JP4441610B2 - 核酸の単離方法 - Google Patents
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Description
である。従って、核酸を固体材料に吸着させて、分離する技術は実用性が高い。
を持つシリカ材料が活発に研究され、多くの応用例が報告されている。特に、ナノサイズの細孔空間の利用は、分離、吸着への可能性が高く、活発に研究開発されている(例えば、非特許文献3参照)。
効率よく分離、吸着できることが報告されている(例えば、非特許文献5参照)。オクタ
デシル基を修飾したメソポーラスシリカ(SBA-15)によるポリペプチド、タンパク質の分離も報告されている(例えば、非特許文献6参照)。
ックでない)条件下では両者は結合せず、カオトロピックイオンの濃厚溶液等の特殊な条件が必須となる。
J. Clin. Microbiol. Vol-28,495 (1990)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol-76,615(1979) Mater. Sci. Eng. C, Vol-23, 93 (2003) A. Stein, Adv. Mater., Vol-15, 763 (2003) T. Nassiveraら, J. Chromat. A, Vol-973, 97 (2002) X. Fengら, Science, Vol-276, 923 (1997) J. Zhaoら, Chem. Commun., 752 (2002)
着された核酸とを含む複合体。
本発明において単離される核酸の種類は限定されない。DNAであってもよく、RNAであっ
てもよい。また、DNAとRNAとがハイブリダイズしたものであってもよい。
本発明において、核酸の単離に用いるシリカは、主要細孔径が3〜6nm程度、好ましくは3〜5nm 程度、特に好ましくは3.5〜4.4nm程度の筒状のメソ細孔を有することが必要であ
る。
ることをいう。また、本明細書中では、メソ細孔を有するシリカをメソポーラスシリカということがある。
程度とすればよい。
されているような方法、MCM-41(Mobil社)、FSM-16等の製造方法のような公知の方法を
利用(参考に)して製造することができる。
ミセルがシリカで覆われた六方晶系の(ヘキサゴナル)構造のものが得られる。
コール−ポリエチレングリコール等の中性界面活性剤を使用することができる。
の水溶液(vol)=1:0.1〜0.8程度とするのが好ましい。
(1)核酸とメソポーラスシリカとの複合体の形成
本発明において、核酸を単離するためには、必要に応じて、水、緩衝液等の溶媒中で、上記の核酸含有試料と上記メソポーラスシリカとを混合すればよい。混合時間は核酸がメソポーラスシリカの細孔内に十分に入ることができれば限定されない。例えば、1〜40時
間程度、好ましくは2〜20時間程度とすればよい。また、混合は撹拌下に行うのが好まし
い。撹拌速度も限定されず、適宜選択することができる。例えば、1000〜10000rpm程度、好ましくは2000〜5000rpm程度とすればよい。
〜8程度に調整すればよい。この範囲のpHにおいて、効率良くメソポーラスシリカ中に核
酸を吸着させることができるからである。また、pHを8以上に調整することにより、いっ
たん吸着させた核酸を、メソポーラスシリカから遊離(脱離)させることができる。
、好ましくは50〜500mg程度とすればよい。
上記のようにして得られた核酸含有メソポーラスシリカは、濾過、遠心分離等の公知の方法で回収することができる。
カを添加することにより、核酸をメソポーラスシリカから遊離させることができる。
る。
平均細孔径2.3nmのメソポーラスシリカ(メソポーラスシリカ1)の調製
本明細書における実施例で使用するメソポーラスシリカは、米国特許公報第5,143,879
号に記載の方法に基いて得ることができる。
塩酸−エタノール溶液(1 M)400 mlで加熱還流し(2時間)、ろ別までの操作を2度行い
、ロート上で洗浄(イオン交換水300 ml)し、120 ℃で一晩乾燥させた(収量11.765 g、収率79.1 %)。得られたメソポーラスシリカの細孔径を、窒素吸着等温線を用いてDH法で測定したところ、2.3nmであった。
細孔径3.0nmのメソポーラスシリカ(メソポーラスシリカ2)の調製
水酸化ナトリウム(2.704 g、67.60 mmol)にイオン交換水(97 ml、5.389 mmol)を加えて、均一溶液とした。その水酸化ナトリウム水溶液をn-ヘキサデシルトリメチルアンモニウム・ブロミド(9.853 g、27.04 mmol)に加え、室温で30分間撹拌した。
℃、20時間)を行った。
細孔径3.5nmのメソポーラスシリカ(メソポーラスシリカ3)の調製
水酸化ナトリウム(2.528 g、64.55 mmol)にイオン交換水(93 ml、5.167 mol)を加
えて、均一溶液とした。その水酸化ナトリウム水溶液をn-オクタデシルトリメチルアンモニウム・ブロミド(10.133 g、25.82 mmol)に加え、室温で30分間撹拌した。
℃、20時間)を行った。
た(収量11.841 g、収率79.2 %)。得られたメソポーラスシリカの細孔径を、窒素吸着等温線を用いてDH法で測定したところ、3.5nmであった。
細孔径3.5nmのメソポーラスシリカ(メソポーラスシリカ4)の調製(別の方法)
水酸化ナトリウム(2.604 g、65.10 mmol)にイオン交換水(94 ml、5.222 mol)を加
えて、均一溶液とした。その水酸化ナトリウム水溶液をn-ヘキサデシルトリメチルアンモニウム・ブロミド(9.487 g、26.03 mmol)に加え、室温で30分間撹拌させた。その後、
界面活性剤の膨潤剤としてメシチレン(1.572 g、13.14 mmol)を滴下し、10分間、室温
で撹拌した。
)を加え、30分間撹拌させたものをオートクレーブ中で恒温槽に入れて、水熱合成(115 ℃,20時間)を行った。
)。このうち19.00 gを塩酸−エタノール溶液(1 M)400 mlで加熱還流(2時間)、ろ別
までの操作を2度行い、ロート上での洗浄(イオン交換水300 ml)、120 ℃で一晩乾燥さ
せた(収量12.26 g、収率79.8 %)。得られたメソポーラスシリカの細孔径を、窒素吸着
等温線を用いてDH法で測定したところ、3.5nmであった。
細孔径4.4nmのメソポーラスシリカ(メソポーラスシリカ5)の調製
加えるメシチレンを3.144 g(26.28 mmol)とした以外は、合成例4と同様にして実験
を行った。最終サンプルの収量は11.95 g(収率77.8 %)であった。得られたメソポーラ
スシリカの細孔径を、窒素吸着等温線を用いてDH法で測定したところ、4.4nmであった。
細孔径5.3nmのメソポーラスシリカ(メソポーラスシリカ6)の調製
加えるメシチレンを4.716 g(39.42 mmol)とした以外は、合成例4と同様にして実験
を行った。最終サンプルの収量は11.45 g(収率74.5 %)であった。得られたメソポーラ
スシリカの細孔径を、窒素吸着等温線を用いてDH法で測定したところ、5.3nmであった。
細孔径5.6nmのメソポーラスシリカ(メソポーラスシリカ7)の調製
加えるメシチレンを6.288 g(52.56 mmol)とした以外は、合成例4と同様にして実験
を行った。最終サンプルの収量は12.15 g(収率79.1 %)であった。得られたメソポーラ
スシリカの細孔径を、窒素吸着等温線を用いてDH法で測定したところ、5.6nmであった。
100 mlのメスフラスコにサケの二本鎖DNAを5 mg取り、100mlのイオン交換水に溶解させ、そこから10mlずつ採取してDNAの水溶液を準備した。そこに、上記合成例1〜7で得られ
たメソポーラスシリカをそれぞれ50mgずつ添加し、室温で20時間撹拌した。
吸光度を測定し、強度を比較することによって吸着率、吸着量を得た。
の)シャケの二本鎖DNAの吸着率の結果を示す。プロトン型のDNAは、メソポーラスシリカ3、4、5に特異的に吸着することがわかる。また、不定形のアモルファスシリカ(シリカ
ゲル、Merck Silica gel 60)にはDNAが全く吸着しないこともわかる。さらに、ナトリウム型のDNAは、どのメソポーラスシリカにおいても吸着されないことがわかる。
、アモルファスシリカ(シリカゲル)もDNAを吸着することがわかる。
合成例2、4及び5(メソポーラスシリカ2、4及び5)において、塩酸−エタノール溶液で加熱還流する代わりに、550℃で12時間の焼成を行ってメソポーラスシリカを得た。この
焼成により得られたメソポーラスシリカを用いて、実施例1と同様にDNAの吸着実験を行った。結果を表3に示す。
メソポーラスシリカは、焼成により得られたメソポーラスシリカに比して、DNAの吸着率
が非常に高いことが分かる。
Claims (3)
- ピーク細孔径が3.5〜4.4nmである筒状のメソ細孔を有するシリカを含む核酸の吸着剤。
- ピーク細孔径が3.5〜4.4nmである筒状のメソ細孔を有するシリカと、前記メソ細孔中に吸着された核酸とを含む複合体。
- ピーク細孔径が3.5〜4.4nmである筒状のメソ細孔を有するシリカと核酸含有試料とを混合することにより、核酸をシリカの細孔中に吸着させる工程を含む、核酸の単離方法。
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