JP6111200B2 - 除草剤耐性イベント8264.44.06.1のスタック、関連するトランスジェニックダイズ系統、およびその検出 - Google Patents
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Description
ンドポイントTaqMan PCRアッセイにも一部関する。一部の実施形態は、ハイス
ループット接合性分析が可能であるアッセイを対象とする。対象発明は、一部、接合性を
判定するのに用いられるGMFL01−25−J19(GenBank:AK28629
2.1)参照遺伝子の使用にさらに関する。イベントpDAB8264.44.06.1
の接合性を特異的に同定し、このイベントを含むダイズ系統を育種するために、これらお
よび他の関連した手順を用いることができる。
本願発明のさらなる具体的態様として、以下のものが挙げられる。
[1] 配列番号14と少なくとも95%の同一性を有する第1のポリヌクレオチドセグメントおよび配列番号15と少なくとも95%の同一性を有する第2のポリヌクレオチドセグメントを含むゲノムを含むトランスジェニックダイズ植物細胞。
[2] 受託番号PTA-11336でアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に寄託されている代表的な種子に存在するイベントpDAB8264.44.06.1を含むゲノムを含むダイズ種子。
[3] [1]に記載の細胞を含むダイズ種子。
[4] 前記イベントを含む、[2]に記載の種子を生育させることによって生成されるダイズ植物。
[5] イベントpDAB8264.44.06.1を含む、[4]に記載のダイズ植物の後代植物。
[6] [1]に記載の複数の細胞を含むトランスジェニックダイズ植物。
[7] 前記細胞が昆虫抵抗性遺伝子をさらに含む、[6]に記載の植物。
[8] フェノキシ酢酸除草剤、フェノキシブタン酸除草剤、ピリジルオキシアルカン酸除草剤、グリホサート除草剤およびグルホシネート除草剤からなる群から選択される少なくとも1つの除草剤に抵抗性であり、配列番号13の残基2026〜9222を含むトランスジェニックゲノム挿入物を含む、[6]に記載の植物。
[9] 花粉、胚珠、花、苗条、根および葉からなる群から選択され、配列番号14および配列番号15を含む、[4]に記載の植物の一部。
[10] 受託番号PTA-11336でアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に寄託されている代表的な種子に存在するイベントpDAB8264.44.06.1を含むゲノムを含む植物細胞。
[11] 配列番号3〜28からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
[12] 配列番号14および配列番号15を含む第1のダイズ植物を第2のダイズ植物と交配してゲノムを含む第3のダイズ植物を生成するステップと、前記第3のダイズ植物を前記ゲノム中の配列番号14および/または配列番号15の存在についてアッセイするステップとを含む、ダイズ植物の育種方法。
[13] ダイズ植物に除草剤耐性形質を遺伝子移入するために用いられる、[12]に記載の方法。
[14] フェノキシ酢酸、フェノキシブタン酸、ピリジルオキシアルカン酸、グリホサート、ビアラホス、フォスフィノスリシンまたはグルホシネート除草剤の少なくとも1つを圃場へ施用するステップを含み、前記圃場が、[6]に記載の植物を含み、前記植物が、配列番号13の残基2026〜9222を含むトランスジェニックゲノム挿入物を含む、雑草の防除方法。
[15] 前記除草剤の少なくとも2つを同時に施用するステップを含む、[14]に記載の方法。
[16] 前記除草剤の少なくとも2つを逐次的に施用するステップを含む、[14]に記載の方法。
[17] 前記アリールオキシアルカノエート除草剤が、2,4-D、2,4-DB、MCPAおよびMCPBからなる群から選択され、前記ピリジルオキシアルカン酸除草剤が、トリクロピルおよびフルロキシピルからなる群から選択される、[14]に記載の方法。
[18] 前記圃場へ少なくとも1つの追加の除草剤を施用するステップを含む、[14]に記載の方法。
[19] 前記少なくとも1つの追加の除草剤がジカンバである、[18]に記載の方法。
[20] フェノキシ酢酸、フェノキシブタン酸、ピリジルオキシアルカン酸、グリホサートおよび/またはグルホシネート除草剤を圃場へ施用するステップ、ならびに請求項3に記載の種子を除草剤(複数可)を施用してから14日以内に圃場に播種するステップとを含む、圃場の雑草を防除する方法であって、前記トランスジェニック挿入物が配列番号13の残基2026〜9222を含む、方法。
[21] 前記施用ステップが前記播種ステップの前に実施される、[20]に記載の方法。
[22] 前記少なくとも1つの除草剤が前記植物の頂部の上側に施用される、[14]に記載の方法。
[23] 前記植物が、配列番号27を含む核酸分子と少なくとも95%の同一性を含むポリヌクレオチドをさらに含む、[6]に記載の植物。
[24] ダイズ(Glycine max)由来である、[23]に記載の植物。
[25] [6]に記載の植物を生育させることによって生成される、ミールまたは油製品。
[26] 植物細胞のゲノムの単一の染色体遺伝子座中に遺伝子導入により挿入されている発現カセットを含む植物細胞であって、
a.グリホサート除草剤耐性遺伝子を発現する第1の植物転写単位;
b.フェノキシ酢酸除草剤耐性遺伝子、フェノキシブタン酸除草剤耐性遺伝子および/またはピリジルオキシアルカン酸耐性遺伝子を発現する第2の植物転写単位;ならびに
c.グルホシネート除草剤耐性遺伝子を発現する第3の植物転写単位
を含む、植物細胞。
[27] 試料中のイベントpDAB8264.44.06.1を同定するための方法であって、ATCC受託番号PTA-11336で寄託されている種子に存在するpDAB8264.44.06.1の接合部配列を、前記接合部配列と特異的に結合するか前記接合部配列を特異的に増幅するプローブまたは少なくとも1つのプライマーで検出するステップを含み、前記接合部配列が、配列番号14の残基570〜571または配列番号15の残基220~221を含む、方法。
[28] 少なくとも2つのプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、前記試料に存在する核酸のDNA断片を増幅するステップをさらに含み、前記第1のプライマーが、配列番号13内の挿入物配列またはその相補配列に特異的に結合し、第2のプライマーが、配列番号1および配列番号2からなる群から選択される隣接配列内の配列に特異的に結合する、[27]に記載の方法。
[29] ATCC受託番号PTA-11336で寄託されている種子に存在するダイズイベントpDAB-8264.44.06.1を含むダイズ植物のイベント接合性を判定する方法であって、前記イベントが導入遺伝子構築物を含み、前記導入遺伝子構築物は5’隣接ダイズゲノムDNAおよび3’隣接ダイズゲノムDNAが側面に位置し、前記方法が、
前記ダイズ植物からゲノムDNAのDNA試料を得るステップ;
前記DNA試料を
a.第1のイベントプライマーおよび第2のイベントプライマーであって、前記第1のイベントプライマーが前記導入遺伝子構築物に特異的に結合し、前記第2のイベントプライマーが前記5’ダイズゲノム隣接DNAまたは前記3’ダイズゲノム隣接DNAに特異的に結合し、TaqManPCR条件に供される場合に前記第1のイベントプライマーおよび前記第2のイベントプライマーがイベントアンプリコンを生成する、第1のイベントプライマーおよび第2のイベントプライマー
b.TaqMan PCR条件に供されると内在性ダイズ参照遺伝子から参照アンプリコンを生成する参照フォワードプライマーおよび参照リバースプライマー
c.前記イベントアンプリコンとハイブリダイズする開花イベントプローブ
d.前記参照アンプリコンとハイブリダイズする開花参照プローブ
と接触させることによって接触させた試料を生成するステップ;
前記接触させた試料を蛍光ベースのエンドポイントTaqMan PCR条件に供するステップ;
前記イベントアンプリコンとハイブリダイズした前記開花イベントプローブを定量化するステップと;
前記参照アンプリコンとハイブリダイズした前記開花参照プローブを定量化するステップ;
ハイブリダイズした開花イベントプローブの量を、ハイブリダイズした開花参照プローブの量と比較するステップ;ならびに
ハイブリダイズした蛍光イベントプローブとハイブリダイズした蛍光参照プローブとの開花比を比較することによってpDAB8264.44.06.1の接合性を判定するステップ
を含む方法。
[30] 前記アンプリコンが50〜150残基からなる、[29]に記載の方法。
[31] 前記5’隣接DNAが配列番号1を含み、前記3’隣接DNAが配列番号2を含む、[29]に記載の方法。
[32] 前記参照遺伝子が内在性ダイズGMFL01-25-J19遺伝子である、[29]に記載の方法。
[33] 前記第1のイベントプライマーが配列番号13に結合し、第2のイベントプライマーが配列番号1もしくは配列番号2、またはその相補配列に結合する、[29]に記載の方法。
[34] 別のダイズ系統への前記イベントの育種遺伝子移入のために用いられる、[29]に記載の方法。
[35] 前記別のダイズ系統が前記イベントを欠く、[34]に記載の方法。
[36] 前記参照遺伝子が、配列番号24、配列番号25および配列番号26からなる群から選択される配列を含むかそれとハイブリダイズする、[29]に記載の方法。
[37] 前記参照プライマーが、配列番号25および配列番号24を含み、前記参照プローブが、配列番号26を含む、[29]に記載の方法。
[38] 前記プローブが蛍光色素および消光剤で標識されている、[29]に記載の方法。
[39] 前記イベントプローブが、前記イベントプローブの5’末端に前記蛍光色素としてFAMを含み、前記イベントプローブの3’末端にMGB消光剤を含む、[38]に記載の方法。
[40] 前記参照プローブが、前記参照プローブの5’末端においてHEXで標識されており、前記参照プローブの3’末端においてBlack Hole Quencher1(BHQ1)で標識されている、[38]に記載の方法。
[41] 前記イベントプローブが配列番号20を含む、[29]に記載の方法。
[42] 前記イベントプライマーが、配列番号18、配列番号19、配列番号21および配列番号22からなる群から選択される、[29]に記載の方法。
[43] プレートリーダーで結果が直接読み取られる、[29]に記載の方法。
[44] 前記DNA試料が圃場のダイズ植物から得られる、[29]に記載の方法。
[45] 前記第1のイベントプライマー、前記第2のイベントプライマー、前記参照フォワードプライマー、前記参照リバースプライマー、前記イベントプローブおよび前記参照プローブを含む、[29]に記載の方法を実施するためのキット。
[46] 前記イベントプライマーが配列番号18および配列番号19からなり、前記参照プライマーが配列番号24および配列番号25からなり、前記イベントプローブが配列番号20からなり、前記参照プローブが配列番号26からなる、[45]に記載のキット。
[47] 前記プローブまたは前記少なくとも1つのプライマーを含む、[27]に記載の方法を実施するためのキット。
[48] 前記増幅されたDNA断片が約7196塩基を含む、[28]に記載の方法。
[49] 配列番号1、配列番号2、配列番号14、配列番号15およびその相補配列からなる群から選択される配列と少なくとも95%同一であるプローブ。
[50] 少なくとも15ヌクレオチドを含み、配列番号1および配列番号2からなる群から選択される核酸配列とストリンジェントな洗浄条件の下でハイブリダイゼーションを維持する、単離されたポリヌクレオチド分子。
[51] ゲノム、および前記ゲノムのDNAセグメント中のトランスジェニック挿入物を含み、前記DNAセグメントが、配列番号1を含む5’末端および配列番号2を含む3’末端を含む、トランスジェニックダイズ植物。
[52] ダイズゲノムのDNAセグメント中にトランスジェニック挿入物を挿入する方法であって、前記DNAセグメントが、配列番号1を含む5’末端および配列番号2を含む3’末端を含む、方法。
[53] ゲノムを含むトランスジェニックダイズ植物を作製する方法であって、前記ゲノムのDNAセグメント中にトランスジェニック挿入物を挿入するステップを含み、前記DNAセグメントが、配列番号1を含む5’末端およびヌクレオチド残基配列番号2を含む3’末端を含む、方法。
[54] 前記挿入物が配列番号27を含む、[52]に記載の方法。
[55] 前記挿入物が配列番号27を含む、[53]に記載の方法。
[56] PTA-11602およびPTA-12006からなる群から選択される受託番号でATCCに寄託されている種子に存在する昆虫抵抗性イヘ゛ントをさらに含む、[2]に記載の種子。
[57] 配列番号28、配列番号29、配列番号28と少なくとも95%同一である変異体、または配列番号29と少なくとも95%同一である変異体をさらに含む、[3]に記載の種子。
[58] [56]に記載の種子から生育し、前記イベントおよび前記昆虫抵抗性イベントを含む植物。
[59] 配列番号28および/または配列番号29と少なくとも95%同一である昆虫抵抗性ポリヌクレオチドセグメントをさらに含む、[6]に記載の植物。
[60] PTA-11602およびPTA-12006からなる群から選択される受託番号でATCCに寄託されている種子に存在する昆虫抵抗性イヘ゛ントをさらに含む、[10]に記載の植物細胞。
[61] 配列番号27または配列番号27と少なくとも95%同一であるその変異体を含む、[1]に記載の植物細胞。
[62] 配列番号28、配列番号29、配列番号28と少なくとも95%同一である変異体、または配列番号29と少なくとも95%同一である変異体をさらに含む、[61]に記載の植物細胞。
[63] 前記細胞が配列番号27または配列番号27と少なくとも95%同一であるその変異体を含む、[3]に記載の種子。
[64] 配列番号28、配列番号29、配列番号28と少なくとも95%同一である変異体、または配列番号29と少なくとも95%同一である変異体をさらに含む、[63]に記載の種子。
[65] 2011年11月18日に呼称pDAB9582.812.9.1::イベントpDAB8264.44.06.1でATCCに寄託されたダイズ種子に存在するイベントpDAB8264.44.06.1およびイベント9582.812.9.1を含む種子。
[66] 2011年11月18日に呼称pDAB9582.812.9.1::イベントpDAB8264.44.06.1でATCCに寄託されたダイズ種子に存在するイベントpDAB8264.44.06.1およびイベント9582.812.9.1を含む植物。
[67] 2011年11月18日に呼称pDAB9582.812.9.1::イベントpDAB8264.44.06.1でATCCに寄託されたダイズ種子に存在するイベントpDAB8264.44.06.1およびイベント9582.812.9.1を含む植物細胞。
[68] 配列番号28を含む植物、植物細胞または種子。
[69] 受託番号PTA-11602の下でATCCに寄託されたダイズ種子に存在するイベント9582.812.9.1を含む植物、植物細胞または種子。
[A]以下の場合に、品種は、別の品種(「最初の品種」)に事実上由来するとみなされるものとする
(i)それは主に最初の品種に由来するか、またはそれ自体主に最初の品種に由来する品種に由来するが、最初の品種の遺伝子型または遺伝子型の組合せから生じる本質的特徴の発現を保持する;
(ii)それは、最初の品種と明らかに識別可能である;および
(iii)誘導の行為から生じる差を除いて、それは、最初の品種の遺伝子型または遺伝子型の組合せから生じる本質的特徴の発現において最初の品種に一致する。
bp 塩基対
℃ 摂氏温度
DNA デオキシリボ核酸
DIG ジゴキシゲニン
EDTA エチレンジアミン四酢酸
kb キロベース
μg マイクログラム
μL マイクロリットル
mL ミリリットル
M モル質量
OLP 重複プローブ
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PTU 植物転写単位
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
SOP 標準操作手順
SSC 塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムの混合物を含有する緩衝溶液、pH7.0
TBE トリス塩基、ホウ酸およびEDTAの混合物を含有する緩衝溶液、pH8.3
V ボルト
ダイズ子葉節外植片のアグロバクテリウム(Agrobacteriumu)媒介形質転換を介して、ダイズイベント8264.44.06.1を含有するトランスジェニックダイズ(Glycine max)を作出した。形質転換を開始するために、T鎖DNA領域の中に選択可能なマーカー、patならびに対象遺伝子aad−12および2mepsps v1を含有する二成分ベクターpDAB8264(図1)を運ぶ、無害化アグロバクテリウム(Agrobacterium)株EHA101(Hoodら、2006年)を用いた。
トランスジェニックダイズイベントpDAB8264.44.06.1に由来する組換え体AAD−12、2mEPSPSおよびPATタンパク質の生化学的性質を特徴づけした。タンパク質の生化学的性質を特徴づけて、AAD−12、PATおよび2mEPSPSタンパク質の発現を確認するために、定量的酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)を用いた。
AAD−12タンパク質のレベルを、ダイズイベント8264.44.06.1で判定した。定量的酵素結合免疫吸着検定(ELISA)方法を用いて、ダイズ葉組織から可溶性の抽出可能なAAD−12タンパク質を測定した。
2mEPSPSタンパク質のレベルを、ダイズイベント8264.44.06.1で判定した。定量的酵素結合免疫吸着検定(ELISA)方法を用いて、ダイズ葉組織から可溶性の抽出可能な2mEPSPSタンパク質を測定した。
PATタンパク質のレベルを、ダイズイベント8264.44.06.1で判定した。定量的酵素結合免疫吸着検定(ELISA)方法を用いて、ダイズ葉組織から可溶性の抽出可能なPATタンパク質を測定した。
ゲノム挿入部位を特徴づけて記載するために、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の隣接ゲノムT−DNAボーダー領域の配列を決定した。全体で、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1ゲノム配列の2,578bpが確認され、5’隣接ボーダー配列の570bp(配列番号1)、3’隣接ボーダー配列の1,499bp(配列番号2)を含む。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1ボーダー配列に基づくPCR増幅は、ボーダー領域がダイズ起源であり、接合部領域がイベントpDAB8264.44.06.1に特有な配列であることを確認した。接合部領域は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のイベント特異的同定のために用いることができた。さらに、野生型ダイズのゲノムから同定された隣接ボーダー配列の領域に対応するゲノム断片を増幅することによって、T鎖挿入部位を特徴づけた。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1と野生型ゲノム配列との比較により、元の遺伝子座から約4,357bpが欠失したことを明らかにした。全体として、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の挿入物およびボーダー配列の特徴づけは、T鎖の無傷のコピーがダイズゲノムに存在することを示した。
5’および3’隣接ボーダーは、第6染色体からのダイズ(Glycine max)全ゲノムショットガン配列と整列し、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の導入遺伝子がダイズゲノムの第6染色体に挿入されたことを示している。ダイズゲノムからのダイズイベントpDAB8264.44.06.1導入遺伝子の挿入部位を確認するために、異なる対のプライマーでPCRを実行した(図2および表3)。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1および他のトランスジェニックであるか非トランスジェニックのダイズ系統からのゲノムDNAを、鋳型として用いた。したがって、5’ボーダー配列が正しいかどうかを確認するために、2mepsps遺伝子から5’末端ボーダー配列にわたるDNAセグメントを増幅するために、2mepsps特異的プライマー、例えばED_v1_C1(配列番号11)、ならびに、4406−WF1(配列番号3)および4406−WF3(配列番号5)と命名された、クローニングされた5’末端ボーダー配列および/またはダイズゲノム第6染色体の上のその整列配列によって設計された2つのプライマーを用いた。同様に、クローニングされた3’末端ボーダー配列の確認のために、pat遺伝子から3’末端ボーダー配列にわたるDNAセグメントを増幅するために、pat特異的プライマー、例えばPAT−12(配列番号12)、ならびに、4406−WR5(配列番号7)、4406−WR7(配列番号9)および4406−WR8(配列番号10)と命名された、クローニングされた3’末端ボーダー配列によって設計された3つのプライマーを用いた。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のゲノムDNAのみに由来する予測されたサイズのDNA断片は、1つのプライマーがダイズイベントpDAB8264.44.06.1の隣接ボーダーに位置し、1つが導入遺伝子特異的プライマーである各プライマー対を用いて増幅されたが、他のトランスジェニックダイズ系または非トランスジェニック対照のDNA試料からは増幅されなかった。これらの結果は、クローニングされた5’および3’ボーダー配列が、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のためのT鎖挿入物の隣接ボーダー配列であることを示す。
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の組込みパターンを確立するために、サザンブロット分析を用いた。これらの実験は、ダイズゲノム内でのaad−12、patおよび2mepsps v1導入遺伝子の組込みおよび統合性を実証するデータを生成した。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1は、プラスミドpDAB8264からのaad−12、patおよび2mepsps v1 PTUの単一コピーを含有する、完全長の単純な組込みイベントと特徴づけられた。
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1を含有する個々のダイズ植物から収集された葉組織から、ゲノムDNAを抽出した。さらに、aad−12および2mepsps v1遺伝子のないサブスタンス系統を表す遺伝的背景を含有する、従来のダイズ植物MaverickからgDNAを単離した。標準の臭化セチルトリメチルアンモニウムCTAB方法に従って、個々のゲノムDNAを凍結乾燥葉組織から抽出した。抽出の後、Pico Green試薬(Invitrogen、Carlsbad、CA)を用いて、DNAを分光蛍光分析により定量した。Pico Green分析からの値を確認し、次に、DNA特質を決定するためにDNAをアガロースゲルで可視化した。
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のサザンブロット分子特徴づけのために、10マイクログラム(10μg)のゲノムDNAを消化した。1μgのDNAにつきおよそ5単位の選択された制限酵素および対応する反応緩衝液を各DNA試料に加えることによって、ダイズpDAB8264.44.06.1および非トランスジェニックダイズ系統MeverickからのゲノムDNAを消化した。各試料は、およそ37℃で一晩インキュベートした。消化物のために、制限酵素BstZ17I、HinDIII、NcoI、NsiIおよびPacIを個々に用いた(New England Biolabs、Ipswich、MA)。さらに、プラスミドDNA、pDAB8264を非トランスジェニックダイズ品種MaverickからのゲノムDNAと組み合わせることによって、陽性のハイブリダイゼーション対照試料を調製した。試験試料と同じ手順および同じ制限酵素を用いて、プラスミドDNA/ゲノムDNAカクテルを消化した。消化を一晩インキュベートした後、NaClを0.1Mの最終濃度まで加え、消化されたDNA試料をイソプロパノールで沈殿させた。沈殿したDNAペレットを20μlの1×添加液(0.01%ブロムフェノールブルー、10.0mM EDTA、5.0%グリセロール、1.0mMトリスpH7.5)に再懸濁させた。次に、このDNA試料および分子サイズのマーカーを、0.85%アガロースゲルを介して0.4×TAE緩衝液(Fisher Scientific、Pittsburgh、PA)で35ボルトでおよそ18〜22時間電気泳動にかけて、断片の分離を達成した。ゲルを臭化エチジウム(Invitrogen、Carlsbad、CA)で染色し、紫外(UV)光の下でDNAを可視化した。
サザンブロット分析は、事実上、Memelink, J.;Swords, K.;Harry J.;Hoge, C.;(1994年)Southern, Northern, and Western Blot Analysis、Plant Mol. Biol. Manual F1:1〜23頁に記載のように実施した。簡潔に述べると、DNA断片の電気泳動分離および可視化の後、0.25MのHClでおよそ20分間ゲルを脱プリンし、次に変性溶液(0.4MのNaOH、1.5MのNaCl)におよそ30分間、その後中和溶液(1.5MのNaCl、0.5MトリスpH7.5)に少なくとも30分間晒した。10×SSCによるウィッキング系を用いてナイロン膜の上でサザン転写を一晩実施した。転写の後、UV架橋によりDNAを膜に結合させ、続いて2×SSC溶液により簡単に膜洗浄した。この方法は、ハイブリダイゼーション用のサザンブロット膜を生成した。
ナイロン膜に結合したDNA断片は、標識プローブを用いて検出した。遺伝子エレメントに特異的なプライマーを用いて、プラスミドpDAB8264から増幅されたDNA断片中への、ジゴキシゲニン(DIG)標識ヌクレオチド[DIG−11]−dUTPのPCRをベースとした組込みによってプローブを生成した。PCR合成によるDNAプローブの生成は、製造業者の推奨手順に従ってPCR DIGプローブ合成キット(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)を用いて実行した。
aad−12および2mepspsPTUの既知の制限酵素部位に基づく、特定の消化物およびプローブで予想および観察された断片サイズを、表6に示す。予想された断片サイズはpDAB8264のプラスミドマップに基づき、観察された断片サイズはこれらの分析からの近似結果であり、DIG標識DNA分子量マーカーIIおよびマークVII断片の示されたサイズに基づく。
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1でスペクチノマイシン抵抗性遺伝子(specR)、Ori Repエレメントおよび複製開始タンパク質trfA(trf Aエレメント)の不在を検証するために、サザンブロット分析も行った。適当な陽性対照(pDAB8264プラスMaverick)および陰性対照(Maverick)をサザン分析のために含める場合、スペクチノマイシン抵抗性、Ori Repエレメントまたはtrf Aエレメントには特異的なハイブリダイゼーションがないと予想される。HinD III消化およびspecR特異的プローブとのハイブリダイゼーションの後、およそ9,300bpの1つの予想サイズのバンドが、陽性対照試料(pDAB8264プラスmaverick)で観察されたが、陰性対照およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1の試料にはなかった。同様に、PacI消化およびOri Rep特異的プローブとtrfA特異的プローブとの混合物とのハイブリダイゼーションの後には、およそ9,200bpの1つの予想サイズのバンドが陽性対照試料(pDAB8264プラスmaverick)で検出されたが、陰性対照およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1の試料にはなかった。これらのデータは、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1でのスペクチノマイシン抵抗性遺伝子、Ori Repエレメントおよび複製開始タンパク質trfAの不在を示す。
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の農業特性および除草剤耐性を、単一の生育段階の間に複数の地理的場所での収量試験で試験した。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1とMaverick対照植物との間で、農業上意味のある予想外の差は観察されなかった。試験の結果は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1が、Maverick対照植物と農業上同等であることを実証した。さらに、グリホサートと2,4−Dのタンクミックスを噴霧したとき、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1は強固な除草剤耐性を提供した。
1)出芽:株立ち数を1メートルの区画に植えた種子数で割り、100を掛けることによって計算される。
2)V1時の苗活力:活力は、試験区の健康状態の全体的な推定値である。結果は0〜100%のスケールで評価し、0%は全て死植物の試験区を表し、100%は非常に健康そうな試験区を表す。
3)V3薬剤施用から1日、7日および14日後の全体的な視覚的作物傷害、クロロシスおよび壊死を評価した。2,4−D傷害の典型である上偏成長の全ての徴候について観察した。上偏成長は、葉および茎のねじれまたは下垂として表される。全ての作物傷害は0〜100%スケールを用い、0%は傷害なしを示し、100%は完全な植物死を示す。
4)開花日:この測定では、試験区での植物の50%が開花し始める日を記録する。各試験区で植えてから植物の50%が開花したときまでの日数を記録した。
5)R2またはR1時の株立ち数:1試験区につき1うねの代表的な1メートル区画での植物数を数え、R2またはR1生育段階に記録することによって判定される、各試験区での平均の植物活力の視覚的推定値である。
6)R2薬剤施用から1日、7日および14日後の全体的な視覚的作物傷害、クロロシスおよび壊死を評価した。2,4−D傷害の典型である上偏成長の全ての徴候について観察した。上偏成長は、葉および茎のねじれまたは下垂として表される。全ての作物傷害は0〜100%スケールを用い、0%は傷害なしを示し、100%は完全な植物死を示す。
7)R6生育段階の病害発生率:試験区での病害の程度を記録するために病害発生率の視覚的推定値を用いる。0〜100%のスケールで評価する。0%は病害が存在しないことを示し、100%は試験区の全ての植物が罹病したことを示す。
8)R6生育段階の虫害:試験区での虫害の程度を記録するために虫害の視覚的推定値を用いる。昆虫による傷害を受けた試験区の植物組織の百分率を、0〜100%スケールを用いて記録した。0%は虫害が存在しないことを示し、100%は試験区の全ての植物が虫害を受けたことを示す。
9)老化時の草高:各試験区の植物の平均高を記録した。葉が落ちた後、植物を土壌表面から先端まで測定した。測定値は、センチメートルで記録した。試験区が倒伏した場合は、代表的な植物群を立ち上げて測定値を得た。
10)成熟までの日数。試験区のさやの95%が生理的成熟に到達し、植物が干乾びた色であった日を記録した。植えてからの経過日数を計算した。
11)倒伏:収穫時に倒伏程度の視覚的推定値を記録した。0〜100%スケールで記録し、0%は倒伏なしを示し、100%は試験区の全ての植物が地面にひれ伏したことを示す。
12)脱粒:収穫時にさやの脱粒の視覚的推定値を記録した。試験区ごとに脱粒を起こしたさやの百分率の推定値として記録した。0〜100%スケールを用い、0%は脱粒なしを示し、100%は全てのさやが脱粒を起こしたことを示す。
13)収量:各試験区から収集した穀物の重量を記録した。2うねの試験区全体を収穫して、種子重量および水分を記録した。13%の水分に調整することによって、ブッシェル/エーカーを計算した。
14)100粒重:各試験区について、100粒の種子を数え、重量をグラムで記録した。
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の存在を検出して、育種集団で植物の接合性状態を判定するために、2つのイベント特異的なTAQMANアッセイを開発した。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1は、二成分ベクターpDAB8264のT鎖を含有する(図1)。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の特異的検出のために、特異的なTaqmanプライマーおよびプローブを、5’(配列番号14)または3’(配列番号15)の挿入物−植物接合部に位置するDNA配列によって設計した(図4)。その5’末端にFAMリポーターを含有する、Applied Biosystems(ABI)によって合成された2つのプライマーおよび標的特異的MGBプローブを用いて、5’組込み接合部にわたる98bpのDNA断片(配列番号16)を特異的に検出するように、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のための1つのイベント特異的アッセイを設計した。その5’末端にFAMリポーターを含有する、ABIによって合成された2つの特異的プライマーおよび標的特異的MGBプローブを用いて、3’組込み接合部にわたる131bpのDNA断片(配列番号17)を特異的に標的にするように、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のための別のイベント特異的アッセイを設計した。2mEPSPSおよびaad−12PTUを含有する11個の異なるイベント、ならびにダイズ特異的内在性参照遺伝子GMFL01−25−J19(ダイズ(Glycine max)cDNA、GenBank:AK286292.1)との二重形式での対照非トランスジェニックダイズ品種(Maverick)に対して、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のためのこのTaqman検出方法の特異性を試験した。
11個の異なるダイズイベントおよび非トランスジェニックダイズ品種のgDNA試料をこの試験で試験した。改変Qiagen MagAttract植物DNAキット(Qiagen、Valencia、CA)を用いてゲノムDNAを抽出した。gDNA抽出のために、1試料につき8個の新鮮なダイズ葉ディスクを用いた。販売会社の指示(Molecular Probes、Eugene、OR)に従って、gDNAをPico Green法で定量した。この試験のために、DNA分解酵素を含まない水で試料を希釈して、10ng/μLの濃度をもたらした。
特異的なTaqmanプライマーおよびプローブを、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1特異的Taqmanアッセイのために設計した。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の中で導入遺伝子を検出するために、これらの試薬は下記の条件で用いることができる。表9は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の検出のために特に開発されたプライマーおよびプローブ配列を記載する。
配列番号27は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の完全長配列を提供する。この配列は、5’ゲノム隣接配列、pDAB8264からの組み込まれたT鎖挿入物および3’ゲノム隣接配列を含有する。配列番号27に関して、残基1〜1494は5’ゲノム隣接配列であり、残基1495〜1497は3つの塩基対挿入であり、残基1498〜11,774はpDAB8264T鎖挿入物であり、残基11,775〜13,659は3’隣接配列である。したがって、挿入物の5’末端に関する接合部配列または移行は、配列番号27の残基1494〜1495において起こる。したがって、挿入物の3’末端に関する接合部配列または移行は、配列番号27の残基11,774〜11,775において起こる。配列番号27は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のポリヌクレオチド配列であり、それは、PCR増幅反応を介して生成され、ABI Big Dye(登録商標)ターミネーター配列決定反応キット(Applied Biosystems、Foster City、CA)を用いて配列決定された複数のPCRコンティグのアラインメントから組み立てられた。
実施例8.1:ダイズイベントpDAB8264.44.06.1とダイズ昆虫耐性イベントpDAB9582.812.9.1の有性交配
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1を、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1と有性的に交配した。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の葯をダイズイベントpDAB9582.812.9.1の柱頭全体に手でこすりつけ、それによってダイズイベントpDAB9582.812.9.1を受精させた。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方からの組込みイベントを含有している生じたF1後代を、2,4−Dおよびグリホサート除草剤への耐性についてスクリーニングして、両方の組込みイベントを含有する後代植物を同定した。次に、F1後代植物を自家受精させてF2子孫を生成し、それは両イベントに関して独立して分離することが確認された。F2植物に、2,4−D(1120g ae/ヘクタール)およびグリホサート(1120g ae/ヘクタール)の両方を含有する除草剤を一回噴霧施用した。両イベントに関してホモ接合である植物を同定するために、Taqmanの接合性をベースとしたアッセイを用いて生じたF2植物をスクリーニングした。これらのF2ホモ接合植物の自家受粉は、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方についてホモ接合であったF3子孫を生成した。生じたイベントは、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.4406.1と表示した。
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1およびダイズイベントpDAB9582.812.9.1の育種交配から生成された植物の接合性状態を判定するために、別々のイベント特異的なTAQMAN(登録商標)アッセイを開発して、pDAB9582.812.9.1またはpDAB8264.44.06.1のいずれかの組込みイベントの存在を検出した。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方を含有し、両イベントに関してホモ接合である個体植物を同定するために、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の育種交配の自家受精から生成された分離するF2植物を、これらのイベント特異的なTAQMAN(登録商標)アッセイで試験した。
ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの分離するF2植物からのgDNA試料を、この試験で試験した。1植物につき4枚の新鮮なダイズ葉ディスクを、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの3,187個の分離するF2植物から収集した。改変Qiagen MagAttract植物DNAキット(登録商標)(Qiagen、Valencia、CA)を用いて、これらの試料からゲノムDNAを抽出した。
ダイズイベントpDAB9582.812.9.1(米国特許仮出願第61/471845号)およびpDAB8264.44.06.1(上記)のための個々のイベント特異的アッセイの使用のために、前述のTAQMAN(登録商標)プライマーおよびプローブを設計した。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの中に含まれる各組込みイベントの接合性を判定するために、これらの試薬を下記の条件で用いた。
ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで発現される組換え体Cry1F、Cry1Ac、AAD12、2mEPSPSおよびPATタンパク質の生化学的性質を特徴づけた。PATの発現を定量するために、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)を用いた。比較上、Meso−Scale Discovery(MSD、Gaithersburg、Maryland)からの電気化学発光技術を利用して、多重化イムノアッセイによってCry1Ac/Cry1FおよびAAD12/2mEPSPSタンパク質を定量した。総合すると、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックでのこれらのタンパク質の生化学的性質を特徴づけ、その強固な発現を確認するために、これらのアッセイを用いた。
PATタンパク質のレベルは、F3ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで判定され、それらはイベントpDAB9582.812.9.1とイベントpDAB8264.44.06.1の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1から発現されたPATタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1と比較した。
Cry1FおよびCry1Acタンパク質のレベルは、F3ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで判定され、それらはイベントpDAB9582.812.9.1とイベントpDAB8264.44.06.1の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1から発現されたCry1FおよびCry1Acタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1と比較した。
AAD12および2mEPSPSタンパク質のレベルは、F3ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで判定され、それらはイベントpDAB9582.812.9.1とイベントpDAB8264.44.06.1の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1から発現されたAAD12および2mEPSPSタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1と比較した。
育種スタック、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の除草剤耐性を、2生育期の間検定した。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1種子を植え、成熟するまで生育させた。成熟した植物に、2,4−Dおよびグリホサートの組合せからなった除草剤を一回噴霧施用した。これらの除草剤に対して生じた耐性は、生存植物数を数えることによって測定した。比較上、aad−12および2mEPSPS遺伝子を含有せず、2,4−Dおよびグリホサート除草剤の施用に感受性であると予想された対照植物が、試験に含まれた。
cry1Acおよびcry1F導入遺伝子の発現からもたらされた、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの殺虫性耐性を特徴づけるために、温室内評価を実施した。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1を、アンチカルシア・ゲンマタリス(Anticarsia gemmatalis)(ベルベットビーンキャタピラー)およびシュードプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens)(ダイズルーパ)を含む実験室内飼育ダイズ害虫に対して試験した。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックを、非形質転換ダイズ品種Maverickに加えて親のダイズイベント(ダイズイベントpDAB9582.812.9.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1)と比較した。この比較は、Cry1FおよびCry1Acタンパク質によって提供される植物保護のレベルが、ダイズ植物のゲノムにさらなる導入遺伝子を導入した育種スタックに存在するかどうか判定するために行った。さらに、除草剤の施用がCry1FおよびCry1Acタンパク質によって提供される昆虫からの植物の保護に何らかの効果を有するかどうか判定するために、昆虫バイオアッセイの前に、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方の育種スタックに、2,4−Dおよびグリホサートを含有する除草剤を一回噴霧施用した(840g ae/ヘクタール)。
ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタック、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1および陰性対照;除草剤を噴霧したダイズイベントpDAB8264.44.06.1およびMaverickを評価するために、10個体の植物を各々用いた。合計30枚の葉ディスク/植物/昆虫種に対して各昆虫種(アンチカルシア・ゲンマタリス(Anticarsia gemmatalis)およびクリソデイキシス(Chrysodeixis)(旧称シュードプルシア(Pseudoplusia))・インクルデンス(includens))を試験するため、各植物から葉を3回打ち抜いた。1.4cm直径(または1.54cm2)の葉パンチを2%素寒天の上の試験領域に置き、1匹の新生子幼虫を寄生させ、有孔のプラスチックふたで密封した。寄生させてから4日後に死亡率および葉の消費を評価した。軽く突いても応答しなかった幼虫は、死虫とみなされた。昆虫によって消費された葉パンチの百分率を視覚的に評価することによって、葉の傷害を調べた。JMP(登録商標)Pro9.0.1(2010 SAS Institute Inc.、Cary、NC)を用いて、データの統計分析を実施した。
実施例9.1:ダイズイベントpDAB8264.44.06.1とダイズ昆虫耐性イベントpDAB9582.814.19.1の有性交配
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1を、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1と有性的に交配した。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の葯をダイズイベントpDAB9582.814.19.1の柱頭全体に手でこすりつけ、それによってダイズイベントpDAB9582.814.19.1を受精させた。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方からの組込みイベントを含有している生じたF1後代を、2,4−Dおよびグリホサート除草剤への耐性についてスクリーニングして、両方の組込みイベントを含有する後代植物を同定した。次に、F1後代植物を自家受精させてF2子孫を生成し、それは両イベントに関して独立して分離することが確認された。F2植物に、2,4−D(840g ae/ヘクタール)およびグリホサート(840g ae/ヘクタール)の両方を含有する除草剤を一回噴霧施用した。両イベントに関してホモ接合である植物を同定するために、Taqmanの接合性をベースとしたアッセイを用いて生じたF2植物をスクリーニングした。これらのF2ホモ接合植物の自家受粉は、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方についてホモ接合であったF3子孫を生成した。生じたイベントは、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.4406.1と表示した。
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1とダイズイベントpDAB9582.814.19.1の育種交配から生成された植物の接合性状態を判定するために、別々のイベント特異的なTAQMAN(登録商標)アッセイを開発して、pDAB9582.814.19.1またはpDAB8264.44.06.1のいずれかの組込みイベントの存在を検出した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方を含有し、両イベントに関してホモ接合である個体植物を同定するために、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の育種交配の自家受精から生成された分離するF2植物を、これらのイベント特異的なTAQMAN(登録商標)アッセイで試験した。
ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの分離するF2植物からのgDNA試料を、この試験で試験した。1植物につき4枚の新鮮なダイズ葉ディスクを、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの37個の分離するF2植物から収集した。改変Qiagen MagAttract植物DNAキット(登録商標)(Qiagen、Valencia、CA)を用いて、これらの試料からゲノムDNAを抽出した。
ダイズイベントpDAB9582.814.19.1(米国特許仮出願第61/471845号)およびpDAB8264.44.06.1(上記)のための個々のイベント特異的アッセイの使用のために、前述のTAQMAN(登録商標)プライマーおよびプローブを設計した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの中に含まれる各組込みイベントの接合性を判定するために、これらの試薬を下記の条件で用いた。
ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで発現される組換え体Cry1F、Cry1Ac、AAD12、2mEPSPSおよびPATタンパク質の生化学的性質を特徴づけた。PATの発現を定量するために、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)を用いた。比較上、Meso−Scale Discovery(MSD、Gaithersburg、Maryland)からの電気化学発光技術を利用して、多重化イムノアッセイによってCry1Ac/Cry1FおよびAAD12/2mEPSPSタンパク質を定量した。総合すると、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックでのこれらのタンパク質の生化学的性質を特徴づけ、その強固な発現を確認するために、これらのアッセイを用いた。
PATタンパク質のレベルは、F3ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで判定され、それらはイベントpDAB9582.814.19.1とイベントpDAB8264.44.06.1の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1から発現されたPATタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1と比較した。
Cry1FおよびCry1Acタンパク質のレベルは、F3ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで判定され、それらはイベントpDAB9582.814.19.1とイベントpDAB8264.44.06.1の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1から発現されたCry1FおよびCry1Acタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1と比較した。
AAD12および2mEPSPSタンパク質のレベルは、F3ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで判定され、それらはイベントpDAB9582.814.19.1とイベントpDAB8264.44.06.1の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1から発現されたAAD12および2mEPSPSタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1と比較した。
育種スタック、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の除草剤耐性を検定した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の種子を温室内試験で播種し、成熟植物体に2,4−Dとグリホサートの組合せからなる除草剤を一回噴霧施用した。これらの除草剤に対して生じた耐性は、生存植物数を数えることによって測定した。比較上、aad−12および2mEPSPS遺伝子を含有せず、2,4−Dおよびグリホサート除草剤の施用に感受性であると予想された対照植物が、試験に含まれた。
Cry1AcおよびCry1F導入遺伝子の発現からもたらされた、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の殺虫性耐性活性を特徴づけるために、温室内評価を実施した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1を、アンチカルシア・ゲンマタリス(Anticarsia gemmatalis)(ベルベットビーンキャタピラー)およびシュードプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens)(ダイズルーパ)を含む実験室内飼育ダイズ害虫に対して試験した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックを、非形質転換ダイズ品種Maverickに加えて親のダイズイベント(ダイズイベントpDAB9582.814.19.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1)と比較した。この比較は、Cry1FおよびCry1Acタンパク質によって提供される虫害に対する植物保護のレベルが、ダイズ植物のゲノムにさらなる導入遺伝子を導入した育種スタックに存在するかどうか判定するために行った。さらに、除草剤の噴霧がCry1FおよびCry1Acタンパク質によって提供される昆虫からの植物の保護に何らかの効果を有するかどうか判定するために、昆虫バイオアッセイの前に、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックおよびダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方に、2,4−Dおよびグリホサートを含有する除草剤を一回噴霧施用した(840g ae/ヘクタール)。
配列番号2は、対象のダイズイベントpDAB8264.44.06.1の3’隣接ボーダー配列を示す。
配列番号3は、プライマー4406_WF1を示す。
配列番号4は、プライマー4406_WF2を示す。
配列番号5は、プライマー4406_WF3を示す。
配列番号6は、プライマー4406_WF4を示す。
配列番号7は、プライマー4406_WR5を示す。
配列番号8は、プライマー4406_WR6を示す。
配列番号9は、プライマー4406_WR7を示す。
配列番号10は、プライマー4406_WR8を示す。
配列番号11は、プライマーED_v1_C1を示す。
配列番号12は、プライマーPAT_12を示す。
配列番号13は、プラスミドpDAB8264の配列を示す。
配列番号14は、部分的5’ダイズゲノム隣接および部分的5’挿入物配列を示す。
配列番号15は、部分的3’ダイズゲノム隣接および部分的3’挿入物配列を示す。
配列番号16は、5’組込み接合部にわたっている98塩基対配列を示す。
配列番号17は、3’組込み接合部にわたっている131塩基対配列を示す。
配列番号18は、プライマー4406_5’Fを示す。
配列番号19は、プライマー4406_5’Rを示す。
配列番号20は、プローブ4406_5’Pを示す。
配列番号21は、プライマー4406_3’Fを示す。
配列番号22は、プライマー4406_3’Rを示す。
配列番号23は、プローブ4406_3’Pを示す。
配列番号24は、プライマーGMS116Fを示す。
配列番号25は、プライマーGMS116Rを示す。
配列番号26は、プローブGMS116Probeを示す
配列番号27は、5’ゲノム隣接配列、挿入物および3’ゲノム隣接配列を含む、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の配列を示す。
配列番号28は、5’ゲノム隣接配列、pDAB9582 T鎖挿入物および3’ゲノム隣接配列を含む、ダイズイベント9582.812.9.1の予想配列を示す。
配列番号29は、5’ゲノム隣接配列、pDAB9582 T鎖挿入物および3’ゲノム隣接配列を含む、ダイズイベント9582.814.19.1の予想配列を示す。
Claims (30)
- 配列番号27のヌクレオチド配列と少なくとも95%の同一性を有するポリヌクレオチドセグメントであって、除草剤抵抗性を植物細胞にもたらすポリヌクレオチドセグメントを含むゲノムを含むトランスジェニックダイズ植物細胞。
- 受託番号PTA−11336でアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に寄託されている代表的な種子に存在する、配列番号27のイベントpDAB8264.44.06.1を含むゲノムを含むダイズ種子。
- 請求項1に記載の細胞を含むダイズ種子。
- 前記配列番号27のイベントpDAB8264.44.06.1を含む、請求項2に記載の種子を生育させることによって生成されるダイズ植物。
- 配列番号27のイベントpDAB8264.44.06.1を含む、請求項4に記載のダイズ植物の後代植物。
- 複数の請求項1に記載の細胞を含むトランスジェニックダイズ植物。
- 前記細胞が昆虫抵抗性遺伝子をさらに含む、請求項6に記載の植物。
- フェノキシ酢酸除草剤、フェノキシブタン酸除草剤、ピリジルオキシアルカン酸除草剤、グリホサート除草剤およびグルホシネート除草剤からなる群から選択される少なくとも1つの除草剤に抵抗性であり、配列番号13の残基2026〜9222を含むトランスジェニックゲノム挿入物を含む、請求項6に記載の植物。
- 受託番号PTA−11336でアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に寄託されている代表的な種子に存在する配列番号27のイベントpDAB8264.44.06.1を含むゲノムを含む植物細胞。
- 配列番号13〜17、20、27および28からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、単離されたポリヌクレオチド。
- アリールオキシアルカノエート、ピリジルオキシアルカン酸、グリホサート、ビアラホス、フォスフィノスリシンまたはグルホシネート除草剤の少なくとも1つを圃場へ施用するステップを含み、前記圃場が請求項6に記載の植物を含む、雑草の防除方法。
- 前記除草剤の少なくとも2つを同時に又は連続的に施用するステップを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記アリールオキシアルカノエート除草剤が、2,4−D、2,4−DB、MCPAおよびMCPBからなる群から選択され、前記ピリジルオキシアルカン酸除草剤が、トリクロピルおよびフルロキシピルからなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記圃場へ少なくとも1つの追加の除草剤を施用するステップを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの追加の除草剤がジカンバである、請求項14に記載の方法。
- 前記除草剤を前記圃場へ施用するステップ、および前記除草剤を施用してから14日以内に圃場に種子を播種して植物を生育させるステップを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記施用ステップが前記播種ステップの前に実施される、請求項16に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの除草剤が前記植物の頂部の上側に施用される、請求項11に記載の方法。
- 前記植物が、配列番号27のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む、請求項6に記載の植物。
- 配列番号27のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むミール。
- 植物細胞のゲノムが配列番号27を含むように該ゲノムの単一の染色体遺伝子座中に遺伝子導入により挿入される、発現カセット。
- 試料中の配列番号27のイベントpDAB8264.44.06.1を同定するための方法であって、ATCC受託番号PTA−11336で寄託されている種子に存在するpDAB8264.44.06.1の接合部配列を、前記接合部配列と特異的に結合するか前記接合部配列を特異的に増幅するプローブまたは少なくとも1つのプライマーで検出するステップを含み、前記接合部配列が、配列番号14の残基570〜571または配列番号15の残基220〜221を含む、方法。
- 第1のプライマーおよび第2のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、前記試料に存在する核酸のDNA断片を増幅するステップをさらに含み、前記第1のプライマーが、配列番号13内の挿入物配列またはその相補配列に特異的に結合し、前記第2のプライマーが、配列番号1および配列番号2からなる群から選択される隣接配列内の配列に特異的に結合する、請求項22に記載の方法。
- 配列番号18のヌクレオチド配列からなる第1のイベントプライマー、
配列番号19のヌクレオチド配列からなる第2のイベントプライマー、
配列番号24のヌクレオチド配列からなる参照フォワードプライマー、
配列番号25のヌクレオチド配列からなる参照リバースプライマー、
配列番号20のヌクレオチド配列からなるイベントプローブ、および
配列番号26のヌクレオチド配列からなる参照プローブ
を含む、ATCC受託番号PTA−11336で寄託されている種子に存在する配列番号27のダイズイベントpDAB−8264.44.06.1を含むダイズ植物のイベント接合性を判定する方法を実施するためのキット。 - 配列番号20のヌクレオチド配列からなるプローブ、または
配列番号18または配列番号19のヌクレオチド配列からなる少なくとも1つのプライマー
を含む、請求項22に記載の方法を実施するためのキット。 - 前記増幅されたDNA断片が約7196塩基を含む、請求項23に記載の方法。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号14、配列番号15およびその相補配列からなる群から選択される配列からなるプローブ。
- 配列番号1および配列番号2からなる群から選択される核酸配列からなる、単離されたポリヌクレオチド分子。
- 配列番号28、配列番号29、配列番号28と少なくとも95%同一である変異体、または配列番号29と少なくとも95%同一である変異体のヌクレオチド配列からなる核酸分子をさらに含み、前記核酸分子が植物細胞に昆虫抵抗性をもたらす、請求項1に記載の植物細胞。
- 配列番号27のヌクレオチド配列からなる核酸分子を含む、請求項1に記載の細胞を含む種子。
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