JP6143921B2 - ヒトｅｐｏ受容体に対する抗体 - Google Patents
ヒトｅｐｏ受容体に対する抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6143921B2 JP6143921B2 JP2016123178A JP2016123178A JP6143921B2 JP 6143921 B2 JP6143921 B2 JP 6143921B2 JP 2016123178 A JP2016123178 A JP 2016123178A JP 2016123178 A JP2016123178 A JP 2016123178A JP 6143921 B2 JP6143921 B2 JP 6143921B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- seq
- heavy chain
- region
- epo
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 title claims description 8
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 title claims description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 23
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 23
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 18
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims description 10
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 8
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 4
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 claims 1
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 58
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 26
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 24
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 24
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 24
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 19
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 19
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 17
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 101000852145 Homo sapiens Erythropoietin receptor Proteins 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 101100118983 Homo sapiens EPOR gene Proteins 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 7
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 7
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- -1 L) ) Chemical compound 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 208000031637 Erythroblastic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000036566 Erythroleukaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000004097 Protein phosphatase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000506 Protein phosphatase inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 201000004283 Shwachman-Diamond syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000021841 acute erythroid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000012219 cassette mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
発明の背景
ヒトエリスロポエチン（EPO）は、赤血球前駆細胞の増殖および分化に関与する166-aaの糖タンパク質である。これらの細胞応答は、508-aaの糖タンパク質であるヒトEPO受容体（EPO-R）により媒介される。ヒトEPO受容体（EPO-R）は単一の膜貫通ドメインを含有する508アミノ酸長のタンパク質であり（Swiss Prot P19235）、およびクラスIサイトカイン受容体の成長ホルモンサブファミリーのメンバーとして分類されている。EPO-Rは、例えば、Winkelmann, J.C. et al., Blood 76 (1990) 24-30、およびJones, S.S. et al., Blood 76 (1990) 31-35において記載されている。EPO-Rの活性化は二量体化により起きる（Matthews, D.J., PNAS 93 (1996) 9471-9476）。EPO-Rは、EPOでの刺激時にリン酸化されて「活性化EPO-R」をもたらす、8箇所の細胞質内チロシン部位を含む（Li, K. et al., J. Biol. Chem. 278 (2003) 40702-40709; Wu, H.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 1806-1810）。
ヒトエリスロポエチン（EPO）は、赤血球前駆細胞の増殖および分化に関与する166-aaの糖タンパク質である。これらの細胞応答は、508-aaの糖タンパク質であるヒトEPO受容体（EPO-R）により媒介される。ヒトEPO受容体（EPO-R）は単一の膜貫通ドメインを含有する508アミノ酸長のタンパク質であり（Swiss Prot P19235）、およびクラスIサイトカイン受容体の成長ホルモンサブファミリーのメンバーとして分類されている。EPO-Rは、例えば、Winkelmann, J.C. et al., Blood 76 (1990) 24-30、およびJones, S.S. et al., Blood 76 (1990) 31-35において記載されている。EPO-Rの活性化は二量体化により起きる（Matthews, D.J., PNAS 93 (1996) 9471-9476）。EPO-Rは、EPOでの刺激時にリン酸化されて「活性化EPO-R」をもたらす、8箇所の細胞質内チロシン部位を含む（Li, K. et al., J. Biol. Chem. 278 (2003) 40702-40709; Wu, H.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 1806-1810）。
EPO-Rに対する抗体は、例えば、Andrea, A.D., Blood 82 (1993) 46-52; Elliott, S., Blood 107 (2006) 1892-1895; Kirkeby, A., J. Nerosci. 164 (2007) 50-58; Miura, O., Arch. Biochem. 306 (1993) 200-208; およびEP 1 146 056、EP 1 327 681、EP 0 773 962、EP 0 776 370、US 2002/0031806、US 2003/0215444、US 2004/0058393、US 2004/0071694、US 2004/0175379、US 2005/0227289、US 2005/0244409、US 2006/0018902、US 6,998,124、US 7,053,184、US 7,081,523、WO 1995/005469、WO 1996/003438、WO 2000/061637、WO 2004/035603 A2、WO 2005/100403 A2より公知である。しかしながら、EPO-Rに対する公知の抗体は非活性化EPO-Rと、活性化EPO-Rとを区別できないことが当技術分野では公知である（Jelkmann, W. et al., Crit. Rev. Onc/Hematol. 67 (2008) 39-61; Li, K. et al., J. Biol. Chem. 278 (2003) 40702-40709、およびWu, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 1806-1810を参照されたい）。
本発明は、活性化ヒトEPO受容体に特異的に結合し、かつ非活性化EPO-Rと、活性化EPO-Rとを区別し、特にヒト組織由来の細胞および生検材料においてEPO-Rの活性化の特異的解析を可能にする抗体を含む。
本発明は、ヒトEPO受容体断片である以下：
430位にリン酸化チロシン残基（下線）を含む
、461位にリン酸化チロシン残基（下線）を含む
、または465位にリン酸化チロシン残基（下線）を含む
に、特異的に結合することを特徴とする抗体を含む。
430位にリン酸化チロシン残基（下線）を含む
ナンバリングは、シグナルペプチドを含まないUniProtKB/Swiss-Prot P19235のEPO受容体アミノ酸配列に関連する。
本発明記載の抗体は、EPO受容体断片である以下：
430位にリン酸化チロシン残基を含まない
、461位にリン酸化チロシン残基を含まない
、または465位にリン酸化チロシン残基を含まない
、には結合しない。
430位にリン酸化チロシン残基を含まない
本発明記載の抗体は、細胞が細胞当たり100.000〜500.000の量の受容体EPO-Rを発現し（EPO-R発現細胞）、活性化のために500 pM EPOで処理されているUT7細胞の溶解物において、リン酸化（活性化）EPO受容体に特異的に結合する。本発明記載の抗体は、EPO受容体を発現し、EPOで処理されていないUT7細胞の溶解物においてはEPO受容体に結合しない。そのような結合は、ウエスタンブロットによって測定することができる。
好ましくは、本発明は、重鎖可変ドメインCDR3領域としてSEQ ID NO: 1、9、または17のCDR3領域を含むことを特徴とする、ヒトEPO-Rに結合する抗体を含む。
好ましくは、抗体は、重鎖可変ドメインが、SEQ ID NO: 1のCDR3領域、SEQ ID NO:2のCDR2領域、およびSEQ ID NO:3のCDR1領域、または、SEQ ID NO:9のCDR3領域、SEQ ID NO:10のCDR2領域、およびSEQ ID NO:11のCDR1領域、または、SEQ ID NO:17のCDR3領域、SEQ ID NO:18のCDR2領域、およびSEQ ID NO:19のCDR1領域を含むことを特徴とする。
好ましくは、抗体は、重鎖可変ドメインが、SEQ ID NO: 1のCDR3領域、SEQ ID NO:2のCDR2領域、およびSEQ ID NO:3のCDR1領域を含むこと、ならびに軽鎖可変ドメインが、SEQ ID NO: 4のCDR3領域、SEQ ID NO:5のCDR2領域、およびSEQ ID NO:6のCDR1領域を含むことを特徴とする。
好ましくは、抗体は、重鎖可変ドメインが、SEQ ID NO: 9のCDR3領域、SEQ ID NO:10のCDR2領域、およびSEQ ID NO:11のCDR1領域を含むこと、ならびに軽鎖可変ドメインが、SEQ ID NO: 12のCDR3領域、SEQ ID NO:13のCDR2領域、およびSEQ ID NO:14のCDR1領域を含むことを特徴とする。
好ましくは、抗体は、重鎖可変ドメインが、SEQ ID NO: 17のCDR3領域、SEQ ID NO:18のCDR2領域、およびSEQ ID NO:19のCDR1領域を含むこと、ならびに軽鎖可変ドメインが、SEQ ID NO: 20のCDR3領域、SEQ ID NO:21のCDR2領域、およびSEQ ID NO:22のCDR1領域を含むことを特徴とする。
好ましくは、抗体は、重鎖可変ドメインがSEQ ID NO:7、15、または23を含むことを特徴とする。
好ましくは、抗体は、軽鎖可変ドメインがSEQ ID NO:8、16、または24を含むことを特徴とする。
好ましくは、抗体は、重鎖可変ドメインがSEQ ID NO:7を含み、および軽鎖可変ドメインがSEQ ID NO:8を含むことを特徴とする。
好ましくは、抗体は、重鎖可変ドメインがSEQ ID NO:15を含み、および軽鎖可変ドメインがSEQ ID NO:16を含むことを特徴とする。
好ましくは、抗体は、重鎖可変ドメインがSEQ ID NO:23を含み、および軽鎖可変ドメインがSEQ ID NO:24を含むことを特徴とする。
好ましくは、本発明記載の抗体は、少なくとも10-8 M-1〜10-12 M-1の結合親和性でEPO-Rに結合することを特徴とする。
本発明のさらなる態様は、本発明記載の抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸である。
ヒトおよび他の定常鎖は当技術分野では周知であり、ならびに、例えばKabatにより記載されている（例えば、Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照されたい）。抗体はマウス由来であり、およびKabatによるマウス抗体の抗体可変配列フレームを含むことがさらに好ましい（例えば、Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照されたい）。
本発明記載の抗体は、好ましくは、マウス、ウサギ、またはヒト由来である。ヒト抗体としては、アイソタイプIgG1が好ましい。
本発明はさらに、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において本発明記載の核酸を発現することができる、該核酸を含有する発現ベクター、および該抗体の組換え生産のための該ベクターを含有する宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、本発明記載のベクターを含む原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞を含む。
本発明はさらに、本発明記載の組換えヒトまたはヒト化抗体の生産のための方法であって、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において本発明記載の核酸を発現すること、および該細胞または細胞培養上清から該抗体を回収することにより特徴付けられる方法を含む。本発明はさらに、そのような組換え法により取得可能な抗体を含む。
本発明はさらに、活性化EPO受容体を有する／発現する哺乳動物細胞を測定する／検出するための本発明記載の抗体の使用を含む。
好ましくは、本発明記載の抗体は、ヒト組織試料の生検材料の溶解物において活性化EPO受容体を測定するために使用される。好ましくは、そのような検出はウエスタンブロットにより行われる。
[本発明1001]
EPO受容体断片である以下：
430位にリン酸化チロシン残基を含む
、461位にリン酸化チロシン残基を含む
、または465位にリン酸化チロシン残基を含む
に、特異的に結合することを特徴とする、ヒトEPO受容体に結合する、抗体。
[本発明1002]
重鎖可変ドメインCDR3領域として、SEQ ID NO: 1、9、または17のCDR3領域を含むことを特徴とする、本発明1001の抗体。
[本発明1003]
重鎖可変ドメインが、SEQ ID NO: 1のCDR3領域、SEQ ID NO:2のCDR2領域、およびSEQ ID NO:3のCDR1領域、または、SEQ ID NO:9のCDR3領域、SEQ ID NO:10のCDR2領域、およびSEQ ID NO:11のCDR1領域、または、SEQ ID NO:17のCDR3領域、SEQ ID NO:18のCDR2領域、およびSEQ ID NO:19のCDR1領域を含むことを特徴とする、本発明1001の抗体。
[本発明1004]
重鎖可変ドメインがSEQ ID NO:7を含み、かつ軽鎖可変ドメインがSEQ ID NO:8を含むこと、または、重鎖可変ドメインがSEQ ID NO:15を含み、かつ軽鎖可変ドメインがSEQ ID NO:16を含むこと、または、重鎖可変ドメインがSEQ ID NO:23を含み、かつ軽鎖可変ドメインがSEQ ID NO:24を含むことを特徴とする、本発明1001または1002の抗体。
[本発明1005]
本発明1003の抗体の重鎖をコードし、該重鎖が、SEQ ID NO: 1のCDR3領域、SEQ ID NO:2のCDR2領域、およびSEQ ID NO:3のCDR1領域、または、SEQ ID NO:9のCDR3領域、SEQ ID NO:10のCDR2領域、およびSEQ ID NO:11のCDR1領域、または、SEQ ID NO:17のCDR3領域、SEQ ID NO:18のCDR2領域、およびSEQ ID NO:19のCDR1領域を含むことを特徴とする、核酸。
[本発明1006]
本発明1004の抗体の重鎖をコードし、該重鎖が、可変ドメインとしてSEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、またはSEQ ID NO:19を含むことを特徴とする、核酸。
[本発明1007]
本発明1001〜1004のいずれかの抗体を含む診断キットの製造のための、方法。
[本発明1008]
本発明1005または1006の核酸を含むことを特徴とする、発現ベクター。
[本発明1009]
本発明1008のベクターを含むことを特徴とする、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞。
[本発明1010]
本発明1003または1004の組換えヒトまたはヒト化抗体の生産のための方法であって、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において本発明1005または1006の核酸を発現すること、および該細胞または細胞培養上清から該抗体を回収することにより特徴付けられる、方法。
[本発明1011]
ヒト細胞組織、および生検材料における活性化EPO受容体の測定のための、本発明1001〜1004のいずれかの抗体の使用。
[本発明1012]
試料がヒト組織の溶解物であることを特徴とする、本発明1011の使用。
[本発明1013]
測定がウエスタンブロットまたはELISAにより行われることを特徴とする、本発明1012の使用。
[本発明1014]
ヒト細胞組織、および生検材料における活性化EPO受容体の測定での使用のための、本発明1001〜1004のいずれかの抗体。
[本発明1001]
EPO受容体断片である以下：
430位にリン酸化チロシン残基を含む
[本発明1002]
重鎖可変ドメインCDR3領域として、SEQ ID NO: 1、9、または17のCDR3領域を含むことを特徴とする、本発明1001の抗体。
[本発明1003]
重鎖可変ドメインが、SEQ ID NO: 1のCDR3領域、SEQ ID NO:2のCDR2領域、およびSEQ ID NO:3のCDR1領域、または、SEQ ID NO:9のCDR3領域、SEQ ID NO:10のCDR2領域、およびSEQ ID NO:11のCDR1領域、または、SEQ ID NO:17のCDR3領域、SEQ ID NO:18のCDR2領域、およびSEQ ID NO:19のCDR1領域を含むことを特徴とする、本発明1001の抗体。
[本発明1004]
重鎖可変ドメインがSEQ ID NO:7を含み、かつ軽鎖可変ドメインがSEQ ID NO:8を含むこと、または、重鎖可変ドメインがSEQ ID NO:15を含み、かつ軽鎖可変ドメインがSEQ ID NO:16を含むこと、または、重鎖可変ドメインがSEQ ID NO:23を含み、かつ軽鎖可変ドメインがSEQ ID NO:24を含むことを特徴とする、本発明1001または1002の抗体。
[本発明1005]
本発明1003の抗体の重鎖をコードし、該重鎖が、SEQ ID NO: 1のCDR3領域、SEQ ID NO:2のCDR2領域、およびSEQ ID NO:3のCDR1領域、または、SEQ ID NO:9のCDR3領域、SEQ ID NO:10のCDR2領域、およびSEQ ID NO:11のCDR1領域、または、SEQ ID NO:17のCDR3領域、SEQ ID NO:18のCDR2領域、およびSEQ ID NO:19のCDR1領域を含むことを特徴とする、核酸。
[本発明1006]
本発明1004の抗体の重鎖をコードし、該重鎖が、可変ドメインとしてSEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、またはSEQ ID NO:19を含むことを特徴とする、核酸。
[本発明1007]
本発明1001〜1004のいずれかの抗体を含む診断キットの製造のための、方法。
[本発明1008]
本発明1005または1006の核酸を含むことを特徴とする、発現ベクター。
[本発明1009]
本発明1008のベクターを含むことを特徴とする、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞。
[本発明1010]
本発明1003または1004の組換えヒトまたはヒト化抗体の生産のための方法であって、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において本発明1005または1006の核酸を発現すること、および該細胞または細胞培養上清から該抗体を回収することにより特徴付けられる、方法。
[本発明1011]
ヒト細胞組織、および生検材料における活性化EPO受容体の測定のための、本発明1001〜1004のいずれかの抗体の使用。
[本発明1012]
試料がヒト組織の溶解物であることを特徴とする、本発明1011の使用。
[本発明1013]
測定がウエスタンブロットまたはELISAにより行われることを特徴とする、本発明1012の使用。
[本発明1014]
ヒト細胞組織、および生検材料における活性化EPO受容体の測定での使用のための、本発明1001〜1004のいずれかの抗体。
発明の詳細な説明
「抗体」という用語は、抗体全体および抗体断片を含むがそれらに限定されない、種々の形態の抗体構造を包含する。
「抗体」という用語は、抗体全体および抗体断片を含むがそれらに限定されない、種々の形態の抗体構造を包含する。
「抗体断片」とは、完全長抗体の一部、好ましくはその可変ドメイン、または少なくともその抗原結合部位を含む。抗体断片の例は、二重特異性抗体、一本鎖抗体分子、および抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。scFv抗体は、例えば、Houston, J.S., Methods Enzymol. 203 (1991) 46-88において記載されている。さらに、抗体断片は、VHドメインの特徴、すなわちVLドメインとアセンブルすることができること、または、EPO-Rに結合するVLドメインの特徴、すなわちVHドメインとアセンブルすることができること、を有し、機能的な抗原結合部位を形成してそれによってヒトEPO-Rに特異的に結合する特性を有する抗体を提供する、一本鎖ポリペプチドを含む。
「ヒト化抗体」という用語は、親イムノグロブリンと比較して異なる種のイムノグロブリンの「相補性決定領域」（CDR）を含むように、フレームワークおよび／またはCDRが改変されている抗体を指す。好ましい態様において、「ヒト化抗体」を調製するためにマウスCDRがヒト抗体のフレームワーク領域中へ移植される。例えば、Riechmann, L. et al., Nature 332 (1988) 323-327；およびNeuberger, M.S. et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照されたい。
「SEQ ID NO:1の重鎖CDR3領域を含む」という用語は、抗体がその重鎖CDR3領域の配列としてSEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含むことを示す。抗体の他の5箇所のCDR領域について同じことを示す。
「活性化EPO-Rへの結合」という用語は、本明細書において使用されるとき、ウエスタンブロッティングによって測定される生化学的結合アッセイにおけるヒト活性化EPO-Rへの抗体の結合を意味する。1μg/mlの抗体濃度で400以上のS/N（シグナル／ノイズ）比を抗体がもたらす場合、結合が見出される。「EPO-Rへ結合しない」という用語は、本明細書において使用されるとき、ウエスタンブロッティングによって測定される生化学的結合アッセイにおけるヒトEPO-Rへの抗体の結合を意味する。1μg/mlの抗体濃度で400未満のS/N（シグナル／ノイズ）比を抗体がもたらす場合、結合は見出されない。本発明記載の抗体の非活性化EPO Rへの結合はウエスタンブロットにおいて検出不可能であり、そのためS/N比は10よりいっそう低く、好ましくは約1以下である。
「EPOのEPO受容体への結合」という用語は、本明細書において使用されるとき、ウエスタンブロッティングによって測定される生化学的結合アッセイにおけるヒト活性化EPO-RへのEPOの結合を意味する。1μg/mlのEPO濃度でわずか10のS/N（シグナル／ノイズ）比しかEPOがもたらさない場合、結合は見出されない。
「pY430」という用語は、本明細書において使用されるとき、430位にリン酸化チロシン残基を含む、成熟ヒトエリスロポエチン受容体の424〜437残基に相当する17アミノ酸の合成ペプチド
を意味する。「pY461」という用語は、本明細書において使用されるとき、461位にリン酸化チロシン残基を含む、成熟ヒトエリスロポエチン受容体の455〜471残基に相当する17アミノ酸の合成ペプチド
を意味する。「pY465」という用語は、本明細書において使用されるとき、465位にリン酸化チロシン残基を含む、成熟ヒトエリスロポエチン受容体の455〜471残基に相当する17アミノ酸の合成ペプチド
を意味する。
本発明記載の抗体は、0.1μg/mlの抗体濃度でELISAにおいて10以上のS/N比で、pY430、pY461、またはpY465に特異的に結合することを特徴とする。
「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（VL）、重鎖の可変ドメイン（VH））とは、本明細書において使用されるとき、抗体を抗原に結合させることに直接関与する軽鎖と重鎖のドメインのペアの各々を示す。可変性の、軽鎖および重鎖のドメインは同じ一般構造を有し、かつ各ドメインは配列が広く保存され、3箇所の「超可変領域」（または相補性決定領域、CDR）により連結される4箇所のフレームワーク（FR）領域を含む。フレームワーク領域はβ-シートコンフォメーションをとり、CDRはβ-シート構造を連結するループを形成し得る。各鎖におけるCDRはフレームワーク領域により三次元構造に保持され、もう一方の鎖由来のCDRと共に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖および軽鎖のCDR3領域は、本発明記載の抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たし、それによって本発明のさらなる対象を提供する。
「抗体の抗原結合部分」という用語は、本明細書において使用される際、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」または「CDR」由来のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」または「FR」領域とは、本明細書において定義されるような超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。そのため、抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインは、N-末端からC-末端へドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含む。特に、重鎖のCDR3は抗原結合に最も貢献し、および抗体の特性を定義する領域である。CDRおよびFR領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的定義、および／または「超可変ループ」由来の残基に従って決定される。
「核酸」または「核酸分子」という用語は、本明細書において使用されるとき、DNA分子およびRNA分子を含むように意図される。核酸分子は1本鎖または2本鎖であり得るが、好ましくは2本鎖DNAである。
「アミノ酸」という用語は、本出願内で使用されるとき、アラニン（3文字表記：ala、1文字表記：A）、アルギニン（arg、R）、アスパラギン（asn、N）、アスパラギン酸（asp、D）、システイン（cys、C）、グルタミン（gln、Q）、グルタミン酸（glu、E）、グリシン（gly、G）、ヒスチジン（his、H）、イソロイシン（ile、I）、ロイシン（leu、L）、リジン（lys、K）、メチオニン（met、M）、フェニルアラニン（phe、F）、プロリン（pro、P）、セリン（ser、S）、スレオニン（thr、T）、トリプトファン（trp、W）、チロシン（tyr、Y）、およびバリン（val、V）を含む天然に存在するカルボキシα-アミノ酸の群を示す。
核酸は、別の核酸と機能的な関係に配置される際に「機能的に連結される」。例えば、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合には、プレ配列または分泌リーダーのためのDNAがポリペプチドのためのDNAに機能的に連結され；配列の転写に影響を及ぼす場合には、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列に機能的に連結され；または、翻訳を促進するように配置される場合には、リボソーム結合部位がコード配列に機能的に連結される。一般に、「機能的に連結される」とは、連結されるDNA配列が同一線上にあり、分泌リーダーの場合には、隣接し、かつリーディングフレームにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は適切な制限酵素部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
本明細書において使用されるとき、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養」という表現は互換的に使用され、およびすべてのそのような名称は子孫を含む。従って、「形質転換体」および「形質転換された細胞」という単語は、初代の対象細胞、および継代の数にかかわらずそれに由来する培養物を含む。作為的または偶発的変異のために、すべての子孫がDNAの内容において正確に同一ではない可能性があることもまた理解される。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングされたのと同じ機能または生物活性を有する変異体子孫が含まれる。
有用なヒト重鎖定常領域の例は、SEQ ID NO: 23のアミノ酸を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、SEQ ID NO: 24のκ-軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。
本発明は、ヒト細胞組織、および生検材料における活性化EPO-Rの検出または測定のための方法を含む。
本発明は、ヒト細胞組織、および生検材料における活性化EPO-Rの診断のための、本発明記載の抗体の使用を含む。
本発明は、ヒト細胞組織、および生検材料において活性化EPO-Rを検出または測定する目的での診断アッセイの調製のための、本発明記載の抗体の使用を含む。
本発明記載の抗体は、さらに、本発明記載の抗体の上述された特徴に影響を及ぼさないかまたは変化させないヌクレオチドおよびアミノ酸配列の改変である、「保存的配列改変」を有するような抗体（変異体抗体）を含む。改変は、部位特異的変異誘発およびPCRを介する変異誘発などの、当技術分野において公知である標準的技術により導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものを含む。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β-分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。従って、ヒト抗EPO-R抗体において予測される非必須のアミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置き換えることができる。そのため本明細書において、「変異体」抗EPO-R抗体とは、「親」抗EPO-R抗体アミノ酸配列から、親抗体の1つまたは複数の可変領域において10箇所までの、好ましくは約2〜約5箇所の、付加、欠失、および／または置換によりアミノ酸配列が異なる分子を指す。アミノ酸置換は、Riechmann, L. et al., Nature 332 (1988) 323-327 and Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033により記載されるような、分子モデリングに基づく変異誘発により行うことができる。
本発明記載の抗体は、好ましくは組換え手段により生産される。そのような方法は当技術分野では広く知られており、ならびに、その後の抗体ポリペプチドの単離、および通常薬学的に許容される純度への精製を伴う、原核生物および真核生物細胞におけるタンパク質発現を含む。タンパク質発現のために、軽鎖および重鎖またはそれらの断片をコードする核酸を、標準的方法により発現ベクター中に挿入する。CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、酵母、または大腸菌（E. coli）細胞などの適切な原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において発現を行い、および細胞から（上清からまたは細胞溶解後）抗体を回収する。
抗体の組換え生産は、当技術分野では周知であり、および、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S. et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の総説論文において記載されている。
抗体は、細胞全体において、細胞溶解物において、または、部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態において存在し得る。他の細胞成分または他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質を除去するために、アルカリ／SDS処理、CsClバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野において周知である他のものを含む標準的技術により、精製を行う。Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照されたい。
NSO細胞における発現は、例えば、Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270により記載されている。一過性発現は、例えば、Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9により記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87により記載されている。好ましい一過性発現系（HEK 293）は、Schlaeger, E.-J. and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83により、およびSchlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199により記載されている。
モノクローナル抗体は、例えば、プロテインA-Sepharose、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来のイムノグロブリン精製手順により、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするDNAおよびRNAは、従来の手順を用いて容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAおよびRNAの供給源として働き得る。ひとたび単離すると、DNAを発現ベクター中に挿入してもよく、その後、宿主細胞において組換えモノクローナル抗体の合成を得るために、別のイムノグロブリンタンパク質を産生しないHEK 293細胞、CHO細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞中に発現ベクターをトランスフェクションする。
ヒトEPO-R抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするDNA中に適切なヌクレオチド変化を導入することにより、またはペプチド合成により調製する。しかしながら、そのような改変は、例えば上述されるような非常に限定された範囲においてのみ行うことができる。例えば、改変は、IgGアイソタイプおよびエピトープ結合などの上述の抗体の特徴を変化させないが、組換え生産の収率、タンパク質安定性を改善し得るか、または精製を促進し得る。
抗EPO-R抗体の適切なコンフォメーションを維持することに関与しない任意のシステイン残基はまた、分子の酸化安定性を改善するため、および異常な架橋を予防するために、一般的にセリンで置換してもよい。逆に、抗体の安定性を改善するために、システイン結合を抗体に付加してもよい（特に、抗体がFv断片などの抗体断片である場合）。
抗EPO-R抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野において公知である様々な方法により調製される。これらの方法は、天然供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）、または、ヒト化抗EPO-R抗体の以前に調製された変異体もしくは非変異体バージョンのオリゴヌクレオチド媒介（もしくは部位特異的）変異誘発、PCR変異誘発、およびカセット変異誘発による調製を含むが、それらに限定されない。
本発明記載の重鎖および軽鎖可変ドメインは、発現ベクター構築物を形成するために、プロモーター、翻訳開始、定常領域、3'非翻訳領域、ポリアデニル化、および転写終結の配列と併用される。重鎖および軽鎖の発現構築物は、両鎖を発現する単一の宿主細胞を形成するために、単一のベクター中に結合することができ、コトランスフェクションすることができ、連続的にトランスフェクションすることができ、または宿主細胞中に別々にトランスフェクションしてその後融合させることができる。
別の局面において、本発明は、例えばヒト細胞組織、および生検材料における活性化EPO-Rの測定のための診断用組成物を提供する。
配列の説明
SEQ ID No: 1 重鎖CDR3、Mab Cl.16.7.5
SEQ ID No: 2 重鎖CDR2、Mab Cl.16.7.5
SEQ ID No: 3 重鎖CDR1、Mab Cl.16.7.5
SEQ ID No: 4 軽鎖CDR3、Mab Cl.16.7.5
SEQ ID No: 5 軽鎖CDR2、Mab Cl.16.7.5
SEQ ID No: 6 軽鎖CDR1、Mab Cl.16.7.5
SEQ ID No: 7 重鎖可変ドメイン、Mab Cl.16.7.5
SEQ ID No: 8 軽鎖可変ドメイン、Mab Cl.16.7.5
SEQ ID No: 9 重鎖CDR3、Mab Cl.8.7.16
SEQ ID No: 10 重鎖CDR2、Mab Cl.8.7.16
SEQ ID No: 11 重鎖CDR1、Mab Cl.8.7.16
SEQ ID No: 12 軽鎖CDR3、Mab Cl.8.7.16
SEQ ID No: 13 軽鎖CDR2、Mab Cl.8.7.16
SEQ ID No: 14 軽鎖CDR1、Mab Cl.8.7.16
SEQ ID No: 15 重鎖可変ドメイン、Mab Cl.8.7.16
SEQ ID No: 16 軽鎖可変ドメイン、Mab Cl.8.7.16
SEQ ID No: 17 重鎖CDR3、Mab Cl.24.11.31
SEQ ID No: 18 重鎖CDR2、Mab Cl.24.11.31
SEQ ID No: 19 重鎖CDR1、Mab Cl.24.11.31
SEQ ID No: 20 軽鎖CDR3、Mab Cl.24.11.31
SEQ ID No: 21 軽鎖CDR2、Mab Cl.24.11.31
SEQ ID No: 22 軽鎖CDR1、Mab Cl.24.11.31
SEQ ID No: 23 重鎖可変ドメイン、Mab Cl.24.11.31
SEQ ID No: 24 軽鎖可変ドメイン、Mab Cl.24.11.31
SEQ ID No: 25 合成ペプチド
SEQ ID No: 26 合成ペプチド
SEQ ID No: 1 重鎖CDR3、Mab Cl.16.7.5
SEQ ID No: 2 重鎖CDR2、Mab Cl.16.7.5
SEQ ID No: 3 重鎖CDR1、Mab Cl.16.7.5
SEQ ID No: 4 軽鎖CDR3、Mab Cl.16.7.5
SEQ ID No: 5 軽鎖CDR2、Mab Cl.16.7.5
SEQ ID No: 6 軽鎖CDR1、Mab Cl.16.7.5
SEQ ID No: 7 重鎖可変ドメイン、Mab Cl.16.7.5
SEQ ID No: 8 軽鎖可変ドメイン、Mab Cl.16.7.5
SEQ ID No: 9 重鎖CDR3、Mab Cl.8.7.16
SEQ ID No: 10 重鎖CDR2、Mab Cl.8.7.16
SEQ ID No: 11 重鎖CDR1、Mab Cl.8.7.16
SEQ ID No: 12 軽鎖CDR3、Mab Cl.8.7.16
SEQ ID No: 13 軽鎖CDR2、Mab Cl.8.7.16
SEQ ID No: 14 軽鎖CDR1、Mab Cl.8.7.16
SEQ ID No: 15 重鎖可変ドメイン、Mab Cl.8.7.16
SEQ ID No: 16 軽鎖可変ドメイン、Mab Cl.8.7.16
SEQ ID No: 17 重鎖CDR3、Mab Cl.24.11.31
SEQ ID No: 18 重鎖CDR2、Mab Cl.24.11.31
SEQ ID No: 19 重鎖CDR1、Mab Cl.24.11.31
SEQ ID No: 20 軽鎖CDR3、Mab Cl.24.11.31
SEQ ID No: 21 軽鎖CDR2、Mab Cl.24.11.31
SEQ ID No: 22 軽鎖CDR1、Mab Cl.24.11.31
SEQ ID No: 23 重鎖可変ドメイン、Mab Cl.24.11.31
SEQ ID No: 24 軽鎖可変ドメイン、Mab Cl.24.11.31
SEQ ID No: 25 合成ペプチド
SEQ ID No: 26 合成ペプチド
実施例1
リン酸化型特異的EPORモノクローナル抗体の生成
pY430（Cl.16.7.5）：430位にリン酸化チロシン残基を含む、成熟ヒトエリスロポエチン受容体の424〜437残基に相当する17アミノ酸の合成ペプチド
を免疫原として使用した。
リン酸化型特異的EPORモノクローナル抗体の生成
pY430（Cl.16.7.5）：430位にリン酸化チロシン残基を含む、成熟ヒトエリスロポエチン受容体の424〜437残基に相当する17アミノ酸の合成ペプチド
pY461（Cl.8.7.16）：461位にリン酸化チロシン残基を含む、成熟ヒトエリスロポエチン受容体の455〜471残基に相当する17アミノ酸の合成ペプチド
を免疫原として使用した。
pY465（Cl.24.11.31）：465位にリン酸化チロシン残基を含む、成熟ヒトエリスロポエチン受容体の455〜471残基に相当する17アミノ酸の合成ペプチド
を免疫原として使用した。
免疫化のために、ペプチドをC末端のシステインを介してKLHに連結した。Balb/cマウスを4週毎に3回免疫原で免疫し、その後融合の4日前にi.v.で追加免疫を行い、脾細胞を収集し、およびAg8骨髄腫細胞と融合させた。リン酸化型特異的抗体のスクリーニングは、標準的手順に従いペプチドでコーティングしたELISAマイクロタイタープレートを用いて、ペプチドのリン酸化型対非リン酸化型（その他の点ではリン酸化ペプチドと同一であった）に対する差次的試験により行った。EPOで刺激された細胞溶解物のウエスタンブロット上でEPORに相当する1本の特異的なバンドを検出したため、抗体クローンを選択した（実施例2）。
SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティング：
SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングは、標準的手順およびInvitrogenのNupage（登録商標）ゲルシステムに従って行った。5.104〜105細胞に相当する溶解物を、Nupage（登録商標） Novex 4-12％ Bis-Tris gelの各ラインにロードした。タンパク質をその後PVDF（ポリフッ化ビニリデン）膜上に転写し、室温で2時間または4℃で一晩、抗体および抗GAPDH抗体（Abcam m9484, Abcam plc UK）とインキュベーションした。洗浄後、膜を抗マウスIgG-POD結合体とインキュベーションし、ECL試薬（Lumi-LightPLUSウエスタンブロッティング基質、Roche Applied Science #2015218）を用いて現像した。
SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングは、標準的手順およびInvitrogenのNupage（登録商標）ゲルシステムに従って行った。5.104〜105細胞に相当する溶解物を、Nupage（登録商標） Novex 4-12％ Bis-Tris gelの各ラインにロードした。タンパク質をその後PVDF（ポリフッ化ビニリデン）膜上に転写し、室温で2時間または4℃で一晩、抗体および抗GAPDH抗体（Abcam m9484, Abcam plc UK）とインキュベーションした。洗浄後、膜を抗マウスIgG-POD結合体とインキュベーションし、ECL試薬（Lumi-LightPLUSウエスタンブロッティング基質、Roche Applied Science #2015218）を用いて現像した。
非活性化EPO受容体に結合することなく活性化EPO受容体のみに特異的に結合することから、抗体Cl.24.11.31、Cl.16.7.5、およびCl.8.7.16を選択した（図1）。
実施例2
UT-7細胞の活性化
UT-7細胞株は、長期の増殖にEPOを必要とするヒト因子依存性赤白血病細胞株（ヒト骨髄急性骨髄性白血病細胞株DSMZ：ACC 137）である。UT7細胞は、L-グルタミン（2mM）、非必須アミノ酸（1×）、およびピルビン酸ナトリウム（1mM）をさらに含むRPMI培地（飢餓培地）において、10％ウシ胎児血清および10U/ml GM-CSFを添加して維持した。形質導入細胞（UT7/EPOR）は、0.4 mg/ml zeocineの添加を伴う非形質導入細胞と同じ培地（10U/mlの代わりに25U/ml GM-CSF）において維持した。各刺激の前に、L-グルタミン（2mM）、非必須アミノ酸（1×）、ピルビン酸ナトリウム（1mM）、および0.1％ウシ胎児血清を添加したRPMI培地における一晩のインキュベーションにより、細胞を飢餓状態にした。
UT-7細胞の活性化
UT-7細胞株は、長期の増殖にEPOを必要とするヒト因子依存性赤白血病細胞株（ヒト骨髄急性骨髄性白血病細胞株DSMZ：ACC 137）である。UT7細胞は、L-グルタミン（2mM）、非必須アミノ酸（1×）、およびピルビン酸ナトリウム（1mM）をさらに含むRPMI培地（飢餓培地）において、10％ウシ胎児血清および10U/ml GM-CSFを添加して維持した。形質導入細胞（UT7/EPOR）は、0.4 mg/ml zeocineの添加を伴う非形質導入細胞と同じ培地（10U/mlの代わりに25U/ml GM-CSF）において維持した。各刺激の前に、L-グルタミン（2mM）、非必須アミノ酸（1×）、ピルビン酸ナトリウム（1mM）、および0.1％ウシ胎児血清を添加したRPMI培地における一晩のインキュベーションにより、細胞を飢餓状態にした。
形質導入：
hEPORをコードするレトロウイルス発現ベクターおよびpVSV-G（ラブドウイルス水疱性口内炎ウイルスのG糖タンパク質をコードする発現ベクター）を一過性にトランスフェクションしたGP2-293（Clontech Laboratories, Inc）細胞由来の上清で、UT-7細胞に形質導入した。形質導入の2日後に、0.4 mg/ml zeocineおよび25U/ml GM-CSFを含有する新しいRPMIで培地を置換した。選択後、EPORを表面上に安定に発現するUT-7細胞の細胞株を取得した。
hEPORをコードするレトロウイルス発現ベクターおよびpVSV-G（ラブドウイルス水疱性口内炎ウイルスのG糖タンパク質をコードする発現ベクター）を一過性にトランスフェクションしたGP2-293（Clontech Laboratories, Inc）細胞由来の上清で、UT-7細胞に形質導入した。形質導入の2日後に、0.4 mg/ml zeocineおよび25U/ml GM-CSFを含有する新しいRPMIで培地を置換した。選択後、EPORを表面上に安定に発現するUT-7細胞の細胞株を取得した。
刺激：
血清を欠乏させた細胞を、指示された時間、500 pMエリスロポエチンで、（0.1％ウシ胎児血清を添加した）飢餓培地において37℃で、1、3、および5分間刺激した。刺激後、細胞を遠心分離し、培地を捨て、ペレットを氷冷した溶解バッファー［トリス20 mM（pH7.4）、NaCl 137 mM、グリセロール 10％、Nonidet（登録商標） P-40 1％、プロテアーゼ阻害剤 1×（Pierce, # 78410）、ホスファターゼ阻害剤 1×（Pierce #78420）］において30分間4℃でインキュベーションし、その後13000 rpm、10分間、4℃での遠心分離を行った。溶解物上清を還元剤の存在下でサンプルバッファー（Nupage（登録商標）, Invitrogen）中で煮沸するか、またはそのまま、のいずれかをSDS-PAGEに使用した。
血清を欠乏させた細胞を、指示された時間、500 pMエリスロポエチンで、（0.1％ウシ胎児血清を添加した）飢餓培地において37℃で、1、3、および5分間刺激した。刺激後、細胞を遠心分離し、培地を捨て、ペレットを氷冷した溶解バッファー［トリス20 mM（pH7.4）、NaCl 137 mM、グリセロール 10％、Nonidet（登録商標） P-40 1％、プロテアーゼ阻害剤 1×（Pierce, # 78410）、ホスファターゼ阻害剤 1×（Pierce #78420）］において30分間4℃でインキュベーションし、その後13000 rpm、10分間、4℃での遠心分離を行った。溶解物上清を還元剤の存在下でサンプルバッファー（Nupage（登録商標）, Invitrogen）中で煮沸するか、またはそのまま、のいずれかをSDS-PAGEに使用した。
実施例1において説明したように標準的な手順に従って、対応するビオチン化ペプチドでコーティングしたマイクロタイタープレート上でのELISAにより、Mabの特異的結合を試験した。1分以内に早くもヒトEPORの明らかな活性化を示すことができ、一方刺激されていない細胞はいかなる検出可能な基礎レベルの活性化も示さない。
実施例3
EPOにより活性化されたUT-7/EPOR細胞へのMabの結合についてのウエスタンブロットアッセイ
UT7/EPOR細胞を上述したように刺激し、ウエスタンブロットにより解析した。ウエスタンブロット上でMabは、0.5nM EPOで1〜5分間刺激した細胞においてEPORに対応するMW 66kDの1本のバンドを認識する（図1）。1分以内に早くもヒトEPORの明らかな活性化を示すことができ、一方刺激されていない細胞はいかなる検出可能な基礎レベルの活性化も示さない（図1）。ローディング対照としてGAPDHを使用した。従って、これらの抗体は、ESA（エリスロポエチン刺激剤）によるEPORの活性化を特異的に解析する。
EPOにより活性化されたUT-7/EPOR細胞へのMabの結合についてのウエスタンブロットアッセイ
UT7/EPOR細胞を上述したように刺激し、ウエスタンブロットにより解析した。ウエスタンブロット上でMabは、0.5nM EPOで1〜5分間刺激した細胞においてEPORに対応するMW 66kDの1本のバンドを認識する（図1）。1分以内に早くもヒトEPORの明らかな活性化を示すことができ、一方刺激されていない細胞はいかなる検出可能な基礎レベルの活性化も示さない（図1）。ローディング対照としてGAPDHを使用した。従って、これらの抗体は、ESA（エリスロポエチン刺激剤）によるEPORの活性化を特異的に解析する。
Claims (12)
- EPO受容体断片である、430位にリン酸化チロシン残基を含む
TPPHLKYLYLVVSD (SEQ ID NO:25)
に特異的に結合することを特徴とする、ヒトEPO受容体に結合する抗体であって、重鎖可変ドメインが、SEQ ID NO:1のCDR3領域、SEQ ID NO:2のCDR2領域、およびSEQ ID NO:3のCDR1領域を含み、かつ軽鎖可変ドメインが、SEQ ID NO:4のCDR3領域、SEQ ID NO:5のCDR2領域、およびSEQ ID NO:6のCDR1領域を含む、抗体。 - 重鎖可変ドメインがSEQ ID NO:7を含み、かつ軽鎖可変ドメインがSEQ ID NO:8を含むことを特徴とする、請求項1記載の抗体。
- 請求項１または２記載の抗体の重鎖、および請求項１または２記載の抗体の軽鎖をコードする核酸。
- 請求項1または２記載の抗体を含む診断キットの製造のための、該抗体の使用。
- 請求項１または２記載の抗体の重鎖をコードする核酸、および請求項１または２記載の抗体の軽鎖をコードする核酸を含むことを特徴とする、発現ベクター。
- 請求項５記載のベクターを含むことを特徴とする、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞。
- 請求項１または２記載の抗体の生産のための方法であって、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において請求項１または２記載の抗体の重鎖をコードする核酸、および請求項１または２記載の抗体の軽鎖をコードする核酸を発現すること、および該細胞または細胞培養上清から該抗体を回収することにより特徴付けられる、方法。
- ヒト細胞組織、および生検材料における活性化EPO受容体の測定のための、請求項1または２記載の抗体の使用。
- 試料がヒト組織の溶解物であることを特徴とする、請求項８記載の使用。
- 測定がウエスタンブロットまたはELISAにより行われることを特徴とする、請求項９記載の使用。
- ヒト細胞組織、および生検材料における活性化EPO受容体の測定での使用のための、請求項1または２記載の抗体。
- 請求項1または２記載の抗体を含む診断キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP09000499.5 | 2009-01-15 | ||
| EP09000499 | 2009-01-15 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2014100146A Division JP5980265B2 (ja) | 2009-01-15 | 2014-05-14 | ヒトｅｐｏ受容体に対する抗体 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017092761A Division JP6363255B2 (ja) | 2009-01-15 | 2017-05-09 | ヒトｅｐｏ受容体に対する抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2016190862A JP2016190862A (ja) | 2016-11-10 |
| JP6143921B2 true JP6143921B2 (ja) | 2017-06-07 |
Family
ID=40379757
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011545672A Pending JP2012514985A (ja) | 2009-01-15 | 2010-01-13 | ヒトｅｐｏ受容体に対する抗体 |
| JP2014100146A Expired - Fee Related JP5980265B2 (ja) | 2009-01-15 | 2014-05-14 | ヒトｅｐｏ受容体に対する抗体 |
| JP2016123178A Expired - Fee Related JP6143921B2 (ja) | 2009-01-15 | 2016-06-22 | ヒトｅｐｏ受容体に対する抗体 |
| JP2017092761A Expired - Fee Related JP6363255B2 (ja) | 2009-01-15 | 2017-05-09 | ヒトｅｐｏ受容体に対する抗体 |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011545672A Pending JP2012514985A (ja) | 2009-01-15 | 2010-01-13 | ヒトｅｐｏ受容体に対する抗体 |
| JP2014100146A Expired - Fee Related JP5980265B2 (ja) | 2009-01-15 | 2014-05-14 | ヒトｅｐｏ受容体に対する抗体 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017092761A Expired - Fee Related JP6363255B2 (ja) | 2009-01-15 | 2017-05-09 | ヒトｅｐｏ受容体に対する抗体 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9221909B2 (ja) |
| EP (1) | EP2387586B1 (ja) |
| JP (4) | JP2012514985A (ja) |
| CN (1) | CN102282174B (ja) |
| CA (3) | CA3018087C (ja) |
| ES (1) | ES2528219T3 (ja) |
| SG (1) | SG172927A1 (ja) |
| WO (1) | WO2010081679A2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017136093A (ja) * | 2009-01-15 | 2017-08-10 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | ヒトｅｐｏ受容体に対する抗体 |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8338439B2 (en) | 2008-06-27 | 2012-12-25 | Celgene Avilomics Research, Inc. | 2,4-disubstituted pyrimidines useful as kinase inhibitors |
| EP3549934A1 (en) | 2008-06-27 | 2019-10-09 | Celgene CAR LLC | Heteroaryl compounds and uses thereof |
| US11351168B1 (en) | 2008-06-27 | 2022-06-07 | Celgene Car Llc | 2,4-disubstituted pyrimidines useful as kinase inhibitors |
| CN102131829A (zh) * | 2008-08-28 | 2011-07-20 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 抗人epo受体抗体 |
| BR112013003388A2 (pt) | 2010-08-10 | 2016-07-12 | Celgene Avilomics Res Inc | sal de besilato de um inibidor de btk |
| JP5957460B2 (ja) | 2010-11-01 | 2016-07-27 | セルジーン アヴィロミクス リサーチ， インコーポレイテッド | 複素環式化合物またはその使用 |
| WO2012061303A1 (en) | 2010-11-01 | 2012-05-10 | Avila Therapeutics, Inc. | Heteroaryl compounds and uses thereof |
| US8796255B2 (en) | 2010-11-10 | 2014-08-05 | Celgene Avilomics Research, Inc | Mutant-selective EGFR inhibitors and uses thereof |
| US8623666B2 (en) | 2011-06-15 | 2014-01-07 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for detecting erythropoietin (EPO) receptor using anti-human EPO receptor antibodies |
| AR088570A1 (es) | 2011-10-28 | 2014-06-18 | Celgene Avilomics Res Inc | Metodos para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con la tirosina quinasa de bruton |
| WO2013138495A1 (en) | 2012-03-15 | 2013-09-19 | Celgene Avilomics Research, Inc. | Solid forms of an epidermal growth factor receptor kinase inhibitor |
| CN104284584B (zh) | 2012-03-15 | 2019-06-04 | 西建卡尔有限责任公司 | 表皮生长因子受体激酶抑制剂的盐 |
| MX368067B (es) | 2012-12-05 | 2019-09-18 | Novartis Ag | Composiciones y métodos para dirigir anticuerpos a la eritropoyetina (epo). |
| US9126950B2 (en) | 2012-12-21 | 2015-09-08 | Celgene Avilomics Research, Inc. | Heteroaryl compounds and uses thereof |
| US9145387B2 (en) | 2013-02-08 | 2015-09-29 | Celgene Avilomics Research, Inc. | ERK inhibitors and uses thereof |
| US9492471B2 (en) | 2013-08-27 | 2016-11-15 | Celgene Avilomics Research, Inc. | Methods of treating a disease or disorder associated with Bruton'S Tyrosine Kinase |
| US9415049B2 (en) | 2013-12-20 | 2016-08-16 | Celgene Avilomics Research, Inc. | Heteroaryl compounds and uses thereof |
| EP3179858B1 (en) | 2014-08-13 | 2019-05-15 | Celgene Car Llc | Forms and compositions of an erk inhibitor |
| CN107922975B (zh) | 2015-08-12 | 2022-06-28 | 诺华股份有限公司 | 治疗眼科病症的方法 |
| JP7320291B2 (ja) | 2021-07-12 | 2023-08-03 | 有限会社 エコ・ライス新潟 | 液体冷凍保存用容器及び飲料の長期保存方法 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100355159B1 (ko) | 1993-08-16 | 2002-12-26 | 이종예 | 인간 에리스로포이에틴 수용체 단편 및 그에 대한 항체 |
| US5885574A (en) | 1994-07-26 | 1999-03-23 | Amgen Inc. | Antibodies which activate an erythropoietin receptor |
| JP2002544123A (ja) | 1999-04-14 | 2002-12-24 | スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション | エリトロポイエチン受容体抗体 |
| US6998124B1 (en) | 1999-04-14 | 2006-02-14 | Smithkline Beecham Corporation | Erythropoietin receptor antibodies |
| US20040058393A1 (en) | 2000-04-17 | 2004-03-25 | Naoshi Fukishima | Agonist antibodies |
| WO2002033073A1 (fr) | 2000-10-20 | 2002-04-25 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anticorps agoniste degrade |
| US7910314B2 (en) | 2002-03-01 | 2011-03-22 | Roger Williams Hospital | Shc protein-related methods and compositions for the prognosis of breast, prostate and ovarian cancer |
| JP2003310276A (ja) * | 2002-04-30 | 2003-11-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | １２１４位チロシンがリン酸化したＫＤＲ／Ｆｌｋ−１に対する情報伝達分子の結合を阻害する物質およびその利用方法 |
| US7396913B2 (en) | 2002-10-14 | 2008-07-08 | Abbott Laboratories | Erythropoietin receptor binding antibodies |
| US20040071694A1 (en) | 2002-10-14 | 2004-04-15 | Devries Peter J. | Erythropoietin receptor binding antibodies |
| TWI320716B (en) | 2002-10-14 | 2010-02-21 | Abbott Lab | Erythropoietin receptor binding antibodies |
| JP2005089354A (ja) * | 2003-09-16 | 2005-04-07 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | リン酸化されたβカテニンを選択的に認識する抗体 |
| US20060018902A1 (en) | 2004-04-09 | 2006-01-26 | Reilly Edward B | Antibodies to erythropoietin receptor and uses thereof |
| US20050227289A1 (en) | 2004-04-09 | 2005-10-13 | Reilly Edward B | Antibodies to erythropoietin receptor and uses thereof |
| CN1686543A (zh) * | 2005-05-09 | 2005-10-26 | 叶新新 | Mods－mof的干预治疗药物epo抗体epo受体与制造方法及动物模型 |
| AR060440A1 (es) * | 2006-04-14 | 2008-06-18 | Amgen Inc | Agonistas receptores de eritropoietina |
| CA3018087C (en) * | 2009-01-15 | 2019-09-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Antibodies against phosphorylated tyrosines on erythropoietin receptor (epor) |
-
2010
- 2010-01-13 CA CA3018087A patent/CA3018087C/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-01-13 CA CA2748758A patent/CA2748758C/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-01-13 US US13/144,671 patent/US9221909B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-01-13 WO PCT/EP2010/000130 patent/WO2010081679A2/en active Application Filing
- 2010-01-13 CA CA2965031A patent/CA2965031C/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-01-13 JP JP2011545672A patent/JP2012514985A/ja active Pending
- 2010-01-13 ES ES10700705.6T patent/ES2528219T3/es active Active
- 2010-01-13 EP EP10700705.6A patent/EP2387586B1/en active Active
- 2010-01-13 CN CN201080004518.2A patent/CN102282174B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2010-01-13 SG SG2011050168A patent/SG172927A1/en unknown
-
2014
- 2014-05-14 JP JP2014100146A patent/JP5980265B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2016
- 2016-06-22 JP JP2016123178A patent/JP6143921B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2017
- 2017-05-09 JP JP2017092761A patent/JP6363255B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017136093A (ja) * | 2009-01-15 | 2017-08-10 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | ヒトｅｐｏ受容体に対する抗体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2017136093A (ja) | 2017-08-10 |
| CA2748758C (en) | 2017-06-13 |
| US9221909B2 (en) | 2015-12-29 |
| CA2965031A1 (en) | 2010-07-22 |
| JP5980265B2 (ja) | 2016-08-31 |
| CA3018087C (en) | 2019-09-24 |
| EP2387586A2 (en) | 2011-11-23 |
| SG172927A1 (en) | 2011-08-29 |
| JP2014204721A (ja) | 2014-10-30 |
| CA3018087A1 (en) | 2010-07-22 |
| CA2965031C (en) | 2018-12-04 |
| JP6363255B2 (ja) | 2018-07-25 |
| EP2387586B1 (en) | 2014-12-17 |
| JP2016190862A (ja) | 2016-11-10 |
| WO2010081679A3 (en) | 2010-09-23 |
| CA2748758A1 (en) | 2010-07-22 |
| JP2012514985A (ja) | 2012-07-05 |
| CN102282174A (zh) | 2011-12-14 |
| ES2528219T3 (es) | 2015-02-05 |
| US20120122120A1 (en) | 2012-05-17 |
| CN102282174B (zh) | 2014-02-26 |
| WO2010081679A2 (en) | 2010-07-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6363255B2 (ja) | ヒトｅｐｏ受容体に対する抗体 | |
| EP3176181B1 (en) | Anti-ctla4 monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof, medicinal composition and use | |
| US10633430B2 (en) | Engineering of immunoglobulin domains | |
| JP5522405B2 (ja) | 安定な多価抗体 | |
| US20210054103A1 (en) | IgG Bispecific Antibodies and Processes for Preparation | |
| DK2146745T3 (en) | Penta-specific antibody | |
| TW200932271A (en) | Bivalent, bispecific antibodies | |
| WO2021139758A1 (zh) | 新型多肽复合物 | |
| KR20170056521A (ko) | 항-vasa 항체, 및 이것의 제조 및 사용 방법 | |
| CN116635071A (zh) | 抗tspan8-抗cd3双特异性抗体和抗tspan8抗体 | |
| US20240141071A1 (en) | Antibodies that bind cd123 and gamma-delta t cell receptors | |
| JP2023518225A (ja) | ムチン１７に対する抗体及びその使用 | |
| JP2012528812A (ja) | ヒトｃｃｎ１に対する抗体とその用途 | |
| CN115850458A (zh) | 一种抗冠状病毒rbd蛋白的抗体、制备方法和应用 | |
| TW202412838A (zh) | 包含結合γ-δ T細胞受體之抗體之組合物 | |
| EA046350B1 (ru) | Анти-интерлейкин-17а антитело, фармацевтическая композиция и их применение |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170419 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170509 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6143921 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |