JP6111200B2 - 除草剤耐性イベント８２６４．４４．０６．１のスタック、関連するトランスジェニックダイズ系統、およびその検出 - Google Patents

除草剤耐性イベント８２６４．４４．０６．１のスタック、関連するトランスジェニックダイズ系統、およびその検出 Download PDF

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Description

グリホサート（Ｎ−ホスホノメチルグリシン）は広スペクトル除草剤であり、植物細胞において必須芳香族アミノ酸を生成するシキミ酸生合成経路の酵素、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）を阻害する。ＥＰＳＰＳの阻害は、タンパク質合成を効果的に破壊し、それによって影響を受ける植物細胞を死滅させる。グリホサートは非選択性であるので、雑草と作物植物の両方を死滅させる。したがって、グリホサートに抵抗性になるように作物植物を改変して、望ましい植物がグリホサートへの曝露後も生存することを可能にすることができる場合、グリホサートは作物植物に有益である。
グリホサート抵抗性である突然変異体ＥＰＳＰ合成酵素を単離するために、組換えＤＮＡ技術が用いられている。そのようなグリホサート抵抗性の突然変異体ＥＰＳＰ合成酵素を植物に形質転換させて、形質転換させた植物にグリホサート抵抗性を付与することができる。例として、米国特許第５，６３３，４３５号に記載されているように、グリホサート耐性遺伝子がアグロバクテリウム（Agrobacterium）株ＣＰ４から単離された。この参照および本明細書の全ての引用文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
突然変異の導入によって他のグリホサート耐性遺伝子が作製されている。これらには、Ｃｏｍａｉによって単離され、米国特許第５，０９４，９４５号、第４，７６９，０６１号および第４，５３５，０６０号に記載されているＡｒｏＡ遺伝子が含まれる。米国特許第５，３１０，６６７号に記載されているように、アミノ酸８０位と１２０位との間のグリシン残基をアラニン残基に置換することによる、単一突然変異体が利用されている。米国特許第６，２２５，１１４号および第５，８６６，７７５号には、上記の突然変異に加えて、第２の突然変異（１７０位と２１０位との間のアラニン残基の代わりにトレオニン残基）が野生型ＥＰＳＰＳ遺伝子に導入された二重突然変異体が記載されている。
他の研究は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６３３７４によってコードされるアミノ酸配列の残基１０２の突然変異（トレオニンをイソロイシンに変える）および残基１０６の突然変異（プロリンをセリンに変える）を有する改変メイズＥＰＳＰＳ遺伝子の導入によってグリホサート抵抗性トウモロコシの生成をもたらした。米国特許第６，５６６，５８７号および第６，０４０，４９７号を参照されたい。
ダイズにおいてグリホサート抵抗性を提供するイベントの例としては、ダイズ株ＧＴＳ４０−３−２（Padgetteら1995年）、ダイズイベントＭＯＮ８９７８８（米国特許第７，６０８，７６１号）が挙げられ、米国特許第７，６０８，７６１号はダイズイベントＭＯＮ８９７８８に関連し、そのそれぞれはｃｐ４ ｅｐｓｐｓ遺伝子をダイズに挿入することによって生成された。
グリホサート耐性の作付け体系の広範囲にわたる採用およびグリホサート使用の増加は、近年グリホサート抵抗性雑草および防除困難な雑草の蔓延に寄与している。栽培者がグリホサート抵抗性雑草または防除がより困難な雑草種へのシフトに直面しているエリアでは、漏れた雑草を防除する他の除草剤とタンクミックスするか交互に用いることによって、栽培者はグリホサートの弱点を補うことができる。
多くの例で広葉エスケープを防除するための１つの普及している効果的なタンクミックスパートナーは、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）である。６０年より長く除草剤として用いられている２，４−Ｄは、トウモロコシ、ダイズおよび綿でのいくつかの重要な雑草を含む多くの一年生、二年生および多年生の広葉雑草の、広スペクトルの出芽後防除を提供する。条植え作物生産で２，４−Ｄ（５６０〜１１２０ｇ ａｅ／ヘクタールの施用量）によって防除される重要な雑草には、ブタクサ（Ambrosia artemisiifolia）、オオブタクサ（Ambrosia trifida）、オナモミ（Xanthium strumarium）、アカザ（Chenopodium album）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、イポメア属（Ipomoea）の種、イチビ（Abutilon theophrasti）、ヒメムカシヨモギ（Conyza Canadensis）およびエビスグサ（Senna obtusifolia）が含まれる。２，４−Ｄは、ポリゴナム・ペンシルバニカム（Polygonum pensylvanicum）、ポリゴナム・ペルシカリア（Polygonum persicaria）、シルシウム・アルベンス（Cirsium arvense）、タラクサカム・オフィシナーレ（Taraxacum officinale）、ならびにアマランサス・ルディス（Amaranthus rudis）およびアマランサス・パルメリ（Amaranthus palmeri）を含むアマランサス属（Amaranthus）の種を含む、いくつかの重要な雑草の部分的防除を提供する。
２，４−Ｄのさらなる使用への制限は、その選択性がダイズまたは綿のような双子葉作物において非常に乏しいことであり、したがって、２，４−Ｄは感受性の双子葉作物で（および一般にその近くで）一般的に用いられない。さらに、イネ科作物での２，４−Ｄの使用は、起こる可能性のある作物損傷の性質によって多少制限される。不耕起ダイズおよび綿を植える前により強硬な焼払い処理を提供するために、グリホサートと組み合わせた２，４−Ｄが用いられている；しかし、２，４−Ｄへのこれらの双子葉植物種の感受性のために、これらの焼払い処理は栽植の少なくとも１４〜３０日前でなければならない（Agriliance、2005年）。
２，４−Ｄを分解するその能力のために広く研究された１つの生物体はラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）であり、それは、無機化経路の第１段階を触媒する酵素であるｔｆｄＡをコードする遺伝子を含有する（Streberら、1987年）。（米国特許第６，１５３，４０１号およびＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｍ１６７３０を参照）。ｔｆｄＡは、２，４−Ｄを分解することが報告されている（Smejkalら、2001年）。分解から生じる生成物は、２，４−Ｄと比較してほとんど除草力を有しない。２，４−Ｄに通常感受性の双子葉植物（例えば、綿およびタバコ）に２，４−Ｄ抵抗性を付与するために、ｔｆｄＡがトランスジェニック植物において用いられている（Streberら（1989年）、Lyonら（1989年）、Lyon（1993年）および米国特許第５，６０８，１４７号）。
２，４−Ｄを分解することが可能なタンパク質をコードするいくつかのｔｆｄＡ型遺伝子が環境から同定されており、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに寄託されている。多くのホモログはｔｆｄＡに類似している（８５％超のアミノ酸同一性）。しかし、ｔｆｄＡに対してかなり低い同一性（２５〜５０％）を有するが、α−ケトグルタル酸ジオキシゲナーゼＦｅ（ＩＩ）ジオキシゲナーゼと関連する特徴的な残基を有するいくつかのポリヌクレオチド配列がある。
ｔｆｄＡとの低い配列同一性（３５％未満）を有する２，４−Ｄ分解性遺伝子の例は、デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）のａａｄ−１２遺伝子である（米国特許出願第２０１１／０２０３０１７号）。ａａｄ−１２遺伝子はＳ鏡像異性体特異的α−ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼをコードし、それは、例えばそれらに限定されないが：２，４−ＤおよびＭＣＰＡなどのフェノキシ酢酸系除草剤；フェノキシブタン酸系除草剤、例えば２，４−ＤＢおよびＭＣＰＢ）、ならびにピリジルオキシアルカン酸系除草剤（例えば、トリクロピルおよびフルロキシピルなどのピリジルオキシ酢酸系除草剤）を含み、その有効成分の酸、塩またはエステル型を含む、特定のフェノキシオーキシン除草剤に耐性を付与するために植物で用いられている。（例えば、国際公開第２００７／０５３４８２号を参照）。
グルホシネート−アンモニウム（「グルホシネート」）は、フォスフィノスリシンクラスの除草剤の非浸透移行性の非選択的除草剤である。広範囲の広葉およびイネ科雑草の出芽後防除のために主に用いられる、グルホシネートの有効成分Ｌ−フォスフィノスリシンは、植物でのアンモニア無毒化のために必要な酵素であるグルタミン合成酵素の不可逆的阻害を通して雑草を防除する。グルホシネート除草剤は、例えば、商標名Ｉｇｎｉｔｅ（登録商標）、ＢＡＳＴＡおよびＬｉｂｅｒｔｙ（登録商標）の下で市販される。
土壌菌ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）から単離された酵素フォスフィノスリシンＮ−アセチル転移酵素（ＰＡＴ）は、アセチル化によるその不活性形へのＬ−フォスフィノスリシンの変換を触媒する。グルホシネート除草剤への耐性を付与するために、ＰＡＴを発現する遺伝子の植物に最適化させた形がダイズで用いられた。グルホシネート抵抗性のダイズの１つのそのような例は、イベントＡ５５４７−１２７である。最近、グルホシネート耐性形質と組み合わせたグルホシネート除草剤の使用が、ＡＬＳ−およびグリホサート抵抗性雑草を効果的に管理する非選択的手段として提案されている。
植物での異種または外来の遺伝子の発現は、外来遺伝子が染色体に挿入される位置によって影響される。これは、例えば、クロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチン）または転写調節エレメント（例えば、エンハンサー）と組込み部位との近接性による可能性がある（Weisingら、Ann. Rev. Genet 22:421〜477頁、1988年）。同じ型のトランスジェニック植物（または他の生物体）での同じ遺伝子は、異なるイベントの間で発現レベルの大きな変動を示すことがある。発現の空間的または時間的パターンに差があることもある。例えば、様々な植物組織での導入遺伝子の相対的発現の差は、導入された遺伝子構築物に存在する転写調節エレメントから予想されるパターンに対応しないことがある。
したがって、多数のイベントがしばしば形成され、所与の目的のために良好なレベルに対象の導入遺伝子を発現するイベントを同定するためにスクリーニングされる。商用目的のために、数百から数千の異なるイベントを生成して、所望の導入遺伝子発現レベルおよびパターンを有する単一のイベントのためにそれらのイベントをスクリーニングすることが一般的である。導入遺伝子発現の所望のレベルおよび／またはパターンを有するイベントは、従来の育種方法を用いて有性異系交配によって他の遺伝的背景に導入遺伝子を遺伝子移入するために有益である。そのような交配の後代は、元の形質転換体の導入遺伝子発現特性を維持する。この戦略は、現地の生育条件によく適合するいくつかの変種で信頼できる遺伝子発現を確保するために用いられる。
対象発明は、一部には、雑草抵抗性を管理するために有効な手段を提供することができ、それは除草剤耐性技術の有用性を保存するのを助ける。対象発明は、雑草防除選択肢の大きな融通性および利便性を栽培者に提供することもできる。
より具体的には、本発明は、受託番号ＰＴＡ−１１３３６でアメリカ基準株保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託された代表的種子を有する、ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１と指定されたダイズ（Glycine max）イベント（「イベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１」）、およびそれに由来する後代に一部関する。対象発明は、イベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を含むダイズ植物を含む（ならびに配列番号１および配列番号２を含むゲノムセグメント中にトランスジェニック挿入物を含むダイズ植物を含む）。
対象イベントおよび寄託種子に存在するトランスジェニック挿入物は、下記の３つの除草剤耐性遺伝子を含む：ａａｄ−１２、２ｍｅｐｓｐｓおよびｐａｔ遺伝子。デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）に由来するａａｄ−１２遺伝子は、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１２）タンパク質をコードし、それは、例えば２，４−ジクロロフェノキシ酢酸およびピリジルオキシアセテート除草剤への耐性を付与する。トウモロコシから単離された改変ＥＰＳＰＳ配列である２ｍｅｐｓｐｓ遺伝子は、グリホサート除草剤への耐性を付与するタンパク質を生成する。土壌菌ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）からのｐａｔ遺伝子は、除草剤グルホシネートへの耐性を付与する。
本発明の他の態様は、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を含む後代植物、ダイズ、種子、ならびに／または植物および種子および後代の再生可能な部分、ならびにそのいずれかから作製される食品または飼料製品を含む。本発明は、それらに限定されないが花粉、胚珠、花、苗条、根、葉、栄養細胞の核、花粉細胞を含むイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の植物部分、ならびにイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を含む他の植物細胞も含む。本発明は、フェノキシ酢酸除草剤、フェノキシブタン酸除草剤、ピリジルオキシアルカン酸除草剤、グリホサート、および／またはグルホシネートを含む複数の除草剤への耐性を有するダイズ植物にさらに関する。そのようなダイズ植物は、それらに限定されないが、ジカンバ、イミダゾリノンおよびＨＰＰＤ除草剤を含む様々な他の非選択性および選択性除草剤への耐性を付与する遺伝子をスタックされてもよい。本発明は、新規な遺伝子組成イベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１およびイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を含むダイズ植物の農業パフォーマンスの態様をさらに含む。
本発明は、植物育種および除草剤耐性植物に一部関する。本発明は、ダイズ細胞のゲノム内の特定の部位に挿入されている、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むダイズ植物での新規形質転換イベントを含む。
一部の実施形態では、前記イベント／ポリヌクレオチドは、例えば、農業形質および／または昆虫抑制タンパク質を含む他の形質を「スタック」されてもよい。しかし、本明細書に記載されるように、対象発明は単一のイベントを有する植物を含む。
一部の実施形態では、対象の除草剤耐性イベントは、昆虫抵抗性イベントとの育種スタックで組み合わされてよい。これらの実施形態のいくつかでは、昆虫抵抗性イベントは、ｃｒｙ１Ｆ遺伝子およびｃｒｙ１Ａｃ遺伝子を含む。いくつかのそのようなイベントおよびスタックは、ダイズイベント９５８２．８１２．９．１（「８１２イベント」）およびダイズイベント９５８２．８１４．１９．１（「８１４イベント」）を含め、本明細書に具体的に例示される。例えば、対象イベントの任意の組合せを含む植物、植物細胞および種子は、対象発明に含まれる。一部の実施形態では、さらに詳細に下で論じられるように、対象発明はダイズイベント９５８２．８１２．９．１（「８１２イベント」）を単独で含む。
例えば植物育種、イベントＤＡＳ−８２６４．４４．０６．１を含有するトランスジェニック植物の再形質転換、または相同組換えを介した標的化組込みによる新しい形質の追加を介して、追加の形質が植物ゲノムに、またはイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１と同じ遺伝子座にスタックされてよい。
他の実施形態は、トランスジェニック挿入物および／またはイベントＤＡＳ−８２６４．４４．０６．１の隣接配列の一部または全ての切除を含む。切除の後、別のおよび／または追加の挿入物を、イベントＤＡＳ−８２６４．４４．０６．１の特定の染色体部位に標的化させてもよい。例示される挿入物は対象ダイズイベントの例示される挿入物と交換されてもよいか、またはさらなる挿入物（複数可）がこのようにスタックされてもよい。
一実施形態では、本発明は、第６染色体に位置するダイズ染色体の標的部位を包含する。一部の実施形態では、標的部位は異種核酸を含む。一部の実施形態では、ダイズ染色体の標的部位は、配列番号１および配列番号２に示すゲノム隣接配列の間かその中に位置する。
一実施形態では、本発明は、第６染色体上の位置に異種核酸を挿入するステップを含む、トランスジェニックダイズ植物を作製する方法を包含する。別の実施形態では、異種核酸は、第６染色体の上の、本明細書に記載される様々な例示ポリヌクレオチドセグメントの近くかその間に挿入される。
さらに、対象発明は、試料（例えば、ダイズの）中の対象イベントの存在を検出するためのアッセイを提供する。アッセイは、ダイズゲノムに挿入された組換え体構築物のＤＮＡ配列、および挿入部位の側面に位置するゲノム配列に基づいてよい。アッセイの実行で有益なキットおよび条件もまた提供される。
したがって、対象発明は、（トランスジェニックダイズ系統の）例示される挿入物全体およびその境界（ボーダー）領域のＤＮＡ配列のクローニングおよび分析に一部関する。これらの配列は特有のものである。これらの挿入物およびボーダー（および接合部）配列に基づき、イベント特異的なプライマーを生成することができ、生成した。ＰＣＲ分析は、これらのイベント特異的なプライマーセットで生成されるＰＣＲアンプリコンの分析によって、イベントを同定することができることを実証した。したがって、対象発明のイベントを含むダイズ系統を特異的に同定するために、これらおよび他の関連した手順を用いることができる。
対象発明は、イベント８２６４．４４．０６．１の検出のためのリアルタイムまたはエ
ンドポイントＴａｑＭａｎ ＰＣＲアッセイにも一部関する。一部の実施形態は、ハイス
ループット接合性分析が可能であるアッセイを対象とする。対象発明は、一部、接合性を
判定するのに用いられるＧＭＦＬ０１−２５−Ｊ１９（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＫ２８６２９
２．１）参照遺伝子の使用にさらに関する。イベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１
の接合性を特異的に同定し、このイベントを含むダイズ系統を育種するために、これらお
よび他の関連した手順を用いることができる。
本願発明のさらなる具体的態様として、以下のものが挙げられる。
[1] 配列番号14と少なくとも95％の同一性を有する第1のポリヌクレオチドセグメントおよび配列番号15と少なくとも95％の同一性を有する第2のポリヌクレオチドセグメントを含むゲノムを含むトランスジェニックダイズ植物細胞。
[2] 受託番号PTA-11336でアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に寄託されている代表的な種子に存在するイベントpDAB8264.44.06.1を含むゲノムを含むダイズ種子。
[3] [1]に記載の細胞を含むダイズ種子。
[4] 前記イベントを含む、[2]に記載の種子を生育させることによって生成されるダイズ植物。
[5] イベントpDAB8264.44.06.1を含む、[4]に記載のダイズ植物の後代植物。
[6] [1]に記載の複数の細胞を含むトランスジェニックダイズ植物。
[7] 前記細胞が昆虫抵抗性遺伝子をさらに含む、[6]に記載の植物。
[8] フェノキシ酢酸除草剤、フェノキシブタン酸除草剤、ピリジルオキシアルカン酸除草剤、グリホサート除草剤およびグルホシネート除草剤からなる群から選択される少なくとも1つの除草剤に抵抗性であり、配列番号13の残基2026〜9222を含むトランスジェニックゲノム挿入物を含む、[6]に記載の植物。
[9] 花粉、胚珠、花、苗条、根および葉からなる群から選択され、配列番号14および配列番号15を含む、[4]に記載の植物の一部。
[10] 受託番号PTA-1133６でアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に寄託されている代表的な種子に存在するイベントpDAB8264.44.06.1を含むゲノムを含む植物細胞。
[11] 配列番号3〜28からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
[12] 配列番号14および配列番号15を含む第1のダイズ植物を第2のダイズ植物と交配してゲノムを含む第3のダイズ植物を生成するステップと、前記第3のダイズ植物を前記ゲノム中の配列番号14および／または配列番号15の存在についてアッセイするステップとを含む、ダイズ植物の育種方法。
[13] ダイズ植物に除草剤耐性形質を遺伝子移入するために用いられる、[12]に記載の方法。
[14] フェノキシ酢酸、フェノキシブタン酸、ピリジルオキシアルカン酸、グリホサート、ビアラホス、フォスフィノスリシンまたはグルホシネート除草剤の少なくとも1つを圃場へ施用するステップを含み、前記圃場が、[6]に記載の植物を含み、前記植物が、配列番号13の残基2026〜9222を含むトランスジェニックゲノム挿入物を含む、雑草の防除方法。
[15] 前記除草剤の少なくとも2つを同時に施用するステップを含む、[14]に記載の方法。
[16] 前記除草剤の少なくとも2つを逐次的に施用するステップを含む、[14]に記載の方法。
[17] 前記アリールオキシアルカノエート除草剤が、2,4-D、2,4-DB、MCPAおよびMCPBからなる群から選択され、前記ピリジルオキシアルカン酸除草剤が、トリクロピルおよびフルロキシピルからなる群から選択される、[14]に記載の方法。
[18] 前記圃場へ少なくとも1つの追加の除草剤を施用するステップを含む、[14]に記載の方法。
[19] 前記少なくとも１つの追加の除草剤がジカンバである、[18]に記載の方法。
[20] フェノキシ酢酸、フェノキシブタン酸、ピリジルオキシアルカン酸、グリホサートおよび／またはグルホシネート除草剤を圃場へ施用するステップ、ならびに請求項３に記載の種子を除草剤（複数可）を施用してから14日以内に圃場に播種するステップとを含む、圃場の雑草を防除する方法であって、前記トランスジェニック挿入物が配列番号13の残基2026〜9222を含む、方法。
[21] 前記施用ステップが前記播種ステップの前に実施される、[20]に記載の方法。
[22] 前記少なくとも1つの除草剤が前記植物の頂部の上側に施用される、[14]に記載の方法。
[23] 前記植物が、配列番号27を含む核酸分子と少なくとも95％の同一性を含むポリヌクレオチドをさらに含む、[6]に記載の植物。
[24] ダイズ(Glycine max)由来である、[23]に記載の植物。
[25] [6]に記載の植物を生育させることによって生成される、ミールまたは油製品。
[26] 植物細胞のゲノムの単一の染色体遺伝子座中に遺伝子導入により挿入されている発現カセットを含む植物細胞であって、
a.グリホサート除草剤耐性遺伝子を発現する第1の植物転写単位；
b.フェノキシ酢酸除草剤耐性遺伝子、フェノキシブタン酸除草剤耐性遺伝子および／またはピリジルオキシアルカン酸耐性遺伝子を発現する第2の植物転写単位；ならびに
c.グルホシネート除草剤耐性遺伝子を発現する第3の植物転写単位
を含む、植物細胞。
[27] 試料中のイベントpDAB8264.44.06.1を同定するための方法であって、ATCC受託番号PTA-11336で寄託されている種子に存在するpDAB8264.44.06.1の接合部配列を、前記接合部配列と特異的に結合するか前記接合部配列を特異的に増幅するプローブまたは少なくとも１つのプライマーで検出するステップを含み、前記接合部配列が、配列番号14の残基570〜571または配列番号15の残基220~221を含む、方法。
[28] 少なくとも2つのプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、前記試料に存在する核酸のＤＮＡ断片を増幅するステップをさらに含み、前記第1のプライマーが、配列番号13内の挿入物配列またはその相補配列に特異的に結合し、第2のプライマーが、配列番号1および配列番号2からなる群から選択される隣接配列内の配列に特異的に結合する、[27]に記載の方法。
[29] ATCC受託番号PTA-11336で寄託されている種子に存在するダイズイベントpDAB-8264.44.06.1を含むダイズ植物のイベント接合性を判定する方法であって、前記イベントが導入遺伝子構築物を含み、前記導入遺伝子構築物は5’隣接ダイズゲノムDNAおよび3’隣接ダイズゲノムDNAが側面に位置し、前記方法が、
前記ダイズ植物からゲノムＤNAのDNA試料を得るステップ；
前記DNA試料を
a.第1のイベントプライマーおよび第2のイベントプライマーであって、前記第1のイベントプライマーが前記導入遺伝子構築物に特異的に結合し、前記第2のイベントプライマーが前記5’ダイズゲノム隣接DNAまたは前記3’ダイズゲノム隣接DNAに特異的に結合し、TaqManPCR条件に供される場合に前記第1のイベントプライマーおよび前記第2のイベントプライマーがイベントアンプリコンを生成する、第1のイベントプライマーおよび第2のイベントプライマー
b.TaqMan PCR条件に供されると内在性ダイズ参照遺伝子から参照アンプリコンを生成する参照フォワードプライマーおよび参照リバースプライマー
c.前記イベントアンプリコンとハイブリダイズする開花イベントプローブ
d.前記参照アンプリコンとハイブリダイズする開花参照プローブ
と接触させることによって接触させた試料を生成するステップ；
前記接触させた試料を蛍光ベースのエンドポイントTaqMan PCR条件に供するステップ；
前記イベントアンプリコンとハイブリダイズした前記開花イベントプローブを定量化するステップと；
前記参照アンプリコンとハイブリダイズした前記開花参照プローブを定量化するステップ；
ハイブリダイズした開花イベントプローブの量を、ハイブリダイズした開花参照プローブの量と比較するステップ；ならびに
ハイブリダイズした蛍光イベントプローブとハイブリダイズした蛍光参照プローブとの開花比を比較することによってpDAB8264.44.06.1の接合性を判定するステップ
を含む方法。
[30] 前記アンプリコンが50〜150残基からなる、[29]に記載の方法。
[31] 前記５’隣接DNAが配列番号1を含み、前記3’隣接DNAが配列番号2を含む、[29]に記載の方法。
[32] 前記参照遺伝子が内在性ダイズGMFL01-25-J19遺伝子である、[29]に記載の方法。
[33] 前記第1のイベントプライマーが配列番号13に結合し、第2のイベントプライマーが配列番号1もしくは配列番号2、またはその相補配列に結合する、[29]に記載の方法。
[34] 別のダイズ系統への前記イベントの育種遺伝子移入のために用いられる、[29]に記載の方法。
[35] 前記別のダイズ系統が前記イベントを欠く、[34]に記載の方法。
[36] 前記参照遺伝子が、配列番号24、配列番号25および配列番号26からなる群から選択される配列を含むかそれとハイブリダイズする、[29]に記載の方法。
[37] 前記参照プライマーが、配列番号25および配列番号24を含み、前記参照プローブが、配列番号26を含む、[29]に記載の方法。
[38] 前記プローブが蛍光色素および消光剤で標識されている、[29]に記載の方法。
[39] 前記イベントプローブが、前記イベントプローブの5’末端に前記蛍光色素としてFAMを含み、前記イベントプローブの3’末端にMGB消光剤を含む、[38]に記載の方法。
[40] 前記参照プローブが、前記参照プローブの5’末端においてHEXで標識されており、前記参照プローブの3’末端においてBlack Hole Quencher1(BHQ1)で標識されている、[38]に記載の方法。
[41] 前記イベントプローブが配列番号20を含む、[29]に記載の方法。
[42] 前記イベントプライマーが、配列番号18、配列番号19、配列番号21および配列番号22からなる群から選択される、[29]に記載の方法。
[43] プレートリーダーで結果が直接読み取られる、[29]に記載の方法。
[44] 前記ＤＮＡ試料が圃場のダイズ植物から得られる、[29]に記載の方法。
[45] 前記第1のイベントプライマー、前記第2のイベントプライマー、前記参照フォワードプライマー、前記参照リバースプライマー、前記イベントプローブおよび前記参照プローブを含む、[29]に記載の方法を実施するためのキット。
[46] 前記イベントプライマーが配列番号18および配列番号19からなり、前記参照プライマーが配列番号２４および配列番号25からなり、前記イベントプローブが配列番号20からなり、前記参照プローブが配列番号26からなる、[45]に記載のキット。
[47] 前記プローブまたは前記少なくとも１つのプライマーを含む、[27]に記載の方法を実施するためのキット。
[48] 前記増幅されたDNA断片が約7196塩基を含む、[28]に記載の方法。
[49] 配列番号1、配列番号2、配列番号14、配列番号15およびその相補配列からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一であるプローブ。
[50] 少なくとも15ヌクレオチドを含み、配列番号1および配列番号2からなる群から選択される核酸配列とストリンジェントな洗浄条件の下でハイブリダイゼーションを維持する、単離されたポリヌクレオチド分子。
[51] ゲノム、および前記ゲノムのDNAセグメント中のトランスジェニック挿入物を含み、前記DNAセグメントが、配列番号1を含む5’末端および配列番号2を含む3’末端を含む、トランスジェニックダイズ植物。
[52] ダイズゲノムのDNAセグメント中にトランスジェニック挿入物を挿入する方法であって、前記DNAセグメントが、配列番号1を含む5’末端および配列番号2を含む3’末端を含む、方法。
[53] ゲノムを含むトランスジェニックダイズ植物を作製する方法であって、前記ゲノムのDNAセグメント中にトランスジェニック挿入物を挿入するステップを含み、前記DNAセグメントが、配列番号1を含む5’末端およびヌクレオチド残基配列番号2を含む3’末端を含む、方法。
[54] 前記挿入物が配列番号27を含む、[52]に記載の方法。
[55] 前記挿入物が配列番号27を含む、[53]に記載の方法。
[56] PTA-11602およびPTA-12006からなる群から選択される受託番号でATCCに寄託されている種子に存在する昆虫抵抗性イヘ゛ントをさらに含む、[2]に記載の種子。
[57] 配列番号28、配列番号29、配列番号28と少なくとも95％同一である変異体、または配列番号29と少なくとも95％同一である変異体をさらに含む、[3]に記載の種子。
[58] [56]に記載の種子から生育し、前記イベントおよび前記昆虫抵抗性イベントを含む植物。
[59] 配列番号28および/または配列番号29と少なくとも95％同一である昆虫抵抗性ポリヌクレオチドセグメントをさらに含む、[6]に記載の植物。
[60] PTA-11602およびPTA-12006からなる群から選択される受託番号でATCCに寄託されている種子に存在する昆虫抵抗性イヘ゛ントをさらに含む、[10]に記載の植物細胞。
[61] 配列番号27または配列番号27と少なくとも95％同一であるその変異体を含む、[1]に記載の植物細胞。
[62] 配列番号28、配列番号29、配列番号28と少なくとも95％同一である変異体、または配列番号29と少なくとも95％同一である変異体をさらに含む、[61]に記載の植物細胞。
[63] 前記細胞が配列番号27または配列番号27と少なくとも95％同一であるその変異体を含む、[３]に記載の種子。
[64] 配列番号28、配列番号29、配列番号28と少なくとも95％同一である変異体、または配列番号29と少なくとも95％同一である変異体をさらに含む、[63]に記載の種子。
[65] 2011年11月18日に呼称pDAB9582.812.9.1::イベントpDAB8264.44.06.1でATCCに寄託されたダイズ種子に存在するイベントpDAB8264.44.06.1およびイベント9582.812.9.1を含む種子。
[66] 2011年11月18日に呼称pDAB9582.812.9.1::イベントpDAB8264.44.06.1でATCCに寄託されたダイズ種子に存在するイベントpDAB8264.44.06.1およびイベント9582.812.9.1を含む植物。
[67] 2011年11月18日に呼称pDAB9582.812.9.1::イベントpDAB8264.44.06.1でATCCに寄託されたダイズ種子に存在するイベントpDAB8264.44.06.1およびイベント9582.812.9.1を含む植物細胞。
[68] 配列番号２８を含む植物、植物細胞または種子。
[69] 受託番号PTA-11602の下でATCCに寄託されたダイズ種子に存在するイベント9582.812.9.1を含む植物、植物細胞または種子。
図１は、ｐＤＡＢ８２６４のプラスミドマップである。 図２は、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のプライマー位置を表す概略図である。 図３は、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１でのプライマー位置およびゲノムＤＮＡ欠失を表す概略図である。 図４は、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のＴａｑＭａｎアッセイ検出のためのプライマー位置を表す概略図である。
本明細書に記載される本発明は、ダイズ細胞のゲノム内の特定の遺伝子座に挿入された複数の除草剤耐性遺伝子の発現のためのカセットを含むダイズ植物（ダイズ）の新規形質転換イベントを含む。
イベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を含む例示トランスジェニック挿入物は、３つの異なる除草剤耐性遺伝子：（１）合成ａａｄ−１２遺伝子；（２）野生型ＥＰＳＰＳポリペプチドと比較して、アミノ酸残基１０２（トレオニンからイソロイシン）および１０６（プロリンからセリン）に突然変異を含有する、グリホサート除草剤への抵抗性または耐性を付与するタンパク質をコードするトウモロコシのＥＰＳＰＳ配列；ならびに（３）グルホシネート除草剤への耐性または抵抗性を付与するｐａｔ遺伝子の発現のための遺伝子エレメントを含む。ａａｄ−１２遺伝子はデルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）に由来し、それは、例えば、その有効成分（複数可）の酸、塩またはエステル型を含む、フェノキシアルカノエート除草剤（例えば、２，４−ＤおよびＭＣＰＡなどのフェノキシ酢酸除草剤；ジクロルプロップ、メコプロップなどのフェノキシプロピオン酸除草剤およびそれらの鏡像異性体；ならびに２，４−ＤＢおよびＭＣＰＢなどのフェノキシブタン酸除草剤）、ならびにピリジルオキシアルカン酸除草剤（例えば、トリクロピルおよびフルロキシピルなどのピリジルオキシ酢酸除草剤）を含むα−ケトグルタル酸部分を有する除草剤を不活性化することが可能なアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１２）タンパク質酵素をコードする。
より具体的には、対象発明は、トランスジェニックダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１、これらのイベントを含む植物系統、ならびにこの挿入物のＤＮＡ配列および／またはそのボーダー領域のクローニングおよび分析に一部関する。対象発明の植物系統は、本明細書に開示および示唆される配列を用いて検出することができる。
本発明は、植物育種および除草剤耐性植物に一部関する。一部の実施形態では、前記ポリヌクレオチド配列は、他の形質（例えば、他の除草剤耐性遺伝子（複数可）および／または昆虫抑制タンパク質もしくは抑制性ＲＮＡ配列をコードする遺伝子（複数可）など）を「多重化（スタック）」されてよい。しかし、本明細書に記載されるように、対象発明は単一のイベントを有する植物も含む。
一部の実施形態では、対象の除草剤耐性イベントは、育種スタックにおいて昆虫抵抗性イベントと組み合わされてよい。一部の実施形態では、昆虫抵抗性イベントは、８１２イベントおよび８１４イベント（後でさらに詳しく記載される）からなる群から選択され、それぞれはｃｒｙ１Ｆ遺伝子およびｃｒｙ１Ａｃ遺伝子を含む。例えば、対象イベントの任意の組合せを含む植物、植物細胞および種子は、対象発明に含まれる。特定の実施形態では、対象発明は、例えば、植物、植物細胞および種子を含め、新規８１２のイベントを単独でも含む。
２０１１年４月５日に出願された米国仮出願第６１／４７１，８４５号は、ダイズイベント９５８２．８１２．９．１（８１２イベント）を含むダイズ系統に一部関する。このイベントを含む種子は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１ ユニバーシティ ブールバード、マナサス、ＶＡ、２０１１０、に寄託され、制限なしで（しかし、特許権の制限の下）公開利用できる。ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１１６０２と指定された寄託は、２０１１年１月２０日にされた。この寄託は、特許手続のための種子寄託に関するブダペスト条約の条項に従って、およびその下でなされたものであり、維持される。
米国仮出願第６１／５１１，６６４号（２０１１年７月２６日に出願された）および第６１／５２１，７９８号（２０１１年８月１０日に出願された）は、ダイズイベント９５８２．８１４．１９．１（８１４イベント）を含むダイズ系統に一部関する。このイベントを含む種子は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１ ユニバーシティ ブールバード、マナサス、ＶＡ、２０１１０、に寄託された。この寄託、ＡＴＣＣ特許寄託指定ＰＴＡ−１２００６は、２０１１年７月２１日にＡＴＣＣによって受理された。この寄託は、特許手続のための種子寄託に関するブダペスト条約の条項に従って、およびその下でなされたものであり、維持される。
対象発明は、例えば、配列番号２７（イベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１；４４０６イベント）、配列番号２８（８１２イベント）および／または配列番号２９（８１４イベント）、ならびに、例えば、そのような配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するこれらの配列の変異体を含む植物、種子および植物細胞も含む。植物ゲノムの中で挿入物配列の組込みの結果、多少の変動（一部のセグメントの欠失など）が起こることは珍しくない。これは、例えば、実施例７でさらに詳細に議論される。
対象発明は、試料中の対象イベントの存在を検出するためのアッセイも提供する。対象発明の態様は、本明細書で例示または提案される任意の診断核酸分子、特に対象隣接配列に完全または部分的に基づくものを設計および／または生成する方法を含む。
一部の実施形態では、本明細書で例示または記載されるポリヌクレオチドセグメント（例えば配列番号１、配列番号２、および／または例えば図２に表されるその間の挿入物）を切除し、その後追加のポリヌクレオチド配列（複数可）で再標的化してよい。
一部の実施形態では、本発明は、除草剤耐性のダイズ系統およびその同定に関する。対象発明は、有性交配の後代が対象のイベントを含有するかどうかを判定するために、対象イベントの存在を検出することに一部関する。さらに、イベントを検出するための方法は、例えば、市販前承認および組換え作物植物に由来する食品の表示を要求する規則に対応するために例えば含まれており、有益である。核酸プローブを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＤＮＡハイブリダイゼーションなどの任意の周知の核酸検出方法により、対象イベントの存在を検出することができる。イベント特異的なＰＣＲアッセイが、本明細書で議論される。（別の例については、例えばWindelsら（Med. Fac. Landbouww、Univ. Gent 64/5b:459462、1999年）を参照。）これらの例のいくつかは、挿入物と隣接ＤＮＡとの間の接合部にわたるプライマーセットを用いることに関する。より具体的には、１つのプライマーは挿入物の配列を含み、第２のプライマーは隣接ＤＮＡの配列を含んでいた。
本明細書では、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１ならびに代々引き続くダイズ植物での安定性および発現についてのその選択および特徴付けが例示される。イベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の両隣接配列が配列決定されており、本明細書では配列番号１および配列番号２と記載される。イベント特異的なアッセイが開発された。それは、ダイズゲノム（ダイズ第６染色体）にマッピングもされている。イベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１は優良栽培種に遺伝子移入することができ、そこで、それは近交系統およびハイブリッドダイズ系統でフェノキシオーキシン、グリホサートおよびグルホシネート除草剤への耐性を付与する。
対象ＥＰＳＰＳ遺伝子は、突然変異体５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）をコードする。野生型ＥＰＳＰＳ遺伝子は、当初トウモロコシ（Zea mays）から単離され、その配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６３３７４の下で寄託された。米国特許第６，５６６，５８７号（特に、その中の配列番号３）を参照されたい。
植物で異種遺伝子の高い発現を得るために、それらが植物細胞でより効率的に発現されるように、前記遺伝子を再操作するのが好ましいことがある。野生型植物ＥＰＳＰＳヌクレオチド配列の改変は、植物細胞で発現されるときにそのような抵抗性を提供することができる。’５８７特許に記載されているように、ＥＰＳＰＳポリペプチドを野生型ポリペプチドと比較したとき、タンパク質の残基１０２のトレオニンの代わりにイソロイシンを置換し、１０６位のプロリンの代わりにセリンを置換する改変は、結果として対象挿入物で用いられる二重突然変異体ＥＰＳＰＳポリペプチド（２ｍＥＰＳＰＳ）をもたらす。植物細胞で発現されるとき、それはグリホサートへの耐性を提供する。あるいは、「２ｍｅｐｓｐｓ遺伝子」またはＤＭＭＧとも呼ばれる対象ＥＰＳＰＳ遺伝子は、双子葉植物および単子葉植物で、特にダイズでの発現を向上させるように最適化することができる。コドン利用は、好ましいｈｅｍｉｃｏｔコドン利用に基づいて選択することができ、すなわち、タンパク質が単子葉植物と双子葉植物の両方の利用への偏りを有するコドンによってコードされるように再設計することができる。２ｍｅｐｓｐｓコード配列の転写／翻訳の効率を増加させ、ＤＮＡ操作段階を促進するために、有害な配列および余分な制限部位は除去されてよい。対象単子葉植物遺伝子のｈｅｍｉｃｏｔ最適化バージョンは、「植物細胞でのグリホサート抵抗性をコードする核酸分子の最適化発現（OPTIMIZED EXPRESSION OF GLYPHOSATE RESISTANCE ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES IN PLANT CELLS）」という名称のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１３／３０３，５０２（２０１１年１１月２３日に出願され、２０１０年１２月３日への優先権を主張）でさらに詳述されている。
前に本明細書に言及されているように、植物ゲノムへの導入遺伝子の導入および組込みは、多少のランダムイベントを含む（したがって、名称「イベント」は発現される所与の挿入のためである）。すなわち、アグロバクテリウム菌形質転換、「遺伝子銃」およびＷＨＩＳＫＥＲＳなどの多くの形質転換技術では、導入遺伝子がゲノムのどこに挿入されるかは予測できない。したがって、挿入物の両側の隣接植物ゲノムＤＮＡを同定することは、所与の挿入イベントを有する植物を同定するために重要な可能性がある。例えば、挿入物と宿主ゲノムの接合部領域にわたるＰＣＲアンプリコンを生成するＰＣＲプライマーを設計することができる。このＰＣＲアンプリコンは、特有であるか異なる型の挿入イベントを同定するために用いることができる。
植物細胞のゲノムに挿入物を導入する過程で、挿入物および／またはゲノム隣接配列の一部の欠失または他の変更が起こることは珍しくない。したがって、本明細書で提供されるプラスミド配列の関連するセグメントは、多少の軽微な変化を含むかもしれない。本明細書で提供される隣接配列についても同じである。したがって、対象の隣接配列および／または挿入物配列とある範囲の同一性を有するポリヌクレオチドを含む植物は、対象発明の範囲内である。本発明の配列との同一性は、本明細書に例示または記載される配列と少なくとも６５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列であってよい。対象発明のそのような植物およびポリヌクレオチド配列を規定するために、本明細書で提供されるハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション条件を用いることもできる。完全な挿入物配列に加えて隣接配列を含む配列は、寄託種子を参照して確認することができる。
「イベント」は本来ランダムイベントであるので、本開示の一部として、イベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を含むダイズ系統の少なくとも２５００粒の種子を、アメリカ基準株保存機関（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、２０１１０、に寄託し、制限なしで（しかし、特許権に従う）公開利用できるようにした。この寄託は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１１３３６と指定された。１００パケット（１パケットにつき２５粒の種子）のダイズ（Glycine max）種子（「ダイズ種子Glycine max L.：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１」）を、２０１０年９月１４日にＤｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣおよびＭＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣを代表して寄託した。寄託物は２０１０年１０月４日に試験され、その日に種子は成育可能であった。この寄託は、特許手続のための種子寄託に関するブダペスト条約の条項に従って、およびその下で執行され、維持される。この寄託物は、公的な受託所であるＡＴＣＣ受託所において、３０年間か、最近の請求から５年間か、または特許有効期間のうちのより長い期間制限なしに維持され、その期間中に成育不能になる場合には交換される。
本開示の一部として、イベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１およびイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１（対象の除草剤耐性イベントおよび８１２昆虫抵抗性イベント）を含むダイズ系統の少なくとも２５００粒の種子を、アメリカ基準株保存機関（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、２０１１０、に寄託し、制限なしで（しかし、特許権に従う）公開利用できるようにした。寄託物は、ＡＴＣＣによって「名称：ｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：イベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１」と同定された。１００パケット（１パケットにつき２５粒の種子）のダイズ（Glycine max）種子（「ダイズ種子Glycine max L.：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１」）を、２０１１年１１月１８日に寄託した。この寄託は、特許手続のための種子寄託に関するブダペスト条約の条項に従って、およびその下で執行され、維持される。この寄託物は、公的な受託所であるＡＴＣＣ受託所において、３０年間か、最近の請求から５年間か、または特許有効期間のうちのより長い期間制限なしに維持され、その期間中に成育不能になる場合には交換される。
寄託された種子は、対象発明の一部である。明らかに、ダイズ植物はこれらの種子から生育させることができ、そのような植物は対象発明の一部である。対象発明は、これらの植物およびその後代を検出するために有益であるこれらのダイズ植物に含有されるＤＮＡ配列にも関する。対象発明の検出方法およびキットは、試験の最終的な目的に応じて、これらのイベントのいずれか１つ、２つまたはさらには３つ全てを同定することを対象としてもよい。
定義および例は、本発明の記載の助けとなるように、および当業者が本発明を実施するのを指導するために本明細書で提供される。特に明記しない限り、用語は、関連分野の通常の知識を有する者による従来の用法に従って理解されるべきである。米国特許法施行規則§１．８２２に示されるＤＮＡ塩基のための命名法が用いられる。
本明細書で用いるように、用語「後代」は、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を含む親植物の任意の世代の子孫を表す。
トランスジェニック「イベント」は、異種ＤＮＡ、すなわち対象の導入遺伝子を含む核酸構築物による植物細胞の形質転換、植物のゲノムへの導入遺伝子の挿入からもたらされる植物の集団の再生、および特定のゲノム位置への挿入によって特徴づけられる特定の植物の選択によって生成される。用語「イベント」は、異種ＤＮＡを含む元の形質転換体および形質転換体の後代を指す。用語「イベント」は、形質転換体とゲノム／導入遺伝子ＤＮＡを含む別の変種との間の有性異系交配によって生成される後代も指す。反復親への反復戻し交雑の後でさえ、形質転換された親からの挿入導入遺伝子ＤＮＡおよび隣接ゲノムＤＮＡ（ゲノム／導入遺伝子ＤＮＡ）が、交配の後代の同じ染色体位置に存在する。用語「イベント」は、挿入ＤＮＡ（例えば、自家受粉から生じる元の形質転換体および後代）および挿入ＤＮＡを含有しない親の系統を含む１つの親の系統の有性交配の結果として、対象の導入遺伝子を含む挿入ＤＮＡを受ける後代へ伝えられることが予想される挿入ＤＮＡに直接隣接して挿入ＤＮＡおよび隣接ゲノム配列を含む元の形質転換体およびその後代のＤＮＡも指す。
「接合部配列」は、ゲノムに挿入されているＤＮＡが、挿入点に隣接するダイズの天然ゲノムのＤＮＡに連結する点にわたり、植物の遺伝物質中の１つまたは他の接合部配列の同定または検出は、イベントの診断に十分である。本明細書に記載されるダイズイベント中の挿入にわたるＤＮＡ配列および類似した長さの隣接ＤＮＡが含まれる。そのような診断配列の具体例が本明細書で提供される；しかし、挿入の接合部に重複する他の配列、または挿入およびゲノム配列の接合部も診断に役立ち、対象発明によって用いることもできた。
対象発明は、そのような隣接、接合部および挿入物配列を用いることによるイベント同定に一部関する。関連するＰＣＲプライマーおよびアンプリコンが、本発明に含まれる。対象発明により、挿入ＤＮＡおよびその境界（ボーダー）にわたるアンプリコンを用いるＰＣＲ分析法は、対象の商標登録されたトランスジェニックダイズ系統に由来する市販のトランスジェニックダイズ品種または系統を検出または同定するために用いることができる。
二成分プラスミド、ｐＤＡＢ８２６４（配列番号１３）は、図１に表される遺伝子エレメントを含む。以下の遺伝子エレメント（Ｔ鎖ボーダー配列は含まれない）が、ｐＤＡＢ８２６４のＴ鎖領域中に含有される。表１で、本明細書に開示される配列番号１３に関して遺伝子エレメントの残基番号付けが提供される。
配列番号１４および１５は、下でより詳細に記載されるように、それぞれ、挿入物配列の５’および３’部分と一緒になっている５’および３’隣接配列であり、したがって挿入物およびゲノムＤＮＡの５’および３’の「接合部」または「移行」配列を含む。配列番号１４に関して、残基１〜５７０は５’ゲノム隣接配列であり、残基５７１〜８５９は挿入物の５’末端の残基である。配列番号１５に関して、残基１〜２２０は挿入物の３’末端の残基であり、残基２２１〜１７１９は３’ゲノム隣接配列である。したがって、挿入物の５’末端に関する接合部配列または移行は、配列番号１４の残基５７０〜５７１の位置で起こる。したがって、挿入物の３’末端に関する接合部配列または移行は、配列番号１５の残基２２０〜２２１の位置で起こる。対象発明のポリヌクレオチドには、接合部配列のいずれの側にも、例えば、５、１０、２０、５０、１００、１５０または２００個の塩基、またはおそらくそれ以上、およびその間の任意の増分を含むものが含まれる。したがって、接合部配列にわたるプライマーは、例えば、隣接配列とハイブリダイズする５〜１０個の塩基および挿入物配列とハイブリダイズする５〜１０個の塩基を含むことができた。プローブおよびアンプリコンを同じように設計することができたが、それらは多くの場合プライマーより長かった。
対象配列（隣接配列を含む）は特有のものである。これらの挿入物および隣接配列に基づき、イベント特異的プライマーが生成された。ＰＣＲ分析は、これらのイベント特異的なプライマーセットで生成されるＰＣＲアンプリコンの分析によって、異なるダイズ遺伝子型でこれらのダイズ系統を同定することができることを実証した。したがって、これらのダイズ系統を特異的に同定するために、これらおよび他の関連した手順を用いることができる。本明細書で同定される配列は特有のものである。
後代に対象の１つまたは複数の追加の形質を付与しようとして対象のイベントを含む親植物を別の植物系統と交配させた後に、どの後代植物が所与のイベントを含むかについて判定するために、対象発明の検出技術は植物育種と合わせて特に有益である。これらのＰＣＲ分析法は、特に商品化されるトランスジェニックダイズ種子のために、ダイズ育種プログラムならびに品質管理に有益である。これらのトランスジェニックダイズ系統のためのＰＣＲ検出キットは、現在作製および使用することもできる。このことは、製品登録および製品管理にも有益である。
さらに、各挿入物のゲノム位置を特異的に同定するために、隣接ダイズ／ゲノム配列を用いることができる。この情報は、分子マーカー系統を各イベントに特異的にするために用いることができる。これらは、育種戦略の加速のために、および連鎖データを確立するために用いることができる。
なおさらに、隣接配列情報は、導入遺伝子組込み方法、ゲノム組込み部位の特性、イベント選別、導入遺伝子およびそれらの隣接配列の安定性、ならびに遺伝子発現（特に、遺伝子抑制、導入遺伝子メチル化パターン、位置効果、および潜在的発現関連のエレメント、例えばＭＡＲＳ［マトリックス給合領域］などに関連する）を試験し、特徴づけるために用いることができる。
対象開示を考慮すると、対象発明はＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１１３３６の下で入手可能な種子を含むことが明らかになるはずである。対象発明は、受託番号ＰＴＡ−１１３３６の下でＡＴＣＣに寄託された種子から生育させた除草剤耐性ダイズ植物も含む。対象発明は、前記植物の部分、例えば葉、組織試料、前記植物によって生成される種子、花粉などをさらに含む（それらは、配列番号１および配列番号２が側面に位置するトランスジェニック挿入物を含む）。
なおさらに、対象発明は、寄託種子から生育させた植物の子孫および／または後代植物、好ましくは除草剤抵抗性ダイズ植物を含み、前記植物は、本明細書に記載される検出可能な野生型ゲノムＤＮＡ／挿入物ＤＮＡ接合部配列を含むゲノムを有する。本明細書で用いる場合、用語「ダイズ」は、ダイズ（Glycine max）を意味し、ダイズ植物と交配することができるその全ての品種を含む。
本発明は、少なくとも片方の親として対象発明の植物を用いて交雑種を作製する方法をさらに含む。例えば、対象発明は、片方か両方の親として本明細書に例示される植物のいずれかを有するＦ１雑種植物を含む。対象発明のそのようなＦ１雑種によって生成される種子も、対象発明の範囲内にある。本発明は、例示される植物を異なる（例えば近交系統親）植物と交配して、生じるハイブリッド種子を収集することによってＦ１雑種種子を生成する方法を含む。対象発明は、雌親または雄親のいずれかである例示植物を含む。生じる植物の特性は、親植物の慎重な考慮によって向上させることができる。
対象発明の除草剤耐性のダイズ植物は、本明細書で言及される系統のいずれか１つの種子から生育させたダイズ植物からなる第１の親ダイズ植物と第２の親ダイズ植物を先ず有性交配させ、それによって複数の第１の後代植物を生成し；次に、除草剤に抵抗性である（または対象発明のイベントの少なくとも１つを保有する）第１の後代植物を選択し；第１の後代植物を自家受粉させ、それによって複数の第２の後代植物を生成し；次に、除草剤に抵抗性である（または対象発明のイベントの少なくとも１つを保有する）植物を第２の後代植物から選択することによって改良することができる。これらの段階は、第２の親ダイズ植物または第３の親ダイズ植物への第１の後代植物または第２の後代植物の戻し交雑をさらに含むことができる。対象発明のダイズ種子を含むダイズ作物、またはその後代を次に植えることができる。
２つの独立して分離している追加された外来性遺伝子を含有する子孫を生成するために、２つの異なるトランスジェニック植物を交配することもできることも理解するべきである。適当な後代の自家受粉は、両方の追加された外来性遺伝子がホモ接合である植物を生成することができる。栄養繁殖のように、親植物への戻し交雑および非トランスジェニック植物との異系交配も企図される。異なる形質および作物のために通常用いられる他の育種方法が、当技術分野で公知である。戻し交雑用親である、望ましいホモ接合栽培種または近交系統に、単純に遺伝する高度に遺伝性の形質のための遺伝子を伝えるために、戻し交雑育種法が用いられている。伝えられる形質の供給源は、ドナー親と呼ばれる。生じる植物は、反復親（例えば、栽培種）の特質およびドナー親から伝えられる望ましい形質を有すると予想される。最初の交配の後、ドナー親の表現型を保有する個体が選択され、反復親と繰り返し交配（戻し交配）される。生じる親は、反復親（例えば、栽培種）の特質およびドナー親から伝えられる望ましい形質を有すると予想される。
本発明のＤＮＡ分子は、マーカー支援育種（ＭＡＢ）方法で分子マーカーとして用いることができる。当技術分野で公知であるように、本発明のＤＮＡ分子は、遺伝的に連結されている農業上有益な形質を同定する方法（例えば、ＡＦＬＰマーカー、ＲＦＬＰマーカー、ＲＡＰＤマーカー、ＳＮＰおよびＳＳＲ）で用いることができる。除草剤耐性形質は、ＭＡＢ方法を用いて、対象発明のダイズ植物（またはその後代、および他の任意のダイズ栽培種もしくは品種）との交配の後代において追跡できる。ＤＮＡ分子はこの形質のためのマーカーであり、対象発明の少なくとも１つのダイズ系統またはその後代が親または祖先であったダイズ植物で除草剤抵抗性形質（複数可）を追跡するために、当技術分野で周知であるＭＡＢ方法を用いることができる。本発明の方法は、対象イベントを有する任意のダイズ品種を同定するために用いることができる。
対象発明の方法は、ダイズ栽培種にイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を遺伝子移入するステップを含む、除草剤耐性のダイズ植物を生成する方法を含む。より具体的には、本発明の方法は、対象発明の２つの植物または対象発明の１つの植物および他の任意の植物を交配するステップを含むことができる。好ましい方法は、対象発明によって検出可能なイベントについて前記後代を分析することによって、前記交配の後代を選択するステップをさらに含む。例えば、対象発明は、他の望ましい形質、例えば様々な実施例において本明細書で試験されるものなどの農業形質を含む植物との育種サイクルを通して対象イベントを追跡するために用いることができる。対象イベントおよび所望の形質を含む植物は、例えばさらなるラウンドの育種で検出、同定、選択すること、および速やかに用いることができる。対象イベント／形質は、対象発明によって、昆虫抵抗性形質（複数可）および／またはさらなる除草剤耐性形質と育種を通して組み合わせること、および追跡することもできる。後者の一実施形態は、除草剤ジカンバへの抵抗性をコードする遺伝子と組み合わせた対象イベントを含む植物である。
したがって、対象発明は、例えば、グリホサート抵抗性（例えば、抵抗性植物または細菌性グリホサートオキシダーゼ（ＧＯＸ））をコードする追加の形質、グリホサートアセチル転移酵素（ＧＡＴ）、グルホシネート抵抗性（例えばビアラホス抵抗性（ｂａｒ））のための追加の形質、アセトラクテート合成酵素（ＡＬＳ）抑制性の除草剤抵抗性を付与する形質（例えば、イミダゾリノン［イマゼタピルなど］、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド、ピリミジニルチオベンゾエートおよび他の化学作用［Ｃｓｒ１、ＳｕｒＡ、他］）、ブロモキシニル抵抗性形質（例えば、Ｂｘｎ）、ジカンバ除草剤への抵抗性のための形質（例えばＵ．Ｓ．２００３／０１３５８７９を参照）、ＨＰＰＤ（４−ヒドロキシフェニル−ピルビン酸−ジオキシゲナーゼ）酵素の阻害剤への抵抗性のための形質、フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）の阻害剤への抵抗性のための形質、光化学系ＩＩ抑制性の除草剤への抵抗性のための形質（例えば、ｐｓｂＡ）、光化学系Ｉ抑制性の除草剤への抵抗性のための形質、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＩＸ（ＰＰＯ）抑制性の除草剤（例えば、ＰＰＯ−１）への抵抗性のための形質、およびフェニル尿素除草剤（例えば、ＣＹＰ７６Ｂ１）への抵抗性のための形質と組み合わせることができる。複数のクラスの除草剤に対する雑草シフトおよび／または抵抗性を効果的に制御し、遅らせ、および／または防止する能力を提供するために、そのような形質の１つまたは複数を対象発明と組み合わせることができる。
当業者は、対象発明で用いられるａａｄ−１２遺伝子が、フェノキシアセテートオーキシン除草剤（例えば、２，４−ＤＢ、ＭＣＰＢなど）に変換される化合物への抵抗性も提供すると理解する。２，４−ＤＢ除草剤に存在する酪酸部分は、β−酸化を介して植物に有害である２，４−ジクロロフェノキシ酢酸に変換される。同様に、ＭＣＰＢはβ−酸化を介して植物に有害であるＭＣＰＡに変換される。ブタン酸除草剤はそれ自身除草活性はないが、感受性の植物の中でβ−酸化によってそれらのそれぞれの酸形に変換され、植物に有害である除草剤の酢酸形を生成する。急速なβ−酸化ができない植物は、ブタン酸除草剤によって害されない。しかし、急速なβ−酸化が可能で、ブタン酸除草剤を酢酸形に変換することができる植物は、その後ＡＡＤ−１２によって保護される。
除草剤の施用法は当技術分野で周知である。そのような施用には、複数の除草剤のタンクミックスを含めることができる。対象発明によって使用するための好ましい除草剤は、グリホサート、グルホシネートおよびフェノキシオーキシン除草剤（例えば２，４−Ｄ；２，４−ＤＢ；ＭＣＰＡ；ＭＣＰＢ）の組合せである。他の好ましい組合せには、グリホサートに２，４−Ｄを、またはグルホシネートに２，４−Ｄを加えた混合物が含まれる。これらの３種類の除草剤は、対象開示を利用する当業技術者に明らかになる有利な組合せで用いることができる。対象発明の種子を植えようとする前に、対象除草剤の１つまたは複数を畑／エリアへ施用することができる。そのような施用は、対象発明の種子の播種から例えば１４日以内であってよい。対象除草剤の１つまたは複数を、播種後から出芽前に施用することもできる。地面へ（雑草を防除するために）、または雑草の上面におよび／または対象発明のトランスジェニック植物の上面に、対象除草剤の１つまたは複数を施用することもできる。対象の３つの除草剤は、例えば、１つの除草剤に耐性であるが別のものには耐性でない雑草を防除または阻止するために、交替で、または組合せで用いることができる。対象の３種類の除草剤の様々な施用時期は、当技術分野で公知であるように様々な方法で用いることができる。
さらに、対象イベントは、トランスジェニックおよび非トランスジェニックの両方の、１つまたは複数の追加の除草剤耐性形質、１つまたは複数の追加のインプット（例えば、昆虫抵抗性（例えば、８１２イベントまたは８１４イベント）、真菌抵抗性、またはストレス耐性他）またはアウトプット（例えば、収量増、油プロファイルの向上、繊維特質の向上他）形質をスタックされてよい。したがって、対象発明は、任意の数の農業有害生物を柔軟におよび費用効果的に防除する能力を有する、向上した作物特質の完全な農業パッケージを提供するために用いることができる。
相同組換えを介して植物細胞の特定の染色体部位の中にポリヌクレオチド配列を組み込む方法は、当技術分野で記載されている。例えば、米国特許出願公開第２００９／０１１１１８８Ａ１号に記載される部位特異的組込みは、染色体標的へのドナーポリヌクレオチド配列の導入を媒介するための、リコンビナーゼまたはインテグラーゼの使用を記載する。さらに、国際特許出願ＷＯ２００８／０２１２０７は、ゲノムの特定位置に１つまたは複数のドナーポリヌクレオチド配列を組み込むための、ジンクフィンガーによって媒介される相同組換えを記載する。特定の染色体部位にポリヌクレオチド配列を組み込むために、米国特許第６，７２０，４７５号に記載されるＦＬＰ／ＦＲＴ、または米国特許第５，６５８，７７２号に記載されるＣＲＥ／ＬＯＸなどのリコンビナーゼの使用を利用することができる。最後に、特定の染色体位置にドナーポリヌクレオチドを向かわせるためのメガヌクレアーゼの使用が、Puchtaら、PNAS USA 93巻（1996年）5055〜5060頁に記載された。
植物細胞の中の部位特異的組込みのための他の様々な方法が一般的に公知であり、適用できる（Kumarら、Trends in Plant Sci. 6巻（4号）（2001年）155〜159頁）。さらに、いくつかの原核生物および下等真核生物で同定された部位特異的組換系を、植物で用いるために適用できる。そのような系の例として、それらに限定されないが以下のものが挙げられる：酵母ザイゴサッカロミセス・ルーキシ（Zygosaccharomyces rouxii）のｐＳＲ１プラスミドからのＲ／ＲＳリコンビナーゼ系（Arakiら（1985年）J. Mol. Biol. 182巻：191〜203頁）、およびファージμのＧｉｎ／ｇｉｘ系（MaeserおよびKahlmann（1991年）Mol. Gen. Genet. 230巻：170〜176頁）。
本発明の一部の実施形態では、既存のトランスジェニックイベントに近接して新しい導入遺伝子（複数可）を組み込むかスタックすることが望ましいことがある。トランスジェニックイベントは、単一の挿入部位、正常なメンデル分離および安定した発現、ならびに複数の環境場所における、およびそれらにわたる除草剤耐性および農業パフォーマンスを含む効力の優れた組合せなどの特有な特徴に基づいて選択された好ましいゲノム遺伝子座とみなすことができる。新たに組み込まれた導入遺伝子は、既存の形質転換体の導入遺伝子発現特性を維持するはずである。さらに、新たに組み込まれるイベントのゲノム隣接配列および染色体位置は既に同定されているので、新たに組み込まれるイベントの検出および確認のためのアッセイの開発は克服される。最後に、既存の導入遺伝子に連結する特定の染色体位置への新しい導入遺伝子の組込みは、従来の育種方法を用いる有性異系交配による他の遺伝的背景への導入遺伝子の遺伝子移入を促進する。
本発明の一部の実施形態では、トランスジェニックイベントからポリヌクレオチド配列を切除することが望ましいことがある。例えば、米国特許出願第１３／０１１，６６６号に記載される導入遺伝子切除は、染色体に組み込まれたトランスジェニックイベントから、遺伝子発現カセットからなるポリヌクレオチド配列を除去するためのジンクフィンガーヌクレアーゼの使用を記載する。除去されるポリヌクレオチド配列は、選択可能なマーカーであってよい。ポリヌクレオチド配列の切除および除去の後に、改変されたトランスジェニックイベントは、ポリヌクレオチド配列の挿入によって再標的化することができる。ポリヌクレオチド配列の切除および続く改変トランスジェニックイベントの再標的化は、選択マーカーの再利用、または特定の遺伝子の発現から生じる植物トランスクリプトームの予想外の変化を克服する能力などの利点を提供する。
本明細書で対象発明は、異種核酸の挿入のために優れている、ダイズゲノムの第６染色体の上の特定部位を開示する。第６染色体の上の挿入／ターゲティング部位の位置を同定することおよび／または標的化することにおいても役立つことができる、５’隣接配列および３’隣接配列も開示される。したがって、対象発明は、対象の異種核酸をこの事前に確立された標的部位またはこの標的部位の近くに導入する方法を提供する。対象発明は、開示される標的部位またはそのような部位の近辺に挿入されている任意の異種ヌクレオチド配列を含むダイズ種子および／またはダイズ植物も包含する。そのような標的化組込みを達成する１つの選択肢は、本明細書に例示されるｐａｔ発現カセットを切除することおよび／またはその代わりに異なる挿入物を置換することである。一般に、例えば、および限定されずに、対象発明によって標的化相同組換えを用いることができる。
本明細書で用いられる場合、遺伝子、イベントまたは形質の「スタッキング」は、所望の形質を１つのトランスジェニック系統で一緒にする。植物育種家は、所望の形質を各々有する親の間で交配を行い、次にこれらの所望の形質の両方とも有する子孫を同定することによって、トランスジェニック形質をスタックする。遺伝子をスタックする別の方法は、形質転換の間に植物の細胞核に２つ以上の遺伝子を同時に移すことによる。遺伝子をスタックする別の方法は、対象の別の遺伝子でトランスジェニック植物を再形質転換することによる。例えば、遺伝子スタッキングは、２つ以上の異なる形質、例えば２つ以上の異なる昆虫形質、昆虫抵抗性形質（複数可）および病気抵抗性形質（複数可）、２つ以上の除草剤抵抗性形質、および／または昆虫抵抗性形質（複数可）および除草剤抵抗性形質（複数可）を組み合わせるために用いることができる。対象の遺伝子に加えての選択可能なマーカーの使用も、遺伝子スタッキングとみなすことができる。
「相同組換え」は、それを通して２つのヌクレオチド配列が相互作用（再結合）して新しい組換え体ＤＮＡ配列を形成することができる、類似したヌクレオチド配列を含有する対応部位を有する任意の対のヌクレオチド配列の間の反応を指す。類似したヌクレオチド配列の部位は、本明細書で各々「相同配列」と呼ばれる。一般に、相同組換えの頻度は、相同配列の長さが増加するに従って増加する。したがって、相同組換えは同一未満である２つのヌクレオチド配列の間で起こり得るが、２つの配列の間の相違が増加するに従って組換え頻度（または効率）は低下する。組換えは、ドナーおよび標的分子の各々についての１つの相同配列を用いて達成することができ、それによって、「単一交差」組換え生成物を生成する。あるいは、標的およびドナーヌクレオチド配列の各々について２つの相同配列が配置されてもよい。ドナーについての２つの相同配列と標的についての２つの相同配列との間の組換えは、「二重交差」組換え生成物を生成する。ドナー分子の上の相同配列が操作され得る配列（例えば、対象配列）の側面に位置する場合は、標的分子との二重交差組換えは、標的分子についての相同配列の間に当初存在したＤＮＡ配列を対象配列が置換している組換え生成物をもたらす。二重交差組換イベントを介しての標的とドナーとの間でのＤＮＡ配列の交換は、「配列交換」と呼ばれる。
対象イベントは、３つの異なる除草剤耐性タンパク質のトランスジェニック発現を可能にし、ほとんど全ての広葉およびイネ科雑草を防除する除草剤の組合せへの耐性をもたらす。この多除草剤耐性形質の発現カセット／トランスジェニック挿入物は、例えば、他の除草剤耐性形質（例えば、グリホサート抵抗性、グルホシネート抵抗性、イミダゾリノン抵抗性、ジカンバ抵抗性、ＨＰＰＤ抵抗性、ブロモキシニル抵抗性他）、および昆虫抵抗性形質（例えば、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ３４／４５、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１Ｄａ、Ｃｒｙ１Ｅａ、Ｃｒｙ１Ｆａ、栄養性殺虫性タンパク質（「ＶＩＰＳ」）−ＶＩＰ３Ａを含む、など）をスタックされてよい。さらに、対象発明の発現カセット／トランスジェニック挿入物中の除草剤耐性タンパク質は、第２の遺伝子または遺伝子群で遺伝子操作された植物の一次形質転換体の選択を助けるための１つまたは複数の選択可能なマーカーの役割を果たすことができる。
除草剤（例えば、グリホサート）への新たに獲得された抵抗性または固有の耐性のために、形質のこれらの組合せは、雑草（および同様の）種を防除する新規方法をもたらす。したがって、イベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を用いて雑草を防除するための新規方法は、本発明の範囲内である。
作物に個々にスタックまたは形質転換される対象トランスジェニック形質の使用は、フェノキシ、ピリジルオキシ、グリホサートおよび／またはグルホシネート除草剤への耐性を付与するための遺伝子を含有しない他の除草剤耐性自生作物を防除するツールを提供する。
対象発明の好ましい植物または種子は、そのゲノムに、本明細書で特定される挿入物配列を、本明細書に記載される挿入物の両側の少なくとも２０〜５００個以上の連続する隣接ヌクレオチドと一緒に含む。特に明記しない限り、隣接配列への言及は、配列番号１および配列番号２に関して特定される配列を指す。前と同様に、対象イベントは、挿入ＤＮＡの直近の対象隣接ゲノム配列の間に挿入されている異種ＤＮＡを含む。これらの隣接配列の全てまたは一部は、そのイベントを含む親の系統の有性交配の結果として挿入ＤＮＡを受け取る後代へ伝えられることが予想することができる。
対象発明は、対象発明の植物の再生可能な細胞の組織培養を含む。そのような組織培養から再生される植物、特に例示される品種の全ての形態的および生理的特性を発現することが可能な植物も含まれる。対象発明の好ましい植物は、寄託種子から生育させた植物の全ての生理的および形態的特徴を有する。本発明は、そのような種子および対象の特質形質を保有する種子の後代をさらに含む。
植物または種子、またはその一部の操作（例えば、突然変異、さらなるトランスフェクションおよびさらなる育種）は、「事実上由来する」品種と呼ぶことができるものの生成をもたらすことができる。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗ Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ （ＵＰＯＶ）は、品種が保護品種に事実上由来しているかどうかについて判定するための以下のガイドラインを提供している：
［Ａ］以下の場合に、品種は、別の品種（「最初の品種」）に事実上由来するとみなされるものとする
（ｉ）それは主に最初の品種に由来するか、またはそれ自体主に最初の品種に由来する品種に由来するが、最初の品種の遺伝子型または遺伝子型の組合せから生じる本質的特徴の発現を保持する；
（ｉｉ）それは、最初の品種と明らかに識別可能である；および
（ｉｉｉ）誘導の行為から生じる差を除いて、それは、最初の品種の遺伝子型または遺伝子型の組合せから生じる本質的特徴の発現において最初の品種に一致する。
ＵＰＯＶ、国際機関との第６回会議、Ｇｅｎｅｖａ、１９９２年１０月３０日；文書は、連合事務局によって作成された。
本明細書で用いる場合、「系統」は、少なくとも１つの形質について個体間で遺伝的変異をほとんど又は全く示さない一群の植物である。そのような系統は、数世代の自家受粉および選択、または組織もしくは細胞培養技術を用いる単一の親からの栄養繁殖によって作製することができる。
本明細書で用いる場合、用語「栽培種」および「品種」は同義であり、商業生産のために用いられる系統を指す。
「安定性」または「安定した」は、所与の成分に関して、その成分が代々、好ましくは少なくとも３世代、実質的に同じレベルで、例えば好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、最も好ましくは±５％で引き続いて維持されることを意味する。安定性は、温度、場所、ストレスおよび栽植時期の影響を受けることがある。圃場条件下の以降の世代の比較は、同様の方法で成分を生成するはずである。
「商業上の有用性」は、従来の耕作機械を用いて作物を農民が生産することができ、従来の破砕および抽出設備を用いて記載される成分の油を種子から抽出することができるように、優れた植物活力および高い繁殖性を有することと定義される。商業上有益であるために、種子重量で測定される収量、含油量およびエーカーあたりの生産される全油は、同じ地域で育てられる高級な価値形質のない、その他は同等の市販キャノーラ品種の平均収量から１５％以内にある。
「農業優良種」は、対象イベント（複数可）による除草剤耐性に加えて、収量、成熟、病害抵抗性などの望ましい農業特性をある系統が有することを意味する。対象発明のイベントを含む植物の、下の実施例に示す、個々にまたは任意の組合せでとられる農業形質は、対象発明の範囲内である。これらの農業特性およびデータポイントのいずれかおよび全ては、そのような植物を同定するために、１点として用いられるか、またはそのような植物を規定するために用いられる特性範囲の一端もしくは両端で用いることができる。
本開示を考慮して当業技術者が認識するように、検出キットの好ましい実施形態は、例えば、「接合部配列」または「移行配列」（ダイズゲノム隣接配列が挿入物配列と出会う場所）に向けられるおよび／またはそれを含むプローブおよび／またはプライマーを含むことができる。例えば、これは、表１に示されるように、片方または両方の接合部配列（挿入物が隣接配列と出会う場所）を同定するように設計されるポリヌクレオチドプローブ、プライマー、および／またはアンプリコンを含む。１つの一般的な設計は、隣接領域でハイブリダイズする１つのプライマー、および挿入物でハイブリダイズする１つのプライマーを持つことである。そのようなプライマーは、各々しばしば約少なくとも１５残基の長さである。この配置で、プライマーは、対象発明のイベントの存在を示す検出可能なアンプリコンを生成／増幅するために用いることができる。これらのプライマーは、上で示される接合部配列にわたる（およびそれを含む）アンプリコンを生成するために用いることができる。
隣接配列で「タッチダウン」するプライマー（複数可）は、一般的に接合部から約２００個の塩基を越えてハイブリダイズするように設計されない。したがって、一般的な隣接プライマーは、挿入物の最初から数えて隣接配列に２００塩基の範囲内のいずれかの鎖の少なくとも１５残基を含むように設計される。すなわち、上で同定される一方または両方の接合部配列から約１００から２００〜５００（またはその位）塩基内の残基からの（またはそれとハイブリダイズする）適切なサイズの配列を含むプライマーは、対象発明の範囲内である。挿入物プライマーは挿入物の上のいずれかの位置に同様に設計することができるが、上で同定される接合部配列（複数可）中のまたはそこからの１００から約２００〜５００塩基内の挿入物（相補配列を含む）の上の残基は、例えば、そのようなプライマー設計のために非排他的に用いることができる。
当業者は、プライマーおよびプローブは、標準のハイブリダイゼーション条件および／またはＰＣＲ条件範囲の下で、本明細書に例示される配列（またはその相補配列）のセグメントとハイブリダイズするように設計することができることも認識し、そこで、プライマーまたはプローブは例示される配列に完全には相補的でない。すなわち、多少の程度のミスマッチは寛容できる。例えば約２０ヌクレオチドプライマーについては、ミスマッチ塩基が内部にあるか、アンプリコンの反対側にあるプライマーの末端である場合は、一般的に１つまたは２つほどのヌクレオチドが反対側の鎖と結合する必要性はない。様々な適当なハイブリダイゼーション条件が下で提供される。イノシンなどの合成ヌクレオチド類似体をプローブで用いることもできる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡプローブを用いることもできる。重要であることは、そのようなプローブおよびプライマーが対象発明のイベントの存在の診断に役立つ（特異的に同定および区別することができる）ことである。
例えば軽微な配列決定の誤りをもたらし得るＰＣＲ増幅での誤りが起こる可能性があることに注意すべきである。すなわち、特に明記しない限り、本明細書に記載される配列は、ダイズゲノムＤＮＡから長いアンプリコンを生成し、次にアンプリコンをクローニングおよび配列決定することによって決定された。ゲノムＤＮＡから配列決定のために十分なアンプリコンを生成するのに必要である多くの増幅周回を考慮すると、このように生成および判定される配列のわずかな差および軽微な不一致を見出すことは珍しいことではない。当業者は、この種の一般的な配列決定の誤りまたは不一致のために必要とされるいかなる調整も、対象発明の範囲内にあることを認識するべきであり、注意させるべきである。
配列がイベントの生成の間に挿入されるとき、例えば一部のゲノム配列が削除されることは珍しくないことにも注意すべきである。したがって、例えば対象の隣接配列とＧＥＮＢＡＮＫに記載されるゲノム配列との間に、多少の差が現れることもある。
「挿入物」の成分は図面で例示され、下の実施例でさらに詳細に議論される。これらの成分またはその断片のＤＮＡポリヌクレオチド配列は、本発明の方法でＤＮＡプライマーまたはプローブとして用いることができる。
本発明の一部の実施形態では、ダイズ植物から、植物および種子などで、導入遺伝子／ゲノム挿入領域の存在を検出するための組成物および方法が提供される。本明細書で提供される対象導入遺伝子／ゲノム挿入領域接合部配列、本明細書で同定される接合部配列を含むセグメント、ならびに任意のそのような例示配列およびその任意のセグメントの相補配列を含むＤＮＡ配列が提供される。挿入領域接合部配列は、ゲノムに挿入されている異種ＤＮＡと、挿入部位の側面に位置するダイズ細胞由来のＤＮＡとの間の接合部にわたる。そのような配列は、所与のイベントの診断に役立つことができる。
これらの挿入物およびボーダー配列に基づき、イベント特異的プライマーを生成することができる。ＰＣＲ分析は、これらのイベント特異的なプライマーセットで生成されるＰＣＲアンプリコンの分析によって、異なるダイズ遺伝子型における対象発明のダイズ系統を同定することができることを実証した。これらのダイズ系統を特異的に同定するために、これらおよび他の関連した手順を用いることができる。したがって、そのようなプライマー対に由来するＰＣＲアンプリコンは特有のものであり、これらのダイズ系統を同定するために用いることができる。
一部の実施形態では、新規導入遺伝子／ゲノム挿入領域の連続した断片を含むＤＮＡ配列は、本発明の一態様である。導入遺伝子挿入物配列のポリヌクレオチドの十分な長さ、および前記ダイズ植物の１つまたは複数からのダイズゲノム配列のポリヌクレオチドの十分な長さを含むＤＮＡ配列、ならびに／またはこれらのダイズ植物の１つまたは複数の診断に役立つアンプリコン生成物の生成のためのプライマー配列として有益である配列が含まれる。
関連する実施形態は、本明細書で同定されるＤＮＡ配列またはその相補配列の導入遺伝子部分の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ配列、およびこれらの配列またはその相補配列からの類似した長さの隣接ダイズＤＮＡ配列（例えば配列番号１および配列番号２ならびにそのセグメント）に関する。そのような配列は、ＤＮＡ増幅方法でのＤＮＡプライマーとして有益である。これらのプライマーを用いて生成されるアンプリコンは、本明細書で言及されるダイズイベントのいずれかの診断に役立つ。したがって、本発明は、そのようなＤＮＡプライマーおよび相同プライマーによって生成されるアンプリコンも含む。
本発明は、本明細書で言及されるダイズイベントに対応するＤＮＡの、試料中の存在を検出する方法も含む。そのような方法は、以下を含むことができる：（ａ）ＤＮＡを含む試料を、これらのダイズイベントの少なくとも１つ由来のＤＮＡとの核酸増幅反応で用いられるときに前記イベント（複数可）の診断に役立つアンプリコンを生成するプライマーセットと接触させるステップ；（ｂ）核酸増幅反応を実施し、それによってアンプリコンを生成するステップ；および（ｃ）アンプリコンを検出するステップ。
対象発明のさらなる検出方法は、前記イベントに対応するＤＮＡの試料中の存在を検出する方法を含み、前記方法は以下を含む：（ａ）ＤＮＡを含む試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で前記ダイズイベントの少なくとも１つ由来のＤＮＡとハイブリダイズし、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で対照ダイズ植物（非対象イベントＤＮＡ）とハイブリダイズしないプローブと接触させるステップ；（ｂ）試料およびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供するステップ；および（ｃ）ＤＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションを検出するステップ。
さらなる実施形態では、対象発明は、イベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を含むダイズ植物を生成する方法を含み、前記方法は以下のステップを含む：（ａ）第１の親ダイズ系統（前記系統の植物に前記除草剤抵抗性形質を付与する、本発明の発現カセットを含む）と第２の親のダイズ系統（この除草剤耐性形質を欠く）を有性的に交配し、それによって複数の後代植物を生成するステップ；および（ｂ）分子マーカーを用いて後代植物を選択するステップ。そのような方法は、前記除草剤耐性形質を含む純粋種の(true-breeding)ダイズ植物を生成するために、後代植物を第２の親ダイズ系統へ戻し交配するさらなるステップを任意選択で含むことができる。
本発明の別の態様により、前記イベントとの交配の後代の接合性を判定する方法が提供される。前記方法は、ダイズＤＮＡを含む試料を対象発明のプライマーセットと接触させるステップを含むことができる。前記ダイズイベントの少なくとも１つのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応で用いられるときに、前記プライマーは、前記ダイズイベントの少なくとも１つの診断に役立つ第１のアンプリコンを生成する。そのような方法は、核酸増幅反応を実施し、それによって第１のアンプリコンを生成するステップ；第１のアンプリコンを検出するステップ；およびダイズＤＮＡを含む試料を前記プライマーセットと接触させるステップ（前記プライマーセットは、ダイズ植物由来のゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応で用いられるとき、ダイズゲノム領域に相同性である天然のダイズゲノムＤＮＡを含む第２のアンプリコンを生成する；ならびに、核酸増幅反応を実施し、それによって第２のアンプリコンを生成するステップをさらに含む。この方法は、第２のアンプリコンを検出するステップ、ならびに試料中の第１および第２のアンプリコンを比較するステップをさらに含み、そこで、両アンプリコンの存在はその試料が導入遺伝子挿入にヘテロ接合であることを示す。
本明細書に開示される組成物およびＤＮＡ検出の分野で周知である方法を用いて、ＤＮＡ検出キットを開発することができる。キットは試料中の対象ダイズイベントＤＮＡの同定のために有益であり、このＤＮＡを含有するダイズ植物を育種する方法へ適用することができる。キットは、例えば本明細書に開示されるアンプリコンに相同であるか相補的なＤＮＡ配列、または対象イベントの導入遺伝子遺伝子エレメントに含有されるＤＮＡに相同であるか相補的なＤＮＡ配列を含有する。これらのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ増幅反応で、またはＤＮＡハイブリダイゼーション方法でのプローブとして用いることができる。キットは、検出方法の実施で必要な試薬および材料を含有することもできる。
「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはリポーター分子（放射性同位体、リガンド、化学発光剤または酵素など）が結合している、単離された核酸分子である。そのようなプローブは、標的核酸の鎖に、本発明の場合は、ダイズ植物からであれイベントのＤＮＡを含む試料からであれ、前記ダイズイベントの１つ由来のゲノムＤＮＡの鎖に相補的である。本発明によるプローブには、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合してその標的ＤＮＡ配列の存在を検出するために用いることができるポリアミドおよび他のプローブ材料も含まれる。「単離された」ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが非天然の状態にあること、例えば、異種プロモーターに作動可能に連結していることを意味する。「精製された」タンパク質は、同様に、そのタンパク質が非天然の状態にあることを意味する。
「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的標的ＤＮＡ鎖とアニールされて、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間でハイブリッドを形成し、次に、ポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼによって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長する、単離／合成された核酸である。本発明のプライマー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来の核酸増幅方法による標的核酸配列の増幅のためのそれらの使用を指す。
プローブおよびプライマーは、長さが一般に５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００ポリヌクレオチド以上である。そのようなプローブおよびプライマーは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の下で標的配列と特異的にハイブリダイズする。好ましくは、本発明によるプローブおよびプライマーは標的配列との完全な配列類似性を有するが、標的配列とハイブリダイズする能力を保持する、標的配列と異なるプローブを従来の方法によって設計することができる。
プローブおよびプライマーを調製する方法および用いる方法は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、第1〜3巻、Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989年に記載される。ＰＣＲプライマー対は、例えばその目的のためのコンピュータプログラムを用いて、既知の配列から導くことができる。
本明細書に開示される隣接ＤＮＡおよび挿入物配列に基づくプライマーおよびプローブは、従来の方法によって、例えばそのような配列を再クローニングおよび配列決定することによって、開示される配列を確認する（および、必要に応じて訂正する）ために用いることができる。
本発明の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件の下で標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズする。試料中のトランスジェニックイベント由来のＤＮＡの存在を同定するために、任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法を用いることができる。核酸分子またはその断片は、特定の状況下で他の核酸分子と特異的にハイブリダイズすることが可能である。本明細書で用いる場合、２つの核酸分子が逆平行の二本鎖核酸構造を形成することが可能であるならば、その２つの核酸分子は互いと特異的にハイブリダイズすることが可能であると言われる。それらが完全な相補性を示すならば、核酸分子は別の核酸分子の「相補配列」であると言われる。本明細書で用いる場合、分子の１つのあらゆるヌクレオチドが他の分子のヌクレオチドに相補的である場合に、それらの分子は「完全な相補性」を示すと言われる。少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件の下でそれらが互いとアニールした状態を保つのを可能にするのに十分な安定性でそれらが互いとハイブリダイズすることができる場合に、２つの分子は「最小限に相補的である」と言われる。同様に、従来の「高ストリンジェンシー」条件の下でそれらが互いとアニールした状態を保つのを可能にするのに十分な安定性でそれらが互いとハイブリダイズすることができる場合に、それらの分子は「相補的である」と言われる。従来のストリンジェンシー条件は、Sambrookら、1989年、によって記載される。したがって、完全な相補性からの逸脱は、そのような逸脱が二本鎖構造を形成する分子の能力を完全に排除しない限り許容される。核酸分子がプライマーまたはプローブの役割を果たすためには、その核酸分子は、利用される特定の溶媒および塩濃度の下で安定した二本鎖構造を形成できるように、配列が十分に相補的であることのみを必要とする。
本明細書で用いる場合、実質的に相同な配列は、高ストリンジェンシー条件の下でそれが比較される核酸配列の相補配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列である。用語「ストリンジェント条件」は、Sambrookら、1989年、9.52〜9.55で議論される特異的ハイブリダイゼーション手順による、核酸プローブと標的核酸（すなわち、対象の特定の核酸配列）とのハイブリダイゼーションに関して、機能的に定義される。Sambrookら、1989年、9.47〜9.52および9.56〜9.58も参照。したがって、本発明のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ断片の相補的ストレッチと二重鎖分子を選択的に形成するそれらの能力のために用いることができる。
想定される適用に従い、標的配列に対するプローブの様々な程度の選択性を達成するために、様々なハイブリダイゼーション条件を用いることができる。高い選択性を必要とする適用のために、例えばエンドポイントＴａｑＭａｎおよびリアルタイムＰＣＲ適用に関して、ハイブリッドを形成するために比較的ストリンジェントな条件が一般的に使用され、約６０℃から約７５℃の温度で１．５ｍＭから約４．０ｍＭのＭｇＣｌ２が選択され、および本明細書に記載されるように、ストリンジェンシーを増加させるために保持時間が変更されることがある。他のハイブリダイゼーション技術については、例えば約５０℃から約７０℃の温度で約０．０２Ｍから約０．１５ＭのＮａＣｌによって提供されるような、比較的低い塩および／または高い温度条件が一般的に使用される。ストリンジェント条件は、例えば、ハイブリダイゼーションフィルターを高ストリンジェンシー洗浄緩衝液（０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）で少なくとも２回洗浄することを含むことができる。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェンシー条件、例えば、約４５℃の６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）と、続く５０℃の２．０×ＳＳＣの洗浄は、当業者に公知である。例えば、洗浄工程での塩濃度は、５０℃の約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃の約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまでから選択することができる。さらに、洗浄工程での温度は、約２２℃の室温の低ストリンジェンシー条件から約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで増加させることができる。温度と塩の両方を変化させることができるか、または温度もしくは塩濃度のいずれかを一定に保持し、他の変数を変化させることができる。そのような選択的な条件は、プローブと鋳型または標的鎖との間のミスマッチを、あるとしてもわずかしか許容しない。ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ配列の検出は当業者に周知であり、米国特許第４，９６５，１８８号および第５，１７６，９９５号の教示はハイブリダイゼーション分析の方法の例である。
特に好ましい実施形態では、本発明の核酸は、相補配列およびその断片を含む、本明細書で例示または提案されるプライマー（またはアンプリコンもしくは他の配列）の１つまたは複数と、高ストリンジェンシー条件の下で特異的にハイブリダイズする。本発明の一態様では、本発明のマーカー核酸分子は、例示される配列の１つ、またはその相補配列および／または断片の、本明細書で示される核酸配列を有する。
本発明の別の態様では、本発明のマーカー核酸分子は、そのような核酸配列と８０％から１００％、または９０％から１００％の間の配列同一性を共有する。本発明のさらなる態様では、本発明のマーカー核酸分子は、そのような配列と９５％から１００％の間の配列同一性を共有する。そのような配列は、遺伝的交配の後代を同定するための植物育種法でマーカーとして用いることができる。プローブと標的ＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーションは、当業者に公知である任意の数の方法によって検出することができ、これらには、それらに限定されないが、蛍光性タグ、放射性タグ、抗体ベースのタグ、および化学発光タグを含めることができる。
特定の増幅プライマー対を用いての標的核酸配列の増幅（例えば、ＰＣＲによる）に関して、「ストリンジェント条件」は、プライマー対が、対応する野生型配列（またはその相補配列）を有するプライマーが結合する標的核酸配列とだけハイブリダイズして、好ましくは特有な増幅生成物アンプリコンを生成することを許す条件である。
用語「（標的配列）に特異的な」は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で、プローブまたはプライマーが標的配列を含む試料の標的配列とだけハイブリダイズすることを示す。
本明細書で用いる場合、「増幅されたＤＮＡ」または「アンプリコン」は、核酸鋳型の一部である標的核酸配列の核酸増幅生成物を指す。例えば、有性交配から生じるダイズ植物が本発明のダイズ植物からのトランスジェニックイベントゲノムＤＮＡを含有するかどうか判定するために、ダイズ植物組織試料から抽出されるＤＮＡは、挿入された異種ＤＮＡの挿入部位に隣接している植物ゲノムの隣接配列に由来するプライマーおよび挿入された異種ＤＮＡに由来する第２のプライマーを含むプライマー対を用いて核酸増幅方法にかけ、イベントＤＮＡの存在の診断に役立つアンプリコンを生成することができる。アンプリコンは、イベントの診断に同じく役立つ長さおよび配列を有する。アンプリコンの長さは、プライマー対に１つのヌクレオチド塩基対を組み合わせた長さから、および／またはプライマー対に約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００以上のヌクレオチド塩基対（上記の増分のいずれかを加えるか引いたもの）を組み合わせた長さに変動することができる。あるいは、全体の挿入物ヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成するように、プライマー対は挿入されるＤＮＡの両側の隣接配列に由来してよい。植物ゲノム配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入されるＤＮＡ配列から離れた位置にあることができる。この距離は、１ヌクレオチド塩基対から約２０，０００ヌクレオチド塩基対までの範囲内であってよい。用語「アンプリコン」の使用は、ＤＮＡ熱増幅反応で形成することができるプライマー二量体を特異的に排除する。
核酸増幅は、当技術分野で公知である、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む様々な核酸増幅方法のいずれかによって達成することができる。様々な増幅方法が当技術分野で公知であり、とりわけ、米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号に記載されている。最高２２ｋｂのゲノムＤＮＡを増幅するように、ＰＣＲ増幅方法が開発されている。本発明の実施で、これらの方法およびＤＮＡ増幅の技術分野で公知である他の方法を用いることができる。対象ダイズイベントからの異種導入遺伝子ＤＮＡ挿入物の配列または隣接ゲノム配列は、本明細書で提供される配列に由来するプライマーを用いてイベントからそのような配列を増幅し、続いてＰＣＲアンプリコンまたはクローンＤＮＡの標準のＤＮＡ配列決定によって検証する（および必要に応じて訂正する）ことができる。
これらの方法によって生成されるアンプリコンは、複数の技術によって検出することができる。アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウムによる染色は、ＤＮＡアンプリコンを検出する一般的な周知の方法である。別のそのような方法は、隣接する隣接ゲノムＤＮＡ配列と挿入されるＤＮＡ配列の両方に重複するＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計される、遺伝子ビット分析である。オリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプレートのウェルに固定化される。対象領域のＰＣＲ（挿入される配列中の１つのプライマーおよび隣接する隣接ゲノム配列中の１つのプライマーを用いる）の後、一本鎖ＰＣＲ生成物は、固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることができ、ＤＮＡポリメラーゼおよび予想される隣の塩基に特異的な標識ｄｄＮＴＰを用いる一塩基伸長反応のための鋳型の役割を果たすことができる。読み出しは蛍光性であるか、ＥＬＩＳＡベースであってよい。シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび一塩基伸長による挿入物／隣接配列の存在を示す。
別の方法は、Winge（Innov. Pharma. Tech. 00：18〜24頁、2000年）によって記載されるピロシークエンシング技術である。この方法では、隣接するゲノムＤＮＡおよび挿入物ＤＮＡ接合部に重複するオリゴヌクレオチドが設計される。オリゴヌクレオチドは、対象領域からの一本鎖ＰＣＲ生成物とハイブリダイズされ（挿入配列中の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列中の１つのプライマー）、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホスルフェートおよびルシフェリンの存在下でインキュベートされる。ＤＮＴＰが個々に追加され、その組込みが測定される光シグナルを生じる。光シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび一塩基または多塩基伸長による導入遺伝子挿入物／隣接配列の存在を示す。
蛍光偏光法は、本発明のアンプリコンを検出するために用いることができる別の方法である。この方法に従い、ゲノム隣接部および挿入ＤＮＡ接合部に重複するオリゴヌクレオチドが設計される。オリゴヌクレオチドは、対象領域からの一本鎖ＰＣＲ生成物とハイブリダイズされ（挿入ＤＮＡ中の１つのプライマーおよび隣接ゲノムＤＮＡ配列中の１つのプライマー）、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識ｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートされる。一塩基伸長は、ｄｄＮＴＰの組込みをもたらす。組込みは、蛍光光度計を用いて偏光での変化として測定することができる。偏光の変化は、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび一塩基伸長による導入遺伝子挿入物／隣接配列の存在を示す。
ＴＡＱＭＡＮ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）は、ＤＮＡ配列の存在を検出し、定量する方法である。簡潔に述べると、ゲノム隣接部および挿入物ＤＮＡ接合部に重複するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で、ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入物ＤＮＡ配列中の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列中の１つのプライマー）がサイクル処理される。特異的な増幅の間、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、ＦＲＥＴプローブの上の消光部分から蛍光部分を除いてこの部分を放出する。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによる隣接／導入遺伝子挿入物配列の存在を示す。
分子ビーコンは、配列検出で使用するために記載されている。簡潔に述べると、隣接ゲノムおよび挿入物ＤＮＡ接合部に重複するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブの特有な構造は、それが、蛍光部分および消光部分を極めて近くに保つ２次構造を含有することをもたらす。耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で、ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入物ＤＮＡ配列中の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列中の１つのプライマー）がサイクル処理される。ＰＣＲ増幅が成功した後、ＦＲＥＴプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションによって、プローブ２次構造の除去ならびに蛍光部分および消光部分の空間的分離が起こる。蛍光シグナルが生じる。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによる隣接ゲノム／導入遺伝子挿入物配列の存在を示す。
挿入のために優れているダイズゲノムの位置が開示されたが、対象発明は、このゲノム位置の概ね近辺に又はその周辺に少なくとも１つの非ａａｄ１２／ｐａｔ／２ｍｅｐｓｐｓコード配列を含むダイズ種子および／またはダイズ植物も含む。１つの選択肢は、本明細書に例示される挿入物の代わりに異なる挿入物を置換することである。これに一般に関し、例えば、対象発明によって標的化相同組換えを用いることができる。この種の技術は、例えば、ＷＯ０３／０８０８０９Ａ２および対応する公開米国特許出願（Ｕ．Ｓ．２００３／０２３２４１０）の対象である。したがって、対象発明は、本明細書で配列番号１および配列番号２と同定される隣接配列の全てまたは認識できるその一部が側面に位置する異種挿入物を（例示される挿入物の代わりに、またはその多コピーと共に）含む植物および植物細胞を含む。例示挿入物またはその成分のいずれかの追加のコピー（または複数の追加のコピー）も、この方法／これらの方法で挿入の標的にすることができた。
本明細書で参照または引用される全ての特許、特許出願、仮出願および刊行物は、それらがこの明細書の明白な教示と矛盾しない範囲で、参照により全体が組み込まれる。
本発明を実施するための手順を例示するために、および本発明の特定の好ましい実施形態を実証するために、以下の実施例が含まれる。これらの実施例は、限定するものと解釈されるべきでない。以下の実施例で開示される技術はその実施のための好ましい様式を例示するために用いられる特定の方法を表すことを、当業者は理解するべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、本発明の精神と範囲から逸脱することなく同様であるか類似した結果をなお得ながら、これらの具体的な実施形態に多くの変更を加えることができることを理解するべきである。特記されない限り、全ての百分率は重量によるものであり、全ての溶媒混合割合は特記されない限り容量によるものである。
特に明記しない限り、以下の略記号が用いられる。
ｂｐ 塩基対
℃ 摂氏温度
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ＤＩＧ ジゴキシゲニン
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ｋｂ キロベース
μｇ マイクログラム
μＬ マイクロリットル
ｍＬ ミリリットル
Ｍ モル質量
ＯＬＰ 重複プローブ
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＴＵ 植物転写単位
ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＯＰ 標準操作手順
ＳＳＣ 塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムの混合物を含有する緩衝溶液、ｐＨ７．０
ＴＢＥ トリス塩基、ホウ酸およびＥＤＴＡの混合物を含有する緩衝溶液、ｐＨ８．３
Ｖ ボルト
２ｍＥＰＳＰＳおよびＡＡＤ−１２ダイズイベント８２６４．４４．０６．１の形質転換および選択
ダイズ子葉節外植片のアグロバクテリウム（Agrobacteriumu）媒介形質転換を介して、ダイズイベント８２６４．４４．０６．１を含有するトランスジェニックダイズ（Glycine max）を作出した。形質転換を開始するために、Ｔ鎖ＤＮＡ領域の中に選択可能なマーカー、ｐａｔならびに対象遺伝子ａａｄ−１２および２ｍｅｐｓｐｓ ｖ１を含有する二成分ベクターｐＤＡＢ８２６４（図１）を運ぶ、無害化アグロバクテリウム（Agrobacterium）株ＥＨＡ１０１（Hoodら、2006年）を用いた。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換は、Zengら（2004年）の改変手順を用いて実行した。簡潔に述べると、ダイズ種子（栽培品種Ｍａｖｅｒｉｃｋ）を基本培地の上で発芽させ、子葉節を単離してアグロバクテリウム（Agrobacterium）に感染させた。アグロバクテリウム（Agrobacterium）の除去のために、生長開始、苗条伸長および発根用の培地に、セフォタキシム、チメンチンおよびバンコマイシンを補充した。形質転換されていない苗条の生育を抑制するために、グルホシネート選択を用いた。選択された苗条は根の発達のために発根培地に移し、次に、小植物の順応のために配合土に移した。
選択された小植物の頂生小葉は、推定上の形質転換体についてスクリーニングするためにグルホシネートを葉に塗布した。スクリーニングされた小植物を温室に移し、順応させ、次に耐性を再確認するためにグルホシネートを葉に塗布し、推定上の形質転換体であるとみなした。スクリーニングした植物から試料を採取し、選択可能なマーカー遺伝子および／または対象遺伝子の確認のための分子解析を実行した。Ｔ０植物を温室で自家受精させて、Ｔ１種子を生成した。
このイベント、ダイズイベント８２６４．４４．０６．１は、独立した形質転換分離株から生成された。Ｔ１植物は、以降の世代にわたって戻し交配され、優良品種へ遺伝子移入された。このイベントは、単一の挿入部位、正常なメンデル分離および安定した発現、ならびに除草剤耐性および農業パフォーマンスを含む効力の優れた組合せなどのその特有の特徴に基づいて選択された。以下の実施例は、ダイズイベント８２６４．４４．０６．１を特徴づけるために用いられたデータを含有する。
ダイズイベント８２６４．４４．０６．１でのＡＡＤ−１２、２ｍＥＰＳＰＳおよびＰＡＴタンパク質の特徴づけ
トランスジェニックダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１に由来する組換え体ＡＡＤ−１２、２ｍＥＰＳＰＳおよびＰＡＴタンパク質の生化学的性質を特徴づけした。タンパク質の生化学的性質を特徴づけて、ＡＡＤ−１２、ＰＡＴおよび２ｍＥＰＳＰＳタンパク質の発現を確認するために、定量的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いた。
実施例２．１：植物組織でのＡＡＤ−１２タンパク質の発現
ＡＡＤ−１２タンパク質のレベルを、ダイズイベント８２６４．４４．０６．１で判定した。定量的酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）方法を用いて、ダイズ葉組織から可溶性の抽出可能なＡＡＤ−１２タンパク質を測定した。
ダイズ組織の試料を試験植物から単離し、発現分析のために調製した。０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、ＡＡＤ−１２タンパク質をダイズ植物組織から抽出した。植物組織を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、サンドイッチ形式のＡＡＤ−１２ ＥＬＩＳＡキットを用いて分析した。キットを、製造業者の推奨プロトコルに従って用いた。
ダイズイベント８２６４．４４．０６．１で発現安定性および遺伝率を垂直（世代間）および水平（同世代の系統の間）の両方で調査するために、検出分析を実施した。Ｔ４世代で、ダイズイベント８２６４．４４．０６．１の発現は全ての系統を通して安定で（分離せず）、一貫していた。圃場発現レベル試験をダイズイベントについて実施した；全ての系統を通しての平均発現は、およそ２００〜４００ｎｇ／ｃｍ２であった。
実施例２．２：植物組織での２ｍＥＰＳＰＳタンパク質の発現
２ｍＥＰＳＰＳタンパク質のレベルを、ダイズイベント８２６４．４４．０６．１で判定した。定量的酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）方法を用いて、ダイズ葉組織から可溶性の抽出可能な２ｍＥＰＳＰＳタンパク質を測定した。
ダイズ組織の試料を試験植物から単離し、発現分析のために調製した。０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、２ｍＥＰＳＰＳタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。植物組織を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、サンドイッチ形式の２ｍＥＰＳＰＳ ＥＬＩＳＡキットを用いて分析した。キットを、製造業者の推奨プロトコルに従って用いた。
ダイズイベント８２６４．４４．０６．１で発現安定性および遺伝率を垂直（世代間）および水平（同世代の系統の間）の両方で調査するために、検出分析を実施した。Ｔ４世代で、ダイズイベント８２６４．４４．０６．１の発現は全ての系統を通して安定で（分離せず）、一貫していた。圃場発現レベル試験をダイズイベント８２６４．４４．０６．１について実施した。全ての系統を通しての平均発現は、およそ５，０００〜１７，５００ｎｇ／ｃｍ２であった。これらの発現レベルは、２ｍＥＰＳＰＳタンパク質を発現した陽性対照より高かった。
実施例２．３：植物組織でのＰＡＴタンパク質の発現
ＰＡＴタンパク質のレベルを、ダイズイベント８２６４．４４．０６．１で判定した。定量的酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）方法を用いて、ダイズ葉組織から可溶性の抽出可能なＰＡＴタンパク質を測定した。
ダイズ組織の試料を試験植物から単離し、発現分析のために調製した。０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、ＰＡＴタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。植物組織を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、サンドイッチ形式のＰＡＴ ＥＬＩＳＡキットを用いて分析した。キットを、製造業者の推奨プロトコルに従って用いた。
ダイズイベント８２６４．４４．０６．１で発現安定性および遺伝率を垂直（世代間）および水平（同世代の系統の間）の両方で調査するために、検出分析を実施した。Ｔ４世代で、ダイズイベント８２６４．４４．０６．１の発現は全ての系統を通して安定で（分離せず）、一貫していた。圃場発現レベル試験をダイズイベント８２６４．４４．０６．１について実施した。全ての系統を通しての平均発現は、およそ１５〜２５ｎｇ／ｃｍ２であった。
ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の挿入物および隣接ボーダー領域のＤＮＡ配列のクローニングおよび特徴づけ
ゲノム挿入部位を特徴づけて記載するために、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の隣接ゲノムＴ−ＤＮＡボーダー領域の配列を決定した。全体で、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１ゲノム配列の２，５７８ｂｐが確認され、５’隣接ボーダー配列の５７０ｂｐ（配列番号１）、３’隣接ボーダー配列の１，４９９ｂｐ（配列番号２）を含む。ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１ボーダー配列に基づくＰＣＲ増幅は、ボーダー領域がダイズ起源であり、接合部領域がイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１に特有な配列であることを確認した。接合部領域は、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のイベント特異的同定のために用いることができた。さらに、野生型ダイズのゲノムから同定された隣接ボーダー配列の領域に対応するゲノム断片を増幅することによって、Ｔ鎖挿入部位を特徴づけた。ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１と野生型ゲノム配列との比較により、元の遺伝子座から約４，３５７ｂｐが欠失したことを明らかにした。全体として、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の挿入物およびボーダー配列の特徴づけは、Ｔ鎖の無傷のコピーがダイズゲノムに存在することを示した。
実施例３．１：ダイズゲノム配列の確認
５’および３’隣接ボーダーは、第６染色体からのダイズ（Glycine max）全ゲノムショットガン配列と整列し、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の導入遺伝子がダイズゲノムの第６染色体に挿入されたことを示している。ダイズゲノムからのダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１導入遺伝子の挿入部位を確認するために、異なる対のプライマーでＰＣＲを実行した（図２および表３）。ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１および他のトランスジェニックであるか非トランスジェニックのダイズ系統からのゲノムＤＮＡを、鋳型として用いた。したがって、５’ボーダー配列が正しいかどうかを確認するために、２ｍｅｐｓｐｓ遺伝子から５’末端ボーダー配列にわたるＤＮＡセグメントを増幅するために、２ｍｅｐｓｐｓ特異的プライマー、例えばＥＤ＿ｖ１＿Ｃ１（配列番号１１）、ならびに、４４０６−ＷＦ１（配列番号３）および４４０６−ＷＦ３（配列番号５）と命名された、クローニングされた５’末端ボーダー配列および／またはダイズゲノム第６染色体の上のその整列配列によって設計された２つのプライマーを用いた。同様に、クローニングされた３’末端ボーダー配列の確認のために、ｐａｔ遺伝子から３’末端ボーダー配列にわたるＤＮＡセグメントを増幅するために、ｐａｔ特異的プライマー、例えばＰＡＴ−１２（配列番号１２）、ならびに、４４０６−ＷＲ５（配列番号７）、４４０６−ＷＲ７（配列番号９）および４４０６−ＷＲ８（配列番号１０）と命名された、クローニングされた３’末端ボーダー配列によって設計された３つのプライマーを用いた。ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のゲノムＤＮＡのみに由来する予測されたサイズのＤＮＡ断片は、１つのプライマーがダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の隣接ボーダーに位置し、１つが導入遺伝子特異的プライマーである各プライマー対を用いて増幅されたが、他のトランスジェニックダイズ系または非トランスジェニック対照のＤＮＡ試料からは増幅されなかった。これらの結果は、クローニングされた５’および３’ボーダー配列が、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のためのＴ鎖挿入物の隣接ボーダー配列であることを示す。
ダイズゲノムのＤＮＡ挿入をさらに確認するために、２つのダイズ配列にわたるＰＣＲ増幅を完了した。全導入遺伝子、５’末端ボーダー配列および３’ボーダー配列を含有するＤＮＡセグメントを増幅するために、５’末端ボーダー配列によって設計された２つのプライマー、４４０６−ＷＦ１（配列番号３）および４４０６−ＷＦ３（配列番号５）、ならびに３’末端ボーダー配列のための２つのプライマー、４４０６−ＷＲ５（配列番号７）および４４０６−ＷＲ７（配列番号９）を用いた。予想通りに、４４０６−ＷＦ１（配列番号３）および４４０６−ＷＲ５（配列番号７）のプライマー対によるＰＣＲ増幅は、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のゲノムＤＮＡからおよそ１２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅し、非トランスジェニックダイズ対照および他のダイズトランスジェニック系から６ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。同様に、４４０６−ＷＦ３（配列番号５）および４４０６−ＷＲ７（配列番号９）のプライマー対で完了したＰＣＲ反応は、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の試料からおよそ１２ｋｂのＤＮＡ断片を生成し、他の全てのダイズ対照系統から６ｋｂのＤＮＡ断片を生成した。これらの結果は、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の導入遺伝子がダイズゲノムの第６染色体の部位に挿入されたことを実証した。ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の同定された５’および３’ボーダー配列と第６染色体からのダイズ（Glycine max）全ゲノムショットガン配列を整列することにより、元の遺伝子座から約４．４ｋｂが欠失したことを明らかにした。（図３）。
サザンブロットによるダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の特徴づけ
ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の組込みパターンを確立するために、サザンブロット分析を用いた。これらの実験は、ダイズゲノム内でのａａｄ−１２、ｐａｔおよび２ｍｅｐｓｐｓ ｖ１導入遺伝子の組込みおよび統合性を実証するデータを生成した。ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１は、プラスミドｐＤＡＢ８２６４からのａａｄ−１２、ｐａｔおよび２ｍｅｐｓｐｓ ｖ１ ＰＴＵの単一コピーを含有する、完全長の単純な組込みイベントと特徴づけられた。
サザンブロットデータは、Ｔ鎖断片がダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のゲノムに挿入されたことを示唆した。ｐＤＡＢ８２６４のＴ鎖組込み領域に含有されるａａｄ−１２、ｐａｔおよび２ｍｅｐｓｐｓ ｖ１挿入物に特異的なプローブ、ならびに、プラスミドの中に位置する切断部位を有し、プラスミドの内部のハイブリダイズする断片またはダイズゲノムＤＮＡとのプラスミドの接合部（ボーダー断片）にわたる断片を生成する記載の制限酵素を用いて、詳細なサザンブロット分析を実行した。制限酵素とプローブの組合せのためのサザンハイブリダイゼーションから示される分子量は、そのイベントに特有のものであって、その同定パターンを確立した。これらの分析は、プラスミド断片が、ａａｄ−１２、ｐａｔおよび２ｍｅｐｓｐｓ ｖ１ ＰＴＵの再配列なしでダイズゲノムＤＮＡに挿入されたことも示した。
実施例４．１：ダイズ葉試料収集およびゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）単離
ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を含有する個々のダイズ植物から収集された葉組織から、ゲノムＤＮＡを抽出した。さらに、ａａｄ−１２および２ｍｅｐｓｐｓ ｖ１遺伝子のないサブスタンス系統を表す遺伝的背景を含有する、従来のダイズ植物ＭａｖｅｒｉｃｋからｇＤＮＡを単離した。標準の臭化セチルトリメチルアンモニウムＣＴＡＢ方法に従って、個々のゲノムＤＮＡを凍結乾燥葉組織から抽出した。抽出の後、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、ＤＮＡを分光蛍光分析により定量した。Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ分析からの値を確認し、次に、ＤＮＡ特質を決定するためにＤＮＡをアガロースゲルで可視化した。
実施例４．２：ＤＮＡ消化および分離
ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のサザンブロット分子特徴づけのために、１０マイクログラム（１０μｇ）のゲノムＤＮＡを消化した。1μｇのＤＮＡにつきおよそ５単位の選択された制限酵素および対応する反応緩衝液を各ＤＮＡ試料に加えることによって、ダイズｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１および非トランスジェニックダイズ系統ＭｅｖｅｒｉｃｋからのゲノムＤＮＡを消化した。各試料は、およそ３７℃で一晩インキュベートした。消化物のために、制限酵素ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＨｉｎＤＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＮｓｉＩおよびＰａｃＩを個々に用いた（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）。さらに、プラスミドＤＮＡ、ｐＤＡＢ８２６４を非トランスジェニックダイズ品種ＭａｖｅｒｉｃｋからのゲノムＤＮＡと組み合わせることによって、陽性のハイブリダイゼーション対照試料を調製した。試験試料と同じ手順および同じ制限酵素を用いて、プラスミドＤＮＡ／ゲノムＤＮＡカクテルを消化した。消化を一晩インキュベートした後、ＮａＣｌを０．１Ｍの最終濃度まで加え、消化されたＤＮＡ試料をイソプロパノールで沈殿させた。沈殿したＤＮＡペレットを２０μｌの１×添加液（０．０１％ブロムフェノールブルー、１０．０ｍＭ ＥＤＴＡ、５．０％グリセロール、１．０ｍＭトリスｐＨ７．５）に再懸濁させた。次に、このＤＮＡ試料および分子サイズのマーカーを、０．８５％アガロースゲルを介して０．４×ＴＡＥ緩衝液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）で３５ボルトでおよそ１８〜２２時間電気泳動にかけて、断片の分離を達成した。ゲルを臭化エチジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で染色し、紫外（ＵＶ）光の下でＤＮＡを可視化した。
実施例４．３：サザン法および膜処理
サザンブロット分析は、事実上、Memelink, J.；Swords, K.；Harry J.；Hoge, C.；（1994年）Southern, Northern, and Western Blot Analysis、Plant Mol. Biol. Manual F1：1〜23頁に記載のように実施した。簡潔に述べると、ＤＮＡ断片の電気泳動分離および可視化の後、０．２５ＭのＨＣｌでおよそ２０分間ゲルを脱プリンし、次に変性溶液（０．４ＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣｌ）におよそ３０分間、その後中和溶液（１．５ＭのＮａＣｌ、０．５ＭトリスｐＨ７．５）に少なくとも３０分間晒した。１０×ＳＳＣによるウィッキング系を用いてナイロン膜の上でサザン転写を一晩実施した。転写の後、ＵＶ架橋によりＤＮＡを膜に結合させ、続いて２×ＳＳＣ溶液により簡単に膜洗浄した。この方法は、ハイブリダイゼーション用のサザンブロット膜を生成した。
実施例４．４：ＤＮＡプローブ標識化およびハイブリダイゼーション
ナイロン膜に結合したＤＮＡ断片は、標識プローブを用いて検出した。遺伝子エレメントに特異的なプライマーを用いて、プラスミドｐＤＡＢ８２６４から増幅されたＤＮＡ断片中への、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ヌクレオチド［ＤＩＧ−１１］−ｄＵＴＰのＰＣＲをベースとした組込みによってプローブを生成した。ＰＣＲ合成によるＤＮＡプローブの生成は、製造業者の推奨手順に従ってＰＣＲ ＤＩＧプローブ合成キット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて実行した。
標識プローブをアガロースゲル電気泳動によって分析して、それらの特質および量を決定した。次に、実質的にＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）について記載した手順を用いて、特異的な断片の検出のために、ナイロン膜の上での標的ＤＮＡへのハイブリダイゼーションのために所望量の標識プローブを用いた。簡潔に述べると、固定されたＤＮＡを含有するナイロン膜ブロットを２×ＳＳＣで簡単に洗浄し、ハイブリダイゼーションオーブン内で、およそ４５〜５５℃で約２時間、ハイブリダイゼーションボトルの中で２０〜２５ｍＬの予熱したＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液でプレハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーション溶液を次にデカントし、およそ５分間水浴上で沸騰させることによって変性させた特異的プローブの所望量を含有する、およそ１５ｍＬの予熱したＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液と交換した。次に、ハイブリダイゼーションオーブン内でおよそ４５〜５５℃で一晩、ハイブリダイゼーション工程を実行した。
プローブハイブリダイゼーションの終わりに、プローブを含有するＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液を清潔なチューブにデカントし、およそ−２０℃で保存した。製造業者の推奨手順に従って、これらのプローブは二度にわたって再利用することができた。膜のブロットを簡単に洗い落とし、室温でおよそ５分間、清潔なプラスチック容器の中で低ストリンジェンシー洗浄緩衝液（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）によって２回洗浄し、その後およそ６５℃でそれぞれ１５分間、高ストリンジェンシー洗浄緩衝液（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で２回洗浄した。膜のブロットは、およそ５分間、ＤＩＧ洗浄およびブロック緩衝液セット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）からの１×マレイン酸緩衝液で簡単に洗浄した。この後に、１×ブロック緩衝液中で２時間のブロック、および同じく１×ブロック緩衝液中で最低３０分間の抗ＤＩＧ−ＡＰ（アルカリ性ホスファターゼ）抗体（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）とのインキュベーションが続いた。１×洗浄緩衝液による２〜３回の洗浄の後、特異的ＤＮＡプローブは膜ブロットに結合したままであり、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ化学発光核酸検出系（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を製造業者の推奨に従って用いてＤＩＧ標識ＤＮＡ標準を可視化した。１つまたは複数の時点についてブロットを化学発光フィルムに曝露させ、ハイブリダイズする断片を検出し、分子サイズ標準を可視化させた。フィルムをＡｌｌ−Ｐｒｏ １００ Ｐｌｕｓフィルム現像液（Ｋｏｎｉｃａ Ｍｉｎｏｌｔａ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）で現像し、画像を走査した。各プローブについて検出されたバンドの数およびサイズを記録した（表５）。記載のようにＤＩＧ検出の後可視になるＤＩＧ標識ＤＮＡ分子量マーカーＩＩ（ＤＩＧＭＷＭＩＩ）およびＤＩＧ標識ＤＮＡ分子量マーカーＶＩＩ（ＤＩＧＭＷＭＶＩＩ）を用いて、サザンブロットでハイブリダイズする断片のサイズを決定した。
実施例４．５：サザンブロットの結果
ａａｄ−１２および２ｍｅｐｓｐｓＰＴＵの既知の制限酵素部位に基づく、特定の消化物およびプローブで予想および観察された断片サイズを、表６に示す。予想された断片サイズはｐＤＡＢ８２６４のプラスミドマップに基づき、観察された断片サイズはこれらの分析からの近似結果であり、ＤＩＧ標識ＤＮＡ分子量マーカーＩＩおよびマークＶＩＩ断片の示されたサイズに基づく。
２種類の断片がこれらの消化物およびハイブリダイゼーションから同定された：既知の酵素部位がプローブ領域の側面に位置し、ａａｄ−１２および２ｍｅｐｓｐｓ ＰＴＵ ＰＴＵの挿入領域の中に完全に含有される内部断片、ならびに既知の酵素部位がプローブ領域の一方の末端に位置し、第２の部位がダイズゲノムで予想されるボーダー断片。ほとんどの場合、ＤＮＡ断片組込み部位は各イベントに特有であるので、ボーダー断片サイズはイベントによって異なる。ボーダー断片は、組み込まれたＤＮＡと比較した制限酵素部位の位置決めし、ＤＮＡ挿入物の数を評価するための手段を提供する。イベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を含有するダイズの複数世代についてサザンブロット分析を完了させ、プラスミドｐＤＡＢ８２６４からの低コピーの無傷のａａｄ−１２および２ｍｅｐｓｐｓ ＰＴＵがダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のダイズゲノムに挿入されていることを示唆するデータを生じた。
制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎＤ ＩＩＩは、プラスミドｐＤＡＢ８２６４の特有の制限部位に結合して切断する。その後、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のａａｄ−１２遺伝子挿入物を特徴づけるために、これらの酵素が選択された。４，０７８ｂｐを超えるまたは３，６９０ｂｐを超えるボーダー断片が、それぞれＨｉｎＤ ＩＩＩおよびＮｃｏＩ消化の後、プローブとハイブリダイズすると予測された（表６）。ＨｉｎＤ ＩＩＩおよびＮｃｏＩがそれぞれ用いられたとき、およそ７，４００ｂｐおよびおよそ３，８００ｂｐの単一のａａｄ−１２ハイブリダイゼーションバンドが観察された。このサイズのバンドへのプローブのハイブリダイゼーションは、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のダイズゲノムでのａａｄ−１２遺伝子のための単一の挿入部位の存在を示唆する。制限酵素ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＮｓｉＩおよびＰａｃＩは、ａａｄ−１２植物転写単位（ＰＴＵ；プロモーター／遺伝子／ターミネーター）を含有する断片を放出するように選択された（表６）。予測されたおよそ５，０００、およそ５，０００およびおよそ６，８００ｂｐの断片は、それぞれＢｓｔＺ１７Ｉ、ＮｓｉＩおよびＰａｃＩによる消化の後にプローブで観察された。ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１試料の酵素消化と続くプローブハイブリダイゼーションで得られた結果は、プラスミドｐＤＡＢ８２６４からの無傷のａａｄ−１２ＰＴＵがダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のダイズゲノムに挿入されていることを示した。さらに、ＨｉｎＤＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＮｓｉＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉ制限断片に対して生じたハイブリダイゼーションバンドの分子量サイズは、ａａｄ−１２ＰＴＵが、連結したｐａｔ ＰＴＵも含有したことを示す。
制限酵素ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＮｃｏＩおよびＮｓｉＩは、プラスミドｐＤＡＢ８２６４の制限部位に結合して切断する。その後、これらの酵素を選択して、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の２ｍｅｐｓｐｓ遺伝子挿入物を特徴づけた。４，８５８ｂｐを超える、３，７５６ｂｐを超える、または５，１９９ｂｐを超えるボーダー断片は、それぞれＢｓｔＺ１７Ｉ、ＮｃｏＩおよびＮｓｉＩによる消化の後にプローブとハイブリダイズすると予測された（表６）。ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＮｃｏＩおよびＮｓｉＩがそれぞれ用いられたとき、およそ１６，０００ｂｐ、およそ６，１００ｂｐおよびおよそ５，３００ｂｐの単一の２ｍｅｐｓｐｓハイブリダイゼーションバンドが観察された。このサイズのバンドへのプローブのハイブリダイゼーションは、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のダイズゲノムでの２ｍｅｐｓｐｓ遺伝子のための単一の挿入部位の存在を示唆する。制限酵素ＰａｃＩは、２ｍｅｐｓｐｓ植物転写単位（ＰＴＵ；プロモーター／遺伝子／ターミネーター）を含有する断片を放出するように選択された（表６）。ＰａｃＩによる消化の後に、予測されたおよそ６，８００ｂｐの断片がプローブで観察された。ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１試料の酵素消化と続くプローブハイブリダイゼーションで得られた結果は、プラスミドｐＤＡＢ８２６４からの無傷の２ｍｅｐｓｐｓ ＰＴＵがダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のダイズゲノムに挿入されていることを示した。
実施例４．６：骨格配列の不在
ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１でスペクチノマイシン抵抗性遺伝子（ｓｐｅｃＲ）、Ｏｒｉ Ｒｅｐエレメントおよび複製開始タンパク質ｔｒｆＡ（ｔｒｆ Ａエレメント）の不在を検証するために、サザンブロット分析も行った。適当な陽性対照（ｐＤＡＢ８２６４プラスＭａｖｅｒｉｃｋ）および陰性対照（Ｍａｖｅｒｉｃｋ）をサザン分析のために含める場合、スペクチノマイシン抵抗性、Ｏｒｉ Ｒｅｐエレメントまたはｔｒｆ Ａエレメントには特異的なハイブリダイゼーションがないと予想される。ＨｉｎＤ ＩＩＩ消化およびｓｐｅｃＲ特異的プローブとのハイブリダイゼーションの後、およそ９，３００ｂｐの１つの予想サイズのバンドが、陽性対照試料（ｐＤＡＢ８２６４プラスｍａｖｅｒｉｃｋ）で観察されたが、陰性対照およびダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の試料にはなかった。同様に、ＰａｃＩ消化およびＯｒｉ Ｒｅｐ特異的プローブとｔｒｆＡ特異的プローブとの混合物とのハイブリダイゼーションの後には、およそ９，２００ｂｐの１つの予想サイズのバンドが陽性対照試料（ｐＤＡＢ８２６４プラスｍａｖｅｒｉｃｋ）で検出されたが、陰性対照およびダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の試料にはなかった。これらのデータは、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１でのスペクチノマイシン抵抗性遺伝子、Ｏｒｉ Ｒｅｐエレメントおよび複製開始タンパク質ｔｒｆＡの不在を示す。
耕種学、収量および除草剤耐性の評価
ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の農業特性および除草剤耐性を、単一の生育段階の間に複数の地理的場所での収量試験で試験した。ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１とＭａｖｅｒｉｃｋ対照植物との間で、農業上意味のある予想外の差は観察されなかった。試験の結果は、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１が、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照植物と農業上同等であることを実証した。さらに、グリホサートと２，４−Ｄのタンクミックスを噴霧したとき、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１は強固な除草剤耐性を提供した。
各場所での全ての試験項目について以下の農業特性を測定し、記録した。
１）出芽：株立ち数を１メートルの区画に植えた種子数で割り、１００を掛けることによって計算される。
２）Ｖ１時の苗活力：活力は、試験区の健康状態の全体的な推定値である。結果は０〜１００％のスケールで評価し、０％は全て死植物の試験区を表し、１００％は非常に健康そうな試験区を表す。
３）Ｖ３薬剤施用から１日、７日および１４日後の全体的な視覚的作物傷害、クロロシスおよび壊死を評価した。２，４−Ｄ傷害の典型である上偏成長の全ての徴候について観察した。上偏成長は、葉および茎のねじれまたは下垂として表される。全ての作物傷害は０〜１００％スケールを用い、０％は傷害なしを示し、１００％は完全な植物死を示す。
４）開花日：この測定では、試験区での植物の５０％が開花し始める日を記録する。各試験区で植えてから植物の５０％が開花したときまでの日数を記録した。
５）Ｒ２またはＲ１時の株立ち数：１試験区につき１うねの代表的な１メートル区画での植物数を数え、Ｒ２またはＲ１生育段階に記録することによって判定される、各試験区での平均の植物活力の視覚的推定値である。
６）Ｒ２薬剤施用から１日、７日および１４日後の全体的な視覚的作物傷害、クロロシスおよび壊死を評価した。２，４−Ｄ傷害の典型である上偏成長の全ての徴候について観察した。上偏成長は、葉および茎のねじれまたは下垂として表される。全ての作物傷害は０〜１００％スケールを用い、０％は傷害なしを示し、１００％は完全な植物死を示す。
７）Ｒ６生育段階の病害発生率：試験区での病害の程度を記録するために病害発生率の視覚的推定値を用いる。０〜１００％のスケールで評価する。０％は病害が存在しないことを示し、１００％は試験区の全ての植物が罹病したことを示す。
８）Ｒ６生育段階の虫害：試験区での虫害の程度を記録するために虫害の視覚的推定値を用いる。昆虫による傷害を受けた試験区の植物組織の百分率を、０〜１００％スケールを用いて記録した。０％は虫害が存在しないことを示し、１００％は試験区の全ての植物が虫害を受けたことを示す。
９）老化時の草高：各試験区の植物の平均高を記録した。葉が落ちた後、植物を土壌表面から先端まで測定した。測定値は、センチメートルで記録した。試験区が倒伏した場合は、代表的な植物群を立ち上げて測定値を得た。
１０）成熟までの日数。試験区のさやの９５％が生理的成熟に到達し、植物が干乾びた色であった日を記録した。植えてからの経過日数を計算した。
１１）倒伏：収穫時に倒伏程度の視覚的推定値を記録した。０〜１００％スケールで記録し、０％は倒伏なしを示し、１００％は試験区の全ての植物が地面にひれ伏したことを示す。
１２）脱粒：収穫時にさやの脱粒の視覚的推定値を記録した。試験区ごとに脱粒を起こしたさやの百分率の推定値として記録した。０〜１００％スケールを用い、０％は脱粒なしを示し、１００％は全てのさやが脱粒を起こしたことを示す。
１３）収量：各試験区から収集した穀物の重量を記録した。２うねの試験区全体を収穫して、種子重量および水分を記録した。１３％の水分に調整することによって、ブッシェル／エーカーを計算した。
１４）１００粒重：各試験区について、１００粒の種子を数え、重量をグラムで記録した。
２重量％の硫酸アンモニウム（ＡＭＳ）を混合した、２，４−Ｄとグリホサートのタンクミックスの２，１８５ｇ ａｅ／ヘクタールでの噴霧の施用後、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の除草剤耐性を調べた。除草剤は、Ｖ３／Ｒ２逐次的除草剤処理として噴霧した。この除草剤処理は、発達のＶ３生育段階のダイズ植物に噴霧し、続いて発達のＲ２生育段階の第２の逐次的噴霧よって完了した。Ｖ３生育段階は、単葉および最初の３つの三小葉の葉が完全に展開したときに特徴づけられる。Ｒ２生育段階は、完全に展開した葉のついた主幹の２つの最上節の１つでの単一の開花を特徴とする。
これらの試験は、処理ごとに４反復の無作為化された完備型ブロック計画を用いて設定された。各試験区は２うね幅であり、うねは３０インチ間隔であった。試験区には、試験区の間に２．５〜３．０フィートの通路を設けて、全長１２．５フィートに植えた。Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照植物は除草剤施用によって死滅すると予想され、したがってそれらはトランスジェニックダイズ植物のうねから離れた別の試験区で生育させた。
噴霧されなかったダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１と比較した、２，４−Ｄとグリホサートの除草剤タンクミックスを噴霧したダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の結果を要約する。表７は、２，４−Ｄとグリホサートのタンクミックスを噴霧したダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１と噴霧されなかったダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を比較する分析からの平均値を提示する。除草剤施用はダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１に傷害を及ぼさず、これらの植物は、表７に記載される報告された農業特性に関して、噴霧されなかったダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１植物と比較して同等の成績を挙げた。発達のＶ３段階での１および７ｄａａ（噴霧後日数）ならびに発達のＲ２段階での１、７および１４ｄａａ時の一部の初期の一過性傷害を除いては、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１は、２，４−Ｄとグリホサートのタンクミックスに強固な耐性を示した。対照的に、Ｍａｖｅｒｉｃｋ植物のいずれも除草剤噴霧処理の後に生存していなかった。
対照系統Ｍａｖｅｒｉｃｋと比較したダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の耕種学的同等性を調べた。これらの試験は、２反復のブロック計画を用いて設定された。各試験区は２うね幅であり、うねは３０インチ間隔であった。試験区には、試験区の間に２．５〜３．０フィートの通路を設けて、全長１２．５フィートに植えた。
表８は、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の耕種学的同等性を対照系統Ｍａｖｅｒｉｃｋと比較する分析からの平均値を提示する。耕種学的データは、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１がＭａｖｅｒｉｃｋ植物と同等の成績を挙げ、農業上意味のある予想外の差をもたらさないことを示す。
イベント特異的なＴａｑＭａｎアッセイ
ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の存在を検出して、育種集団で植物の接合性状態を判定するために、２つのイベント特異的なＴＡＱＭＡＮアッセイを開発した。ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１は、二成分ベクターｐＤＡＢ８２６４のＴ鎖を含有する（図１）。ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の特異的検出のために、特異的なＴａｑｍａｎプライマーおよびプローブを、５’（配列番号１４）または３’（配列番号１５）の挿入物−植物接合部に位置するＤＮＡ配列によって設計した（図４）。その５’末端にＦＡＭリポーターを含有する、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）によって合成された２つのプライマーおよび標的特異的ＭＧＢプローブを用いて、５’組込み接合部にわたる９８ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号１６）を特異的に検出するように、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のための１つのイベント特異的アッセイを設計した。その５’末端にＦＡＭリポーターを含有する、ＡＢＩによって合成された２つの特異的プライマーおよび標的特異的ＭＧＢプローブを用いて、３’組込み接合部にわたる１３１ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号１７）を特異的に標的にするように、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のための別のイベント特異的アッセイを設計した。２ｍＥＰＳＰＳおよびａａｄ−１２ＰＴＵを含有する１１個の異なるイベント、ならびにダイズ特異的内在性参照遺伝子ＧＭＦＬ０１−２５−Ｊ１９（ダイズ（Glycine max）ｃＤＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＫ２８６２９２．１）との二重形式での対照非トランスジェニックダイズ品種（Ｍａｖｅｒｉｃｋ）に対して、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のためのこのＴａｑｍａｎ検出方法の特異性を試験した。
実施例６．１：ｇＤＮＡ単離
１１個の異なるダイズイベントおよび非トランスジェニックダイズ品種のｇＤＮＡ試料をこの試験で試験した。改変Ｑｉａｇｅｎ ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ植物ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。ｇＤＮＡ抽出のために、１試料につき８個の新鮮なダイズ葉ディスクを用いた。販売会社の指示（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）に従って、ｇＤＮＡをＰｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ法で定量した。この試験のために、ＤＮＡ分解酵素を含まない水で試料を希釈して、１０ｎｇ／μＬの濃度をもたらした。
実施例６．２：Ｔａｑｍａｎアッセイおよび結果
特異的なＴａｑｍａｎプライマーおよびプローブを、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１特異的Ｔａｑｍａｎアッセイのために設計した。ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の中で導入遺伝子を検出するために、これらの試薬は下記の条件で用いることができる。表９は、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の検出のために特に開発されたプライマーおよびプローブ配列を記載する。
増幅のための多重ＰＣＲ条件は、以下の通りである：１０μｌの全反応液中に、１×ロシュＰＣＲ緩衝液、０．４μＭイベント特異的フォワードプライマー、０．４μＭイベント特異的リバースプライマー、０．４μＭプライマーＧＭＳ１１６Ｆ、０．４μＭプライマーＧＭＳ１１６Ｒ、０．２μＭイベント特異的プローブ、０．２μＭ ＧＭＳ１１６プローブ、０．１％ＰＶＰ、２０ｎｇ ｇＤＮＡ。以下の条件を用いてこのカクテルを増幅した：ｉ）９５℃で１０分間、ｉｉ）９５℃で１０秒間、ｉｉｉ）６０℃で３０秒間、ｉｖ）７２℃で１秒間、ｖ）ステップｉｉ〜ｉｖを３５サイクル繰り返す、ｖ）４０℃を保持。リアルタイムＰＣＲを、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０で実行した。データ分析は、蛍光の変化率がその最大値に到達するときのＰＣＲサイクル数である、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ソフトウェアで判定された交差点（Ｃｐ値）の測定に基づいた。
２ｍＥＰＳＰＳおよびａａｄ−１２ＰＴＵを含有する１１個の異なるイベント、ならびにダイズ特異的内在性参照遺伝子ＧＭＦＬ０１−２５−Ｊ１９（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＫ２８６２９２．１）との二重形式での非トランスジェニックダイズ品種に対して、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のためのＴａｑｍａｎ検出方法を試験した。アッセイは、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を特異的に検出し、対照（すなわち、２ｍＥＰＳＰＳおよびａａｄ−１２ＰＴＵを含有する１１個の異なるイベントならびに非トランスジェニックダイズ品種）からいかなる偽陽性結果も生成または増幅しなかった。イベント特異的なプライマーおよびプローブは、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の検出のために用いることができ、これらの条件および試薬は接合性アッセイに適用できる。
ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の完全長配列
配列番号２７は、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の完全長配列を提供する。この配列は、５’ゲノム隣接配列、ｐＤＡＢ８２６４からの組み込まれたＴ鎖挿入物および３’ゲノム隣接配列を含有する。配列番号２７に関して、残基１〜１４９４は５’ゲノム隣接配列であり、残基１４９５〜１４９７は３つの塩基対挿入であり、残基１４９８〜１１，７７４はｐＤＡＢ８２６４Ｔ鎖挿入物であり、残基１１，７７５〜１３，６５９は３’隣接配列である。したがって、挿入物の５’末端に関する接合部配列または移行は、配列番号２７の残基１４９４〜１４９５において起こる。したがって、挿入物の３’末端に関する接合部配列または移行は、配列番号２７の残基１１，７７４〜１１，７７５において起こる。配列番号２７は、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のポリヌクレオチド配列であり、それは、ＰＣＲ増幅反応を介して生成され、ＡＢＩ Ｂｉｇ Ｄｙｅ（登録商標）ターミネーター配列決定反応キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて配列決定された複数のＰＣＲコンティグのアラインメントから組み立てられた。
ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１およびダイズ昆虫耐性イベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１の育種スタック
実施例８．１：ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１とダイズ昆虫耐性イベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１の有性交配
ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１と有性的に交配した。ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の葯をダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１の柱頭全体に手でこすりつけ、それによってダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１を受精させた。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１とダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の両方からの組込みイベントを含有している生じたＦ１後代を、２，４−Ｄおよびグリホサート除草剤への耐性についてスクリーニングして、両方の組込みイベントを含有する後代植物を同定した。次に、Ｆ１後代植物を自家受精させてＦ２子孫を生成し、それは両イベントに関して独立して分離することが確認された。Ｆ２植物に、２，４−Ｄ（１１２０ｇ ａｅ／ヘクタール）およびグリホサート（１１２０ｇ ａｅ／ヘクタール）の両方を含有する除草剤を一回噴霧施用した。両イベントに関してホモ接合である植物を同定するために、Ｔａｑｍａｎの接合性をベースとしたアッセイを用いて生じたＦ２植物をスクリーニングした。これらのＦ２ホモ接合植物の自家受粉は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１およびダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の両方についてホモ接合であったＦ３子孫を生成した。生じたイベントは、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４０６．１と表示した。
実施例８．２：ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の接合性状態の判定
ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１およびダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１の育種交配から生成された植物の接合性状態を判定するために、別々のイベント特異的なＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを開発して、ｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１またはｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のいずれかの組込みイベントの存在を検出した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１およびダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の両方を含有し、両イベントに関してホモ接合である個体植物を同定するために、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１とダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種交配の自家受精から生成された分離するＦ２植物を、これらのイベント特異的なＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイで試験した。
ｇＤＮＡ単離
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックの分離するＦ２植物からのｇＤＮＡ試料を、この試験で試験した。１植物につき４枚の新鮮なダイズ葉ディスクを、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックの３，１８７個の分離するＦ２植物から収集した。改変Ｑｉａｇｅｎ ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ植物ＤＮＡキット（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、これらの試料からゲノムＤＮＡを抽出した。
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイおよび結果
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１（米国特許仮出願第６１／４７１８４５号）およびｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１（上記）のための個々のイベント特異的アッセイの使用のために、前述のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プライマーおよびプローブを設計した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックの中に含まれる各組込みイベントの接合性を判定するために、これらの試薬を下記の条件で用いた。
増幅のための多重ＰＣＲ条件は、以下の通りである：１０μｌの全体の反応液中に、１×ロシュＰＣＲ緩衝液、０．４μＭイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１特異的フォワードプライマー、０．４μＭイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１特異的リバースプライマー、０．４μＭイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１特異的フォワードプライマー、０．４μＭイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１特異的リバースプライマー、０．４μＭプライマーＧＭＳ１１６Ｆ、０．４μＭプライマーＧＭＳ１１６Ｒ、０．２μＭイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１特異的プローブ、０．２μＭイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１特異的プローブ、０．２μＭ ＧＭＳ１１６プローブ、０．１％ＰＶＰ、２０ｎｇ ｇＤＮＡ。以下の条件を用いてこのカクテルを増幅した：ｉ）９５℃で１０分間、ｉｉ）９５℃で１０秒間、ｉｉｉ）６０℃で３０秒間、ｉｖ）７２℃で１秒間、ｖ）ステップｉｉ〜ｉｖを３５サイクル繰り返す、ｖ）４０℃を保持。リアルタイムＰＣＲを、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０で実行した。データ分析は、蛍光の変化率がその最大値に到達するときのＰＣＲサイクル数である、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ソフトウェアで判定された交差点（Ｃｐ値）の測定に基づいた。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１とダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の両方に関して個々の植物の接合性を判定するために、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１とダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種交配から生成された合計３，１８７個の分離するＦ２植物を、イベント特異的ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイで試験した。これらのアッセイからの結果は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１とダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の両方が２，３６０個体の植物に存在し、検出されたことを示した。各組込みイベントの接合性状態（倍数性レベルとしても記載される）を、表９ｂに示す。２，３６０個体の同定された植物のうち、２３７個体は２コピーのダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１およびダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を含有すると判定された。
実施例８．３：ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックでのタンパク質発現の特徴づけ
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックで発現される組換え体Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａｃ、ＡＡＤ１２、２ｍＥＰＳＰＳおよびＰＡＴタンパク質の生化学的性質を特徴づけた。ＰＡＴの発現を定量するために、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いた。比較上、Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）からの電気化学発光技術を利用して、多重化イムノアッセイによってＣｒｙ１Ａｃ／Ｃｒｙ１ＦおよびＡＡＤ１２／２ｍＥＰＳＰＳタンパク質を定量した。総合すると、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックでのこれらのタンパク質の生化学的性質を特徴づけ、その強固な発現を確認するために、これらのアッセイを用いた。
植物組織でのＰＡＴタンパク質の発現
ＰＡＴタンパク質のレベルは、Ｆ３ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックで判定され、それらはイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１とイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１から発現されたＰＡＴタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１およびダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１と比較した。
可溶性の抽出可能なＰＡＴタンパク質をダイズ葉組織から得、定量的ＥＬＩＳＡ方法（ＡＰＳ ０１４、Ｅｎｖｉｒｏｌｏｇｉｘ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）を用いて測定した。単葉からＶ１段階の温室で育てた試験植物からダイズ葉組織の試料を単離し、発現分析のために調製した。界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）および１％のポリビニルピロリドン４０（ＰＶＰ−４０）を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、ＰＡＴタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。次に、ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ（登録商標）を１５００ｒｐｍで５分間用いて、試料を抽出した。植物抽出物を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、サンドイッチ形式のＰＡＴ ＥＬＩＳＡキットを用いて分析した。キットを、製造業者の推奨プロトコル（Ｅｎｖｉｒｏｌｏｇｉｘ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）に従って用いた。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の発現および遺伝率を調査するために、検出分析を実施した。育種スタック、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のＦ３世代は、親のイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１およびｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のいずれよりも高い濃度でＰＡＴを発現した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１育種スタックでのＰＡＴ濃度の増加が予想された。ＰＡＴのより高い濃度は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１が親のイベントのいずれと比較してもｐａｔコード配列のコピーを２倍多く含有する結果である（表１０）。
植物組織でのＣｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａｃタンパク質の発現
Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａｃタンパク質のレベルは、Ｆ３ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックで判定され、それらはイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１とイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１から発現されたＣｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａｃタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１と比較した。
可溶性の抽出可能なＣｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａｃタンパク質をダイズ葉組織から得、多重化電気化学発光ＭＳＤアッセイを用いて測定した。単葉からＶ１段階の温室で育てた植物からダイズ葉組織の試料を単離し、発現分析のために調製した。界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）および１％のポリビニルピロリドン４０（ＰＶＰ−４０）を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａｃタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。次に、ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ（登録商標）を１５００ｒｐｍで５分間用いて、試料を抽出した。植物抽出物を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ ＤｉｓｃｏｖｅｒｙからのＣｒｙ１Ｆ／Ｃｒｙ１Ａｃ多重ＭＳＤアッセイを用いて分析した。キットを、製造業者の勧めるプロトコルに従って用いた。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の発現および遺伝率を調査するために、検出分析を実施した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックのＦ３世代は、親のダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１よりも高い濃度でＣｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａｃタンパク質を発現した。（表１１）。これらの結果は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１植物が、親の系統、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１から受け継いだｃｒｙ１Ｆおよびｃｒｙ１Ａｃコード配列の機能的に発現するコピーを含有したことを示す。
植物組織でのＡＡＤ１２および２ｍＥＰＳＰＳタンパク質の発現
ＡＡＤ１２および２ｍＥＰＳＰＳタンパク質のレベルは、Ｆ３ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックで判定され、それらはイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１とイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１から発現されたＡＡＤ１２および２ｍＥＰＳＰＳタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１と比較した。
可溶性の抽出可能なＡＡＤ１２および２ｍＥＰＳＰＳタンパク質をダイズ葉組織から得、多重化電気化学発光ＭＳＤアッセイを用いて測定した。単葉からＶ１段階の温室で育てた植物からダイズ葉組織の試料を単離し、発現分析のために調製した。界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）および１％のポリビニルピロリドン４０（ＰＶＰ−４０）を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、ＡＡＤ１２および２ｍＥＰＳＰＳタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。次に、ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ（登録商標）を１５００ｒｐｍで５分間用いて、試料を抽出した。植物抽出物を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ ＤｉｓｃｏｖｅｒｙからのＡＡＤ１２および２ｍＥＰＳＰＳ多重ＭＳＤアッセイを用いて分析した。キットを、製造業者の勧めるプロトコルに従って用いた。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の発現および遺伝率を調査するために、検出分析を実施した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックのＦ３世代は、親のダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１よりも高い濃度でＡＡＤ１２および２ｍＥＰＳＰＳタンパク質を発現した。（表１２）。これらの結果は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１植物が、親の系統、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１から受け継いだａａｄ−１２および２ｍＥＰＳＰＳコード配列の機能的に発現するコピーを含有することを示した。
実施例８．４：ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックの除草剤耐性
育種スタック、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の除草剤耐性を、２生育期の間検定した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１種子を植え、成熟するまで生育させた。成熟した植物に、２，４−Ｄおよびグリホサートの組合せからなった除草剤を一回噴霧施用した。これらの除草剤に対して生じた耐性は、生存植物数を数えることによって測定した。比較上、ａａｄ−１２および２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子を含有せず、２，４−Ｄおよびグリホサート除草剤の施用に感受性であると予想された対照植物が、試験に含まれた。
最初のシーズンには、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックのＦ２分離系統の１２０個の圃場生育試験区で、除草剤耐性を調べた。各試験区は１うね幅であり、うねは３０インチ間隔であった。試験区は、試験区の間に４．５フィートの通路を設け、１２フィートの中心（全長７．５フィートに植えた）に植えた。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックのＦ２分離系統からの合計４，３６４個体の植物に、２，４−Ｄとグリホサートの混合液を噴霧した（１１２０ｇ ａｅ／ヘクタール）。グリホサート／２，４−Ｄ除草剤の一回の噴霧施用は、Ｖ３とＶ４生育段階との間に行った。Ｖ３生育段階は、単葉および最初の３枚の三葉葉が完全に展開することで特徴づけられ、Ｖ４生育段階は、単葉および最初の４枚の三葉葉が完全に展開することで特徴づけられる。除草剤処理が完了した後、試験区を観察し、３，２３４個体の植物が除草剤施用に耐性であると同定された。除草剤施用に感受性であったダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１植物は、ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１組込みイベントのメンデル分離の結果として、ａａｄ−１２および２ｍＥＰＳＰＳのコピーを含有していなかった。
第２のシーズンには、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の温室で育てたＦ３ホモ接合植物で除草剤耐性を調べた。ダイズ植物を、１ポットに１つの植物を含有する４インチポットにおいて生育させた。合計１５個体のＦ３ホモ接合植物に、２，４−Ｄおよびグリホサート（８４０ａｅ／ヘクタール）を一回噴霧施用した。１５個体の植物は全て除草剤の噴霧後に生存し、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１植物が除草剤グリホサートおよび２，４−Ｄの施用に耐性であることを示した。
要約すると、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１親系統に存在したａａｄ−１２および２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子は、２，４−Ｄおよびグリホサート除草剤への耐性を付与した。これらの形質はダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１で継承され、受け継がれ、それによってダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１に除草性耐性を提供した。比較上、ａａｄ−１２および２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子を含有しない対照植物は、２，４−Ｄおよびグリホサート除草剤の施用に感受性であった。
実施例８．５：ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４０６．１の殺虫活性の特徴づけ
ｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１Ｆ導入遺伝子の発現からもたらされた、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックの殺虫性耐性を特徴づけるために、温室内評価を実施した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を、アンチカルシア・ゲンマタリス（Anticarsia gemmatalis）（ベルベットビーンキャタピラー）およびシュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）（ダイズルーパ）を含む実験室内飼育ダイズ害虫に対して試験した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックを、非形質転換ダイズ品種Ｍａｖｅｒｉｃｋに加えて親のダイズイベント（ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１およびダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１）と比較した。この比較は、Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａｃタンパク質によって提供される植物保護のレベルが、ダイズ植物のゲノムにさらなる導入遺伝子を導入した育種スタックに存在するかどうか判定するために行った。さらに、除草剤の施用がＣｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａｃタンパク質によって提供される昆虫からの植物の保護に何らかの効果を有するかどうか判定するために、昆虫バイオアッセイの前に、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１およびダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の両方の育種スタックに、２，４−Ｄおよびグリホサートを含有する除草剤を一回噴霧施用した（８４０ｇ ａｅ／ヘクタール）。
温室内試験を、およそ３週間目の植物で行った。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタック、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１および陰性対照；除草剤を噴霧したダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１およびＭａｖｅｒｉｃｋを評価するために、１０個体の植物を各々用いた。合計３０枚の葉ディスク／植物／昆虫種に対して各昆虫種（アンチカルシア・ゲンマタリス（Anticarsia gemmatalis）およびクリソデイキシス（Chrysodeixis）（旧称シュードプルシア（Pseudoplusia））・インクルデンス（includens））を試験するため、各植物から葉を３回打ち抜いた。１．４ｃｍ直径（または１．５４ｃｍ２）の葉パンチを２％素寒天の上の試験領域に置き、１匹の新生子幼虫を寄生させ、有孔のプラスチックふたで密封した。寄生させてから４日後に死亡率および葉の消費を評価した。軽く突いても応答しなかった幼虫は、死虫とみなされた。昆虫によって消費された葉パンチの百分率を視覚的に評価することによって、葉の傷害を調べた。ＪＭＰ（登録商標）Ｐｒｏ９．０．１（２０１０ ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて、データの統計分析を実施した。
これらの反復実験から得られた結果（表１３）は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックのＣｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａｃタンパク質によって提供された昆虫保護のレベルおよび死亡率が、親のダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１と一貫していたことを示した。予想された通り、試験した全ての昆虫について、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１は、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１（５８〜７６％）およびＭａｖｅｒｉｃｋ（７９〜９１％）対照植物より有意に低い虫害（０．１０〜０．１５％）を維持した。さらに、ｃｒｙ１Ｆおよびｃｒｙ１Ａｃコード配列を含有した全てのダイズイベントで高い昆虫死亡率（１００％）が記録されたが、陰性対照、ＭａｖｅｒｉｃｋおよびダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１は１０％未満の昆虫死亡率であった。したがって、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１は、親のダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１と同等レベルの殺虫活性由来の保護を提供した。
ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１およびダイズ昆虫耐性イベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の育種スタック
実施例９．１：ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１とダイズ昆虫耐性イベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の有性交配
ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１と有性的に交配した。ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の葯をダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の柱頭全体に手でこすりつけ、それによってダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１を受精させた。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１とダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の両方からの組込みイベントを含有している生じたＦ１後代を、２，４−Ｄおよびグリホサート除草剤への耐性についてスクリーニングして、両方の組込みイベントを含有する後代植物を同定した。次に、Ｆ１後代植物を自家受精させてＦ２子孫を生成し、それは両イベントに関して独立して分離することが確認された。Ｆ２植物に、２，４−Ｄ（８４０ｇ ａｅ／ヘクタール）およびグリホサート（８４０ｇ ａｅ／ヘクタール）の両方を含有する除草剤を一回噴霧施用した。両イベントに関してホモ接合である植物を同定するために、Ｔａｑｍａｎの接合性をベースとしたアッセイを用いて生じたＦ２植物をスクリーニングした。これらのＦ２ホモ接合植物の自家受粉は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１およびダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の両方についてホモ接合であったＦ３子孫を生成した。生じたイベントは、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４０６．１と表示した。
実施例９．２：ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の接合性状態の判定
ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１とダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の育種交配から生成された植物の接合性状態を判定するために、別々のイベント特異的なＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを開発して、ｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１またはｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のいずれかの組込みイベントの存在を検出した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１とダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の両方を含有し、両イベントに関してホモ接合である個体植物を同定するために、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１とダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種交配の自家受精から生成された分離するＦ２植物を、これらのイベント特異的なＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイで試験した。
ｇＤＮＡ単離
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックの分離するＦ２植物からのｇＤＮＡ試料を、この試験で試験した。１植物につき４枚の新鮮なダイズ葉ディスクを、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックの３７個の分離するＦ２植物から収集した。改変Ｑｉａｇｅｎ ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ植物ＤＮＡキット（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、これらの試料からゲノムＤＮＡを抽出した。
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイおよび結果
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１（米国特許仮出願第６１／４７１８４５号）およびｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１（上記）のための個々のイベント特異的アッセイの使用のために、前述のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プライマーおよびプローブを設計した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックの中に含まれる各組込みイベントの接合性を判定するために、これらの試薬を下記の条件で用いた。
増幅のための多重ＰＣＲ条件は、以下の通りである：１０μｌの全体の反応液中に、１×ロシュＰＣＲ緩衝液、０．４μＭイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１特異的フォワードプライマー、０．４μＭイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１特異的リバースプライマー、０．４μＭイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１特異的フォワードプライマー、０．４μＭイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１特異的リバースプライマー、０．４μＭプライマーＧＭＳ１１６Ｆ、０．４μＭプライマーＧＭＳ１１６Ｒ、０．２μＭイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１特異的プローブ、０．２μＭイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１特異的プローブ、０．２μＭ ＧＭＳ１１６プローブ、０．１％ＰＶＰ、２０ｎｇ ｇＤＮＡ。以下の条件を用いてこのカクテルを増幅した：ｉ）９５℃で１０分間、ｉｉ）９５℃で１０秒間、ｉｉｉ）６０℃で３０秒間、ｉｖ）７２℃で１秒間、ｖ）ステップｉｉ〜ｉｖを３５サイクル繰り返す、ｖ）４０℃を保持。リアルタイムＰＣＲを、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０で実行した。データ分析は、蛍光の変化率がその最大値に到達するときのＰＣＲサイクル数である、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ソフトウェアで判定された交差点（Ｃｐ値）の測定に基づいた。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１とダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の両方に関して個々の植物の接合性を判定するために、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１とダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種交配から生成された合計３７個の分離するＦ２植物を、イベント特異的ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイで試験した。これらのアッセイからの結果は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１とダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の両方が２３個体の植物に存在し、検出されたことを示した。各組込みイベントの接合性状態（倍数性レベルとしても記載される）を、表１４に示す。２３個体の同定された植物のうち、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１およびダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を２コピー含有する１個体が同定された。
実施例９．３：ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックでのタンパク質発現の特徴づけ
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックで発現される組換え体Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａｃ、ＡＡＤ１２、２ｍＥＰＳＰＳおよびＰＡＴタンパク質の生化学的性質を特徴づけた。ＰＡＴの発現を定量するために、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いた。比較上、Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）からの電気化学発光技術を利用して、多重化イムノアッセイによってＣｒｙ１Ａｃ／Ｃｒｙ１ＦおよびＡＡＤ１２／２ｍＥＰＳＰＳタンパク質を定量した。総合すると、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックでのこれらのタンパク質の生化学的性質を特徴づけ、その強固な発現を確認するために、これらのアッセイを用いた。
植物組織でのＰＡＴタンパク質の発現
ＰＡＴタンパク質のレベルは、Ｆ３ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックで判定され、それらはイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１とイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１から発現されたＰＡＴタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１およびダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１と比較した。
可溶性の抽出可能なＰＡＴタンパク質をダイズ葉組織から得、定量的ＥＬＩＳＡ方法（ＡＰＳ ０１４、Ｅｎｖｉｒｏｌｏｇｉｘ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）を用いて測定した。単葉からＶ１段階の温室で育てた試験植物からダイズ葉組織の試料を単離し、発現分析のために調製した。界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）および１％のポリビニルピロリドン４０（ＰＶＰ−４０）を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、ＰＡＴタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。次に、ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ（登録商標）を１５００ｒｐｍで５分間用いて、試料を抽出した。植物抽出物を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、サンドイッチ形式のＰＡＴ ＥＬＩＳＡキットを用いて分析した。キットを、製造業者の勧めるプロトコル（Ｅｎｖｉｒｏｌｏｇｉｘ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）に従って用いた。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の発現および遺伝率を調査するために、検出分析を実施した。育種スタック、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のＦ３世代は、親のイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１およびｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１のいずれよりも高い濃度でＰＡＴを発現した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１育種スタックでのＰＡＴ濃度の増加が予想された。ＰＡＴのより高い濃度は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１が親のイベントのいずれと比較してもｐａｔコード配列のコピーを２倍多く含有する結果である（表１５）。
植物組織でのＣｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａｃタンパク質の発現
Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａｃタンパク質のレベルは、Ｆ３ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックで判定され、それらはイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１とイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１から発現されたＣｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａｃタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１と比較した。
可溶性の抽出可能なＣｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａｃタンパク質をダイズ葉組織から得、多重化電気化学発光ＭＳＤアッセイを用いて測定した。単葉からＶ１段階の温室で育てた植物からダイズ葉組織の試料を単離し、発現分析のために調製した。界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）および１％のポリビニルピロリドン４０（ＰＶＰ−４０）を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａｃタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。次に、ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ（登録商標）を１５００ｒｐｍで５分間用いて、試料を抽出した。植物抽出物を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ ＤｉｓｃｏｖｅｒｙからのＣｒｙ１Ｆ／Ｃｒｙ１Ａｃ多重ＭＳＤアッセイを用いて分析した。キットを、製造業者の勧めるプロトコルに従って用いた。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の発現および遺伝率を調査するために、検出分析を実施した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックのＦ３世代は、親のダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１よりも高い濃度でＣｒｙ１Ａｃタンパク質を発現した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックのＦ３世代は、親のダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１よりも低い濃度でＣｒｙ１Ｆタンパク質を発現した。（表１６）。発現レベルの変動はあったものの、これらの結果は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１植物が、親の系統、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１から受け継いだｃｒｙ１Ｆおよびｃｒｙ１Ａｃコード配列の機能的に発現するコピーを含有したことを示す。
植物組織でのＡＡＤ１２および２ｍＥＰＳＰＳタンパク質の発現
ＡＡＤ１２および２ｍＥＰＳＰＳタンパク質のレベルは、Ｆ３ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックで判定され、それらはイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１とイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１から発現されたＡＡＤ１２および２ｍＥＰＳＰＳタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１と比較した。
可溶性の抽出可能なＡＡＤ１２および２ｍＥＰＳＰＳタンパク質をダイズ葉組織から得、多重化電気化学発光ＭＳＤアッセイを用いて測定した。単葉からＶ１段階の温室で育てた植物からダイズ葉組織の試料を単離し、発現分析のために調製した。界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）および１％のポリビニルピロリドン４０（ＰＶＰ−４０）を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、ＡＡＤ１２および２ｍＥＰＳＰＳタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。次に、ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ（登録商標）を１５００ｒｐｍで５分間用いて、試料を抽出した。植物抽出物を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ ＤｉｓｃｏｖｅｒｙからのＡＡＤ１２および２ｍＥＰＳＰＳ多重ＭＳＤアッセイを用いて分析した。キットを、製造業者の勧めるプロトコルに従って用いた。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の発現および遺伝率を調査するために、検出分析を実施した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックのＦ３世代は、親のダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１よりも低い濃度でＡＡＤ１２および２ｍＥＰＳＰＳタンパク質を発現した。（表１７）。発現レベルの変動はあったものの、これらの結果は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１植物が、親の系統、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１から受け継いだａａｄ−１２および２ｍＥＰＳＰＳコード配列の機能的に発現するコピーを含有することを示した。
実施例９．４：ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックの除草剤耐性
育種スタック、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の除草剤耐性を検定した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の種子を温室内試験で播種し、成熟植物体に２，４−Ｄとグリホサートの組合せからなる除草剤を一回噴霧施用した。これらの除草剤に対して生じた耐性は、生存植物数を数えることによって測定した。比較上、ａａｄ−１２および２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子を含有せず、２，４−Ｄおよびグリホサート除草剤の施用に感受性であると予想された対照植物が、試験に含まれた。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の温室で育てたＦ２植物で除草剤耐性を調べた。ダイズ植物は、１ポットに１つの植物を含有する４インチポットにおいて生育させた。単葉生育段階の合計３７個体のＦ３ホモ接合植物に、２，４−Ｄおよびグリホサート（８４０ａｅ／ヘクタール）を一回噴霧施用した。２５個体の植物は全て除草剤の噴霧後に生存し、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１植物が除草剤グリホサートおよび２，４−Ｄの施用に耐性であることを示した。
要約すると、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１親系統に存在したａａｄ−１２および２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子は、２，４−Ｄおよびグリホサート除草剤への耐性を付与した。これらの形質はダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１に継承され、受け継がれ、それによってダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１に除草性耐性を提供した。除草剤施用に感受性であったダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１２．９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１植物は、ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１組込みイベントのメンデル分離の結果として、ａａｄ−１２および２ｍＥＰＳＰＳのコピーを含有していなかった。さらに、ａａｄ−１２および２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子を含有しない対照植物は、２，４−Ｄおよびグリホサート除草剤の施用に感受性であった。
実施例９．５：ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の殺虫活性の特徴づけ
Ｃｒｙ１ＡｃおよびＣｒｙ１Ｆ導入遺伝子の発現からもたらされた、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の殺虫性耐性活性を特徴づけるために、温室内評価を実施した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を、アンチカルシア・ゲンマタリス（Anticarsia gemmatalis）（ベルベットビーンキャタピラー）およびシュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）（ダイズルーパ）を含む実験室内飼育ダイズ害虫に対して試験した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックを、非形質転換ダイズ品種Ｍａｖｅｒｉｃｋに加えて親のダイズイベント（ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１およびダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１）と比較した。この比較は、Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａｃタンパク質によって提供される虫害に対する植物保護のレベルが、ダイズ植物のゲノムにさらなる導入遺伝子を導入した育種スタックに存在するかどうか判定するために行った。さらに、除草剤の噴霧がＣｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａｃタンパク質によって提供される昆虫からの植物の保護に何らかの効果を有するかどうか判定するために、昆虫バイオアッセイの前に、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックおよびダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の両方に、２，４−Ｄおよびグリホサートを含有する除草剤を一回噴霧施用した（８４０ｇ ａｅ／ヘクタール）。
温室内試験を、およそ３週間目の植物で行った。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタック、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１の育種スタックおよび陰性対照；除草剤を噴霧したダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックおよびＭａｖｅｒｉｃｋを評価するために、１０個体の植物を各々用いた。合計３０枚の葉ディスク／植物／昆虫種に対して、各昆虫種（アンチカルシア・ゲンマタリス（Anticarsia gemmatalis）およびシュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens））を試験するために、各植物から葉パンチを３つ作製した。１．４ｃｍ直径（または１．５４ｃｍ２）の葉パンチを２％素寒天の上の試験領域に置き、１匹の新生子幼虫を寄生させ、有孔のプラスチックふたで密封した。寄生させてから４日後に死亡率および葉の消費を評価した。軽く突いても応答しなかった幼虫は、死虫とみなされた。昆虫によって消費された葉パンチの百分率を視覚的に評価することによって、葉の傷害を調べた。ＪＭＰ（登録商標）Ｐｒｏ９．０．１（２０１０ ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて、データの統計分析を実施した。
これらの反復実験から得られた結果（表１８）は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の育種スタックのＣｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａｃタンパク質によって提供される虫害および死亡率のレベルが、親のダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１と一貫していたことを示した。予想された通り、試験した全ての昆虫について、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１は、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１（５８〜７６％）およびＭａｖｅｒｉｃｋ（７９〜９１％）対照植物より有意に低い虫害（０．１０〜０．１２％）を維持した。さらに、ｃｒｙ１Ｆおよびｃｒｙ１Ａｃコード配列を含有した全てのダイズイベントで高い昆虫死亡率（１００％）が記録されたが、陰性対照、ｍａｖｅｒｉｃｋおよびダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１は１０％未満の昆虫死亡率であった。したがって、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１：：ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１は、親のダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１４．１９．１と同等レベルの殺虫活性由来の保護を提供した。
配列番号１は、対象のダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の５’隣接ボーダー配列を示す。
配列番号２は、対象のダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の３’隣接ボーダー配列を示す。
配列番号３は、プライマー４４０６＿ＷＦ１を示す。
配列番号４は、プライマー４４０６＿ＷＦ２を示す。
配列番号５は、プライマー４４０６＿ＷＦ３を示す。
配列番号６は、プライマー４４０６＿ＷＦ４を示す。
配列番号７は、プライマー４４０６＿ＷＲ５を示す。
配列番号８は、プライマー４４０６＿ＷＲ６を示す。
配列番号９は、プライマー４４０６＿ＷＲ７を示す。
配列番号１０は、プライマー４４０６＿ＷＲ８を示す。
配列番号１１は、プライマーＥＤ＿ｖ１＿Ｃ１を示す。
配列番号１２は、プライマーＰＡＴ＿１２を示す。
配列番号１３は、プラスミドｐＤＡＢ８２６４の配列を示す。
配列番号１４は、部分的５’ダイズゲノム隣接および部分的５’挿入物配列を示す。
配列番号１５は、部分的３’ダイズゲノム隣接および部分的３’挿入物配列を示す。
配列番号１６は、５’組込み接合部にわたっている９８塩基対配列を示す。
配列番号１７は、３’組込み接合部にわたっている１３１塩基対配列を示す。
配列番号１８は、プライマー４４０６＿５’Ｆを示す。
配列番号１９は、プライマー４４０６＿５’Ｒを示す。
配列番号２０は、プローブ４４０６＿５’Ｐを示す。
配列番号２１は、プライマー４４０６＿３’Ｆを示す。
配列番号２２は、プライマー４４０６＿３’Ｒを示す。
配列番号２３は、プローブ４４０６＿３’Ｐを示す。
配列番号２４は、プライマーＧＭＳ１１６Ｆを示す。
配列番号２５は、プライマーＧＭＳ１１６Ｒを示す。
配列番号２６は、プローブＧＭＳ１１６Ｐｒｏｂｅを示す
配列番号２７は、５’ゲノム隣接配列、挿入物および３’ゲノム隣接配列を含む、ダイズイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の配列を示す。
配列番号２８は、５’ゲノム隣接配列、ｐＤＡＢ９５８２ Ｔ鎖挿入物および３’ゲノム隣接配列を含む、ダイズイベント９５８２．８１２．９．１の予想配列を示す。
配列番号２９は、５’ゲノム隣接配列、ｐＤＡＢ９５８２ Ｔ鎖挿入物および３’ゲノム隣接配列を含む、ダイズイベント９５８２．８１４．１９．１の予想配列を示す。

Claims (30)

  1. 配列番号２７のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドセグメントであって、除草剤抵抗性を植物細胞にもたらすポリヌクレオチドセグメントを含むゲノムを含むトランスジェニックダイズ植物細胞。
  2. 受託番号ＰＴＡ−１１３３６でアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されている代表的な種子に存在する、配列番号２７のイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を含むゲノムを含むダイズ種子。
  3. 請求項１に記載の細胞を含むダイズ種子。
  4. 前記配列番号２７のイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を含む、請求項２に記載の種子を生育させることによって生成されるダイズ植物。
  5. 配列番号２７のイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を含む、請求項４に記載のダイズ植物の後代植物。
  6. 複数の請求項１に記載の細胞を含むトランスジェニックダイズ植物。
  7. 前記細胞が昆虫抵抗性遺伝子をさらに含む、請求項６に記載の植物。
  8. フェノキシ酢酸除草剤、フェノキシブタン酸除草剤、ピリジルオキシアルカン酸除草剤、グリホサート除草剤およびグルホシネート除草剤からなる群から選択される少なくとも１つの除草剤に抵抗性であり、配列番号１３の残基２０２６〜９２２２を含むトランスジェニックゲノム挿入物を含む、請求項６に記載の植物。
  9. 受託番号ＰＴＡ−１１３３６でアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されている代表的な種子に存在する配列番号２７のイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を含むゲノムを含む植物細胞。
  10. 配列番号１３〜１７、２０、２７および２８からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、単離されたポリヌクレオチド。
  11. アリールオキシアルカノエート、ピリジルオキシアルカン酸、グリホサート、ビアラホス、フォスフィノスリシンまたはグルホシネート除草剤の少なくとも１つを圃場へ施用するステップを含み、前記圃場が請求項６に記載の植物を含む、雑草の防除方法。
  12. 前記除草剤の少なくとも２つを同時に又は連続的に施用するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記アリールオキシアルカノエート除草剤が、２，４−Ｄ、２，４−ＤＢ、ＭＣＰＡおよびＭＣＰＢからなる群から選択され、前記ピリジルオキシアルカン酸除草剤が、トリクロピルおよびフルロキシピルからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記圃場へ少なくとも１つの追加の除草剤を施用するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
  15. 前記少なくとも１つの追加の除草剤がジカンバである、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記除草剤を前記圃場へ施用するステップ、および前記除草剤を施用してから１４日以内に圃場に種子を播種して植物を生育させるステップを含む、請求項１１に記載の方法。
  17. 前記施用ステップが前記播種ステップの前に実施される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記少なくとも１つの除草剤が前記植物の頂部の上側に施用される、請求項１１に記載の方法。
  19. 前記植物が、配列番号２７のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む、請求項６に記載の植物。
  20. 配列番号２７のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むミール。
  21. 植物細胞のゲノムが配列番号２７を含むように該ゲノムの単一の染色体遺伝子座中に遺伝子導入により挿入される、発現カセット。
  22. 試料中の配列番号２７のイベントｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１を同定するための方法であって、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１３３６で寄託されている種子に存在するｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１の接合部配列を、前記接合部配列と特異的に結合するか前記接合部配列を特異的に増幅するプローブまたは少なくとも１つのプライマーで検出するステップを含み、前記接合部配列が、配列番号１４の残基５７０〜５７１または配列番号１５の残基２２０〜２２１を含む、方法。
  23. 第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、前記試料に存在する核酸のＤＮＡ断片を増幅するステップをさらに含み、前記第１のプライマーが、配列番号１３内の挿入物配列またはその相補配列に特異的に結合し、前記第２のプライマーが、配列番号１および配列番号２からなる群から選択される隣接配列内の配列に特異的に結合する、請求項２２に記載の方法。
  24. 配列番号１８のヌクレオチド配列からなる第１のイベントプライマー、
    配列番号１９のヌクレオチド配列からなる第２のイベントプライマー、
    配列番号２４のヌクレオチド配列からなる参照フォワードプライマー、
    配列番号２５のヌクレオチド配列からなる参照リバースプライマー、
    配列番号２０のヌクレオチド配列からなるイベントプローブ、および
    配列番号２６のヌクレオチド配列からなる参照プローブ
    を含む、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１３３６で寄託されている種子に存在する配列番号２７のダイズイベントｐＤＡＢ−８２６４．４４．０６．１を含むダイズ植物のイベント接合性を判定する方法を実施するためのキット。
  25. 配列番号２０のヌクレオチド配列からなるプローブ、または
    配列番号１８または配列番号１９のヌクレオチド配列からなる少なくとも１つのプライマー
    を含む、請求項２２に記載の方法を実施するためのキット。
  26. 前記増幅されたＤＮＡ断片が約７１９６塩基を含む、請求項２３に記載の方法。
  27. 配列番号１、配列番号２、配列番号１４、配列番号１５およびその相補配列からなる群から選択される配列からなるプローブ。
  28. 配列番号１および配列番号２からなる群から選択される核酸配列からなる、単離されたポリヌクレオチド分子。
  29. 配列番号２８、配列番号２９、配列番号２８と少なくとも９５％同一である変異体、または配列番号２９と少なくとも９５％同一である変異体のヌクレオチド配列からなる核酸分子をさらに含み、前記核酸分子が植物細胞に昆虫抵抗性をもたらす、請求項１に記載の植物細胞。
  30. 配列番号２７のヌクレオチド配列からなる核酸分子を含む、請求項１に記載の細胞を含む種子。
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