JP6111200B2 - 除草剤耐性イベント8264.44.06.1のスタック、関連するトランスジェニックダイズ系統、およびその検出 - Google Patents

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グリホサート(N−ホスホノメチルグリシン)は広スペクトル除草剤であり、植物細胞において必須芳香族アミノ酸を生成するシキミ酸生合成経路の酵素、5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸合成酵素(EPSPS)を阻害する。EPSPSの阻害は、タンパク質合成を効果的に破壊し、それによって影響を受ける植物細胞を死滅させる。グリホサートは非選択性であるので、雑草と作物植物の両方を死滅させる。したがって、グリホサートに抵抗性になるように作物植物を改変して、望ましい植物がグリホサートへの曝露後も生存することを可能にすることができる場合、グリホサートは作物植物に有益である。
グリホサート抵抗性である突然変異体EPSP合成酵素を単離するために、組換えDNA技術が用いられている。そのようなグリホサート抵抗性の突然変異体EPSP合成酵素を植物に形質転換させて、形質転換させた植物にグリホサート抵抗性を付与することができる。例として、米国特許第5,633,435号に記載されているように、グリホサート耐性遺伝子がアグロバクテリウム(Agrobacterium)株CP4から単離された。この参照および本明細書の全ての引用文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
突然変異の導入によって他のグリホサート耐性遺伝子が作製されている。これらには、Comaiによって単離され、米国特許第5,094,945号、第4,769,061号および第4,535,060号に記載されているAroA遺伝子が含まれる。米国特許第5,310,667号に記載されているように、アミノ酸80位と120位との間のグリシン残基をアラニン残基に置換することによる、単一突然変異体が利用されている。米国特許第6,225,114号および第5,866,775号には、上記の突然変異に加えて、第2の突然変異(170位と210位との間のアラニン残基の代わりにトレオニン残基)が野生型EPSPS遺伝子に導入された二重突然変異体が記載されている。
他の研究は、GenBank受託番号X63374によってコードされるアミノ酸配列の残基102の突然変異(トレオニンをイソロイシンに変える)および残基106の突然変異(プロリンをセリンに変える)を有する改変メイズEPSPS遺伝子の導入によってグリホサート抵抗性トウモロコシの生成をもたらした。米国特許第6,566,587号および第6,040,497号を参照されたい。
ダイズにおいてグリホサート抵抗性を提供するイベントの例としては、ダイズ株GTS40−3−2(Padgetteら1995年)、ダイズイベントMON89788(米国特許第7,608,761号)が挙げられ、米国特許第7,608,761号はダイズイベントMON89788に関連し、そのそれぞれはcp4 epsps遺伝子をダイズに挿入することによって生成された。
グリホサート耐性の作付け体系の広範囲にわたる採用およびグリホサート使用の増加は、近年グリホサート抵抗性雑草および防除困難な雑草の蔓延に寄与している。栽培者がグリホサート抵抗性雑草または防除がより困難な雑草種へのシフトに直面しているエリアでは、漏れた雑草を防除する他の除草剤とタンクミックスするか交互に用いることによって、栽培者はグリホサートの弱点を補うことができる。
多くの例で広葉エスケープを防除するための1つの普及している効果的なタンクミックスパートナーは、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)である。60年より長く除草剤として用いられている2,4−Dは、トウモロコシ、ダイズおよび綿でのいくつかの重要な雑草を含む多くの一年生、二年生および多年生の広葉雑草の、広スペクトルの出芽後防除を提供する。条植え作物生産で2,4−D(560〜1120g ae/ヘクタールの施用量)によって防除される重要な雑草には、ブタクサ(Ambrosia artemisiifolia)、オオブタクサ(Ambrosia trifida)、オナモミ(Xanthium strumarium)、アカザ(Chenopodium album)、ヒマワリ(Helianthus annuus)、イポメア属(Ipomoea)の種、イチビ(Abutilon theophrasti)、ヒメムカシヨモギ(Conyza Canadensis)およびエビスグサ(Senna obtusifolia)が含まれる。2,4−Dは、ポリゴナム・ペンシルバニカム(Polygonum pensylvanicum)、ポリゴナム・ペルシカリア(Polygonum persicaria)、シルシウム・アルベンス(Cirsium arvense)、タラクサカム・オフィシナーレ(Taraxacum officinale)、ならびにアマランサス・ルディス(Amaranthus rudis)およびアマランサス・パルメリ(Amaranthus palmeri)を含むアマランサス属(Amaranthus)の種を含む、いくつかの重要な雑草の部分的防除を提供する。
2,4−Dのさらなる使用への制限は、その選択性がダイズまたは綿のような双子葉作物において非常に乏しいことであり、したがって、2,4−Dは感受性の双子葉作物で(および一般にその近くで)一般的に用いられない。さらに、イネ科作物での2,4−Dの使用は、起こる可能性のある作物損傷の性質によって多少制限される。不耕起ダイズおよび綿を植える前により強硬な焼払い処理を提供するために、グリホサートと組み合わせた2,4−Dが用いられている;しかし、2,4−Dへのこれらの双子葉植物種の感受性のために、これらの焼払い処理は栽植の少なくとも14〜30日前でなければならない(Agriliance、2005年)。
2,4−Dを分解するその能力のために広く研究された1つの生物体はラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)であり、それは、無機化経路の第1段階を触媒する酵素であるtfdAをコードする遺伝子を含有する(Streberら、1987年)。(米国特許第6,153,401号およびGENBANK受託番号M16730を参照)。tfdAは、2,4−Dを分解することが報告されている(Smejkalら、2001年)。分解から生じる生成物は、2,4−Dと比較してほとんど除草力を有しない。2,4−Dに通常感受性の双子葉植物(例えば、綿およびタバコ)に2,4−D抵抗性を付与するために、tfdAがトランスジェニック植物において用いられている(Streberら(1989年)、Lyonら(1989年)、Lyon(1993年)および米国特許第5,608,147号)。
2,4−Dを分解することが可能なタンパク質をコードするいくつかのtfdA型遺伝子が環境から同定されており、Genbankデータベースに寄託されている。多くのホモログはtfdAに類似している(85%超のアミノ酸同一性)。しかし、tfdAに対してかなり低い同一性(25〜50%)を有するが、α−ケトグルタル酸ジオキシゲナーゼFe(II)ジオキシゲナーゼと関連する特徴的な残基を有するいくつかのポリヌクレオチド配列がある。
tfdAとの低い配列同一性(35%未満)を有する2,4−D分解性遺伝子の例は、デルフチア・アシドボランス(Delftia acidovorans)のaad−12遺伝子である(米国特許出願第2011/0203017号)。aad−12遺伝子はS鏡像異性体特異的α−ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼをコードし、それは、例えばそれらに限定されないが:2,4−DおよびMCPAなどのフェノキシ酢酸系除草剤;フェノキシブタン酸系除草剤、例えば2,4−DBおよびMCPB)、ならびにピリジルオキシアルカン酸系除草剤(例えば、トリクロピルおよびフルロキシピルなどのピリジルオキシ酢酸系除草剤)を含み、その有効成分の酸、塩またはエステル型を含む、特定のフェノキシオーキシン除草剤に耐性を付与するために植物で用いられている。(例えば、国際公開第2007/053482号を参照)。
グルホシネート−アンモニウム(「グルホシネート」)は、フォスフィノスリシンクラスの除草剤の非浸透移行性の非選択的除草剤である。広範囲の広葉およびイネ科雑草の出芽後防除のために主に用いられる、グルホシネートの有効成分L−フォスフィノスリシンは、植物でのアンモニア無毒化のために必要な酵素であるグルタミン合成酵素の不可逆的阻害を通して雑草を防除する。グルホシネート除草剤は、例えば、商標名Ignite(登録商標)、BASTAおよびLiberty(登録商標)の下で市販される。
土壌菌ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces viridochromogenes)から単離された酵素フォスフィノスリシンN−アセチル転移酵素(PAT)は、アセチル化によるその不活性形へのL−フォスフィノスリシンの変換を触媒する。グルホシネート除草剤への耐性を付与するために、PATを発現する遺伝子の植物に最適化させた形がダイズで用いられた。グルホシネート抵抗性のダイズの1つのそのような例は、イベントA5547−127である。最近、グルホシネート耐性形質と組み合わせたグルホシネート除草剤の使用が、ALS−およびグリホサート抵抗性雑草を効果的に管理する非選択的手段として提案されている。
植物での異種または外来の遺伝子の発現は、外来遺伝子が染色体に挿入される位置によって影響される。これは、例えば、クロマチン構造(例えば、ヘテロクロマチン)または転写調節エレメント(例えば、エンハンサー)と組込み部位との近接性による可能性がある(Weisingら、Ann. Rev. Genet 22:421〜477頁、1988年)。同じ型のトランスジェニック植物(または他の生物体)での同じ遺伝子は、異なるイベントの間で発現レベルの大きな変動を示すことがある。発現の空間的または時間的パターンに差があることもある。例えば、様々な植物組織での導入遺伝子の相対的発現の差は、導入された遺伝子構築物に存在する転写調節エレメントから予想されるパターンに対応しないことがある。
したがって、多数のイベントがしばしば形成され、所与の目的のために良好なレベルに対象の導入遺伝子を発現するイベントを同定するためにスクリーニングされる。商用目的のために、数百から数千の異なるイベントを生成して、所望の導入遺伝子発現レベルおよびパターンを有する単一のイベントのためにそれらのイベントをスクリーニングすることが一般的である。導入遺伝子発現の所望のレベルおよび/またはパターンを有するイベントは、従来の育種方法を用いて有性異系交配によって他の遺伝的背景に導入遺伝子を遺伝子移入するために有益である。そのような交配の後代は、元の形質転換体の導入遺伝子発現特性を維持する。この戦略は、現地の生育条件によく適合するいくつかの変種で信頼できる遺伝子発現を確保するために用いられる。
対象発明は、一部には、雑草抵抗性を管理するために有効な手段を提供することができ、それは除草剤耐性技術の有用性を保存するのを助ける。対象発明は、雑草防除選択肢の大きな融通性および利便性を栽培者に提供することもできる。
より具体的には、本発明は、受託番号PTA−11336でアメリカ基準株保存機関(ATCC)に寄託された代表的種子を有する、pDAB8264.44.06.1と指定されたダイズ(Glycine max)イベント(「イベントpDAB8264.44.06.1」)、およびそれに由来する後代に一部関する。対象発明は、イベントpDAB8264.44.06.1を含むダイズ植物を含む(ならびに配列番号1および配列番号2を含むゲノムセグメント中にトランスジェニック挿入物を含むダイズ植物を含む)。
対象イベントおよび寄託種子に存在するトランスジェニック挿入物は、下記の3つの除草剤耐性遺伝子を含む:aad−12、2mepspsおよびpat遺伝子。デルフチア・アシドボランス(Delftia acidovorans)に由来するaad−12遺伝子は、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ(AAD−12)タンパク質をコードし、それは、例えば2,4−ジクロロフェノキシ酢酸およびピリジルオキシアセテート除草剤への耐性を付与する。トウモロコシから単離された改変EPSPS配列である2mepsps遺伝子は、グリホサート除草剤への耐性を付与するタンパク質を生成する。土壌菌ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces viridochromogenes)からのpat遺伝子は、除草剤グルホシネートへの耐性を付与する。
本発明の他の態様は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1を含む後代植物、ダイズ、種子、ならびに/または植物および種子および後代の再生可能な部分、ならびにそのいずれかから作製される食品または飼料製品を含む。本発明は、それらに限定されないが花粉、胚珠、花、苗条、根、葉、栄養細胞の核、花粉細胞を含むイベントpDAB8264.44.06.1の植物部分、ならびにイベントpDAB8264.44.06.1を含む他の植物細胞も含む。本発明は、フェノキシ酢酸除草剤、フェノキシブタン酸除草剤、ピリジルオキシアルカン酸除草剤、グリホサート、および/またはグルホシネートを含む複数の除草剤への耐性を有するダイズ植物にさらに関する。そのようなダイズ植物は、それらに限定されないが、ジカンバ、イミダゾリノンおよびHPPD除草剤を含む様々な他の非選択性および選択性除草剤への耐性を付与する遺伝子をスタックされてもよい。本発明は、新規な遺伝子組成イベントpDAB8264.44.06.1およびイベントpDAB8264.44.06.1を含むダイズ植物の農業パフォーマンスの態様をさらに含む。
本発明は、植物育種および除草剤耐性植物に一部関する。本発明は、ダイズ細胞のゲノム内の特定の部位に挿入されている、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むダイズ植物での新規形質転換イベントを含む。
一部の実施形態では、前記イベント/ポリヌクレオチドは、例えば、農業形質および/または昆虫抑制タンパク質を含む他の形質を「スタック」されてもよい。しかし、本明細書に記載されるように、対象発明は単一のイベントを有する植物を含む。
一部の実施形態では、対象の除草剤耐性イベントは、昆虫抵抗性イベントとの育種スタックで組み合わされてよい。これらの実施形態のいくつかでは、昆虫抵抗性イベントは、cry1F遺伝子およびcry1Ac遺伝子を含む。いくつかのそのようなイベントおよびスタックは、ダイズイベント9582.812.9.1(「812イベント」)およびダイズイベント9582.814.19.1(「814イベント」)を含め、本明細書に具体的に例示される。例えば、対象イベントの任意の組合せを含む植物、植物細胞および種子は、対象発明に含まれる。一部の実施形態では、さらに詳細に下で論じられるように、対象発明はダイズイベント9582.812.9.1(「812イベント」)を単独で含む。
例えば植物育種、イベントDAS−8264.44.06.1を含有するトランスジェニック植物の再形質転換、または相同組換えを介した標的化組込みによる新しい形質の追加を介して、追加の形質が植物ゲノムに、またはイベントpDAB8264.44.06.1と同じ遺伝子座にスタックされてよい。
他の実施形態は、トランスジェニック挿入物および/またはイベントDAS−8264.44.06.1の隣接配列の一部または全ての切除を含む。切除の後、別のおよび/または追加の挿入物を、イベントDAS−8264.44.06.1の特定の染色体部位に標的化させてもよい。例示される挿入物は対象ダイズイベントの例示される挿入物と交換されてもよいか、またはさらなる挿入物(複数可)がこのようにスタックされてもよい。
一実施形態では、本発明は、第6染色体に位置するダイズ染色体の標的部位を包含する。一部の実施形態では、標的部位は異種核酸を含む。一部の実施形態では、ダイズ染色体の標的部位は、配列番号1および配列番号2に示すゲノム隣接配列の間かその中に位置する。
一実施形態では、本発明は、第6染色体上の位置に異種核酸を挿入するステップを含む、トランスジェニックダイズ植物を作製する方法を包含する。別の実施形態では、異種核酸は、第6染色体の上の、本明細書に記載される様々な例示ポリヌクレオチドセグメントの近くかその間に挿入される。
さらに、対象発明は、試料(例えば、ダイズの)中の対象イベントの存在を検出するためのアッセイを提供する。アッセイは、ダイズゲノムに挿入された組換え体構築物のDNA配列、および挿入部位の側面に位置するゲノム配列に基づいてよい。アッセイの実行で有益なキットおよび条件もまた提供される。
したがって、対象発明は、(トランスジェニックダイズ系統の)例示される挿入物全体およびその境界(ボーダー)領域のDNA配列のクローニングおよび分析に一部関する。これらの配列は特有のものである。これらの挿入物およびボーダー(および接合部)配列に基づき、イベント特異的なプライマーを生成することができ、生成した。PCR分析は、これらのイベント特異的なプライマーセットで生成されるPCRアンプリコンの分析によって、イベントを同定することができることを実証した。したがって、対象発明のイベントを含むダイズ系統を特異的に同定するために、これらおよび他の関連した手順を用いることができる。
対象発明は、イベント8264.44.06.1の検出のためのリアルタイムまたはエ
ンドポイントTaqMan PCRアッセイにも一部関する。一部の実施形態は、ハイス
ループット接合性分析が可能であるアッセイを対象とする。対象発明は、一部、接合性を
判定するのに用いられるGMFL01−25−J19(GenBank:AK28629
2.1)参照遺伝子の使用にさらに関する。イベントpDAB8264.44.06.1
の接合性を特異的に同定し、このイベントを含むダイズ系統を育種するために、これらお
よび他の関連した手順を用いることができる。
本願発明のさらなる具体的態様として、以下のものが挙げられる。
[1] 配列番号14と少なくとも95%の同一性を有する第1のポリヌクレオチドセグメントおよび配列番号15と少なくとも95%の同一性を有する第2のポリヌクレオチドセグメントを含むゲノムを含むトランスジェニックダイズ植物細胞。
[2] 受託番号PTA-11336でアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に寄託されている代表的な種子に存在するイベントpDAB8264.44.06.1を含むゲノムを含むダイズ種子。
[3] [1]に記載の細胞を含むダイズ種子。
[4] 前記イベントを含む、[2]に記載の種子を生育させることによって生成されるダイズ植物。
[5] イベントpDAB8264.44.06.1を含む、[4]に記載のダイズ植物の後代植物。
[6] [1]に記載の複数の細胞を含むトランスジェニックダイズ植物。
[7] 前記細胞が昆虫抵抗性遺伝子をさらに含む、[6]に記載の植物。
[8] フェノキシ酢酸除草剤、フェノキシブタン酸除草剤、ピリジルオキシアルカン酸除草剤、グリホサート除草剤およびグルホシネート除草剤からなる群から選択される少なくとも1つの除草剤に抵抗性であり、配列番号13の残基2026〜9222を含むトランスジェニックゲノム挿入物を含む、[6]に記載の植物。
[9] 花粉、胚珠、花、苗条、根および葉からなる群から選択され、配列番号14および配列番号15を含む、[4]に記載の植物の一部。
[10] 受託番号PTA-11336でアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に寄託されている代表的な種子に存在するイベントpDAB8264.44.06.1を含むゲノムを含む植物細胞。
[11] 配列番号3〜28からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
[12] 配列番号14および配列番号15を含む第1のダイズ植物を第2のダイズ植物と交配してゲノムを含む第3のダイズ植物を生成するステップと、前記第3のダイズ植物を前記ゲノム中の配列番号14および/または配列番号15の存在についてアッセイするステップとを含む、ダイズ植物の育種方法。
[13] ダイズ植物に除草剤耐性形質を遺伝子移入するために用いられる、[12]に記載の方法。
[14] フェノキシ酢酸、フェノキシブタン酸、ピリジルオキシアルカン酸、グリホサート、ビアラホス、フォスフィノスリシンまたはグルホシネート除草剤の少なくとも1つを圃場へ施用するステップを含み、前記圃場が、[6]に記載の植物を含み、前記植物が、配列番号13の残基2026〜9222を含むトランスジェニックゲノム挿入物を含む、雑草の防除方法。
[15] 前記除草剤の少なくとも2つを同時に施用するステップを含む、[14]に記載の方法。
[16] 前記除草剤の少なくとも2つを逐次的に施用するステップを含む、[14]に記載の方法。
[17] 前記アリールオキシアルカノエート除草剤が、2,4-D、2,4-DB、MCPAおよびMCPBからなる群から選択され、前記ピリジルオキシアルカン酸除草剤が、トリクロピルおよびフルロキシピルからなる群から選択される、[14]に記載の方法。
[18] 前記圃場へ少なくとも1つの追加の除草剤を施用するステップを含む、[14]に記載の方法。
[19] 前記少なくとも1つの追加の除草剤がジカンバである、[18]に記載の方法。
[20] フェノキシ酢酸、フェノキシブタン酸、ピリジルオキシアルカン酸、グリホサートおよび/またはグルホシネート除草剤を圃場へ施用するステップ、ならびに請求項3に記載の種子を除草剤(複数可)を施用してから14日以内に圃場に播種するステップとを含む、圃場の雑草を防除する方法であって、前記トランスジェニック挿入物が配列番号13の残基2026〜9222を含む、方法。
[21] 前記施用ステップが前記播種ステップの前に実施される、[20]に記載の方法。
[22] 前記少なくとも1つの除草剤が前記植物の頂部の上側に施用される、[14]に記載の方法。
[23] 前記植物が、配列番号27を含む核酸分子と少なくとも95%の同一性を含むポリヌクレオチドをさらに含む、[6]に記載の植物。
[24] ダイズ(Glycine max)由来である、[23]に記載の植物。
[25] [6]に記載の植物を生育させることによって生成される、ミールまたは油製品。
[26] 植物細胞のゲノムの単一の染色体遺伝子座中に遺伝子導入により挿入されている発現カセットを含む植物細胞であって、
a.グリホサート除草剤耐性遺伝子を発現する第1の植物転写単位;
b.フェノキシ酢酸除草剤耐性遺伝子、フェノキシブタン酸除草剤耐性遺伝子および/またはピリジルオキシアルカン酸耐性遺伝子を発現する第2の植物転写単位;ならびに
c.グルホシネート除草剤耐性遺伝子を発現する第3の植物転写単位
を含む、植物細胞。
[27] 試料中のイベントpDAB8264.44.06.1を同定するための方法であって、ATCC受託番号PTA-11336で寄託されている種子に存在するpDAB8264.44.06.1の接合部配列を、前記接合部配列と特異的に結合するか前記接合部配列を特異的に増幅するプローブまたは少なくとも1つのプライマーで検出するステップを含み、前記接合部配列が、配列番号14の残基570〜571または配列番号15の残基220~221を含む、方法。
[28] 少なくとも2つのプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、前記試料に存在する核酸のDNA断片を増幅するステップをさらに含み、前記第1のプライマーが、配列番号13内の挿入物配列またはその相補配列に特異的に結合し、第2のプライマーが、配列番号1および配列番号2からなる群から選択される隣接配列内の配列に特異的に結合する、[27]に記載の方法。
[29] ATCC受託番号PTA-11336で寄託されている種子に存在するダイズイベントpDAB-8264.44.06.1を含むダイズ植物のイベント接合性を判定する方法であって、前記イベントが導入遺伝子構築物を含み、前記導入遺伝子構築物は5’隣接ダイズゲノムDNAおよび3’隣接ダイズゲノムDNAが側面に位置し、前記方法が、
前記ダイズ植物からゲノムDNAのDNA試料を得るステップ;
前記DNA試料を
a.第1のイベントプライマーおよび第2のイベントプライマーであって、前記第1のイベントプライマーが前記導入遺伝子構築物に特異的に結合し、前記第2のイベントプライマーが前記5’ダイズゲノム隣接DNAまたは前記3’ダイズゲノム隣接DNAに特異的に結合し、TaqManPCR条件に供される場合に前記第1のイベントプライマーおよび前記第2のイベントプライマーがイベントアンプリコンを生成する、第1のイベントプライマーおよび第2のイベントプライマー
b.TaqMan PCR条件に供されると内在性ダイズ参照遺伝子から参照アンプリコンを生成する参照フォワードプライマーおよび参照リバースプライマー
c.前記イベントアンプリコンとハイブリダイズする開花イベントプローブ
d.前記参照アンプリコンとハイブリダイズする開花参照プローブ
と接触させることによって接触させた試料を生成するステップ;
前記接触させた試料を蛍光ベースのエンドポイントTaqMan PCR条件に供するステップ;
前記イベントアンプリコンとハイブリダイズした前記開花イベントプローブを定量化するステップと;
前記参照アンプリコンとハイブリダイズした前記開花参照プローブを定量化するステップ;
ハイブリダイズした開花イベントプローブの量を、ハイブリダイズした開花参照プローブの量と比較するステップ;ならびに
ハイブリダイズした蛍光イベントプローブとハイブリダイズした蛍光参照プローブとの開花比を比較することによってpDAB8264.44.06.1の接合性を判定するステップ
を含む方法。
[30] 前記アンプリコンが50〜150残基からなる、[29]に記載の方法。
[31] 前記5’隣接DNAが配列番号1を含み、前記3’隣接DNAが配列番号2を含む、[29]に記載の方法。
[32] 前記参照遺伝子が内在性ダイズGMFL01-25-J19遺伝子である、[29]に記載の方法。
[33] 前記第1のイベントプライマーが配列番号13に結合し、第2のイベントプライマーが配列番号1もしくは配列番号2、またはその相補配列に結合する、[29]に記載の方法。
[34] 別のダイズ系統への前記イベントの育種遺伝子移入のために用いられる、[29]に記載の方法。
[35] 前記別のダイズ系統が前記イベントを欠く、[34]に記載の方法。
[36] 前記参照遺伝子が、配列番号24、配列番号25および配列番号26からなる群から選択される配列を含むかそれとハイブリダイズする、[29]に記載の方法。
[37] 前記参照プライマーが、配列番号25および配列番号24を含み、前記参照プローブが、配列番号26を含む、[29]に記載の方法。
[38] 前記プローブが蛍光色素および消光剤で標識されている、[29]に記載の方法。
[39] 前記イベントプローブが、前記イベントプローブの5’末端に前記蛍光色素としてFAMを含み、前記イベントプローブの3’末端にMGB消光剤を含む、[38]に記載の方法。
[40] 前記参照プローブが、前記参照プローブの5’末端においてHEXで標識されており、前記参照プローブの3’末端においてBlack Hole Quencher1(BHQ1)で標識されている、[38]に記載の方法。
[41] 前記イベントプローブが配列番号20を含む、[29]に記載の方法。
[42] 前記イベントプライマーが、配列番号18、配列番号19、配列番号21および配列番号22からなる群から選択される、[29]に記載の方法。
[43] プレートリーダーで結果が直接読み取られる、[29]に記載の方法。
[44] 前記DNA試料が圃場のダイズ植物から得られる、[29]に記載の方法。
[45] 前記第1のイベントプライマー、前記第2のイベントプライマー、前記参照フォワードプライマー、前記参照リバースプライマー、前記イベントプローブおよび前記参照プローブを含む、[29]に記載の方法を実施するためのキット。
[46] 前記イベントプライマーが配列番号18および配列番号19からなり、前記参照プライマーが配列番号24および配列番号25からなり、前記イベントプローブが配列番号20からなり、前記参照プローブが配列番号26からなる、[45]に記載のキット。
[47] 前記プローブまたは前記少なくとも1つのプライマーを含む、[27]に記載の方法を実施するためのキット。
[48] 前記増幅されたDNA断片が約7196塩基を含む、[28]に記載の方法。
[49] 配列番号1、配列番号2、配列番号14、配列番号15およびその相補配列からなる群から選択される配列と少なくとも95%同一であるプローブ。
[50] 少なくとも15ヌクレオチドを含み、配列番号1および配列番号2からなる群から選択される核酸配列とストリンジェントな洗浄条件の下でハイブリダイゼーションを維持する、単離されたポリヌクレオチド分子。
[51] ゲノム、および前記ゲノムのDNAセグメント中のトランスジェニック挿入物を含み、前記DNAセグメントが、配列番号1を含む5’末端および配列番号2を含む3’末端を含む、トランスジェニックダイズ植物。
[52] ダイズゲノムのDNAセグメント中にトランスジェニック挿入物を挿入する方法であって、前記DNAセグメントが、配列番号1を含む5’末端および配列番号2を含む3’末端を含む、方法。
[53] ゲノムを含むトランスジェニックダイズ植物を作製する方法であって、前記ゲノムのDNAセグメント中にトランスジェニック挿入物を挿入するステップを含み、前記DNAセグメントが、配列番号1を含む5’末端およびヌクレオチド残基配列番号2を含む3’末端を含む、方法。
[54] 前記挿入物が配列番号27を含む、[52]に記載の方法。
[55] 前記挿入物が配列番号27を含む、[53]に記載の方法。
[56] PTA-11602およびPTA-12006からなる群から選択される受託番号でATCCに寄託されている種子に存在する昆虫抵抗性イヘ゛ントをさらに含む、[2]に記載の種子。
[57] 配列番号28、配列番号29、配列番号28と少なくとも95%同一である変異体、または配列番号29と少なくとも95%同一である変異体をさらに含む、[3]に記載の種子。
[58] [56]に記載の種子から生育し、前記イベントおよび前記昆虫抵抗性イベントを含む植物。
[59] 配列番号28および/または配列番号29と少なくとも95%同一である昆虫抵抗性ポリヌクレオチドセグメントをさらに含む、[6]に記載の植物。
[60] PTA-11602およびPTA-12006からなる群から選択される受託番号でATCCに寄託されている種子に存在する昆虫抵抗性イヘ゛ントをさらに含む、[10]に記載の植物細胞。
[61] 配列番号27または配列番号27と少なくとも95%同一であるその変異体を含む、[1]に記載の植物細胞。
[62] 配列番号28、配列番号29、配列番号28と少なくとも95%同一である変異体、または配列番号29と少なくとも95%同一である変異体をさらに含む、[61]に記載の植物細胞。
[63] 前記細胞が配列番号27または配列番号27と少なくとも95%同一であるその変異体を含む、[3]に記載の種子。
[64] 配列番号28、配列番号29、配列番号28と少なくとも95%同一である変異体、または配列番号29と少なくとも95%同一である変異体をさらに含む、[63]に記載の種子。
[65] 2011年11月18日に呼称pDAB9582.812.9.1::イベントpDAB8264.44.06.1でATCCに寄託されたダイズ種子に存在するイベントpDAB8264.44.06.1およびイベント9582.812.9.1を含む種子。
[66] 2011年11月18日に呼称pDAB9582.812.9.1::イベントpDAB8264.44.06.1でATCCに寄託されたダイズ種子に存在するイベントpDAB8264.44.06.1およびイベント9582.812.9.1を含む植物。
[67] 2011年11月18日に呼称pDAB9582.812.9.1::イベントpDAB8264.44.06.1でATCCに寄託されたダイズ種子に存在するイベントpDAB8264.44.06.1およびイベント9582.812.9.1を含む植物細胞。
[68] 配列番号28を含む植物、植物細胞または種子。
[69] 受託番号PTA-11602の下でATCCに寄託されたダイズ種子に存在するイベント9582.812.9.1を含む植物、植物細胞または種子。
図1は、pDAB8264のプラスミドマップである。 図2は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のプライマー位置を表す概略図である。 図3は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1でのプライマー位置およびゲノムDNA欠失を表す概略図である。 図4は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のTaqManアッセイ検出のためのプライマー位置を表す概略図である。
本明細書に記載される本発明は、ダイズ細胞のゲノム内の特定の遺伝子座に挿入された複数の除草剤耐性遺伝子の発現のためのカセットを含むダイズ植物(ダイズ)の新規形質転換イベントを含む。
イベントpDAB8264.44.06.1を含む例示トランスジェニック挿入物は、3つの異なる除草剤耐性遺伝子:(1)合成aad−12遺伝子;(2)野生型EPSPSポリペプチドと比較して、アミノ酸残基102(トレオニンからイソロイシン)および106(プロリンからセリン)に突然変異を含有する、グリホサート除草剤への抵抗性または耐性を付与するタンパク質をコードするトウモロコシのEPSPS配列;ならびに(3)グルホシネート除草剤への耐性または抵抗性を付与するpat遺伝子の発現のための遺伝子エレメントを含む。aad−12遺伝子はデルフチア・アシドボランス(Delftia acidovorans)に由来し、それは、例えば、その有効成分(複数可)の酸、塩またはエステル型を含む、フェノキシアルカノエート除草剤(例えば、2,4−DおよびMCPAなどのフェノキシ酢酸除草剤;ジクロルプロップ、メコプロップなどのフェノキシプロピオン酸除草剤およびそれらの鏡像異性体;ならびに2,4−DBおよびMCPBなどのフェノキシブタン酸除草剤)、ならびにピリジルオキシアルカン酸除草剤(例えば、トリクロピルおよびフルロキシピルなどのピリジルオキシ酢酸除草剤)を含むα−ケトグルタル酸部分を有する除草剤を不活性化することが可能なアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ(AAD−12)タンパク質酵素をコードする。
より具体的には、対象発明は、トランスジェニックダイズイベントpDAB8264.44.06.1、これらのイベントを含む植物系統、ならびにこの挿入物のDNA配列および/またはそのボーダー領域のクローニングおよび分析に一部関する。対象発明の植物系統は、本明細書に開示および示唆される配列を用いて検出することができる。
本発明は、植物育種および除草剤耐性植物に一部関する。一部の実施形態では、前記ポリヌクレオチド配列は、他の形質(例えば、他の除草剤耐性遺伝子(複数可)および/または昆虫抑制タンパク質もしくは抑制性RNA配列をコードする遺伝子(複数可)など)を「多重化(スタック)」されてよい。しかし、本明細書に記載されるように、対象発明は単一のイベントを有する植物も含む。
一部の実施形態では、対象の除草剤耐性イベントは、育種スタックにおいて昆虫抵抗性イベントと組み合わされてよい。一部の実施形態では、昆虫抵抗性イベントは、812イベントおよび814イベント(後でさらに詳しく記載される)からなる群から選択され、それぞれはcry1F遺伝子およびcry1Ac遺伝子を含む。例えば、対象イベントの任意の組合せを含む植物、植物細胞および種子は、対象発明に含まれる。特定の実施形態では、対象発明は、例えば、植物、植物細胞および種子を含め、新規812のイベントを単独でも含む。
2011年4月5日に出願された米国仮出願第61/471,845号は、ダイズイベント9582.812.9.1(812イベント)を含むダイズ系統に一部関する。このイベントを含む種子は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)、10801 ユニバーシティ ブールバード、マナサス、VA、20110、に寄託され、制限なしで(しかし、特許権の制限の下)公開利用できる。ATCC寄託番号PTA−11602と指定された寄託は、2011年1月20日にされた。この寄託は、特許手続のための種子寄託に関するブダペスト条約の条項に従って、およびその下でなされたものであり、維持される。
米国仮出願第61/511,664号(2011年7月26日に出願された)および第61/521,798号(2011年8月10日に出願された)は、ダイズイベント9582.814.19.1(814イベント)を含むダイズ系統に一部関する。このイベントを含む種子は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)、10801 ユニバーシティ ブールバード、マナサス、VA、20110、に寄託された。この寄託、ATCC特許寄託指定PTA−12006は、2011年7月21日にATCCによって受理された。この寄託は、特許手続のための種子寄託に関するブダペスト条約の条項に従って、およびその下でなされたものであり、維持される。
対象発明は、例えば、配列番号27(イベントpDAB8264.44.06.1;4406イベント)、配列番号28(812イベント)および/または配列番号29(814イベント)、ならびに、例えば、そのような配列と少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するこれらの配列の変異体を含む植物、種子および植物細胞も含む。植物ゲノムの中で挿入物配列の組込みの結果、多少の変動(一部のセグメントの欠失など)が起こることは珍しくない。これは、例えば、実施例7でさらに詳細に議論される。
対象発明は、試料中の対象イベントの存在を検出するためのアッセイも提供する。対象発明の態様は、本明細書で例示または提案される任意の診断核酸分子、特に対象隣接配列に完全または部分的に基づくものを設計および/または生成する方法を含む。
一部の実施形態では、本明細書で例示または記載されるポリヌクレオチドセグメント(例えば配列番号1、配列番号2、および/または例えば図2に表されるその間の挿入物)を切除し、その後追加のポリヌクレオチド配列(複数可)で再標的化してよい。
一部の実施形態では、本発明は、除草剤耐性のダイズ系統およびその同定に関する。対象発明は、有性交配の後代が対象のイベントを含有するかどうかを判定するために、対象イベントの存在を検出することに一部関する。さらに、イベントを検出するための方法は、例えば、市販前承認および組換え作物植物に由来する食品の表示を要求する規則に対応するために例えば含まれており、有益である。核酸プローブを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)またはDNAハイブリダイゼーションなどの任意の周知の核酸検出方法により、対象イベントの存在を検出することができる。イベント特異的なPCRアッセイが、本明細書で議論される。(別の例については、例えばWindelsら(Med. Fac. Landbouww、Univ. Gent 64/5b:459462、1999年)を参照。)これらの例のいくつかは、挿入物と隣接DNAとの間の接合部にわたるプライマーセットを用いることに関する。より具体的には、1つのプライマーは挿入物の配列を含み、第2のプライマーは隣接DNAの配列を含んでいた。
本明細書では、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1ならびに代々引き続くダイズ植物での安定性および発現についてのその選択および特徴付けが例示される。イベントpDAB8264.44.06.1の両隣接配列が配列決定されており、本明細書では配列番号1および配列番号2と記載される。イベント特異的なアッセイが開発された。それは、ダイズゲノム(ダイズ第6染色体)にマッピングもされている。イベントpDAB8264.44.06.1は優良栽培種に遺伝子移入することができ、そこで、それは近交系統およびハイブリッドダイズ系統でフェノキシオーキシン、グリホサートおよびグルホシネート除草剤への耐性を付与する。
対象EPSPS遺伝子は、突然変異体5−エノールピルビル−3−ホスホシキミ酸合成酵素(EPSPS)をコードする。野生型EPSPS遺伝子は、当初トウモロコシ(Zea mays)から単離され、その配列はGenBank受託番号X63374の下で寄託された。米国特許第6,566,587号(特に、その中の配列番号3)を参照されたい。
植物で異種遺伝子の高い発現を得るために、それらが植物細胞でより効率的に発現されるように、前記遺伝子を再操作するのが好ましいことがある。野生型植物EPSPSヌクレオチド配列の改変は、植物細胞で発現されるときにそのような抵抗性を提供することができる。’587特許に記載されているように、EPSPSポリペプチドを野生型ポリペプチドと比較したとき、タンパク質の残基102のトレオニンの代わりにイソロイシンを置換し、106位のプロリンの代わりにセリンを置換する改変は、結果として対象挿入物で用いられる二重突然変異体EPSPSポリペプチド(2mEPSPS)をもたらす。植物細胞で発現されるとき、それはグリホサートへの耐性を提供する。あるいは、「2mepsps遺伝子」またはDMMGとも呼ばれる対象EPSPS遺伝子は、双子葉植物および単子葉植物で、特にダイズでの発現を向上させるように最適化することができる。コドン利用は、好ましいhemicotコドン利用に基づいて選択することができ、すなわち、タンパク質が単子葉植物と双子葉植物の両方の利用への偏りを有するコドンによってコードされるように再設計することができる。2mepspsコード配列の転写/翻訳の効率を増加させ、DNA操作段階を促進するために、有害な配列および余分な制限部位は除去されてよい。対象単子葉植物遺伝子のhemicot最適化バージョンは、「植物細胞でのグリホサート抵抗性をコードする核酸分子の最適化発現(OPTIMIZED EXPRESSION OF GLYPHOSATE RESISTANCE ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES IN PLANT CELLS)」という名称のU.S.S.N.13/303,502(2011年11月23日に出願され、2010年12月3日への優先権を主張)でさらに詳述されている。
前に本明細書に言及されているように、植物ゲノムへの導入遺伝子の導入および組込みは、多少のランダムイベントを含む(したがって、名称「イベント」は発現される所与の挿入のためである)。すなわち、アグロバクテリウム菌形質転換、「遺伝子銃」およびWHISKERSなどの多くの形質転換技術では、導入遺伝子がゲノムのどこに挿入されるかは予測できない。したがって、挿入物の両側の隣接植物ゲノムDNAを同定することは、所与の挿入イベントを有する植物を同定するために重要な可能性がある。例えば、挿入物と宿主ゲノムの接合部領域にわたるPCRアンプリコンを生成するPCRプライマーを設計することができる。このPCRアンプリコンは、特有であるか異なる型の挿入イベントを同定するために用いることができる。
植物細胞のゲノムに挿入物を導入する過程で、挿入物および/またはゲノム隣接配列の一部の欠失または他の変更が起こることは珍しくない。したがって、本明細書で提供されるプラスミド配列の関連するセグメントは、多少の軽微な変化を含むかもしれない。本明細書で提供される隣接配列についても同じである。したがって、対象の隣接配列および/または挿入物配列とある範囲の同一性を有するポリヌクレオチドを含む植物は、対象発明の範囲内である。本発明の配列との同一性は、本明細書に例示または記載される配列と少なくとも65%の配列同一性、より好ましくは少なくとも70%の配列同一性、より好ましくは少なくとも75%の配列同一性、より好ましくは少なくとも80%の同一性、より好ましくは少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列であってよい。対象発明のそのような植物およびポリヌクレオチド配列を規定するために、本明細書で提供されるハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション条件を用いることもできる。完全な挿入物配列に加えて隣接配列を含む配列は、寄託種子を参照して確認することができる。
「イベント」は本来ランダムイベントであるので、本開示の一部として、イベントpDAB8264.44.06.1を含むダイズ系統の少なくとも2500粒の種子を、アメリカ基準株保存機関(ATCC)、10801 University Boulevard、Manassas、VA、20110、に寄託し、制限なしで(しかし、特許権に従う)公開利用できるようにした。この寄託は、ATCC寄託番号PTA−11336と指定された。100パケット(1パケットにつき25粒の種子)のダイズ(Glycine max)種子(「ダイズ種子Glycine max L.:pDAB8264.44.06.1」)を、2010年9月14日にDow AgroSciences LLCおよびMS Technologies,LLCを代表して寄託した。寄託物は2010年10月4日に試験され、その日に種子は成育可能であった。この寄託は、特許手続のための種子寄託に関するブダペスト条約の条項に従って、およびその下で執行され、維持される。この寄託物は、公的な受託所であるATCC受託所において、30年間か、最近の請求から5年間か、または特許有効期間のうちのより長い期間制限なしに維持され、その期間中に成育不能になる場合には交換される。
本開示の一部として、イベントpDAB9582.812.9.1およびイベントpDAB8264.44.06.1(対象の除草剤耐性イベントおよび812昆虫抵抗性イベント)を含むダイズ系統の少なくとも2500粒の種子を、アメリカ基準株保存機関(ATCC)、10801 University Boulevard、Manassas、VA、20110、に寄託し、制限なしで(しかし、特許権に従う)公開利用できるようにした。寄託物は、ATCCによって「名称:pDAB9582.812.9.1:イベントpDAB8264.44.06.1」と同定された。100パケット(1パケットにつき25粒の種子)のダイズ(Glycine max)種子(「ダイズ種子Glycine max L.:pDAB8264.44.06.1」)を、2011年11月18日に寄託した。この寄託は、特許手続のための種子寄託に関するブダペスト条約の条項に従って、およびその下で執行され、維持される。この寄託物は、公的な受託所であるATCC受託所において、30年間か、最近の請求から5年間か、または特許有効期間のうちのより長い期間制限なしに維持され、その期間中に成育不能になる場合には交換される。
寄託された種子は、対象発明の一部である。明らかに、ダイズ植物はこれらの種子から生育させることができ、そのような植物は対象発明の一部である。対象発明は、これらの植物およびその後代を検出するために有益であるこれらのダイズ植物に含有されるDNA配列にも関する。対象発明の検出方法およびキットは、試験の最終的な目的に応じて、これらのイベントのいずれか1つ、2つまたはさらには3つ全てを同定することを対象としてもよい。
定義および例は、本発明の記載の助けとなるように、および当業者が本発明を実施するのを指導するために本明細書で提供される。特に明記しない限り、用語は、関連分野の通常の知識を有する者による従来の用法に従って理解されるべきである。米国特許法施行規則§1.822に示されるDNA塩基のための命名法が用いられる。
本明細書で用いるように、用語「後代」は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1を含む親植物の任意の世代の子孫を表す。
トランスジェニック「イベント」は、異種DNA、すなわち対象の導入遺伝子を含む核酸構築物による植物細胞の形質転換、植物のゲノムへの導入遺伝子の挿入からもたらされる植物の集団の再生、および特定のゲノム位置への挿入によって特徴づけられる特定の植物の選択によって生成される。用語「イベント」は、異種DNAを含む元の形質転換体および形質転換体の後代を指す。用語「イベント」は、形質転換体とゲノム/導入遺伝子DNAを含む別の変種との間の有性異系交配によって生成される後代も指す。反復親への反復戻し交雑の後でさえ、形質転換された親からの挿入導入遺伝子DNAおよび隣接ゲノムDNA(ゲノム/導入遺伝子DNA)が、交配の後代の同じ染色体位置に存在する。用語「イベント」は、挿入DNA(例えば、自家受粉から生じる元の形質転換体および後代)および挿入DNAを含有しない親の系統を含む1つの親の系統の有性交配の結果として、対象の導入遺伝子を含む挿入DNAを受ける後代へ伝えられることが予想される挿入DNAに直接隣接して挿入DNAおよび隣接ゲノム配列を含む元の形質転換体およびその後代のDNAも指す。
「接合部配列」は、ゲノムに挿入されているDNAが、挿入点に隣接するダイズの天然ゲノムのDNAに連結する点にわたり、植物の遺伝物質中の1つまたは他の接合部配列の同定または検出は、イベントの診断に十分である。本明細書に記載されるダイズイベント中の挿入にわたるDNA配列および類似した長さの隣接DNAが含まれる。そのような診断配列の具体例が本明細書で提供される;しかし、挿入の接合部に重複する他の配列、または挿入およびゲノム配列の接合部も診断に役立ち、対象発明によって用いることもできた。
対象発明は、そのような隣接、接合部および挿入物配列を用いることによるイベント同定に一部関する。関連するPCRプライマーおよびアンプリコンが、本発明に含まれる。対象発明により、挿入DNAおよびその境界(ボーダー)にわたるアンプリコンを用いるPCR分析法は、対象の商標登録されたトランスジェニックダイズ系統に由来する市販のトランスジェニックダイズ品種または系統を検出または同定するために用いることができる。
二成分プラスミド、pDAB8264(配列番号13)は、図1に表される遺伝子エレメントを含む。以下の遺伝子エレメント(T鎖ボーダー配列は含まれない)が、pDAB8264のT鎖領域中に含有される。表1で、本明細書に開示される配列番号13に関して遺伝子エレメントの残基番号付けが提供される。
配列番号14および15は、下でより詳細に記載されるように、それぞれ、挿入物配列の5’および3’部分と一緒になっている5’および3’隣接配列であり、したがって挿入物およびゲノムDNAの5’および3’の「接合部」または「移行」配列を含む。配列番号14に関して、残基1〜570は5’ゲノム隣接配列であり、残基571〜859は挿入物の5’末端の残基である。配列番号15に関して、残基1〜220は挿入物の3’末端の残基であり、残基221〜1719は3’ゲノム隣接配列である。したがって、挿入物の5’末端に関する接合部配列または移行は、配列番号14の残基570〜571の位置で起こる。したがって、挿入物の3’末端に関する接合部配列または移行は、配列番号15の残基220〜221の位置で起こる。対象発明のポリヌクレオチドには、接合部配列のいずれの側にも、例えば、5、10、20、50、100、150または200個の塩基、またはおそらくそれ以上、およびその間の任意の増分を含むものが含まれる。したがって、接合部配列にわたるプライマーは、例えば、隣接配列とハイブリダイズする5〜10個の塩基および挿入物配列とハイブリダイズする5〜10個の塩基を含むことができた。プローブおよびアンプリコンを同じように設計することができたが、それらは多くの場合プライマーより長かった。
対象配列(隣接配列を含む)は特有のものである。これらの挿入物および隣接配列に基づき、イベント特異的プライマーが生成された。PCR分析は、これらのイベント特異的なプライマーセットで生成されるPCRアンプリコンの分析によって、異なるダイズ遺伝子型でこれらのダイズ系統を同定することができることを実証した。したがって、これらのダイズ系統を特異的に同定するために、これらおよび他の関連した手順を用いることができる。本明細書で同定される配列は特有のものである。
後代に対象の1つまたは複数の追加の形質を付与しようとして対象のイベントを含む親植物を別の植物系統と交配させた後に、どの後代植物が所与のイベントを含むかについて判定するために、対象発明の検出技術は植物育種と合わせて特に有益である。これらのPCR分析法は、特に商品化されるトランスジェニックダイズ種子のために、ダイズ育種プログラムならびに品質管理に有益である。これらのトランスジェニックダイズ系統のためのPCR検出キットは、現在作製および使用することもできる。このことは、製品登録および製品管理にも有益である。
さらに、各挿入物のゲノム位置を特異的に同定するために、隣接ダイズ/ゲノム配列を用いることができる。この情報は、分子マーカー系統を各イベントに特異的にするために用いることができる。これらは、育種戦略の加速のために、および連鎖データを確立するために用いることができる。
なおさらに、隣接配列情報は、導入遺伝子組込み方法、ゲノム組込み部位の特性、イベント選別、導入遺伝子およびそれらの隣接配列の安定性、ならびに遺伝子発現(特に、遺伝子抑制、導入遺伝子メチル化パターン、位置効果、および潜在的発現関連のエレメント、例えばMARS[マトリックス給合領域]などに関連する)を試験し、特徴づけるために用いることができる。
対象開示を考慮すると、対象発明はATCC寄託番号PTA−11336の下で入手可能な種子を含むことが明らかになるはずである。対象発明は、受託番号PTA−11336の下でATCCに寄託された種子から生育させた除草剤耐性ダイズ植物も含む。対象発明は、前記植物の部分、例えば葉、組織試料、前記植物によって生成される種子、花粉などをさらに含む(それらは、配列番号1および配列番号2が側面に位置するトランスジェニック挿入物を含む)。
なおさらに、対象発明は、寄託種子から生育させた植物の子孫および/または後代植物、好ましくは除草剤抵抗性ダイズ植物を含み、前記植物は、本明細書に記載される検出可能な野生型ゲノムDNA/挿入物DNA接合部配列を含むゲノムを有する。本明細書で用いる場合、用語「ダイズ」は、ダイズ(Glycine max)を意味し、ダイズ植物と交配することができるその全ての品種を含む。
本発明は、少なくとも片方の親として対象発明の植物を用いて交雑種を作製する方法をさらに含む。例えば、対象発明は、片方か両方の親として本明細書に例示される植物のいずれかを有するF雑種植物を含む。対象発明のそのようなF雑種によって生成される種子も、対象発明の範囲内にある。本発明は、例示される植物を異なる(例えば近交系統親)植物と交配して、生じるハイブリッド種子を収集することによってF雑種種子を生成する方法を含む。対象発明は、雌親または雄親のいずれかである例示植物を含む。生じる植物の特性は、親植物の慎重な考慮によって向上させることができる。
対象発明の除草剤耐性のダイズ植物は、本明細書で言及される系統のいずれか1つの種子から生育させたダイズ植物からなる第1の親ダイズ植物と第2の親ダイズ植物を先ず有性交配させ、それによって複数の第1の後代植物を生成し;次に、除草剤に抵抗性である(または対象発明のイベントの少なくとも1つを保有する)第1の後代植物を選択し;第1の後代植物を自家受粉させ、それによって複数の第2の後代植物を生成し;次に、除草剤に抵抗性である(または対象発明のイベントの少なくとも1つを保有する)植物を第2の後代植物から選択することによって改良することができる。これらの段階は、第2の親ダイズ植物または第3の親ダイズ植物への第1の後代植物または第2の後代植物の戻し交雑をさらに含むことができる。対象発明のダイズ種子を含むダイズ作物、またはその後代を次に植えることができる。
2つの独立して分離している追加された外来性遺伝子を含有する子孫を生成するために、2つの異なるトランスジェニック植物を交配することもできることも理解するべきである。適当な後代の自家受粉は、両方の追加された外来性遺伝子がホモ接合である植物を生成することができる。栄養繁殖のように、親植物への戻し交雑および非トランスジェニック植物との異系交配も企図される。異なる形質および作物のために通常用いられる他の育種方法が、当技術分野で公知である。戻し交雑用親である、望ましいホモ接合栽培種または近交系統に、単純に遺伝する高度に遺伝性の形質のための遺伝子を伝えるために、戻し交雑育種法が用いられている。伝えられる形質の供給源は、ドナー親と呼ばれる。生じる植物は、反復親(例えば、栽培種)の特質およびドナー親から伝えられる望ましい形質を有すると予想される。最初の交配の後、ドナー親の表現型を保有する個体が選択され、反復親と繰り返し交配(戻し交配)される。生じる親は、反復親(例えば、栽培種)の特質およびドナー親から伝えられる望ましい形質を有すると予想される。
本発明のDNA分子は、マーカー支援育種(MAB)方法で分子マーカーとして用いることができる。当技術分野で公知であるように、本発明のDNA分子は、遺伝的に連結されている農業上有益な形質を同定する方法(例えば、AFLPマーカー、RFLPマーカー、RAPDマーカー、SNPおよびSSR)で用いることができる。除草剤耐性形質は、MAB方法を用いて、対象発明のダイズ植物(またはその後代、および他の任意のダイズ栽培種もしくは品種)との交配の後代において追跡できる。DNA分子はこの形質のためのマーカーであり、対象発明の少なくとも1つのダイズ系統またはその後代が親または祖先であったダイズ植物で除草剤抵抗性形質(複数可)を追跡するために、当技術分野で周知であるMAB方法を用いることができる。本発明の方法は、対象イベントを有する任意のダイズ品種を同定するために用いることができる。
対象発明の方法は、ダイズ栽培種にイベントpDAB8264.44.06.1を遺伝子移入するステップを含む、除草剤耐性のダイズ植物を生成する方法を含む。より具体的には、本発明の方法は、対象発明の2つの植物または対象発明の1つの植物および他の任意の植物を交配するステップを含むことができる。好ましい方法は、対象発明によって検出可能なイベントについて前記後代を分析することによって、前記交配の後代を選択するステップをさらに含む。例えば、対象発明は、他の望ましい形質、例えば様々な実施例において本明細書で試験されるものなどの農業形質を含む植物との育種サイクルを通して対象イベントを追跡するために用いることができる。対象イベントおよび所望の形質を含む植物は、例えばさらなるラウンドの育種で検出、同定、選択すること、および速やかに用いることができる。対象イベント/形質は、対象発明によって、昆虫抵抗性形質(複数可)および/またはさらなる除草剤耐性形質と育種を通して組み合わせること、および追跡することもできる。後者の一実施形態は、除草剤ジカンバへの抵抗性をコードする遺伝子と組み合わせた対象イベントを含む植物である。
したがって、対象発明は、例えば、グリホサート抵抗性(例えば、抵抗性植物または細菌性グリホサートオキシダーゼ(GOX))をコードする追加の形質、グリホサートアセチル転移酵素(GAT)、グルホシネート抵抗性(例えばビアラホス抵抗性(bar))のための追加の形質、アセトラクテート合成酵素(ALS)抑制性の除草剤抵抗性を付与する形質(例えば、イミダゾリノン[イマゼタピルなど]、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド、ピリミジニルチオベンゾエートおよび他の化学作用[Csr1、SurA、他])、ブロモキシニル抵抗性形質(例えば、Bxn)、ジカンバ除草剤への抵抗性のための形質(例えばU.S.2003/0135879を参照)、HPPD(4−ヒドロキシフェニル−ピルビン酸−ジオキシゲナーゼ)酵素の阻害剤への抵抗性のための形質、フィトエンデサチュラーゼ(PDS)の阻害剤への抵抗性のための形質、光化学系II抑制性の除草剤への抵抗性のための形質(例えば、psbA)、光化学系I抑制性の除草剤への抵抗性のための形質、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼIX(PPO)抑制性の除草剤(例えば、PPO−1)への抵抗性のための形質、およびフェニル尿素除草剤(例えば、CYP76B1)への抵抗性のための形質と組み合わせることができる。複数のクラスの除草剤に対する雑草シフトおよび/または抵抗性を効果的に制御し、遅らせ、および/または防止する能力を提供するために、そのような形質の1つまたは複数を対象発明と組み合わせることができる。
当業者は、対象発明で用いられるaad−12遺伝子が、フェノキシアセテートオーキシン除草剤(例えば、2,4−DB、MCPBなど)に変換される化合物への抵抗性も提供すると理解する。2,4−DB除草剤に存在する酪酸部分は、β−酸化を介して植物に有害である2,4−ジクロロフェノキシ酢酸に変換される。同様に、MCPBはβ−酸化を介して植物に有害であるMCPAに変換される。ブタン酸除草剤はそれ自身除草活性はないが、感受性の植物の中でβ−酸化によってそれらのそれぞれの酸形に変換され、植物に有害である除草剤の酢酸形を生成する。急速なβ−酸化ができない植物は、ブタン酸除草剤によって害されない。しかし、急速なβ−酸化が可能で、ブタン酸除草剤を酢酸形に変換することができる植物は、その後AAD−12によって保護される。
除草剤の施用法は当技術分野で周知である。そのような施用には、複数の除草剤のタンクミックスを含めることができる。対象発明によって使用するための好ましい除草剤は、グリホサート、グルホシネートおよびフェノキシオーキシン除草剤(例えば2,4−D;2,4−DB;MCPA;MCPB)の組合せである。他の好ましい組合せには、グリホサートに2,4−Dを、またはグルホシネートに2,4−Dを加えた混合物が含まれる。これらの3種類の除草剤は、対象開示を利用する当業技術者に明らかになる有利な組合せで用いることができる。対象発明の種子を植えようとする前に、対象除草剤の1つまたは複数を畑/エリアへ施用することができる。そのような施用は、対象発明の種子の播種から例えば14日以内であってよい。対象除草剤の1つまたは複数を、播種後から出芽前に施用することもできる。地面へ(雑草を防除するために)、または雑草の上面におよび/または対象発明のトランスジェニック植物の上面に、対象除草剤の1つまたは複数を施用することもできる。対象の3つの除草剤は、例えば、1つの除草剤に耐性であるが別のものには耐性でない雑草を防除または阻止するために、交替で、または組合せで用いることができる。対象の3種類の除草剤の様々な施用時期は、当技術分野で公知であるように様々な方法で用いることができる。
さらに、対象イベントは、トランスジェニックおよび非トランスジェニックの両方の、1つまたは複数の追加の除草剤耐性形質、1つまたは複数の追加のインプット(例えば、昆虫抵抗性(例えば、812イベントまたは814イベント)、真菌抵抗性、またはストレス耐性他)またはアウトプット(例えば、収量増、油プロファイルの向上、繊維特質の向上他)形質をスタックされてよい。したがって、対象発明は、任意の数の農業有害生物を柔軟におよび費用効果的に防除する能力を有する、向上した作物特質の完全な農業パッケージを提供するために用いることができる。
相同組換えを介して植物細胞の特定の染色体部位の中にポリヌクレオチド配列を組み込む方法は、当技術分野で記載されている。例えば、米国特許出願公開第2009/0111188A1号に記載される部位特異的組込みは、染色体標的へのドナーポリヌクレオチド配列の導入を媒介するための、リコンビナーゼまたはインテグラーゼの使用を記載する。さらに、国際特許出願WO2008/021207は、ゲノムの特定位置に1つまたは複数のドナーポリヌクレオチド配列を組み込むための、ジンクフィンガーによって媒介される相同組換えを記載する。特定の染色体部位にポリヌクレオチド配列を組み込むために、米国特許第6,720,475号に記載されるFLP/FRT、または米国特許第5,658,772号に記載されるCRE/LOXなどのリコンビナーゼの使用を利用することができる。最後に、特定の染色体位置にドナーポリヌクレオチドを向かわせるためのメガヌクレアーゼの使用が、Puchtaら、PNAS USA 93巻(1996年)5055〜5060頁に記載された。
植物細胞の中の部位特異的組込みのための他の様々な方法が一般的に公知であり、適用できる(Kumarら、Trends in Plant Sci. 6巻(4号)(2001年)155〜159頁)。さらに、いくつかの原核生物および下等真核生物で同定された部位特異的組換系を、植物で用いるために適用できる。そのような系の例として、それらに限定されないが以下のものが挙げられる:酵母ザイゴサッカロミセス・ルーキシ(Zygosaccharomyces rouxii)のpSR1プラスミドからのR/RSリコンビナーゼ系(Arakiら(1985年)J. Mol. Biol. 182巻:191〜203頁)、およびファージμのGin/gix系(MaeserおよびKahlmann(1991年)Mol. Gen. Genet. 230巻:170〜176頁)。
本発明の一部の実施形態では、既存のトランスジェニックイベントに近接して新しい導入遺伝子(複数可)を組み込むかスタックすることが望ましいことがある。トランスジェニックイベントは、単一の挿入部位、正常なメンデル分離および安定した発現、ならびに複数の環境場所における、およびそれらにわたる除草剤耐性および農業パフォーマンスを含む効力の優れた組合せなどの特有な特徴に基づいて選択された好ましいゲノム遺伝子座とみなすことができる。新たに組み込まれた導入遺伝子は、既存の形質転換体の導入遺伝子発現特性を維持するはずである。さらに、新たに組み込まれるイベントのゲノム隣接配列および染色体位置は既に同定されているので、新たに組み込まれるイベントの検出および確認のためのアッセイの開発は克服される。最後に、既存の導入遺伝子に連結する特定の染色体位置への新しい導入遺伝子の組込みは、従来の育種方法を用いる有性異系交配による他の遺伝的背景への導入遺伝子の遺伝子移入を促進する。
本発明の一部の実施形態では、トランスジェニックイベントからポリヌクレオチド配列を切除することが望ましいことがある。例えば、米国特許出願第13/011,666号に記載される導入遺伝子切除は、染色体に組み込まれたトランスジェニックイベントから、遺伝子発現カセットからなるポリヌクレオチド配列を除去するためのジンクフィンガーヌクレアーゼの使用を記載する。除去されるポリヌクレオチド配列は、選択可能なマーカーであってよい。ポリヌクレオチド配列の切除および除去の後に、改変されたトランスジェニックイベントは、ポリヌクレオチド配列の挿入によって再標的化することができる。ポリヌクレオチド配列の切除および続く改変トランスジェニックイベントの再標的化は、選択マーカーの再利用、または特定の遺伝子の発現から生じる植物トランスクリプトームの予想外の変化を克服する能力などの利点を提供する。
本明細書で対象発明は、異種核酸の挿入のために優れている、ダイズゲノムの第6染色体の上の特定部位を開示する。第6染色体の上の挿入/ターゲティング部位の位置を同定することおよび/または標的化することにおいても役立つことができる、5’隣接配列および3’隣接配列も開示される。したがって、対象発明は、対象の異種核酸をこの事前に確立された標的部位またはこの標的部位の近くに導入する方法を提供する。対象発明は、開示される標的部位またはそのような部位の近辺に挿入されている任意の異種ヌクレオチド配列を含むダイズ種子および/またはダイズ植物も包含する。そのような標的化組込みを達成する1つの選択肢は、本明細書に例示されるpat発現カセットを切除することおよび/またはその代わりに異なる挿入物を置換することである。一般に、例えば、および限定されずに、対象発明によって標的化相同組換えを用いることができる。
本明細書で用いられる場合、遺伝子、イベントまたは形質の「スタッキング」は、所望の形質を1つのトランスジェニック系統で一緒にする。植物育種家は、所望の形質を各々有する親の間で交配を行い、次にこれらの所望の形質の両方とも有する子孫を同定することによって、トランスジェニック形質をスタックする。遺伝子をスタックする別の方法は、形質転換の間に植物の細胞核に2つ以上の遺伝子を同時に移すことによる。遺伝子をスタックする別の方法は、対象の別の遺伝子でトランスジェニック植物を再形質転換することによる。例えば、遺伝子スタッキングは、2つ以上の異なる形質、例えば2つ以上の異なる昆虫形質、昆虫抵抗性形質(複数可)および病気抵抗性形質(複数可)、2つ以上の除草剤抵抗性形質、および/または昆虫抵抗性形質(複数可)および除草剤抵抗性形質(複数可)を組み合わせるために用いることができる。対象の遺伝子に加えての選択可能なマーカーの使用も、遺伝子スタッキングとみなすことができる。
「相同組換え」は、それを通して2つのヌクレオチド配列が相互作用(再結合)して新しい組換え体DNA配列を形成することができる、類似したヌクレオチド配列を含有する対応部位を有する任意の対のヌクレオチド配列の間の反応を指す。類似したヌクレオチド配列の部位は、本明細書で各々「相同配列」と呼ばれる。一般に、相同組換えの頻度は、相同配列の長さが増加するに従って増加する。したがって、相同組換えは同一未満である2つのヌクレオチド配列の間で起こり得るが、2つの配列の間の相違が増加するに従って組換え頻度(または効率)は低下する。組換えは、ドナーおよび標的分子の各々についての1つの相同配列を用いて達成することができ、それによって、「単一交差」組換え生成物を生成する。あるいは、標的およびドナーヌクレオチド配列の各々について2つの相同配列が配置されてもよい。ドナーについての2つの相同配列と標的についての2つの相同配列との間の組換えは、「二重交差」組換え生成物を生成する。ドナー分子の上の相同配列が操作され得る配列(例えば、対象配列)の側面に位置する場合は、標的分子との二重交差組換えは、標的分子についての相同配列の間に当初存在したDNA配列を対象配列が置換している組換え生成物をもたらす。二重交差組換イベントを介しての標的とドナーとの間でのDNA配列の交換は、「配列交換」と呼ばれる。
対象イベントは、3つの異なる除草剤耐性タンパク質のトランスジェニック発現を可能にし、ほとんど全ての広葉およびイネ科雑草を防除する除草剤の組合せへの耐性をもたらす。この多除草剤耐性形質の発現カセット/トランスジェニック挿入物は、例えば、他の除草剤耐性形質(例えば、グリホサート抵抗性、グルホシネート抵抗性、イミダゾリノン抵抗性、ジカンバ抵抗性、HPPD抵抗性、ブロモキシニル抵抗性他)、および昆虫抵抗性形質(例えば、Cry1F、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry34/45、Cry1Be、Cry1Ca、Cry1Da、Cry1Ea、Cry1Fa、栄養性殺虫性タンパク質(「VIPS」)−VIP3Aを含む、など)をスタックされてよい。さらに、対象発明の発現カセット/トランスジェニック挿入物中の除草剤耐性タンパク質は、第2の遺伝子または遺伝子群で遺伝子操作された植物の一次形質転換体の選択を助けるための1つまたは複数の選択可能なマーカーの役割を果たすことができる。
除草剤(例えば、グリホサート)への新たに獲得された抵抗性または固有の耐性のために、形質のこれらの組合せは、雑草(および同様の)種を防除する新規方法をもたらす。したがって、イベントpDAB8264.44.06.1を用いて雑草を防除するための新規方法は、本発明の範囲内である。
作物に個々にスタックまたは形質転換される対象トランスジェニック形質の使用は、フェノキシ、ピリジルオキシ、グリホサートおよび/またはグルホシネート除草剤への耐性を付与するための遺伝子を含有しない他の除草剤耐性自生作物を防除するツールを提供する。
対象発明の好ましい植物または種子は、そのゲノムに、本明細書で特定される挿入物配列を、本明細書に記載される挿入物の両側の少なくとも20〜500個以上の連続する隣接ヌクレオチドと一緒に含む。特に明記しない限り、隣接配列への言及は、配列番号1および配列番号2に関して特定される配列を指す。前と同様に、対象イベントは、挿入DNAの直近の対象隣接ゲノム配列の間に挿入されている異種DNAを含む。これらの隣接配列の全てまたは一部は、そのイベントを含む親の系統の有性交配の結果として挿入DNAを受け取る後代へ伝えられることが予想することができる。
対象発明は、対象発明の植物の再生可能な細胞の組織培養を含む。そのような組織培養から再生される植物、特に例示される品種の全ての形態的および生理的特性を発現することが可能な植物も含まれる。対象発明の好ましい植物は、寄託種子から生育させた植物の全ての生理的および形態的特徴を有する。本発明は、そのような種子および対象の特質形質を保有する種子の後代をさらに含む。
植物または種子、またはその一部の操作(例えば、突然変異、さらなるトランスフェクションおよびさらなる育種)は、「事実上由来する」品種と呼ぶことができるものの生成をもたらすことができる。International Union for the Protection of New Varieties of Plants (UPOV)は、品種が保護品種に事実上由来しているかどうかについて判定するための以下のガイドラインを提供している:
[A]以下の場合に、品種は、別の品種(「最初の品種」)に事実上由来するとみなされるものとする
(i)それは主に最初の品種に由来するか、またはそれ自体主に最初の品種に由来する品種に由来するが、最初の品種の遺伝子型または遺伝子型の組合せから生じる本質的特徴の発現を保持する;
(ii)それは、最初の品種と明らかに識別可能である;および
(iii)誘導の行為から生じる差を除いて、それは、最初の品種の遺伝子型または遺伝子型の組合せから生じる本質的特徴の発現において最初の品種に一致する。
UPOV、国際機関との第6回会議、Geneva、1992年10月30日;文書は、連合事務局によって作成された。
本明細書で用いる場合、「系統」は、少なくとも1つの形質について個体間で遺伝的変異をほとんど又は全く示さない一群の植物である。そのような系統は、数世代の自家受粉および選択、または組織もしくは細胞培養技術を用いる単一の親からの栄養繁殖によって作製することができる。
本明細書で用いる場合、用語「栽培種」および「品種」は同義であり、商業生産のために用いられる系統を指す。
「安定性」または「安定した」は、所与の成分に関して、その成分が代々、好ましくは少なくとも3世代、実質的に同じレベルで、例えば好ましくは±15%、より好ましくは±10%、最も好ましくは±5%で引き続いて維持されることを意味する。安定性は、温度、場所、ストレスおよび栽植時期の影響を受けることがある。圃場条件下の以降の世代の比較は、同様の方法で成分を生成するはずである。
「商業上の有用性」は、従来の耕作機械を用いて作物を農民が生産することができ、従来の破砕および抽出設備を用いて記載される成分の油を種子から抽出することができるように、優れた植物活力および高い繁殖性を有することと定義される。商業上有益であるために、種子重量で測定される収量、含油量およびエーカーあたりの生産される全油は、同じ地域で育てられる高級な価値形質のない、その他は同等の市販キャノーラ品種の平均収量から15%以内にある。
「農業優良種」は、対象イベント(複数可)による除草剤耐性に加えて、収量、成熟、病害抵抗性などの望ましい農業特性をある系統が有することを意味する。対象発明のイベントを含む植物の、下の実施例に示す、個々にまたは任意の組合せでとられる農業形質は、対象発明の範囲内である。これらの農業特性およびデータポイントのいずれかおよび全ては、そのような植物を同定するために、1点として用いられるか、またはそのような植物を規定するために用いられる特性範囲の一端もしくは両端で用いることができる。
本開示を考慮して当業技術者が認識するように、検出キットの好ましい実施形態は、例えば、「接合部配列」または「移行配列」(ダイズゲノム隣接配列が挿入物配列と出会う場所)に向けられるおよび/またはそれを含むプローブおよび/またはプライマーを含むことができる。例えば、これは、表1に示されるように、片方または両方の接合部配列(挿入物が隣接配列と出会う場所)を同定するように設計されるポリヌクレオチドプローブ、プライマー、および/またはアンプリコンを含む。1つの一般的な設計は、隣接領域でハイブリダイズする1つのプライマー、および挿入物でハイブリダイズする1つのプライマーを持つことである。そのようなプライマーは、各々しばしば約少なくとも15残基の長さである。この配置で、プライマーは、対象発明のイベントの存在を示す検出可能なアンプリコンを生成/増幅するために用いることができる。これらのプライマーは、上で示される接合部配列にわたる(およびそれを含む)アンプリコンを生成するために用いることができる。
隣接配列で「タッチダウン」するプライマー(複数可)は、一般的に接合部から約200個の塩基を越えてハイブリダイズするように設計されない。したがって、一般的な隣接プライマーは、挿入物の最初から数えて隣接配列に200塩基の範囲内のいずれかの鎖の少なくとも15残基を含むように設計される。すなわち、上で同定される一方または両方の接合部配列から約100から200〜500(またはその位)塩基内の残基からの(またはそれとハイブリダイズする)適切なサイズの配列を含むプライマーは、対象発明の範囲内である。挿入物プライマーは挿入物の上のいずれかの位置に同様に設計することができるが、上で同定される接合部配列(複数可)中のまたはそこからの100から約200〜500塩基内の挿入物(相補配列を含む)の上の残基は、例えば、そのようなプライマー設計のために非排他的に用いることができる。
当業者は、プライマーおよびプローブは、標準のハイブリダイゼーション条件および/またはPCR条件範囲の下で、本明細書に例示される配列(またはその相補配列)のセグメントとハイブリダイズするように設計することができることも認識し、そこで、プライマーまたはプローブは例示される配列に完全には相補的でない。すなわち、多少の程度のミスマッチは寛容できる。例えば約20ヌクレオチドプライマーについては、ミスマッチ塩基が内部にあるか、アンプリコンの反対側にあるプライマーの末端である場合は、一般的に1つまたは2つほどのヌクレオチドが反対側の鎖と結合する必要性はない。様々な適当なハイブリダイゼーション条件が下で提供される。イノシンなどの合成ヌクレオチド類似体をプローブで用いることもできる。ペプチド核酸(PNA)プローブ、ならびにDNAおよびRNAプローブを用いることもできる。重要であることは、そのようなプローブおよびプライマーが対象発明のイベントの存在の診断に役立つ(特異的に同定および区別することができる)ことである。
例えば軽微な配列決定の誤りをもたらし得るPCR増幅での誤りが起こる可能性があることに注意すべきである。すなわち、特に明記しない限り、本明細書に記載される配列は、ダイズゲノムDNAから長いアンプリコンを生成し、次にアンプリコンをクローニングおよび配列決定することによって決定された。ゲノムDNAから配列決定のために十分なアンプリコンを生成するのに必要である多くの増幅周回を考慮すると、このように生成および判定される配列のわずかな差および軽微な不一致を見出すことは珍しいことではない。当業者は、この種の一般的な配列決定の誤りまたは不一致のために必要とされるいかなる調整も、対象発明の範囲内にあることを認識するべきであり、注意させるべきである。
配列がイベントの生成の間に挿入されるとき、例えば一部のゲノム配列が削除されることは珍しくないことにも注意すべきである。したがって、例えば対象の隣接配列とGENBANKに記載されるゲノム配列との間に、多少の差が現れることもある。
「挿入物」の成分は図面で例示され、下の実施例でさらに詳細に議論される。これらの成分またはその断片のDNAポリヌクレオチド配列は、本発明の方法でDNAプライマーまたはプローブとして用いることができる。
本発明の一部の実施形態では、ダイズ植物から、植物および種子などで、導入遺伝子/ゲノム挿入領域の存在を検出するための組成物および方法が提供される。本明細書で提供される対象導入遺伝子/ゲノム挿入領域接合部配列、本明細書で同定される接合部配列を含むセグメント、ならびに任意のそのような例示配列およびその任意のセグメントの相補配列を含むDNA配列が提供される。挿入領域接合部配列は、ゲノムに挿入されている異種DNAと、挿入部位の側面に位置するダイズ細胞由来のDNAとの間の接合部にわたる。そのような配列は、所与のイベントの診断に役立つことができる。
これらの挿入物およびボーダー配列に基づき、イベント特異的プライマーを生成することができる。PCR分析は、これらのイベント特異的なプライマーセットで生成されるPCRアンプリコンの分析によって、異なるダイズ遺伝子型における対象発明のダイズ系統を同定することができることを実証した。これらのダイズ系統を特異的に同定するために、これらおよび他の関連した手順を用いることができる。したがって、そのようなプライマー対に由来するPCRアンプリコンは特有のものであり、これらのダイズ系統を同定するために用いることができる。
一部の実施形態では、新規導入遺伝子/ゲノム挿入領域の連続した断片を含むDNA配列は、本発明の一態様である。導入遺伝子挿入物配列のポリヌクレオチドの十分な長さ、および前記ダイズ植物の1つまたは複数からのダイズゲノム配列のポリヌクレオチドの十分な長さを含むDNA配列、ならびに/またはこれらのダイズ植物の1つまたは複数の診断に役立つアンプリコン生成物の生成のためのプライマー配列として有益である配列が含まれる。
関連する実施形態は、本明細書で同定されるDNA配列またはその相補配列の導入遺伝子部分の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含むDNA配列、およびこれらの配列またはその相補配列からの類似した長さの隣接ダイズDNA配列(例えば配列番号1および配列番号2ならびにそのセグメント)に関する。そのような配列は、DNA増幅方法でのDNAプライマーとして有益である。これらのプライマーを用いて生成されるアンプリコンは、本明細書で言及されるダイズイベントのいずれかの診断に役立つ。したがって、本発明は、そのようなDNAプライマーおよび相同プライマーによって生成されるアンプリコンも含む。
本発明は、本明細書で言及されるダイズイベントに対応するDNAの、試料中の存在を検出する方法も含む。そのような方法は、以下を含むことができる:(a)DNAを含む試料を、これらのダイズイベントの少なくとも1つ由来のDNAとの核酸増幅反応で用いられるときに前記イベント(複数可)の診断に役立つアンプリコンを生成するプライマーセットと接触させるステップ;(b)核酸増幅反応を実施し、それによってアンプリコンを生成するステップ;および(c)アンプリコンを検出するステップ。
対象発明のさらなる検出方法は、前記イベントに対応するDNAの試料中の存在を検出する方法を含み、前記方法は以下を含む:(a)DNAを含む試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で前記ダイズイベントの少なくとも1つ由来のDNAとハイブリダイズし、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で対照ダイズ植物(非対象イベントDNA)とハイブリダイズしないプローブと接触させるステップ;(b)試料およびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供するステップ;および(c)DNAに対するプローブのハイブリダイゼーションを検出するステップ。
さらなる実施形態では、対象発明は、イベントpDAB8264.44.06.1を含むダイズ植物を生成する方法を含み、前記方法は以下のステップを含む:(a)第1の親ダイズ系統(前記系統の植物に前記除草剤抵抗性形質を付与する、本発明の発現カセットを含む)と第2の親のダイズ系統(この除草剤耐性形質を欠く)を有性的に交配し、それによって複数の後代植物を生成するステップ;および(b)分子マーカーを用いて後代植物を選択するステップ。そのような方法は、前記除草剤耐性形質を含む純粋種の(true-breeding)ダイズ植物を生成するために、後代植物を第2の親ダイズ系統へ戻し交配するさらなるステップを任意選択で含むことができる。
本発明の別の態様により、前記イベントとの交配の後代の接合性を判定する方法が提供される。前記方法は、ダイズDNAを含む試料を対象発明のプライマーセットと接触させるステップを含むことができる。前記ダイズイベントの少なくとも1つのゲノムDNAとの核酸増幅反応で用いられるときに、前記プライマーは、前記ダイズイベントの少なくとも1つの診断に役立つ第1のアンプリコンを生成する。そのような方法は、核酸増幅反応を実施し、それによって第1のアンプリコンを生成するステップ;第1のアンプリコンを検出するステップ;およびダイズDNAを含む試料を前記プライマーセットと接触させるステップ(前記プライマーセットは、ダイズ植物由来のゲノムDNAとの核酸増幅反応で用いられるとき、ダイズゲノム領域に相同性である天然のダイズゲノムDNAを含む第2のアンプリコンを生成する;ならびに、核酸増幅反応を実施し、それによって第2のアンプリコンを生成するステップをさらに含む。この方法は、第2のアンプリコンを検出するステップ、ならびに試料中の第1および第2のアンプリコンを比較するステップをさらに含み、そこで、両アンプリコンの存在はその試料が導入遺伝子挿入にヘテロ接合であることを示す。
本明細書に開示される組成物およびDNA検出の分野で周知である方法を用いて、DNA検出キットを開発することができる。キットは試料中の対象ダイズイベントDNAの同定のために有益であり、このDNAを含有するダイズ植物を育種する方法へ適用することができる。キットは、例えば本明細書に開示されるアンプリコンに相同であるか相補的なDNA配列、または対象イベントの導入遺伝子遺伝子エレメントに含有されるDNAに相同であるか相補的なDNA配列を含有する。これらのDNA配列は、DNA増幅反応で、またはDNAハイブリダイゼーション方法でのプローブとして用いることができる。キットは、検出方法の実施で必要な試薬および材料を含有することもできる。
「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはリポーター分子(放射性同位体、リガンド、化学発光剤または酵素など)が結合している、単離された核酸分子である。そのようなプローブは、標的核酸の鎖に、本発明の場合は、ダイズ植物からであれイベントのDNAを含む試料からであれ、前記ダイズイベントの1つ由来のゲノムDNAの鎖に相補的である。本発明によるプローブには、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、標的DNA配列に特異的に結合してその標的DNA配列の存在を検出するために用いることができるポリアミドおよび他のプローブ材料も含まれる。「単離された」ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが非天然の状態にあること、例えば、異種プロモーターに作動可能に連結していることを意味する。「精製された」タンパク質は、同様に、そのタンパク質が非天然の状態にあることを意味する。
「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的標的DNA鎖とアニールされて、プライマーと標的DNA鎖との間でハイブリッドを形成し、次に、ポリメラーゼ、例えばDNAポリメラーゼによって標的DNA鎖に沿って伸長する、単離/合成された核酸である。本発明のプライマー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または他の従来の核酸増幅方法による標的核酸配列の増幅のためのそれらの使用を指す。
プローブおよびプライマーは、長さが一般に5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、または500ポリヌクレオチド以上である。そのようなプローブおよびプライマーは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の下で標的配列と特異的にハイブリダイズする。好ましくは、本発明によるプローブおよびプライマーは標的配列との完全な配列類似性を有するが、標的配列とハイブリダイズする能力を保持する、標的配列と異なるプローブを従来の方法によって設計することができる。
プローブおよびプライマーを調製する方法および用いる方法は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、第1〜3巻、Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989年に記載される。PCRプライマー対は、例えばその目的のためのコンピュータプログラムを用いて、既知の配列から導くことができる。
本明細書に開示される隣接DNAおよび挿入物配列に基づくプライマーおよびプローブは、従来の方法によって、例えばそのような配列を再クローニングおよび配列決定することによって、開示される配列を確認する(および、必要に応じて訂正する)ために用いることができる。
本発明の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件の下で標的DNA配列とハイブリダイズする。試料中のトランスジェニックイベント由来のDNAの存在を同定するために、任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法を用いることができる。核酸分子またはその断片は、特定の状況下で他の核酸分子と特異的にハイブリダイズすることが可能である。本明細書で用いる場合、2つの核酸分子が逆平行の二本鎖核酸構造を形成することが可能であるならば、その2つの核酸分子は互いと特異的にハイブリダイズすることが可能であると言われる。それらが完全な相補性を示すならば、核酸分子は別の核酸分子の「相補配列」であると言われる。本明細書で用いる場合、分子の1つのあらゆるヌクレオチドが他の分子のヌクレオチドに相補的である場合に、それらの分子は「完全な相補性」を示すと言われる。少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件の下でそれらが互いとアニールした状態を保つのを可能にするのに十分な安定性でそれらが互いとハイブリダイズすることができる場合に、2つの分子は「最小限に相補的である」と言われる。同様に、従来の「高ストリンジェンシー」条件の下でそれらが互いとアニールした状態を保つのを可能にするのに十分な安定性でそれらが互いとハイブリダイズすることができる場合に、それらの分子は「相補的である」と言われる。従来のストリンジェンシー条件は、Sambrookら、1989年、によって記載される。したがって、完全な相補性からの逸脱は、そのような逸脱が二本鎖構造を形成する分子の能力を完全に排除しない限り許容される。核酸分子がプライマーまたはプローブの役割を果たすためには、その核酸分子は、利用される特定の溶媒および塩濃度の下で安定した二本鎖構造を形成できるように、配列が十分に相補的であることのみを必要とする。
本明細書で用いる場合、実質的に相同な配列は、高ストリンジェンシー条件の下でそれが比較される核酸配列の相補配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列である。用語「ストリンジェント条件」は、Sambrookら、1989年、9.52〜9.55で議論される特異的ハイブリダイゼーション手順による、核酸プローブと標的核酸(すなわち、対象の特定の核酸配列)とのハイブリダイゼーションに関して、機能的に定義される。Sambrookら、1989年、9.47〜9.52および9.56〜9.58も参照。したがって、本発明のヌクレオチド配列は、DNA断片の相補的ストレッチと二重鎖分子を選択的に形成するそれらの能力のために用いることができる。
想定される適用に従い、標的配列に対するプローブの様々な程度の選択性を達成するために、様々なハイブリダイゼーション条件を用いることができる。高い選択性を必要とする適用のために、例えばエンドポイントTaqManおよびリアルタイムPCR適用に関して、ハイブリッドを形成するために比較的ストリンジェントな条件が一般的に使用され、約60℃から約75℃の温度で1.5mMから約4.0mMのMgCl2が選択され、および本明細書に記載されるように、ストリンジェンシーを増加させるために保持時間が変更されることがある。他のハイブリダイゼーション技術については、例えば約50℃から約70℃の温度で約0.02Mから約0.15MのNaClによって提供されるような、比較的低い塩および/または高い温度条件が一般的に使用される。ストリンジェント条件は、例えば、ハイブリダイゼーションフィルターを高ストリンジェンシー洗浄緩衝液(0.2×SSC、0.1%SDS、65℃)で少なくとも2回洗浄することを含むことができる。DNAハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェンシー条件、例えば、約45℃の6.0×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)と、続く50℃の2.0×SSCの洗浄は、当業者に公知である。例えば、洗浄工程での塩濃度は、50℃の約2.0×SSCの低ストリンジェンシーから50℃の約0.2×SSCの高ストリンジェンシーまでから選択することができる。さらに、洗浄工程での温度は、約22℃の室温の低ストリンジェンシー条件から約65℃の高ストリンジェンシー条件まで増加させることができる。温度と塩の両方を変化させることができるか、または温度もしくは塩濃度のいずれかを一定に保持し、他の変数を変化させることができる。そのような選択的な条件は、プローブと鋳型または標的鎖との間のミスマッチを、あるとしてもわずかしか許容しない。ハイブリダイゼーションによるDNA配列の検出は当業者に周知であり、米国特許第4,965,188号および第5,176,995号の教示はハイブリダイゼーション分析の方法の例である。
特に好ましい実施形態では、本発明の核酸は、相補配列およびその断片を含む、本明細書で例示または提案されるプライマー(またはアンプリコンもしくは他の配列)の1つまたは複数と、高ストリンジェンシー条件の下で特異的にハイブリダイズする。本発明の一態様では、本発明のマーカー核酸分子は、例示される配列の1つ、またはその相補配列および/または断片の、本明細書で示される核酸配列を有する。
本発明の別の態様では、本発明のマーカー核酸分子は、そのような核酸配列と80%から100%、または90%から100%の間の配列同一性を共有する。本発明のさらなる態様では、本発明のマーカー核酸分子は、そのような配列と95%から100%の間の配列同一性を共有する。そのような配列は、遺伝的交配の後代を同定するための植物育種法でマーカーとして用いることができる。プローブと標的DNA分子とのハイブリダイゼーションは、当業者に公知である任意の数の方法によって検出することができ、これらには、それらに限定されないが、蛍光性タグ、放射性タグ、抗体ベースのタグ、および化学発光タグを含めることができる。
特定の増幅プライマー対を用いての標的核酸配列の増幅(例えば、PCRによる)に関して、「ストリンジェント条件」は、プライマー対が、対応する野生型配列(またはその相補配列)を有するプライマーが結合する標的核酸配列とだけハイブリダイズして、好ましくは特有な増幅生成物アンプリコンを生成することを許す条件である。
用語「(標的配列)に特異的な」は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で、プローブまたはプライマーが標的配列を含む試料の標的配列とだけハイブリダイズすることを示す。
本明細書で用いる場合、「増幅されたDNA」または「アンプリコン」は、核酸鋳型の一部である標的核酸配列の核酸増幅生成物を指す。例えば、有性交配から生じるダイズ植物が本発明のダイズ植物からのトランスジェニックイベントゲノムDNAを含有するかどうか判定するために、ダイズ植物組織試料から抽出されるDNAは、挿入された異種DNAの挿入部位に隣接している植物ゲノムの隣接配列に由来するプライマーおよび挿入された異種DNAに由来する第2のプライマーを含むプライマー対を用いて核酸増幅方法にかけ、イベントDNAの存在の診断に役立つアンプリコンを生成することができる。アンプリコンは、イベントの診断に同じく役立つ長さおよび配列を有する。アンプリコンの長さは、プライマー対に1つのヌクレオチド塩基対を組み合わせた長さから、および/またはプライマー対に約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、または500、750、1000、1250、1500、1750、2000以上のヌクレオチド塩基対(上記の増分のいずれかを加えるか引いたもの)を組み合わせた長さに変動することができる。あるいは、全体の挿入物ヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成するように、プライマー対は挿入されるDNAの両側の隣接配列に由来してよい。植物ゲノム配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入されるDNA配列から離れた位置にあることができる。この距離は、1ヌクレオチド塩基対から約20,000ヌクレオチド塩基対までの範囲内であってよい。用語「アンプリコン」の使用は、DNA熱増幅反応で形成することができるプライマー二量体を特異的に排除する。
核酸増幅は、当技術分野で公知である、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む様々な核酸増幅方法のいずれかによって達成することができる。様々な増幅方法が当技術分野で公知であり、とりわけ、米国特許第4,683,195号および米国特許第4,683,202号に記載されている。最高22kbのゲノムDNAを増幅するように、PCR増幅方法が開発されている。本発明の実施で、これらの方法およびDNA増幅の技術分野で公知である他の方法を用いることができる。対象ダイズイベントからの異種導入遺伝子DNA挿入物の配列または隣接ゲノム配列は、本明細書で提供される配列に由来するプライマーを用いてイベントからそのような配列を増幅し、続いてPCRアンプリコンまたはクローンDNAの標準のDNA配列決定によって検証する(および必要に応じて訂正する)ことができる。
これらの方法によって生成されるアンプリコンは、複数の技術によって検出することができる。アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウムによる染色は、DNAアンプリコンを検出する一般的な周知の方法である。別のそのような方法は、隣接する隣接ゲノムDNA配列と挿入されるDNA配列の両方に重複するDNAオリゴヌクレオチドが設計される、遺伝子ビット分析である。オリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプレートのウェルに固定化される。対象領域のPCR(挿入される配列中の1つのプライマーおよび隣接する隣接ゲノム配列中の1つのプライマーを用いる)の後、一本鎖PCR生成物は、固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることができ、DNAポリメラーゼおよび予想される隣の塩基に特異的な標識ddNTPを用いる一塩基伸長反応のための鋳型の役割を果たすことができる。読み出しは蛍光性であるか、ELISAベースであってよい。シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび一塩基伸長による挿入物/隣接配列の存在を示す。
別の方法は、Winge(Innov. Pharma. Tech. 00:18〜24頁、2000年)によって記載されるピロシークエンシング技術である。この方法では、隣接するゲノムDNAおよび挿入物DNA接合部に重複するオリゴヌクレオチドが設計される。オリゴヌクレオチドは、対象領域からの一本鎖PCR生成物とハイブリダイズされ(挿入配列中の1つのプライマーおよび隣接ゲノム配列中の1つのプライマー)、DNAポリメラーゼ、ATP、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン5’ホスホスルフェートおよびルシフェリンの存在下でインキュベートされる。DNTPが個々に追加され、その組込みが測定される光シグナルを生じる。光シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび一塩基または多塩基伸長による導入遺伝子挿入物/隣接配列の存在を示す。
蛍光偏光法は、本発明のアンプリコンを検出するために用いることができる別の方法である。この方法に従い、ゲノム隣接部および挿入DNA接合部に重複するオリゴヌクレオチドが設計される。オリゴヌクレオチドは、対象領域からの一本鎖PCR生成物とハイブリダイズされ(挿入DNA中の1つのプライマーおよび隣接ゲノムDNA配列中の1つのプライマー)、DNAポリメラーゼおよび蛍光標識ddNTPの存在下でインキュベートされる。一塩基伸長は、ddNTPの組込みをもたらす。組込みは、蛍光光度計を用いて偏光での変化として測定することができる。偏光の変化は、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび一塩基伸長による導入遺伝子挿入物/隣接配列の存在を示す。
TAQMAN(PE Applied Biosystems、Foster City、Calif.)は、DNA配列の存在を検出し、定量する方法である。簡潔に述べると、ゲノム隣接部および挿入物DNA接合部に重複するFRETオリゴヌクレオチドプローブが設計される。耐熱性ポリメラーゼおよびdNTPの存在下で、FRETプローブおよびPCRプライマー(挿入物DNA配列中の1つのプライマーおよび隣接ゲノム配列中の1つのプライマー)がサイクル処理される。特異的な増幅の間、Taq DNAポリメラーゼは、FRETプローブの上の消光部分から蛍光部分を除いてこの部分を放出する。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによる隣接/導入遺伝子挿入物配列の存在を示す。
分子ビーコンは、配列検出で使用するために記載されている。簡潔に述べると、隣接ゲノムおよび挿入物DNA接合部に重複するFRETオリゴヌクレオチドプローブが設計される。FRETプローブの特有な構造は、それが、蛍光部分および消光部分を極めて近くに保つ2次構造を含有することをもたらす。耐熱性ポリメラーゼおよびdNTPの存在下で、FRETプローブおよびPCRプライマー(挿入物DNA配列中の1つのプライマーおよび隣接ゲノム配列中の1つのプライマー)がサイクル処理される。PCR増幅が成功した後、FRETプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションによって、プローブ2次構造の除去ならびに蛍光部分および消光部分の空間的分離が起こる。蛍光シグナルが生じる。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによる隣接ゲノム/導入遺伝子挿入物配列の存在を示す。
挿入のために優れているダイズゲノムの位置が開示されたが、対象発明は、このゲノム位置の概ね近辺に又はその周辺に少なくとも1つの非aad12/pat/2mepspsコード配列を含むダイズ種子および/またはダイズ植物も含む。1つの選択肢は、本明細書に例示される挿入物の代わりに異なる挿入物を置換することである。これに一般に関し、例えば、対象発明によって標的化相同組換えを用いることができる。この種の技術は、例えば、WO03/080809A2および対応する公開米国特許出願(U.S.2003/0232410)の対象である。したがって、対象発明は、本明細書で配列番号1および配列番号2と同定される隣接配列の全てまたは認識できるその一部が側面に位置する異種挿入物を(例示される挿入物の代わりに、またはその多コピーと共に)含む植物および植物細胞を含む。例示挿入物またはその成分のいずれかの追加のコピー(または複数の追加のコピー)も、この方法/これらの方法で挿入の標的にすることができた。
本明細書で参照または引用される全ての特許、特許出願、仮出願および刊行物は、それらがこの明細書の明白な教示と矛盾しない範囲で、参照により全体が組み込まれる。
本発明を実施するための手順を例示するために、および本発明の特定の好ましい実施形態を実証するために、以下の実施例が含まれる。これらの実施例は、限定するものと解釈されるべきでない。以下の実施例で開示される技術はその実施のための好ましい様式を例示するために用いられる特定の方法を表すことを、当業者は理解するべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、本発明の精神と範囲から逸脱することなく同様であるか類似した結果をなお得ながら、これらの具体的な実施形態に多くの変更を加えることができることを理解するべきである。特記されない限り、全ての百分率は重量によるものであり、全ての溶媒混合割合は特記されない限り容量によるものである。
特に明記しない限り、以下の略記号が用いられる。
bp 塩基対
℃ 摂氏温度
DNA デオキシリボ核酸
DIG ジゴキシゲニン
EDTA エチレンジアミン四酢酸
kb キロベース
μg マイクログラム
μL マイクロリットル
mL ミリリットル
M モル質量
OLP 重複プローブ
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PTU 植物転写単位
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
SOP 標準操作手順
SSC 塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムの混合物を含有する緩衝溶液、pH7.0
TBE トリス塩基、ホウ酸およびEDTAの混合物を含有する緩衝溶液、pH8.3
V ボルト
2mEPSPSおよびAAD−12ダイズイベント8264.44.06.1の形質転換および選択
ダイズ子葉節外植片のアグロバクテリウム(Agrobacteriumu)媒介形質転換を介して、ダイズイベント8264.44.06.1を含有するトランスジェニックダイズ(Glycine max)を作出した。形質転換を開始するために、T鎖DNA領域の中に選択可能なマーカー、patならびに対象遺伝子aad−12および2mepsps v1を含有する二成分ベクターpDAB8264(図1)を運ぶ、無害化アグロバクテリウム(Agrobacterium)株EHA101(Hoodら、2006年)を用いた。
アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介形質転換は、Zengら(2004年)の改変手順を用いて実行した。簡潔に述べると、ダイズ種子(栽培品種Maverick)を基本培地の上で発芽させ、子葉節を単離してアグロバクテリウム(Agrobacterium)に感染させた。アグロバクテリウム(Agrobacterium)の除去のために、生長開始、苗条伸長および発根用の培地に、セフォタキシム、チメンチンおよびバンコマイシンを補充した。形質転換されていない苗条の生育を抑制するために、グルホシネート選択を用いた。選択された苗条は根の発達のために発根培地に移し、次に、小植物の順応のために配合土に移した。
選択された小植物の頂生小葉は、推定上の形質転換体についてスクリーニングするためにグルホシネートを葉に塗布した。スクリーニングされた小植物を温室に移し、順応させ、次に耐性を再確認するためにグルホシネートを葉に塗布し、推定上の形質転換体であるとみなした。スクリーニングした植物から試料を採取し、選択可能なマーカー遺伝子および/または対象遺伝子の確認のための分子解析を実行した。T植物を温室で自家受精させて、T種子を生成した。
このイベント、ダイズイベント8264.44.06.1は、独立した形質転換分離株から生成された。T植物は、以降の世代にわたって戻し交配され、優良品種へ遺伝子移入された。このイベントは、単一の挿入部位、正常なメンデル分離および安定した発現、ならびに除草剤耐性および農業パフォーマンスを含む効力の優れた組合せなどのその特有の特徴に基づいて選択された。以下の実施例は、ダイズイベント8264.44.06.1を特徴づけるために用いられたデータを含有する。
ダイズイベント8264.44.06.1でのAAD−12、2mEPSPSおよびPATタンパク質の特徴づけ
トランスジェニックダイズイベントpDAB8264.44.06.1に由来する組換え体AAD−12、2mEPSPSおよびPATタンパク質の生化学的性質を特徴づけした。タンパク質の生化学的性質を特徴づけて、AAD−12、PATおよび2mEPSPSタンパク質の発現を確認するために、定量的酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)を用いた。
実施例2.1:植物組織でのAAD−12タンパク質の発現
AAD−12タンパク質のレベルを、ダイズイベント8264.44.06.1で判定した。定量的酵素結合免疫吸着検定(ELISA)方法を用いて、ダイズ葉組織から可溶性の抽出可能なAAD−12タンパク質を測定した。
ダイズ組織の試料を試験植物から単離し、発現分析のために調製した。0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有する界面活性剤Tween20(PBST)を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、AAD−12タンパク質をダイズ植物組織から抽出した。植物組織を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、サンドイッチ形式のAAD−12 ELISAキットを用いて分析した。キットを、製造業者の推奨プロトコルに従って用いた。
ダイズイベント8264.44.06.1で発現安定性および遺伝率を垂直(世代間)および水平(同世代の系統の間)の両方で調査するために、検出分析を実施した。T4世代で、ダイズイベント8264.44.06.1の発現は全ての系統を通して安定で(分離せず)、一貫していた。圃場発現レベル試験をダイズイベントについて実施した;全ての系統を通しての平均発現は、およそ200〜400ng/cmであった。
実施例2.2:植物組織での2mEPSPSタンパク質の発現
2mEPSPSタンパク質のレベルを、ダイズイベント8264.44.06.1で判定した。定量的酵素結合免疫吸着検定(ELISA)方法を用いて、ダイズ葉組織から可溶性の抽出可能な2mEPSPSタンパク質を測定した。
ダイズ組織の試料を試験植物から単離し、発現分析のために調製した。0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有する界面活性剤Tween20(PBST)を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、2mEPSPSタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。植物組織を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、サンドイッチ形式の2mEPSPS ELISAキットを用いて分析した。キットを、製造業者の推奨プロトコルに従って用いた。
ダイズイベント8264.44.06.1で発現安定性および遺伝率を垂直(世代間)および水平(同世代の系統の間)の両方で調査するために、検出分析を実施した。T4世代で、ダイズイベント8264.44.06.1の発現は全ての系統を通して安定で(分離せず)、一貫していた。圃場発現レベル試験をダイズイベント8264.44.06.1について実施した。全ての系統を通しての平均発現は、およそ5,000〜17,500ng/cmであった。これらの発現レベルは、2mEPSPSタンパク質を発現した陽性対照より高かった。
実施例2.3:植物組織でのPATタンパク質の発現
PATタンパク質のレベルを、ダイズイベント8264.44.06.1で判定した。定量的酵素結合免疫吸着検定(ELISA)方法を用いて、ダイズ葉組織から可溶性の抽出可能なPATタンパク質を測定した。
ダイズ組織の試料を試験植物から単離し、発現分析のために調製した。0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有する界面活性剤Tween20(PBST)を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、PATタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。植物組織を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、サンドイッチ形式のPAT ELISAキットを用いて分析した。キットを、製造業者の推奨プロトコルに従って用いた。
ダイズイベント8264.44.06.1で発現安定性および遺伝率を垂直(世代間)および水平(同世代の系統の間)の両方で調査するために、検出分析を実施した。T4世代で、ダイズイベント8264.44.06.1の発現は全ての系統を通して安定で(分離せず)、一貫していた。圃場発現レベル試験をダイズイベント8264.44.06.1について実施した。全ての系統を通しての平均発現は、およそ15〜25ng/cmであった。
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の挿入物および隣接ボーダー領域のDNA配列のクローニングおよび特徴づけ
ゲノム挿入部位を特徴づけて記載するために、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の隣接ゲノムT−DNAボーダー領域の配列を決定した。全体で、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1ゲノム配列の2,578bpが確認され、5’隣接ボーダー配列の570bp(配列番号1)、3’隣接ボーダー配列の1,499bp(配列番号2)を含む。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1ボーダー配列に基づくPCR増幅は、ボーダー領域がダイズ起源であり、接合部領域がイベントpDAB8264.44.06.1に特有な配列であることを確認した。接合部領域は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のイベント特異的同定のために用いることができた。さらに、野生型ダイズのゲノムから同定された隣接ボーダー配列の領域に対応するゲノム断片を増幅することによって、T鎖挿入部位を特徴づけた。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1と野生型ゲノム配列との比較により、元の遺伝子座から約4,357bpが欠失したことを明らかにした。全体として、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の挿入物およびボーダー配列の特徴づけは、T鎖の無傷のコピーがダイズゲノムに存在することを示した。
実施例3.1:ダイズゲノム配列の確認
5’および3’隣接ボーダーは、第6染色体からのダイズ(Glycine max)全ゲノムショットガン配列と整列し、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の導入遺伝子がダイズゲノムの第6染色体に挿入されたことを示している。ダイズゲノムからのダイズイベントpDAB8264.44.06.1導入遺伝子の挿入部位を確認するために、異なる対のプライマーでPCRを実行した(図2および表3)。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1および他のトランスジェニックであるか非トランスジェニックのダイズ系統からのゲノムDNAを、鋳型として用いた。したがって、5’ボーダー配列が正しいかどうかを確認するために、2mepsps遺伝子から5’末端ボーダー配列にわたるDNAセグメントを増幅するために、2mepsps特異的プライマー、例えばED_v1_C1(配列番号11)、ならびに、4406−WF1(配列番号3)および4406−WF3(配列番号5)と命名された、クローニングされた5’末端ボーダー配列および/またはダイズゲノム第6染色体の上のその整列配列によって設計された2つのプライマーを用いた。同様に、クローニングされた3’末端ボーダー配列の確認のために、pat遺伝子から3’末端ボーダー配列にわたるDNAセグメントを増幅するために、pat特異的プライマー、例えばPAT−12(配列番号12)、ならびに、4406−WR5(配列番号7)、4406−WR7(配列番号9)および4406−WR8(配列番号10)と命名された、クローニングされた3’末端ボーダー配列によって設計された3つのプライマーを用いた。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のゲノムDNAのみに由来する予測されたサイズのDNA断片は、1つのプライマーがダイズイベントpDAB8264.44.06.1の隣接ボーダーに位置し、1つが導入遺伝子特異的プライマーである各プライマー対を用いて増幅されたが、他のトランスジェニックダイズ系または非トランスジェニック対照のDNA試料からは増幅されなかった。これらの結果は、クローニングされた5’および3’ボーダー配列が、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のためのT鎖挿入物の隣接ボーダー配列であることを示す。
ダイズゲノムのDNA挿入をさらに確認するために、2つのダイズ配列にわたるPCR増幅を完了した。全導入遺伝子、5’末端ボーダー配列および3’ボーダー配列を含有するDNAセグメントを増幅するために、5’末端ボーダー配列によって設計された2つのプライマー、4406−WF1(配列番号3)および4406−WF3(配列番号5)、ならびに3’末端ボーダー配列のための2つのプライマー、4406−WR5(配列番号7)および4406−WR7(配列番号9)を用いた。予想通りに、4406−WF1(配列番号3)および4406−WR5(配列番号7)のプライマー対によるPCR増幅は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のゲノムDNAからおよそ12kbのDNA断片を増幅し、非トランスジェニックダイズ対照および他のダイズトランスジェニック系から6kbのDNA断片を増幅した。同様に、4406−WF3(配列番号5)および4406−WR7(配列番号9)のプライマー対で完了したPCR反応は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の試料からおよそ12kbのDNA断片を生成し、他の全てのダイズ対照系統から6kbのDNA断片を生成した。これらの結果は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の導入遺伝子がダイズゲノムの第6染色体の部位に挿入されたことを実証した。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の同定された5’および3’ボーダー配列と第6染色体からのダイズ(Glycine max)全ゲノムショットガン配列を整列することにより、元の遺伝子座から約4.4kbが欠失したことを明らかにした。(図3)。
サザンブロットによるダイズイベントpDAB8264.44.06.1の特徴づけ
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の組込みパターンを確立するために、サザンブロット分析を用いた。これらの実験は、ダイズゲノム内でのaad−12、patおよび2mepsps v1導入遺伝子の組込みおよび統合性を実証するデータを生成した。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1は、プラスミドpDAB8264からのaad−12、patおよび2mepsps v1 PTUの単一コピーを含有する、完全長の単純な組込みイベントと特徴づけられた。
サザンブロットデータは、T鎖断片がダイズイベントpDAB8264.44.06.1のゲノムに挿入されたことを示唆した。pDAB8264のT鎖組込み領域に含有されるaad−12、patおよび2mepsps v1挿入物に特異的なプローブ、ならびに、プラスミドの中に位置する切断部位を有し、プラスミドの内部のハイブリダイズする断片またはダイズゲノムDNAとのプラスミドの接合部(ボーダー断片)にわたる断片を生成する記載の制限酵素を用いて、詳細なサザンブロット分析を実行した。制限酵素とプローブの組合せのためのサザンハイブリダイゼーションから示される分子量は、そのイベントに特有のものであって、その同定パターンを確立した。これらの分析は、プラスミド断片が、aad−12、patおよび2mepsps v1 PTUの再配列なしでダイズゲノムDNAに挿入されたことも示した。
実施例4.1:ダイズ葉試料収集およびゲノムDNA(gDNA)単離
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1を含有する個々のダイズ植物から収集された葉組織から、ゲノムDNAを抽出した。さらに、aad−12および2mepsps v1遺伝子のないサブスタンス系統を表す遺伝的背景を含有する、従来のダイズ植物MaverickからgDNAを単離した。標準の臭化セチルトリメチルアンモニウムCTAB方法に従って、個々のゲノムDNAを凍結乾燥葉組織から抽出した。抽出の後、Pico Green試薬(Invitrogen、Carlsbad、CA)を用いて、DNAを分光蛍光分析により定量した。Pico Green分析からの値を確認し、次に、DNA特質を決定するためにDNAをアガロースゲルで可視化した。
実施例4.2:DNA消化および分離
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のサザンブロット分子特徴づけのために、10マイクログラム(10μg)のゲノムDNAを消化した。1μgのDNAにつきおよそ5単位の選択された制限酵素および対応する反応緩衝液を各DNA試料に加えることによって、ダイズpDAB8264.44.06.1および非トランスジェニックダイズ系統MeverickからのゲノムDNAを消化した。各試料は、およそ37℃で一晩インキュベートした。消化物のために、制限酵素BstZ17I、HinDIII、NcoI、NsiIおよびPacIを個々に用いた(New England Biolabs、Ipswich、MA)。さらに、プラスミドDNA、pDAB8264を非トランスジェニックダイズ品種MaverickからのゲノムDNAと組み合わせることによって、陽性のハイブリダイゼーション対照試料を調製した。試験試料と同じ手順および同じ制限酵素を用いて、プラスミドDNA/ゲノムDNAカクテルを消化した。消化を一晩インキュベートした後、NaClを0.1Mの最終濃度まで加え、消化されたDNA試料をイソプロパノールで沈殿させた。沈殿したDNAペレットを20μlの1×添加液(0.01%ブロムフェノールブルー、10.0mM EDTA、5.0%グリセロール、1.0mMトリスpH7.5)に再懸濁させた。次に、このDNA試料および分子サイズのマーカーを、0.85%アガロースゲルを介して0.4×TAE緩衝液(Fisher Scientific、Pittsburgh、PA)で35ボルトでおよそ18〜22時間電気泳動にかけて、断片の分離を達成した。ゲルを臭化エチジウム(Invitrogen、Carlsbad、CA)で染色し、紫外(UV)光の下でDNAを可視化した。
実施例4.3:サザン法および膜処理
サザンブロット分析は、事実上、Memelink, J.;Swords, K.;Harry J.;Hoge, C.;(1994年)Southern, Northern, and Western Blot Analysis、Plant Mol. Biol. Manual F1:1〜23頁に記載のように実施した。簡潔に述べると、DNA断片の電気泳動分離および可視化の後、0.25MのHClでおよそ20分間ゲルを脱プリンし、次に変性溶液(0.4MのNaOH、1.5MのNaCl)におよそ30分間、その後中和溶液(1.5MのNaCl、0.5MトリスpH7.5)に少なくとも30分間晒した。10×SSCによるウィッキング系を用いてナイロン膜の上でサザン転写を一晩実施した。転写の後、UV架橋によりDNAを膜に結合させ、続いて2×SSC溶液により簡単に膜洗浄した。この方法は、ハイブリダイゼーション用のサザンブロット膜を生成した。
実施例4.4:DNAプローブ標識化およびハイブリダイゼーション
ナイロン膜に結合したDNA断片は、標識プローブを用いて検出した。遺伝子エレメントに特異的なプライマーを用いて、プラスミドpDAB8264から増幅されたDNA断片中への、ジゴキシゲニン(DIG)標識ヌクレオチド[DIG−11]−dUTPのPCRをベースとした組込みによってプローブを生成した。PCR合成によるDNAプローブの生成は、製造業者の推奨手順に従ってPCR DIGプローブ合成キット(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)を用いて実行した。
標識プローブをアガロースゲル電気泳動によって分析して、それらの特質および量を決定した。次に、実質的にDIG Easy Hyb溶液(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)について記載した手順を用いて、特異的な断片の検出のために、ナイロン膜の上での標的DNAへのハイブリダイゼーションのために所望量の標識プローブを用いた。簡潔に述べると、固定されたDNAを含有するナイロン膜ブロットを2×SSCで簡単に洗浄し、ハイブリダイゼーションオーブン内で、およそ45〜55℃で約2時間、ハイブリダイゼーションボトルの中で20〜25mLの予熱したDIG Easy Hyb溶液でプレハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーション溶液を次にデカントし、およそ5分間水浴上で沸騰させることによって変性させた特異的プローブの所望量を含有する、およそ15mLの予熱したDIG Easy Hyb溶液と交換した。次に、ハイブリダイゼーションオーブン内でおよそ45〜55℃で一晩、ハイブリダイゼーション工程を実行した。
プローブハイブリダイゼーションの終わりに、プローブを含有するDIG Easy Hyb溶液を清潔なチューブにデカントし、およそ−20℃で保存した。製造業者の推奨手順に従って、これらのプローブは二度にわたって再利用することができた。膜のブロットを簡単に洗い落とし、室温でおよそ5分間、清潔なプラスチック容器の中で低ストリンジェンシー洗浄緩衝液(2×SSC、0.1%SDS)によって2回洗浄し、その後およそ65℃でそれぞれ15分間、高ストリンジェンシー洗浄緩衝液(0.1×SSC、0.1%SDS)で2回洗浄した。膜のブロットは、およそ5分間、DIG洗浄およびブロック緩衝液セット(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)からの1×マレイン酸緩衝液で簡単に洗浄した。この後に、1×ブロック緩衝液中で2時間のブロック、および同じく1×ブロック緩衝液中で最低30分間の抗DIG−AP(アルカリ性ホスファターゼ)抗体(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)とのインキュベーションが続いた。1×洗浄緩衝液による2〜3回の洗浄の後、特異的DNAプローブは膜ブロットに結合したままであり、CDP−Star化学発光核酸検出系(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)を製造業者の推奨に従って用いてDIG標識DNA標準を可視化した。1つまたは複数の時点についてブロットを化学発光フィルムに曝露させ、ハイブリダイズする断片を検出し、分子サイズ標準を可視化させた。フィルムをAll−Pro 100 Plusフィルム現像液(Konica Minolta、Osaka、Japan)で現像し、画像を走査した。各プローブについて検出されたバンドの数およびサイズを記録した(表5)。記載のようにDIG検出の後可視になるDIG標識DNA分子量マーカーII(DIGMWMII)およびDIG標識DNA分子量マーカーVII(DIGMWMVII)を用いて、サザンブロットでハイブリダイズする断片のサイズを決定した。
実施例4.5:サザンブロットの結果
aad−12および2mepspsPTUの既知の制限酵素部位に基づく、特定の消化物およびプローブで予想および観察された断片サイズを、表6に示す。予想された断片サイズはpDAB8264のプラスミドマップに基づき、観察された断片サイズはこれらの分析からの近似結果であり、DIG標識DNA分子量マーカーIIおよびマークVII断片の示されたサイズに基づく。
2種類の断片がこれらの消化物およびハイブリダイゼーションから同定された:既知の酵素部位がプローブ領域の側面に位置し、aad−12および2mepsps PTU PTUの挿入領域の中に完全に含有される内部断片、ならびに既知の酵素部位がプローブ領域の一方の末端に位置し、第2の部位がダイズゲノムで予想されるボーダー断片。ほとんどの場合、DNA断片組込み部位は各イベントに特有であるので、ボーダー断片サイズはイベントによって異なる。ボーダー断片は、組み込まれたDNAと比較した制限酵素部位の位置決めし、DNA挿入物の数を評価するための手段を提供する。イベントpDAB8264.44.06.1を含有するダイズの複数世代についてサザンブロット分析を完了させ、プラスミドpDAB8264からの低コピーの無傷のaad−12および2mepsps PTUがダイズイベントpDAB8264.44.06.1のダイズゲノムに挿入されていることを示唆するデータを生じた。
制限酵素NcoIおよびHinD IIIは、プラスミドpDAB8264の特有の制限部位に結合して切断する。その後、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のaad−12遺伝子挿入物を特徴づけるために、これらの酵素が選択された。4,078bpを超えるまたは3,690bpを超えるボーダー断片が、それぞれHinD IIIおよびNcoI消化の後、プローブとハイブリダイズすると予測された(表6)。HinD IIIおよびNcoIがそれぞれ用いられたとき、およそ7,400bpおよびおよそ3,800bpの単一のaad−12ハイブリダイゼーションバンドが観察された。このサイズのバンドへのプローブのハイブリダイゼーションは、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のダイズゲノムでのaad−12遺伝子のための単一の挿入部位の存在を示唆する。制限酵素BstZ17I、NsiIおよびPacIは、aad−12植物転写単位(PTU;プロモーター/遺伝子/ターミネーター)を含有する断片を放出するように選択された(表6)。予測されたおよそ5,000、およそ5,000およびおよそ6,800bpの断片は、それぞれBstZ17I、NsiIおよびPacIによる消化の後にプローブで観察された。pDAB8264.44.06.1試料の酵素消化と続くプローブハイブリダイゼーションで得られた結果は、プラスミドpDAB8264からの無傷のaad−12PTUがダイズイベントpDAB8264.44.06.1のダイズゲノムに挿入されていることを示した。さらに、HinDIII、NcoI、NsiIおよびBstZ17I制限断片に対して生じたハイブリダイゼーションバンドの分子量サイズは、aad−12PTUが、連結したpat PTUも含有したことを示す。
制限酵素BstZ17I、NcoIおよびNsiIは、プラスミドpDAB8264の制限部位に結合して切断する。その後、これらの酵素を選択して、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の2mepsps遺伝子挿入物を特徴づけた。4,858bpを超える、3,756bpを超える、または5,199bpを超えるボーダー断片は、それぞれBstZ17I、NcoIおよびNsiIによる消化の後にプローブとハイブリダイズすると予測された(表6)。BstZ17I、NcoIおよびNsiIがそれぞれ用いられたとき、およそ16,000bp、およそ6,100bpおよびおよそ5,300bpの単一の2mepspsハイブリダイゼーションバンドが観察された。このサイズのバンドへのプローブのハイブリダイゼーションは、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のダイズゲノムでの2mepsps遺伝子のための単一の挿入部位の存在を示唆する。制限酵素PacIは、2mepsps植物転写単位(PTU;プロモーター/遺伝子/ターミネーター)を含有する断片を放出するように選択された(表6)。PacIによる消化の後に、予測されたおよそ6,800bpの断片がプローブで観察された。pDAB8264.44.06.1試料の酵素消化と続くプローブハイブリダイゼーションで得られた結果は、プラスミドpDAB8264からの無傷の2mepsps PTUがダイズイベントpDAB8264.44.06.1のダイズゲノムに挿入されていることを示した。
実施例4.6:骨格配列の不在
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1でスペクチノマイシン抵抗性遺伝子(specR)、Ori Repエレメントおよび複製開始タンパク質trfA(trf Aエレメント)の不在を検証するために、サザンブロット分析も行った。適当な陽性対照(pDAB8264プラスMaverick)および陰性対照(Maverick)をサザン分析のために含める場合、スペクチノマイシン抵抗性、Ori Repエレメントまたはtrf Aエレメントには特異的なハイブリダイゼーションがないと予想される。HinD III消化およびspecR特異的プローブとのハイブリダイゼーションの後、およそ9,300bpの1つの予想サイズのバンドが、陽性対照試料(pDAB8264プラスmaverick)で観察されたが、陰性対照およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1の試料にはなかった。同様に、PacI消化およびOri Rep特異的プローブとtrfA特異的プローブとの混合物とのハイブリダイゼーションの後には、およそ9,200bpの1つの予想サイズのバンドが陽性対照試料(pDAB8264プラスmaverick)で検出されたが、陰性対照およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1の試料にはなかった。これらのデータは、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1でのスペクチノマイシン抵抗性遺伝子、Ori Repエレメントおよび複製開始タンパク質trfAの不在を示す。
耕種学、収量および除草剤耐性の評価
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の農業特性および除草剤耐性を、単一の生育段階の間に複数の地理的場所での収量試験で試験した。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1とMaverick対照植物との間で、農業上意味のある予想外の差は観察されなかった。試験の結果は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1が、Maverick対照植物と農業上同等であることを実証した。さらに、グリホサートと2,4−Dのタンクミックスを噴霧したとき、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1は強固な除草剤耐性を提供した。
各場所での全ての試験項目について以下の農業特性を測定し、記録した。
1)出芽:株立ち数を1メートルの区画に植えた種子数で割り、100を掛けることによって計算される。
2)V1時の苗活力:活力は、試験区の健康状態の全体的な推定値である。結果は0〜100%のスケールで評価し、0%は全て死植物の試験区を表し、100%は非常に健康そうな試験区を表す。
3)V3薬剤施用から1日、7日および14日後の全体的な視覚的作物傷害、クロロシスおよび壊死を評価した。2,4−D傷害の典型である上偏成長の全ての徴候について観察した。上偏成長は、葉および茎のねじれまたは下垂として表される。全ての作物傷害は0〜100%スケールを用い、0%は傷害なしを示し、100%は完全な植物死を示す。
4)開花日:この測定では、試験区での植物の50%が開花し始める日を記録する。各試験区で植えてから植物の50%が開花したときまでの日数を記録した。
5)R2またはR1時の株立ち数:1試験区につき1うねの代表的な1メートル区画での植物数を数え、R2またはR1生育段階に記録することによって判定される、各試験区での平均の植物活力の視覚的推定値である。
6)R2薬剤施用から1日、7日および14日後の全体的な視覚的作物傷害、クロロシスおよび壊死を評価した。2,4−D傷害の典型である上偏成長の全ての徴候について観察した。上偏成長は、葉および茎のねじれまたは下垂として表される。全ての作物傷害は0〜100%スケールを用い、0%は傷害なしを示し、100%は完全な植物死を示す。
7)R6生育段階の病害発生率:試験区での病害の程度を記録するために病害発生率の視覚的推定値を用いる。0〜100%のスケールで評価する。0%は病害が存在しないことを示し、100%は試験区の全ての植物が罹病したことを示す。
8)R6生育段階の虫害:試験区での虫害の程度を記録するために虫害の視覚的推定値を用いる。昆虫による傷害を受けた試験区の植物組織の百分率を、0〜100%スケールを用いて記録した。0%は虫害が存在しないことを示し、100%は試験区の全ての植物が虫害を受けたことを示す。
9)老化時の草高:各試験区の植物の平均高を記録した。葉が落ちた後、植物を土壌表面から先端まで測定した。測定値は、センチメートルで記録した。試験区が倒伏した場合は、代表的な植物群を立ち上げて測定値を得た。
10)成熟までの日数。試験区のさやの95%が生理的成熟に到達し、植物が干乾びた色であった日を記録した。植えてからの経過日数を計算した。
11)倒伏:収穫時に倒伏程度の視覚的推定値を記録した。0〜100%スケールで記録し、0%は倒伏なしを示し、100%は試験区の全ての植物が地面にひれ伏したことを示す。
12)脱粒:収穫時にさやの脱粒の視覚的推定値を記録した。試験区ごとに脱粒を起こしたさやの百分率の推定値として記録した。0〜100%スケールを用い、0%は脱粒なしを示し、100%は全てのさやが脱粒を起こしたことを示す。
13)収量:各試験区から収集した穀物の重量を記録した。2うねの試験区全体を収穫して、種子重量および水分を記録した。13%の水分に調整することによって、ブッシェル/エーカーを計算した。
14)100粒重:各試験区について、100粒の種子を数え、重量をグラムで記録した。
2重量%の硫酸アンモニウム(AMS)を混合した、2,4−Dとグリホサートのタンクミックスの2,185g ae/ヘクタールでの噴霧の施用後、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の除草剤耐性を調べた。除草剤は、V3/R2逐次的除草剤処理として噴霧した。この除草剤処理は、発達のV3生育段階のダイズ植物に噴霧し、続いて発達のR2生育段階の第2の逐次的噴霧よって完了した。V3生育段階は、単葉および最初の3つの三小葉の葉が完全に展開したときに特徴づけられる。R2生育段階は、完全に展開した葉のついた主幹の2つの最上節の1つでの単一の開花を特徴とする。
これらの試験は、処理ごとに4反復の無作為化された完備型ブロック計画を用いて設定された。各試験区は2うね幅であり、うねは30インチ間隔であった。試験区には、試験区の間に2.5〜3.0フィートの通路を設けて、全長12.5フィートに植えた。Maverick対照植物は除草剤施用によって死滅すると予想され、したがってそれらはトランスジェニックダイズ植物のうねから離れた別の試験区で生育させた。
噴霧されなかったダイズイベントpDAB8264.44.06.1と比較した、2,4−Dとグリホサートの除草剤タンクミックスを噴霧したダイズイベントpDAB8264.44.06.1の結果を要約する。表7は、2,4−Dとグリホサートのタンクミックスを噴霧したダイズイベントpDAB8264.44.06.1と噴霧されなかったダイズイベントpDAB8264.44.06.1を比較する分析からの平均値を提示する。除草剤施用はダイズイベントpDAB8264.44.06.1に傷害を及ぼさず、これらの植物は、表7に記載される報告された農業特性に関して、噴霧されなかったダイズイベントpDAB8264.44.06.1植物と比較して同等の成績を挙げた。発達のV3段階での1および7daa(噴霧後日数)ならびに発達のR2段階での1、7および14daa時の一部の初期の一過性傷害を除いては、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1は、2,4−Dとグリホサートのタンクミックスに強固な耐性を示した。対照的に、Maverick植物のいずれも除草剤噴霧処理の後に生存していなかった。
対照系統Maverickと比較したダイズイベントpDAB8264.44.06.1の耕種学的同等性を調べた。これらの試験は、2反復のブロック計画を用いて設定された。各試験区は2うね幅であり、うねは30インチ間隔であった。試験区には、試験区の間に2.5〜3.0フィートの通路を設けて、全長12.5フィートに植えた。
表8は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の耕種学的同等性を対照系統Maverickと比較する分析からの平均値を提示する。耕種学的データは、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1がMaverick植物と同等の成績を挙げ、農業上意味のある予想外の差をもたらさないことを示す。
イベント特異的なTaqManアッセイ
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の存在を検出して、育種集団で植物の接合性状態を判定するために、2つのイベント特異的なTAQMANアッセイを開発した。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1は、二成分ベクターpDAB8264のT鎖を含有する(図1)。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の特異的検出のために、特異的なTaqmanプライマーおよびプローブを、5’(配列番号14)または3’(配列番号15)の挿入物−植物接合部に位置するDNA配列によって設計した(図4)。その5’末端にFAMリポーターを含有する、Applied Biosystems(ABI)によって合成された2つのプライマーおよび標的特異的MGBプローブを用いて、5’組込み接合部にわたる98bpのDNA断片(配列番号16)を特異的に検出するように、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のための1つのイベント特異的アッセイを設計した。その5’末端にFAMリポーターを含有する、ABIによって合成された2つの特異的プライマーおよび標的特異的MGBプローブを用いて、3’組込み接合部にわたる131bpのDNA断片(配列番号17)を特異的に標的にするように、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のための別のイベント特異的アッセイを設計した。2mEPSPSおよびaad−12PTUを含有する11個の異なるイベント、ならびにダイズ特異的内在性参照遺伝子GMFL01−25−J19(ダイズ(Glycine max)cDNA、GenBank:AK286292.1)との二重形式での対照非トランスジェニックダイズ品種(Maverick)に対して、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のためのこのTaqman検出方法の特異性を試験した。
実施例6.1:gDNA単離
11個の異なるダイズイベントおよび非トランスジェニックダイズ品種のgDNA試料をこの試験で試験した。改変Qiagen MagAttract植物DNAキット(Qiagen、Valencia、CA)を用いてゲノムDNAを抽出した。gDNA抽出のために、1試料につき8個の新鮮なダイズ葉ディスクを用いた。販売会社の指示(Molecular Probes、Eugene、OR)に従って、gDNAをPico Green法で定量した。この試験のために、DNA分解酵素を含まない水で試料を希釈して、10ng/μLの濃度をもたらした。
実施例6.2:Taqmanアッセイおよび結果
特異的なTaqmanプライマーおよびプローブを、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1特異的Taqmanアッセイのために設計した。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の中で導入遺伝子を検出するために、これらの試薬は下記の条件で用いることができる。表9は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の検出のために特に開発されたプライマーおよびプローブ配列を記載する。
増幅のための多重PCR条件は、以下の通りである:10μlの全反応液中に、1×ロシュPCR緩衝液、0.4μMイベント特異的フォワードプライマー、0.4μMイベント特異的リバースプライマー、0.4μMプライマーGMS116F、0.4μMプライマーGMS116R、0.2μMイベント特異的プローブ、0.2μM GMS116プローブ、0.1%PVP、20ng gDNA。以下の条件を用いてこのカクテルを増幅した:i)95℃で10分間、ii)95℃で10秒間、iii)60℃で30秒間、iv)72℃で1秒間、v)ステップii〜ivを35サイクル繰り返す、v)40℃を保持。リアルタイムPCRを、Roche LightCycler 480で実行した。データ分析は、蛍光の変化率がその最大値に到達するときのPCRサイクル数である、LightCycler 480ソフトウェアで判定された交差点(Cp値)の測定に基づいた。
2mEPSPSおよびaad−12PTUを含有する11個の異なるイベント、ならびにダイズ特異的内在性参照遺伝子GMFL01−25−J19(GenBank:AK286292.1)との二重形式での非トランスジェニックダイズ品種に対して、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のためのTaqman検出方法を試験した。アッセイは、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1を特異的に検出し、対照(すなわち、2mEPSPSおよびaad−12PTUを含有する11個の異なるイベントならびに非トランスジェニックダイズ品種)からいかなる偽陽性結果も生成または増幅しなかった。イベント特異的なプライマーおよびプローブは、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の検出のために用いることができ、これらの条件および試薬は接合性アッセイに適用できる。
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の完全長配列
配列番号27は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の完全長配列を提供する。この配列は、5’ゲノム隣接配列、pDAB8264からの組み込まれたT鎖挿入物および3’ゲノム隣接配列を含有する。配列番号27に関して、残基1〜1494は5’ゲノム隣接配列であり、残基1495〜1497は3つの塩基対挿入であり、残基1498〜11,774はpDAB8264T鎖挿入物であり、残基11,775〜13,659は3’隣接配列である。したがって、挿入物の5’末端に関する接合部配列または移行は、配列番号27の残基1494〜1495において起こる。したがって、挿入物の3’末端に関する接合部配列または移行は、配列番号27の残基11,774〜11,775において起こる。配列番号27は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1のポリヌクレオチド配列であり、それは、PCR増幅反応を介して生成され、ABI Big Dye(登録商標)ターミネーター配列決定反応キット(Applied Biosystems、Foster City、CA)を用いて配列決定された複数のPCRコンティグのアラインメントから組み立てられた。
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1およびダイズ昆虫耐性イベントpDAB9582.812.9.1の育種スタック
実施例8.1:ダイズイベントpDAB8264.44.06.1とダイズ昆虫耐性イベントpDAB9582.812.9.1の有性交配
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1を、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1と有性的に交配した。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の葯をダイズイベントpDAB9582.812.9.1の柱頭全体に手でこすりつけ、それによってダイズイベントpDAB9582.812.9.1を受精させた。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方からの組込みイベントを含有している生じたF1後代を、2,4−Dおよびグリホサート除草剤への耐性についてスクリーニングして、両方の組込みイベントを含有する後代植物を同定した。次に、F1後代植物を自家受精させてF2子孫を生成し、それは両イベントに関して独立して分離することが確認された。F2植物に、2,4−D(1120g ae/ヘクタール)およびグリホサート(1120g ae/ヘクタール)の両方を含有する除草剤を一回噴霧施用した。両イベントに関してホモ接合である植物を同定するために、Taqmanの接合性をベースとしたアッセイを用いて生じたF2植物をスクリーニングした。これらのF2ホモ接合植物の自家受粉は、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方についてホモ接合であったF3子孫を生成した。生じたイベントは、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.4406.1と表示した。
実施例8.2:ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の接合性状態の判定
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1およびダイズイベントpDAB9582.812.9.1の育種交配から生成された植物の接合性状態を判定するために、別々のイベント特異的なTAQMAN(登録商標)アッセイを開発して、pDAB9582.812.9.1またはpDAB8264.44.06.1のいずれかの組込みイベントの存在を検出した。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方を含有し、両イベントに関してホモ接合である個体植物を同定するために、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の育種交配の自家受精から生成された分離するF2植物を、これらのイベント特異的なTAQMAN(登録商標)アッセイで試験した。
gDNA単離
ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの分離するF2植物からのgDNA試料を、この試験で試験した。1植物につき4枚の新鮮なダイズ葉ディスクを、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの3,187個の分離するF2植物から収集した。改変Qiagen MagAttract植物DNAキット(登録商標)(Qiagen、Valencia、CA)を用いて、これらの試料からゲノムDNAを抽出した。
TAQMAN(登録商標)アッセイおよび結果
ダイズイベントpDAB9582.812.9.1(米国特許仮出願第61/471845号)およびpDAB8264.44.06.1(上記)のための個々のイベント特異的アッセイの使用のために、前述のTAQMAN(登録商標)プライマーおよびプローブを設計した。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの中に含まれる各組込みイベントの接合性を判定するために、これらの試薬を下記の条件で用いた。
増幅のための多重PCR条件は、以下の通りである:10μlの全体の反応液中に、1×ロシュPCR緩衝液、0.4μMイベントpDAB8264.44.06.1特異的フォワードプライマー、0.4μMイベントpDAB8264.44.06.1特異的リバースプライマー、0.4μMイベントpDAB9582.812.9.1特異的フォワードプライマー、0.4μMイベントpDAB9582.812.9.1特異的リバースプライマー、0.4μMプライマーGMS116F、0.4μMプライマーGMS116R、0.2μMイベントpDAB9582.812.9.1特異的プローブ、0.2μMイベントpDAB8264.44.06.1特異的プローブ、0.2μM GMS116プローブ、0.1%PVP、20ng gDNA。以下の条件を用いてこのカクテルを増幅した:i)95℃で10分間、ii)95℃で10秒間、iii)60℃で30秒間、iv)72℃で1秒間、v)ステップii〜ivを35サイクル繰り返す、v)40℃を保持。リアルタイムPCRを、Roche LightCycler(登録商標)480で実行した。データ分析は、蛍光の変化率がその最大値に到達するときのPCRサイクル数である、LightCycler(登録商標)480ソフトウェアで判定された交差点(Cp値)の測定に基づいた。
ダイズイベントpDAB9582.812.9.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方に関して個々の植物の接合性を判定するために、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の育種交配から生成された合計3,187個の分離するF2植物を、イベント特異的TAQMAN(登録商標)アッセイで試験した。これらのアッセイからの結果は、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方が2,360個体の植物に存在し、検出されたことを示した。各組込みイベントの接合性状態(倍数性レベルとしても記載される)を、表9bに示す。2,360個体の同定された植物のうち、237個体は2コピーのダイズイベントpDAB9582.812.9.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1を含有すると判定された。
実施例8.3:ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックでのタンパク質発現の特徴づけ
ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで発現される組換え体Cry1F、Cry1Ac、AAD12、2mEPSPSおよびPATタンパク質の生化学的性質を特徴づけた。PATの発現を定量するために、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)を用いた。比較上、Meso−Scale Discovery(MSD、Gaithersburg、Maryland)からの電気化学発光技術を利用して、多重化イムノアッセイによってCry1Ac/Cry1FおよびAAD12/2mEPSPSタンパク質を定量した。総合すると、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックでのこれらのタンパク質の生化学的性質を特徴づけ、その強固な発現を確認するために、これらのアッセイを用いた。
植物組織でのPATタンパク質の発現
PATタンパク質のレベルは、F3ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで判定され、それらはイベントpDAB9582.812.9.1とイベントpDAB8264.44.06.1の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1から発現されたPATタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1と比較した。
可溶性の抽出可能なPATタンパク質をダイズ葉組織から得、定量的ELISA方法(APS 014、Envirologix、Portland、ME)を用いて測定した。単葉からV1段階の温室で育てた試験植物からダイズ葉組織の試料を単離し、発現分析のために調製した。界面活性剤Tween20(PBST)および1%のポリビニルピロリドン40(PVP−40)を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、PATタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。次に、GenoGrinder(登録商標)を1500rpmで5分間用いて、試料を抽出した。植物抽出物を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、サンドイッチ形式のPAT ELISAキットを用いて分析した。キットを、製造業者の推奨プロトコル(Envirologix、Portland、ME)に従って用いた。
ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の発現および遺伝率を調査するために、検出分析を実施した。育種スタック、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1のF3世代は、親のイベントpDAB9582.812.9.1およびpDAB8264.44.06.1のいずれよりも高い濃度でPATを発現した。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1育種スタックでのPAT濃度の増加が予想された。PATのより高い濃度は、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1が親のイベントのいずれと比較してもpatコード配列のコピーを2倍多く含有する結果である(表10)。
植物組織でのCry1FおよびCry1Acタンパク質の発現
Cry1FおよびCry1Acタンパク質のレベルは、F3ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで判定され、それらはイベントpDAB9582.812.9.1とイベントpDAB8264.44.06.1の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1から発現されたCry1FおよびCry1Acタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1と比較した。
可溶性の抽出可能なCry1FおよびCry1Acタンパク質をダイズ葉組織から得、多重化電気化学発光MSDアッセイを用いて測定した。単葉からV1段階の温室で育てた植物からダイズ葉組織の試料を単離し、発現分析のために調製した。界面活性剤Tween20(PBST)および1%のポリビニルピロリドン40(PVP−40)を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、Cry1FおよびCry1Acタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。次に、GenoGrinder(登録商標)を1500rpmで5分間用いて、試料を抽出した。植物抽出物を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、Meso−Scale DiscoveryからのCry1F/Cry1Ac多重MSDアッセイを用いて分析した。キットを、製造業者の勧めるプロトコルに従って用いた。
ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の発現および遺伝率を調査するために、検出分析を実施した。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックのF3世代は、親のダイズイベントpDAB9582.812.9.1よりも高い濃度でCry1FおよびCry1Acタンパク質を発現した。(表11)。これらの結果は、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1植物が、親の系統、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1から受け継いだcry1Fおよびcry1Acコード配列の機能的に発現するコピーを含有したことを示す。
植物組織でのAAD12および2mEPSPSタンパク質の発現
AAD12および2mEPSPSタンパク質のレベルは、F3ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで判定され、それらはイベントpDAB9582.812.9.1とイベントpDAB8264.44.06.1の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1から発現されたAAD12および2mEPSPSタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1と比較した。
可溶性の抽出可能なAAD12および2mEPSPSタンパク質をダイズ葉組織から得、多重化電気化学発光MSDアッセイを用いて測定した。単葉からV1段階の温室で育てた植物からダイズ葉組織の試料を単離し、発現分析のために調製した。界面活性剤Tween20(PBST)および1%のポリビニルピロリドン40(PVP−40)を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、AAD12および2mEPSPSタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。次に、GenoGrinder(登録商標)を1500rpmで5分間用いて、試料を抽出した。植物抽出物を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、Meso−Scale DiscoveryからのAAD12および2mEPSPS多重MSDアッセイを用いて分析した。キットを、製造業者の勧めるプロトコルに従って用いた。
ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の発現および遺伝率を調査するために、検出分析を実施した。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックのF3世代は、親のダイズイベントpDAB8264.44.06.1よりも高い濃度でAAD12および2mEPSPSタンパク質を発現した。(表12)。これらの結果は、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1植物が、親の系統、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1から受け継いだaad−12および2mEPSPSコード配列の機能的に発現するコピーを含有することを示した。
実施例8.4:ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの除草剤耐性
育種スタック、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の除草剤耐性を、2生育期の間検定した。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1種子を植え、成熟するまで生育させた。成熟した植物に、2,4−Dおよびグリホサートの組合せからなった除草剤を一回噴霧施用した。これらの除草剤に対して生じた耐性は、生存植物数を数えることによって測定した。比較上、aad−12および2mEPSPS遺伝子を含有せず、2,4−Dおよびグリホサート除草剤の施用に感受性であると予想された対照植物が、試験に含まれた。
最初のシーズンには、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックのF2分離系統の120個の圃場生育試験区で、除草剤耐性を調べた。各試験区は1うね幅であり、うねは30インチ間隔であった。試験区は、試験区の間に4.5フィートの通路を設け、12フィートの中心(全長7.5フィートに植えた)に植えた。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックのF2分離系統からの合計4,364個体の植物に、2,4−Dとグリホサートの混合液を噴霧した(1120g ae/ヘクタール)。グリホサート/2,4−D除草剤の一回の噴霧施用は、V3とV4生育段階との間に行った。V3生育段階は、単葉および最初の3枚の三葉葉が完全に展開することで特徴づけられ、V4生育段階は、単葉および最初の4枚の三葉葉が完全に展開することで特徴づけられる。除草剤処理が完了した後、試験区を観察し、3,234個体の植物が除草剤施用に耐性であると同定された。除草剤施用に感受性であったダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1植物は、pDAB8264.44.06.1組込みイベントのメンデル分離の結果として、aad−12および2mEPSPSのコピーを含有していなかった。
第2のシーズンには、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の温室で育てたF3ホモ接合植物で除草剤耐性を調べた。ダイズ植物を、1ポットに1つの植物を含有する4インチポットにおいて生育させた。合計15個体のF3ホモ接合植物に、2,4−Dおよびグリホサート(840ae/ヘクタール)を一回噴霧施用した。15個体の植物は全て除草剤の噴霧後に生存し、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1植物が除草剤グリホサートおよび2,4−Dの施用に耐性であることを示した。
要約すると、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1親系統に存在したaad−12および2mEPSPS遺伝子は、2,4−Dおよびグリホサート除草剤への耐性を付与した。これらの形質はダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1で継承され、受け継がれ、それによってダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1に除草性耐性を提供した。比較上、aad−12および2mEPSPS遺伝子を含有しない対照植物は、2,4−Dおよびグリホサート除草剤の施用に感受性であった。
実施例8.5:ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.4406.1の殺虫活性の特徴づけ
cry1Acおよびcry1F導入遺伝子の発現からもたらされた、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの殺虫性耐性を特徴づけるために、温室内評価を実施した。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1を、アンチカルシア・ゲンマタリス(Anticarsia gemmatalis)(ベルベットビーンキャタピラー)およびシュードプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens)(ダイズルーパ)を含む実験室内飼育ダイズ害虫に対して試験した。ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックを、非形質転換ダイズ品種Maverickに加えて親のダイズイベント(ダイズイベントpDAB9582.812.9.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1)と比較した。この比較は、Cry1FおよびCry1Acタンパク質によって提供される植物保護のレベルが、ダイズ植物のゲノムにさらなる導入遺伝子を導入した育種スタックに存在するかどうか判定するために行った。さらに、除草剤の施用がCry1FおよびCry1Acタンパク質によって提供される昆虫からの植物の保護に何らかの効果を有するかどうか判定するために、昆虫バイオアッセイの前に、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方の育種スタックに、2,4−Dおよびグリホサートを含有する除草剤を一回噴霧施用した(840g ae/ヘクタール)。
温室内試験を、およそ3週間目の植物で行った。
ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタック、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1および陰性対照;除草剤を噴霧したダイズイベントpDAB8264.44.06.1およびMaverickを評価するために、10個体の植物を各々用いた。合計30枚の葉ディスク/植物/昆虫種に対して各昆虫種(アンチカルシア・ゲンマタリス(Anticarsia gemmatalis)およびクリソデイキシス(Chrysodeixis)(旧称シュードプルシア(Pseudoplusia))・インクルデンス(includens))を試験するため、各植物から葉を3回打ち抜いた。1.4cm直径(または1.54cm)の葉パンチを2%素寒天の上の試験領域に置き、1匹の新生子幼虫を寄生させ、有孔のプラスチックふたで密封した。寄生させてから4日後に死亡率および葉の消費を評価した。軽く突いても応答しなかった幼虫は、死虫とみなされた。昆虫によって消費された葉パンチの百分率を視覚的に評価することによって、葉の傷害を調べた。JMP(登録商標)Pro9.0.1(2010 SAS Institute Inc.、Cary、NC)を用いて、データの統計分析を実施した。
これらの反復実験から得られた結果(表13)は、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックのCry1FおよびCry1Acタンパク質によって提供された昆虫保護のレベルおよび死亡率が、親のダイズイベントpDAB9582.812.9.1と一貫していたことを示した。予想された通り、試験した全ての昆虫について、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1(58〜76%)およびMaverick(79〜91%)対照植物より有意に低い虫害(0.10〜0.15%)を維持した。さらに、cry1Fおよびcry1Acコード配列を含有した全てのダイズイベントで高い昆虫死亡率(100%)が記録されたが、陰性対照、MaverickおよびダイズイベントpDAB8264.44.06.1は10%未満の昆虫死亡率であった。したがって、ダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1は、親のダイズイベントpDAB9582.812.9.1と同等レベルの殺虫活性由来の保護を提供した。
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1およびダイズ昆虫耐性イベントpDAB9582.814.19.1の育種スタック
実施例9.1:ダイズイベントpDAB8264.44.06.1とダイズ昆虫耐性イベントpDAB9582.814.19.1の有性交配
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1を、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1と有性的に交配した。ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の葯をダイズイベントpDAB9582.814.19.1の柱頭全体に手でこすりつけ、それによってダイズイベントpDAB9582.814.19.1を受精させた。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方からの組込みイベントを含有している生じたF1後代を、2,4−Dおよびグリホサート除草剤への耐性についてスクリーニングして、両方の組込みイベントを含有する後代植物を同定した。次に、F1後代植物を自家受精させてF2子孫を生成し、それは両イベントに関して独立して分離することが確認された。F2植物に、2,4−D(840g ae/ヘクタール)およびグリホサート(840g ae/ヘクタール)の両方を含有する除草剤を一回噴霧施用した。両イベントに関してホモ接合である植物を同定するために、Taqmanの接合性をベースとしたアッセイを用いて生じたF2植物をスクリーニングした。これらのF2ホモ接合植物の自家受粉は、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方についてホモ接合であったF3子孫を生成した。生じたイベントは、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.4406.1と表示した。
実施例9.2:ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の接合性状態の判定
ダイズイベントpDAB8264.44.06.1とダイズイベントpDAB9582.814.19.1の育種交配から生成された植物の接合性状態を判定するために、別々のイベント特異的なTAQMAN(登録商標)アッセイを開発して、pDAB9582.814.19.1またはpDAB8264.44.06.1のいずれかの組込みイベントの存在を検出した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方を含有し、両イベントに関してホモ接合である個体植物を同定するために、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の育種交配の自家受精から生成された分離するF2植物を、これらのイベント特異的なTAQMAN(登録商標)アッセイで試験した。
gDNA単離
ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの分離するF2植物からのgDNA試料を、この試験で試験した。1植物につき4枚の新鮮なダイズ葉ディスクを、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの37個の分離するF2植物から収集した。改変Qiagen MagAttract植物DNAキット(登録商標)(Qiagen、Valencia、CA)を用いて、これらの試料からゲノムDNAを抽出した。
TAQMAN(登録商標)アッセイおよび結果
ダイズイベントpDAB9582.814.19.1(米国特許仮出願第61/471845号)およびpDAB8264.44.06.1(上記)のための個々のイベント特異的アッセイの使用のために、前述のTAQMAN(登録商標)プライマーおよびプローブを設計した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの中に含まれる各組込みイベントの接合性を判定するために、これらの試薬を下記の条件で用いた。
増幅のための多重PCR条件は、以下の通りである:10μlの全体の反応液中に、1×ロシュPCR緩衝液、0.4μMイベントpDAB8264.44.06.1特異的フォワードプライマー、0.4μMイベントpDAB8264.44.06.1特異的リバースプライマー、0.4μMイベントpDAB9582.814.19.1特異的フォワードプライマー、0.4μMイベントpDAB9582.814.19.1特異的リバースプライマー、0.4μMプライマーGMS116F、0.4μMプライマーGMS116R、0.2μMイベントpDAB9582.814.19.1特異的プローブ、0.2μMイベントpDAB8264.44.06.1特異的プローブ、0.2μM GMS116プローブ、0.1%PVP、20ng gDNA。以下の条件を用いてこのカクテルを増幅した:i)95℃で10分間、ii)95℃で10秒間、iii)60℃で30秒間、iv)72℃で1秒間、v)ステップii〜ivを35サイクル繰り返す、v)40℃を保持。リアルタイムPCRを、Roche LightCycler(登録商標)480で実行した。データ分析は、蛍光の変化率がその最大値に到達するときのPCRサイクル数である、LightCycler(登録商標)480ソフトウェアで判定された交差点(Cp値)の測定に基づいた。
ダイズイベントpDAB9582.814.19.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方に関して個々の植物の接合性を判定するために、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の育種交配から生成された合計37個の分離するF2植物を、イベント特異的TAQMAN(登録商標)アッセイで試験した。これらのアッセイからの結果は、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1とダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方が23個体の植物に存在し、検出されたことを示した。各組込みイベントの接合性状態(倍数性レベルとしても記載される)を、表14に示す。23個体の同定された植物のうち、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1を2コピー含有する1個体が同定された。
実施例9.3:ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックでのタンパク質発現の特徴づけ
ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで発現される組換え体Cry1F、Cry1Ac、AAD12、2mEPSPSおよびPATタンパク質の生化学的性質を特徴づけた。PATの発現を定量するために、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)を用いた。比較上、Meso−Scale Discovery(MSD、Gaithersburg、Maryland)からの電気化学発光技術を利用して、多重化イムノアッセイによってCry1Ac/Cry1FおよびAAD12/2mEPSPSタンパク質を定量した。総合すると、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックでのこれらのタンパク質の生化学的性質を特徴づけ、その強固な発現を確認するために、これらのアッセイを用いた。
植物組織でのPATタンパク質の発現
PATタンパク質のレベルは、F3ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで判定され、それらはイベントpDAB9582.814.19.1とイベントpDAB8264.44.06.1の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1から発現されたPATタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1と比較した。
可溶性の抽出可能なPATタンパク質をダイズ葉組織から得、定量的ELISA方法(APS 014、Envirologix、Portland、ME)を用いて測定した。単葉からV1段階の温室で育てた試験植物からダイズ葉組織の試料を単離し、発現分析のために調製した。界面活性剤Tween20(PBST)および1%のポリビニルピロリドン40(PVP−40)を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、PATタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。次に、GenoGrinder(登録商標)を1500rpmで5分間用いて、試料を抽出した。植物抽出物を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、サンドイッチ形式のPAT ELISAキットを用いて分析した。キットを、製造業者の勧めるプロトコル(Envirologix、Portland、ME)に従って用いた。
ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の発現および遺伝率を調査するために、検出分析を実施した。育種スタック、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1のF3世代は、親のイベントpDAB9582.814.19.1およびpDAB8264.44.06.1のいずれよりも高い濃度でPATを発現した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1育種スタックでのPAT濃度の増加が予想された。PATのより高い濃度は、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1が親のイベントのいずれと比較してもpatコード配列のコピーを2倍多く含有する結果である(表15)。
植物組織でのCry1FおよびCry1Acタンパク質の発現
Cry1FおよびCry1Acタンパク質のレベルは、F3ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで判定され、それらはイベントpDAB9582.814.19.1とイベントpDAB8264.44.06.1の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1から発現されたCry1FおよびCry1Acタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1と比較した。
可溶性の抽出可能なCry1FおよびCry1Acタンパク質をダイズ葉組織から得、多重化電気化学発光MSDアッセイを用いて測定した。単葉からV1段階の温室で育てた植物からダイズ葉組織の試料を単離し、発現分析のために調製した。界面活性剤Tween20(PBST)および1%のポリビニルピロリドン40(PVP−40)を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、Cry1FおよびCry1Acタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。次に、GenoGrinder(登録商標)を1500rpmで5分間用いて、試料を抽出した。植物抽出物を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、Meso−Scale DiscoveryからのCry1F/Cry1Ac多重MSDアッセイを用いて分析した。キットを、製造業者の勧めるプロトコルに従って用いた。
ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の発現および遺伝率を調査するために、検出分析を実施した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックのF3世代は、親のダイズイベントpDAB9582.814.19.1よりも高い濃度でCry1Acタンパク質を発現した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックのF3世代は、親のダイズイベントpDAB9582.814.19.1よりも低い濃度でCry1Fタンパク質を発現した。(表16)。発現レベルの変動はあったものの、これらの結果は、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1植物が、親の系統、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1から受け継いだcry1Fおよびcry1Acコード配列の機能的に発現するコピーを含有したことを示す。
植物組織でのAAD12および2mEPSPSタンパク質の発現
AAD12および2mEPSPSタンパク質のレベルは、F3ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックで判定され、それらはイベントpDAB9582.814.19.1とイベントpDAB8264.44.06.1の両方の組込みに関してホモ接合であると同定された。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1から発現されたAAD12および2mEPSPSタンパク質のレベルを、親のイベント、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1と比較した。
可溶性の抽出可能なAAD12および2mEPSPSタンパク質をダイズ葉組織から得、多重化電気化学発光MSDアッセイを用いて測定した。単葉からV1段階の温室で育てた植物からダイズ葉組織の試料を単離し、発現分析のために調製した。界面活性剤Tween20(PBST)および1%のポリビニルピロリドン40(PVP−40)を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、AAD12および2mEPSPSタンパク質をダイズ植物組織から抽出した。次に、GenoGrinder(登録商標)を1500rpmで5分間用いて、試料を抽出した。植物抽出物を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適当な緩衝液で希釈し、Meso−Scale DiscoveryからのAAD12および2mEPSPS多重MSDアッセイを用いて分析した。キットを、製造業者の勧めるプロトコルに従って用いた。
ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の発現および遺伝率を調査するために、検出分析を実施した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックのF3世代は、親のダイズイベントpDAB8264.44.06.1よりも低い濃度でAAD12および2mEPSPSタンパク質を発現した。(表17)。発現レベルの変動はあったものの、これらの結果は、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1植物が、親の系統、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1から受け継いだaad−12および2mEPSPSコード配列の機能的に発現するコピーを含有することを示した。
実施例9.4:ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックの除草剤耐性
育種スタック、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の除草剤耐性を検定した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の種子を温室内試験で播種し、成熟植物体に2,4−Dとグリホサートの組合せからなる除草剤を一回噴霧施用した。これらの除草剤に対して生じた耐性は、生存植物数を数えることによって測定した。比較上、aad−12および2mEPSPS遺伝子を含有せず、2,4−Dおよびグリホサート除草剤の施用に感受性であると予想された対照植物が、試験に含まれた。
ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の温室で育てたF2植物で除草剤耐性を調べた。ダイズ植物は、1ポットに1つの植物を含有する4インチポットにおいて生育させた。単葉生育段階の合計37個体のF3ホモ接合植物に、2,4−Dおよびグリホサート(840ae/ヘクタール)を一回噴霧施用した。25個体の植物は全て除草剤の噴霧後に生存し、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1植物が除草剤グリホサートおよび2,4−Dの施用に耐性であることを示した。
要約すると、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1親系統に存在したaad−12および2mEPSPS遺伝子は、2,4−Dおよびグリホサート除草剤への耐性を付与した。これらの形質はダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1に継承され、受け継がれ、それによってダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1に除草性耐性を提供した。除草剤施用に感受性であったダイズイベントpDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1植物は、pDAB8264.44.06.1組込みイベントのメンデル分離の結果として、aad−12および2mEPSPSのコピーを含有していなかった。さらに、aad−12および2mEPSPS遺伝子を含有しない対照植物は、2,4−Dおよびグリホサート除草剤の施用に感受性であった。
実施例9.5:ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の殺虫活性の特徴づけ
Cry1AcおよびCry1F導入遺伝子の発現からもたらされた、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の殺虫性耐性活性を特徴づけるために、温室内評価を実施した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1を、アンチカルシア・ゲンマタリス(Anticarsia gemmatalis)(ベルベットビーンキャタピラー)およびシュードプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens)(ダイズルーパ)を含む実験室内飼育ダイズ害虫に対して試験した。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックを、非形質転換ダイズ品種Maverickに加えて親のダイズイベント(ダイズイベントpDAB9582.814.19.1およびダイズイベントpDAB8264.44.06.1)と比較した。この比較は、Cry1FおよびCry1Acタンパク質によって提供される虫害に対する植物保護のレベルが、ダイズ植物のゲノムにさらなる導入遺伝子を導入した育種スタックに存在するかどうか判定するために行った。さらに、除草剤の噴霧がCry1FおよびCry1Acタンパク質によって提供される昆虫からの植物の保護に何らかの効果を有するかどうか判定するために、昆虫バイオアッセイの前に、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックおよびダイズイベントpDAB8264.44.06.1の両方に、2,4−Dおよびグリホサートを含有する除草剤を一回噴霧施用した(840g ae/ヘクタール)。
温室内試験を、およそ3週間目の植物で行った。ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタック、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1の育種スタックおよび陰性対照;除草剤を噴霧したダイズイベントpDAB8264.44.06.1の育種スタックおよびMaverickを評価するために、10個体の植物を各々用いた。合計30枚の葉ディスク/植物/昆虫種に対して、各昆虫種(アンチカルシア・ゲンマタリス(Anticarsia gemmatalis)およびシュードプルシア・インクルデンス(Pseudoplusia includens))を試験するために、各植物から葉パンチを3つ作製した。1.4cm直径(または1.54cm)の葉パンチを2%素寒天の上の試験領域に置き、1匹の新生子幼虫を寄生させ、有孔のプラスチックふたで密封した。寄生させてから4日後に死亡率および葉の消費を評価した。軽く突いても応答しなかった幼虫は、死虫とみなされた。昆虫によって消費された葉パンチの百分率を視覚的に評価することによって、葉の傷害を調べた。JMP(登録商標)Pro9.0.1(2010 SAS Institute Inc.、Cary、NC)を用いて、データの統計分析を実施した。
これらの反復実験から得られた結果(表18)は、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1の育種スタックのCry1FおよびCry1Acタンパク質によって提供される虫害および死亡率のレベルが、親のダイズイベントpDAB9582.814.19.1と一貫していたことを示した。予想された通り、試験した全ての昆虫について、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1は、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1(58〜76%)およびMaverick(79〜91%)対照植物より有意に低い虫害(0.10〜0.12%)を維持した。さらに、cry1Fおよびcry1Acコード配列を含有した全てのダイズイベントで高い昆虫死亡率(100%)が記録されたが、陰性対照、maverickおよびダイズイベントpDAB8264.44.06.1は10%未満の昆虫死亡率であった。したがって、ダイズイベントpDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1は、親のダイズイベントpDAB9582.814.19.1と同等レベルの殺虫活性由来の保護を提供した。
配列番号1は、対象のダイズイベントpDAB8264.44.06.1の5’隣接ボーダー配列を示す。
配列番号2は、対象のダイズイベントpDAB8264.44.06.1の3’隣接ボーダー配列を示す。
配列番号3は、プライマー4406_WF1を示す。
配列番号4は、プライマー4406_WF2を示す。
配列番号5は、プライマー4406_WF3を示す。
配列番号6は、プライマー4406_WF4を示す。
配列番号7は、プライマー4406_WR5を示す。
配列番号8は、プライマー4406_WR6を示す。
配列番号9は、プライマー4406_WR7を示す。
配列番号10は、プライマー4406_WR8を示す。
配列番号11は、プライマーED_v1_C1を示す。
配列番号12は、プライマーPAT_12を示す。
配列番号13は、プラスミドpDAB8264の配列を示す。
配列番号14は、部分的5’ダイズゲノム隣接および部分的5’挿入物配列を示す。
配列番号15は、部分的3’ダイズゲノム隣接および部分的3’挿入物配列を示す。
配列番号16は、5’組込み接合部にわたっている98塩基対配列を示す。
配列番号17は、3’組込み接合部にわたっている131塩基対配列を示す。
配列番号18は、プライマー4406_5’Fを示す。
配列番号19は、プライマー4406_5’Rを示す。
配列番号20は、プローブ4406_5’Pを示す。
配列番号21は、プライマー4406_3’Fを示す。
配列番号22は、プライマー4406_3’Rを示す。
配列番号23は、プローブ4406_3’Pを示す。
配列番号24は、プライマーGMS116Fを示す。
配列番号25は、プライマーGMS116Rを示す。
配列番号26は、プローブGMS116Probeを示す
配列番号27は、5’ゲノム隣接配列、挿入物および3’ゲノム隣接配列を含む、ダイズイベントpDAB8264.44.06.1の配列を示す。
配列番号28は、5’ゲノム隣接配列、pDAB9582 T鎖挿入物および3’ゲノム隣接配列を含む、ダイズイベント9582.812.9.1の予想配列を示す。
配列番号29は、5’ゲノム隣接配列、pDAB9582 T鎖挿入物および3’ゲノム隣接配列を含む、ダイズイベント9582.814.19.1の予想配列を示す。

Claims (30)

  1. 配列番号27のヌクレオチド配列と少なくとも95%の同一性を有するポリヌクレオチドセグメントであって、除草剤抵抗性を植物細胞にもたらすポリヌクレオチドセグメントを含むゲノムを含むトランスジェニックダイズ植物細胞。
  2. 受託番号PTA−11336でアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に寄託されている代表的な種子に存在する、配列番号27のイベントpDAB8264.44.06.1を含むゲノムを含むダイズ種子。
  3. 請求項1に記載の細胞を含むダイズ種子。
  4. 前記配列番号27のイベントpDAB8264.44.06.1を含む、請求項2に記載の種子を生育させることによって生成されるダイズ植物。
  5. 配列番号27のイベントpDAB8264.44.06.1を含む、請求項4に記載のダイズ植物の後代植物。
  6. 複数の請求項1に記載の細胞を含むトランスジェニックダイズ植物。
  7. 前記細胞が昆虫抵抗性遺伝子をさらに含む、請求項6に記載の植物。
  8. フェノキシ酢酸除草剤、フェノキシブタン酸除草剤、ピリジルオキシアルカン酸除草剤、グリホサート除草剤およびグルホシネート除草剤からなる群から選択される少なくとも1つの除草剤に抵抗性であり、配列番号13の残基2026〜9222を含むトランスジェニックゲノム挿入物を含む、請求項6に記載の植物。
  9. 受託番号PTA−11336でアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に寄託されている代表的な種子に存在する配列番号27のイベントpDAB8264.44.06.1を含むゲノムを含む植物細胞。
  10. 配列番号13〜17、20、27および28からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、単離されたポリヌクレオチド。
  11. アリールオキシアルカノエート、ピリジルオキシアルカン酸、グリホサート、ビアラホス、フォスフィノスリシンまたはグルホシネート除草剤の少なくとも1つを圃場へ施用するステップを含み、前記圃場が請求項6に記載の植物を含む、雑草の防除方法。
  12. 前記除草剤の少なくとも2つを同時に又は連続的に施用するステップを含む、請求項11に記載の方法。
  13. 前記アリールオキシアルカノエート除草剤が、2,4−D、2,4−DB、MCPAおよびMCPBからなる群から選択され、前記ピリジルオキシアルカン酸除草剤が、トリクロピルおよびフルロキシピルからなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
  14. 前記圃場へ少なくとも1つの追加の除草剤を施用するステップを含む、請求項11に記載の方法。
  15. 前記少なくとも1つの追加の除草剤がジカンバである、請求項14に記載の方法。
  16. 前記除草剤を前記圃場へ施用するステップ、および前記除草剤を施用してから14日以内に圃場に種子を播種して植物を生育させるステップを含む、請求項11に記載の方法。
  17. 前記施用ステップが前記播種ステップの前に実施される、請求項16に記載の方法。
  18. 前記少なくとも1つの除草剤が前記植物の頂部の上側に施用される、請求項11に記載の方法。
  19. 前記植物が、配列番号27のヌクレオチド配列を含む核酸分子含む、請求項6に記載の植物。
  20. 配列番号27のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むミール。
  21. 植物細胞のゲノムが配列番号27を含むように該ゲノムの単一の染色体遺伝子座中に遺伝子導入により挿入される、発現カセット。
  22. 試料中の配列番号27のイベントpDAB8264.44.06.1を同定するための方法であって、ATCC受託番号PTA−11336で寄託されている種子に存在するpDAB8264.44.06.1の接合部配列を、前記接合部配列と特異的に結合するか前記接合部配列を特異的に増幅するプローブまたは少なくとも1つのプライマーで検出するステップを含み、前記接合部配列が、配列番号14の残基570〜571または配列番号15の残基220〜221を含む、方法。
  23. 第1のプライマーおよび第2のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、前記試料に存在する核酸のDNA断片を増幅するステップをさらに含み、前記第1のプライマーが、配列番号13内の挿入物配列またはその相補配列に特異的に結合し、前記第2のプライマーが、配列番号1および配列番号2からなる群から選択される隣接配列内の配列に特異的に結合する、請求項22に記載の方法。
  24. 配列番号18のヌクレオチド配列からなる第1のイベントプライマー、
    配列番号19のヌクレオチド配列からなる第2のイベントプライマー、
    配列番号24のヌクレオチド配列からなる参照フォワードプライマー、
    配列番号25のヌクレオチド配列からなる参照リバースプライマー、
    配列番号20のヌクレオチド配列からなるイベントプローブおよび
    配列番号26のヌクレオチド配列からなる参照プローブ
    を含む、ATCC受託番号PTA−11336で寄託されている種子に存在する配列番号27のダイズイベントpDAB−8264.44.06.1を含むダイズ植物のイベント接合性を判定する方法を実施するためのキット。
  25. 配列番号20のヌクレオチド配列からなるプローブまたは
    配列番号18または配列番号19のヌクレオチド配列からなる少なくとも1つのプライマー
    を含む、請求項22に記載の方法を実施するためのキット。
  26. 前記増幅されたDNA断片が約7196塩基を含む、請求項23に記載の方法。
  27. 配列番号1、配列番号2、配列番号14、配列番号15およびその相補配列からなる群から選択される配列からなるプローブ。
  28. 配列番号1および配列番号2からなる群から選択される核酸配列からなる、単離されたポリヌクレオチド分子。
  29. 配列番号28、配列番号29、配列番号28と少なくとも95%同一である変異体、または配列番号29と少なくとも95%同一である変異体のヌクレオチド配列からなる核酸分子をさらに含み、前記核酸分子が植物細胞に昆虫抵抗性をもたらす、請求項に記載の植物細胞。
  30. 配列番号27のヌクレオチド配列からなる核酸分子を含む、請求項1に記載の細胞を含む種子。
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IL (1) IL226664B (ja)
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RU (1) RU2608650C2 (ja)
UA (1) UA115766C2 (ja)
UY (2) UY38329A (ja)
WO (1) WO2012075426A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7211387B2 (ja) 2020-02-28 2023-01-24 いすゞ自動車株式会社 運転支援装置及び運転支援方法

Families Citing this family (482)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA115766C2 (uk) * 2010-12-03 2017-12-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Трансгенна стійка до гербіцидів рослина сої, яка містить пакетовану подію 8264.44.06.1
CN103562392B (zh) 2010-12-03 2016-07-20 Ms技术有限责任公司 植物细胞中草甘膦抗性编码核酸分子的优化表达
BR112013015745B1 (pt) 2010-12-03 2021-01-19 Ms Technologies, Llc polinucleotídeos referente ao evento de tolerância a herbicida 8291.45.36.2, cassete de expressão, sonda, bem como processos para identificação do evento, determinação da zigosidade, produção de uma planta de soja transgênica e produção de uma proteína em uma célula de planta
CN107603978A (zh) 2011-07-13 2018-01-19 陶氏益农公司 叠加的除草剂耐受性事件8264.42.32.1、相关转基因大豆系及其检测方法
CN103826445A (zh) 2011-07-26 2014-05-28 陶氏益农公司 昆虫抗性和除草剂耐受性大豆事件9582.814.19.1
BR102012019436B8 (pt) * 2011-07-26 2022-10-11 Dow Agrosciences Llc Método de detecção do evento de soja pdab9582.814.19.1
RU2014125077A (ru) 2011-11-21 2015-12-27 Байер Интеллекчуал Проперти Гмбх Фунгицидные n-[(тризамещенный силил)этил]-карбоксамидные производные
CN105906567B (zh) 2011-11-30 2019-01-22 拜耳知识产权有限责任公司 杀真菌的n-二环烷基和n-三环烷基(硫代)羧酰胺衍生物
KR102028903B1 (ko) 2011-12-29 2019-10-07 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 살진균 3-[(피리딘-2-일메톡시이미노)(페닐)메틸]-2-치환-1,2,4-옥사디아졸-5(2h)-온 유도체
IN2014DN06122A (ja) 2011-12-29 2015-08-14 Bayer Ip Gmbh
EP2806739A1 (en) 2012-01-25 2014-12-03 Bayer Intellectual Property GmbH Active compound combinations containing fluopyram and biological control agent
UY34878A (es) * 2012-06-25 2014-01-31 Dow Agrosciences Llc ?MÉTODO DE DETECCIÓN DEL EVENTO DE SOJA pDAB9582.816.15.1 ?.
UY34877A (es) * 2012-06-25 2014-01-31 Dow Agrosciences Llc ?evento de soja pdab9582.816.15.1 resistente a insectos y tolerante a herbicidas, método para controlar insectos, adn , plantas, semillas, composición derivada?.
US10793872B2 (en) 2012-09-14 2020-10-06 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC HPPD variants and methods of use
CA2888559C (en) 2012-10-19 2021-03-02 Bayer Cropscience Ag Method for enhancing tolerance to abiotic stress in plants using carboxamide or thiocarboxamide derivatives
PL2908640T3 (pl) 2012-10-19 2020-06-29 Bayer Cropscience Ag Sposób stymulowania wzrostu roślin przy pomocy pochodnych karboksamidu
AU2013333916B2 (en) 2012-10-19 2017-05-25 Bayer Cropscience Ag Active compound combinations comprising carboxamide derivatives
EA026838B1 (ru) 2012-10-19 2017-05-31 Байер Кропсайенс Аг Способ обработки растений, пораженных грибами, устойчивыми к фунгицидам, с использованием производных карбоксамида или тиокарбоксамида
WO2014090765A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 Bayer Cropscience Ag Use of 1-[2-fluoro-4-methyl-5-(2,2,2-trifluoroethylsulfinyl)phenyl]-5-amino-3-trifluoromethyl)-1 h-1,2,4 tfia zole for controlling nematodes in nematode-resistant crops
US20150359220A1 (en) 2013-02-11 2015-12-17 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising gougerotin and a fungicide
CA2898792A1 (en) 2013-02-11 2014-08-14 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising a streptomyces-based biological control agent and another biological control agent
AU2014214634A1 (en) 2013-02-11 2015-08-06 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising a streptomyces-based biological control agent and an insecticide
DK2964767T3 (da) 2013-03-07 2020-03-23 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Toksingener og fremgangsmåder til anvendelse deraf
CN105555135B (zh) 2013-04-19 2018-06-15 拜耳作物科学股份公司 涉及邻苯二甲酰胺衍生物应用的用于改善对转基因植物生产潜能的利用的方法
TW201507722A (zh) 2013-04-30 2015-03-01 Bayer Cropscience Ag 做為殺線蟲劑及殺體內寄生蟲劑的n-(2-鹵素-2-苯乙基)-羧醯胺類
WO2014177514A1 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Bayer Cropscience Ag Nematicidal n-substituted phenethylcarboxamides
EP2837287A1 (en) 2013-08-15 2015-02-18 Bayer CropScience AG Use of prothioconazole for increasing root growth of Brassicaceae
US10876130B2 (en) 2014-03-11 2020-12-29 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC HPPD variants and methods of use
WO2015160618A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising ningnanmycin and a biological control agent
WO2015160619A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising ningnanmycin and a fungicide
WO2015160620A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising ningnanmycin and an insecticide
EP3097782A1 (en) 2015-05-29 2016-11-30 Bayer CropScience Aktiengesellschaft Methods for controlling phytopathogenic nematodes by combination of fluopyram and biological control agents
US9491922B1 (en) 2015-08-05 2016-11-15 M.S. Technologies Llc Soybean cultivar 45391601
US9497924B1 (en) 2015-08-05 2016-11-22 M.S. Technologies Llc Soybean cultivar 41180801
ES2933673T3 (es) 2015-09-11 2023-02-13 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Variantes de HPPD y métodos de uso
CN105567682B (zh) * 2016-01-12 2019-01-29 吉林省农业科学院 转基因大豆事件b4j8049外源插入片段旁侧序列及其应用
WO2018098214A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Bayer Cropscience Lp Axmi669 and axmi991 toxin genes and methods for their use
AU2017382330A1 (en) 2016-12-22 2019-06-20 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Elite event EE-GM4 and methods and kits for identifying such event in biological samples
JP2020513753A (ja) 2016-12-22 2020-05-21 ビーエーエスエフ アグリカルチュラル ソリューションズ シード ユーエス エルエルシー エリートイベントee−gm5ならびに生物学的試料中でそのようなイベントを同定するための方法およびキット
WO2018119336A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Athenix Corp. Use of cry14 for the control of nematode pests
BR112019014727A2 (pt) 2017-01-18 2020-04-07 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC molécula de ácido nucleico, vector, célula, planta, semente, polipeptídeo, composição, métodos para o controle de uma população de pragas, para matar uma praga, para produzir um polipeptídeo, para proteger uma planta e para aumentar o rendimento em uma planta, uso do ácido nucleico e produto de base
BR112019014720A2 (pt) 2017-01-18 2020-04-07 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC métodos para conferir resistência a doença em uma planta e para aumentar o rendimento em uma planta
US9867357B1 (en) 2017-02-28 2018-01-16 M.S. Technologies, Llc Soybean cultivar 56171900
US9999189B1 (en) 2017-02-28 2018-06-19 M.S. Technologies, Llc Soybean cultivar 54113122
US9961858B1 (en) 2017-02-28 2018-05-08 M.S. Technologies, Llc Soybean cultivar 54062650
US9961861B1 (en) 2017-02-28 2018-05-08 M.S. Technologies, Llc Soybean cultivar 54190212
US9999190B1 (en) 2017-02-28 2018-06-19 M.S. Technologies, Llc Soybean cultivar 54172927
US9961860B1 (en) 2017-02-28 2018-05-08 M.S. Technologies, Llc Soybean cultivar 52030201
US10058049B1 (en) 2017-02-28 2018-08-28 M.S. Technologies Llc Soybean cultivar 59104161
US9961859B1 (en) 2017-02-28 2018-05-08 M.S. Technologies, Llc Soybean cultivar 57111348
WO2018165091A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Bayer Cropscience Lp Hppd variants and methods of use
CA3061009A1 (en) 2017-04-21 2018-10-25 Bayer Cropscience Lp Method of improving crop safety
BR112020001585A2 (pt) 2017-07-27 2020-08-11 Basf Se usos de uma composição e método para controlar plantas prejudiciais em uma cultura de campo tolerante a glufosinato
US20210032651A1 (en) 2017-10-24 2021-02-04 Basf Se Improvement of herbicide tolerance to hppd inhibitors by down-regulation of putative 4-hydroxyphenylpyruvate reductases in soybean
WO2019083810A1 (en) 2017-10-24 2019-05-02 Basf Se IMPROVING HERBICIDE TOLERANCE FOR 4-HYDROXYPHENYLPYRUVATE DIOXYGENASE (HPPD) INHIBITORS BY NEGATIVE REGULATION OF HPPD EXPRESSION IN SOYBEANS
US10568288B1 (en) * 2018-05-15 2020-02-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean variety 5PUBF54
US10568287B1 (en) * 2018-05-15 2020-02-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean variety 5PYVU85
US10501747B1 (en) 2018-05-21 2019-12-10 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 77130123
US10485208B1 (en) 2018-05-21 2019-11-26 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 69311428
US10499594B1 (en) 2018-05-21 2019-12-10 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 79162140
US10494639B1 (en) 2018-05-21 2019-12-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 63301112
US10485209B1 (en) 2018-05-21 2019-11-26 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 72151329
BR112020024615A2 (pt) 2018-06-04 2021-03-02 Bayer Aktiengesellschaft benzoilpirazóis bicíclicos de ação herbicida
US10555478B1 (en) 2018-08-01 2020-02-11 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 75242840
US10485212B1 (en) 2018-08-01 2019-11-26 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 65110742
US10455796B1 (en) 2018-08-01 2019-10-29 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 76420724
US10485210B1 (en) 2018-08-01 2019-11-26 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 64432136
US10555479B1 (en) 2018-08-01 2020-02-11 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 71342318
US10492400B1 (en) 2018-08-01 2019-12-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 76011212
US10455794B1 (en) 2018-08-01 2019-10-29 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 51284052
US10492402B1 (en) 2018-08-01 2019-12-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 63452016
US10492404B1 (en) 2018-08-01 2019-12-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 61332840
US10485211B1 (en) 2018-08-01 2019-11-26 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 74142136
US10492401B1 (en) 2018-08-01 2019-12-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 64002217
US10492433B1 (en) 2018-08-01 2019-12-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 78492244
US10492403B1 (en) 2018-08-01 2019-12-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 70311819
US10499582B1 (en) 2018-08-01 2019-12-10 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 60312840
US10492399B1 (en) 2018-08-01 2019-12-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 75001212
US10455793B1 (en) 2018-08-01 2019-10-29 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 69090024
US10448604B1 (en) 2018-08-01 2019-10-22 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 60111110
US10455795B1 (en) 2018-08-01 2019-10-29 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 79150907
US10499597B1 (en) 2018-08-02 2019-12-10 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 74211709
US10492438B1 (en) 2018-08-02 2019-12-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 72191315
US10349605B1 (en) 2018-08-02 2019-07-16 M.S. Technologies, Llc Soybean cultivar 78320329
US10499583B1 (en) 2018-08-02 2019-12-10 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 73390208
US10506783B1 (en) 2018-08-02 2019-12-17 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 70391206
US10398121B1 (en) 2018-08-02 2019-09-03 M.S. Technologies, Llc Soybean cultivar 76132184
US10492437B1 (en) 2018-08-02 2019-12-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 73081781
US10349606B1 (en) 2018-08-02 2019-07-16 M.S. Technologies, Llc Soybean cultivar 70404329
US10492439B1 (en) 2018-08-02 2019-12-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 78281713
US10492440B1 (en) 2018-08-02 2019-12-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 76172605
US10448605B1 (en) 2018-08-02 2019-10-22 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 63332027
US10398120B1 (en) 2018-08-02 2019-09-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 70271905
US10537076B1 (en) 2018-08-02 2020-01-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 70120311
US10499595B1 (en) 2018-08-02 2019-12-10 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 77242824
US10512229B1 (en) 2018-08-02 2019-12-24 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 74340613
US10440926B1 (en) 2018-08-02 2019-10-15 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 75251428
US10531620B1 (en) 2018-08-02 2020-01-14 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 70140849
US10499596B1 (en) 2018-08-02 2019-12-10 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 76034331
US10440924B1 (en) 2018-08-02 2019-10-15 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 60431428
US10542690B1 (en) 2018-08-02 2020-01-28 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 71052129
US10537084B1 (en) 2018-08-02 2020-01-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 71201428
US10440925B1 (en) 2018-08-02 2019-10-15 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 61414428
US10537085B1 (en) 2018-08-02 2020-01-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 73330613
US10548271B1 (en) 2018-08-02 2020-02-04 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 65180532
US10492441B1 (en) 2018-08-02 2019-12-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 75162223
US10542691B1 (en) 2018-08-02 2020-01-28 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 73040436
US10542692B1 (en) 2018-08-02 2020-01-28 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 70262703
US10492436B1 (en) 2018-08-02 2019-12-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 70422534
US10524445B1 (en) 2018-08-02 2020-01-07 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 75052534
US10492444B1 (en) 2018-08-03 2019-12-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 73412247
US10631484B2 (en) 2018-08-03 2020-04-28 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 60310209
US10537077B1 (en) 2018-08-03 2020-01-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 76391606
US10631483B2 (en) 2018-08-03 2020-04-28 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 63030535
US10542694B1 (en) 2018-08-03 2020-01-28 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 77290232
US10517247B1 (en) 2018-08-03 2019-12-31 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 71270402
US10531621B1 (en) 2018-08-03 2020-01-14 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 61364961
US10537078B1 (en) 2018-08-03 2020-01-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 78221232
US10517245B1 (en) 2018-08-03 2019-12-31 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 67371612
US10492443B1 (en) 2018-08-03 2019-12-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 70552824
US10660286B2 (en) 2018-08-03 2020-05-26 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 66472542
US10609881B2 (en) 2018-08-03 2020-04-07 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 74092327
US10660291B2 (en) 2018-08-03 2020-05-26 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 76071630
US10517246B1 (en) 2018-08-03 2019-12-31 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 61242247
US10492442B1 (en) 2018-08-03 2019-12-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 64490328
US10542693B1 (en) 2018-08-03 2020-01-28 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 74312619
US10477819B1 (en) 2018-08-06 2019-11-19 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 75162339
US10631511B1 (en) 2019-04-04 2020-04-28 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 83190332
US10667483B1 (en) 2019-04-22 2020-06-02 M.S. Technolgies, L.L.C. Soybean cultivar 88092742
US10595486B1 (en) 2019-06-13 2020-03-24 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 80330329
EP4003966A1 (de) 2019-07-22 2022-06-01 Bayer Aktiengesellschaft 5-amino substituierte pyrazole und triazole als schädlingsbekämpfungsmittel
JP2022541808A (ja) 2019-07-23 2022-09-27 バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト 農薬としての新規ヘテロアリール-トリアゾール化合物
EP4003973A1 (en) 2019-07-23 2022-06-01 Bayer Aktiengesellschaft Novel heteroaryl-triazole compounds as pesticides
WO2021022069A1 (en) 2019-08-01 2021-02-04 Bayer Cropscience Lp Method of improving cold stress tolerance and crop safety
EP3701796A1 (en) 2019-08-08 2020-09-02 Bayer AG Active compound combinations
US10980205B2 (en) 2019-08-19 2021-04-20 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 81140111
US10945400B1 (en) 2019-08-19 2021-03-16 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 86220335
US10932431B1 (en) 2019-08-19 2021-03-02 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 86072910
US10980204B2 (en) 2019-08-19 2021-04-20 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 85010111
US11044870B2 (en) 2019-08-19 2021-06-29 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 87011338
US10897867B1 (en) 2019-08-19 2021-01-26 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 84450325
US10980207B2 (en) 2019-08-19 2021-04-20 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 87242903
US10980206B2 (en) 2019-08-19 2021-04-20 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 86052115
US10918064B1 (en) 2019-08-19 2021-02-16 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 84322401
US10939651B1 (en) 2019-08-19 2021-03-09 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 83011212
US10993403B2 (en) 2019-08-19 2021-05-04 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 88042312
US10973197B2 (en) 2019-08-19 2021-04-13 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 87161800
US10945401B1 (en) 2019-08-19 2021-03-16 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 83372609
US10952395B2 (en) 2019-08-19 2021-03-23 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 81371335
US10897866B1 (en) 2019-08-19 2021-01-26 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 81442208
US10966396B2 (en) 2019-08-19 2021-04-06 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 89192414
US10952394B2 (en) 2019-08-19 2021-03-23 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 88390016
US10993402B2 (en) 2019-08-19 2021-05-04 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 87390112
US10945399B1 (en) 2019-08-19 2021-03-16 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 89442841
US11044871B2 (en) 2019-08-20 2021-06-29 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 84340383
US11337394B2 (en) 2019-08-20 2022-05-24 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 86092833
US11044872B2 (en) 2019-08-20 2021-06-29 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 84344663
US10945405B1 (en) 2019-08-20 2021-03-16 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 81090603
US11219179B2 (en) 2019-08-20 2022-01-11 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 87272833
US10932432B1 (en) 2019-08-20 2021-03-02 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 87222215
US10952399B2 (en) 2019-08-20 2021-03-23 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 80230701
US10945404B1 (en) 2019-08-20 2021-03-16 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 83221630
US11044874B2 (en) 2019-08-20 2021-06-29 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 83292541
US10945403B1 (en) 2019-08-20 2021-03-16 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 85202128
US10952398B2 (en) 2019-08-20 2021-03-23 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 84380724
US10945402B1 (en) 2019-08-20 2021-03-16 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 88020223
US10952396B2 (en) 2019-08-20 2021-03-23 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 88362310
US11044873B2 (en) 2019-08-20 2021-06-29 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 88482541
US11172632B2 (en) 2019-08-20 2021-11-16 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 85031644
US11044875B2 (en) 2019-08-20 2021-06-29 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 81322943
US10952397B2 (en) 2019-08-20 2021-03-23 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 86160724
US11212998B2 (en) 2019-08-20 2022-01-04 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 88282833
US10897871B1 (en) 2019-08-27 2021-01-26 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 86240211
US11006605B2 (en) 2019-08-27 2021-05-18 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 84410120
US11044877B2 (en) 2019-08-27 2021-06-29 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 85262507
US11006604B2 (en) 2019-08-27 2021-05-18 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 82431018
US10993405B2 (en) 2019-08-27 2021-05-04 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 85281832
US11071273B2 (en) 2019-08-27 2021-07-27 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 86172030
US10986798B2 (en) 2019-08-28 2021-04-27 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 82230919
US10999999B2 (en) 2019-08-28 2021-05-11 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 83392343
US11071274B2 (en) 2019-08-28 2021-07-27 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 83050118
US10959391B2 (en) 2019-08-28 2021-03-30 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 80412336
US10966397B2 (en) 2019-08-28 2021-04-06 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 82151940
US10966399B2 (en) 2019-08-28 2021-04-06 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 80532336
US10966398B2 (en) 2019-08-28 2021-04-06 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 86240546
US11019791B2 (en) 2019-08-28 2021-06-01 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 89242215
US10952401B1 (en) 2019-08-28 2021-03-23 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 83292238
US10986799B2 (en) 2019-08-28 2021-04-27 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 81440919
US10986797B2 (en) 2019-08-28 2021-04-27 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 86440139
US11076554B2 (en) 2019-08-28 2021-08-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 87272107
US11096364B2 (en) 2019-08-28 2021-08-24 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 81111940
US11006606B2 (en) 2019-08-28 2021-05-18 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 81201100
US10912276B1 (en) 2019-08-29 2021-02-09 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 85161716
US11044878B2 (en) 2019-08-29 2021-06-29 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 88031336
US10925245B1 (en) 2019-08-29 2021-02-23 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 89021021
US10939653B1 (en) 2019-08-29 2021-03-09 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 88432102
US11076556B2 (en) 2019-08-29 2021-08-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 83422133
US11013198B2 (en) 2019-08-29 2021-05-25 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 84042612
US11134636B2 (en) 2019-08-29 2021-10-05 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 83222640
US11076555B2 (en) 2019-08-29 2021-08-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 84490022
US10952405B1 (en) 2019-08-29 2021-03-23 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 88103440
US11140847B2 (en) 2019-08-29 2021-10-12 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 80372223
US10952403B1 (en) 2019-08-29 2021-03-23 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 80462430
US11044879B2 (en) 2019-08-29 2021-06-29 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 82352802
US11140846B2 (en) 2019-08-29 2021-10-12 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 88070907
US11071275B2 (en) 2019-08-29 2021-07-27 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 88060022
US10952404B1 (en) 2019-08-29 2021-03-23 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 87092440
US10905082B1 (en) 2019-08-29 2021-02-02 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 82212235
US11000001B2 (en) 2019-08-29 2021-05-11 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 83271604
US11026391B2 (en) 2019-08-29 2021-06-08 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 82152612
US11006607B2 (en) 2019-08-29 2021-05-18 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 80462534
US10980209B2 (en) 2019-08-29 2021-04-20 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 87230016
US11140845B2 (en) 2019-08-29 2021-10-12 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 88041740
US11076557B2 (en) 2019-08-29 2021-08-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 83381828
US11134635B2 (en) 2019-08-29 2021-10-05 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 82371519
US10952402B1 (en) 2019-08-29 2021-03-23 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 81171312
US10980210B2 (en) 2019-08-29 2021-04-20 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 80202604
US10939654B1 (en) 2019-08-29 2021-03-09 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 81111423
EP4034656A1 (en) 2019-09-26 2022-08-03 Bayer Aktiengesellschaft Rnai-mediated pest control
CA3156302A1 (en) 2019-10-02 2021-04-08 Bayer Aktiengesellschaft COMBINATIONS OF ACTIVE COMPOUNDS INCLUDING FATTY ACIDS
JP2022551309A (ja) 2019-10-09 2022-12-08 バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト 殺有害生物剤としての新規ヘテロアリール-トリアゾール化合物
UY38910A (es) 2019-10-09 2021-05-31 Bayer Ag Compuestos de heteroarilo-triazol como pesticidas, formulaciones, usos y métodos de uso de los mismos
EP4055010A1 (de) 2019-11-07 2022-09-14 Bayer Aktiengesellschaft Substituierte sulfonylamide zur bekämpfung tierischer schädlinge
WO2021097162A1 (en) 2019-11-13 2021-05-20 Bayer Cropscience Lp Beneficial combinations with paenibacillus
WO2021099271A1 (en) 2019-11-18 2021-05-27 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combinations comprising fatty acids
TW202134226A (zh) 2019-11-18 2021-09-16 德商拜耳廠股份有限公司 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物
TW202136248A (zh) 2019-11-25 2021-10-01 德商拜耳廠股份有限公司 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物
CN110951913B (zh) * 2020-01-09 2022-06-10 福建中医药大学 绿苋,凹头苋与反枝苋相互鉴别的分子特异性标记引物及方法
AR121242A1 (es) 2020-01-31 2022-05-04 Pairwise Plants Services Inc Supresión de la respuesta de escape a la sombra en plantas
US11051481B1 (en) 2020-02-13 2021-07-06 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 93020437
US11147229B2 (en) 2020-02-13 2021-10-19 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 98240355
US11051480B1 (en) 2020-02-13 2021-07-06 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 93230440
US11109557B1 (en) 2020-02-13 2021-09-07 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 98110162
US11134640B2 (en) 2020-02-13 2021-10-05 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 94220034
US11116168B2 (en) 2020-02-13 2021-09-14 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 95420460
US11147230B2 (en) 2020-02-13 2021-10-19 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 91420287
US11202427B2 (en) 2020-02-13 2021-12-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 94110636
US11076563B1 (en) 2020-02-13 2021-08-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 94040702
US11191238B2 (en) 2020-02-13 2021-12-07 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 99240189
US11051479B1 (en) 2020-02-13 2021-07-06 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 94140580
US11076562B1 (en) 2020-02-13 2021-08-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 95130401
US11140855B2 (en) 2020-02-13 2021-10-12 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 90420357
BR112022016400A2 (pt) 2020-02-18 2022-10-25 Bayer Ag Compostos inovadores de heteroaril-triazol como pesticidas
US11140856B2 (en) 2020-02-21 2021-10-12 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 93440976
US11109558B1 (en) 2020-02-21 2021-09-07 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 91220032
US11147231B2 (en) 2020-02-21 2021-10-19 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 97040540
EP3708565A1 (en) 2020-03-04 2020-09-16 Bayer AG Pyrimidinyloxyphenylamidines and the use thereof as fungicides
WO2021209490A1 (en) 2020-04-16 2021-10-21 Bayer Aktiengesellschaft Cyclaminephenylaminoquinolines as fungicides
MX2022012878A (es) 2020-04-16 2022-12-08 Pairwise Plants Services Inc Metodos para controlar el tama?o del meristema para la mejora de cultivos.
JP2023522350A (ja) 2020-04-21 2023-05-30 バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト 有害生物防除剤としての2-(ヘタ)アリール-置換縮合ヘテロ環誘導体
TW202208347A (zh) 2020-05-06 2022-03-01 德商拜耳廠股份有限公司 作為殺蟲劑之新穎雜芳基三唑化合物
WO2021224220A1 (en) 2020-05-06 2021-11-11 Bayer Aktiengesellschaft Pyridine (thio)amides as fungicidal compounds
CN115605462A (zh) 2020-05-12 2023-01-13 拜耳公司(De) 作为杀真菌化合物的三嗪和嘧啶(硫代)酰胺
WO2021233861A1 (en) 2020-05-19 2021-11-25 Bayer Aktiengesellschaft Azabicyclic(thio)amides as fungicidal compounds
US11172640B1 (en) 2020-06-02 2021-11-16 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 91230357
US11140857B1 (en) 2020-06-02 2021-10-12 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 93320341
US11102951B1 (en) 2020-06-02 2021-08-31 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 96130264
US11172637B1 (en) 2020-06-02 2021-11-16 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 96350326
US11172638B1 (en) 2020-06-02 2021-11-16 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 97320638
US11172639B1 (en) 2020-06-02 2021-11-16 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 99310382
US11166430B1 (en) 2020-06-02 2021-11-09 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 99120525
US11122765B1 (en) 2020-06-02 2021-09-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 98220804
US11122764B1 (en) 2020-06-02 2021-09-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 91210322
US11122766B1 (en) 2020-06-02 2021-09-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 96140088
CN116096230A (zh) 2020-06-02 2023-05-09 成对植物服务股份有限公司 控制分生组织大小以改良作物的方法
US11202429B1 (en) 2020-06-02 2021-12-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 91410746
US11202430B1 (en) 2020-06-02 2021-12-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 93120753
US11116169B1 (en) 2020-06-02 2021-09-14 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 92050703
US11213001B2 (en) 2020-06-02 2022-01-04 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 98320614
BR112022024394A2 (pt) 2020-06-04 2023-01-31 Bayer Ag Heterociclil pirimidinas e triazinas como novos fungicidas
CN116057056A (zh) 2020-06-10 2023-05-02 拜耳公司 作为杀真菌剂的氮杂双环取代的杂环化合物
CN115943212A (zh) 2020-06-17 2023-04-07 成对植物服务股份有限公司 控制分生组织大小以改良作物的方法
WO2021255071A1 (en) 2020-06-18 2021-12-23 Bayer Aktiengesellschaft 3-(pyridazin-4-yl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine derivatives as fungicides for crop protection
EP4167738A1 (en) 2020-06-18 2023-04-26 Bayer Aktiengesellschaft Composition for use in agriculture
BR112022025692A2 (pt) 2020-06-19 2023-02-28 Bayer Ag 1,3,4-oxadiazóis e seus derivados como fungicidas
UY39276A (es) 2020-06-19 2022-01-31 Bayer Ag Uso de compuestos de 1,3,4–oxadiazol–2–ilpirimidina para controlar microorganismos fitopatógenos, métodos de uso y composiciones.
UY39275A (es) 2020-06-19 2022-01-31 Bayer Ag 1,3,4-oxadiazol pirimidinas como fungicidas, procesos e intermediarios para su preparación, métodos de uso y usos de los mismos
WO2021255089A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 Bayer Aktiengesellschaft 1,3,4-oxadiazole pyrimidines and 1,3,4-oxadiazole pyridines as fungicides
EP3929189A1 (en) 2020-06-25 2021-12-29 Bayer Animal Health GmbH Novel heteroaryl-substituted pyrazine derivatives as pesticides
WO2022002818A1 (de) 2020-07-02 2022-01-06 Bayer Aktiengesellschaft Heterocyclen-derivate als schädlingsbekämpfungsmittel
US11191240B1 (en) 2020-07-14 2021-12-07 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 91210615
US11140858B1 (en) 2020-07-14 2021-10-12 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 91040342
US11191242B1 (en) 2020-07-14 2021-12-07 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 95450804
US11197452B1 (en) 2020-07-14 2021-12-14 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 92140814
US11134642B1 (en) 2020-07-14 2021-10-05 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 98272614
US11202433B1 (en) 2020-07-14 2021-12-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 92010858
US11191241B1 (en) 2020-07-14 2021-12-07 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 92220615
US11172641B1 (en) 2020-07-14 2021-11-16 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 90140287
US11172642B1 (en) 2020-07-14 2021-11-16 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 99150287
US11172643B1 (en) 2020-07-14 2021-11-16 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 94440162
US11202432B1 (en) 2020-07-14 2021-12-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 91410530
US11116170B1 (en) 2020-07-14 2021-09-14 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 91250440
US11252914B2 (en) 2020-07-17 2022-02-22 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 95111047
US11224183B1 (en) 2020-07-17 2022-01-18 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 95040275
US11252912B2 (en) 2020-07-17 2022-02-22 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 90220377
US11202434B1 (en) 2020-07-17 2021-12-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 93140657
US11202435B1 (en) 2020-07-17 2021-12-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 92040765
US11252913B2 (en) 2020-07-17 2022-02-22 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 97240377
US11252909B2 (en) 2020-07-17 2022-02-22 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 94120737
US11219184B1 (en) 2020-07-17 2022-01-11 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 95250357
US11252908B2 (en) 2020-07-17 2022-02-22 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 98310437
US11252910B2 (en) 2020-07-17 2022-02-22 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 99350737
US11252911B2 (en) 2020-07-17 2022-02-22 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 91110447
US11259490B2 (en) 2020-07-17 2022-03-01 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 99250287
US11252915B1 (en) 2020-07-29 2022-02-22 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 99040204
US11134643B1 (en) 2020-07-29 2021-10-05 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 93410922
US11178837B1 (en) 2020-07-29 2021-11-23 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 92230102
US11224184B1 (en) 2020-07-29 2022-01-18 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 93330609
US11266102B2 (en) 2020-07-29 2022-03-08 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 92220922
US11330782B2 (en) 2020-07-29 2022-05-17 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 93070018
US11337396B2 (en) 2020-07-29 2022-05-24 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 92312145
US11178838B1 (en) 2020-07-29 2021-11-23 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 99262713
US11337397B2 (en) 2020-07-29 2022-05-24 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 90442929
US11219186B1 (en) 2020-07-29 2022-01-11 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 91120809
US11266101B2 (en) 2020-07-29 2022-03-08 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 96310052
US11337395B2 (en) 2020-07-29 2022-05-24 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 99090148
US11197453B1 (en) 2020-07-29 2021-12-14 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 95130716
US11229179B1 (en) 2020-07-29 2022-01-25 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 91410830
US11219185B1 (en) 2020-07-29 2022-01-11 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 97250069
US11140860B1 (en) 2020-07-29 2021-10-12 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 96220972
US11259491B2 (en) 2020-07-29 2022-03-01 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 80540918
US11266104B2 (en) 2020-07-29 2022-03-08 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 99030547
US11266103B2 (en) 2020-07-29 2022-03-08 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 99150754
US11140859B1 (en) 2020-07-29 2021-10-12 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 90120947
US11219187B1 (en) 2020-07-29 2022-01-11 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 94240013
US11242534B1 (en) 2020-07-31 2022-02-08 Inari Agriculture Technology, Inc. INHT31 transgenic soybean
BR112023001798A2 (pt) * 2020-07-31 2023-02-23 Inari Agriculture Tech Inc Célula de planta de milho transgênico, parte de planta de milho transgênico, planta de milho transgênico, método para obter uma população a granel de sementes endogâmicas, método de obtenção de semente de milho híbrido, molécula de dna, produto de planta de milho transgênico processado, amostra biológica, molécula de ácido nucleico adaptada para detecção de dna genômico, método de detecção de uma célula de planta de milho, método de excisão do lócus transgênico inir12 do genoma da célula de planta de milho, método de modificação de uma célula de planta de milho transgênico, método de produção de células de plantas de milho transgênico compreendendo um lócus transgênico inir12, calo de planta de milho transgênico, semente de planta de milho transgênico, método de uso da célula de planta de milho, método de coleta de dados de análise de ácidos nucleicos, método de reprodução de plantas
US20240011043A1 (en) 2020-07-31 2024-01-11 Inari Agriculture Technology, Inc. Generation of plants with improved transgenic loci by genome editing
US11214811B1 (en) 2020-07-31 2022-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. INIR6 transgenic maize
US11369073B2 (en) 2020-07-31 2022-06-28 Inari Agriculture Technology, Inc. INIR12 transgenic maize
US11326177B2 (en) 2020-07-31 2022-05-10 Inari Agriculture Technology, Inc. INIR12 transgenic maize
WO2022033991A1 (de) 2020-08-13 2022-02-17 Bayer Aktiengesellschaft 5-amino substituierte triazole als schädlingsbekämpfungsmittel
WO2022053453A1 (de) 2020-09-09 2022-03-17 Bayer Aktiengesellschaft Azolcarboxamide als schädlingsbekämpfungsmittel
WO2022058327A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Bayer Aktiengesellschaft Substituted ureas and derivatives as new antifungal agents
US11369075B2 (en) 2020-09-25 2022-06-28 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 90392435
US11363789B2 (en) 2020-09-25 2022-06-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 90440910
US11363790B2 (en) 2020-09-25 2022-06-21 M.S. Technologies, L.L.C Soybean cultivar 91320747
US11363791B2 (en) 2020-09-25 2022-06-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 96060511
US11432513B2 (en) 2020-09-25 2022-09-06 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 99350040
EP3974414A1 (de) 2020-09-25 2022-03-30 Bayer AG 5-amino substituierte pyrazole und triazole als schädlingsbekämpfungsmittel
US11412693B2 (en) 2020-09-25 2022-08-16 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 95240447
EP3915971A1 (en) 2020-12-16 2021-12-01 Bayer Aktiengesellschaft Phenyl-s(o)n-phenylamidines and the use thereof as fungicides
WO2022129196A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft Heterobicycle substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides
WO2022129190A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft (hetero)aryl substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides
CN116669554A (zh) 2020-12-18 2023-08-29 拜耳公司 使用Dhodh抑制剂来防治作物中的抗性植物病原性真菌
WO2022129188A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft 1,2,4-oxadiazol-3-yl pyrimidines as fungicides
US11540481B2 (en) 2020-12-29 2023-01-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 97282440
US11457602B2 (en) 2020-12-29 2022-10-04 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 97442034
US11477962B2 (en) 2020-12-29 2022-10-25 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 94110617
US11445691B2 (en) 2020-12-29 2022-09-20 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 92170645
EP4036083A1 (de) 2021-02-02 2022-08-03 Bayer Aktiengesellschaft 5-oxy substituierte hetereozyklen, als schädlingsbekämpfungsmittel
CN117441015A (zh) 2021-02-11 2024-01-23 成对植物服务股份有限公司 用于修饰植物中细胞分裂素氧化酶水平的方法和组合物
WO2022182834A1 (en) 2021-02-25 2022-09-01 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying root architecture in plants
BR112023019400A2 (pt) 2021-03-30 2023-12-05 Bayer Ag 3-(hetero)aril-5-clorodifluorometil-1,2,4-oxadiazol como fungicida
BR112023019788A2 (pt) 2021-03-30 2023-11-07 Bayer Ag 3-(hetero)aril-5-clorodifluorometil-1,2,4-oxadiazol como fungicida
CN117597344A (zh) 2021-05-06 2024-02-23 拜耳公司 烷基酰胺取代的环状咪唑及其作为杀虫剂的用途
EP4337661A1 (de) 2021-05-12 2024-03-20 Bayer Aktiengesellschaft 2-(het)aryl-substituierte kondensierte heterocyclen-derivate als schädlingsbekämpfungsmittel
UY39822A (es) 2021-06-17 2022-12-30 Pairwise Plants Services Inc Modificación de factores de transcripción de la familia de factores reguladores del crecimiento en s
UY39827A (es) 2021-06-24 2023-01-31 Pairwise Plants Services Inc Modificación de genes de ubiquitina ligasa e3 hect para mejorar los rasgos de rendimiento
CA3224982A1 (en) 2021-07-01 2023-01-05 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for enhancing root system development
CA3229056A1 (en) 2021-08-12 2023-02-16 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits
CA3228942A1 (en) 2021-08-13 2023-02-16 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combinations and fungicide compositions comprising those
CA3229224A1 (en) 2021-08-17 2023-02-23 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying cytokinin receptor histidine kinase genes in plants
AU2022335669A1 (en) 2021-08-25 2024-02-01 Bayer Aktiengesellschaft Novel pyrazinyl-triazole compounds as pesticides
WO2023034731A1 (en) 2021-08-30 2023-03-09 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of ubiquitin binding peptidase genes in plants for yield trait improvement
AR126938A1 (es) 2021-09-02 2023-11-29 Pairwise Plants Services Inc Métodos y composiciones para mejorar la arquitectura de las plantas y los rasgos de rendimiento
EP4144739A1 (de) 2021-09-02 2023-03-08 Bayer Aktiengesellschaft Anellierte pyrazole als schädlingsbekämpfungsmittel
US11678637B2 (en) 2021-09-07 2023-06-20 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 03220116
US11825797B2 (en) 2021-09-07 2023-11-28 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 03020534
US11818998B2 (en) 2021-09-07 2023-11-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 05370116
US11737418B2 (en) 2021-09-07 2023-08-29 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 00120926
US11678638B2 (en) 2021-09-07 2023-06-20 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 02050116
US11712016B2 (en) 2021-09-07 2023-08-01 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 05101723
US11653616B2 (en) 2021-09-07 2023-05-23 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 03310138
US11716948B2 (en) 2021-09-07 2023-08-08 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 04010758
US11737417B2 (en) 2021-09-07 2023-08-29 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 09020706
US11696559B2 (en) 2021-09-07 2023-07-11 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 08230349
US11832575B2 (en) 2021-09-08 2023-12-05 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 09230307
US11895974B2 (en) 2021-09-08 2024-02-13 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 08140308
US11839191B2 (en) 2021-09-08 2023-12-12 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 01230720
US11622528B2 (en) 2021-09-08 2023-04-11 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 01230324
US11716949B2 (en) 2021-09-08 2023-08-08 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 04130507
US11690345B2 (en) 2021-09-08 2023-07-04 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 09150308
US11766017B2 (en) 2021-09-08 2023-09-26 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 01430308
US11771039B2 (en) 2021-09-08 2023-10-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 06210302
US11696560B2 (en) 2021-09-08 2023-07-11 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 01440925
US11825798B2 (en) 2021-09-08 2023-11-28 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 07030530
US11716952B2 (en) 2021-09-08 2023-08-08 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 04233715
US11647728B2 (en) 2021-09-08 2023-05-16 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 04420302
US11707043B2 (en) 2021-09-08 2023-07-25 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 02330315
US11825799B2 (en) 2021-09-08 2023-11-28 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 01120432
US11653617B2 (en) 2021-09-08 2023-05-23 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 08330707
US11716951B2 (en) 2021-09-08 2023-08-08 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 04130322
US11825800B2 (en) 2021-09-08 2023-11-28 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 05020705
US11716950B2 (en) 2021-09-08 2023-08-08 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 02020322
US11700828B2 (en) 2021-09-08 2023-07-18 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 00320209
US11785909B2 (en) 2021-09-10 2023-10-17 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 08080157
US11696562B2 (en) 2021-09-10 2023-07-11 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 06320913
US11744214B2 (en) 2021-09-10 2023-09-05 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 04040454
US11778971B2 (en) 2021-09-10 2023-10-10 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 08150118
US11696561B2 (en) 2021-09-10 2023-07-11 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 03420817
US11856915B2 (en) 2021-09-10 2024-01-02 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 00350156
US11716955B2 (en) 2021-09-10 2023-08-08 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 08080534
US11712017B2 (en) 2021-09-10 2023-08-01 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 02270817
US11716954B2 (en) 2021-09-10 2023-08-08 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 04110156
US11690346B2 (en) 2021-09-10 2023-07-04 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 08210041
US11766018B2 (en) 2021-09-10 2023-09-26 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 08110534
US11716953B2 (en) 2021-09-10 2023-08-08 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 02440012
US11744213B2 (en) 2021-09-10 2023-09-05 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 05150332
US11771042B2 (en) 2021-09-15 2023-10-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 01310539
US11778972B2 (en) 2021-09-15 2023-10-10 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 05120629
US11856917B2 (en) 2021-09-15 2024-01-02 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 02220303
US11771041B2 (en) 2021-09-15 2023-10-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 00230222
US11825801B2 (en) 2021-09-15 2023-11-28 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 03120254
US11766019B2 (en) 2021-09-15 2023-09-26 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 08220628
US11895975B2 (en) 2021-09-15 2024-02-13 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 09001515
US11766021B2 (en) 2021-09-15 2023-09-26 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 03420109
US11832576B2 (en) 2021-09-15 2023-12-05 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 08050515
US11758867B2 (en) 2021-09-15 2023-09-19 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 01020340
US11758868B2 (en) 2021-09-15 2023-09-19 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 03130400
US11771040B2 (en) 2021-09-15 2023-10-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 07110300
US11785910B2 (en) 2021-09-15 2023-10-17 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 00150230
US11766020B2 (en) 2021-09-15 2023-09-26 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 01450536
US11856916B2 (en) 2021-09-15 2024-01-02 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 06380605
WO2023049720A1 (en) 2021-09-21 2023-03-30 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for reducing pod shatter in canola
US11832577B2 (en) 2021-09-22 2023-12-05 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 08070926
US11812716B2 (en) 2021-09-22 2023-11-14 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 04110707
US11778973B2 (en) 2021-09-22 2023-10-10 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 00150108
US11716956B2 (en) 2021-09-22 2023-08-08 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 07090548
US11771043B2 (en) 2021-09-22 2023-10-03 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 06110608
US11825803B2 (en) 2021-09-22 2023-11-28 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 08140870
US11812715B2 (en) 2021-09-22 2023-11-14 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 05150847
US11812712B2 (en) 2021-09-22 2023-11-14 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 02120535
US11812713B2 (en) 2021-09-22 2023-11-14 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 09080611
US11819002B2 (en) 2021-09-22 2023-11-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 06140706
US11819001B2 (en) 2021-09-22 2023-11-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 02180205
US11825802B2 (en) 2021-09-22 2023-11-28 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 05220177
US11778974B2 (en) 2021-09-22 2023-10-10 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 07050021
US11812717B2 (en) 2021-09-22 2023-11-14 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 06360802
US11818999B2 (en) 2021-09-22 2023-11-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 04420349
US11819000B2 (en) 2021-09-22 2023-11-21 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 05030038
US11812714B2 (en) 2021-09-22 2023-11-14 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 03330181
US20230108968A1 (en) 2021-10-04 2023-04-06 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for improving floret fertility and seed yield
US11925164B2 (en) 2021-10-06 2024-03-12 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 07370900
US11839194B2 (en) 2021-10-06 2023-12-12 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 04020201
US11925165B2 (en) 2021-10-06 2024-03-12 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 03050606
US11832580B2 (en) 2021-10-06 2023-12-05 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 06150159
US11903359B2 (en) 2021-10-06 2024-02-20 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 05010818
US11925163B2 (en) 2021-10-06 2024-03-12 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 07160900
US11758870B2 (en) 2021-10-06 2023-09-19 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 09020446
US11925162B2 (en) 2021-10-06 2024-03-12 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 01030624
US11832579B2 (en) 2021-10-06 2023-12-05 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 04120519
AR127300A1 (es) 2021-10-07 2024-01-10 Pairwise Plants Services Inc Métodos para mejorar la fertilidad de la flor y el rendimiento de semillas
US11895976B2 (en) 2021-10-07 2024-02-13 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 04370122
US11882809B2 (en) 2021-10-07 2024-01-30 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 04110611
US11895977B2 (en) 2021-10-07 2024-02-13 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 03220926
US11917975B2 (en) 2021-10-07 2024-03-05 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 05410624
US11895979B2 (en) 2021-11-01 2024-02-13 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 04420512
US11895978B2 (en) 2021-11-01 2024-02-13 M.S. Technologies, L.L.C. Soybean cultivar 03140402
WO2023078915A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Bayer Aktiengesellschaft Bis(hetero)aryl thioether (thio)amides as fungicidal compounds
WO2023099445A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Bayer Aktiengesellschaft Bis(hetero)aryl thioether oxadiazines as fungicidal compounds
US20230183730A1 (en) 2021-12-09 2023-06-15 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for improving floret fertility and seed yield
US20230284577A1 (en) 2022-01-31 2023-09-14 Pairwise Plants Services, Inc. Suppression of shade avoidance response in plants
WO2023148036A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Globachem Nv Methods and compositions for controlling pests in soybean
WO2023148028A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Globachem Nv Methods and compositions for controlling pests
WO2023168217A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits
WO2023192838A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Pairwise Plants Services, Inc. Early flowering rosaceae plants with improved characteristics
US20230357789A1 (en) 2022-04-07 2023-11-09 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving resistance to fusarium head blight
WO2023205714A1 (en) 2022-04-21 2023-10-26 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
US20230348922A1 (en) 2022-05-02 2023-11-02 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for enhancing yield and disease resistance
WO2023213626A1 (en) 2022-05-03 2023-11-09 Bayer Aktiengesellschaft Use of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine for controlling unwanted microorganisms
WO2023213670A1 (en) 2022-05-03 2023-11-09 Bayer Aktiengesellschaft Crystalline forms of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine
US20230416767A1 (en) 2022-05-05 2023-12-28 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying root architecture and/or improving plant yield traits
WO2024006679A1 (en) 2022-06-27 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants
WO2024006792A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
WO2024006791A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
WO2024018016A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Syngenta Crop Protection Ag Crystalline forms of 1,2,4-oxadiazole fungicides
WO2024030984A1 (en) 2022-08-04 2024-02-08 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
WO2024033374A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Syngenta Crop Protection Ag Novel arylcarboxamide or arylthioamide compounds
US20240060081A1 (en) 2022-08-11 2024-02-22 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
EP4295688A1 (en) 2022-09-28 2023-12-27 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combination
CN116716434B (zh) * 2023-08-01 2023-10-03 隆平生物技术(海南)有限公司 转基因大豆事件lp012-3及其检测方法

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
US5094945A (en) 1983-01-05 1992-03-10 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase, production and use
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5176995A (en) 1985-03-28 1993-01-05 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of viruses by amplification and hybridization
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
DE3629890A1 (de) 1986-08-29 1988-03-10 Schering Ag Mikroorganismen und plasmide fuer die 2,4-dichlorphenoxyessigsaeure (2,4-d)-monooxigenase - bildung und verfahren zur herstellung dieser plasmide und staemme
US5310667A (en) 1989-07-17 1994-05-10 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases
US5658772A (en) 1989-12-22 1997-08-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Site-specific recombination of DNA in plant cells
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
US5866775A (en) 1990-09-28 1999-02-02 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases
US5608147A (en) 1994-01-11 1997-03-04 Kaphammer; Bryan J. tfdA gene selectable markers in plants and the use thereof
FR2736926B1 (fr) 1995-07-19 1997-08-22 Rhone Poulenc Agrochimie 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutee, gene codant pour cette proteine et plantes transformees contenant ce gene
US6040497A (en) 1997-04-03 2000-03-21 Dekalb Genetics Corporation Glyphosate resistant maize lines
US7105724B2 (en) 1997-04-04 2006-09-12 Board Of Regents Of University Of Nebraska Methods and materials for making and using transgenic dicamba-degrading organisms
US6720475B1 (en) 1997-11-18 2004-04-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Modified nucleic acid sequence encoding FLP recombinase
US20030237110A9 (en) * 1998-05-12 2003-12-25 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotides and polypeptides derived from corn seedling
US20040031072A1 (en) * 1999-05-06 2004-02-12 La Rosa Thomas J. Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement
US20070083945A1 (en) * 2000-03-10 2007-04-12 Byrum Joseph R Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants
US7834146B2 (en) 2000-05-08 2010-11-16 Monsanto Technology Llc Recombinant polypeptides associated with plants
US20030031757A1 (en) 2001-08-03 2003-02-13 Kraft Food Holdings, Inc. Stable and bioavailable iron fortified beverages
AU2002319037B2 (en) 2001-08-09 2008-05-29 University Of Saskatchewan Wheat plants having increased resistance to imidazolinone herbicides
EP1320299B1 (en) * 2001-08-22 2005-06-08 Solae L.L.C. Soybean meal with a reduced fat and soluble sugar content, and methods of making and using the same
WO2003080809A2 (en) 2002-03-21 2003-10-02 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
JP2004027091A (ja) 2002-06-27 2004-01-29 Nisshin Oillio Ltd 圧搾大豆油及びその製造方法
UA87808C2 (ru) 2002-07-29 2009-08-25 Монсанто Текнолоджи, Ллс Зерновые растения pv-zmir13 (mon863) и композиции и способы их обнаружения
US7045684B1 (en) 2002-08-19 2006-05-16 Mertec, Llc Glyphosate-resistant plants
BRPI0407592B1 (pt) 2003-02-18 2019-12-31 Monsanto Technology Llc 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (epsps) de classe i resistente ao glifosato, molécula de dna codificando a mesma, constructo de dna e processos de preparação de uma planta tolerante ao glifosato e de controle de ervas-daninhas
KR100851686B1 (ko) 2003-09-29 2008-08-11 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 식물에서 스트레스 내성을 향상시키는 방법 및 이들의 방법
FR2865738B1 (fr) 2004-02-03 2008-06-20 Agronomique Inst Nat Rech Utilisation de genes codant des canaux potassiques pour modifier un phenotype relatif a une taille d'au moins un organe de stockage d'une plante
ES2743789T3 (es) 2004-03-26 2020-02-20 Dow Agrosciences Llc Líneas de algodón transgénico Cry1F y Cry1Ac y su identificación específica de evento
BRPI0509460B8 (pt) * 2004-04-30 2022-06-28 Dow Agrosciences Llc genes de resistência a herbicidas
US7750207B2 (en) 2004-09-01 2010-07-06 Monsanto Technology Llc Zea mays ribulose bisphosphate carboxylase activase promoter
ES2432749T3 (es) 2004-09-29 2013-12-05 Pioneer-Hi-Bred International, Inc. Evento DAS-59122-7 de maíz y métodos para su detección
CN101090971B (zh) 2004-10-29 2013-01-02 拜尔作物科学公司 耐受胁迫的棉花植物
WO2006108675A2 (en) * 2005-04-11 2006-10-19 Bayer Bioscience N.V. Elite event a5547-127 and methods and kits for identifying such event in biological samples
AP2693A (en) * 2005-05-27 2013-07-16 Monsanto Technology Llc Soybean event MON89788 and methods for detection thereof
WO2011066360A1 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Dow Agrosciences Llc Detection of aad-12 soybean event 416
NZ595200A (en) 2005-10-28 2013-04-26 Dow Agrosciences Llc Novel herbicide resistance genes
UA14839U (en) 2006-02-23 2006-05-15 Tetiana Viacheslavivna Chokha Biscuit confectionery product
US7951995B2 (en) 2006-06-28 2011-05-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean event 3560.4.3.5 and compositions and methods for the identification and detection thereof
KR101439568B1 (ko) 2006-08-11 2014-09-12 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 아연 손가락 뉴클레아제-매개 상동 재조합
ES2582552T3 (es) * 2006-10-31 2016-09-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Acontecimiento de soja DP-305423-1 y composiciones y métodos para su identificación y/o detección
DK2412812T3 (en) 2006-12-14 2015-05-26 Dow Agrosciences Llc Optimized non-canonical zinc finger proteins
CN100558902C (zh) * 2007-01-24 2009-11-11 中国农业科学院油料作物研究所 转基因油菜外源基因整合事件Rf1外源插入载体旁侧序列及其应用
EP2145007B1 (en) * 2007-05-09 2017-01-25 Dow AgroSciences LLC Novel herbicide resistance genes
JP2008295322A (ja) * 2007-05-30 2008-12-11 Cb:Kk 食用種子加工物
EP2193202A2 (en) 2007-09-21 2010-06-09 BASF Plant Science GmbH Plants with increased yield
CN101889090B (zh) * 2007-10-05 2018-01-23 陶氏益农公司 用于将分子物质转移入植物细胞中的方法
WO2009064652A1 (en) 2007-11-15 2009-05-22 Monsanto Technology Llc Soybean plant and seed corresponding to transgenic event mon87701 and methods for detection thereof
WO2009110924A1 (en) 2008-03-03 2009-09-11 Ms Technologies Llc Antibodies immunoreactive with mutant 5-enolpyruvlshikimate-3-phosphate synthase
AR072107A1 (es) 2008-06-11 2010-08-04 Dow Agrosciences Llc Construcciones para la expresion de genes de tolerancia a herbicidas, plantas relacionadas y combinaciones de caracteres relacionados
EP2924118A1 (en) * 2008-07-01 2015-09-30 Monsanto Technology LLC Recombinant DNA constructs and methods for modulating expression of a target gene
US8344209B2 (en) 2008-07-14 2013-01-01 Syngenta Participations Ag Plant regulatory sequences
EP2392649A3 (en) 2008-08-05 2012-01-11 DSM IP Assets B.V. Adipoyl-7-ADCA producing strains
WO2010079032A1 (en) 2008-12-17 2010-07-15 Basf Plant Science Gmbh Production of ketocarotenoids in plants
BRPI1007175A2 (pt) 2009-01-22 2015-08-18 Syngenta Participations Ag Polipeptídeos hidroxifenilpriruvato dioxigenase mutantes e métodos de uso
RS55883B1 (sr) 2009-11-23 2017-08-31 Bayer Cropscience Nv Biljke soje otporne na herbicide i postupci za njihovo identifikovanje
MX341974B (es) 2009-11-24 2016-09-07 Dow Agrosciences Llc Evento 416 de ariloaxialcanoato dioxigenasa, lineas de soja transgenica relacionadas y su identificacion especifica del evento.
MX2012006075A (es) 2009-11-24 2012-06-19 Dow Agrosciences Llc Control de plantas voluntarias dicotiledoneas de ariloxialcanoato dioxigenasa en cultivos de plantas monocotiledoneas.
UA115766C2 (uk) * 2010-12-03 2017-12-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Трансгенна стійка до гербіцидів рослина сої, яка містить пакетовану подію 8264.44.06.1
CN107603978A (zh) 2011-07-13 2018-01-19 陶氏益农公司 叠加的除草剂耐受性事件8264.42.32.1、相关转基因大豆系及其检测方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7211387B2 (ja) 2020-02-28 2023-01-24 いすゞ自動車株式会社 運転支援装置及び運転支援方法

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