JP6100367B2 - Ｓｌｉｔ−Ｒｏｂｏシステムを用いた骨折又は骨粗鬆症の予防或いは治療用組成物 - Google Patents

Ｓｌｉｔ−Ｒｏｂｏシステムを用いた骨折又は骨粗鬆症の予防或いは治療用組成物 Download PDF

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Description

本発明は、Ｓｌｉｔ、ｒｏｂｏ又はその発現タンパク質を有効成分として含む骨折又は骨粗鬆症の予防或いは治療用薬学組成物、前記遺伝子又は発現タンパク質を用いた骨折又は骨粗鬆症の発生危険予測用キット、及び骨折又は骨粗鬆症の発生危険を予測するための情報提供方法に関する。
骨粗鬆症とは、骨を形成する無機質と基質の量が過度に減少し、骨密度が減少した状態を示すものであって、骨粗鬆症がある場合、骨が折れやすくなる。従って、骨粗鬆症は、低い骨密度（ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ；ＢＭＤ）及び増加された骨折の危険を有する最も頻繁な代謝性骨疾患（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｂｏｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ；ＭＢＤ）である（Ｐｅａｃｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２３：３０３−３２６，２００２；Ａｋｈｔｅｒ， Ｍ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｏｎｅ．４１（１）：１１１−６，２００７）。最近になって、尻、脊椎及び手首等の一般的な骨粗鬆症性骨折で入院した患者が顕著に増加している（Ｆｏｇａｒｔｙ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．， Ｍａｔｕｒｉｔａｓ．５２ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ３−６，２００５；Ｐａｌａｃｉｏｓ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｕｒｉｔａｓ．１５；５２ Ｓｕｐｐｌ１：Ｓ５３−６０．Ｒｅｖｉｅｗ、２００５）。特に、４０歳以降の女性には閉経による閉経後骨粗鬆症が高い頻度で現れ、７０歳以降は男女を問わず老人性骨粗鬆症が発生する。
現在、骨粗鬆症の診断は、Ｘ線撮影等の物理学的方法を通じて行われているが、この方法は、大規模な診断装置を必要とし、Ｘ線を使用することによる安全性等の問題があるだけでなく、今後の骨密度の減少を予め予測することができず、骨密度の数値だけでは正確に骨粗鬆症性骨折の危険がどのくらいか正確に予測するのは難しいという欠点を有している。
従って、閉経後骨粗鬆症や老人性骨粗鬆症をはじめとして各種骨粗鬆症を早期に発見して診断し、骨折のリスクを予測することによって、効果的な治療を行えるようにする迅速かつ簡便であるとともに、正確な方法の確立が求められる。
よって、本発明者は、骨折又は骨粗鬆症の治療剤、及び骨折或いは骨粗鬆症の発生危険予測用マーカーを開発するために研究を続けた結果、ｓｌｉｔ３が細胞及び動物モデルで骨形成を増加させ、骨吸収を減少させて、骨粗鬆症の発病率と負の相関関係を有していることを確認したことによって、本発明を完成した。
本発明の目的は、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２及びｖｉｌｓｅで構成された群から選択された遺伝子またはその発現タンパク質を有効成分として含有する骨折又は骨粗鬆症の予防或いは治療用薬学的組成物を提供することである。
本発明のまた別の目的は、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２及びｖｉｌｓｅで構成された群から選択された遺伝子またはその発現タンパク質を有効成分として含有する骨折又は骨粗鬆症の予防或いは改善用食品組成物を提供することである。
本発明のまた別の目的は、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２及びｖｉｌｓｅで構成された群から選択されたタンパク質を含む骨折又は骨粗鬆症の発生予測用マーカー組成物を提供することである。
本発明のまた別の目的は、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２及びｖｉｌｓｅで構成された群から選択されたタンパク質またはその免疫原性断片に特異的に結合する抗体を含む骨折又は骨粗鬆症の発生予測用キットを提供することである。
本発明のまた別の目的は、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２及びｖｉｌｓｅで構成された群から選択された遺伝子のｍＲＮＡを検出するためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマを含む骨折又は骨粗鬆症の発生予測用キットを提供することである。
本発明のまた別の目的は、骨折又は骨粗鬆症の発生予測に必要な情報を提供するために、患者の血液試料から抗原−抗体反応を介して、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２及びｖｉｌｓｅで構成された群から選択されたタンパク質を検出する方法を提供することである。
本発明のまた別の目的は、被検物質を処理した細胞でｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２及びｖｉｌｓｅタンパク質の発現の水準を比較する段階を含む骨折又は骨粗鬆症治療剤のスクリーニング方法を提供することである。
本発明のまた別の目的は、ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲ２ドメインの組換えペプチド及びこれを含む骨折又は骨粗鬆症の予防或いは治療用薬学的組成物を提供することである。
本発明のまた別の目的は、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２、ｒｏｂｏ４に位置するＳＮＰを含む骨折又は骨粗鬆症の発生予測用マーカー組成物を提供することである。
前記目的を達成するために、本発明は、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２及びｖｉｌｓｅで構成された群から選択された遺伝子またはその発現タンパク質を有効成分として含有する骨折又は骨粗鬆症の予防あるいは治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２及びｖｉｌｓｅで構成された群から選択されたタンパク質を有効成分として含有する骨折又は骨粗鬆症の予防あるいは改善用食品組成物を提供する。
また、本発明は、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２及びｖｉｌｓｅで構成された群から選択されたタンパク質を含む骨折又は骨粗鬆症の発生予測用マーカー組成物を提供する。
また、本発明は、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２及びｖｉｌｓｅで構成された群から選択されたタンパク質またはその免疫原性断片に特異的に結合する抗体を含む骨折又は骨粗鬆症の発生予測用キットを提供する。
また、本発明は、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２及びｖｉｌｓｅで構成された群から選択された遺伝子のｍＲＮＡを検出するためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマを含む骨折又は骨粗鬆症の発生予測用キットを提供する。
また、本発明は、骨折又は骨粗鬆症の発生予測に必要な情報を提供するために、患者の血液試料から抗原−抗体反応を介して、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２及びｖｉｌｓｅで構成された群から選択されたタンパク質を検出する方法を提供する。
また、本発明は、被検物質を処理した細胞でｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２及びｖｉｌｓｅタンパク質の発現の水準を比較する段階を含む骨折又は骨粗鬆症治療剤のスクリーニング方法を提供する。
また、本発明のｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲ２ドメインの組換えペプチド及びこれを含む骨折又は骨粗鬆症の予防或いは治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２、ｒｏｂｏ４に位置するＳＮＰを含む骨折又は骨粗鬆症の発生予測用マーカー組成物を提供する。
本発明のｓｌｉｔまたはｒｏｂｏタンパク質は、細胞及び動物モデルで骨形成を増加させ、骨吸収を減少させて、骨粗鬆症の発病率と負の相関関係を有しており、骨折又は骨粗鬆症の予防或いは治療用組成物及び骨折または骨粗鬆症の発生危険を予測するためのバイオマーカーとして有用に用いられることができる。
図１は、カップリング現象を調査するための試験管内システムを確立するために、破骨細胞の生成及び骨吸収に対する可変の培養条件を準備する図である。｛はこつさいぼう｝ 図２は、初期の破骨細胞の生成から誘導された因子による前骨芽細胞の補充の刺激が骨−再形成部位でカップリング現象の主要なメカニズムであることを説明する図である。 図３aは、分化した破骨細胞でのｓｌｉｔ３の分泌を示す図である。 図３bは、ＲＡＮＫＬにより分化した破骨細胞でのｓｌｉｔ３の発現がＮＦＡＴｃ1 ｓｉＲＮＡの前処置により抑制されることを示す図である。 図４aは、ｓｌｉｔ３の濃度に応じて骨芽細胞の移動が増加することを示す図である。 図４bは、ｓｌｉｔ３の濃度に応じて骨芽細胞の生存能が増加することを示す図である。 図４cは、ｓｌｉｔ３の濃度に応じて骨芽細胞の増殖が増加することを示す図である。 図４dは、ｓｌｉｔ３により骨芽細胞の分化マーカーであるＡＬＰ及びＯＣＮの発現が増加することを示す図である。 図４eは、ｓｌｉｔ３により骨芽細胞内でＯＰＧの生産が促進されることを示す図である。 図４fは、ｓｌｉｔ３により骨芽細胞でラメリポディアが観察されることを示す図である。 図５は、動物モデルでｓｌｉｔ３の注入により骨形成が増加することを示す図である。 図６は、動物モデルでｓｌｉｔ３の処理により骨損失が抑制されることを示す図である。 図７は、ｓｌｉｔ３により骨形成の表面に骨芽細胞の移動が増加することを説明した図である。 図８aは、ｓｌｉｔ３ノックアウトマウスの胚をＶｏｎ Ｋｏｓｓａ染色を介して観察した図である。 図８bは、ｓｌｉｔ３ノックアウトマウスの胚をＶＥＧＦ免疫組織化学染色を介して観察した図である。 図９は、骨細胞でｓｌｉｔ３の作用がｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２またはｒｏｂｏ３受容体を介して媒介されることを説明する図である。 図１０は、Ｒｏｂｏ１受容体を介したｓｌｉｔの作用が骨細胞でｖｉｌｓｅにより媒介されることができるということを説明する図である。 図１１は、Ｒｏｂｏ１−ノックアウトの動物モデルで骨密度が減少することを説明する図である。 図１２は、ｓｌｉｔ１及びｓｌｉｔ２により破骨細胞の分化が減少することを説明する図である。 図１３は、ＬＲＲ２ドメインの組換えペプチドが破骨細胞の分化を抑制することを説明する図である。
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、下記群から選択された遺伝子又はその発現タンパク質を有効成分として含有する骨折又は骨粗鬆症の予防或いは治療用薬学的組成物を提供する：
配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるｓｌｉｔ１と、
配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるｓｌｉｔ２と、
配列番号３のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるｓｌｉｔ３と、
配列番号４のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるｒｏｂｏ１と、
配列番号５のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるｒｏｂｏ２と、
配列番号６のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるｖｉｌｓｅ。
本発明の一実施例によると、前記ｓｌｉｔ１タンパク質は配列番号1で表示され、前記ｓｌｉｔ２タンパク質は配列番号２で表示され、前記ｓｌｉｔ３タンパク質は配列番号３で表示され、前記ｒｏｂｏ１タンパク質は配列番号４で表示され、前記ｒｏｂｏ２タンパク質は配列番号５で表示され、前記ｖｉｌｓｅタンパク質は配列番号６で表示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、及び前記タンパク質の機能的同等物を含む。
前記「機能的同等物」とは、アミノ酸の付加、置換または結実の結果、配列番号１乃至６で表示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列相同性を有するものであって、配列番号１乃至６で表示されるタンパク質と実質的に同質の生理活性を示すタンパク質を言う。
本発明のｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２又はｖｉｌｓｅタンパク質は、その天然型アミノ酸配列を有するタンパク質だけでなく、そのアミノ酸配列の変異体もまた本発明の範囲に含まれる。ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２又はｖｉｌｓｅタンパク質の変異体とは、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２又はｖｉｌｓｅの天然アミノ酸配列と一つ以上のアミノ酸残基が結実、挿入、非保全的または保全的置換或いはこれらの組み合わせにより相違する配列を有するタンパク質を意味する。分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドでのアミノ酸の交換は、当該分野に公知となっている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７９）。最も通常に生じる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ/Ｓｅｒ、Ｖａｌ/Ｉｌｅ、Ａｓｐ/Ｇｌｕ、Ｔｈｒ/Ｓｅｒ、Ａｌａ/Ｇｌｙ、Ａｌａ/Ｔｈｒ、Ｓｅｒ/Ａｓｎ、Ａｌａ/Ｖａｌ、Ｓｅｒ/Ｇｌｙ、Ｔｈｙ/Ｐｈｅ、Ａｌａ/Ｐｒｏ、Ｌｙｓ/Ａｒｇ、Ａｓｐ/Ａｓｎ、Ｌｅｕ/Ｉｌｅ、Ｌｅｕ/Ｖａｌ、Ａｌａ/Ｇｌｕ、Ａｓｐ/Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）等で修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されることもある。
前記ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２又はｖｉｌｓｅのタンパク質又はその変異体は、天然から抽出したり、合成（Ｍｅｒｒｉｆｌｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５６，１９６３）あるいはＤＮＡ配列を基本とする遺伝子組換え方法により製造されることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，２版，１９８９）。
本発明の一実施例によると、前記ｓｌｉｔ１遺伝子は、配列番号９の塩基配列を有することができる。
本発明の一実施例によると、前記ｓｌｉｔ１２遺伝子は、配列番号１０の塩基配列を有することができる。
本発明の一実施例によると、前記ｓｌｉｔ３遺伝子は、配列番号１１の塩基配列を有することができる。
本発明の一実施例によると、前記ｒｏｂｏ１遺伝子は、配列番号１２の塩基配列を有することができる。
本発明の一実施例によると、前記ｒｏｂｏ２遺伝子は、配列番号１３の塩基配列を有することができる。
本発明の一実施例によると、前記ｖｉｌｓｅ遺伝子は、配列番号１６の塩基配列を有することができる。
本発明の好ましい具現例において、前記ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２又はｖｉｌｓｅは、タンパク質の形態だけでなく、遺伝子治療やワクチン等に使用されるために、細胞内でｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１又はｒｏｂｏ２遺伝子を発現することができるベクターの形態で提供されることができる。
前記発現ベクターは、前記ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２又はｖｉｌｓｅ遺伝子を挿入して発現することができる当業界に公知となった発現ベクターを用いることができ、例えば、ｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＣＲ３.１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等の発現ベクターを使用することができる。
また、前記ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２又はｖｉｌｓｅをコードする塩基配列、即ち、ポリヌクレオチドを含む組換えDNA分子を、発現を調節する核酸配列に作動可能に連結した形態、例えば、発現ベクターの形態で治療対象の患者内でこれが発現するように前記ポリヌクレオチドを投与する。前記ベクターは、よって、コード配列を発現させることができるプロモーターの部位を含む適当な転写調節信号を含み、前記プロモーターは、治療される患者内で作動可能なものである。従って、ヒト遺伝子治療用であって、ＲＮＡポリメラーゼを転写開始部位に導くのに必要な配列だけでなく、適当であれば、エンハンサーを含む他の作動配列又は調節配列を含む用語であるプロモーターは、好ましくはヒト遺伝子からのヒトプロモーター配列または一般的にヒトに発現する遺伝子からのヒトプロモーター配列、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からのプロモーターである。このような観点で、適当な公知となった真核プロモーターのうち、ＣＭＶ、即ち初期のプロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期のＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（“ＲＳＶ”）のようなレトロウイルスＬＴＲプロモーター、及びマウスのメタロチオネイン−１プロモーターのようなメタロチオネインプロモーターが適合である。
前記ポリヌクレオチド配列及び転写調節配列は、商業的に入手可能なｐＢＲ３２２のようなプラスミドに基づいて複製可能なプラスミドベクター内にクローニングされ提供されるか、又はよく知られている公開された手続きの日常的な応用により入手可能なプラスミドから構築されることもできる。
前記ベクターはまた、前記遺伝子配列の３’に位置する転写調節配列、及びヒト治療に使用されるとき、ＳＶ４０ウイルスのようなウイルスからの相応する配列のように治療される患者に認識可能なポリアデニル化配列を含むことができる。その他の転写調節配列がこの技術分野によく知られており、利用可能である。
前記発現ベクターはまた、前記ベクターが伝播されることができるように抗生剤の抵抗性のような選択可能なマーカーを含むことができる。
それ自体で前記タンパク質を合成することができる発現ベクターを物理的方法で直接的に傷部位に導入させることができる。これらの例としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ）のような製薬学的に許容される賦形剤中の溶液内に適当なベヒクル内の「ネイキッド」核酸ベクターを局部的に適用すること、または当業界に知られている方法によって、「遺伝子銃」の技術とも知られている粒子銃のような物理的方法でベクターを投与することを含む。
前記「遺伝子銃」の技術は、米国特許番号第５３７１０１５号に記述された通り、推進装置からの高圧力下で放出させる方法であって、ベクターでコーティングされた金ビードのような不活性粒子を傷部位、例えば、皮膚細胞の表面を通過できる程度に充分な速力で加速するものである。
また、ＤＮＡを直接受容体に投与するその他物理的方法としては、超音波、電気的刺激、電気透過及びミクロシーディング（ｍｉｃｒｏｓｅｅｄｉｎｇ）等がある。
前記遺伝子配列はまた、形質転換された宿主細胞の手段として傷部位に投与されることができる。細胞は、患者から収集された細胞を含み、前記核酸配列をこの細胞内へ当業界に公知となっている遺伝子導入方法により導入し、形質転換された細胞を培養液中に成長させて患者に移植する。
前記記述したような発現構造体を本発明の治療に多様な方法で使用できる。従って、前記発現構造体は、患者において治療が必要な部位に直接投与されることができる。
本発明の別の具現例において、前記薬学的組成物は、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２又はｖｉｌｓｅの発現を増加させる活性因子を有効成分として含むことができる。
本発明において、「ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２又はｖｉｌｓｅの発現を増加させる活性因子」とは、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２又はｖｉｌｓｅに直接または間接的に作用し、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２又はｖｉｌｓｅの生物学的活性を改善、誘導、刺激、増加させる物質を意味する。前記物質は、有機又は無機化合物のような単一化合物、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物及び脂質のような生体高分子化合物並びに複数化合物の複合体等を含む。前記ｓｌｉｔ３の発現を増加させる活性因子は、ｓｌｉｔ３の発現、活性、又は機能の減少により発病する疾病の予防、改善および治療に利用されることができる。前記物質がｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２又はｖｉｌｓｅを活性化させるメカニズムは特に制限されない。例えば、前記物質は、転写、翻訳等の遺伝子発現を増大させたり、非活性型を活性型に転換させるメカニズムとして作用できる。好ましくは、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２又はｖｉｌｓｅを活性化させる物質は、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物及び脂質のような生体高分子化合物である。核酸及びタンパク質の配列が既に公知となったｓｌｉｔ３に対して、当業者は誘導剤または活性剤として作用する有機又は無機化合物のような単一化合物ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物及び脂質のような生体高分子化合物及び複数化合物の複合体等を当分野の技術を用いて製造またはスクリーニングできる。
本発明において、前記ｓｌｉｔ３は分化した破骨細胞から分泌され、骨芽細胞で移動、生存能、増殖、分化及びＯＰＧの生産を増加させる機能を行い、骨形成を増加させて、骨損失を抑制し、血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び骨形成に寄与するＶＥＧＦの発現を増加させるという優れた効果を有している。また、本発明によるｓｌｉｔ３の機能と活性の低下は、骨折又は骨粗鬆症の原因になり得る。これによって、前記遺伝子の機能を正常化、活性化させるための遺伝子又はタンパク質の処置は、骨折及び骨粗鬆症の治療的接近のための重要な観点になることができる。
従って、前記薬学的組成物は、前記遺伝子を含む発現ベクター又はその発現ベクターを含む宿主細胞を増殖及び活性化させて患者に投与し、骨折又は骨粗鬆症を治療又は予防することができ、前記遺伝子又はその発現タンパク質によって破骨細胞の分化を抑制させ、骨芽細胞の分化、増殖、移動を促進させて、骨折又は骨粗鬆症を治療することができる。
本発明の薬学的組成物は、その製造において通常使用する適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。また、通常の方法に従って、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾール等の経口型剤形、外用剤、座剤及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用されることができる。当該技術分野に知られている適合な製剤は、文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、最近、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）に開示されているものを使用することが好ましい。含まれ得る担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、でん粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油等がある。前記組成物を製剤化する場合は、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤等の希釈剤又は賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等が含まれ、このような固形製剤は、前記組成物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、でん粉、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース、ラクトース、ゼラチン等を混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤等が該当するが、通常使用される単純希釈剤である水、流動パラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等が含まれることができる。非経口投与のための製剤には、滅菌した水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステル等が使用されることができる。座剤の基剤としては、ウィテップゾール （ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン等が使用されることができる。
本発明で使用される用語「投与」は、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の組成物を提供することを意味する。
本発明の薬学的組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間に応じて異なるが、当業者により適宜選択されることができる。好ましい効果のために、本発明の組成物は、１日０.００１ｍｇ/ｋｇ乃至１００００ｍｇ/ｋｇの量で投与することができる。前記組成物の投与は、１日に一度投与してもよく、数回分けて投与してもよい。
本発明の薬学的組成物は、個体に多様な経路で投与されることができる。投与のすべての方式は予想できるが、例えば、経口、直腸又は静脈、筋肉、皮下、子宮内の硬膜または脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）への注射によって投与されることができる。
本発明の組成物は、骨折又は骨粗鬆症の予防及び治療のために、単独で、又は手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。
また、本発明は、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２及びｖｉｌｓｅで構成された群から選択されたタンパク質を有効成分として含有する骨折又は骨粗鬆症の予防または改善用食品組成物を提供する。
本発明において、前記「骨折又は骨粗鬆症の予防または改善用食品組成物」は、疾病の予防及び改善、生体防御、免疫、病後の回復、老化抑制等生体調節機能を有する食品を言うものであって、長期的に服用したとき、人体に無害しなければならない。
本発明の組成物は、骨折又は骨粗鬆症の予防あるいは改善を目的として健康機能食品に添加されることができる。本発明のタンパク質またはその発現を増加させる活性因子を食品添加物に使用する場合、前記成分をそのまま添加したり、他の食品又は食品成分と共に使用されることができ、通常の方法によって適宜使用されることができる。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康または治療的処置）に応じて適合に決定されることができる。一般的に、食品または飲料の製造時に、本発明のタンパク質またはその発現を増加させる活性因子は、原料に対して１５重量％以下、好ましくは１０重量％以下の量で添加される。しかし、健康及び衛星を目的としたり、または健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記範囲以下であり得、安全性の面において何ら問題がないため、有効成分は前記範囲以上の量でも使用されることができる。
前記食品の種類には特に制限はない。前記物質を添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤等があり、通常の意味での健康食品を全て含む。
本発明の健康飲料組成物は、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物等を追加成分として含むことができる。前述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、シクロデキストリンのような天然甘味剤や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味剤等を使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物１００ｍｌ当たり、一般的に約０.０１乃至１０ｇ、好ましくは約０.０１乃至０.１ｇである。
前記以外に、本発明の組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤等を含むことができる。その他に、本発明の組成物は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。このような成分は、独立または組み合わせて使用することができる。このような添加剤の割合は大きく重要ではないが、本発明の組成物１００重量部当たり０.０１乃至０.１重量部の範囲で選択されることが一般的である。
また、本発明は、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２及びｖｉｌｓｅで構成された群から選択されたタンパク質を含む骨折又は骨粗鬆症の発生予測用マーカー組成物を提供する。
本発明の具現例において、骨粗鬆症の可能性のある患者を対象に骨粗鬆症の発病率とｓｌｉｔ３タンパク質との相関関係に対して、患者の血液から得たｓｌｉｔ３タンパク質のプロテオームを分析し、骨粗鬆症の発病率が高いグループで血中ｓｌｉｔ３タンパク質の濃度が特徴的に発現が減少するということを明らかにし、骨折又は骨粗鬆症の診断または治療に使用されることができるタンパク質性マーカーとしてｓｌｉｔ３を選択した。
本発明のｓｌｉｔ３タンパク質は、骨粗鬆症の発病率と負の相関関係を有しており、骨折又は骨粗鬆症の発生危険を予測するためのバイオマーカーとして有用に利用されることができる。
本発明に使用された用語、「プロテオーム（ｐｒｏｔｅｏｍｅ）」とは、遺伝体から作られることができる全てのタンパク質の総体を意味するが、これは、ある細胞または組織で特異的な生理状態や病理状態に応じてプロテオームの様相が常に変化することになる動的な概念である。プロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）は、このようなプロテオームを研究する方法と技術を包括して指称するものであって、タンパク質の性質を遺伝子の発現、翻訳後変形（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、他のタンパク質との結合に焦点を置いて研究することによって、細胞内の変形過程とネットワークの形成を疾病の進行過程と連係させて、総体的に理解しようとする研究分野を意味する。このようにプロテオームは、ある細胞または組織での生理状態や病理状態を代弁するので、疾病の診断に直接使用されることができる診断のマーカーを探す方法としては最も適合なものである。また、骨折または骨粗鬆症のような場合、特定遺伝子の発現が疾病の進行程度に関与し、骨折又は骨粗鬆症を促進することが確認されれば、そのタンパク質の存在を確認及び同定し、骨折又は骨粗鬆症の診断あるいは治療剤の開発の標的タンパク質にすることもできる。ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）の優れた敏感度と遺伝子の容易な増幅等のメリットで、これを用いた診断及び治療剤の開発やはり多く行われているが、ＤＮＡやｍＲＮＡ段階での変化が、実際に細胞内で活性を有するタンパク質の変化にすぐに連結されないこともあるという点で、理論上の問題点が残っており、さらに現実的には、遺伝物質がない体液の場合、プロテオミクスが唯一の研究方法である。現在、非−侵襲的｛しんしゅう てき｝アプローチ（ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ ａｐｐｒｏａｃｈ）として診断に使われているものは、血漿、血清、尿、脳脊髄液、羊水、分泌液等の体液であるが、多くの研究者が診断マーカーとして疾病の特異的なタンパク質を発掘するために、プロテオミクス方法を導入している。
本明細書において、「骨折又は骨粗鬆症の発生予測用マーカー」は、骨粗鬆症の発病率が高いグループと低いグループの血液試料を区分する基準になるタンパク質性物質を指称する。本発明において、このタンパク質性マーカーは、骨粗鬆症の発病率が高いグループと低いグループの血液での存在量が相対的に特徴的に多かったり少ない。
本発明は、骨粗鬆症の発病率が高いグループと低いグループの血液からプロテオームを分析したものであるため、このように確認されたタンパク質性マーカーは、骨粗鬆症の発病に対して特異的であるといえ、従って、骨折又は骨粗鬆症の診断に有用に使用されることができる。さらに、このように確認されたタンパク質性マーカーが、骨粗鬆症の発病率が高いグループで変化様相が著しいという点を勘案すると、このタンパク質性マーカーの生理学的機能は、骨粗鬆症の発病に直接的に関係されたものである可能性があり、従って、このタンパク質性マーカーは、骨粗鬆症の発病のメカニズムを研究したり、骨粗鬆症の治療の開発のための標的タンパク質としても有用に使用されることができる。
また、本発明は、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２及びｖｉｌｓｅで構成された群から選択されたタンパク質またはその免疫原性断片に特異的に結合する抗体を含む骨折又は骨粗鬆症の発生予測用キットを提供する。
本発明において、抗体とは抗原性部位に対して指示される特異的なタンパク質分子を意味する。本発明の目的上、抗体はマーカータンパク質に対して特異的に結合する抗体を意味し、多クローン抗体、単クローン抗体及び組換え抗体を全て含む。
前記した通り、骨折又は骨粗鬆症の発生危険予測用マーカータンパク質が糾明されたため、これを用いて抗体を生成することは、当業界に広く公知となった技術を用いて容易に製造できる。
多クローン抗体は、前記した骨折又は骨粗鬆症の発生危険予測用マーカータンパク質の抗原を動物に注射し、動物から採血して、抗体を含む血清を収得する当業界に広く公知となった方法によって生産することができる。このような多クローン抗体は、ヤギ、ウサギ、羊、猿、馬、豚、牛、犬等の任意の動物種宿主から製造可能である。
単クローン抗体は、当業界に広く公知となったハイブリドーマ方法（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６:５１１−５１９参照）、又はファージ抗体ライブラリ（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３５２:６２４−６２８，１９９１;Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.，２２２:５８，１−５９７，１９９１）技術を用いて製造されることができる。前記方法で製造された抗体は、ゲル電気泳動、透析、塩沈殿、イオン交換クロマトグラフィ、環境にやさしいクロマトグラフィ等の方法を用いて分離、精製することができる。
本発明の抗体は、２つの全長の軽鎖及び２つの全長の重鎖を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片を含む。抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）、Ｆ（ａｂ'）２及びＦｖ等がある。
本発明のキットは、分析方法に適合な一つの種類またはそれ以上の他の構成成分組成物、溶液または装置で構成される。
例えば、本発明のキットは、ＥＬＩＳＡを行うために必要な必須要素を含むことを特徴とするキットであり得る。前記ＥＬＩＳＡキットは、マーカータンパク質に対する特異的な抗体を含み、前記タンパク質の水準を測定する製材を含む。前記ＥＬＩＳＡキットは、「抗原−抗体複合体」を形成した抗体を検出することができる試薬、例えば、標識された２次抗体、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｏｒｅｓ）、酵素（例:抗体と接合）及びその基質を含むことができる。また、定量対照区のタンパク質に特異的な抗体を含むことができる。
また、本発明のキットは、ＰＣＲを行うために分析しようとする試料から由来したゲノムＤＮＡ、本発明のマーカーに対して特異的なプライマセット、適当量のＤＮＡ重合酵素（例えば、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ｄＮＴＰ混合物、ＰＣＲ緩衝溶液及び水を含むキットであり得る。前記ＰＣＲ緩衝溶液は、ＫＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及びＭｇＣｌ２を含有することができる。これ以外に、ＰＣＲ産物の増幅可否を確認することができる電気泳動を行うのに必要な構成成分が、本発明のキットにさらに含まれることができる。
また、本発明のキットは、ＲＴ−ＰＣＲを行うために必要な必須要素を含むキットであり得る。ＲＴ−ＰＣＲキットは、マーカー遺伝子に対する特異的な各々のプライマ対以外にも、テストチューブまたは他の適切なコンテナ、反応緩衝液（ｐＨ及びマグネシウム濃度は多様）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ−ポリメラーゼ及び逆転写酵素のような酵素、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ抑制剤、ＤＥＰＣ−水（ＤＥＰＣ−ｗａｔｅｒ）、滅菌水等を含むことができる。また、定量対照区として使用される遺伝子に特異的なプライマ対を含むことができる。
また、本発明のキットは、ＤＮＡチップを行うために必要な必須要素を含むキットであり得る。ＤＮＡチップのキットは、遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡがプローブに付着されている基板を含み、基板は、定量構造の遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡを含むことができる。
また、本発明のキットは、本発明のマーカーが固定化されている基板を有するマイクロアレイの形態であり得る。
また、本発明は、骨折又は骨粗鬆症の発生予測に必要な情報を提供するために、患者の血液試料から抗原−抗体反応を通じ、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２及びｖｉｌｓｅで構成された群から選択されたタンパク質を検出する方法を提供する。
本発明において、「タンパク質の検出」は、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現の水準を測定することによって確認することができる。
前記「ｍＲＮＡ発現の水準の測定」は、骨折又は骨粗鬆症の発生危険を予測するために、生物学的試料で前記タンパク質を暗号化するｍＲＮＡの存在可否と、発現の程度を確認する過程で、ｍＲＮＡの量を測定する。このための分析方法としては、当業界に公知となった方法を利用することができ、例えば、重合酵素反応（ＰＣＲ）、逆転写重合酵素反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、競争的逆転写重合酵素反応（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写重合酵素反応（Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ;ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、ノーザンブロッティング （Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＤＮＡチップ等があるが、これに制限されるわけではない。
本発明において、「タンパク質発現の水準の測定」は、骨折又は骨粗鬆症の発生危険を予測するために生物学的試料でタンパク質の存在可否と発現の程度を確認する過程であって、好ましくは、前記遺伝子のタンパク質に対して特異的に結合する抗体を用いてタンパク質の量を確認することができる。このための分析方法としては、当業界に公知となった方法を利用することができ、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫分析（ＲＩＡ:Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏ ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オクテロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散法、ロケット（ｒｏｃｋｅｔ）免疫電気冷凍、組織免疫染色、免疫沈降分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、流式細胞分析（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ、ＦＡＣＳ）、タンパク質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ）等があるが、これに制限されるわけではない。
本発明の好ましい具現例によると、前記ｓｌｉｔ３は骨粗鬆症の発病率と負の相関関係を有しており、骨折又は骨粗鬆症の発生危険を予測するためのバイオマーカーとして有用に利用されることができる。
また、本発明は、（ａ）ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２及びｖｉｌｓｅで構成された群から選択された遺伝子が導入された細胞を培養する段階と、（ｂ）被検物質を前記（ａ）段階の細胞と接触させる段階と、（ｃ）前記（ｂ）段階の細胞で、ｓｌｉｔ１、ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２またはｖｉｌｓｅタンパク質の発現の水準を、被検物質を処理しない対照群と比較する段階とを含む骨折又は骨粗鬆症治療剤のスクリーニング方法を提供する。
また、本発明は、配列番号１７のアミノ酸配列で表示され、ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲ２ドメインの組換えペプチド、及びこれを含む骨折又は骨粗鬆症の予防或いは治療用薬学的組成物を提供する。
前記ｓｌｉｔ３タンパク質のＬＲＲ２ドメインは、ｓｌｉｔタンパク質にある四つのｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ（ＬＲＲ）ドメインの一つであって、このうち第二のドメインであるＬＲＲ２が受容体と結合する。本発明者は、ＬＲＲ２ドメインとしてｓｌｉｔ３の小さい組換えペプチドを製造した後、これを用いて破骨細胞の分化に対する効果を確認した結果、前記組換えペプチドは、破骨細胞の分化を顕著に抑制することが確認された（図１３）。従って、前記組換えペプチドは骨粗鬆症の治療に有用に使用されることができる。
また、本発明は、下記群から選択されたＳＮＰ位置の塩基を含む１０つ以上の連続塩基で構成される骨折又は骨粗鬆症の発生予測用ポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドを提供する:
配列番号１０の塩基配列からなるポリヌクレオチドのＮＣＢＩ ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ:ｒｓ７６５５０８４;
配列番号１１の塩基配列からなるポリヌクレオチドのＮＣＢＩ ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ:ｒｓ１５４９９０９;
配列番号１１の塩基配列からなるポリヌクレオチドのＮＣＢＩ ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ:ｒｓ１００３６７２７;
配列番号１３の塩基配列からなるポリヌクレオチドのＮＣＢＩ ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ:ｒｓ３８２１７３５;
配列番号１３の塩基配列からなるポリヌクレオチドのＮＣＢＩ ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ:ｒｓ７８８１７２４８;及び
配列番号１５の塩基配列からなるポリヌクレオチドのＮＣＢＩ ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ:ｒｓ１２４１８５４８。
前記ＳＮＰに対するＮＣＢＩのｒｅｆＳＮＰ ＩＤは、前記ＳＮＰの配列及びその位置を示すものである。当業者であれば、前記番号を用いてＳＮＰの位置及び配列を容易に確認することができる。分析に使用されたｒｅｆｅｒｅｎｃｅ配列は、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍで２００９年２月に収集され公開された配列であり、ＮＣＢＩ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｄａｔａｂａｓｅのＧＲＣｈ３７（ｈｇ１９）（ｈｔｔｐ://ｇｅｎｏｍe.ｕｃｓｃ.ｅｄｕ/ｃｇｉ−ｂｉｎ/ｈｇＧａｔｅｗａｙ）で詳しい内容を確認することができる。ＮＣＢＩに登録されているＳＮＰのｒｅｆＳＮＰ ＩＤに該当する具体的な配列は、続けられる遺伝子に対する研究結果に応じて少しずつ変更されることがあり、このような変更された配列もまた、本発明の範囲内に含まれることは当業者に自明であろう。
本発明の実施例によると、前記ＲｅｆＳＮＰ ＩＤ:ｒｓ７６５５０８４の場合は、ＳＬＩＴ２遺伝子の第４染色体２０２５５３０６位置の塩基で骨密度が低く示される遺伝子型は、ＴからＧで置換された。ＲｅｆＳＮＰ ＩＤ:ｒｓ１５４９９０９の場合には、ＳＬＩＴ３遺伝子の第５染色体１６８１８０６７０位置の塩基で骨密度が低く示される遺伝子型は、ＣからＴで置換された。ＲｅｆＳＮＰ ＩＤ:ｒｓ１００３６７２７の場合には、ＳＬＩＴ３遺伝子の第５染色体１６８１８００８１位置の塩基で骨密度が低く示される遺伝子型は、ＣからＴで置換された。ＲｅｆＳＮＰ ＩＤ:ｒｓ３８２１７３５の場合には、ＲＯＢＯ２遺伝子の第３染色体７７６８４２２２位置の塩基で骨密度が低く示される遺伝子型は、ＣからＡで置換された。ＲｅｆＳＮＰ ＩＤ:ｒｓ７８８１７２４８の場合には、ＲＯＢＯ２遺伝子の第３染色体７７６２６７８８位置の塩基で骨密度が低く示される遺伝子型は、ＣからＧで置換された。ＲｅｆＳＮＰ ＩＤ:ｒｓ１２４１８５４８の場合には、ＲＯＢＯ４遺伝子の第１１染色体１２４７５７５６０位置の塩基で骨密度が低く示される遺伝子型は、ＡからＧで置換された。
下記実施例から確認できるように、骨密度（ＢＭＤ）が平均以上であるグループと、極めて低いＢＭＤグループを対象に前記遺伝子に存在する遺伝子多型を研究した結果、前記遺伝子のＳＮＰ位置の対立遺伝子は、極めて低いＢＭＤ状態の危険性と有意に関連があった（表６参照）。具体的に、低いＢＭＤ状態の危険を示すＳＮＰ位置で遺伝子型はｒｅｆＳＮＰ ＩＤ:ｒｓ７６５５０８４の場合はＧＴ、ＧＧ遺伝子型であり;ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ:ｒｓ１５４９９０９の場合はＴＴ遺伝子型であり;ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ:ｒｓ１００３６７２７の場合はＴＴ遺伝子型であり;ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ:ｒｓ３８２１７３５の場合はＣＣ、ＣＴ遺伝子型であり;ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ:ｒｓ７８８１７２４８の場合はＣＧ、ＧＧ遺伝子型であり;ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ:ｒｓ１２４１８５４８の場合はＧＧ、ＧＡ遺伝子型で示された。
従って、本発明の前記ＳＮＰは極めて低い骨密度による骨折又は骨粗鬆症の発生予測のために有用に使用されることができる。
本発明において、前記ＳＮＰを含むポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドは１０つ以上の連続された塩基で構成されたＤＮＡ断片であり得、ＤＮＡ断片の大きさは全体遺伝子のｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈではない一つのＳＮＰ部位の塩基を含むどんな大きさの断片でも構わないが、好ましくは１０乃至数百塩基であることを特徴とし、さらに好ましくは１００−５００個の塩基が適当である。１００−５００個塩基の場合は、前記ＳＮＰを探知するためのプローブ乃至はプライマで用いることができ、それ以上の塩基の場合は、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ等に用いられることができる。
また、本発明は、前記ＳＮＰを含むポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドを含む骨折又は骨粗鬆症の発生予測用マーカー組成物、或いは予測用キットを提供する。
本発明において、前記ＳＮＰを含むキットは、当業界に公知となったＳＮＰキットの製造方法を通じて具現されることができる。例えば、前記キットがマイクロアレイで具現される場合、例えば、ＳＮＰを含むポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドを基板上に固定させ、核酸の混成化及び混成化結果の検出を介して、ＳＮＰを容易に検出することができる。
前記ＳＮＰを含むポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドを基板上に固定させることは、当業界に知られている方法であって、容易に行われることができる。また、マイクロアレイ上での核酸混成化及び混成化結果の検出方法もまた、当業界に知られている方法の通りに行われることができる。例えば、核酸試料を検出可能な信号を発生させる標識物質（例えば、蛍光物質）で標識した後、マイクロアレイ上に混成化し、前記標識物質から発生する信号を検出することによって混成化結果を検出することができる。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明しようとする。これらの実施例は、ひたすら本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者に自明であろう。
材料及び試薬
ＮＦＡＴｃ１に対する抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ｓｌｉｔ３に対する抗体及び組換えｓｌｉｔ１/２/３は、それぞれＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）及びＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ.（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）から購入した。Ｒｏｂｏ１及びＲｏｂｏ２ ｆｃキメラは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ.から購入した。
実施方法１．細胞培養、器官培養及び条件培地の収集
一次マウス骨髄細胞（ＢＭＣｓ）は、５−６週齢のＣ５７ＢＬ/６マウスの大腿骨（ｆｅｍｕｒ）及び脛骨（ｔｉｂｉａ）をフラッシング（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）することによって得た後、５％ＣＯ２で加湿された条件で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ;Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）、１００Ｕ/ｍＬペニシリン、及び１００μｇ/ｍＬストレプトマイシンを含む最小の必須培地（α−ＭＥＭ;Ｗｅｌ Ｇｅｎｅ，Ｄａｅｇｕ，Ｋｏｒｅａ）で、３７℃で培養した。培養の２４時間後、非付着細胞（ｎｏｎａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）を収集して４８−ウェルプレートで１.０×１０５細胞/ウェルの密度で培養した。３日以上３０ｎｇ/ｍＬ Ｍ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ.）で培養したＢＭＣｓを骨髄大食細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ＢＭＭｓ）として使用した。この段階の細胞を破骨細胞前駆体（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）と見なした。ＢＭＣｓは毎２−３日毎に交換された培養培地を用いて、３０ｎｇ/ｍＬ Ｍ−ＣＳＦ及び５０ｎｇ/ｍＬの可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）ＲＡＮＫＬ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ.）で培養することによって、破骨細胞に分化を誘導した。他の方法として、マウス（ｍｕｒｉｎｅ）の大食細胞Ｒａｗ２６４.７細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）もまた同じ容量のＲＡＮＫＬを使用し、破骨細胞−類似細胞の製造に使用された。
ヒト破骨細胞を用いた共免疫沈降（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）実験のために、末梢血液を普通の健康な支援者から入手した。血液を同量のα−ＭＥＭで希釈した後、末梢血液単球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ、ＰＢＭＣｓ）をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐＴＭ（Ａｘｉｓ-Ｓｈｉｅｌｄ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）密度勾配上の遠心分離によって分離した。前記細胞をａｕｔｏＭａｃｓ ｂｕｆｆｅｒで懸濁し、ＣＤ１４−陽性単球を細胞分離機（ａｕｔｏＭａｃｓ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｅｐａｒａｔｏｒ;Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて選別した。ＰＢＭＣｓ（３.０−４.０×１０６/ｗｅｌｌ）をＭ−ＣＳＦ（２５ｎｇ/ｍＬ）がある状態で３日間６ウェルプレートで培養した後、Ｍ−ＣＳＦ（２５ｎｇ/ｍＬ）及びＲＡＮＫＬ（３０ｎｇ/ｍｌ）で追加培養した。細胞が破骨細胞として完全に分化するのには７−９日がかかる。
新生のＣ５７ＢＬ/６マウスから得た頭蓋冠（ｃａｌｖａｒｉａ）のシーケンシャルコラゲナーゼ消化（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）で一次マウスの破骨細胞を分離し、１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭで維持した。マウスＭＣ３Ｔ３−Ｅ１前骨芽細胞株（ｐｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、ＡＴＣＣ）を５％ＣＯ２で加湿された条件で、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ/ｍＬペニシリン、及び１００μｇ/ｍＬストレプトマイシンを含むα−ＭＥＭで３７℃で培養した。前記培地は、週２回交換した。８０％コンフルエンスまで成長させ、前記細胞をｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて継代培養した。ヒト骨芽細胞を用いた共免疫沈降実験のために、一次ヒト骨髄間質細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ，ＢＭＳＣｓ）を肋骨（ｒｉｂｓ）から分離した。肋骨は、代謝性骨疾患のない患者の開胸術（ｔｈｏｒａｃｏｔｏｍｙ）時に開く。前記肋骨は、無菌状態で切除し、軟組織をきれいにした後に縦方向に（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌｌｙ）開いた。露出された骨髄を無血清α−ＭＥＭで何回の洗浄を用いてフラッシュアウトし、１，４００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを培養培地で再懸濁し、ヒトＢＭＳＣの分画をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐＴＭ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）で得た。前記細胞を７５−ｃｍ２のプラスチック培養フラスコに３×１０７細胞/７５−ｃｍ２密度でシーディングし、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ/ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ/ｍＬのストレプトマイシンを含むα−ＭＥＭで培養した。培地は２週間後から週２回交換した。前記細胞が８０−９０％のコンフルエンスに成長すると、０.０１％トリプシン及び０.０５％ＥＤＴＡを用いて継代培養した。第２継代培養の細胞を実験に使用した。
６週齢のＣ５７ＢＬ/６マウスから得た大腿骨の器官培養を行った。前記骨髄を強くフラッシングし、細胞をＨ２Ｏで２４時間振盪培養してさらに除去した。その後、前記骨は、α−ＭＥＭで広く洗浄し、ＢＭＭｓと共同−培養した。
破骨細胞生成（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）又は骨吸収（ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）の間ＣＭは指示された日付に２４時間収集した。確保したＣＭは、０.４５-μｍメンブレンフィルターでろ過し、使用時まで−７０℃で保管した。
実験方法２．ＣＭで破骨細胞の形成及び吸収活性の測定
破骨細胞生成の多様な段階で収集されたＣＭで破骨細胞形成の程度は、０.２Ｕ/Ｌ低い検出限界値を有する商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｏｌｄｏｎ，ＵＫ）を用いて製造会社の説明書に従ってＴＲＡＰ−５ｂ（ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓe−５ｂ）を測定することによって評価した。ＣＭでの吸収活性は、２.０ｎｇ/ｍＬの低い検出限界値を有するＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＲａｔＬａｐｓ;ＩｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ）を用いてＣＴＸ（Ｃ−ｔｅｌｏｐｅｐｔｉｄｅ）を測定することによって評価した。
実験方法３．走化性及び傷治癒の分析
走化性（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ）の分析は、８−μｍポアーを含むポリカーボネートメンブレンのあるトランスウェルを用いて、Ｂｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ ｓｙｓｔｅｍで行った（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）。細胞を０.１％ＦＢＳがあるα−ＭＥＭ１００μＬ当たり１.０×１０５細胞の密度で６時間インナーチャンバにシーディングした後、さらに２４時間アウターチャンバでＣＭまたはｓｌｉｔ３で処理した。上部のメンブレン上の細胞、綿棒で磨いて完全に除去した。下部のメンブレンに侵入した細胞を固定し、ヘマトキシリンを固定し、ヘマトキシリンで染色した。最後に、前記細胞をコンピュータビデオ−イメージングシステム（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてカウントした。
傷−治癒の分析のために、コンフルエント細胞をプラスチックチップを用いて傷が付くようにした。細胞移動（ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）が０.１％ＦＢＳが添加されたα−ＭＥＭで生じた後、傷を表示し、０時間及び２４時間時点で倒立顕微鏡を用いて測定した。定量はＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、各傷縫合（ｗｏｕｎｄ ｃｌｏｓｕｒｅ）領域を測定することによって行った。データは、傷縫合のパーセントで表示した。
実験方法４．細胞生存力及び分化の測定
細胞生存力は、製造会社の説明書に従ってセルカウティングキット−８（ＣＣＫ−８;Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて測定した。簡単に説明すると、１０μＬのＷＳＴ−８ｄｙｅ（２−[２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ]−３−[４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ]−５−[２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ]−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ、ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）を９６ウェルプレートの各ウェルに添加して２時間反応させた後、４５０ｎｍで吸光度をマイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ３４０ＰＣ;Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて６５０ｎｍの参照波長で測定した。
細胞分化は、Ｂｒｄ−Ｕ（５−ｂｒｏｍｏ−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）を用いて測定した。骨芽細胞を９６ウェルプレートにシーディングして２４時間反応させた後、α−ＭＥＭで２４時間継代培養した。続いて、前記細胞を２４時間Ｂｒｄ−Ｕで反応させた後、細胞分化をＢｒｄ−Ｕのラベリング及び検出キット（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定した。
実験方法５．プロテオミクス・プロトコル
サンプル準備
Ｒａｗ２６４.７細胞は、１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭを用いて１００ｍｍディッシュ当り４.０×１０５細胞の密度でシーディングした後、前記細胞を一日に可溶性５０ｎｇ/ｍＬ ＲＡＮＫＬがあったりなかったりする状態で処理し、破骨細胞に分化させた。翌日、前記細胞を無血清及びフェノールレッドがない培地で３回洗浄した後、培地をＲＡＮＫＬがあったりなかったりする、６ｍＬの無血清及びフェノールレッドがないα−ＭＥＭに交換し、一日間培養した。ＣＭは０.４５μｍのメンブレンフィルターでろ過して−７０℃で保管した。ＣＭにあるタンパク質は凍結乾燥して沈殿させた。
Ｃ１８可逆相ＨＰＬＣ及びトリプシン消化による分画
タンパク質の複合体は、Ｃ１８−ＨＰＬＣカラム（２１４ＴＰ５１２５、２.１×１５０ｍｍ;Ｖｙｄａｃ Ｇｒａｃｅ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、オート−サンプラー、及びＵＶ検出器（２１５ｎｍ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ;Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｐｏｈａｎｇ，Ｋｏｒｅａ）で構成されている毛細管ＨＰＬＣシステムを用いて、０.３ｍＬ/ｍｉｎの流速で１２０分間０−６０％勾配のＡＣＮ（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）及び０.１％ＴＦＡ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を用いて９６分画に分離した。
トリプシン消化（ｔｒｙｐｓｉｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）のために、各タンパク質分画を５０ｍＭＡＢＣ（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）に溶解させた後、１０ｍＭ ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を添加してサンプルを還元させ、１００ｍＭのヨードアセトアミド（ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）をシステインアルキル化のために添加した。最後に、５００ｎｇのトリプシンを添加し、３７℃で６時間反応させた。
ＬＣ−ＭＳ/ＭＳ分析
それぞれの消化されたサンプルは、ナノフローＨＰＬＣシステムが備えられたＬＴＱ（ｌｉｎｅａｒ−ｔｒａｐ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）質量分析器を用いて分析した（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）。ペプチドは、Ｃ１８（３μｍ）がパッキングされた可逆相分析カラム（１０ｃｍ×７５μｍｉ.ｄ.）を用いて分離した。勾配は２５０ｎＬ/ｍｉｎｕｔｅの流速で５％ＡＣＮで５分間始め、以降６０分間４０％ＡＣＮで、最終１０分間８０％ＡＣＮで増加させた。溶離液（ｅｌｕｅｎｔ）は１.８ｋＶの電気噴射電圧でナノ−イオンソースを用いてＬＴＱ質量分析器に注入した。前記分析法は、４００−１５００ｍ/ｚ範囲のフル質量分析（ＭＳ）のスキャンで構成され、５つの最も強いイオンに対するデータ−依存性質量分析（ＭＳ２）はフルＭＳスキャンで分析された。
ＭＡＳＣＯＴデータベースの検索
ＴＱ質量分析器から得たデータは国際タンパク質指数（ＩＰＩ）のマウスＦＡＳＴＡのデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ３.５４）及びＭＡＳＣＯＴ検索エンジンを用いて分析した。固定された変形としてトリプシン消化による不完全切断、メチオニンの酸化に対する可変的な変形、及びシステインのカルバミドメチル化（ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）を検索時に考慮した。本発明者は、信頼範囲９５％の確率でそれぞれのイオンを評価した（Ｐ＜０.０５）。
機能的注釈及び分泌性タンパク質の選別
機能的注釈（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）のために、同定されたタンパク質は、ウェブベースのプログラム（ｈｔｔｐ://ｄａｖｉｄ.ａｂｃｃ.ｎｃｉｆｃｒｆ.ｇｏｖ）である、ＤＡＶＩＤ（ａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）データベースを用いて、それらの生物学的過程及び分子機能によって分類した。また、同定されたタンパク質は、ＨＭＭスコアリング（ＳｉｇｎａｌＰ ３.０ ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ ｍａｔｒｉｘ ｓｃｏｒｉｎｇ）を用いて、それらの分泌特性を明らかにするために評価した。
実験方法６．ウエスタンブロット
細胞溶解物は溶解バッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ[ｐＨ７.５]、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２.５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１ｍＭ−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＮａＦ、及びａ ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｍｉｘｔｕｒｅ）で４℃で２０分間製造し、前記溶解物のタンパク質濃度はＢＣＡタンパク質分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ.，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて測定した。１０−２０μｇのタンパク質を含むサンプルは、１０％ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥに分離した後、ニトロセルロースメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に移した。ＴＢＳＴ（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ[ｐＨ７.４]、１.５Ｍ ＮａＣｌ、０.１％Ｔｗｅｅｎ−２０）に入っている５％スキムミルクで１時間室温でブロッキングした後、前記メンブレンを１次抗体で一晩反応させた後、２次抗体で反応させた。免疫反応タンパク質は、増強化学発光キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて検出した。
実験方法７．共免疫沈降法
ＧＦＰ−ｔａｇｇｅｄ Ｒｏｂｏ1及びＭｙｃ−ｔａｇｇｅｄ ＶｉｌｓｅのヒトｃＤＮＡはＯｒｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）社から購入した。Ｒｏｂｏ１−ＧＦＰ及びＶｉｌｓｅ−ＭｙｃのｃＤＮＡをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）でヒトＢＭＳＣ又はヒトＰＢＭＣに６時間トランスフェクションさせた後、細胞をＳｌｉｔ３で処理した。前記細胞はプロテアーゼ阻害剤混合物（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ;Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ.Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）及びホスファターゼ阻害剤（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ;１ ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＮａＦ）を含むＴＮＥバッファ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で溶解させた。溶解物は４℃で１８時間ＧＦＰ抗体（Ａｎａｓｐｅｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びタンパク質−Ｇ−セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で免疫沈降させた。免疫沈降物及び細胞溶解物は、抗−ＧＦＰまたは抗−Ｍｙｃ抗体（Ｎｏｖｕｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，Ｃｏ，ＵＳＡ）で免疫ブロット分析に提供された。
実験方法８．ＲＴ−ＰＣＲ及び定量的なリアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡは、製造会社の説明書に従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡ）を用いて分離し、ｃＤＮＡはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１μｇの全ＲＮＡから合成した。全てのＰＣＲ増幅はＢｉｏｍｅｔｒａ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＧｍｂＨ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。各ターゲット遺伝子のｍＲＮＡ発現の水準は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ ｐｒｏｇｒａｍを用いて、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅｓ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）と正規化した。特異的プライマ対は次の通りである:
５’−ＡＧＧ ＧＡＡ ＧＣＣ ＴＡＣ ＧＣＡ ＧＡＴ Ｇ−３’(ｓｅｎｓｅ) 及び ５’−ＴＧＧ ＡＣＡ ＧＴＧ ＧＧＣ ＧＡＴ ＴＴＴ ＡＴ−３’(ａｎｔｉｓｅｎｓｅ) ｆｏｒ Ｒｏｂｏ１; ５’−ＡＧＣ ＣＣＣ ＡＣＡ ＣＡＡ ＡＣＡ ＡＧＧ−３’(ｓｅｎｓｅ) 及び ５’−ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＧＣ ＴＴＧ ＣＴＧ ＴＡＧ Ｇ−３’(ａｎｔｉｓｅｎｓｅ) ｆｏｒ Ｒｏｂｏ２; ５’−ＧＣＡ ＧＣＧ ＣＴＣ ＡＡＣ ＣＣＴ ＡＧＴ−３’(ｓｅｎｓｅ) 及び ５’−ＣＴＴ ＣＴＧ ＧＣＣ ＣＡＡ ＣＴＣ ＴＴＧ ＡＣ−３’(ａｎｔｉｓｅｎｓｅ) ｆｏｒ Ｒｏｂｏ３; ５’−ＣＧＣ ＡＴＧ ＴＣＴ ＣＴＧ ＡＣＣ ＣＣＴ ＡＣ−３’(ｓｅｎｓｅ)及び５’−ＧＡＧ ＣＴＧ ＴＴＡ ＧＣＴ ＴＧＧ ＴＧＣ ＡＡ−３’(ａｎｔｉｓｅｎｓｅ) ｆｏｒ Ｒｏｂｏ４; 並びに ５'−ＡＣＴ ＴＴＧ ＴＣＡ ＡＧＣ ＴＣＡ ＴＴＴ ＣＣ−３’(ｓｅｎｓｅ)及び ５'−ＴＧＣ ＡＧＣ ＧＡＡ ＣＴＴ ＴＡＴ ＴＧＡ ＴＧ−３’(ａｎｔｉｓｅｎｓｅ) ｆｏｒ ＧＡＰＤＨ。増幅プロトコルは９５℃で３０秒間変性(ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ)、６０℃で３０秒間アニーリング(ａｎｎｅａｌｉｎｇ) 及び７２℃で３０秒間伸長(ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ)の３０サイクルで構成した。ＰＣＲ産物 は１％アガロースゲル上で分離してＥｔＢｒで染色し、ＵＶ下で視覚化した。
定量的なＰＣＲはＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ)を用いて行い、ＯＰＧ(ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ)、ＲＡＮＫＬ、ＡＬＰ(ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ)、ＯＣＮ(ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ)、ＴＲＡＰ、ＣａｔＫ(ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ)、ＭＭＰ−９(ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ-９)および ＣＴＲ(ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ)の遺伝子発現の水準は、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ)を用いて測定した。ＰＣＲ増幅は２回(ｉｎ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ) 行い、水は陰性対照群として、各結果物(ｅａｃｈ ｒｕｎ)でｃＤＮＡを代替するのに使用した。特異的プライマの配列は次の通りである: ５’−ＣＡＣ ＧＧＣ ＣＡＴ ＣＣＴ ＡＴＡ ＴＧＧ ＴＡＡ−３’(ｓｅｎｓｅ)及び５’−ＧＡＧ ＡＣＡ ＴＴＴ ＴＣＣ ＣＧＴ ＴＣＡ ＣＣ−３’ｆｏｒ ＡＬＰ; ５’−ＧＣＴ ＡＣＣ ＴＴＧ ＧＡＧ ＣＣＴ ＣＡＧ ＴＣ−３’(ｓｅｎｓｅ) 及び５’−ＣＴＣ ＧＴＣ ＡＣＡ ＡＧＣ ＡＧＧ ＧＴＴ ＡＡＧ−３’(ａｎｔｉｓｅｎｓｅ) ｆｏｒ ＯＣＮ; ５’−ＧＣＡ ＴＴＡ ＴＧＡ ＣＣＣ ＡＧＡ ＡＡＣ ＴＧＧ Ｔ−３’(ｓｅｎｓｅ)及び５’−ＴＡＧ ＧＴＧ ＣＣＡ ＧＧＡ ＧＣＡ ＣＡＴ ＴＴ−３’（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ) ｆｏｒ ＯＰＧ; ５’−ＡＧＣ ＧＣＡ ＧＡＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＡＡ ＣＡ −３’(ｓｅｎｓｅ)及び５’−ＧＡＧ ＴＣＣ ＴＧＣ ＡＡＡ ＴＣＴ ＧＣＧ ＴＴ−３’(ａｎｔｉｓｅｎｓｅ) ｆｏｒ ＲＡＮＫＬ; ５’−ＣＧＡ ＣＣＡ ＴＴＧ ＴＴＡ ＧＣＣ ＡＣＡ ＴＡＣ Ｇ−３’(ｓｅｎｓｅ)及び５’−ＴＣＧ ＴＣＣ ＴＧＡ ＡＧＡ ＴＡＣ ＴＧＣ ＡＧＧ ＴＴ−３’(ａｎｔｉｓｅｎｓｅ) ｆｏｒ ＴＲＡＰ; ５’−ＡＴＡ ＴＧＴ ＧＧＧ ＣＣＡ ＧＧＡ ＴＧＡ ＡＡＧ ＴＴ−３’(ｓｅｎｓｅ)及び５’−ＴＣＧ ＴＴＣ ＣＣＣ ＡＣＡ ＧＧＡ ＡＴＣ ＴＣＴ−３’(ａｎｔｉｓｅｎｓｅ) ｆｏｒ ＣａｔＫ; ５’−ＴＧＴ ＣＴＧ ＧＡＧ ＡＴＴ ＣＧＡ ＣＴＴ ＧＡＡ ＧＴＣ−３’(ｓｅｎｓｅ)及び５’-ＴＧＡ ＧＴＴ ＣＣＡ ＧＧＧ ＣＡＣ ＡＣＣ Ａ−３’（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ) ｆｏｒ ＭＭＰ−９; ５’−ＡＧＴ ＴＧＣ ＣＣＴ ＣＴＴ ＡＴＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＡＧ−３’(ｓｅｎｓｅ)及び５’−ＧＧＡ ＧＴＧ ＴＣＧ ＴＣＣ ＣＡＧ ＣＡＣ ＡＴ−３’(ａｎｔｉｓｅｎｓｅ) ｆｏｒ ＣＴＲ;並びに５’−ＣＴＣ ＣＡＣ ＴＣＡ ＣＧＧ ＣＡＡ ＡＴＴ ＣＡ−３’(ｓｅｎｓｅ)及び５’−ＧＣＣ ＴＣＡ ＣＣＣ ＣＡＴ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＴ−３’(ａｎｔｉｓｅｎｓｅ) ｆｏｒ ＧＡＰＤＨ。前記反応プロトコルは、ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡの重合酵素を活性化するために、９５℃で１０分間前反応、９５℃で１０秒間、５５℃で１５秒間及び７２℃で２０秒間セット(ｓｅｔ)である４５サイクルの増幅を含んだ。結果物はＧＡＰＤＨと正規化した。
実験方法９．ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
ＮＦＡＴｃ１（Ｍｍ_ＮＦＡＴｃ１_６;Ｑｉａｇｅｎ）、Ｒｏｂｏ１（ＭＳＳ２０８６７３;Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｒｏｂｏ２（ＭＳＳ２４１００５;Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対するｓｉＲＮＡ及びｎｏｎｓｅｎｓｅ ｓｉＲＮＡ（Ｓｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉＴＭ ｓｉＲＮＡ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ;Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造会社の説明書に従ってｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクションした。簡単に説明すると、１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭで細胞を培養した後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にあるｓｉＲＮＡ−試薬の混合物を添加した後、細胞を追加で６時間さらに培養した。以降、前記培地は新鮮な完全α−ＭＥＭに交換した後、細胞を２日間さらに培養した。
実験方法１０．ラメリポディア（ｌａｍｅｌｌｉｐｏｄｉａ）の確認
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を２４ウェルプレートに２４時間シーディングした後、ｓｌｉｔ３があったりなかったりする状態で２４時間ｓｔａｒｖｅさせた。前記細胞を固定し、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓｅｒｕｍ）で二回洗浄した。前記細胞を１００ｎｇ/ｍＬ ファロイジン （ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ;Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で３７℃で３０分間培養した。免疫蛍光のイメージは、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いてキャプチャーした。
実験方法１１．石灰化結節の形成
一次マウスＢＭＣｓを１２ウェルプレートに６×１０６細胞/ウェルの密度でシーディングし、１０％ＦＢＳ（ｖ/ｖ）、１００Ｕ/ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ/Ｌのストレプトマイシンが補充されたα−ＭＥＭで、３７℃で５％ＣＯ２及び９５％空気で加湿されたインキュベータで７日間培養した。７日後、非付着細胞は除去し、以降ＢＭＳＣｓ（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ）を示す付着細胞はＢＭＳＣｓの骨芽細胞の分化を誘導するための分化培地（α−ＭＥＭ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０％ ＦＢＳ[ｖ/ｖ]ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ８ｍＭ β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｎｄ ５０μｇ/ｍL ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）で１４日まで追加的な期間で成長させた。前記培地は毎２日または３日毎に交換した。１４日目、培養物を７０％エタノールで１時間固定した後、４０ｍＭ Ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ Ｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ.Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で染色した。
実験方法１２．ＴＲＡＰ染色及び吸収の分析
一次マウスＢＭＣｓは３０ｎｇ/ｍＬ Ｍ−ＣＳＦ及び５０ｎｇ/ｍＬの可溶性ＲＡＮＫＬで４日間培養した。付着細胞は固定し、製造会社の説明書に従ってｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて破骨細胞の酵素的マーカーである、ＴＲＡＰで染色した。３つ以上の核（ｎｕｃｌｅｉ）を含むＴＲＡＰ−陽性多核細胞を破骨細胞と見なし、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）下でカウントした。
吸収領域の測定のために、ＢＭＣｓ（５×１０４ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌ）を３０ｎｇ/ｍＬ Ｍ−ＣＳＦ及び５０ｎｇ/ｍＬの可溶性ＲＡＮＫＬと共に象牙質ディスク（ｄｅｎｔｉｎｅ ｄｉｓｃｓ）上に位置させた。１０日後、前記スライドを５％次亜塩素酸｛じあ えんそさん｝ナトリウム水溶液で洗浄して細胞を除去した後、吸収ピット（ｐｉｔｓ）をヘマトキシリンで染色した。ＢＭＣｓ数当たり吸収された領域の測定のために、ＴＲＡＰ染色を象牙質ディスク上でヘマトキシリンの染色以前に行った。吸収ピットの領域は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＶｅｒｓａＤｏｃ Ｍｏｄｅｌ ３０００ Ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて分析した。
実験方法１３．生体内頭蓋冠骨の形成モデル
４週齢のＣ５７ＢＬ/６マウスに３週間で週５日、一日に一回、ＰＢＳまたは３００μｇ/ｋｇのｓｌｉｔ３を頭蓋冠（ｃａｌｖａｒｉａ）に皮下に注射した。注射はλ縫合（ｌａｍｂｄｏｉｄａｌ ｓｕｔｕｒｅ）及び冠状縫合（ｃｏｒｏｎａｌ ｓｕｔｕｒｅ）の間にある頭蓋冠の矢状面（ｃａｌｖａｒｉａｌ ｓａｇｉｔｔａｌ）の左側で施行し、右側は対照群として使用された。前記動物を犠牲させ、頭蓋冠を４％ＰＦＡ（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定させた。各頭蓋冠は１４％ＥＤＴＡで石灰質を除去し、凍結切片（ｆｒｏｚｅｎ ｓｅｃｔｉｏｎ）用ＯＣＴ（ｏｐｔｉｃａｌ ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）化合物に包埋した。サンプルを７μｍの切片に切削した後、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。頭蓋冠骨の幅は、光学顕微鏡で測定した。
実験方法１４．生体内頭蓋冠骨消失モデル
６週齢のＣ５７ＢＬ/６マウスを４つのグループに分けた:対照群（０.１％ＢＳＡ+ＰＢＳ）;ｓｌｉｔ３−処理群（０.１％ＢＳＡ+３００μｇ/ｋｇ ｓｌｉｔ３）;ＩＬ−１−誘導された頭蓋冠骨消失群（２μｇＩＬ−１+ＰＢＳ）;及びＩＬ−１骨消失及びｓｌｉｔ３−処理群（２μｇＩＬ−１+３００μｇ/ｋｇ ｓｌｉｔ３）。前記溶液で処理されたコラーゲンスポンジ（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ Ｔｙｐｅ Ｉ−Ａ;Ｎｉｔｔａ Ｇｅｌａｔｉｎ Ｉｎｃ., Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａn）を矢状縫合（ｓａｇｉｔｔａｌ ｓｕｔｕｒｅ）の中央にある頭蓋冠に移植した。前記マウスを移植７日後に犠牲させ、頭蓋冠を４％ＰＦＡに固定させた。各頭蓋冠を１４％ＥＤＴＡで石灰質を除去し、凍結切片用ＯＣＴ化合物に包埋した。サンプルを７μｍ切片に切削した後、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。頭蓋冠骨の幅は、光学顕微鏡で測定した。
実験方法１５．骨髄腔（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃａｖｉｔｙ）の移植
本発明者は、１１週齢のＣ５７ＢＬ/６マウスを使用した。脛骨（ｔｉｂｉａｓ）を２３ゲージ針で丁寧に穴を開けた。ＰＢＳ（ｌｅｆｔ ｔｉｂｉａ）又は３００μｇ/ｋｇのｓｌｉｔ３（ｒｉｇｈｔ ｔｉｂｉａ）でＧＦＰ−標識されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を３１ゲージ針を用いて骨髄腔に注入した。前記マウスは、２日または３日後に犠牲させ、脛骨は４％ＰＦＡに固定させた。それぞれの脛骨を１４％ＥＤＴＡで石灰質を除去し、凍結切片用ＯＣＴ化合物に包埋した。ＧＦＰ陽性細胞の数をカウントするために、サンプルを蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）下に位置されたスライド上で観察した。
実験方法１６．ｓｌｉｔ３ノックアウトマウス胚でＶｏｎ Ｋｏｓｓａ染色及びＶＥＧＦ免疫組織化学染色
ｓｌｉｔ３突然変異胚は、Ｍｕｔａｎｔ Ｍｏｕｓｅ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒｓ（ｓｔｏｃｋ ｎｕｍｂｅr ０３０７５９−ＭＵ;Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した、雄性及び雌性のｓｌｉｔ３＋/−Ｃ５７ＢＬ/６Ｊマウスを交配して製造した。胚組織はＰＢＳから収集し、室温で一晩１０％ホルマリンに固定させた。組織化学の分析のために、野生型及びｓｌｉｔ３突然変異の１７.５日（Ｅ１７．５）された胚を４％ＰＦＡで固定させ、ＯＣＴ化合物に包埋させた。７μｍ切片をＶｏｎ Ｋｏｓｓａ反応及びヌクレアファストレッド（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｓｔ ｒｅｄ）で染色した。Ｆｏｒ ＩＨＣ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ。免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のために、ペルオキシダーゼクロモーゲン（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。前記切片を１０分間メタノールに溶かした３％Ｈ２Ｏ２にクエンチ（ｑｕｅｎｃｈ）した後、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳで１:２００または１:５００で希釈された抗−ＶＥＧＦ抗体（Ａｂｃａｍ）で室温で１時間反応させた。抗体結合に対する信号はＤＡＢ（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）基質で視覚化した。全てのサンプルは光学顕微鏡で評価した。
実験方法１７．骨密度測定
全身骨密度（ＢＭＤ）は密度測定器（Ｌｕｎａｒ ＰＩＸＩｍｕｓ ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １.４; ＧＥ-Ｌｕｎａｒ Ｃｏ., Ｍａｄｉｓｏｎ, ＷＩ, ＵＳＡ ）を用いて、二重エネルギー放射線吸収法（ｄｕａｌ−ｅｎｅｒｇｙ Ｘ-ｒａｙ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ）で測定した。変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ， ＣＶ）で表示される、装備の精密度は１.２７％であった。前記マウスを４０ｍｇ/ｋｇ Ｚｏｌｅｔｉｌ ５０（Ｖｉｒｂａｃ，Ｆｒａｎｃｅ）及び５.６ｍｇ/ｋｇ Ｒｏｍｐｕｎ（Ｂａｙｅｒ Ｋｏｒｅａ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）の混合物で筋肉内に注射して麻酔させ、四肢を伸ばした腹臥位（ｐｒｏｎｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）状態でスキャナに位置させた。
実験方法１８．シークエンシング
本発明者は、染色体４にあるｓｌｉｔ２遺伝子（ＮＭ_００４７８７）、染色体５にあるｓｌｉｔ３遺伝子（ＮＭ_００３０６２）、染色体３にあるｒｏｂｏ１遺伝子（ＮＭ_００１１４５８４５）、染色体３にあるｒｏｂｏ２遺伝子（ＮＭ_ＮＭ_００２９４２）、及び染色体１１にあるｒｏｂｏ４遺伝子（ＮＭ_０１９０５５）について調査した。これらの遺伝子に対するターゲット領域は、全体コーディングエクソン、エクソン−イントロンバウンダリー、及び調節領域であった。ベイトライブラリ（ｂａｉｔ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）をデザインし、Ａｇｉｌｅｎｔ ｅＡｒｒａｙ ｗｅｂｓｉｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ（ｈｔｔｐｓ://ｅａｒｒａｙ.ｃｈｅｍ.ａｇｉｌｅｎｔ.ｃｏｍ/ｅａｒｒａｙ/）を用いて、これらのターゲットゲノム領域にわったてカバリッジを分析した。ＢＬＡＳＴ（〜１２ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂａｉｔ）を用いて９０％以上に一つ以上の位置がベイトマッピングされる場合、デザインから除外した。最終的に、６，５０７ｂｐターゲット領域がＡｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔと確定された。続いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２０００ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）でシークエンシングを９８２閉経後の女性（ｓｕｐｅｒ−ｎｏｒｍａｌ ＢＭＤ ｇｒｏｕｐ=５０１，ａｎｄ ｓｅｖｅｒｅ−ｌｏｗ ＢＭＤ ｇｒｏｕｐ=４８１）に行った。Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを用いて３のゲノムＤＮＡを無作為に使用し、１５０ｂｐのインサート（ｉｎｓｅｒｔｓ）を製造した。この断片化したＤＮＡをＴ４ ＤＮＡ重合酵素及びＫｌｅｎｏｗ重合酵素を用いて末端修復（ｅｎｄ−ｒｅｐａｉｒ）し、修復した末端受容体オリゴヌクレオチド（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ ａｄａｐｔｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）を付着末端（ｓｔｉｃｋｙ ｅｎｄｓ）に付けた。アガロース電気泳動でライゲーション混合物を分析し、２００−２５０ｂｐ大きさの断片で精製した。精製されたＤＮＡライブラリをＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ｓｅｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で混成化させ、製造会社の説明書に従ってタグされた領域にキャプチャーした。キャプチャーされたライブラリを用いて、製造会社のプロトコルに従って、ＨｉＳｅｑ２０００ ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ ｆｌｏｗｃｅｌｌを製造した。次に、ＰＣＲコロニーのクラスターをＨｉＳｅｑ２０００ ｐｌａｔｆｏｒｍでシークエンシングした。
実験結果１．初期の分化段階で、破骨細胞は骨芽細胞前駆体を誘引する潜在的なカップリング因子を分泌する。
前記カップリング現象を調査するための試験管内システムを確立するために、破骨細胞の生成及び骨吸収に対する可変の培養条件を準備した。本発明者は、ＢＭＭｓを３０ｎｇ/ｍＬ Ｍ-ＣＳＦがある状態で１００ｎｇ/ｍＬ ＲＡＮＫＬで２日及び６日間処理し、初期−及び後期−破骨細胞の分化をそれぞれ誘導した。吸収段階を誘導するために、ＢＭＭｓを３０ｎｇ/ｍＬ Ｍ-ＣＳＦがある状態で１００ｎｇ/ｍＬ ＲＡＮＫＬ及びマウスの大腿骨（ｆｅｍｕｒ）と共に１０日間培養した。破骨細胞の分化及び骨吸収は、各培地でＴＲＡＰ-５ｂ活性及びＣＴＸ濃度をそれぞれ測定することによって評価した。
図１ａで見る通り、ＲＡＮＫＬ−処理された細胞から得たＣＭは、毎段階の非処理群と比較し、ＴＲＡＰ−５ｂ活性が著しく増加した。また、図１ｂで見る通り、ＣＴＸ濃度は大腿骨とＲＡＮＫＬが全てある状態でのみ増加した。
各段階で破骨細胞の培養物から収集されたＣＭを一次マウス頭蓋冠の骨芽細胞及びＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に処理した。ＲＡＮＫＬ−処理されたＢＭＭｓの任意の培地は、非処理群の上層液と比較し、一次骨芽細胞の生存力または分化（それぞれ図２ａと２ｃ）、またはＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の生存力または分化（それぞれ図２ｂと２ｄ）に有意な影響を与えなかった。しかし、傷−治癒の分析は、ＲＡＮＫＬ−処理されたＢＭＭｓから得たＣＭが非処理群と比較し、骨芽細胞（図２ｅ）及びＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（図２ｆ）全ての運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）を顕著に増加させることを示す。ＲＡＮＫＬ−処理されたＲａｗ２６４.７細胞から得たＣＭもまたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の運動性を増加させた（図２ｇ）。特に、後期の分化段階でＲＡＮＫＬ−処理された細胞から収集されたＣＭがさらに小さい程度に前骨芽細胞の運動性を刺激させるが、初期の分化段階でＲＡＮＫＬ−処理された細胞から得たＣＭは、前骨芽細胞の運動性を最も著しく増加させた。反面、１０日間ＲＡＮＫＬで培養した破骨細胞から得たＣＭは、マウスの大腿骨があるか否かと関係なく運動性を刺激しなかった。
このような結果は、可能性のあるカップリング因子（ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）が骨吸収の過程からではなく、主に初期−分化した破骨細胞から分泌され得るということを意味する。
骨芽細胞系統の方向性のある移動（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）に対する破骨細胞ＣＭの効果を評価するために、本発明者は、Ｂｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ ａｓｓａｙを使用した。ＲＡＮＫＬ−処理されたＢＭＭ及びＲａｗ２６４.７細胞両方から収集されたＣＭもまた、非処理対照群と比較し、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の方向性のある可動性（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を顕著に刺激した（それぞれ図２ｈと２ｉ）。このような結果は、初期の破骨細胞生成から誘導された因子による前骨芽細胞の補充（ｐｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）の刺激が、骨−再形成部位でカップリング現象の主要なメカニズムになり得ることを説明する。
実験結果２．推定走化性因子の同定
前骨芽細胞に対するケモカインに作用する特異タンパク質を同定するために、本発明者は、ＬＣ-ＭＳ/ＭＳ分画化した。簡単に説明すると、ＲＡＮＫＬ−処理及び−非処理されたＲａｗ２６４.７細胞から得たＣＭの９６つのマッチされた分画をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に処理し、これらの細胞の可動性に対する効果をＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ ａｓｓａｙを用いて比較した。本発明者は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の移動に対する最も差がつく効果を示すマッチされた分画を選別した。前記実験方法欄に記述された、プロテオミクス分析を選別された分画及び隣接したＲＡＮＫＬ−処理された分画に対して行った。本発明者は、隣接した分画及びＲＡＮＫＬ−非処理対照群と比較し、ＲＡＮＫＬ−処理された分画で差がつくように発現する４５つのペプチドを同定した。これらのうち、９つのペプチドが分泌特性を有していた（表１）。最終的に、ｓｌｉｔ３タンパク質を選択し、以降実験を行った。
実験結果３．Ｓｌｉｔ３は、分化した破骨細胞から分泌される。
分化した破骨細胞でｓｌｉｔ３の分泌可否を確認するために、下記のような実験を行った。ＢＭＭｓ（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）を３０ｎｇ/ｍＬ Ｍ-ＣＳＦ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）が含まれた培地下で、１００ｎｇ/ｍＬ ＲＡＮＫＬの処理可否を区分して２日間培養し、前記細胞でウェスタンブロットを行った。また、破骨細胞の形成過程（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関与することがよく知られているマスター遺伝子であるＮＦＡＴｃ１のｓｉＲＮＡを用いてＢＭＭｓで破骨細胞の形成過程を遮断し、同じ方法でウェスタンブロットを行った。その結果をそれぞれ図３ａ及び図３ｂに示した。
図３aに示すように、ｓｌｉｔ３の発現は、分化した破骨細胞の細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅ）及びＣＭ（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ）で全て顕著に増加することを確認した。
また、図３ｂに示すように、ＲＡＮＫＬにより刺激されたｓｌｉｔ３の発現は、ＮＦＡＴｃ１−ｓｉＲＮＡにより完全に遮断されたことを確認した。
前記結果を通じ、ｓｌｉｔ３は分化した破骨細胞から分泌され、破骨細胞の前駆体では分泌されないことを確認した。
実験結果４．Ｓｌｉｔ３は骨芽細胞の移動、生存力、増殖、分化及びＯＰＧの生成を刺激する。
骨芽細胞でｓｌｉｔ３の機能を確認するために、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨芽細胞を組換えｓｌｉｔ３で処理した後、骨芽細胞の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、生存能（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）及びＯＰＧ（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）の生産に及ぼす影響を確認した。その結果をそれぞれ図４ａ乃至４ｇに示した。
図４ａに示すように、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨芽細胞をｓｌｉｔ３（０、０.１、０.５、及び１.０μｇ/ｍＬ）で２４時間処理した結果、ｓｌｉｔ３の濃度に依存的に前骨芽細胞（ｐｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）の移動が増加することを確認した。
また、図４ｂ及び図４ｃに示すように、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨芽細胞をｓｌｉｔ３（０、０.１、０.５、及び１.０μｇ/ｍＬ）で４８時間処理し、ＣＣＫ−８アッセイ及びＢｒｄ−Ｕアッセイを行った結果、ｓｌｉｔ３の処理により骨芽細胞の生存能及び増殖が増加することを確認した。ＣＣＫ−８アッセイでＩＧＦ−１は陽性対照群に用いた。
さらに、図４ｄに示すように、１次（ｐｒｉｍａｒｙ）マウスＢＭＳＣｓ（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ）を１.０μｇ/ｍＬ ｓｌｉｔ３で処理し、骨芽細胞の分化を誘導した結果、ｓｌｉｔ３の処理により骨芽細胞の分化マーカーであるＡＬＰ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）及びＯＣＮ（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）のｍＲＮＡ発現が顕著に増加することを確認した。
また、図４ｅに示すように、１次マウスの頭蓋冠骨芽細胞を１.０μｇ/ｍＬ ｓｌｉｔ３で４８時間処理し、ＱＲＴ−ＰＣＲを行った結果、ｓｌｉｔ３はＯＰＧの生産を促進し、ＲＡＮＫＬの発現には影響を与えないことを確認した。
さらに、図４ｆに示すように、細胞移動過程で細胞方向に移動させ、実質的に運動に関与するラメリポディア（ｌａｍｅｌｌｉｐｏｄｉａ）の形成が刺激され、これは走化性（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ａｃｔｉｏｎ）があることを意味する。
前記結果を通じ、ｓｌｉｔ３は骨芽細胞で移動、生存能、増殖、分化及びＯＰＧの生産を増加させる機能をし、これを通じて骨形成過程に寄与することを確認した。
実験結果５．Ｓｌｉｔ３は頭蓋冠の骨形成を増加させ、ＩＬ−１誘導された頭蓋冠の骨消失を防止する。
骨細胞に対するｓｌｉｔ３の試験管内結果を検証するために、動物モデルを用いた実験を行った。ｓｌｉｔ３を頭蓋冠に直接注入した結果、非処理対照群と比較し、１５％まで骨の幅が増加した（図５）。また、動物モデルの頭蓋冠の骨消失で、ＩＬ−１を処理して骨消失を誘導したとき、ｓｌｉｔ３がＩＬ−１による骨消失を抑制することを証明した（図６）。このような結果は、ｓｌｉｔ３が骨形成を増加させると同時に、骨吸収を減少させる治療剤として使用されることができるということを意味する。
実験結果６．Ｓｌｉｔ３は骨形成の表面にＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の移動を刺激する。
ＧＦＰ−標識されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を骨髄腔に注入させる場合、ｓｌｉｔ３の処理はＰＢＳ処理群と比較し、骨形成の表面に細胞の移動を顕著に増加させる（図７）。
実験結果７．ｓｌｉｔ３ノックアウトマウス胚で骨形成及び血管新生が顕著に弱くなる。
１７.５日されたｓｌｉｔ３マウス胚の大腿骨でカルシウムの蓄積を評価するために、Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色を行い、血管の形成を評価するためにＶＥＧＦ ＩＨＣ染色を行った。ｓｌｉｔ３−ノックアウト胚は、Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ（図８ａ）及びＶＥＧＦＩＨＣ（図８ｂ）の二つの方法による染色が野生型胚と比較して殆ど示されなかった。このような結果は、ｓｌｉｔ３は骨形成に継続的に寄与するとともに、血管新生に対する必須因子であるＶＥＧＦの発現を増加させるのに重要な役割をするということを意味する。
実験結果８．骨細胞に対するｓｌｉｔ３の作用は、Ｒｏｂｏ１及びＲｏｂｏ２受容体を介して媒介される。
ｓｌｉｔリガンド及びＲｏｂｏ受容体は、多様なタイプの細胞で信号伝達経路がよく知られているため（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＲＥ，ｅｔ ａｌ.，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ２０１０;１３９:６９７−７０４）、本発明者は、ＲＴ−ＰＣＲを行って骨細胞でＲｏｂｏ受容体の発現を調査した。
その結果、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、Ｒｏｂｏ１及びＲｏｂｏ２受容体を発現することを確認した（図９ａ）。一次破骨細胞は、Ｒｏｂｏ１受容体を主に発現する反面、Ｒｏｂｏ３及びＲｏｂｏ４受容体の発現の水準は弱く増加した（図９ｂ）。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞でｓｉＲＮＡトランスフェクション及びｆｃキメラによるＲｏｂｏ１及びＲｏｂｏ２の発現を遮断する場合、ｓｌｉｔ３−刺激された細胞の移動及び増殖が抑制された（それぞれ、図９ｃ ９ｄ）。一次破骨細胞に関して、Ｒｏｂｏ１受容体に対するｓｉＲＮＡトランスフェクションは、ｓｌｉｔ３の処理による破骨細胞の形成の減少を完全に回復させた（図９e）。
実験結果９．Ｖｉｌｓｅは骨芽細胞と破骨細胞でＲｏｂｏ１受容体を介して、ｓｌｉｔ３の作用を媒介する主要な信号分子である。
ヒトＢＭＳＣとヒトＰＢＭＣから生成された、ＧＦＰ−Ｒｏｂｏ１は、骨芽細胞（図１０a）と破骨細胞（図１０ｂ）にＭｙｃ−ｖｉｌｓｅとともにそれぞれトランスフェクションする場合、ｓｌｉｔ３の処理は共免疫沈降法でＲｏｂｏ１−Ｖｉｌｓｅの相互作用を顕著に増加させた。ｓｉＲＮＡでｖｉｌｓｅのノックダウンさせると、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のｓｌｉｔ３−刺激された生存力を抑制した（図１０ｃ）。このような結果はＲｏｂｏ１受容体を介したｓｌｉｔの作用が骨細胞でｖｉｌｓｅにより媒介され得るということを意味する。
実験結果１０．全身ＢＭＣはＲｏｂｏ１−ノックアウトマウスで顕著に減少した。
８週齢の雄Ｒｏｂｏ１野生型、ヘテロ型（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）及びノックアウトマウスで全身ＢＭＣ値を比較した結果、Ｒｏｂｏ１−ノックアウトマウスは顕著に低いＢＭＤ値を示した（図１１）。
実験結果１１．ｓｌｉｔ１及びｓｌｉｔ２は破骨細胞の分化を弱化させる。
ＴＲＡＰ染色を行うことによって、破骨細胞に対するｓｌｉｔファミリの他のタンパク質、ｓｌｉｔ１及びｓｌｉｔ２の効果を試験した（図１２）。ｓｌｉｔ１及びｓｌｉｔ２は、ｓｌｉｔ３により観察されるように、破骨細胞の分化を容量−依存的に減少した。
実験結果１２．組換えのｓｌｉｔ３ ＬＲＲ２ペプチドは、破骨細胞の分化を弱化させる。
ｓｌｉｔタンパク質のＬＲＲ２ドメインは、それらの受容体、Ｒｏｂｏと結合するものと報告されている。従って、本発明者は、ＬＲＲ２ドメインペプチドとしてｓｌｉｔ３の小さい組換えペプチドを製造した。前記組換のペプチドは、破骨細胞の分化を抑制することが確認された（図１３）。このような結果は、組換えのペプチドが骨粗鬆症の治療に有用に使用されることができることを意味する。
実施例１３． 臨床実験
１３−１．実験対象の選定
実験対象は、ソウルＡＳＡＮ病院（Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）に来院した健康な閉経後の女性を対象にした。前記全ての女性は、骨粗鬆症の可能性を懸念して訪問した場合、または健康検診で骨粗鬆症が検出された場合であった。このときの閉経は、１年以上無月経が持続された場合であって、血清内ＦＳＨ（ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）の濃度を測定して検証した。実験対象のうち、４０歳以前に閉経した実験対象、骨代謝に影響を与えるだけの薬剤を６ヶ月以上または１２ヶ月以内に投与を受けた実験対象及び骨代謝に影響を与えるだけの疾患を病んだ実験対象は除外した。最終的に３４６名の女性を選定した。
１３−２．骨密度（Ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ、ＢＭＤ）の測定
前記１３−１で選定した実験対象の年齢、体重、身長、ＢＭＩ、行動要因（喫煙、飲酒、運動等）、骨密度等を測定した。
骨密度（ＢＭＤ、ｇ/ｃｍ２）はＤＸＡ（Ｌｕｎａｒ;Ｐｒｏｄｉｇｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて、腰椎（ｌｕｍｂａｒ ｓｐｉｎｅ，Ｌ１−Ｌ４）及び大腿近位部（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｆｅｍｕｒ）のうち、大腿頸部｛だいたい けいぶ｝（ｆｅｍｕｒ ｎｅｃｋ）、大腿骨（ｔｏｔａｌ ｆｅｍｕｒ）、 転子部（ｔｒｏｃｈａｎｔｅｒ）、大腿骨の骨幹（ｓｈａｆｔ）、三角（ｗａｒｄ）を測定した。
その結果を下記表２に示した。
１３−３．血中ｓｌｉｔ３の濃度測定
前記１３−１で選定した実験対象の空腹血液のサンプルを遠心分離した後、上澄液を分離した。血中ｓｌｉｔ３の濃度は、ｓｌｉｔ３の競争的なＥＬＩＳＡキット（Ｅｃｈｅｌｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ，ＵＴ，ＵＳＡ）を用いて測定し、２回繰り返した。前記結果値を各骨の位置でのＢＭＤまたはＴ−ｓｃｏｒｅを従属変数（ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ）として、ｓｌｉｔ３の濃度を独立変数（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ）として用いて多重線形回帰分析（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎａｎ ａｌｙｓｉｓ）を行った。その結果を表２に示した。共変量（Ｃｏｖａｒｉａｔｅｓ）は、年齢、体重、身長、喫煙、飲酒及び定期的な運動を含んだ。
表３に示すように、可能性のある交絡変数（ｃｏｎｆｏｕｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）への補正後に、血中ｓｌｉｔ３の濃度は、腰椎、大腿頸部、全大腿骨、大腿三角、大腿骨幹部でのＢＭＤ値及びＴ-ｓｃｏｒｅと関連性があることを確認した。
また、ｓｌｉｔ３の濃度に応じて５分位にグループを分けた後、骨粗鬆症の発病率を観察した。ＷＨＯによると、腰椎、大腿頸部、全大腿部のいずれか１つでのＴ-ｓｃｏｒｅ≦-２.５ ＳＤであるとき、骨粗鬆症と定義する。その結果を下記表４に示した。
表４に示すように、骨粗鬆症ｏｄｄｓは共変量への補正後に、血中ｓｌｉｔ３の濃度が最も低く示された群（Ｑ１）に比べ最も高く示された群（Ｑ５）で約５８％低く示されることを確認した。
前記結果を通じ、血中ｓｌｉｔ３の濃度は、骨粗鬆症の発病率と負の相関関係を有しており、骨折及び骨粗鬆症の発生危険予測用マーカーに用いられることができることを確認した。
実験結果１４. ｓｌｉｔ２、ｓｌｉｔ３、ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ２及びｒｏｂｏ４にある７つのＳＮＰは低い骨密度の危険と関連がある。
ＢＭＤ状態による遺伝学的研究対象の基準の特性は、下記表５の通りである。二つのグループの年齢が一致するため、年齢での特別な差はなかった。このグループの定義と一致し、ＢＭＩは極めて低いＢＭＤグループで顕著に高い反面、腰椎（ｌｕｍｂａｒ ｓｐｉｎｅ）と大腿頸部（ｆｅｍｕｒ ｎｅｃｋ）でのＢＭＤ値とＴ−スコアは平均以上のＢＭＤグループで顕著に高かった。
極めて低いＢＭＤ状態（ｓｅｖｅｒｅ-ｌｏｗ ＢＭＤ ｓｔａｔｕｓ）の危険におかれた様々な多型性（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）の遺伝的効果は、配列分析（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）及びロジスティック回帰分析（ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）により分析された（表６）。ｓｌｉｔ２で１つのＳＮＰ（ｒｓ７６５５０８４）、ｓｌｉｔ３で２つのＳＮＰ（ｒｓ１５４９９０９及びｒｓ１００３６７２７）、ｒｏｂｏ１で１つのダウンストリームＳＮＰ、ｒｏｂｏ２で２つのＳＮＰ（ｒｓ３８２１７３５及びｒｓ７８８１７２４８）、並びにｒｏｂｏ４で１つのＳＮＰ（ｒｓ１２４１８５４８）が極めて低いＢＭＤ状態の危険と有意に関連があった。
Ｃｈｒ, ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ; ＭＡＦ, ｍｉｎｏｒ ａｌｌｅｌｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ; ＊ Ｐ ｖａｌｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａ ＨａｒｄｙＷｅｉｎｂｅｒｇ Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ（ＨＷＥ) ａｍｏｎｇ ａｌｌ ｓｕｂｊｅｃｔｓ.
これまで本発明についてその好ましい実施例を中心に見てみた。本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者は、本発明が、本発明の本質的な特性から外れない範囲で変形された形態で具現されることができるということを理解できるであろう。従って、開示されている実施例は、限定的な観点ではなく、説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は、前述した説明ではなく、特許請求範囲に示されており、それと同等の範囲内にある全ての差異点は、本発明に含まれているものと解釈されなければならない。
本発明のｓｌｉｔまたはｒｏｂｏタンパク質は、細胞及び動物モデルで骨形成を増加させ、骨吸収を減少させて、骨粗鬆症の発病率と負の相関関係を有しており、骨折または骨粗鬆症の予防または治療用組成物及び骨折あるいは骨粗鬆症の発生危険を予測するためのバイオマーカーとして有用に利用されることができる。

Claims (1)

  1. ｓｌｉｔ３のＬＲＲ２（leucine-rich repeat domain 2）ドメイン組換えペプチドを有効成分として含有する骨折又は骨粗鬆症の予防又は治療用薬学的組成物として、上記 slit3のLRR２ドメイン組換えペプチドは配列番号17の塩基配列中、２位〜３９１位の塩基配列からなるドメイン組換えペプチドである骨折又は骨粗鬆症の予防又は治療用薬学的組成物。
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