、マル２から８の緩衝溶液を用いた場合には、標的ＤＮＡ及びバックグラウンドＤＮＡの両方のＤＮＡ増幅が示されなかった。一方、図１０（ｂ）より、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）複合体の場合には、マル１、３、５、７の緩衝溶液を用いた場合には、標的ＤＮＡと共にバックグラウンドＤＮＡに由来する非特異的ＤＮＡ増幅が示され、マル２、４、６、８の緩衝溶液を用いた場合には、バックグラウンドＤＮＡが示されず、標的ＤＮＡのみの選択的な増幅が認められ、そのうちでもＭｇ塩を含まずＢＳＡを含有させた場合（マル８）が、最も増幅効率が高まった（ＤＮＡ増幅効率は、マル４のＰＣＲ産物のバンド強度を基準（１倍）とした場合、マル８が４．６倍、マル２が３．２倍、また、マル６が２．４倍であった）が、マル８の場合はバックグラウンドＤＮＡが出ている。以上の結果より、ＦＳＭ−２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）の場合には、ＢＳＡと共に、Ｍｇ塩及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００等を含んだ通常のＰＣＲ用緩衝溶液が好適であるのに対して、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）の場合には、Ｍｇ塩を含まずＢＳＡを含む緩衝溶液が好適であることが分かった。
しかし、この実験ではＤＮＡの添加量が微量でない（１ｎｇ）ことと、バックグラウンドＤＮＡを酵素固定化後に添加しているため、正確なバックグラウンドＤＮＡの反応系外への排除能の検証とはいえない可能性があるため、極微量（０．１ｐｇ）の標的ＤＮＡを対象として、引き続き以下の実験を行った。

（実施例７）極微量の環状ＤＮＡを対象としたＤＮＡ増幅（バックグラウンドＤＮＡの反応系外への排除能の検証）
図１１の（ａ）−（ｃ）に、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体による、前記の配列番号４に示される６１６塩基対のＤＮＡが挿入された環状プラスミドＤＮＡ（３３５４塩基対、バックグラウンドＤＮＡ）０．１ｐｇ及びＤＮＡ合成酵素（１ｕｎｉｔ）を含んだ、反応組成の異なる８種類のＰＣＲ用緩衝溶液を用いて、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体前駆体を得、続いて、同ＰＣＲ用緩衝溶液１００μＬを用いて前記複合体を洗浄した後、１２７２塩基対のＤＮＡが挿入された標的となる環状プラスミドＤＮＡ（４０１０塩基対）０．１ｐｇを含んだ前記ＰＣＲ用緩衝溶液５０μＬを添加することによって酵素反応を開始し、温度サイクルを２５回繰り返した場合のＤＮＡ増幅産物の解析結果を示す。図中、Ｍは、ＤＮＡ分子サイズマーカー、Ｐ１は、シリカ系ナノ空孔材料に固定化していない遊離のＤＮＡ合成酵素を用いて６１６塩基対のＤＮＡが挿入された環状プラスミドＤＮＡ（３３５４塩基対、バックグラウンドＤＮＡ）を増幅した場合、Ｐ２は、遊離のＤＮＡ合成酵素を用いて１２７２塩基対のＤＮＡが挿入された標的となる環状プラスミドＤＮＡ（４０１０塩基対）を増幅した場合、である。図中、（ａ）は、ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）に固定化したＤＮＡ合成酵素の場合、（ｂ）は、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）に固定化したＤＮＡ合成酵素の場合、また、（ｃ）は、ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）に固定化したＤＮＡ合成酵素の場合、である。

また、図中、マル１と５は、酵素固定化用及びバックグラウンドＤＮＡの洗浄用の緩衝溶液の組成として、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８）、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化カリウム、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ ＢＳＡであり、マル２と６は、緩衝溶液の組成として、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８）であり、マル３と７は、緩衝溶液の組成として、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８）、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化カリウム、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００であり、また、マル４と８は、緩衝溶液の組成として、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８）、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化カリウム、０．００１％ ＢＳＡである、場合である。また、図中、マル１から４は、前記緩衝溶液に１ｍＭ 塩化マグネシウムを含んでいる場合、マル５から８は、前記緩衝溶液に１ｍＭ 塩化マグネシウムを含んでいない場合、である。

図１１（ａ）より、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）複合体の場合には、マル５の緩衝溶液を用いた場合にＤＮＡ増幅反応の進行がほとんど認められず、マル２、３、６、８の緩衝溶液を用いた場合に標的ＤＮＡ及びバックグラウンドＤＮＡの両方のＤＮＡ増幅が認められ、マル１、４、７の３種類の緩衝溶液を用いた場合にバックグラウンドＤＮＡが示されず、標的ＤＮＡのみの選択的な増幅が認められた。特に、マル１と４の緩衝溶液を用いた場合に標的ＤＮＡの増幅効率が高く、これより、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の存在非存在はあまり影響せず、ＢＳＡと共にＭｇ塩を含んだ緩衝溶液を利用した時に、バックグラウンドＤＮＡの洗浄及び標的ＤＮＡの増幅が効率良く進行することが分かった（ＤＮＡ増幅効率は、遊離のＤＮＡ合成酵素によるＰＣＲ産物（Ｐ２）のバンド強度を基準（１倍）とした場合、マル１が１．１１倍、マル４が１．０１倍、また、マル７が０．２５倍であった）。

図１１（ｂ）より、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）複合体の場合には、マル１から８の全ての種類の緩衝溶液において、標的ＤＮＡの高効率の増幅が示された。マル１から４の緩衝溶液では、極微量のバックグラウンドＤＮＡの増幅が示されたものの、マル５から８の緩衝溶液では、バックグラウンドＤＮＡの際だった増幅は殆ど無く、特にマル５の緩衝溶液を用いた場合に最もバックグラウンドＤＮＡの増幅が示されず、標的ＤＮＡのみの選択的な増幅が認められた。これより、塩化マグネシウムを含んでおらず、ＢＳＡと共にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含んでいる緩衝溶液を利用した時に、バックグラウンドＤＮＡの洗浄及び標的ＤＮＡの増幅が効率良く進行することが分かった。

図１１（ｃ）より、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）複合体の場合には、マル２及び６のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８）のみの他の添加物を含んでいない緩衝溶液を用いた場合にＤＮＡ増幅反応の進行がほとんど認められず、マル１、３、４、７、８の緩衝溶液を用いた場合では極微量のバックグラウンドＤＮＡの増幅が示されたものの、高効率の標的ＤＮＡの増幅が認められ、また、マル５の緩衝溶液を用いた場合にバックグラウンドＤＮＡの増幅が殆ど示されず、標的ＤＮＡのみの選択的な増幅が認められた。これより、塩化マグネシウムを含んでおらず、ＢＳＡとＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含んでいる緩衝溶液を利用した時に、バックグラウンドＤＮＡの洗浄及び標的ＤＮＡの増幅が効率良く進行することが分かった。

以上の結果から、反応系中のバックグラウンドＤＮＡの反応系外への排除能が高く、また、微量の標的ＤＮＡの選択的な増幅に最適な固定化用液及び洗浄液の組成は、シリカ系ナノ空孔材料ごとに異なることが分かった。

（実施例８）ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体のＬＡＭＰ法への応用
本実施例では、ＤＮＡ合成酵素（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）−ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）複合体を用いた、バッチ式及びマイクロ流体デバイスを利用した流通式での等温ＤＮＡ増幅（ＬＡＭＰ法）の評価を行った。ＬＡＭＰ法によるＤＮＡ増幅反応及び増幅評価には、ＤＮＡ増幅試薬キット、プライマーセットＫＨＶ、また、蛍光・目視検出試薬（いずれも栄研化学社製）を用いた。反応条件としては、反応容量を２５μＬとし、６５℃で５０〜６０分間の加温の後、蛍光検出により、ＤＮＡ増幅の評価を行った。本酵素反応には、アルミブロック恒温槽（タイテック社製、Ｃｏｏｌ Ｔｈｅｒｍｏ Ｕｎｉｔ）を使用し、また、蛍光プレートリーダー（モレキュラーデバイス社製、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２ｅ）を用い、基質ＤＮＡを添加した場合（ＰＣ）と添加しなかった場合（ＮＣ）におけるＤＮＡ増幅産物の蛍光強度（励起波長：３２０ｎｍ、蛍光波長：５１５ｎｍ）を測定し、ＰＣ／ＮＣ比を指標とすることによって、酵素活性を評価した。

図１３（ａ）に、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）ゲノムＤＮＡを基質ＤＮＡとした、シリカ系ナノ空孔材料に固定していない遊離のＤＮＡ合成酵素及びＤＮＡ合成酵素−ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）複合体を用いた、バッチ式反応における等温ＤＮＡ増幅（ＬＡＭＰ法）（６５℃、６０分間）を実施し、酵素活性を評価した結果を示す。ＤＮＡ合成酵素−ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）複合体の場合には、１度目の反応後に、遠心分離し、上清を除去した後、新たな反応溶液を添加することによって、３度までの固定化酵素の繰り返し使用を行った。

図１３（ａ）より、ＤＮＡ合成酵素−ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）複合体の場合には、３度の繰り返し使用によっても、遊離の酵素と同等のＤＮＡ増幅活性を示した。これより、ＬＡＭＰ法におけるＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の繰り返し使用の実行可能性が示唆された。

図１３（ｂ）に、ＤＮＡ合成酵素−ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）複合体を流路に担持したマイクロ流体デバイス（反応容積：約１２５μＬ、図１２）を用いた流通式の連続反応において、等温ＤＮＡ増幅（ＬＡＭＰ法）（６５℃、５０分間（滞留時間））を行い、酵素活性を評価した結果を示す。実験操作としては、まず、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）ゲノムＤＮＡ、ＤＮＡ合成酵素、また、蛍光・目視検出試薬等を含んだ反応溶液（５０μＬ）をマイクロ流路内部に充填した後、酵素を含まない反応液（ＰＣ: 基質ＤＮＡ有り、ＮＣ: 基質ＤＮＡ無し）を３００μＬ送液（流速：２．５μＬ／分）し、２５μＬずつ順次、サンプルを回収した。また、送液中の反応溶液の温度を一定に保持するために、マイクロ流体デバイスの背面に設置した透明導電膜（ブラスト社製）への電圧印加により、マイクロ流路内部を６５℃に加温した。

図１３（ｂ）より、ＤＮＡ合成酵素−ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）複合体を固定化したマイクロ流体デバイスは、９度の繰り返し使用によっても、遊離の酵素の２倍以上のＤＮＡ増幅活性を保持した。これより、マイクロ流体デバイスを利用した流通式での等温ＤＮＡ増幅（ＬＡＭＰ法）におけるＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体の繰り返し使用の実行可能性が示唆された。

（実施例９）環状ＤＮＡを対象としたＤＮＡ増幅（極微量ＤＮＡの増幅反応の評価）−２
本実施例は、基質ＤＮＡとして、配列番号５（１２７２塩基対）のＤＮＡを環状プラスミドＤＮＡ（Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０）に挿入して用い、ＰＣＲサイクル数を３５回に増やした以外は、（実施例４）と同様の方法を適用した。具体的には、ＢＳＡを０．００１重量％含有する反応溶液５０μＬ中の基質ＤＮＡ量を１ｎｇから０．０１ｆｇの範囲で段階的に希釈し、ＢＳＡ含有緩衝液で洗浄したＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体による、温度サイクル３５回のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を実施した。図１４（ａ）及び（ｂ）に、後のＤＮＡ増幅産物（分子サイズ：約１５００塩基対）の解析結果を示す。図中、Ｍは、ＤＮＡ分子サイズマーカーである。図１４の（ａ）は、遊離のＤＮＡ合成酵素を利用した場合、また、（ｂ）は、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）複合体を利用した場合、である。
なお、図中、マル１から９は、反応溶液５０μＬ中の基質ＤＮＡ量を、１：１ｎｇ、２：０．１ｎｇ、３：０．０１ｎｇ、４：１ｐｇ、５：０．１ｐｇ、６：０．０１ｐｇ、７：１ｆｇ、８：０．１ｆｇ、９：０．０１ｆｇ、に段階的に希釈し、ＤＮＡ増幅活性の評価を行った場合、である。

図１４（ａ）によれば、遊離のＤＮＡ合成酵素の場合ではマル３の１ｐｇまでの基質ＤＮＡ量において目的ＤＮＡの増幅が示され、マル４の０．１ｐｇ以下の基質ＤＮＡ量では、顕著な非特異的なＤＮＡの増幅反応が示された。一方、図１４（ｂ）によれば、固定化ＤＮＡ合成酵素の場合では非特異的なＤＮＡの増幅反応が抑制され、マル９の０．０１ｆｇの極微量ＤＮＡまで目的ＤＮＡの増幅が示された。これらの実験結果は、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体が非特異的なＤＮＡの増幅反応の抑制能を有している結果、遊離のＤＮＡ合成酵素の場合の１０万分の１の極めて微量の基質ＤＮＡ（マル９の０．０１ｆｇ＝２．３分子に相当）、すなわち、数分子の基質ＤＮＡからの特異的かつ安定的な増幅を示している。
なお、反応溶液中にＢＳＡを添加しなかった場合の同様の実験によると、ＰＣＲ反応の安定性が低下し、非特異的反応量が増加する。特に遊離のＤＮＡ合成酵素の場合に、基質ＤＮＡが０．０１ｎｇ量以下で増幅できなかった（図示せず。）。

（実施例１０）環状ＤＮＡを対象としたＤＮＡ増幅（極微量ＤＮＡの増幅反応における細孔径の影響）−２
本実施例は、（実施例５）と同様の７種類のシリカ系ナノ空孔材料を用いて、（実施例９）の図１４のマル８の反応条件（基質ＤＮＡ量：０．１ｆｇ）を、ＰＣＲサイクル数を３５回に増やして追試した。具体的には、配列番号５（１２７２塩基対）のＤＮＡを含む０．１ｆｇの基質ＤＮＡに対し、遊離のＤＮＡ合成酵素及び７種類のシリカ系ナノ空孔材料に固定化したＤＮＡ合成酵素を用いた、温度サイクル３５回のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を実施した。

図１５に、得られたＤＮＡ増幅産物（分子サイズ：約１５００塩基対）の解析結果を示す。図中、Ｍは、ＤＮＡ分子サイズマーカー、ＰＣは、シリカ系ナノ空孔材料に固定化していない遊離のＤＮＡ合成酵素の場合、また、ＮＣは、遊離のＤＮＡ合成酵素に基質ＤＮＡを添加せず、プライマーＤＮＡを添加した場合、である。
また、図中、マル１から７は、中心細孔直径の異なる各種シリカ系ナノ空孔材料の、１：ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）、２：ＦＳＭ−２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）、３：ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）、４：ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ）、５：ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：１０．６ｎｍ）、６：ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）、７：ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：２４．５ｎｍ）、に固定化したＤＮＡ合成酵素の場合、である。

図１５によれば、ＰＣ及びＮＣでは、どちらも非特異的ＤＮＡ増幅が示され、標的ＤＮＡの増幅が認められなかった。一方、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体では、７種類のシリカ系ナノ空孔材料のうち、４種類において、数十分子レベルの極微量ＤＮＡ（０．１ｆｇ＝２３分子）からの特異的な増幅が認められた。具体的には、ＦＳＭ−２２（中心細孔直径：４．２ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：１０．６ｎｍ）、また、ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：２４．５ｎｍ）に固定化したＤＮＡ合成酵素では、非特異的ＤＮＡ増幅が示されなかったものの、標的のＤＮＡ増幅産物を得ることができず、ＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）、ＳＢＡ−１５（中心細孔直径：７．１ｎｍ）、また、ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）に固定化したＤＮＡ合成酵素では、特異的なＤＮＡ増幅産物が明瞭に示された。

以上の結果は、標的ＤＮＡの増幅産物の長さが０．８ｋｂであった実施例５（図９）の結果とほぼ一致している。すなわち、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体は、標的ＤＮＡの増幅産物がさらに２倍近い１．５ｋｂもの長さの長鎖ＤＮＡであっても、非特異的ＤＮＡ増幅を著しく抑制し、数十分子レベルの基質ＤＮＡを増幅する効果が有ることが確認された。また、各々のタイプのシリカ系ナノ空孔材料ごとの微量ＤＮＡ増幅に最適な細孔径についても、増幅産物の長さが変わっても同様の傾向が示された。

（実施例１１）極微量の環状ＤＮＡを対象としたＤＮＡ増幅（バックグラウンドＤＮＡの反応系外への排除能の検証）
本実施例は、（実施例６）と同様の方法を、０．１ｆｇという数十分子レベルの極微量標的ＤＮＡに適用した実験である。
具体的には、（実施例６）で用いたと同様の配列番号５に示される１２７２塩基対のＤＮＡが挿入された標的となる環状プラスミドＤＮＡ（４０１０塩基対）を基質ＤＮＡとし、配列番号４に示される６１６塩基対のＤＮＡが挿入された環状プラスミドＤＮＡ（３３５４塩基対）をバックグラウンドＤＮＡとし、それぞれ０．１ｆｇずつ用いた。（実施例６）と同様に、バックグラウンドＤＮＡ０．１ｆｇとＤＮＡ合成酵素（１ｕｎｉｔ）とを含んだ、反応組成の異なる４種類のＰＣＲ用緩衝溶液（図１１のレーン(1)、(3)、(5)、(7)の反応組成）を用いて、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体前駆体を得、ＢＳＡを含む又は含まないＰＣＲ用緩衝溶液１００μＬで前記複合体を洗浄した後、１２７２塩基対の標的ＤＮＡを含む基質ＤＮＡ０．１ｆｇを含んだ前記ＰＣＲ用緩衝溶液５０μＬを添加することによって酵素反応を開始し、温度サイクルを３５回繰り返した。得られたＤＮＡ増幅産物の解析結果を図１６に示す。（ａ）は電気泳動図であり、（ｂ）は、（ａ）の結果を図１１の実験結果と共に表にまとめた。

ここで、酵素固定化用反応溶液及びバックグラウンドＤＮＡの洗浄用の緩衝溶液は同一であり、図中で示した４種類の溶液は、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８）、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化カリウム、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を共通の組成とする。
図１６（ａ）中、Ｍは、ＤＮＡ分子サイズマーカーである。また、図中、前記緩衝溶液に対する０．００１％ ＢＳＡの添加の有無を＋、−で示しており、また、１ｍＭ 塩化マグネシウムの添加の有無を（＋）、（−）で示している。
図１６（ｂ）中、前記緩衝溶液に対する０．００１％ ＢＳＡおよび１ｍＭ 塩化マグネシウムの添加の有無を＋、−で表示し、また、バックグラウンドＤＮＡと標的ＤＮＡの増幅の有無を＋、−で表示した。太枠は、図１１において得られた良好な特異性効果と一致した場合を示し、効果は弱いが同様の傾向を示した場合を点線枠で示している。
シリカ系ナノ空孔材料としてＦＳＭ−１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）を用いた場合、及びＳＢＡ−１５（中心細孔直径：５．４ｎｍ）を用いた場合では、ＢＳＡが添加された条件で非特異性ＤＮＡとの反応抑制効果が抑えられる効果が、０．１ｆｇにおいても再現性があったことが実証できた。

ＳＢＡ−１５ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：１８．５ｎｍ）をシリカ系ナノ空孔材料として用いた場合では、１回目のＤＮＡ増幅実験結果では０．１ｆｇでの再現性が認められなかったが、２回目のＤＮＡ増幅実験の結果によると、ＢＳＡが０．００１％含まれると、ＭｇＣｌ_２の有無にかかわらず標的ＤＮＡ（＋）、バックグラウンド（−）であり、ＢＳＡを含まないとＭｇＣｌ_２の有無にかかわらず標的ＤＮＡ（＋）、バックグラウンド（＋）という結果が得られた（図示せず）。この２回目の結果も勘案すれば、０．１ｆｇにおいても概ね実施例７（図１１）でのＢＳＡ添加による効果が追認されたといえる。
すなわち、以上の結果から、バックグラウンドＤＮＡ及び標的ＤＮＡの鋳型量が０．１ｆｇと極微量である場合においても、全体的には、ＢＳＡを添加した場合にバックラウンドＤＮＡの洗浄による排除効果が実証された。
また、極微量の標的ＤＮＡの選択的な増幅にとって最適な固定化用液及び洗浄液中のＭｇＣｌ_２などの組成成分割合を、シリカ系ナノ空孔材料ごとに検討することで、さらに標的ＤＮＡへの特異性の高いＤＮＡ増幅が可能となることも示唆された。

以上詳述したように、本発明は、極微量ＤＮＡの増幅可能なＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体に関するものであり、更に詳しくは、上記複合体が反応基質である核酸（ＤＮＡ）と相互作用を示し、かつＤＮＡ合成能を安定に発現できる複合化状態にある構造を有することを特徴とするＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体による、非特異的ＤＮＡ増幅を抑制できるＤＮＡの増幅方法、及び数分子の鋳型ＤＮＡを対象とした極微量ＤＮＡの増幅方法などを提供することができる。

本発明は、より具体的には、シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔に固定化されたＤＮＡ合成酵素を反応基質の核酸（ＤＮＡ）の増幅反応に適用する手法を中核とする技術であり、本手法では、シリカ系ナノ空孔材料の規則性細孔（シリカ細孔）の表面への反応基質ＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰｓの吸着を極限まで抑制することができ、更に、シリカ系ナノ空孔材料の中心細孔直径の違いによる、各種ＤＮＡ合成酵素の固定化状態の適正化と、固定化したＤＮＡ合成酵素と相互作用できる各種反応基質（ＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰｓ）の供給量及び反応環境の至適化によって、該ＤＮＡ合成酵素による非特異的ＤＮＡ増幅の抑制及び数分子の極微量ＤＮＡの特異的かつ高感度の増幅を可能にするものである。

更に、本発明は、クローニング、遺伝子発現の解析など分子生物学的手法における、汎用のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）や、環境微生物並びに生体の遺伝子診断、及び各種病原因子の検出などに向けた、等温ＤＮＡ増幅（ＬＡＭＰ法）などにおける、極微量の基質ＤＮＡを対象としたＤＮＡ増幅手法、並びに、極微量の核酸試料、例えば、難培養性微生物の一細胞ゲノムＤＮＡを対象とした、Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ法）、又は、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＭＤＡ法）などの分野における新規の高精度ＤＮＡ増幅手法として適用可能である。

また、ＬＡＭＰ法用のＤＮＡ合成酵素とシリカ系ナノ空孔材料の複合体、さらにはＢＳＡも含む複合体をマイクロ流路内に担持させたマイクロリアクターは、より効率的かつ高精度なＤＮＡ増幅反応を行わせることができるので、信頼性の高い迅速、簡便なＤＮＡ診断法、食品検査法が提供できる。

Claims (18)

1. ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体の製造方法であって、
   （１）シリカ系ナノ空孔材料に対してＤＮＡ合成酵素を含む緩衝液を接触させ、シリカ細孔内にＤＮＡ合成酵素を吸着させる工程、
   （２）得られた沈殿物を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む緩衝溶液に１回以上再懸濁し、遠心分離により回収する工程を設けることを特徴とする、製造方法。
2. 工程（１）で用いる緩衝液が、ＢＳＡを含む緩衝溶液である、請求項１に記載の製造方法。
3. シリカ系ナノ空孔材料が、ＦＳＭ、ＳＢＡ、及びＳＢＡ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅのいずれかから選択される、請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 選択されたＦＳＭの中心細孔直径が２〜４ｎｍであるか、選択されたＳＢＡの中心細孔直径が４〜９ｎｍであるか、又は選択されたＳＢＡ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅの中心細孔直径が１０〜２０ｎｍである、請求項３に記載の製造方法。
5. シリカ系ナノ空孔材料がＦＳＭであって、少なくとも工程（２）で用いるＢＳＡを含む緩衝溶液が、さらにマグネシウム塩及び界面活性剤を含有している、請求項３又は４に記載の製造方法。
6. 工程（１）で用いるＤＮＡ合成酵素を含む緩衝液が、ＢＳＡと共に、マグネシウム塩及び界面活性剤を含有している緩衝液である請求項５に記載の製造方法。
7. シリカ系ナノ空孔材料がＳＢＡ又はＳＢＡ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅであって、少なくとも工程（２）で用いるＢＳＡを含む緩衝溶液が、マグネシウム塩を含有せず、界面活性剤を含有している、請求項３又は４に記載の製造方法。
8. 工程（１）で用いるＤＮＡ合成酵素を含む緩衝液が、ＢＳＡを含み、かつマグネシウム塩を含有せず、界面活性剤を含有している緩衝液である請求項７に記載の製造方法。
9. シリカ系ナノ空孔材料のシリカ細孔内にＤＮＡ合成酵素及びＢＳＡが固定化されて複合体を形成している、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体。
10. シリカ系ナノ空孔材料が、ＦＳＭ、ＳＢＡ、及びＳＢＡ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅのいずれかから選択される、請求項９に記載のＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体。
11. 標的ＤＮＡを、ＢＳＡを含有する緩衝液内で、標的ＤＮＡの増幅用プライマー及びｄＮＴＰｓと共に、請求項９又は１０に記載のＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体を作用させることで増幅させることを特徴とする、標的ＤＮＡの増幅方法。
12. 被検試料中の標的ＤＮＡの検出又は同定する方法であって、下記の（１）〜（３）からなる方法；
    （１）被検試料をＢＳＡを含有する緩衝液で希釈する工程、
    （２）請求項９又は１０に記載のＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体を標的ＤＮＡの増幅用プライマー及びｄＮＴＰｓと共に作用させて、標的ＤＮＡを増幅する工程
    （３）標的ＤＮＡを検出する工程。
13. 被検試料中の標的ＤＮＡの含有量が、０．０１ｆｇ／ｍｌ〜１．０μｇ／ｍｌである、請求項１２に記載の方法。
14. ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体がマイクロ流路内部に担持されたマイクロリアクターであって、
    前記ＤＮＡ合成酵素が、ＬＡＭＰ法によるＤＮＡ増幅反応に用いるためのＤＮＡ合成酵素であり、かつ当該酵素がシリカ系ナノ空孔材料の細孔内部に固定化されてＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体を形成していることを特徴とするマイクロリアクター。
15. マイクロ流路内部に担持された前記ＤＮＡ合成酵素−シリカ系ナノ空孔材料複合体に対してさらにＢＳＡが吸着されており、ＤＮＡ合成酵素−ＢＳＡ−シリカ系ナノ空孔材料複合体を形成していることを特徴とする請求項１４に記載のマイクロリアクター。
16. シリカ系ナノ空孔材料が、ＦＳＭ、ＳＢＡ、及びＳＢＡ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅのいずれかから選択される、請求項１４又は１５に記載のマイクロリアクター。
17. ＬＡＭＰ法を用いた核酸の増幅方法であって、下記の（１）〜（５）の工程を含む方法；
    （１）請求項１５又は１６に記載のマイクロリアクターのマイクロ流路内を緩衝液で洗浄する工程、
    （２）流路内部が６５℃になるように加温する工程、
    （３）標的核酸を含むか又は含む可能性のある核酸試料及び標的核酸増幅用プライマーセットを含む反応溶液を送液する工程、
    （４）流路内部で標的核酸を等温核酸増幅させる工程、
    （５）得られた核酸増幅産物を含有する溶液を順次連続的に回収する工程。
18. 核酸増幅産物を回収後、さらに（１）〜（５）の工程を繰り返す、請求項１７に記載の方法。