WO2013187730A1 - Ｓｌｉｔ-Ｒｏｂｏ 시스템을 이용한 골절 또는 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Ｓｌｉｔ-Ｒｏｂｏ 시스템을 이용한 골절 또는 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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김기수
이승훈
이영선
김범준
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    • G01N2800/108—Osteoporosis

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating fracture or osteoporosis comprising slit, robo or an expression protein thereof as an active ingredient, a kit for predicting risk of fracture or osteoporosis using the gene or expression protein, and a risk of fracture or osteoporosis To an information providing method for predicting information.
  • Osteoporosis is a condition in which the amount of minerals and substrates that form the bone is excessively reduced, leading to a decrease in bone density. In the case of osteoporosis, the bone can easily break. Thus, osteoporosis is the most frequent metabolic bone disease (MBD) with low bone mineral density (BMD) and increased risk of fracture (Peacock, M., et al., Endocr. Rev. 23: 303 -326, 2002; Akhter, MP, et al., Bone 41 (1): 111-6, 2007).
  • MBD metabolic bone disease
  • BMD bone mineral density
  • the present inventors have continued to develop a therapeutic agent for fracture or osteoporosis and a marker for predicting the risk of fracture or osteoporosis. As a result, it has been found that slit3 increases osteogenesis, decreases bone resorption and increases the incidence of osteoporosis And that the present invention has been completed.
  • Another object of the present invention is to provide a marker composition for predicting the development of fracture or osteoporosis, which comprises a protein selected from the group consisting of slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 and vilse.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for predicting the development of fracture or osteoporosis, which comprises an antibody specifically binding to a protein selected from the group consisting of slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 and vilse or an immunogenic fragment thereof .
  • Another object of the present invention is to provide a marker composition for predicting the occurrence of fracture or osteoporosis, which comprises SNPs located in slit2, slit3, robo1, robo2 and robo4.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating fracture or osteoporosis comprising, as an active ingredient, a gene selected from the group consisting of slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 and vilse, .
  • the present invention also provides a food composition for preventing or ameliorating fracture or osteoporosis, which comprises a protein selected from the group consisting of slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 and vilse as an active ingredient.
  • the present invention also provides a marker composition for predicting the occurrence of fracture or osteoporosis comprising a protein selected from the group consisting of slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 and vilse.
  • the present invention also provides a kit for predicting the development of fracture or osteoporosis, which comprises an antibody specifically binding to a protein selected from the group consisting of slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 and vilse or an immunogenic fragment thereof.
  • the present invention provides a kit for predicting the development of fracture or osteoporosis, which comprises a primer for RT-PCR for detecting mRNA of a gene selected from the group consisting of slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 and vilse.
  • the present invention also provides a method for detecting a protein selected from the group consisting of slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 and vilse through an antigen-antibody reaction from a blood sample of a patient in order to provide information necessary for prediction of fracture or osteoporosis occurrence .
  • the present invention provides a method for screening for a therapeutic agent for fracture or osteoporosis comprising comparing the expression levels of slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 and vilse protein in cells treated with the test substance.
  • compositions for preventing or treating fracture or osteoporosis comprising LRR2 domain recombinant peptide of the slit3 protein of the present invention.
  • the present invention provides a marker composition for predicting the occurrence of fracture or osteoporosis including SNPs located in slit2, slit3, robo1, robo2, and robo4.
  • the slit or robo protein of the present invention increases osteogenesis, decreases bone resorption, and has a negative correlation with the incidence of osteoporosis in cell and animal models, and is useful as a composition for preventing or treating fracture or osteoporosis, And can be usefully used as a biomarker for predicting the risk of occurrence.
  • Figure 1 illustrates the preparation of variable culture conditions for osteoclastogenesis and bone resorption in order to establish an in vitro system for examining the coupling phenomenon.
  • FIG. 2 illustrates that stimulation of supplementation of precursor bone cells by factors derived from early osteoclastogenesis is a major mechanism of coupling phenomenon at the bone-remodeling site.
  • FIG. 3A shows secretion of slit3 in differentiated osteoclasts.
  • FIG. 3B is a graph showing that slit3 expression in osteoclast differentiated by RANKL is inhibited by NFATc1 siRNA pretreatment.
  • FIG. 4A shows that osteoblast migration increases according to the concentration of slit3.
  • FIG. 4B shows that the viability of osteoblasts is increased according to the concentration of slit3.
  • FIG. 4c shows that the proliferation of osteoblasts is increased according to the concentration of slit3.
  • FIG. 4d shows that the expression of ALP and OCN, which are osteoblast differentiation markers, is increased by slit3.
  • FIG. 4E shows that OPG production is promoted in osteoblast by slit3.
  • Figure 5 is an illustration of increased bone formation by slit3 injection in animal models.
  • FIG. 6 is a graph showing that bone loss is suppressed by slit 3 treatment in an animal model.
  • FIG. 7 is a graph illustrating that osteoclast migration to the osteogenic surface is increased by slit3.
  • FIG. 8A is a view showing the embryo of slit3 knockout mouse through Von Kossa staining.
  • FIG. 8B is a view of the embryo of slit3 knockout mouse through VEGF immunohistochemical staining.
  • FIG. 9 illustrates that the action of slit3 in bone cells is mediated through the robo1, robo2, or robo3 receptors.
  • FIG. 10 illustrates that the action of slit through the Robo1 receptor can be mediated by vilse in bone cells.
  • FIG. 11 is a graph illustrating a decrease in bone density in a Robo1-knockout animal model.
  • FIG. 12 is a diagram illustrating that osteoclast differentiation is reduced by slit1 and slit2.
  • FIG. 13 is a graph illustrating that the LRR2 domain recombinant peptide inhibits osteoclast differentiation.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating fracture or osteoporosis comprising as an active ingredient a gene selected from the group consisting of the following or an expression protein thereof:
  • a slit1 consisting of a base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
  • a slit2 consisting of a base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
  • a slit3 consisting of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
  • Robo1 consisting of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
  • Robo2 consisting of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5;
  • a vilse consisting of a base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the slit1 protein is represented by SEQ ID NO: 1
  • the slit2 protein is represented by SEQ ID NO: 2
  • the slit3 protein is represented by SEQ ID NO: 3
  • the robo1 protein is represented by SEQ ID NO:
  • the robo2 protein is represented by SEQ ID NO: 5
  • the vilse protein comprises a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, and a functional equivalent of the protein.
  • &quot functional equivalent " means an amino acid sequence having at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more Preferably 95% or more, of a protein having substantially the same physiological activity as the protein represented by SEQ ID NOS: 1-6.
  • the slit1, slit2, slit3, robo1, robo2, or vilse protein of the present invention as well as the protein having the native amino acid sequence thereof, as well as amino acid sequence variants thereof, are also included in the scope of the present invention.
  • a mutant of a slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 or vilse protein is a mutated protein having a deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof with one or more amino acid residues and a natural amino acid sequence of slit1, slit2, slit3, robo1, &Quot; means a protein having a different sequence.
  • Amino acid exchanges in proteins and peptides that do not globally alter the activity of the molecule are known in the art (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most commonly occurring exchanges involve amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu and Asp / Gly.
  • it may be modified by phosphorylation, sulfation, acetylation, glycosylation, methylation, farnesylation, and the like.
  • the slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 or vilse proteins or variants thereof may be isolated from natural sources or synthesized (Merrifleld, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2156, 1963) (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2nd ed., 1989).
  • the slit1 gene may have the nucleotide sequence of SEQ ID NO:
  • the slit 12 gene may have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the slit3 gene may have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the robo1 gene may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
  • the robo2 gene may have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the vilse gene may have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 or vilse expresses the slit1, slit2, slit3, robo1 or robo2 gene in the cell in order to be used for gene therapy, Can be provided in the form of a vector.
  • pBK-CMV (Staratagene), pCR3.1 (Invitrogen), or the like can be used as the expression vector, and expression vectors known in the art that can be expressed by inserting the slit1, slit2, slit3, robo1, robo2, Or the like can be used.
  • a form in which a recombinant DNA molecule comprising a nucleotide sequence coding for the above-mentioned slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 or vilse, that is, a polynucleotide, is operatively linked to a nucleic acid sequence for regulating expression
  • the polynucleotide is administered so that it is expressed in the subject to be treated.
  • the vector thus comprises a suitable transcription regulatory signal comprising a promoter region capable of expressing the coding sequence, said promoter being operable in the patient to be treated.
  • the promoter which is a term including sequences necessary for directing the RNA polymerase to the transcription initiation site, as well as other operative sequences or control sequences, including the promoter, if appropriate,
  • CMV human cytomegalovirus
  • the polynucleotide sequence and transcriptional control sequence may be provided cloned into a replicable plasmid vector based on a plasmid such as commercially available pBR322 or may be constructed from a plasmid available by routine application of well-known published procedures.
  • the vector may also contain a polyadenylation sequence that is recognizable in a patient to be treated, such as a transcription control sequence located 3 ' of the gene sequence, and a corresponding sequence from a virus such as the SV40 virus when used in human therapy .
  • a transcription control sequence located 3 &apos of the gene sequence
  • a corresponding sequence from a virus such as the SV40 virus when used in human therapy .
  • Other transcriptional control sequences are well known and available in the art.
  • the expression vector may also include a selectable marker, such as antibiotic resistance, so that the vector can be propagated.
  • a selectable marker such as antibiotic resistance
  • expression vectors capable of synthesizing the protein can be directly introduced into a wound site by a physical method. These include, for example, locally applying a " naked " nucleic acid vector in a suitable vehicle within a solution in a pharmaceutically acceptable excipient, such as phosphate buffered saline (PBS) Quot; gene gun " technique. ≪ / RTI >
  • PBS phosphate buffered saline
  • the " gene gun " technique as described in U.S. Patent No. 5371015, is a method of releasing inert particles such as vector coated gold beads at wound sites, e.g., skin cells It accelerates at a speed sufficient to pass through the surface.
  • the gene sequence may also be administered to the wound site by means of a transformed host cell.
  • the cell contains cells harvested from the patient.
  • the nucleic acid sequence is introduced into the cell by a gene transfusion method known in the art, and the transformed cells are transplanted into the patient and grown in the culture medium.
  • the expression constructs as described above may be used in various ways in the treatment of the present invention.
  • the expression constructs may be administered directly to the site of treatment in the patient.
  • the pharmaceutical composition may contain, as an active ingredient, an activity factor that increases the expression of slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 or vilse.
  • an activity factor that increases the expression of slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 or vilse refers to an activity factor that directly or indirectly acts on slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 or vilse to produce slit1, slit2, slit3, robo1 , robo2, or vilse.
  • Such materials include single compounds such as organic or inorganic compounds, biopolymer compounds such as peptides, proteins, nucleic acids, carbohydrates and lipids, and complexes of multiple compounds.
  • the activity factor that increases the expression of slit3 can be used for the prevention, improvement and treatment of diseases caused by the expression, activity, or decrease in function of slit3.
  • the mechanism by which the substance activates slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 or vilse is not particularly limited.
  • the substance may act as a mechanism to increase gene expression, such as transcription, translation, or to convert an inactive form to an active form.
  • the substance activating slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 or vilse is a biomacromolecule such as peptide, protein, nucleic acid, carbohydrate and lipid.
  • nucleic acid and protein sequences are already known, one of ordinary skill in the art will be able to employ a single compound such as an organic or inorganic compound that acts as an inducer or activator, a biopolymer compound such as protein, nucleic acid, carbohydrate and lipid, And screening can be carried out.
  • a single compound such as an organic or inorganic compound that acts as an inducer or activator, a biopolymer compound such as protein, nucleic acid, carbohydrate and lipid, And screening can be carried out.
  • the slit3 is secreted from differentiated osteoclasts and functions to increase the production of osteoblast migration, viability, proliferation, differentiation and OPG, increases osteogenesis, inhibits bone loss, (angiogenesis) and the expression of VEGF that contribute to bone formation.
  • the function and activity of slit3 according to the present invention may be a cause of fracture or osteoporosis. Accordingly, the treatment of gene or protein for normalizing or activating the function of the gene can be an important aspect for the therapeutic approach of fracture and osteoporosis.
  • the pharmaceutical composition may be administered to a patient by proliferating and activating an expression vector containing the gene or a host cell containing the expression vector to treat or prevent fracture or osteoporosis, It can inhibit the differentiation of cells and promote the differentiation, proliferation and migration of osteoblasts to treat fractures or osteoporosis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents conventionally used in the production thereof.
  • it can be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, oral preparations such as syrups and aerosols, external preparations, suppositories and sterilized injection solutions according to a conventional method.
  • suitable formulations known in the art are preferably those as disclosed in Remington ' s Pharmaceutical Science, recently, Mack Publishing Company, Easton PA.
  • Examples of carriers, excipients and diluents which may be included include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, Cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • compositions When the composition is formulated, it is prepared using a diluent such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, a surfactant, or an excipient usually used.
  • a diluent such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, a surfactant, or an excipient usually used.
  • Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, Gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • the liquid preparation for oral use include suspensions, solutions, emulsions, and syrups.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like.
  • the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin and the like.
  • " administering " as used herein is meant to provide any desired composition of the invention to a subject in any suitable manner.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the condition and the weight of the patient, the degree of disease, the type of drug, the route of administration and the period of time, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the composition of the present invention may be administered in an amount of 0.001 mg / kg to 10000 mg / kg per day.
  • the composition may be administered once a day, or divided into several doses.
  • composition of the present invention may be administered to a subject in various routes. All modes of administration may be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intra-uterine or intracerebroventricular injections.
  • composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological response modifiers for the prevention and treatment of fracture or osteoporosis.
  • the present invention also provides a food composition for preventing or ameliorating fracture or osteoporosis, which comprises a protein selected from the group consisting of slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 and vilse as an active ingredient.
  • the 'food composition for preventing or ameliorating fracture or osteoporosis' refers to a food having a biological control function such as prevention and improvement of disease, bio-defense, immunity, recovery after disease and suppression of aging. It should be harmless to human body.
  • the composition of the present invention may be added to a health functional food for the purpose of preventing or improving fracture or osteoporosis.
  • the protein of the present invention or an activity factor that increases the expression thereof is used as a food additive
  • the above ingredients can be directly added or used together with other food or food ingredients, and can be suitably used according to a conventional method.
  • the amount of the active ingredient to be mixed can be suitably determined according to the intended use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the activity factor for increasing the protein or expression of the present invention in the production of food or beverage is added in an amount of not more than 15% by weight, preferably not more than 10% by weight based on the raw material.
  • the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount exceeding the above range.
  • the kind of the food There is no particular limitation on the kind of the food.
  • the foods to which the above substances can be added include dairy products including meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen noodles, gums, ice cream, various soups, drinks, tea, Alcoholic beverages, and vitamin complexes, all of which include health foods in a conventional sense.
  • the health beverage composition of the present invention may contain various flavors or natural carbohydrates as an additional ingredient such as ordinary beverages.
  • the natural carbohydrates may be monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, natural sweeteners such as dextrin and cyclodextrin, synthetic sweeteners such as saccharine and aspartame, and the like.
  • the ratio of the natural carbohydrate is generally about 0.01 to 10 g, preferably about 0.01 to 0.1 g per 100 ml of the composition of the present invention.
  • composition of the present invention may further contain various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, A carbonating agent used in a carbonated beverage, and the like.
  • composition of the present invention may comprise flesh for the production of natural fruit juices, fruit juice drinks and vegetable drinks. These components may be used independently or in combination. Although the ratio of such additives is not critical, it is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the present invention also provides a marker composition for predicting the occurrence of fracture or osteoporosis comprising a protein selected from the group consisting of slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 and vilse.
  • the proteome of the slit3 protein obtained from the patient's blood was analyzed for the correlation between the incidence of osteoporosis and the slit3 protein in patients with osteoporosis potential, and the concentration of serum slit3 protein in the group with high osteoporosis incidence Characteristically, expression was reduced and slit3 was selected as a proteinaceous marker that could be used for the diagnosis or treatment of fracture or osteoporosis.
  • the slit3 protein of the present invention has a negative correlation with the incidence of osteoporosis, and thus can be useful as a biomarker for predicting the risk of fracture or osteoporosis.
  • proteome refers to the entirety of all proteins that can be made from a genome, which means that the pattern of proteomes always changes according to a specific physiological or pathological condition in a cell or tissue Is a dynamic concept.
  • Proteomics is a comprehensive description of methods and techniques for studying such proteomes. By studying the properties of proteins by focusing on gene expression, post-translational modification, and binding to other proteins, It refers to the field of study in which the transformation process and network formation are linked to the progress of the disease to understand them as a whole.
  • proteomes represent physiological or pathological conditions in a cell or tissue, and thus are most suitable for finding a marker for diagnosis that can be directly used for diagnosis of disease.
  • proteomics is the only research method. Currently, a non-invasive approach is used to diagnose body fluids such as plasma, serum, urine, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, and fluid. Many researchers use proteomics methods to identify disease-specific proteins with diagnostic markers .
  • the term " marker for predicting fracture or osteoporosis occurrence " refers to a proteinaceous substance that is a standard for distinguishing between a group having a high incidence of osteoporosis and a group of a low blood sample.
  • the proteinaceous markers have a relatively high or low abundance in a group having a high incidence of osteoporosis and a low group of blood.
  • the protein markers thus identified can be said to be specific to the onset of osteoporosis and thus can be used for diagnosing fracture or osteoporosis have. Furthermore, considering that the protein markers thus identified are prominent in the group with a high incidence of osteoporosis, the physiological function of the protein markers is likely to be directly related to the onset of osteoporosis, Sex markers can also be useful as a target protein for studying the mechanism of osteoporosis onset or for developing osteoporosis treatment.
  • the present invention provides a kit for predicting the development of fracture or osteoporosis, which comprises an antibody specifically binding to a protein selected from the group consisting of slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 and vilse or an immunogenic fragment thereof.
  • an antibody refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to a marker protein and includes both polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and recombinant antibodies.
  • the production of the antibody using the marker protein can be easily performed using techniques well known in the art.
  • Polyclonal antibodies can be produced by methods well known in the art for obtaining serum containing antibodies by injecting an animal with a marker protein antigen for predicting the risk of fracture or osteoporosis as described above and collecting blood from the animal.
  • Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal species host, such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, small dogs, and the like.
  • Monoclonal antibodies can be obtained from the hybridoma method (see Kohler and Milstein (1976) European Journal of Immunology 6: 511-519), or the phage antibody library (Clackson et al, Nature, 352: 624 Biol., 222: 58, 1-597, 1991) techniques.
  • the antibody prepared by the above method can be separated and purified by gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like.
  • An antibody of the invention comprises a functional fragment of an antibody molecule as well as a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen binding function, and includes Fab, F (ab ') 2, F (ab') 2 and Fv.
  • kits of the present invention are comprised of one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay method.
  • the kit of the present invention may be a kit that includes essential elements necessary for performing an ELISA.
  • the ELISA kit comprises an antibody specific for a marker protein and comprises a agent for measuring the protein level.
  • the ELISA kit may comprise a reagent capable of detecting an antibody forming an "antigen-antibody complex", such as a labeled secondary antibody, chromopores, an enzyme (eg, conjugated to an antibody) have.
  • antibodies specific for the quantitative control protein may be included.
  • the kit of the present invention may further comprise a genomic DNA derived from a sample to be analyzed, a primer set specific for the marker of the present invention, an appropriate amount of DNA polymerase (for example, Taq polymerase), a dNTP mixture, PCR buffer solution and water.
  • the PCR buffer solution may contain KCl, Tris-HCl and MgCl2.
  • components necessary for conducting electrophoresis to confirm whether the PCR product is amplified can be further included in the kit of the present invention.
  • kit of the present invention may be a kit containing essential elements necessary for performing RT-PCR.
  • RT-PCR kits can be used in combination with test tubes or other appropriate containers, reaction buffers (varying in pH and magnesium concentration), deoxynucleotides (dNTPs), Taq polymerase and reverse transcriptase , DNase, RNase inhibitor, DEPC-water, sterile water, and the like. It may also contain a primer pair specific to the gene used as a quantitative control.
  • the kit of the present invention may be a kit containing essential elements necessary for performing a DNA chip.
  • the DNA chip kit may include a substrate to which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached as a probe, and the substrate may include a cDNA corresponding to a quantitative structural gene or a fragment thereof.
  • the kit of the present invention may also be in the form of a microarray having a substrate on which the markers of the present invention are immobilized.
  • the present invention also provides a method for detecting a protein selected from the group consisting of slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 and vilse through an antigen-antibody reaction from a blood sample of a patient in order to provide information necessary for prediction of fracture or osteoporosis occurrence .
  • &quot detection of protein " can be confirmed by measuring the expression level of mRNA or protein.
  • RNA expression level &quot measures the amount of mRNA by confirming the presence and expression level of mRNA encoding the protein in a biological sample to predict the risk of fracture or osteoporosis.
  • PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • PCR competitive reverse-transcription polymerase chain reaction
  • RPA RNase protection assay
  • &quot measurement of protein expression level " is a process for confirming the presence and the degree of expression of a protein in a biological sample in order to predict the risk of fracture or osteoporosis.
  • the protein is specifically bound to the protein of the gene The amount of protein can be confirmed by using an antibody.
  • Methods known in the art can be used as an assay method for this, and examples thereof include Western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Immunoprecipitation Assay, Complement Fixation Assay, Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS), Immunoprecipitation Assay, Immunoprecipitation Assay, Ouchterlony Immunoprecipitation, Rocket Immunoelectrophoresis, Protein chips, and the like.
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • RIA radioimmunodiffusion
  • Immunoprecipitation Assay Complement Fixation Assay
  • Fluorescence Activated Cell Sorter FACS
  • Immunoprecipitation Assay Immunoprecipitation Assay
  • Ouchterlony Immunoprecipitation Rocket Immunoelectrophoresis, Protein chips, and the like.
  • the slit3 has a negative correlation with the incidence of osteoporosis, and thus may be useful as a biomarker for predicting the risk of fracture or osteoporosis.
  • the present invention also provides a method for producing a recombinant vector comprising the steps of: (a) culturing cells transfected with a gene selected from the group consisting of slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 and vilse; (b) contacting the test substance with the cells of step (a); And (c) comparing the expression level of slit1, slit2, slit3, robo1, robo2, or vilse protein in the cells of step (b) with a control group not treated with the test substance, and screening for a therapeutic agent for bone fracture or osteoporosis ≪ / RTI >
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating fracture or osteoporosis, which is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 and comprises the LRR2 domain recombinant peptide of the slit3 protein.
  • the LRR2 domain of the slit3 protein is one of four leucine-rich repeat (LRR) domains in the slit protein, and the second domain, LRR2, binds to the receptor.
  • the present inventors prepared a small recombinant peptide of slit3 as an LRR2 domain and confirmed the effect on the differentiation of osteoclasts by using it. As a result, it was confirmed that the recombinant peptide significantly inhibited osteoclast differentiation (Fig. 13). Therefore, the recombinant peptide may be useful for the treatment of osteoporosis.
  • the present invention provides a polynucleotide or a complementary polynucleotide thereof for predicting the occurrence of fracture or osteoporosis, the polynucleotide being composed of 10 or more continuous bases comprising a base at a SNP position selected from the group consisting of:
  • NCBI refSNP ID of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10: rs7655084;
  • NCBI refSNP ID of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11: rs1549909;
  • NCBI refSNP ID of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11: rs10036727;
  • NCBI refSNP ID of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13: rs3821735;
  • NCBI refSNP ID of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13: rs78817248;
  • NCBI refSNP ID of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15: rs12418548.
  • the refSNP ID of the NCBI for the SNP indicates the sequence of the SNP and its position. Those skilled in the art can easily identify the position and sequence of the SNP using the above numbers.
  • the reference sequence used in the analysis is the sequence collected and published by the Genome Reference Consortium in February 2009, and the detailed information is available from GRCh37 (hg19) (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway) in the NCBI assembly database. You can check the contents. It will be apparent to those skilled in the art that the specific sequence corresponding to the refSNP ID of the SNPs registered in the NCBI may be varied slightly depending on the results of the study of the succeeding genes and such altered sequences are also included within the scope of the present invention.
  • RefSNP ID: rs7655084 the genotype in which the bone density is low in the base at the position of chromosome 4 gene was changed from T to G.
  • RefSNP ID: rs1549909 the genotype with low bone density in the base at position 168180670 on chromosome 5 of SLIT3 gene was replaced with T in C.
  • RefSNP ID: rs10036727 the genotype of the SLIT3 gene with low bone density in the base of chromosome # 168180081 at position 5 was replaced with T in C.
  • RefSNP ID: rs3821735 the genotype with low bone density in the base at position 77684222 on chromosome 3 of ROBO2 gene was replaced with A in C.
  • RefSNP ID: rs78817248 the genotype with low bone density in the base at position 77626788 on chromosome 3 of ROBO2 gene was replaced with G in C.
  • RefSNP ID: rs12418548 the genotype with low bone density in the base of position 124757560 of chromosome 11 of ROBO4 gene was replaced with A to G.
  • the polymorphisms of the genes in the genes were studied in a group having an average BMD of more than a mean BMD group and a BMD group having a significantly lower BMD. As a result, Were significantly associated with the risk of BMD status (see Table 6).
  • the genotype at the SNP position that represents the risk of low BMD status is GT, GG genotype in the case of refSNP ID: rs7655084; refSNP ID: rs1549909 is the TT genotype; refSNP ID: rs10036727 is TT genotype; refSNP ID: rs3821735 is the CC, CT genotype; refSNP ID: CG, GG genotype in the case of rs78817248; The refSNP ID: rs12418548 showed GG and GA genotypes.
  • the SNPs of the present invention can be usefully used for predicting fracture or osteoporosis occurrence due to a significantly low bone density.
  • the polynucleotide comprising the SNP, or a complementary polynucleotide thereof may be a DNA fragment composed of 10 or more consecutive bases, and the size of the DNA fragment may include a base at the SNP site But it is preferably 10 to several hundred bases, more preferably 100 to 500 bases are suitable. 100-500 bases can be used as a probe or a primer for detecting the SNP, and more bases can be used for PCR-RFLP and the like.
  • the present invention also provides a marker composition for predicting the development of fracture or osteoporosis comprising a polynucleotide comprising the SNP or a complementary polynucleotide thereof, or a prediction kit.
  • the kit containing the SNP may be implemented by a method of manufacturing a SNP kit known in the art.
  • SNPs can be easily detected by, for example, immobilizing a polynucleotide comprising the SNP or its complementary polynucleotide on a substrate and detecting the result of hybridization and hybridization of the nucleic acid .
  • Immobilization of a polynucleotide comprising the SNP or a complementary polynucleotide thereof on a substrate can be easily carried out by methods known in the art.
  • methods for detecting nucleic acid hybridization and hybridization results on a microarray can be performed according to methods known in the art.
  • a hybridization result can be detected by labeling a nucleic acid sample with a labeling substance (for example, a fluorescent substance) that generates a detectable signal, and then hybridizing on the microarray and detecting a signal generated from the labeling substance .
  • a labeling substance for example, a fluorescent substance
  • Antibodies to NFATc1 were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Antibodies and recombinant slit1 / 2/3 to slit3 were obtained from Abcam (Cambridge, MA, USA) and R & D System Inc. (Minneapolis, MN, USA). Robo1 and Robo2 fc chimeras were purchased from R & D system Inc.
  • Procedure 1 Cell culture, organ culture and collection of conditioned media
  • BMCs Primary mouse bone marrow cells
  • BMCs cultured with 30 ng / mL M-CSF (R & D System Inc.) over 3 days were used as bone marrow macrophages (BMMs). Cells at this stage were considered to be osteoclast precursors. BMCs were induced to differentiate into osteoclasts by culturing with 30 ng / mL M-CSF and 50 ng / mL soluble RANKL (R & D System Inc.) using culture medium exchanged every 2-3 days. Alternatively, murine macrophage Raw 264.7 cells (ATCC, Manassas, VA, USA) were also used to prepare osteoclast-like cells using the same volume of RANKL.
  • ATCC Manassas, VA, USA
  • peripheral blood was obtained from normal healthy volunteers. Blood was diluted with the same amount of ⁇ -MEM and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated by centrifugation on a Lymphoprep TM (Axis-Shield, Oslo, Norway) density gradient. The cells were suspended in autoMacs buffer and CD14-positive mononuclear cells were selected using a cell separator (autoMacs magnetic cell separator; Miltenyi Biotech, Auburn, CA, USA).
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • PBMCs (3.0-4.0 ⁇ 10 6 / well ) to M-CSF are incubated for 3 days 6 well plates in the presence (25 ng / mL), and then, M-CSF (25 ng / mL) and RANKL (30 ng / ml). It takes 7-9 days for the cells to completely differentiate into osteoclasts.
  • Rat MC3T3-E1 precursor bone cells in (preosteoblast cell line, ATCC) of 10% under the conditions humidified with 5% CO 2 FBS, 100 U / mL penicillin, and ⁇ -MEM containing 100 ⁇ g / mL streptomycin, 37 °C Lt; / RTI > The medium was changed twice a week. 80% confluence, and the cells were subcultured using trypsin-EDTA (Gibco).
  • BMSCs primary human bone marrow stromal cells
  • the ribs are discarded in thoracotomy in patients without metabolic bone disease.
  • the ribs were opened aseptically and longitudinally cleaned after clearing the soft tissue.
  • the exposed bone marrow was flushed out with serum-free ⁇ -MEM several times and centrifuged at 1,400 rpm for 10 minutes.
  • the cell pellet was resuspended in the culture medium and the human BMSC fraction was obtained with Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo, Norway).
  • the cells were seeded in 75-cm 2 plastic culture flasks at a density of 3 ⁇ 10 7 cells / 75-cm 2 and cultured in ⁇ -MEM containing 10% FBS, 100 U / mL penicillin, and 100 ⁇ g / mL streptomycin Respectively.
  • the medium was changed twice a week from two weeks later.
  • the cells grew to 80-90% confluence, they were subcultured using 0.01% trypsin and 0.05% EDTA. Second subculture cells were used for the experiments.
  • the organ culture of the femurs obtained from 6-week-old C57BL / 6 mice was performed.
  • the bone marrow was strongly flushed and cells were further shaken for 24 hours with H 2 O to remove.
  • the bones were then washed extensively with alpha-MEM and co-cultured with BMMs.
  • CM osteoclastogenesis or bone resorption
  • CMs collected at various stages of osteoclastogenesis were assessed using a commercially available ELISA kit (Immunodiagnostic Systems, Boldon, UK) with a low detection limit of 0.2 U / L, -5b (tartrate-resistant acid phosphatase-5b).
  • Absorption activity in CM was assessed by measuring CTX (C-telopeptide) using an ELISA kit (RatLaps; Immunodiagnostic Systems) with a low detection limit of 2.0 ng / mL.
  • Chemotaxis analysis was performed in a Boyden chamber system (Costar, Corning, NY, USA) using transwells with polycarbonate membranes containing 8- ⁇ m pores. After seeding the cells to the inner chamber for six hours at a density of ⁇ -MEM per 100 ⁇ L with 0.1% FBS 1.0 ⁇ 10 5 cells for an additional 24 hours to process in the outer chamber to the CM or slit3. The cells on the upper membrane were wiped off with a cotton swab and removed completely. Cells infiltrated into the lower membrane were fixed and stained with hematoxylin. Finally, the cells were counted using a computer video-imaging system (Olympus, Tokyo, Japan).
  • the confluent cells were wounded with a plastic tip.
  • Cell migration was observed in ⁇ -MEM supplemented with 0.1% FBS, and wound marks were measured using an inverted microscope at 0 and 24 hours. Quantitation was performed by measuring each wound closure area using Quantity One (BioRad, Hercules, Calif., USA). Data are expressed as percent of wound closure.
  • Cell viability was measured using Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japan) according to the manufacturer's instructions. Briefly, 10 ⁇ L of WST-8 dye (2- [2-methoxy-4-nitrophenyl] -3- [4-nitrophenyl] -5- [2,4-disulfophenyl] -2H-tetrazolium, monosodium salt) was added to each well of a 96 well plate and allowed to react for 2 hours and absorbance at 450 nm was measured at a reference wavelength of 650 nm using a microplate reader (SPECTRAmax 340PC; Molecular Devices, Palo Alto, CA, USA).
  • SPECTRAmax 340PC Molecular Devices, Palo Alto, CA, USA
  • Brd-U (5-bromo-2'-deoxyuridine). Osteoblast cells were seeded in a 96-well plate, allowed to react for 24 hours, and subcultured in? -MEM for 24 hours. The cells were then reacted with Brd-U for 24 hours before cell differentiation was measured with Brd-U labeling and detection kit (Roche, Mannheim, Germany).
  • Raw 264.7 cells were seeded at a density of 4.0 ⁇ 10 5 cells per 100 mm dish using ⁇ -MEM containing 10% FBS, and then treated with the cells with or without a soluble 50 ng / mL RANKL per day And differentiated into osteoclasts. The next day, the cells were washed three times with serum-free and phenol red-free medium, and then the medium was replaced with 6 mL of serum-free and non-phenol red ⁇ -MEM with or without RANKL and cultured for one day. The CM was filtered through a 0.45 ⁇ m membrane filter and stored at -70 ° C. The proteins in the CM were lyophilized and precipitated.
  • Protein complexes were composed of C18-HPLC columns (214TP5125, 2.1 x 150 mm; Vydac Grace, Hesperia, CA, USA), autosampler and UV detector (215 nm wavelength; Peptide Library Support Facility, Pohang, Korea) (Acetonitrile) and 0.1% TFA (trifluoroacetic acid) at a flow rate of 0.3 mL / min for 120 minutes using a capillary HPLC system.
  • each protein fraction was dissolved in 50 mM ABC (ammonium bicarbonate) and the sample was reduced by the addition of 10 mM DTT (dithiothreitol), and 100 mM iodoacetamide was added was added for cysteine alkylation. Finally, 500 ng of trypsin was added and incubated at 37 ° C for 6 hours.
  • ABC ammonium bicarbonate
  • Each digested sample was analyzed using a linear-trap quadrupole (LTQ) mass spectrometer equipped with a nanoflow HPLC system (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA).
  • the peptides were separated using a reversed phase analysis column (10 cm ⁇ 75 ⁇ m i.d.) packed with C18 (3 ⁇ m).
  • the gradient was started at 5% ACN for 5 min at a flow rate of 250 nL / minute, then increased to 40% ACN for 60 min and 80% ACN for the final 10 min.
  • the eluent was injected into the LTQ mass spectrometer using a nano-ion source at an electrospray voltage of 1.8 kV.
  • the assay consisted of a full mass spectrometry (MS) scan in the range of 400-1500 m / z, and a data-dependent mass spectrometry (MS2) for the five most-intense ions was analyzed in a full MS scan.
  • MS mass spectrometry
  • MS2 data-dependent mass spectrometry
  • the identified proteins are analyzed using DAVID (atabase for annotation, visualization, and integrated discovery) database, a web-based program (http://david.abcc.ncifcrf.gov) And molecular function.
  • the identified proteins were evaluated to characterize their secretion using HMM scoring (SignalP 3.0 hidden Markov matrix scoring).
  • Cell lysates were lysed in lysis buffer (20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, protease-inhibitor mixture at 4 ° C for 20 minutes. Protein concentrations of the lysates were measured using a BCA protein assay kit (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA). Samples containing 10-20 ⁇ g protein were separated by 10% gel SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose membranes (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK).
  • phosphatase inhibitors (1 mM Na3VO4, 1 mM NaF) HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA).
  • the lysates were immunoprecipitated with GFP antibody (Anaspec, Fremont, CA, USA) and protein-G-Sepharose beads (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) at 4 ° C for 18 hours. Immunoprecipitates and cell lysates were provided for immunoblot analysis with anti-GFP or anti-Myc antibodies (Novus biological, Littleton, Co, USA).
  • the amplification protocol consisted of 30 cycles of denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 60 ° C for 30 seconds, and extension at 72 ° C for 30 seconds.
  • the PCR products were separated on 1% agarose gel, stained with EtBr and visualized under UV.
  • Quantitative PCR was performed using Light Cycler 480 (Roche), and OPG (osteoprotegerin), RANKL, ALP (alkaline phosphatase), OCN (osteocalcin), TRAP, CatK (cathepsin K), MMP- ) And CTR (calcitonin receptor) gene expression levels were measured using Light Cycler 480 SYBR Green I Master Mix (Roche). PCR amplification was performed in duplicate and water was used as a negative control to replace the cDNA in each run.
  • primer sequences are: 5'-CAC GGC CAT CCT ATA TGG TAA-3 '(sense) and 5'-GAG ACA TTT TCC CGT TCA CC-3' for ALP; 5'-GCT ACC TTG GAG CCT CAG TC-3 '(sense) and 5'-CTC GTC ACA AGC AGG GTT AAG-3' (antisense) for OCN; 5'-GCA TTA TGA CCC AGAAC TGG T-3 '(sense) and 5'-TAG GTG CCA GGA GCA CAT TT-3' (antisense) for OPG; 5'-AGC GCA GAT GGA TCC TAA CA 3 '(sense) and 5'-GAG TCC TGC AAA TCT GCG TT-3' (antisense) for RANKL; 5'-CGA CCA TTG TTA GCC ACA TAC G-3 '(sense) and 5'-TCG TCC TGA AGA TAC TGC A
  • SiRNA and nonsense siRNA were transfected with lipofectamine reagent (Invitrogen) Respectively. Briefly, after culturing the cells in? -MEM containing 10% FBS, the siRNA-reagent mixture in OPTI-MEM (Invitrogen) was added and the cells were further cultured for an additional 6 hours. Subsequently, the medium was replaced with fresh complete [alpha] -MEM, and the cells were further cultured for 2 days.
  • MC3T3-E1 cells were seeded in 24-well plates for 24 hours, then starved for 24 hours with or without slit3. The cells were fixed and washed twice with phosphate-buffered serum (PBS). The cells were incubated with 100 ng / mL phalloidin (Molecular Probes, Leiden, Netherlands) at 37 ° C for 30 minutes. Immunofluorescence images were captured using a fluorescence microscope (Olympus).
  • TRAP an enzymatic marker of osteoclast
  • TRAP-positive polynuclear cells containing three or more nuclei were considered osteoclasts and counted under an optical microscope (Olympus).
  • BMCs (5 x 10 4 cells / well) were placed on dentine discs with 30 ng / mL M-CSF and 50 ng / mL soluble RANKL for measurement of the absorbance area. After 10 days, the slide was washed with 5% sodium hypochlorite aqueous solution to remove cells, and the absorbing pits were stained with hematoxylin. For measurement of the absorbed area per number of BMCs, TRAP staining was performed prior to staining hematoxylin on dentin discs. The area of the absorbing pit was analyzed using Quantity One Software (VersaDoc Model 3000 Imaging system, Bio-Rad, Berkeley, Calif., USA).
  • mice Four-week-old C57BL / 6 mice were injected subcutaneously in two openings (calvaria) with PBS or 300 ⁇ g / kg of slit3 once a day for 3 days, once a day for 5 days. The injection was performed on the left side of the calvarial sagittal between the lambdoidal suture and the coronal suture and the right side was used as the control group. The animals were sacrificed and the two openings were fixed in 4% PFA (paraformaldehyde). Each of the two openings was de-calcined with 14% EDTA and embedded in an OCT (optical cutting temperature) compound for frozen section. Samples were cut into 7- ⁇ m sections and stained with hemotoxylin and eosin. The width of the two open bones was measured with an optical microscope.
  • mice Six-week old C57BL / 6 mice were divided into 4 groups: control (0.1% BSA + PBS); slit3-treated group (0.1% BSA + 300 [mu] g / kg slit3); Two IL-1-induced osteoblasts (2 ⁇ g IL-1 + PBS); And IL-1 bone loss and slit3-treated group (2 ⁇ g IL-1 + 300 ⁇ g / kg slit3).
  • a collagen sponge Cellmatrix Type I-A; Nitta Gelatin Inc., Osaka, Japan
  • the mice were sacrificed 7 days after transplantation and the two openings were fixed in 4% PFA.
  • Each of the two openings was decalcified with 14% EDTA and embedded in the OCT compound for frozen section. Samples were cut into 7- ⁇ m sections and stained with hemotoxylin and eosin. The width of the two open bones was measured with an optical microscope.
  • the present inventors used 11-week-old C57BL / 6 mice.
  • the tibias were carefully pierced with a 23 gauge needle.
  • GFP-labeled MC3T3-E1 cells were injected into the bone marrow using a 31 gauge needle with PBS (left tibia) or 300 ⁇ g / kg slit3 (right tibia).
  • the mice were sacrificed after 2 or 3 days and the shinbone was fixed in 4% PFA. Each shin bone was de-calcified with 14% EDTA and embedded in OCT compound for frozen section.
  • To count the number of GFP positive cells samples were observed on slides placed under a fluorescence microscope (Olympus).
  • the slit3 mutant embryos were prepared by crossing male and female slit3 +/- C57BL / 6J mice purchased from Mutant Mouse Regional Resource Centers (stock number 030759-MU; Columbia, MO, USA). Embryonic tissue was collected in PBS and fixed at 10% formalin overnight at room temperature. For histochemical analysis, 17.5 days (E17.5) of wild-type and slit3 mutants were fixed with 4% PFA and embedded in OCT compound. 7 [mu] m sections were stained with Von Kossa reaction and nuclear fast red. For IHC staining, peroxidase chromogens (Invitrogen) were used.
  • mice were anesthetized by intramuscular injection with a mixture of 40 mg / kg Zoletil 50 (Virbac, France) and 5.6 mg / kg Rompun (Bayer Korea, Seoul, Korea) and placed in a prone position in a limb Respectively.
  • the inventors of the present invention have found that the mutation of the mutation in the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation of the mutation (NM_019055) were investigated. Target regions for these genes were the entire coding exon, exon-intron boundary, and regulatory region.
  • the purified DNA library was hybridized with SureSelect Target Enrichment probes set (Agilent, Santa Clara, Calif.) And captured in the tagged region according to the manufacturer's instructions. Using the captured library, HiSeq2000 paired-end flowcell was prepared according to the manufacturer's protocol. Next, clusters of PCR colonies were sequenced on a HiSeq2000 platform.
  • variable culture conditions for osteoclastogenesis and bone resorption were prepared.
  • BMMs were incubated with 100 ng / mL RANKL and mouse femur for 10 days with 30 ng / mL M-CSF.
  • Osteoclast differentiation and bone resorption were evaluated by measuring TRAP-5b activity and CTX concentration in each medium.
  • CM obtained from RANKL-treated cells showed a marked increase in TRAP-5b activity compared with the untreated group at each step.
  • CTX concentration increased only in the presence of both femur and RANKL.
  • CM collected from osteoclast cultures was treated with osteoblasts and MC3T3-E1 cells of primary mouse mice.
  • Any medium of RANKL-treated BMMs was tested for viability or differentiation of primary osteoblasts (Figs. 2a and 2c, respectively) or viability or differentiation of MC3T3-E1 cells (Figs. 2b and 2d, respectively) Of the respondents.
  • wound-healing analysis shows that CM from RANKL-treated BMMs significantly increases the motility of both osteoblasts (Fig. 2E) and MC3T3-E1 cells (Fig. 2F) compared to the untreated group.
  • CM from RANKL-treated Raw 264.7 cells also increased mobility of MC3T3-E1 cells (Fig.
  • CM collected from RANKL-treated cells in the late differentiation stage showed a greater degree of mobility of osteoclasts Stimulated, but the CM obtained from RANKL-treated cells at the early differentiation stage most significantly increased the motility of the precursor bone cells.
  • CM from osteoclasts cultured for 10 days with RANKL did not stimulate motility regardless of whether or not the rat femur is present.
  • CM collected from both RANKL-treated BMM and Raw 264.7 cells also markedly stimulated the directional mobilization of MC3T3-E1 cells (Figs. 2h and 2i, respectively) as compared to untreated controls.
  • LC-MS / MS fractionation In order to identify specific proteins that act as chemokines for osteoclasts, we performed LC-MS / MS fractionation. Briefly, 96 matched fractions of CM from RANKL-treated and-untreated Raw 264.7 cells were treated in MC3T3-E1 cells and the effect on mobility of these cells was compared using the Boyden chamber assay. We selected matched fractions that exhibited the most different effects on migration of MC3T3-E1 cells. The proteomic analysis described in the Experimental Method section was performed on selected fractions and adjacent RANKL-treated fractions. We identified 45 peptides that were differentially expressed in the RANKL-treated fraction as compared to the adjacent fraction and the RANKL-untreated control. Of these, 9 peptides were secreted (Table 1). Finally, the slit3 protein was selected and further experiments were performed.
  • BMMs bone marrow macrophages
  • M-CSF macrophage colony-stimulating factor
  • the osteoclast formation process was blocked in BMMs using siRNA of NFATc1, a master gene known to be involved in osteoclastogenesis, and Western blotting was performed by the same method. The results are shown in Figs. 3A and 3B, respectively.
  • slit3 was significantly increased in both cell lysate and CM (conditioned media) of differentiated osteoclasts.
  • Slit3 stimulates osteoblast migration, viability, proliferation, differentiation and OPG production.
  • osteoprotegerin osteoprotegerin
  • MC3T3-E1 osteoblasts were treated with slit3 (0, 0.1, 0.5, and 1.0 ⁇ g / mL) for 48 hours and CCK-8 assay and Brd-U assay were performed as shown in FIGS. 4B and 4C As a result, it was confirmed that osteoblast survival and proliferation were increased by treatment with slit3.
  • IGF-1 was used as a positive control.
  • osteoblast differentiation marker MRNA expression of ALP (alkaline phosphatase) and OCN (osteocalcin) was significantly increased.
  • slit3 contributes to the osteogenesis process by enhancing migration, viability, proliferation, differentiation and production of OPG in osteoblast.
  • Slit3 stimulates the migration of MC3T3-E1 cells to the osteogenic surface.
  • Von Kossa staining was performed to evaluate the accumulation of calcium in the femur of 17.5-day-old slit3 mouse embryos and VEGF IHC staining was performed to assess vessel formation.
  • Slit3-knockout embryos showed little staining by both methods, Von Kossa ( Figure 8a) and VEGF IHC ( Figure 8b), compared to wild-type embryos.
  • MC3T3-E1 cells expressed Robo1 and Robo2 receptors (Fig. 9A).
  • Primary osteoclast cells mainly express Robo1 receptor, while expression levels of Robo3 and Robo4 receptor were weakly increased (Fig. 9b).
  • Blocking siRNA transfection and expression of Robo1 and Robo2 by fc chimera in MC3T3-E1 cells inhibited the migration and proliferation of slit3-stimulated cells (FIGS. 9c 9d, respectively).
  • siRNA transfection to the Robo1 receptor completely restored the reduction of osteoclast formation by slit3 treatment ( Figure 9e).
  • GFP-Robo1 produced from human BMSC and human PBMC was transfected with Myc-vilse in osteoblast (Fig. 10a) and osteoclast (Fig. 10b), respectively.
  • Slit3 treatment was induced by co- Significantly increased the Vilse interaction.
  • Knockdown of vilse with siRNA inhibited the slit3-stimulated viability of MC3T3-E1 cells ( Figure 10c).
  • the LRR2 domain of the slit protein has been reported to bind to their receptor, Robo.
  • the present inventors have produced small recombinant peptides of slit3 as LRR2 domain peptides. It was confirmed that the recombinant peptide significantly inhibited osteoclast differentiation (Fig. 13). These results indicate that recombinant peptides can be useful for the treatment of osteoporosis.
  • the subjects were healthy postmenopausal women who visited Seoul Asan Medical Center (Seoul, Korea). All of the above women were concerned about the possibility of osteoporosis, or osteoporosis was detected in a health examination. At this time, menopause was the case of amenorrhea persisted for more than 1 year, and the concentration of follicle stimulating hormone (FSH) in the serum was measured and verified. Subjects who were menopausal before 40 years of age, subjects who received medication that would affect bone metabolism for more than 6 months or 12 months, and those who had diseases that might affect bone metabolism were excluded. Finally, 346 women were selected.
  • FSH follicle stimulating hormone
  • the age, weight, height, BMI, behavioral factors (smoking, drinking, exercise, etc.) and bone mineral density were measured.
  • Bone mineral density (BMD, g / cm 2) is DXA; femoral neck (femur neck) of using the (Lunar Prodigy, Madison, WI, USA) spinal (lumbar spine, L1-L4) and the proximal femur (proximal femur), the femoral total femur, trochanter, femoral shaft, and ward were measured.
  • the fasting blood samples of the subject selected in 13-1 above were centrifuged and the supernatant was separated.
  • Serum slit3 concentrations were measured using a slit3 competitive ELISA kit (Echelon Biosciences Inc, Salt Lake, UT, USA) and repeated twice.
  • the results were subjected to multiple linear regression analysis using BMD or T-score at each bone position as a dependent variable and slit3 concentration as an independent variable.
  • the results are shown in Table 2. Covariates included age, weight, height, smoking, drinking and regular exercise.
  • blood slit3 concentration was correlated with BMD and T-score in lumbar spine, femoral neck, total femur, femoral triangle, and femoral shaft Respectively.
  • osteoporosis is defined as T-score ⁇ -2.5 SD in either lumbar spine, femoral neck, or total thigh. The results are shown in Table 4 below.
  • the osteoporosis odds was found to be about 58% lower in the group with the highest level of slit3 (Q1) than in the group with the lowest level of slit3 (Q5) after correction to covariance.
  • the slit or robo protein of the present invention increases osteogenesis, decreases bone resorption, and has a negative correlation with the incidence of osteoporosis in cell and animal models, and is useful as a composition for preventing or treating fracture or osteoporosis, And can be usefully used as a biomarker for predicting the risk of occurrence.
  • composition for treating or preventing osteoporotic fracture or osteoporosis comprising slit-robo system

Abstract

본 발명은 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질을 유효성분으로 함유하는 골절 또는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 단백질을 포함하는 골절 또는 골다공증 발생 위험 예측용 마커 조성물, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 골절 또는 골다공증 발생 위험 예측용 키트, 및 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합 반응을 통해 slit 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 골절 또는 골다공증의 발생 위험을 예측하기 위한 정보제공방법에 관한 것이다. 본 발명의 slit3은 세포 및 동물모델에서 골 형성을 증가시키고, 골 흡수를 감소시키며, 골다공증의 발병률과 음의 상관관계를 가지고 있어, 골절 또는 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물 및 골절 또는 골다공증 발생 위험을 예측하기 위한 바이오 마커로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

Ｓｌｉｔ-Ｒｏｂｏ 시스템을 이용한 골절 또는 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 slit, robo 또는 그 발현 단백질을 유효성분으로 포함하는 골절 또는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 유전자 또는 발현 단백질을 이용한 골절 또는 골다공증 발생 위험 예측용 키트, 및 골절 또는 골다공증의 발생 위험을 예측하기 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
골다공증이란 뼈를 형성하는 무기질과 기질의 양이 과도하게 감소하여 골밀도가 감소된 상태를 나타내는 것으로, 골다공증이 있는 경우 뼈가 쉽게 부러질 수 있게 된다. 따라서, 골다공증은 낮은 골밀도(bone mineral density; BMD) 및 증가된 골절 위험을 갖는 가장 빈번한 대사성 골질환(metabolic bone disease; MBD) 이다 (Peacock, M., et al., Endocr. Rev. 23:303-326, 2002; Akhter, M.P., et al., Bone. 41(1):111-6, 2007). 최근 들어 엉덩이, 척추 및 손목 등의 일반적인 골다공증성 골절로 입원한 환자가 현저하게 증가하고 있다 (Fogarty, P., et al., Maturitas. 52 Suppl 1:S3-6, 2005; Palacios, S., et al., Maturitas. 15;52 Suppl 1:S53-60. Review, 2005). 특히 40세 이후의 여성에게서는 폐경에 따른 폐경 후 골다공증이 높은 빈도로 나타나며, 70세 이후에는 남녀를 불문하고 노인성 골다공증이 발생한다.
현재, 골다공증의 진단은 X선 촬영 등의 물리학적 방법을 통하여 이루어지고 있지만, 이 방법은 대규모 진단장치를 필요로 하고, X선을 사용함에 따른 안전성 등의 문제가 있을 뿐만 아니라, 향후 골밀도의 감소를 미리 예측할 수 없으며, 골밀도 수치만으로는 정확하게 골다공증성 골절 위험이 얼마인지 정확하게 예측하기 어렵다는 결점을 갖고 있다.
따라서 폐경 후 골다공증이나 노인성 골다공증을 비롯하여 각종 골다공증을 조기에 발견하고 진단하고 골절 리스크를 예측함으로써 효과적인 치료를 할 수 있도록 하는 신속하고 간편하며 아울러 정확한 방법의 확립이 요망된다.
이에 본 발명자들은 골절 또는 골다공증의 치료제, 및 골절 또는 골다공증 발생 위험 예측용 마커를 개발하고자 연구를 계속한 결과, slit3가 세포 및 동물모델에서 골 형성을 증가시키고, 골 흡수를 감소시키며, 골다공증의 발병률과 음의 상관관계를 가지고 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질을 유효성분으로 함유하는 골절 또는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질을 유효성분으로 함유하는 골절 또는 골다공증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 단백질을 포함하는 골절 또는 골다공증 발생 예측용 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 골절 또는 골다공증 발생 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 유전자의 mRNA를 검출하기 위한 RT-PCR용 프라이머를 포함하는 골절 또는 골다공증 발생 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 골절 또는 골다공증 발생 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 혈액 시료로부터 항원-항체 반응을 통해 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 단백질을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 피검물질을 처리한 세포에서 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse 단백질의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는 골절 또는 골다공증 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, slit3 단백질의 LRR2 도메인 재조합 펩타이드 및 이를 포함하는 골절 또는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, slit2, slit3, robo1, robo2, robo4에 위치하는 SNP를 포함하는 골절 또는 골다공증 발생 예측용 마커 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질을 유효성분으로 함유하는 골절 또는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 단백질을 유효성분으로 함유하는 골절 또는 골다공증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 단백질을 포함하는 골절 또는 골다공증 발생 예측용 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 골절 또는 골다공증 발생 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 유전자의 mRNA를 검출하기 위한 RT-PCR용 프라이머를 포함하는 골절 또는 골다공증 발생 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 골절 또는 골다공증 발생 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 혈액 시료로부터 항원-항체 반응을 통해 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 피검물질을 처리한 세포에서 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse 단백질의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는 골절 또는 골다공증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 slit3 단백질의 LRR2 도메인 재조합 펩타이드 및 이를 포함하는 골절 또는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 slit2, slit3, robo1, robo2, robo4에 위치하는 SNP를 포함하는 골절 또는 골다공증 발생 예측용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 slit 또는 robo 단백질은 세포 및 동물모델에서 골 형성을 증가시키고, 골 흡수를 감소시키며, 골다공증의 발병률과 음의 상관관계를 가지고 있어, 골절 또는 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물 및 골절 또는 골다공증 발생 위험을 예측하기 위한 바이오 마커로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 커플링 현상을 조사하기 위한 시험관내 시스템을 확립하기 위해, 파골세포생성 및 골흡수에 대한 가변 배양조건을 준비하는 도이다.
도 2는 초기 파골세포생성으로부터 유도된 인자들에 의한 전조골세포의 보충의 자극이 골-재형성 부위에서 커플링 현상의 주요 메카니즘임을 설명하는 도이다.
도 3a는 분화된 파골세포에서의 slit3의 분비를 나타낸 도이다.
도 3b는 RANKL에 의해 분화된 파골세포에서의 slit3 발현이 NFATc1 siRNA 전처치에 의해 억제되는 것을 나타낸 도이다.
도 4a는 slit3의 농도에 따라 조골세포의 이동이 증가함을 나타낸 도이다.
도 4b는 slit3의 농도에 따라 조골세포의 생존능이 증가함을 나타낸 도이다.
도 4c는 slit3의 농도에 따라 조골세포의 증식이 증가함을 나타낸 도이다.
도 4d은 slit3에 의해 조골세포 분화 마커인 ALP 및 OCN의 발현이 증가함을 나타낸 도이다.
도 4e은 slit3에 의해 조골세포 내에서 OPG의 생산이 촉진됨을 나타낸 도이다.
도 4f는 slit3에 의해 조골세포에서 라멜리포디아가 관찰됨을 나타낸 도이다.
도 5는 동물모델에서 slit3 주입에 의해 골 형성이 증가함을 나타낸 도이다.
도 6은 동물모델에서 slit3 처리에 의해 골 손실이 억제됨을 나타낸 도이다.
도 7은 slit3에 의해 골 형성 표면으로 조골세포의 이동이 증가됨을 설명한 도이다.
도 8a는 slit3 넉아웃 마우스의 배아를 Von Kossa 염색을 통해 관찰한 도이다.
도 8b는 slit3 넉아웃 마우스의 배아를 VEGF 면역조직화학 염색을 통해 관찰한 도이다.
도 9는 골 세포에서 slit3의 작용이 robo1, robo2 또는 robo3 수용체를 통해 매개됨을 설명하는 도이다.
도 10은 Robo1 수용체를 통한 slit의 작용이 골 세포에서 vilse에 의해 매개될 수 있음을 설명하는 도이다.
도 11은 Robo1-넉아웃 동물모델에서 골밀도가 감소됨을 설명하는 도이다.
도 12는 slit1 및 slit2에 의해 파골세포의 분화가 감소됨을 설명하는 도이다.
도 13은 LRR2 도메인 재조합 펩타이드가 파골세포의 분화를 억제함을 설명하는 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질을 유효성분으로 함유하는 골절 또는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 slit1;
서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 slit2;
서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 slit3;
서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 robo1;
서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 robo2; 및
서열번호 6의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 vilse.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 slit1 단백질은 서열번호 1로 표시되고, 상기 slit2 단백질은 서열번호 2로 표시되고, 상기 slit3 단백질은 서열번호 3으로 표시되고, 상기 robo1 단백질은 서열번호 4로 표시되고, 상기 robo2 단백질은 서열번호 5로 표시되고, 상기 vilse 단백질은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질, 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.
상기 “기능적 동등물”이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.
본 발명의 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 또는 vilse 단백질은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 또는 vilse 단백질의 변이체란 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 또는 vilse 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아세틸화(acetylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 또는 vilse 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성 (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 slit1 유전자는 서열번호 9의 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 slit12 유전자는 서열번호 10의 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 slit3 유전자는 서열번호 11의 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 robo1 유전자는 서열번호 12의 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 robo2 유전자는 서열번호 13의 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 vilse 유전자는 서열번호 16의 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 또는 vilse는 단백질의 형태뿐만 아니라, 유전자 치료나 백신 등에 사용되기 위하여 세포 내에서 slit1, slit2, slit3, robo1 또는 robo2 유전자를 발현할 수 있는 벡터의 형태로 제공될 수 있다.
상기 발현벡터는 상기 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 또는 vilse 유전자를 삽입하여 발현할 수 있는 당업계에 공지된 발현벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 pBK-CMV (Staratagene), pCR3.1 (Invitrogen) 등의 발현벡터를 사용할 수 있다.
또한, 상기 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 또는 vilse를 코딩하는 염기서열, 즉 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 DNA 분자를 발현을 조절하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결한 형태, 예를 들어 발현벡터의 형태로 치료대상 환자내에서 이것이 발현되도록 상기 폴리뉴클레오티드를 투여한다. 상기 벡터는 따라서 코딩 서열을 발현시킬 수 있는 프로모터 부위를 포함하는 적당한 전사 조절 신호를 포함하고, 상기 프로모터는 치료될 환자내에서 작동가능한 것일 것이다. 따라서, 인간 유전자 치료용으로, RNA 폴리머라제를 전사 개시 부위로 인도하는데 필요한 서열 뿐만 아니라, 적당하다면 인헨서를 포함하는 다른 작동 서열 또는 조절 서열들을 포함하는 용어인 프로모터는, 바람직하게는 인간 유전자로부터의 인간 프로모터 서열 또는 일반적으로 인간에게서 발현되는 유전자로부터의 인간 프로모터 서열, 예를 들어 인간 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터의 프로모터이다. 이러한 관점에서 적당한 공지된 진핵 프로모터 중에서 CMV 즉초기 프로모터, HSV 티미딘키나제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, 루 육종 바이러스(“RSV”)의 것들과 같은 레트로바이러스 LTR 프로모터, 및 생쥐 메탈로티오네인-1 프로모터와 같은 메탈로티오네인 프로모터가 적합하다.
상기 폴리뉴클레오티드 서열 및 전사 조절 서열은 상업적으로 입수 가능한 pBR322와 같은 플라스미드에 기초하여 복제가능한 플라스미드 벡터내에 클로닝되어 제공되거나 또는 잘 알려진 공개된 절차의 일상적인 응용에 의해 입수가능한 플라스미드로부터 구축될 수도 있다.
상기 벡터는 또한 상기 유전자 서열의 3’에 위치하는 전사 조절 서열, 및 인간 치료로 사용될 때 SV40 바이러스와 같은 바이러스로부터의 상응하는 서열과 같이 치료될 환자에게서 인식가능한 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 기타 전사 조절 서열이 이 기술분야에 잘 알려져 있고 이용가능하다.
상기 발현벡터는 또한 상기 벡터가 전파될 수 있도록 항생제 저항성과 같은 선택가능한 마커를 포함할 수 있다.
그 자체로 상기 단백질을 합성할 수 있는 발현 벡터들을 물리적 방법으로 직접적으로 상처 부위에 도입시킬 수 있다. 이들의 예로는 예를 들어 인산 완충 염수(PBS)와 같은 제약학적으로 허용되는 부형제 중의 용액내에 적당합 비히클 내의 “네이키드” 핵산 벡터를 국부적으로 적용하는 것, 또는 당업계에 알려진 방법에 따라 “유전자 총” 기술로도 알려진 입자 총알과 같은 물리적 방법으로 벡터를 투여하는 것을 포함한다.
상기 “유전자 총” 기술은 미국특허번호 제5371015호에 기술된 바와 같이, 추진 장치로부터의 고압력하에서 방출시키는 방법으로, 벡터로 코팅된 금 비드와 같은 불활성 입자를 상처 부위, 예를 들어 피부 세포의 표면을 통과할 수 있을 정도로 충분한 속력으로 가속하는 것이다.
또한, DNA를 직접 수용체에 투여하는 기타 물리적 방법으로는 초음파, 전기적 자극, 전기투과 및 마이크로시딩(microseeding) 등이 있다.
상기 유전자 서열은 또한 형질전환된 숙주 세포의 수단으로 상처 부위에 투여될 수 있다. 세포는 환자로부터 수거된 세포를 포함하며, 상기 핵산 서열을 이 세포내로 당업계에 공지인 유전자 도입 방법에 의해 도입하여 형질전환된 세포를 배양액중에 성장시켜 환자에게 이식한다.
상기 기술한 바와 같은 발현 구조체를 본 발명의 치료에 다양한 방법으로 사용할 수 있다. 따라서, 상기 발현 구조체들은 환자에서 치료가 필요한 부위에 직접 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 또는 vilse의 발현을 증가시키는 활성인자를 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명에서, “slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 또는 vilse의 발현을 증가시키는 활성인자”란 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 또는 vilse에 직접 또는 간접적으로 작용하여 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 또는 vilse의 생물학적 활성을 개선, 유도, 자극, 증가시키는 물질을 의미한다. 상기 물질은 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물, 펩타이드, 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질과 같은 생체 고분자 화합물 및 복수 화합물의 복합체 등을 포함한다. 상기 slit3의 발현을 증가시키는 활성인자는 slit3의 발현, 활성, 또는 기능의 감소에 의해 발병되는 질병의 예방, 개선 및 치료에 이용될 수 있다. 상기 물질이 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 또는 vilse를 활성화시키는 기작은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 물질은 전사, 번역 등의 유전자 발현을 증대시키거나, 비활성형을 활성형으로 전환시키는 기작으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 또는 vilse를 활성화시키는 물질은 펩타이드, 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질과 같은 생체 고분자 화합물이다. 핵산 및 단백질 서열이 이미 공지된 slit3에 대하여 당업자는 유도제 또는 활성제로 작용하는 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물 펩타이드, 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질과 같은 생체 고분자 화합물 및 복수 화합물의 복합체 등을 당 분야의 기술을 이용하여 제조하거나 스크리닝할 수 있다.
본 발명에서, 상기 slit3은 분화된 파골세포에서 분비되며, 조골세포에서 이동, 생존능, 증식, 분화 및 OPG의 생산을 증가시키는 기능을 하고, 골 형성을 증가시키고, 골 손실을 억제하며, 혈관형성(angiogenesis) 및 골 형성에 기여하는 VEGF의 발현을 증가시키는 우수한 효과를 가지고 있다. 또한, 본 발명에 따른 slit3의 기능과 활성의 저하는 골절 또는 골다공증의 원인이 될 수 있다. 이에 따라, 상기 유전자의 기능을 정상화, 활성화시키기 위한 유전자 또는 단백질의 처치는 골절 및 골다공증의 치료적 접근을 위한 중요한 관점이 될 수 있다.
따라서 상기 약학적 조성물은 상기 유전자를 포함하는 발현벡터 또는 그 발현벡터를 포함하는 숙주세포를 증식 및 활성화시켜 환자에 투여하여 골절 또는 골다공증을 치료 또는 예방할 수 있으며, 상기 유전자 또는 그 발현 단백질에 의해 파골세포의 분화를 억제시키고 조골세포의 분화, 증식, 이동을 촉진시켜 골절 또는 골다공증을 치료할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 그 제조에 있어서 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “투여”는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.001 mg/kg 내지 10000 mg/kg의 양으로 투여할 수 있다. 상기 조성물의 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 골절 또는 골다공증의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 단백질을 유효성분으로 함유하는 골절 또는 골다공증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 ‘골절 또는 골다공증 예방 또는 개선용 식품 조성물’은 질병의 예방 및 개선, 생체방어, 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해하여야 한다.
본 발명의 조성물은 골절 또는 골다공증의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 단백질 또는 이의 발현을 증가시키는 활성인자를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 성분을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 단백질 또는 이의 발현을 증가시키는 활성인자는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 단백질을 포함하는 골절 또는 골다공증 발생 예측용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 구현예에서, 골다공증 가능성이 있는 환자를 대상으로 골다공증 발병률과 slit3 단백질의 상관관계에 대하여, 환자의 혈액에서 얻은 slit3 단백질의 프로테옴을 분석하여 골다공증 발병률이 높은 그룹에서 혈중 slit3 단백질의 농도가 특징적으로 발현이 감소함을 밝혀내고 골절 또는 골다공증 진단 또는 치료에 사용될 수 있는 단백질성 마커로서 slit3을 선택하였다.
본 발명의 slit3 단백질은 골다공증의 발병률과 음의 상관관계를 가지고 있어, 골절 또는 골다공증 발생 위험을 예측하기 위한 바이오 마커로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어, ‘프로테옴(proteome)’이란 유전체로부터 만들어질 수 있는 모든 단백질의 총체를 의미하는데, 이는 한 세포 또는 조직에서 특이적인 생리 상태나 병리 상태에 따라 프로테옴의 양상이 항상 변화하게 되는 동적인 개념이다. 프로테오믹스(proteomics)는 이러한 프로테옴을 연구하는 방법과 기술을 포괄적으로 지칭하는 것으로, 단백질의 성질을 유전자의 발현, 번역 후 변형(post-translational modification), 다른 단백질과의 결합에 초점을 두어 연구함으로써 세포내 변형 과정과 네트워크 형성을 질병의 진행 과정과 연계시켜서 총체적으로 이해하고자 하는 연구 분야를 뜻한다. 이와 같이 프로테옴은 한 세포 또는 조직에서의 생리 상태나 병리 상태를 대변하므로, 질병의 진단에 직접 쓰일 수 있는 진단의 마커를 찾는 방법으로는 가장 적합한 것이다. 또한, 골절 또는 골다공증과 같은 경우 특정 유전자의 발현이 질병의 진행 정도에 관여하여 골절 또는 골다공증을 촉진하는 것으로 확인된다면, 그 단백질의 존재를 확인 및 동정하여 골절 또는 골다공증 진단 또는 치료제 개발의 표적 단백질로 삼을 수도 있다. 게노믹스(Genomics)의 뛰어난 민감도와 유전자의 쉬운 증폭 등의 장점으로 이를 이용한 진단 및 치료제 개발 역시 많이 진행되고 있으나, DNA나 mRNA 단계에서의 변화가 실제로 세포 내에서 활성을 갖는 단백질의 변화로 곧바로 연결되지는 않을 수 있다는 점에서 이론상의 문제점이 남아있으며, 나아가 현실적으로는 유전물질이 없는 체액의 경우 프로테오믹스가 유일한 연구방법이다. 현재 비-침습적 접근(non-invasive approach)으로 진단에 쓰이고 있는 것은 혈장, 혈청, 뇨, 뇌척수액, 양수, 분비액 등의 체액인데, 많은 연구자들이 진단 마커로 질병 특이적인 단백질을 발굴하기 위해 프로테오믹스 방법을 도입하고 있다.
본 명세서에서 “골절 또는 골다공증 발생 예측용 마커”는 골다공증 발병률이 높은 그룹과 낮은 그룹의 혈액 시료를 구분해내는 기준이 되는 단백질성 물질을 지칭한다. 본 발명에서 이 단백질성 마커는 골다공증 발병률이 높은 그룹과 낮은 그룹의 혈액에서의 존재량이 상대적으로 특징적으로 많거나 적다.
본 발명은 골다공증 발병률이 높은 그룹과 낮은 그룹의 혈액에서 프로테옴을 분석한 것이기 때문에, 이렇게 확인된 단백질성 마커는 골다공증 발병에 대하여 특이적이라고 할 수 있으며, 따라서 골절 또는 골다공증을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다. 나아가, 이렇게 확인된 단백질성 마커가 골다공증 발병률이 높은 그룹에서 변화 양상이 두드러지는 것이라는 점을 감안한다면, 이 단백질성 마커의 생리학적 기능은 골다공증의 발병에 직접적으로 관계된 것일 가능성이 있으며, 따라서 이 단백질성 마커는 골다공증 발병의 메커니즘을 연구하거나 골다공증 치료의 개발을 위한 표적 단백질로서도 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 골절 또는 골다공증 발생 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에서, 항체란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
상기한 바와 같이 골절 또는 골다공증 발생 위험 예측용 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
다클론 항체는 상기한 골절 또는 골다공증 발생 위험 예측용 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.
본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.
예를 들어, 본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. 상기 ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함하며, 상기 단백질 수준을 측정하는 제재를 포함한다. 상기 ELISA 키트는 “항원-항체 복합체”를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소(예:항체와 접합) 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소(예를 들면, Taq polymerase), dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR키트는, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량구조 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 마커가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이 형태일 수 있다.
또한, 본 발명은 골절 또는 골다공증 발생 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 혈액 시료로부터 항원-항체 반응을 통해 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 “단백질의 검출”은 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 확인할 수 있다.
상기 “mRNA 발현 수준 측정”은 골절 또는 골다공증 발생 위험을 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 상기 단백질을 암호화하는 mRNA의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는, 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어 중합효소반응(PCR), 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 “단백질 발현 수준 측정”은 골절 또는 골다공증 발생 위험을 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 slit3은 골다공증의 발병률과 음의 상관관계를 가지고 있어, 골절 또는 골다공증 발생 위험을 예측하기 위한 바이오 마커로 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 유전자가 도입된 세포를 배양하는 단계; (b) 피검물질을 상기 (a) 단계의 세포와 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 세포에서 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 또는 vilse 단백질의 발현 수준을, 피검물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 골절 또는 골다공증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되고, slit3 단백질의 LRR2 도메인 재조합 펩타이드, 및 이를 포함하는 골절 또는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 slit3 단백질의 LRR2 도메인은 slit 단백질에 있는 네 개의 leucine-rich repeat (LRR) 도메인 중 하나로서 이중 두 번째 도메인인 LRR2가 수용체와 결합한다. 본 발명자들은 LRR2 도메인으로서 slit3의 작은 재조합 펩타이드를 제조한 후 이를 이용하여 파골세포의 분화에 대한 효과를 확인한 결과, 상기 재조합 펩타이드는 파골세포의 분화를 현저하게 억제하는 것으로 확인되었다 (도 13). 따라서 상기 재조합 펩타이드는 골다공증의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 군에서 선택된 SNP 위치의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 골절 또는 골다공증 발생 예측용 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공한다:
서열번호 10의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs7655084;
서열번호 11의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs1549909;
서열번호 11의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs10036727;
서열번호 13의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs3821735;
서열번호 13의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs78817248; 및
서열번호 15의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs12418548.
상기 SNP에 대한 NCBI의 refSNP ID는 상기 SNP의 서열 및 그 위치를 나타내는 것이다. 당업자라면 상기 번호를 이용하여 SNP의 위치 및 서열을 용이하게 확인할 수 있다. 분석에 사용된 reference 서열은 Genome Reference Consortium에서 2009년 2월에 수집되어 공개된 서열이며, NCBI assembly database의 GRCh37(hg19)(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)에서 자세한 내용을 확인할 수 있다. NCBI에 등록되어 있는 SNP의 refSNP ID에 해당하는 구체적인 서열은 계속되는 유전자에 대한 연구 결과에 따라 약간씩 변경될 수 있으며, 이러한 변경된 서열 또한 본 발명의 범위 내에 포함됨은 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 RefSNP ID: rs7655084의 경우는 SLIT2 유전자의 4번 염색체 20255306 위치의 염기에서 골밀도가 낮게 나타나는 유전자형은 T에서 G로 치환되었다. RefSNP ID: rs1549909의 경우에는 SLIT3 유전자의 5번 염색체 168180670 위치의 염기에서 골밀도가 낮게 나타나는 유전자형은 C에서 T로 치환되었다. RefSNP ID: rs10036727의 경우에는 SLIT3 유전자의 5번 염색체 168180081 위치의 염기에서 골밀도가 낮게 나타나는 유전자형은 C에서 T로 치환되었다. RefSNP ID: rs3821735의 경우에는 ROBO2 유전자의 3번 염색체 77684222 위치의 염기에서 골밀도가 낮게 나타나는 유전자형은 C에서 A로 치환되었다. RefSNP ID: rs78817248의 경우에는 ROBO2 유전자의 3번 염색체 77626788 위치의 염기에서 골밀도가 낮게 나타나는 유전자형은 C에서 G로 치환되었다. RefSNP ID: rs12418548의 경우에는 ROBO4 유전자의 11번 염색체 124757560 위치위치의 염기에서 골밀도가 낮게 나타나는 유전자형은 A에서 G로 치환되었다.
하기 실시예로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 골밀도(BMD)가 평균 이상인 그룹과 심하게 낮은 BMD 그룹을 대상으로 상기 유전자들에 존재하는 유전자 다형성을 연구한 결과, 상기 유전자들의 SNP 위치의 대립유전자는 심하게 낮은 BMD 상태의 위험성과 유의하게 관련이 있었다 (표 6 참조). 구체적으로, 낮은 BMD 상태의 위험을 나타내는 SNP 위치에서 유전자형은 refSNP ID: rs7655084의 경우는 GT, GG 유전자형이고; refSNP ID: rs1549909의 경우는 TT 유전자형이고; refSNP ID: rs10036727의 경우는 TT 유전자형이고; refSNP ID: rs3821735의 경우는 CC, CT 유전자형이고; refSNP ID: rs78817248의 경우는 CG, GG 유전자형이고; refSNP ID: rs12418548의 경우는 GG, GA 유전자형으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 상기 SNP들은 심하게 낮은 골밀도에 따른 골절 또는 골다공증 발생 예측을 위해 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보적 폴리뉴클레오티드는 10개 이상의 연속된 염기로 구성된 DNA 단편일 수 있으며, DNA 단편의 크기는 전체 유전자의 full length가 아닌 한 SNP 부위의 염기를 포함하는 어떤 크기의 단편이라도 무방하나, 바람직하게는 10 내지 수백 염기인 것을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 100-500개 염기가 적당하다. 100-500개 염기의 경우는 상기 SNP를 탐지하기 위한 프로브 내지는 프라이머로 이용할 수 있으며, 그 이상의 염기의 경우는 PCR-RFLP 등에 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 골절 또는 골다공증 발생 예측용 마커 조성물, 또는 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에서, 상기 SNP를 포함하는 키트는 당업계에 공지된 SNP 키트의 제조방법을 통해 구현될 수 있다. 예들 들어, 상기 키트가 마이크로어레이로 구현되는 경우, 예를 들어, SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보적 폴리뉴클레오티드를 기판 상에 고정시키고 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과 검출을 통해 SNP를 용이하게 검출할 수 있다.
상기 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보적 폴리뉴클레오티드를 기판 상에 고정시키는 것은 당업계에 알려진 방법으로 용이하게 수행될 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산 혼성화 및 혼성화 결과의 검출 방법 역시 당업계에 알려진 방법대로 수행될 수 있다. 예를 들면, 핵산 시료를 검출 가능한 신호를 발생시키는 표지 물질(예를 들어, 형광물질)로 표지한 다음 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
재료 및 시약
NFATc1에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다. slit3에 대한 항체 및 재조합 slit1/2/3는 각각 Abcam(Cambridge, MA, USA) 및 R&D System Inc. (Minneapolis, MN, USA)로부터 구입하였다. Robo1 및 Robo2 fc 키메라는 R&D system Inc.부터 구입하였다.
실시방법 1. 세포 배양, 기관 배양 및 조건 배지의 수집
일차 마우스 골수세포(BMCs)는 5-6주령 C57BL/6 마우스의 대퇴골(femur) 및 정강이뼈(tibia)를 플러싱(flushing)함으로써 얻은 후, 5% CO2로 가습된 조건에서 10% 우태아혈청(FBS; Gibco, Grand Island, NY, USA), 100 U/mL 페니실린, 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 최소필수배지(α-MEM; Wel Gene, Daegu, Korea)에서 37℃로 배양하였다. 배양 24시간 후, 비부착세포(nonadherent cells)를 수집하여 48-웰 플레이트에서 1.0×105 세포/웰의 밀도로 배양하였다. 3일 이상 30 ng/mL M-CSF (R&D System Inc.)로 배양한 BMCs를 골수대식세포(bone marrow macrophages, BMMs)로 사용하였다. 이 단계의 세포를 파골세포 전구체(osteoclast precursors)로 간주하였다. BMCs는 매 2-3일 마다 교환된 배양배지를 이용하여, 30 ng/mL M-CSF 및 50 ng/mL 가용성(soluble) RANKL (R&D System Inc.)로 배양함으로써 파골세포로 분화를 유도하였다. 다른 방법으로, 쥐(murine) 대식세포 Raw 264.7 세포(ATCC, Manassas, VA, USA) 또한 동일한 용량의 RANKL를 사용하여, 파골세포-유사 세포를 제조하는데 사용되었다.
인간 파골세포를 이용한 공동면역침전(co-immunoprecipitation) 실험을 위해, 말초혈액을 보통의 건강한 지원자로부터 입수하였다. 혈액을 동량의 α-MEM으로 희석한 다음 말초혈액단핵구(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)를 LymphoprepTM (Axis-Shield, Oslo, Norway) 밀도구배 상의 원심분리에 의해 분리하였다. 상기 세포를 autoMacs buffer로 현탁하고 CD14-양성 단핵구를 세포분리기(autoMacs magnetic cell separator; Miltenyi Biotech, Auburn, CA, USA)를 이용하여 선별하였다. PBMCs(3.0-4.0×106/well)를 M-CSF (25 ng/mL)가 있는 상태에서 3일간 6웰 플레이트에서 배양한 다음, M-CSF (25 ng/mL) 및 RANKL (30 ng/ml)로 추가 배양하였다. 세포들이 파골세포로 완전하게 분화하는 데에는 7-9일이 소요된다.
신생 C57BL/6 마우스로부터 얻은 두 개관(calvaria)의 순차적 콜라게나아제 소화(sequential collagenase digestion)로 일차 쥐 파골세포들을 분리하고 10% FBS를 포함하는 α-MEM에서 유지하였다. 쥐 MC3T3-E1 전조골세포주(preosteoblast cell line, ATCC)를 5% CO2로 가습된 조건에서 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 α-MEM에서 37℃로 배양하였다. 상기 배지는 주 2회 교환하였다. 80% 컨플루언스까지 성장시키고, 상기 세포들을 trypsin-EDTA(Gibco)를 이용하여 계대배양하였다. 인간 조골세포를 이용한 공동면역침전 실험을 위해, 일차 인간 골수간세포(bone marrow stromal cells, BMSCs)를 늑골(ribs)로부터 분리하였다. 늑골은 대사성골질환이 없는 환자에서 개흉술(thoracotomy) 시 버려진다. 상기 늑골은 무균상태로 절제하고 연조직을 깨끗하게 한 후 세로방향으로(longitudinally) 열였다. 노출된 골수를 무혈청 α-MEM으로 몇 번의 세척을 이용하여 플러시 아웃하고 1,400 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 세포 펠렛을 배양배지에서 재현탁하고, 인간 BMSC 분획을 LymphoprepTM (Axis-Shield, Oslo, Norway)로 얻었다. 상기 세포를 75-cm2 플라스틱 배양 플라스크에 3×107 세포/75-cm2 밀도로 씨딩하고 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 α-MEM에서 배양하였다. 배지는 2주 후부터 주 2회 교환하였다. 상기 세포가 80-90% 컨플루언스로 성장하면, 0.01% 트립신 및 0.05% EDTA를 이용하여 계대배양하였다. 2번째 계대배양 세포를 실험에 사용하였다.
6주령 C57BL/6 마우스에서 얻은 대퇴골의 기관 배양을 수행하였다. 상기 골수를 강하게 플러싱하고, 세포들을 H2O로 24시간 진탕 배양하여 더 제거하였다. 그 후, 상기 골은 α-MEM로 넓게 세척하고 BMMs와 공동-배양하였다.
파골세포생성(osteoclastogenesis) 또는 골 흡수(bone resorption) 동안 CM은 지시된 날짜에 24시간 동안 수집하였다. 확보한 CM은 0.45-μm 멤브레인 필터로 여과하여 사용 시까지 -70℃에서 보관하였다.
실헙방법 2. CM에서 파골세포 형성 및 흡수 활성의 측정
파골세포생성의 다양한 단계에서 수집된 CM에서 파골세포 형성의 정도는 0.2 U/L의 낮은 검출 한계치를 갖는 상업적으로 입수가능한 ELISA 키트(Immunodiagnostic Systems, Boldon, UK)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 TRAP-5b(tartrate-resistant acid phosphatase-5b)를 측정함으로써 평가하였다. CM에서의 흡수 활성은 2.0 ng/mL의 낮은 검출 한계치를 갖는 ELISA kit (RatLaps; Immunodiagnostic Systems)를 이용하여 CTX(C-telopeptide)를 측정함으로써 평가하였다.
실험방법 3. 주화성 및 상처치유 분석
주화성(chemotaxis) 분석은 8-μm 포어를 포함하는 폴리카보네이트 멤브레인이 있는 트랜스웰을 이용하여 Boyden chamber system에서 수행하였다 (Costar, Corning, NY, USA). 세포를 0.1% FBS가 있는 α-MEM 100 μL 당 1.0 × 105 세포의 밀도로 6시간 동안 이너챔버에 씨딩한 후 추가 24시간 동안 아우터챔버에서 CM 또는 slit3로 처리하였다. 상부 멤브레인 상의 세포들은 면봉으로 닦아내어 완전히 제거하였다. 하부 멤브레인에 침입된 세포들을 고정하고 헤마톡실린으로 염색하였다. 마지막으로, 상기 세포들을 컴퓨터 비디오-이미징 시스템(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 카운팅하였다.
상처-치유 분석을 위해, 컨플루언트 세포들을 플라스틱 팁을 이용하여 상처나게 하였다. 세포 이동(cell migration)이 0.1% FBS가 첨가된 α-MEM에서 일어난 후, 상처를 표시하고 O시간 및 24시간 시점에서 도립현미경을 이용하여 측정하였다. 정량은 Quantity One (BioRad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 각 상처 봉합(wound closure) 영역을 측정함으로써 수행하였다. 데이터는 상처 봉합의 퍼센트로 표시하였다.
실험방법 4. 세포 생존력 및 분화의 측정
세포 생존력은 제조사의 설명서에 따라 셀카운팅 키트-8(CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japan)을 이용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 10 μL의 WST-8 dye (2-[2-methoxy-4-nitrophenyl]-3-[4-nitrophenyl]-5-[2,4-disulfophenyl]-2H-tetrazolium, monosodium salt)를 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고 2시간 동안 반응시킨 후, 450 nm에서 흡광도를 마이크로플레이트리더(SPECTRAmax 340PC; Molecular Devices, Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 650 nm의 참조 파장으로 측정하였다.
세포 분화는 Brd-U(5-bromo-2’-deoxyuridine)를 이용하여 측정하였다. 조골세포를 96웰 플레이트에 씨딩하고 24시간 반응시킨 후, α-MEM에서 24시간 동안 계대배양하였다. 이어서, 상기 세포를 24시간 동안 Brd-U로 반응시킨 후, 세포 분화를 Brd-U 라벨링 및 검출 키트(Roche, Mannheim, Germany)로 측정하였다.
실험방법 5. 프로테오믹스 프로토콜
샘플 준비
Raw 264.7 세포는 10% FBS를 포함하는 α-MEM을 이용하여 100 mm 디쉬 당 4.0×105 세포의 밀도로 씨딩한 후, 상기 세포를 하루에 가용성 50 ng/mL RANKL이 있거나 없는 상태로 처리하여 파골세포로 분화시켰다. 다음 날, 상기 세포를 무혈청 및 페놀레드가 없는 배지로 3회 세척한 후, 배지를 RANKL이 있거나 없는, 6 mL 무혈청 및 페놀레드가 없는 α-MEM으로 교체하고, 하루동안 배양하였다. CM은 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하고 -70℃에서 보관하였다. CM에 있는 단백질은 동결건조하여 침전시켰다.
C18 가역상 HPLC 및 트립신 소화에 의한 분획
단백질의 복합체는 C18-HPLC 컬럼(214TP5125, 2.1 × 150 mm; Vydac Grace, Hesperia, CA, USA), 오토-샘플러, 및 UV 검출기(215 nm wavelength; Peptide Library Support Facility, Pohang, Korea)로 구성되어 있는 모세관 HPLC 시스템을 이용하여 0.3 mL/min 유속에서 120분간 0-60% 구배의 ACN(acetonitrile) 및 0.1% TFA(trifluoroacetic acid)를 이용하여 96 분획으로 분리하였다.
트립신 소화(trypsin digestion)를 위해, 각 단백질 분획을 50 mM ABC(ammonium bicarbonate)에 용해시킨 후, 10 mM DTT(dithiothreitol)를 첨가하여 샘플을 환원시켰으며, 100 mM 아이오도아세트아마이드(iodoacetamide)를 시스테인 알킬레이션을 위해 첨가하였다. 마지막으로, 500 ng 트립신을 첨가하고 37℃에서 6시간 반응시켰다.
LC-MS/MS 분석
각각의 소화된 샘플들은 나노플로우 HPLC 시스템이 갖춰진 LTQ(linear-trap quadrupole) 질량분석기를 이용하여 분석하였다 (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA). 펩타이드들은 C18 (3 μm)이 팩킹된 가역상 분석컬럼(10 cm × 75 μm i.d.)을 이용하여 분리하였다. 구배는 250 nL/minute 유속으로 5% ACN에서 5분간 시작하여, 이후 60분간 40% ACN으로, 최종 10분간 80% ACN으로 증가시켰다. 용리액(eluent)은 1.8 kV의 전기분사 전압으로 나노-이온 소스를 이용하여 LTQ 질량분석기에 주입하였다. 상기 분석법은 400-1500 m/z 범위의 풀 질량분석(MS) 스캔으로 구성되고, 5개의 가장-강렬한 이온들에 대한 데이터-의존성 질량분석(MS2)은 풀 MS 스캔에서 분석되었다.
MASCOT 데이터베이스 검색
TQ 질량분석기로부터 얻은 데이터는 국제단백질지수(IPI) 마우스 FASTA 데이터베이스(version 3.54) 및 MASCOT 검색엔진을 이용하여 분석하였다. 고정된 변형으로서 트립신 소화에 따른 불완전 절단, 메티오닌의 산화에 대한 가변적인 변형, 및 시스테인의 카브아미도메틸레이션(carbamidomethylation)을 검색 시 고려하였다. 본 발명자들은 신뢰범위 95% 확률로 각각의 이온들을 평가하였다 (P < 0.05).
기능적 주석 및 분비성 단백질 선별
기능적 주석(functional annotation)을 위해, 동정된 단백질들은 웹기반 프로그램(http://david.abcc.ncifcrf.gov)인, DAVID(atabase for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) 데이터베이스를 이용하여 그들의 생물학적 과정 및 분자 기능에 따라 분류하였다. 또한, 동정된 단백질들은 HMM 스코어링(SignalP 3.0 hidden Markov matrix scoring)을 이용하여 그들의 분비 특성을 밝혀내기 위해 평가하였다.
실험방법 6. 웨스턴 블롯
세포 용해물은 용해버퍼(20 mM Tris [pH 7.5], 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM -glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 및 a protease-inhibitor mixture)로 4℃에서 20분간 제조하였고, 상기 용해물의 단백질 농도는 BCA 단백질 분석키트(Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA)를 이용하여 측정하였다. 10-20 μg 단백질을 포함하는 샘플은 10% 겔 SDS-PAGE로 분리한 다음, 니트로셀룰로오스 멤브레인(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)에 옮겼다. TBST(500 mM Tris-HCL [pH 7.4], 1.5 M NaCl, 0.1% Tween-20)에 들어있는 5% 스킴 밀크로 1시간 동안 실온에서 블로킹한 후, 상기 멤브레인을 1차 항체로 밤새 반응시킨 다음, 2차 항체로 반응시켰다. 면역반응 단백질들은 증강 화학발광 키트(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 이용하여 검출하였다.
실험방법 7. 공동-면역침전법
GFP-tagged Robo1 및 Myc-tagged Vilse의 인간 cDNA는 Origene (Rockville, MD, USA)사로부터 구입하였다. Robo1-GFP 및 Vilse-Myc의 cDNA를 lipofectamine 2000(Gibco, Grand Island, NY, USA)으로 인간 BMSC 또는 인간 PBMC에 6시간 동안 트랜스펙션 시킨 다음, 세포를 Slit3으로 처리하였다. 상기 세포는 프로테아제 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 포스파타아제 저해제(phosphatase inhibitors; 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF)를 포함하는 TNE 버퍼(25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA)로 용해시켰다. 용해물은 4℃에서 18시간 동안 GFP 항체(Anaspec, Fremont, CA, USA) 및 단백질-G-세파로스 비드(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)로 면역침전시켰다. 면역침전물 및 세포 용해물은 항-GFP 또는 항-Myc 항체(Novus biological, Littleton, Co, USA)로 면역블롯 분석에 제공되었다.
실험방법 8. RT-PCR 및 정량적인 실시간 PCR
총 RNA는 제조사의 설명서에 따라 TRIzol 시약(Invitrogen, Rockville, MD, USA)을 이용하여 분리하였고, cDNA는 Superscript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen)를 이용하여 1 μg의 총 RNA로부터 합성하였다. 모든 PCR 증폭은 Biometra thermocycler (GmbH, Goettingen, Germany)를 이용하여 수행하였다. 각 타겟 유전자의 mRNA 발현의 수준은 Quantity One program을 이용하여 하우스키핑 유전자 GAPDH(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)로 정규화하였다. 특이적 프라이머쌍은 다음과 같다:
5’-AGG GAA GCC TAC GCA GAT G-3’ (sense) 및 5’- TGG ACA GTG GGC GAT TTT AT-3’ (antisense) for Robo1; 5’-AGC CCC ACA CAA ACA AGG-3’ (sense) 및 5’-AAG CTG GGC TTG CTG TAG G-3’ (antisense) for Robo2; 5’- GCA GCG CTC AAC CCT AGT-3’ (sense) 및 5’-CTT CTG GCC CAA CTC TTG AC-3’ (antisense) for Robo3; 5’-CGC ATG TCT CTG ACC CCT AC-3’ (sense) 및 5’-GAG CTG TTA GCT TGG TGC AA-3’ (antisense) for Robo4; 그리고 5'-ACT TTG TCA AGC TCA TTT CC-3' (sense) 및 5'-TGC AGC GAA CTT TAT TGA TG-3' (antisense) for GAPDH. 증폭 프로토콜은 95℃에서 30초간 변성(denaturation), 60℃에서 30초간 어닐링(annealing) 및 72℃에서 30초간 신장(extension)의 30 싸이클로 구성하였다. PCR 산물은 1% 아가로즈 겔상에서 분리하여 EtBr로 염색하고 UV 하에서 시각화하였다.
정량적인 PCR은 Light Cycler 480 (Roche)를 이용하여 수행하였고, OPG(osteoprotegerin), RANKL, ALP(alkaline phosphatase), OCN(osteocalcin), TRAP, CatK(cathepsin K), MMP-9(matrix metallopeptidase-9) 및 CTR(calcitonin receptor)의 유전자 발현 수준은 Light Cycler 480 SYBR Green I Master Mix (Roche)를 이용하여 측정하였다. PCR 증폭은 2회(in duplicate) 수행하였으며, 물은 음성대조군으로서 각 결과물(each run)에서 cDNA를 대체하는데 사용하였다. 특이적 프라이머 서열은 다음과 같다: 5’-CAC GGC CAT CCT ATA TGG TAA-3’ (sense) 및 5’-GAG ACA TTT TCC CGT TCA CC-3’ for ALP; 5’-GCT ACC TTG GAG CCT CAG TC-3’ (sense) 및 5’-CTC GTC ACA AGC AGG GTT AAG-3’ (antisense) for OCN; 5’-GCA TTA TGA CCC AGA AAC TGG T-3’ (sense) 및 5’-TAG GTG CCA GGA GCA CAT TT-3’ (antisense) for OPG; 5’-AGC GCA GAT GGA TCC TAA CA -3’ (sense) 및 5’-GAG TCC TGC AAA TCT GCG TT-3’ (antisense) for RANKL; 5’-CGA CCA TTG TTA GCC ACA TAC G-3’ (sense) 및 5’-TCG TCC TGA AGA TAC TGC AGG TT-3’ (antisense) for TRAP; 5’-ATA TGT GGG CCA GGA TGA AAG TT-3’ (sense) 및 5’-TCG TTC CCC ACA GGA ATC TCT-3’ (antisense) for CatK; 5’-TGT CTG GAG ATT CGA CTT GAA GTC-3’ (sense) 및 5’-TGA GTT CCA GGG CAC ACC A-3’ (antisense) for MMP-9; 5’-AGT TGC CCT CTT ATG AAG GAG AAG-3’ (sense) 및 5’-GGA GTG TCG TCC CAG CAC AT-3’ (antisense) for CTR; 그리고 5’-CTC CAC TCA CGG CAA ATT CA-3’ (sense) 및 5’-GCC TCA CCC CAT TTG ATG TT-3’ (antisense) for GAPDH. 상기 반응 프로토콜은 FastStart DNA 중합효소를 활성화하기 위해 95℃에서 10분간 전반응, 95℃에서 10초간, 55℃에서 15초간 및 72℃에서 20초간 세트(set)인 45 사이클의 증폭을 포함하였다. 결과물은 GAPDH로 정규화하였다.
실험방법 9. siRNA의 트랜스펙션
NFATc1 (Mm_NFATc1_6; Qiagen), Robo1 (MSS208673; Invitrogen), Robo2 (MSS241005; Invitrogen)에 대한 siRNA 및 nonsense siRNA(Stealth RNAiTM siRNA negative control; Invitrogen)를 제조사의 설명서에 따라 lipofectamine 시약(Invitrogen)으로 트랜스펙션하였다. 간단히 설명하면, 10% FBS를 포함하는 α-MEM에서 세포를 배양한 후, OPTI-MEM (Invitrogen)에 있는 siRNA-시약 혼합물을 첨가한 다음, 세포를 추가 6시간 동안 더 배양하였다. 이후 상기 배지는 신선한 완전 α-MEM으로 교체한 다음, 세포를 2일간 더 배양하였다.
실험방법 10. 라멜리포디아(lamellipodia)의 확인
MC3T3-E1 세포를 24웰 플레이트에 24시간 씨딩한 다음, slit3가 있거나 없는 상태에서 24시간 starve시켰다. 상기 세포를 고정하고 PBS(phosphate-buffered serum)로 두 번 세척하였다. 상기 세포를 100 ng/mL 팔로이딘(phalloidin; Molecular Probes, Leiden, Netherlands)으로 37℃에서 30분간 배양하였다. 면역형광 이미지는 형광현미경(Olympus)을 이용하여 캡쳐하였다.
실험방법 11. 석회화결절 형성
일차 마우스 BMCs를 12웰 플레이스에 6×106 세포/웰의 밀도로 씨딩하고 10% FBS (v/v), 100 U/mL 페니실린 및 100 mg/L 스트렙토마이신이 보충된 α-MEM에서 37℃에서 5% CO2 및 95% 공기로 가습된 인큐베이터에서 7일간 배양하였다. 7일 후 비부착 세포들은 제거하였고, 이후 BMSCs(bone marrow stromal cells)를 나타내는, 부착세포들은 BMSCs의 조골세포 분화를 유도하기 위한 분화배지(α-MEM containing 10% FBS [v/v] supplemented with 8mM β-glycerophosphate and 50 μg/mL ascorbic acid)에서 14일까지 추가적인 기간동안 성장시켰다. 상기 배지는 매 2 또는 3일 마다 교체하였다. 14일째, 배양물을 70% 에탄올로 1시간 동안 고정한 후, 40 mM Alizarin red S (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 염색하였다.
실험방법 12. TRAP 염색 및 흡수 분석
일차 마우스 BMCs는 30 ng/mL M-CSF 및 50 ng/mL 가용성 RANKL로 4일간 배양하였다. 부착 세포들은 고정하고 제조사의 설명서에 따라 leukocyte acid phosphatase kit (Sigma-Aldrich)를 이용하여 파골세포의 효소적 마커인, TRAP으로 염색하였다. 3개 이상의 핵(nuclei)을 포함하는 TRAP-양성 다핵 세포를 파골세포로 간주하였고, 광학현미경(Olympus) 하에서 카운팅하였다.
흡수 영역의 측정을 위해, BMCs (5×104 cells/well)를 30 ng/mL M-CSF 및 50 ng/mL 가용성 RANKL와 함께 상아질 디스크(dentine discs) 상에 위치시켰다. 10일 후, 상기 슬라이드를 5% 차아염소산나트륨 수용액으로 세척하여 세포를 제거한 후, 흡수 피트(pits)를 헤마톡실린으로 염색하였다. BMCs 수 당 흡수된 영역의 측정을 위해, TRAP 염색을 상아질 디스크 상에서 헤마톡실린의 염색 이전에 수행하였다. 흡수 피트의 영역은 Quantity One Software (VersaDoc Model 3000 Imaging system, Bio-Rad, Berkeley, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
실험방법 13. 생체 내 두 개관 골 형성 모델
4주령 C57BL/6 마우스에 3주 동안 주 5일, 하루 한번, PBS 또는 300 μg/kg의 slit3을 두개관(calvaria)에 피하로 주사하였다. 주사는 λ자봉합(lambdoidal suture) 및 관상봉합(coronal suture) 사이에 있는 구개관 시상면(calvarial sagittal)의 왼쪽에 시행하였고, 오른쪽은 대조군으로 사용되었다. 상기 동물들을 희생시키고 두개관을 4% PFA(paraformaldehyde)에서 고정시켰다. 각 두개관은 14% EDTA로 석회질을 제거하고, 동결절편(frozen section)용 OCT(optical cutting temperature) 화합물에 포매하였다. 샘플들을 7 μm 절편으로 절삭한 후, 헤모톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 두개관 골의 폭는 광학현미경으로 측정하였다.
실험방법 14. 생채 내 두개관 골소실 모델
6주령 C57BL/6 마우스를 4개의 그룹으로 나누었다: 대조군(0.1% BSA + PBS); slit3-처리 군(0.1% BSA + 300 μg/kg slit3); IL-1-유도된 두개관 골소실 군(2 μg IL-1 + PBS); 및 IL-1 골소실 및 slit3-처리 군(2 μg IL-1 + 300 μg/kg slit3). 상기 용액으로 처리된 콜라겐 스펀지(Cellmatrix Type I-A; Nitta Gelatin Inc., Osaka, Japan)를 시상봉합(sagittal suture) 중앙에 있는 두개관에 이식하였다. 상기 마우스를 이식 7일 후 희생시키고, 두개관을 4% PFA에 고정시켰다. 각 두개관을 14% EDTA로 석회질을 제거하고, 동결절편용 OCT 화합물에 포매하였다. 샘플들을 7 μm 절편으로 절삭한 후, 헤모톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 두개관 골의 폭는 광학현미경으로 측정하였다.
실험방법 15. 골수강(bone marrow cavity) 이식
본 발명자들은 11주령 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 정강이뼈(tibias)를 23게이지 바늘로 조심스럽게 구멍을 뚫었다. PBS (left tibia) 또는 300 μg/kg의 slit3 (right tibia)으로 GFP-표지된 MC3T3-E1 세포를 31게이지 바늘을 이용하여 골수강에 주입하였다. 상기 마우스는 2 또는 3일 후 희생시켰으며 정강이뼈는 4% PFA에 고정시켰다. 각각의 정강이뼈를 14% EDTA로 석회질을 제거하고, 동결절편용 OCT 화합물에 포매하였다. GFP 양성 세포 수를 카운팅하기 위해, 샘플들을 형광현미경(Olympus) 하에 위치된 슬라이드 상에서 관찰하였다.
실험방법 16. slit3 넉아웃 마우스 배아에서 Von Kossa 염색 및 VEGF 면역조직화학 염색
slit3 돌연변이의 배아는 Mutant Mouse Regional Resource Centers (stock number 030759-MU; Columbia, MO, USA)로부터 구입한, 수컷 및 암컷 slit3 +/- C57BL/6J 마우스를 교배하여 제조하였다. 배아 조직은 PBS에서 수집하여, 실온에서 밤새 10% 포르말린에 고정시켰다. 조직화학 분석을 위해, 야생형 및 slit3 돌연변이의 17.5일(E17.5)된 배아를 4% PFA로 고정시키고 OCT 화합물에 포매시켰다. 7 μm 절편을 Von Kossa 반응 및 뉴클리어패스트레드(nuclear fast red)로 염색하였다. For IHC staining, peroxidase chromogens (Invitrogen) were used. 면역조직화학(IHC) 염색을 위해, 페록시다아제 크로모젠(peroxidase chromogens, Invitrogen)을 사용하였다. 상기 절편을 10분간 메탄올에 녹인 3% H2O2에 퀀치(quench)한 후, PBS에서 체척하여, PBS로 1:200 또는 1:500으로 희석된 항-VEGF 항체(Abcam)로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 항체 결합에 대한 신호는 DAB(diaminobenzidine) 기질로 시각화하였다. 모든 샘플들은 광학현미경으로 평가하였다.
실험방법 17. 골밀도 측정
전신 골밀도(BMD)는 밀도측정기(Lunar PIXImus densitometer software version 1.4; GE-Lunar Co., Madison, WI, USA)를 이용하여 이중에너지 방사선흡수법(dual-energy X-ray absorptiometry)으로 측정하였다. 변동계수(coefficient of variation, CV)로 표시되는, 장비의 정밀도는 1.27%였다. 상기 마우스를 40 mg/kg Zoletil 50 (Virbac, France) 및 5.6 mg/kg Rompun (Bayer Korea, Seoul, Korea)의 혼합물로 근육내 주사하여 마취시키고 사지를 뻗은 복와위(prone position) 상태로 스캐너에 위치시켰다.
실험방법 18. 시퀀싱
본 발명자들은 염색체 4에 있는 slit2 유전자(NM_004787), 염색체 5에 있는 slit3 유전자(NM_003062), 염색체 3에 있는 robo1 유전자(NM_001145845), 염색체 3에 있는 robo2 유전자(NM_NM_002942), 및 염색체 11에 있는 robo4 유전자(NM_019055)에 대해 조사하였다. 이들 유전자에 대한 타겟 영역은 전체 코딩 엑손, 엑손-인트론 바운더리, 및 조절영역이었다. 베이트 라이브러리(bait libraries)를 디자인하여 Agilent eArray website functionality (https://earray.chem.agilent.com/earray/)를 이용하여 이들 타겟 게노믹 영역에 걸쳐 커버리지를 분석하였다. BLAST (~12 mismatches across the bait)를 이용하여 90% 이상으로 하나 이상의 위치가 베이트 맵핑되는 경우, 디자인에서 제외하였다. 최종적으로, 6,507 bp 타겟 영역이 Agilent SureSelect Sequence Enrichment Kit로 확정되었다. 이어, Illumina HiSeq2000 analyzer (Illumina, San Diego, CA)로 시퀀싱을 982 폐경후의 여성(super-normal BMD group = 501, and severe-low BMD group = 481)에 수행하였다. Covaris System을 이용하여 3 의 게노믹 DNA를 무작위로 사용하여 150 bp의 인서트(inserts)를 제조하였다. 이 단편화된 DNA를 T4 DNA 중합효소 및 Klenow 중합효소를 이용하여 말단수선(end-repair)하여, 수선된 말단 수용체 올리고뉴클레오티드(Illumina paired-end adaptor oligonucleotides)를 스티키 말단(sticky ends)에 붙였다. 아가로스 전기영동으로 라이게이션 혼합물을 분석하여 200-250 bp 크기의 단편으로 정제하였다. 정제된 DNA 리이브러리를 SureSelect Target Enrichment probes set (Agilent, Santa Clara, CA)로 혼성화시켜 제조사의 설명서에 따라 태그된 영역에 캡쳐하였다. 캡쳐된 라이브러리를 이용하여, 제조사의 프로토콜에 따라, HiSeq2000 paired-end flowcell을 제조하였다. 다음으로, PCR 콜로니의 클러스터들을 HiSeq2000 platform에서 시퀀싱하였다.
실험결과 1. 초기 분화 단계에서 파골세포는 조골세포 전구체를 유인하는 잠재적인 커플링 인자를 분비한다.
상기 커플링 현상을 조사하기 위한 시험관내 시스템을 확립하기 위해, 파골세포생성 및 골흡수에 대한 가변 배양조건을 준비하였다. 본 발명자들은 BMMs를 30 ng/mL M-CSF가 있는 상태에서 100 ng/mL RANKL로 2일 및 6일 동안 처리하여 초기- 및 후기-파골세포 분화를 각각 유도하였다. 흡수 단계를 유도하기 위해, BMMs를 30 ng/mL M-CSF가 있는 상태에서 100 ng/mL RANKL 및 마우스 대퇴골(femur)과 함께 10일간 배양하였다. 파골세포 분화 및 골흡수는 각 배지에서 TRAP-5b 활성 및 CTX 농도를 각각 측정함으로써 평가하였다.
도 1a에서 보는 바와 같이, RANKL-처리된 세포로부터 얻은 CM은 매 단계의 비처리군과 비교하여 TRAP-5b 활성이 현저하게 증가하였다. 또한 도 1b에서 보는 바와 같이, CTX 농도는 대퇴골과 RANKL 모두 있는 상태에서만 증가하였다.
각 단계에서 파골세포 배양물로부터 수집된 CM을 일차 마우스 두개관의 조골세포 및 MC3T3-E1 세포에 처리하였다. RANKL-처리된 BMMs의 임의의 배지는 비처리군의 상층액과 비교하여 일차 조골세포의 생존력 또는 분화 (각각 도 2a와 2c), 또는 MC3T3-E1 세포의 생존력 또는 분화 (각각 도 2b와 2d)에 유의한 영향을 미치지 못했다. 그러나 상처-치유 분석은 RANKL-처리된 BMMs로부터 얻은 CM이 비처리군과 비교하여 조골세포(도 2e) 및 MC3T3-E1 세포 (도 2f) 모두의 운동성(motility)을 현저하게 증가시킴을 보여준다. RANKL-처리된 Raw 264.7 세포로부터 얻은 CM 역시 MC3T3-E1 세포의 운동성을 증가시켰다 (도 2g).특히, 후기 분화 단계에서 RANKL-처리된 세포로부터 수집된 CM이 더 작은 정도로 전조골세포의 운동성을 자극시키지만, 초기 분화 단계에서 RANKL-처리된 세포로부터 얻은 CM은 전조골세포의 운동성을 가장 두드러지게 증가시켰다. 반면에, 10일간 RANKL로 배양한 파골세포로부터 얻은 CM은 쥐 대퇴골이 있거나 없는 것과 상관없이 운동성을 자극하지 않았다.
이러한 결과는 가능성 있는 커플링 인자(possible coupling factors)가 골흡수 과정으로부터가 아니라, 주로 초기-분화된 파골세포로부터 분비될 수 있음을 의미한다.
조골세포 계통의 방향성이 있는 이동(directional migration)에 대한 파골세포 CM의 효과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 Boyden chamber assay를 사용하였다. RANKL-처리된 BMM 및 Raw 264.7 세포 둘다로부터 수집된 CM 역시 비처리 대조군과 비교하여 MC3T3-E1 세포의 방향성이 있는 가동성(mobilization)을 현저하게 자극하였다 (각각 도 2h와 2i). 이러한 결과는 초기 파골세포생성으로부터 유도된 인자들에 의한 전조골세포의 보충(preosteoblastic recruitment)의 자극이 골-재형성 부위에서 커플링 현상의 주요 메카니즘일 될 수 있음을 설명한다.
실험결과 2. 추정 주화성 인자의 동정
전조골세포에 대한 케모카인으로 작용하는 특이 단백질들을 동정하기 위해, 본 발명자들은 LC-MS/MS 분획화 하였다. 간단히 설명하면, RANKL-처리 및 -비처리된 Raw 264.7 세포로부터 얻은 CM의 96개의 매치된 분획을 MC3T3-E1 세포에 처리하고, 이들 세포의 가동성에 대한 효과를 Boyden chamber assay를 이용하여 비교하였다. 본 발명자들은 MC3T3-E1 세포의 이동에 대한 가장 차이나는 효과를 나타내는 매치된 분획을 선별하였다. 상기 실험방법란에 기술된, 프로테오믹스 분석을 선별된 분획 및 인접한 RANKL-처리된 분획에 대해 수행하였다. 본 발명자들은 인접한 분획 및 RANKL-비처리 대조군과 비교하여 RANKL-처리된 분획에서 차이나게 발현되는 45개 펩타이드를 동정하였다. 이들 중, 9개의 펩타이드가 분비 특성을 가지고 있었다 (표 1). 최종적으로, slit3 단백질을 선택하여, 이후 실험을 수행하였다.
표 1
Accession number Name MASCOTScore Molecular weight Matched peptides
O89020 Afamin 42 69.3 6
Q80T21 ADAMTS-like protein 4 33 113.3 3
Q9Z319.2 Atrial natriuretic peptide 37 123.0 4
P09470 Angiotensin-converting enzyme 38 150.8 3
Q9WVB4 Slit 3 34 167.7 3
Q61292 Laminin β2 40 196.2 4
NP_808531 Fras-1 33 244.4 4
NP031756 Collagen α-1 chain 39 333.4 7
NP_067383 Usherin 40 569.4 5
실험결과 3. Slit3은 분화된 파골세포로부터 분비된다.
분화된 파골세포에서 slit3의 분비 여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. BMMs (bone marrow macrophages)을 30 ng/mL M-CSF(macrophage colony-stimulating factor)가 포함된 배지 하에서, 100 ng/mL RANKL의 처리 여부를 구분하여 2일간 배양하고, 상기 세포에서 웨스턴 블랏을 수행하였다. 또한, 파골세포 형성 과정 (osteoclastogenesis)에 관여하는 것으로 잘 알려진 마스터 유전자인 NFATc1의 siRNA를 이용하여 BMMs에서 파골세포 형성과정을 차단하고, 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였다. 그 결과를 각각 도 3a 및 도 3b에 나타내었다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, slit3의 발현은 분화된 파골세포의 세포 용해물(lysate) 및 CM(conditioned media)에서 모두 현저하게 증가됨을 확인하였다.
또한, 도 3b에 나타낸 바와 같이, RANKL에 의해 자극된 slit3의 발현은 NFATc1-siRNA에 의해 완전하게 차단된 것을 확인하였다.
상기 결과를 통하여, slit3는 분화된 파골세포에서 분비되며, 파골세포의 전구체에서는 분비되지 않음을 확인하였다.
실험결과 4. Slit3은 조골세포의 이동, 생존력, 증식, 분화 및 OPG 생성을 자극한다.
조골세포에서 slit3의 기능을 확인하기 위하여 MC3T3-E1 조골세포를 재조합 slit3로 처리한 후, 조골세포의 이동(migration), 생존능(viability), 증식(proliferation), 분화(differentiation) 및 OPG(osteoprotegerin)의 생산에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과를 각각 도 4a 내지 4g에 나타내었다.
도 4a에 나타낸 바와 같이, MC3T3-E1 조골세포를 slit3 (0, 0.1, 0.5, 및 1.0 μg/mL)로 24시간 동안 처리한 결과, slit3의 농도에 의존적으로 전조골세포(preosteoblast)의 이동이 증가함을 확인하였다.
또한, 도 4b 및 도 4c에 나타낸 바와 같이, MC3T3-E1 조골세포를 slit3(0, 0.1, 0.5, 및 1.0 μg/mL)로 48시간동안 처리하고 CCK-8 어세이 및 Brd-U 어세이를 수행한 결과, slit3의 처리에 의해 조골세포의 생존능 및 증식이 증가함을 확인하였다. CCK-8 어세이에서 IGF-1은 양성대조군으로 이용하였다.
또한, 도 4d에 나타낸 바와 같이, 1차 (primary) 마우스 BMSCs(bone marrow stromal cells)를 1.0 μg/mL slit3로 처리하고, 조골세포의 분화를 유도한 결과, slit3의 처리에 의해 조골세포 분화 마커인 ALP (alkaline phosphatase) 및 OCN (osteocalcin)의 mRNA 발현이 현저하게 증가함을 확인하였다.
또한, 도 4e에 나타낸 바와 같이, 1차 마우스 두개관 조골세포를 1.0 μg/mL slit3로 48시간 동안 처리하고, QRT-PCR을 수행한 결과, slit3는 OPG의 생산을 촉진하였으며, RANKL의 발현에는 영향을 끼치지 못함을 확인하였다.
또한, 도 4f에 나타낸 바와 같이, 세포 이동 과정에서 세포 방향으로 이동시키고 실질적으로 운동에 관여하는 라멜리포디아(lamellipodia) 형성이 자극되었으며 이는 주화성(chemotactic action)이 있음을 의미한다.
상기 결과를 통하여 slit3는 조골세포에서 이동, 생존능, 증식, 분화 및 OPG의 생산을 증가시키는 기능을 하며, 이를 통해 골 형성 과정에 기여함을 확인하였다.
실험결과 5. Slit3은 두개관 골형성을 증가시키고 IL-1 유도된 두개관 골소실을 방지한다.
골 세포에 대한 slit3의 시험관내 결과를 검증하기 위해, 동물모델을 이용한 실험을 수행하였다. slit3를 두개관에 직접 주입한 결과, 비처리 대조군과 비교하여 15%까지 골의 너비가 증가하였다 (도 5). 또한 동물모델의 두개관 골소실에서, IL-1을 처리하여 골소실을 유도하였을 때 slit3가 IL-1에 의한 골소실을 억제함을 증명하였다 (도 6). 이러한 결과는 slit3이 골 형성을 증가시키는 동시에 골 흡수를 감소시키는 치료제로 사용될 수 있음을 의미한다.
실험결과 6. Slit3은 골 형성 표면으로 MC3T3-E1 세포의 이동을 자극한다.
GFP-표지된 MC3T3-E1 세포를 골수강에 주입시키는 경우, slit3 처리는 PBS 처리군과 비교하여 골 형성 표면으로 세포의 이동을 현저하게 증가시킨다 (도 7).
실험결과 7. slit3 넉아웃 마우스 배아에서 골 형성 및 혈관신생이 현저하게 약화된다.
17.5일된 slit3 마우스 배아의 대퇴골에서 칼슘의 축적을 평가하기 위해 Von Kossa 염색을 수행하고 혈관의 형성을 평가하기 위해 VEGF IHC 염색을 수행하였다. slit3-넉아웃 배아는 Von Kossa (도 8a) 및 VEGF IHC (도 8b) 두 방법에 의한 염색이 야생형 배아와 비교하여 거의 나타나지 않았다. 이러한 결과는 slit3는 골 형성에 계속적으로 기여하면서 혈관신생에 대한 필수인자인 VEGF의 발현을 증가시키는데 중요한 역할을 함을 의미한다.
실험결과 8. 골 세포에 대한 slit3의 작용은 Robo1 및 Robo2 수용체를 통해 매개된다.
slit 리간드 및 Robo 수용체는 다양한 타입의 세포에서 신호전달경로가 잘 알려져 있기 때문에 (Dickinson RE, et al., Reproduction 2010;139: 697-704), 본 발명자들은 RT-PCR을 수행하여 골 세포에서 Robo 수용체의 발현을 조사하였다.
그 결과, MC3T3-E1 세포는 Robo1 및 Robo2 수용체를 발현함을 확인하였다 (도 9a). 일차 파골세포는 Robo1 수용체를 주로 발현하는 반면, Robo3 및 Robo4 수용체의 발현 수준은 약하게 증가하였다 (도 9b). MC3T3-E1 세포에서 siRNA 트랜스펙션 및 fc 키메라에 의한 Robo1 및 Robo2의 발현을 차단한 경우, slit3-자극된 세포의 이동 및 증식이 억제되었다 (각각, 도 9c 9d). 일차 파골세포와 관련하여, Robo1 수용체에 대한 siRNA 트랜스펙션은 slit3 처리에 의한 파골세포 형성의 감소를 완전하게 회복시켰다 (도 9e).
실험결과 9. Vilse는 조골세포와 파골세포에서 Robo1 수용체를 통해 slit3의 작용을 매개하는 주요 신호분자이다.
인간 BMSC와 인간 PBMC로부터 생성된, GFP-Robo1은 조골세포(도 10a)와 파골세포(도 10b)로 Myc-vilse와 함께 각각 트랜스펙션하는 경우, slit3 처리는 공동-면역침전법에서 Robo1-Vilse 상호작용을 현저하게 증가시켰다. siRNA로 vilse의 넉다운시키면 MC3T3-E1 세포의 slit3-자극된 생존력을 억제하였다 (도 10c). 이러한 결과는 Robo1 수용체를 통한 slit의 작용이 골 세포에서 vilse에 의해 매개될 수 있음을 의미한다.
실험결과 10. 전신 BMC는 Robo1-넉아웃 마우스에서 현저하게 감소되었다.
8주령 수컷 Robo1 야생형, 헤테로형(heterozygote) 및 넉아웃 마우스에서 전신 BMC 값을 비교한 결과, Robo1-넉아웃 마우스는 현저하게 낮은 BMD 값을 나타내었다 (도 11).
실험결과 11. slit1 및 slit2는 파골세포의 분화를 약화시킨다.
TRAP 염색을 수행함으로써 파골세포에 대한 slit 패밀리의 다른 단백질, slit1 및 slit2의 효과를 시험하였다 (도 12). slit1 및 slit2는 slit3에 의해 관찰되는 것처럼, 파골세포의 분화를 용량-의존적으로 감소하였다.
실험결과 12. 재조합 slit3 LRR2 펩타이드는 파골세포의 분화를 약화시킨다.
slit 단백질의 LRR2 도메인은 그들의 수용체, Robo들과 결합하는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 본 발명자들은 LRR2 도메인 펩타이드로서 slit3의 작은 재조합 펩타이드를 제조하였다. 상기 재조합 펩타이드는 파골세포의 분화를 현저하게 억제하는 것으로 확인되었다 (도 13). 이러한 결과는 재조합 펩타이드가 골다공증의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
실시예 13. 임상 실험
13-1. 실험대상의 선정
실험 대상은 서울아산병원(Seoul, Korea)에 내원한 건강한 폐경 후 여성을 대상으로 하였다. 상기 모든 여성은 골다공증의 가능성을 염려하여 방문한 경우 또는 건강검진에서 골다공증이 검출된 경우였다. 이때 폐경은 1년 이상 무월경이 지속된 경우로 혈청 내 FSH(follicle stimulating hormone)의 농도를 측정하여 검증하였다. 실험대상 중 40세 이전에 폐경한 실험대상, 골 대사에 영향을 미칠만한 약제를 6개월 이상 또는 12개월 이내에 투여받은 실험대상 및 골 대사에 영향을 미칠만한 질환을 앓은 실험대상은 제외하였다. 최종적으로 346명의 여성을 선정하였다.
13-2. 골밀도 (Bone mineral density, BMD) 측정
상기 13-1선정한 실험 대상의 나이, 몸무게, 키, BMI, 행동 요인 (흡연, 음주, 운동 등), 골밀도 등을 측정하였다.
골밀도 (BMD, g/cm2)는 DXA (Lunar; Prodigy, Madison, WI, USA)를 이용하여 요추 (lumbar spine, L1-L4) 및 대퇴골 근위부 (proximal femur) 중 대퇴 경부 (femur neck), 대퇴골 (total femur), 전자부 (trochanter), 대퇴골 간부(shaft), 삼각 (ward)을 측정하였다.
그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
표 2
변수 실험 대상 (n = 346)
나이 (세) 59.6 ± 7.1
몸무게 (kg) 55.6 ± 6.9
키 (cm) 155.2 ± 5.2
체질량 지수 (BMI) (kg/m2) 23.1 ± 2.7
폐경 기간 9.7 ± 7.1
흡연자, 명. (%) 6 (1.7%)
음주 ≥ 3 U/일, 명. (%) 9 (2.6%)
운동 ≥ 30 분/일, 명. (%) 172 (49.7%)
골밀도 (Bone mineral density) (g/cm2)
요추 (Lumbar spine) 0.882 ± 0.099
대퇴 경부 (femur neck) 0.760 ± 0.085
총 대퇴골 (total femur) 0.819 ± 0.091
삼각 (ward) 0.556 ± 0.091
전자부 (trochanter) 0.641 ± 0.084
간부(shaft) 0.993 ± 0.119
13-3. 혈중 slit3 농도 측정
상기 13-1에서 선정한 실험 대상의 공복 혈액 샘플을 원심 분리한 후, 상등액을 분리하였다. 혈중 slit3 농도는 slit3 경쟁적인 ELISA 키트(Echelon Biosciences Inc, Salt Lake, UT, USA)를 이용하여 측정하였으며, 2회 반복하였다. 상기 결과값을 각 골 위치에서의 BMD 또는 T-score를 종속변수 (dependent variable)로, slit3 농도를 독립변수 (independent variable)로 이용하여 다중선형회귀분석 (Multiple linear regression analysis)을 수행하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다. 공변량 (Covariates)은 나이, 몸무게, 키, 흡연, 음주 및 정기적인 운동을 포함하였다.
표 3
위치 변수 Standardized β-coefficients P 값 위치 변수 Standardized β-coefficients P 값
요추(Lumbar spine) BMD 0.123 0.029 삼각 (ward) BMD 0.178 0.001
T-score 0.146 0.010 T-score 0.118 0.026
대퇴 경부 (femur neck) BMD 0.138 0.012 전자부 (trochanter) BMD 0.098 0.074
T-score 0.164 0.003 T-score 0.099 0.069
총 대퇴골(total femur) BMD 0.126 0.022 간부(shaft) BMD 0.128 0.021
T-score 0.162 0.003 　 　 　
표 3에 나타낸 바와 같이, 가능성 있는 혼란 변수(confounding factor)로의 보정 후에, 혈중 slit3 농도는 요추, 대퇴경부, 총대퇴골, 대퇴 삼각, 대퇴 간부에서의 BMD 값 및 T-score와 관련성이 있음을 확인하였다.
또한, slit3 의 농도에 따라 5분위로 그룹을 나눈 후, 골다공증 발병률을 관찰하였다. WHO에 따를 때, 요추, 대퇴경부, 총 대퇴부 중 어느 한 곳에서의 T-score≤ -2.5 SD일 때 골다공증으로 정의한다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
표 4
slit3 5분위 수 발병률 (%) ORs (95% CI)*
Q1 (1.1 - 4.8 ng/mL) 54.5 1 (Ref.)
Q2 (4.9 - 6.3 ng/mL) 49.3 0.876 (0.420 - 1.830)
Q3 (6.4 - 7.5 ng/mL) 45.6 0.663 (0.316 - 1.391)
Q4 (7.6 - 8.7 ng/mL) 47.1 0.710 (0.421 - 1.423)
Q5 (8.8 - 14.1 ng/mL) 38.2 0.421 (0.197 - 0.900)
표 4에 나타낸 바와 같이, 골다공증 odds는 공변량으로의 보정 후에, 혈중 slit3의 농도가 가장 낮게 나타난 군(Q1)에 비해 가장 높게 나타난 군(Q5)에서 약 58% 낮게 나타남을 확인하였다.
상기 결과를 통하여, 혈중 slit 3 농도는 골다공증의 발병률과 음의 상관관계를 가지고 있어, 골절 및 골다공증 발생 위험 예측용 마커로 이용될 수 있음을 확인하였다.
실험결과 14. slit2, slit3, robo1, robo2 및 robo4에 있는 7개의 SNP는 낮은 골밀도 위험과 관련이 있다.
BMD 상태에 따른 유전학적 연구 대상의 기준 특성은 하기 표 5와 같다. 두 그룹의 나이가 일치하기 때문에, 나이에서의 특별한 차이는 없었다. 이 그룹들의 정의와 일치하게, BMI는 심하게 낮은 BMD 그룹에서 현저하게 높은 반면, 허리뼈(lumbar spine)와 대퇴경부(femur neck)에서의 BMD 값과 T-스코어는 평균이상의 BMD 그룹에서 현저하게 높았다.
심하게 낮은 BMD 상태(severe-low BMD status)의 위험에 놓인 여러 다형성(polymorphism)의 유전적 효과는 서열분석(targeted deep sequencing analysis) 및 로지스틱 회귀분석(logistic regression analysis)에 의해 분석되었다 (표 6). slit2에서 1개의 SNP (rs7655084), slit3에서 2개의 SNP (rs1549909 및 rs10036727), robo1에서 1개의 다운스트림 SNP, robo2에서 2개의 SNP (rs3821735 및 rs78817248), 및 robo4에서 1개의 SNP (rs12418548)가 심하게 낮은 BMD 상태의 위험과 유의하게 관련이 있었다.
표 5
Variables Super-normal BMD group (n = 501) Severe-low BMD group (n = 481) P value
Age (years) 58.4 ± 6.3 58.8 ± 7.0 0.343
Weight (kg) 54.5 ± 5.9 55.6 ± 6.7 0.007
Height (cm) 154.9 ± 4.8 154.6 ± 5.2 0.239
Body mass index (kg/m2) 22.7 ± 2.6 23.3 ± 2.9 0.001
Bone mineral density (g/cm2)
Lumbar spine 0.983 ± 0.119 0.755 ± 0.095 < 0.001
Femur neck 0.778 ± 0.092 0.656 ± 0.094 < 0.001
T-score
Lumbar spine -1.2 ± 0.9 -3.2 ± 0.7 < 0.001
Femur neck -1.1 ± 0.7 -2.3 ± 0.8 < 0.001
Fracture history, no. (%) 0 (0.0%) 164 (34.1%) < 0.001
표 6
Gene Location Chr Position rs ID Genotype MAF HWE* Additive Dominant Recessive
OR (95% CI) P OR (95% CI) P OR (95% CI) P
SLIT2 START_GAINED 4 20255306 rs7655084 TT (859) GT (121) GG (2) 0.064 0.429 1.673 (1.145-2.445) 0.008 1.655 (1.125-2.435) 0.011 ∞ 0.980
SLIT3 intron 5 168180670 rs1549909 TT (359) CT (484) CC (138) 0.387 0.233 0.923(0.766-1.112) 0.399 1.067(0.822-1.385) 0.627 0.649 (0.449-0.938) 0.021
SLIT3 exon 5 168180081 rs10036727 TT (357) CT (487) CC (138) 0.388 0.179 0.931(0.772-1.122) 0.450 1.084(0.834-1.407) 0.547 0.650 (0.450-0.940) 0.022
ROBO1 downstream 3 78647361 AA (904) AC (69) CC (1) 0.036 1.000 0.465 (0.278-0.781) 0.004 0.467 (0.277-0.787) 0.004 0 0.978
ROBO2 intron 3 77684222 rs3821735 CC (606) CT (327) TT (49) 0.216 0.579 0.787 (0.634-0.977) 0.030 0.745 (0.575-0.966) 0.026 0.761(0.425-1.364) 0.360
ROBO2 intron 3 77626788 rs78817248 CC (950) CG (23) GG (1) 0.013 0.145 2.596 (1.097-6.142) 0.030 2.593 (1.062-6.333) 0.036 ∞ 0.978
ROBO4 exon 11 124757560 rs12418548 GG (865) GA (112) AA (5) 0.062 0.422 0.667 (0.459-0.968) 0.033 0.644 (0.434-0.957) 0.030 0.674(0.112-4.077) 0.668
Chr, chromosome; MAF, minor allele frequency; * P values for the deviation from a HardyWeinberg Equilibrium (HWE) among all subjects.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
본 발명의 slit 또는 robo 단백질은 세포 및 동물모델에서 골 형성을 증가시키고, 골 흡수를 감소시키며, 골다공증의 발병률과 음의 상관관계를 가지고 있어, 골절 또는 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물 및 골절 또는 골다공증 발생 위험을 예측하기 위한 바이오 마커로 유용하게 이용될 수 있다.
<110> THE ASAN FOUNDATION
<120> Composition for treating or preventing osteoporotic fracture or osteoporosis comprising slit-robo system
<130> NP13-1157
<150> KR 12/064302
<151> 2012-06-15
<160> 17
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1534
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Leu Thr Pro Gly Trp Gly Ser Ser Ala Gly Pro Val Arg Pro
1 5 10 15
Glu Leu Trp Leu Leu Leu Trp Ala Ala Ala Trp Arg Leu Gly Ala Ser
20 25 30
Ala Cys Pro Ala Leu Cys Thr Cys Thr Gly Thr Thr Val Asp Cys His
35 40 45
Gly Thr Gly Leu Gln Ala Ile Pro Lys Asn Ile Pro Arg Asn Thr Glu
50 55 60
Arg Leu Glu Leu Asn Gly Asn Asn Ile Thr Arg Ile His Lys Asn Asp
65 70 75 80
Phe Ala Gly Leu Lys Gln Leu Arg Val Leu Gln Leu Met Glu Asn Gln
85 90 95
Ile Gly Ala Val Glu Arg Gly Ala Phe Asp Asp Met Lys Glu Leu Glu
100 105 110
Arg Leu Arg Leu Asn Arg Asn Gln Leu His Met Leu Pro Glu Leu Leu
115 120 125
Phe Gln Asn Asn Gln Ala Leu Ser Arg Leu Asp Leu Ser Glu Asn Ala
130 135 140
Ile Gln Ala Ile Pro Arg Lys Ala Phe Arg Gly Ala Thr Asp Leu Lys
145 150 155 160
Asn Leu Gln Leu Asp Lys Asn Gln Ile Ser Cys Ile Glu Glu Gly Ala
165 170 175
Phe Arg Ala Leu Arg Gly Leu Glu Val Leu Thr Leu Asn Asn Asn Asn
180 185 190
Ile Thr Thr Ile Pro Val Ser Ser Phe Asn His Met Pro Lys Leu Arg
195 200 205
Thr Phe Arg Leu His Ser Asn His Leu Phe Cys Asp Cys His Leu Ala
210 215 220
Trp Leu Ser Gln Trp Leu Arg Gln Arg Pro Thr Ile Gly Leu Phe Thr
225 230 235 240
Gln Cys Ser Gly Pro Ala Ser Leu Arg Gly Leu Asn Val Ala Glu Val
245 250 255
Gln Lys Ser Glu Phe Ser Cys Ser Gly Gln Gly Glu Ala Gly Arg Val
260 265 270
Pro Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gly Ser Cys Pro Ala Met Cys Thr Cys
275 280 285
Ser Asn Gly Ile Val Asp Cys Arg Gly Lys Gly Leu Thr Ala Ile Pro
290 295 300
Ala Asn Leu Pro Glu Thr Met Thr Glu Ile Arg Leu Glu Leu Asn Gly
305 310 315 320
Ile Lys Ser Ile Pro Pro Gly Ala Phe Ser Pro Tyr Arg Lys Leu Arg
325 330 335
Arg Ile Asp Leu Ser Asn Asn Gln Ile Ala Glu Ile Ala Pro Asp Ala
340 345 350
Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu Asn Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys
355 360 365
Ile Thr Asp Leu Pro Arg Gly Val Phe Gly Gly Leu Tyr Thr Leu Gln
370 375 380
Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn Lys Ile Asn Cys Ile Arg Pro Asp Ala
385 390 395 400
Phe Gln Asp Leu Gln Asn Leu Ser Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys
405 410 415
Ile Gln Ser Leu Ala Lys Gly Thr Phe Thr Ser Leu Arg Ala Ile Gln
420 425 430
Thr Leu His Leu Ala Gln Asn Pro Phe Ile Cys Asp Cys Asn Leu Lys
435 440 445
Trp Leu Ala Asp Phe Leu Arg Thr Asn Pro Ile Glu Thr Ser Gly Ala
450 455 460
Arg Cys Ala Ser Pro Arg Arg Leu Ala Asn Lys Arg Ile Gly Gln Ile
465 470 475 480
Lys Ser Lys Lys Phe Arg Cys Ser Ala Lys Glu Gln Tyr Phe Ile Pro
485 490 495
Gly Thr Glu Asp Tyr Gln Leu Asn Ser Glu Cys Asn Ser Asp Val Val
500 505 510
Cys Pro His Lys Cys Arg Cys Glu Ala Asn Val Val Glu Cys Ser Ser
515 520 525
Leu Lys Leu Thr Lys Ile Pro Glu Arg Ile Pro Gln Ser Thr Ala Glu
530 535 540
Leu Arg Leu Asn Asn Asn Glu Ile Ser Ile Leu Glu Ala Thr Gly Met
545 550 555 560
Phe Lys Lys Leu Thr His Leu Lys Lys Ile Asn Leu Ser Asn Asn Lys
565 570 575
Val Ser Glu Ile Glu Asp Gly Ala Phe Glu Gly Ala Ala Ser Val Ser
580 585 590
Glu Leu His Leu Thr Ala Asn Gln Leu Glu Ser Ile Arg Ser Gly Met
595 600 605
Phe Arg Gly Leu Asp Gly Leu Arg Thr Leu Met Leu Arg Asn Asn Arg
610 615 620
Ile Ser Cys Ile His Asn Asp Ser Phe Thr Gly Leu Arg Asn Val Arg
625 630 635 640
Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Gln Ile Thr Thr Val Ser Pro Gly Ala
645 650 655
Phe Asp Thr Leu Gln Ser Leu Ser Thr Leu Asn Leu Leu Ala Asn Pro
660 665 670
Phe Asn Cys Asn Cys Gln Leu Ala Trp Leu Gly Gly Trp Leu Arg Lys
675 680 685
Arg Lys Ile Val Thr Gly Asn Pro Arg Cys Gln Asn Pro Asp Phe Leu
690 695 700
Arg Gln Ile Pro Leu Gln Asp Val Ala Phe Pro Asp Phe Arg Cys Glu
705 710 715 720
Glu Gly Gln Glu Glu Gly Gly Cys Leu Pro Arg Pro Gln Cys Pro Gln
725 730 735
Glu Cys Ala Cys Leu Asp Thr Val Val Arg Cys Ser Asn Lys His Leu
740 745 750
Arg Ala Leu Pro Lys Gly Ile Pro Lys Asn Val Thr Glu Leu Tyr Leu
755 760 765
Asp Gly Asn Gln Phe Thr Leu Val Pro Gly Gln Leu Ser Thr Phe Lys
770 775 780
Tyr Leu Gln Leu Val Asp Leu Ser Asn Asn Lys Ile Ser Ser Leu Ser
785 790 795 800
Asn Ser Ser Phe Thr Asn Met Ser Gln Leu Thr Thr Leu Ile Leu Ser
805 810 815
Tyr Asn Ala Leu Gln Cys Ile Pro Pro Leu Ala Phe Gln Gly Leu Arg
820 825 830
Ser Leu Arg Leu Leu Ser Leu His Gly Asn Asp Ile Ser Thr Leu Gln
835 840 845
Glu Gly Ile Phe Ala Asp Val Thr Ser Leu Ser His Leu Ala Ile Gly
850 855 860
Ala Asn Pro Leu Tyr Cys Asp Cys His Leu Arg Trp Leu Ser Ser Trp
865 870 875 880
Val Lys Thr Gly Tyr Lys Glu Pro Gly Ile Ala Arg Cys Ala Gly Pro
885 890 895
Gln Asp Met Glu Gly Lys Leu Leu Leu Thr Thr Pro Ala Lys Lys Phe
900 905 910
Glu Cys Gln Gly Pro Pro Thr Leu Ala Val Gln Ala Lys Cys Asp Leu
915 920 925
Cys Leu Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Thr Cys His Asn Asp Pro
930 935 940
Leu Glu Val Tyr Arg Cys Ala Cys Pro Ser Gly Tyr Lys Gly Arg Asp
945 950 955 960
Cys Glu Val Ser Leu Asp Ser Cys Ser Ser Gly Pro Cys Glu Asn Gly
965 970 975
Gly Thr Cys His Ala Gln Glu Gly Glu Asp Ala Pro Phe Thr Cys Ser
980 985 990
Cys Pro Thr Gly Phe Glu Gly Pro Thr Cys Gly Val Asn Thr Asp Asp
995 1000 1005
Cys Val Asp His Ala Cys Ala Asn Gly Gly Val Cys Val Asp Gly Val
1010 1015 1020
Gly Asn Tyr Thr Cys Gln Cys Pro Leu Gln Tyr Glu Gly Lys Ala Cys
1025 1030 1035 1040
Glu Gln Leu Val Asp Leu Cys Ser Pro Asp Leu Asn Pro Cys Gln His
1045 1050 1055
Glu Ala Gln Cys Val Gly Thr Pro Asp Gly Pro Arg Cys Glu Cys Met
1060 1065 1070
Pro Gly Tyr Ala Gly Asp Asn Cys Ser Glu Asn Gln Asp Asp Cys Arg
1075 1080 1085
Asp His Arg Cys Gln Asn Gly Ala Gln Cys Met Asp Glu Val Asn Ser
1090 1095 1100
Tyr Ser Cys Leu Cys Ala Glu Gly Tyr Ser Gly Gln Leu Cys Glu Ile
1105 1110 1115 1120
Pro Pro His Leu Pro Ala Pro Lys Ser Pro Cys Glu Gly Thr Glu Cys
1125 1130 1135
Gln Asn Gly Ala Asn Cys Val Asp Gln Gly Asn Arg Pro Val Cys Gln
1140 1145 1150
Cys Leu Pro Gly Phe Gly Gly Pro Glu Cys Glu Lys Leu Leu Ser Val
1155 1160 1165
Asn Phe Val Asp Arg Asp Thr Tyr Leu Gln Phe Thr Asp Leu Gln Asn
1170 1175 1180
Trp Pro Arg Ala Asn Ile Thr Leu Gln Val Ser Thr Ala Glu Asp Asn
1185 1190 1195 1200
Gly Ile Leu Leu Tyr Asn Gly Asp Asn Asp His Ile Ala Val Glu Leu
1205 1210 1215
Tyr Gln Gly His Val Arg Val Ser Tyr Asp Pro Gly Ser Tyr Pro Ser
1220 1225 1230
Ser Ala Ile Tyr Ser Ala Glu Thr Ile Asn Asp Gly Gln Phe His Thr
1235 1240 1245
Val Glu Leu Val Ala Phe Asp Gln Met Val Asn Leu Ser Ile Asp Gly
1250 1255 1260
Gly Ser Pro Met Thr Met Asp Asn Phe Gly Lys His Tyr Thr Leu Asn
1265 1270 1275 1280
Ser Glu Ala Pro Leu Tyr Val Gly Gly Met Pro Val Asp Val Asn Ser
1285 1290 1295
Ala Ala Phe Arg Leu Trp Gln Ile Leu Asn Gly Thr Gly Phe His Gly
1300 1305 1310
Cys Ile Arg Asn Leu Tyr Ile Asn Asn Glu Leu Gln Asp Phe Thr Lys
1315 1320 1325
Thr Gln Met Lys Pro Gly Val Val Pro Gly Cys Glu Pro Cys Arg Lys
1330 1335 1340
Leu Tyr Cys Leu His Gly Ile Cys Gln Pro Asn Ala Thr Pro Gly Pro
1345 1350 1355 1360
Met Cys His Cys Glu Ala Gly Trp Val Gly Leu His Cys Asp Gln Pro
1365 1370 1375
Ala Asp Gly Pro Cys His Gly His Lys Cys Val His Gly Gln Cys Val
1380 1385 1390
Pro Leu Asp Ala Leu Ser Tyr Ser Cys Gln Cys Gln Asp Gly Tyr Ser
1395 1400 1405
Gly Ala Leu Cys Asn Gln Ala Gly Ala Leu Ala Glu Pro Cys Arg Gly
1410 1415 1420
Leu Gln Cys Leu His Gly His Cys Gln Ala Ser Gly Thr Lys Gly Ala
1425 1430 1435 1440
His Cys Val Cys Asp Pro Gly Phe Ser Gly Glu Leu Cys Glu Gln Glu
1445 1450 1455
Ser Glu Cys Arg Gly Asp Pro Val Arg Asp Phe His Gln Val Gln Arg
1460 1465 1470
Gly Tyr Ala Ile Cys Gln Thr Thr Arg Pro Leu Ser Trp Val Glu Cys
1475 1480 1485
Arg Gly Ser Cys Pro Gly Gln Gly Cys Cys Gln Gly Leu Arg Leu Lys
1490 1495 1500
Arg Arg Lys Phe Thr Phe Glu Cys Ser Asp Gly Thr Ser Phe Ala Glu
1505 1510 1515 1520
Glu Val Glu Lys Pro Thr Lys Cys Gly Cys Ala Leu Cys Ala
1525 1530
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Met Arg Gly Val Gly Trp Gln Met Leu Ser Leu Ser Leu Gly Leu Val
1 5 10 15
Leu Ala Ile Leu Asn Lys Val Ala Pro Gln Ala Cys Pro Ala Gln Cys
20 25 30
Ser Cys Ser Gly Ser Thr Val Asp Cys His Gly Leu Ala Leu Arg Ser
35 40 45
Val Pro Arg Asn Ile Pro Arg Asn Thr Glu Arg Leu Asp Leu Asn Gly
50 55 60
Asn Asn Ile Thr Arg Ile Thr Lys Thr Asp Phe Ala Gly Leu Arg His
65 70 75 80
Leu Arg Val Leu Gln Leu Met Glu Asn Lys Ile Ser Thr Ile Glu Arg
85 90 95
Gly Ala Phe Gln Asp Leu Lys Glu Leu Glu Arg Leu Arg Leu Asn Arg
100 105 110
Asn His Leu Gln Leu Phe Pro Glu Leu Leu Phe Leu Gly Thr Ala Lys
115 120 125
Leu Tyr Arg Leu Asp Leu Ser Glu Asn Gln Ile Gln Ala Ile Pro Arg
130 135 140
Lys Ala Phe Arg Gly Ala Val Asp Ile Lys Asn Leu Gln Leu Asp Tyr
145 150 155 160
Asn Gln Ile Ser Cys Ile Glu Asp Gly Ala Phe Arg Ala Leu Arg Asp
165 170 175
Leu Glu Val Leu Thr Leu Asn Asn Asn Asn Ile Thr Arg Leu Ser Val
180 185 190
Ala Ser Phe Asn His Met Pro Lys Leu Arg Thr Phe Arg Leu His Ser
195 200 205
Asn Asn Leu Tyr Cys Asp Cys His Leu Ala Trp Leu Ser Asp Trp Leu
210 215 220
Arg Lys Arg Pro Arg Val Gly Leu Tyr Thr Gln Cys Met Gly Pro Ser
225 230 235 240
His Leu Arg Gly His Asn Val Ala Glu Val Gln Lys Arg Glu Phe Val
245 250 255
Cys Ser Asp Glu Glu Glu Gly His Gln Ser Phe Met Ala Pro Ser Cys
260 265 270
Ser Val Leu His Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val
275 280 285
Asp Cys Arg Gly Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu
290 295 300
Thr Ile Thr Glu Ile Arg Leu Glu Gln Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro
305 310 315 320
Pro Gly Ala Phe Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Arg Ile Asp Leu Ser
325 330 335
Asn Asn Gln Ile Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg
340 345 350
Ser Leu Asn Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro
355 360 365
Lys Ser Leu Phe Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gln Leu Leu Leu Leu Asn
370 375 380
Ala Asn Lys Ile Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gln Asp Leu His
385 390 395 400
Asn Leu Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala
405 410 415
Lys Gly Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln Thr Met His Leu Ala
420 425 430
Gln Asn Pro Phe Ile Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr
435 440 445
Leu His Thr Asn Pro Ile Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cys Thr Ser Pro
450 455 460
Arg Arg Leu Ala Asn Lys Arg Ile Gly Gln Ile Lys Ser Lys Lys Phe
465 470 475 480
Arg Cys Ser Gly Thr Glu Asp Tyr Arg Ser Lys Leu Ser Gly Asp Cys
485 490 495
Phe Ala Asp Leu Ala Cys Pro Glu Lys Cys Arg Cys Glu Gly Thr Thr
500 505 510
Val Asp Cys Ser Asn Gln Lys Leu Asn Lys Ile Pro Glu His Ile Pro
515 520 525
Gln Tyr Thr Ala Glu Leu Arg Leu Asn Asn Asn Glu Phe Thr Val Leu
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Glu Ala Thr Gly Ile Phe Lys Lys Leu Pro Gln Leu Arg Lys Ile Asn
545 550 555 560
Phe Ser Asn Asn Lys Ile Thr Asp Ile Glu Glu Gly Ala Phe Glu Gly
565 570 575
Ala Ser Gly Val Asn Glu Ile Leu Leu Thr Ser Asn Arg Leu Glu Asn
580 585 590
Val Gln His Lys Met Phe Lys Gly Leu Glu Ser Leu Lys Thr Leu Met
595 600 605
Leu Arg Ser Asn Arg Ile Thr Cys Val Gly Asn Asp Ser Phe Ile Gly
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Leu Ser Ser Val Arg Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Gln Ile Thr Thr
625 630 635 640
Val Ala Pro Gly Ala Phe Asp Thr Leu His Ser Leu Ser Thr Leu Asn
645 650 655
Leu Leu Ala Asn Pro Phe Asn Cys Asn Cys Tyr Leu Ala Trp Leu Gly
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Glu Trp Leu Arg Lys Lys Arg Ile Val Thr Gly Asn Pro Arg Cys Gln
675 680 685
Lys Pro Tyr Phe Leu Lys Glu Ile Pro Ile Gln Asp Val Ala Ile Gln
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Ser Asn Lys Gly Leu Lys Val Leu Pro Lys Gly Ile Pro Arg Asp Val
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755 760 765
Leu Ser Asn Tyr Lys His Leu Thr Leu Ile Asp Leu Ser Asn Asn Arg
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Ile Ser Thr Leu Ser Asn Gln Ser Phe Ser Asn Met Thr Gln Leu Leu
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Trp Leu Ser Asp Trp Val Lys Ser Glu Tyr Lys Glu Pro Gly Ile Ala
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Ile Pro Ser Ala Lys Val Arg Pro Gln Thr Asn Ile Thr Leu Gln Ile
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Asp Gly Asn Phe His Ile Val Glu Leu Leu Ala Leu Asp Gln Ser Leu
1235 1240 1245
Ser Leu Ser Val Asp Gly Gly Asn Pro Lys Ile Ile Thr Asn Leu Ser
1250 1255 1260
Lys Gln Ser Thr Leu Asn Phe Asp Ser Pro Leu Tyr Val Gly Gly Met
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Pro Gly Lys Ser Asn Val Ala Ser Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Asn
1285 1290 1295
Gly Thr Ser Phe His Gly Cys Ile Arg Asn Leu Tyr Ile Asn Ser Glu
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Gly Ala Arg Gly Ala Ala Glu Pro Phe Leu Ala Gln Ala Arg Leu Ala
545 550 555 560
Trp Glu Ala Gln Gln Ala His Phe His Met Lys Gln Arg Ser Ser Trp
565 570 575
Asp Ser Gln Gln Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Ser Asp Gly Ala Leu Pro
580 585 590
Leu Pro Met Pro Gly Pro Val Val Arg Ala Phe Ser Glu Asp Glu Ala
595 600 605
Leu Ala Gln Gln Glu Asn Arg His Trp Arg Arg Gly Thr Phe Glu Lys
610 615 620
Leu Gly Phe Pro Gln Ile Leu Leu Glu Lys Ser Val Ser Val Gln Thr
625 630 635 640
Asn Leu Ala Ser Pro Glu Pro Tyr Leu His Pro Ser Gln Ser Glu Asp
645 650 655
Leu Ala Ala Cys Ala Gln Phe Glu Ser Ser Arg Gln Ser Arg Ser Gly
660 665 670
Val Pro Ser Ser Ser Cys Val Phe Pro Thr Phe Thr Leu Arg Lys Pro
675 680 685
Ser Ser Glu Thr Asp Ile Glu Asn Trp Ala Ser Lys His Phe Asn Lys
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His Thr Gln Gly Leu Phe Arg Arg Lys Val Ser Ile Ala Asn Met Leu
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Ala Trp Ser Ser Glu Ser Ile Lys Lys Pro Met Ile Val Thr Ser Asp
725 730 735
Arg His Val Lys Lys Glu Ala Cys Glu Leu Phe Lys Leu Ile Gln Met
740 745 750
Tyr Met Gly Asp Arg Arg Ala Lys Ala Asp Pro Leu His Val Ala Leu
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Glu Val Ala Thr Lys Gly Trp Ser Val Gln Gly Leu Arg Asp Glu Leu
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Tyr Ile Gln Leu Cys Arg Gln Thr Thr Glu Asn Phe Arg Leu Glu Ser
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Leu Ala Arg Gly Trp Glu Leu Met Ala Ile Cys Leu Ala Phe Phe Pro
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Met Asp Pro Val Asn Asp Thr Lys Val Thr Gln His Ile Lys Glu Leu
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Pro Tyr Val Glu Glu Pro Asp Gly Val Ala Ile Ser Thr Tyr Ala Lys
865 870 875 880
Tyr Cys Tyr His Lys Leu Gln Lys Ala Ala Leu Thr Gly Ala Lys Lys
885 890 895
Gly Leu Lys Lys Pro Asn Val Glu Glu Ile Arg His Ala Lys Asn Ala
900 905 910
Val Phe Ser Pro Ser Met Phe Gly Ser Ala Leu Gln Glu Val Met Gly
915 920 925
Met Gln Arg Glu Arg Tyr Pro Glu Arg Gln Leu Pro Trp Val Gln Thr
930 935 940
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945 950 955 960
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Val Leu Cys Tyr Leu Ile Arg Phe Leu Gln Val Phe Val Gln Pro Ala
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Asn Val Ala Val Thr Lys Met Asp Val Ser Asn Leu Ala Met Val Met
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Glu Asn Thr Arg Lys Glu Met Ser Phe Leu Arg Val Leu Ile Gln His
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Leu Asp Thr Ser Phe Met Glu Gly Val Leu
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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cgctccctga actcgctggt cctctatgga aacaagatca cagacctccc ccgtggtgtg 1380
tttggaggcc tatacaccct acagctcctg ctcctgaatg ccaacaagat caactgcatc 1440
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tgccgctgtg aggccaacgt ggtggagtgc tccagcctga agctcaccaa gatccctgag 1860
cgcatccccc agtccacggc agaactgcga ttgaataaca atgagatttc catcctggag 1920
gccactggga tgtttaaaaa acttacacat ctgaagaaaa tcaatctgag caacaacaag 1980
gtgtcagaaa ttgaagatgg ggccttcgag ggcgcagcct ctgtgagcga gctgcaccta 2040
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cgcaacgtcc ggctcctctc gctctacgac aaccagatca ccaccgtatc cccaggagcc 2220
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<213> Homo sapiens
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<210> 14
<211> 4554
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
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cagcccgtcc atgttcggca gcgcactgca ggaggtcatg ggcatgcaga gagagcgcta 3360
ccccgagcgc cagctgccct gggtgcagac acggctctct gaggaggtgc tggcgctcaa 3420
cggtgaccag acagagggca tcttcagggt ccctggggac attgacgagg tgaatgccct 3480
gaagctgcag gtggaccagt ggaaggtgcc cacaggcctg gaagaccccc acgtccctgc 3540
gtccctgctg aagctgtggt accgggagct ggaggagccc ctgatcccgc acgagttcta 3600
cgagcagtgc atcgcgcact acgacagccc cgaggcggcg gtggccgtgg tgcacgcgct 3660
gccccgcatc aaccgcatgg tgctgtgcta cctcatccgc ttcctgcagg tcttcgtgca 3720
gccggccaac gtcgcggtca ccaagatgga tgtcagcaac ctggccatgg tgatggcgcc 3780
caactgcttg cgctgccagt ccgacgaccc gcgcgtcatc ttcgagaaca cccgcaagga 3840
gatgtccttc ctgcgggtgc tcatccagca cctggacacc agcttcatgg agggtgtgct 3900
gtagcggggg cgcccgggga caggagggat gtcctgccgc ccccagccag gccgaactcc 3960
gcactcgctc tcccggcaga ggggccagaa tcgcccggcc cagccctgga gccccctcca 4020
ctcccccagg cccctggccc cggcgctccc cacgtcttct gcctggtctg agggtgcagc 4080
cagggcacag cagcggcggg gagggcgcct ctggcccccc acctcacggc cagttcccgc 4140
gggcaccgcc tcgccctccg ctggccgcgg gtcagctccg agaaagtgcc ttctgtgtcc 4200
tggagccgag cgacgctgcc tccttggggc cgggctgcct ccctgtggct cctgcgcgcc 4260
ctggcctggg ccttgcccag ccgccccggt ctctccttcc ctttctcctg tcctcgtcct 4320
ggcctgcagc tcttcccagc cccgagagag cttcccgacc tgtccccgcc tcctctccct 4380
ccctcggccc gtggtcccca gctggtgact gctcaggagt ttgggggctc caggacagtg 4440
ggcccggggc ctggcaggct ctcggtgggt ggggtggggg cccccaaacc aaagtcctct 4500
ggggtaggga gcagggctgg gcaggcattc tgggggcagg gtgggggagg ggcgagagta 4560
tttttttctt cgtgtaactg taaatccaga atctatcctg catcgcagcc caccgtgtat 4620
agagatataa atagagggaa agatataaga actaaatttg ctaatgacat agttttaacc 4680
taaatgctat ttatctctga gccgtccccg tcctccgtgc agagcaagtt gaggtcattc 4740
cttcttttct tctccgatct tttttcttgg cttctgacca aaaaccaagc tctaccccat 4800
ccccatccca gacctgcagg agacgagcga gcgggaaggc gccgggcccg ggactgtccg 4860
ttctcggggc cagagctgct gggggaccga gtttgtacat tttccatttt ggaattttga 4920
gttccaattg ttgtaaaact taatttctcc ccagttttta tatatatatt ttttagagtt 4980
ccgtttttat ttattaaaaa caaaagcccc agccctgccg aggcctgggc ggcgtcctca 5040
gtcgggtggt cccggggcct ttgcggtccc gcccggctga gacgctcgcc ccgacgcatg 5100
gacccgagag gcgacgacac gagtgaataa agtgcacatg gaccctg 5147
<210> 17
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LRR2 domain recombinant
<400> 17
gatcgtcgaa atacgcctag aacagaactc catcaaagcc atccctgcag gagccttcac 60
ccagtacaag aaactgaagc gaatagacat cagcaagaat cagatatcgg atattgctcc 120
agatgccttc cagggcctga aatcactcac atcgctggtc ctgtatggga acaagatcac 180
cgagattgcc aagggactgt ttgatgggct ggtgtcccta cagctgctcc tcctcaatgc 240
caacaagatc aactgcctgc gggtgaacac gtttcaggac ctgcagaacc tcaacttgct 300
ctccctgtat gacaacaagc tgcagaccat cagcaagggg ctcttcgccc ctctgcagtc 360
catccagaca ctccacttag cccaaaaccc acccggggtc 400

Claims (20)

  1. 하기 군에서 선택된 유전자 또는 그 발현 단백질을 유효성분으로 함유하는 골절 또는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 slit1;
    서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 slit2;
    서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 slit3;
    서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 robo1;
    서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 robo2; 및
    서열번호 6의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 vilse.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 slit1 유전자는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 slit12 유전자는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 slit3 유전자는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 robo1 유전자는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 robo2 유전자는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 vilse 유전자는 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 유전자는 발현벡터에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 단백질을 유효성분으로 함유하는 골절 또는 골다공증 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  10. slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 단백질을 포함하는 골절 또는 골다공증 발생 예측용 마커 조성물.
  11. slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 골절 또는 골다공증 발생 예측용 키트.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 항체는 다클론항체, 단클론항체 또는 재조합항체인 것을 특징으로 하는 키트.
  13. slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 유전자의 mRNA를 검출하기 위한 RT-PCR용 프라이머를 포함하는 골절 또는 골다공증 발생 예측용 키트.
  14. 골절 또는 골다공증 발생 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 혈액 시료로부터 항원-항체 반응을 통해 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 단백질을 검출하는 방법.
  15. (a) slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 및 vilse로 구성된 군에서 선택된 유전자가 도입된 세포를 배양하는 단계;
    (b) 피검물질을 상기 (a) 단계의 세포와 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 (b)단계의 세포에서 slit1, slit2, slit3, robo1, robo2 또는 vilse 단백질의 발현 수준을, 피검물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 골절 또는 골다공증 치료제의 스크리닝 방법.
  16. 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되고, slit3 단백질의 LRR2 도메인 재조합 펩타이드.
  17. 제 16항에 따른 재조합 펩타이드를 포함하는 골절 또는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 하기 군에서 선택된 SNP 위치의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 골절 또는 골다공증 발생 예측용 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보적 폴리뉴클레오티드:
    서열번호 10의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs7655084;
    서열번호 11의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs1549909;
    서열번호 11의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs10036727;
    서열번호 13의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs3821735;
    서열번호 13의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs78817248; 및
    서열번호 15의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs12418548.
  19. 제 18항의 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 골절 또는 골다공증 발생 예측용 마커 조성물.
  20. 제 18항의 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 골절 또는 골다공증 발생 예측용 키트.
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