JP6027258B2 - タンパク質の精製プロセスにおける試料のグリコシル化および末端修飾状況を測定する方法 - Google Patents
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Description
(1)カチオン交換クロマトグラフィーにより免疫グロブリンを分離し、保持時間の違う画分をそれぞれ収集する工程と、
(2)工程(1)で得られた免疫グロブリンの画分を変性剤により変性させた後、還元剤により還元させることで、軽鎖と重鎖を離させる工程と、
(3)逆相高速液体クロマトグラフィーにより工程(2)で得られた免疫グロブリンの軽鎖と重鎖を分離する工程と、
(4)質量分析法により工程(3)で得られた軽鎖と重鎖の分子量を測定する工程と、
(5)工程(3)で得られたクロマトグラムのデータおよび工程(4)で得られた質量分析のデータを解析することで、免疫グロブリンのグリコシル化および末端修飾状況を測定する工程とを含む。
免疫グロブリンの還元反応において、タンパク質のジスルフィド結合はDTTの作用により断裂され、同じの軽鎖2本と同じの重鎖2本を生成する。C4逆相高速液体クロマトグラフィーにより軽鎖・重鎖の混合物を分離することで、N末端ピログルタミン酸を含む或いは含まない軽鎖と重鎖(異なるグリコシル型および末端修飾を含むもの)のベースライン分離を実現できる。そして、ESI-MSによりこれらの分子量をオンラインで測定する。異なるグリコシル型または末端修飾を含む重鎖は分子量が異なり、各重鎖の割合がそれぞれその分子量ピークの強さに比例するため、重鎖の質量分析法のデータからグリコシル型の相対含有量および重鎖のN末端におけるピログルタミン酸化の割合並びにC末端における脱リジンの割合が得られる。なお、クロマトグラムのピーク面積から軽鎖のN末端におけるピログルタミン酸化の割合が得られる。
使用量が異なる4つのDTTを用いて軽鎖・重鎖の分離に対する影響を考察した。抗体A 5μgを4部取り、それぞれ6Mのグアニジン塩酸塩溶液10μLに添加した後、0.1MのDTT溶液2μL、5μL、および、0.5MのDTT溶液2μL、4μLをそれぞれ添加した。最後に、DTT終濃度がそれぞれ10mM、25mM、50mM、100mMとなるように6Mのグアニジン塩酸塩溶液を適量添加し、前記IgG1と65℃で45minを反応させた。
結果は図1A〜1Dに示すように、DTT終濃度が10mMの場合は、抗体Aの軽鎖・重鎖が完全に離れなかった。DTT濃度が25mMの場合は、軽鎖・重鎖がほとんどの場合で完全に離れたが、極めて少ない場合は試料のクロマトグラフィーによる分離が不十分であった。DTT濃度が50〜100mMの場合は、全ての抗体試料の軽鎖・重鎖が完全に離れた。従って、抗体の軽鎖・重鎖の離れとクロマトグラフィーによる分離を確保するため、25〜100mMのDTTを適当の還元剤使用量として0.2〜3μg/μLの抗体に使用する。好ましい使用量は50mMである。
抗体A 5μg若干部をそれぞれ6Mのグアニジン塩酸塩溶液10μLに添加し、また0.5M のDTT溶液2μLを添加した。最後に、DTT終濃度が50mMとなるように6Mのグアニジン塩酸塩溶液を適量添加した。37℃、50℃、65℃の3つの反応温度および20min〜120minの反応時間は抗体IgG1の軽鎖・重鎖の分離および末端修飾の結果に対する影響を考察した。クロマトグラフィーおよび質量分析の条件は実施例1.1と同様であった。
最適化された実験条件(抗体A 5μg若干部をそれぞれ6Mのグアニジン塩酸塩溶液10μLに添加し、さらに0.5MのDTT溶液2μLを添加した。最後に、DTT終濃度が50mMとなるように6Mのグアニジン塩酸塩溶液を適量添加し、65℃で45min反応させた。)で、本発明の方法で抗体Aのグリコシル化、N末端ピログルタミン酸環化およびC末端脱リジンを測定する際の精密度と再現性を評価した。クロマトグラフィーおよび質量分析の条件は実施例1.1と同様であった。データの処理方法は実施例1.2 と同様であった。
逆相高速液体クロマトグラフィーを用い、移動相の溶出勾配がクロマトグラフィーによる軽鎖・重鎖の分離に対する影響を考察した。試料として抗体A 5μgを用いて6Mのグアニジン塩酸塩溶液10μLに添加し、さらに0.5MのDTT溶液2μLを添加した。最後に、DTT終濃度が50mMとなるように6Mのグアニジン塩酸塩溶液を適量添加し、65℃で45min反応させた。異なる移動相勾配により反応生成物を分離し、そのほかのクロマトグラフィーの条件および質量分析の条件は実施例1.1と同様であった。移動相Xは0.1%のメタン酸水溶液、移動相Yは0.1%のメタン酸アセトニトリル液、流速は0.4mL/minであった。下記のように溶出勾配を4つ考察した。
勾配2:0〜5min、10%Y;5〜5.1min、10%〜25%Y;5.1〜8min、25%〜27%Y;8〜18min、27%〜30%Y; 18〜18.1min、30%〜90%Y;18.1〜21.0min、90%Y;21.0〜21.1min、90%〜10%Y、21.1〜24.0min、10%Y。
勾配3:0〜5min、10%Y;5〜5.1min、10%〜25%Y;5.1〜8min、25%〜26%Y;8〜18min、26%〜28%Y; 18〜18.1min、28%〜90%Y;18.1〜21.0min、90%Y;21.0〜21.1min、90%〜10%Y、21.1〜24.0min、10%Y。
勾配4:0〜5min、10%Y;5〜5.1min、10%〜25%Y;5.1〜6min、25%〜26%Y;6〜10min、26%〜27%Y; 10〜15min、27%〜32%Y;15〜15.1min、32%〜90%Y;15.1〜18.0min、90%Y;18.0〜18.1min、90%〜10%Y、18.1〜21.0min、10%Y。
最適化された移動相溶出勾配(0〜5min、10%Y;5〜5.1min、10%〜25%Y;5.1〜6min、25%〜26%Y; 6〜10min、26%〜27%Y;10〜15min、27%〜32%Y;15〜15.1min、32%〜90%Y;15.1〜18.0min、90%Y; 18.0〜18.1min、90%〜10%Y、18.1〜21.0min、10%Y)を用いて、質量分析のパラメーターがベースライン分離後の軽鎖および重鎖の質量分析シグナルに対する影響を考察した。コーンガス流量、脱溶媒ガス流量および脱溶媒温度などは、質量分析のシグナルに対する影響が少ないため、ほとんど質量分析計製造会社に勧められたパラメーターを採用する。本発明の方法では、コーン電圧を最適化した。試料として抗体A 5μgを用いて、6Mのグアニジン塩酸塩溶液10μLに添加し、さらに0.5MのDTT溶液2μLを添加した。最後に、DTT終濃度が50mMとなるように6Mのグアニジン塩酸塩溶液を適量添加し、65℃で45min反応させた。実施例1.1と同様のクロマトグラフィー条件で反応生成物を分離し、質量分析法におけるコーン電圧をそれぞれ20V、25V、30Vおよび40Vと設定し、そのほかのクロマトグラフィーの条件は実施例1.1と同様であった。電圧の昇圧に伴い、軽鎖・重鎖のトータルイオン流(ピーク面積)がいずれも増加するが、図4A〜図4Dに示すように、重鎖のデコンボリューションによる分子量の質量分析のシグナルは20〜25Vの範囲で顕著に増加し、25〜30Vの範囲で顕著に増加せず、40Vで顕著に低下することがわかった。従って、本発明の方法では、質量分析におけるコーン電圧を25〜30Vと設定した。
Claims (13)
- 免疫グロブリンの精製プロセスにおける試料のグリコシル化および末端修飾状況を測定する方法であって、
(1)カチオン交換クロマトグラフィーにより免疫グロブリンを分離し、保持時間の違う画分をそれぞれ収集する工程と、
(2)工程(1)で得られた免疫グロブリンの画分を変性剤により変性させた後、還元剤により還元させることで、軽鎖と重鎖を離させる工程と、
(3)逆相高速液体クロマトグラフィーにより工程(2)で得られた免疫グロブリンの軽鎖と重鎖を分離する工程と、
(4)質量分析法により工程(3)で得られた軽鎖と重鎖の分子量を測定する工程と、
(5)工程(3)で得られたクロマトグラムのデータおよび工程(4)で得られた質量分析法のデータを解析することで、免疫グロブリンのグリコシル化および末端修飾状況を測定する工程とを含み、
前記工程(5)において、工程(3)で得られたクロマトグラムのピーク面積から免疫グロブリンの軽鎖のN末端におけるピログルタミン酸化の割合を計算し、工程(4)で得られた質量分析のデータから免疫グロブリンの重鎖におけるグリコシル型の含有量およびN末端におけるピログルタミン酸化の割合並びにC末端における脱リジンの割合を計算することを特徴とする、方法。 - 前記工程(1)において、通常の強カチオン交換クロマトグラフカラムを採用し、試料用緩衝液として20mMのリン酸ナトリウム緩衝液を使用し、溶出用緩衝液として20mMのリン酸ナトリウムと1Mの塩化ナトリウムを含む緩衝液(pH=6.0)を使用し、紫外吸收280nmで溶出画分を監視することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記工程(2)において、反応溶液における終濃度が0.2〜3μg/μLとなるような所定量の免疫グロブリンに1〜6Mのグアニジン塩酸塩水溶液10〜30μLを加えて均一に混ぜた後、反応溶液における終濃度が25〜100mMとなるようにジチオトレイトール(DTT)水溶液1〜4μLを加えることで、免疫グロブリンを変性・還元させることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記工程(2)において、DTTの終濃度は50mMであることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記工程(2)において、免疫グロブリンを変性・還元させる反応温度は50〜65℃であり、反応時間は45〜120分であることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記工程(2)において、免疫グロブリンを変性・還元させる反応温度は65℃であり、反応時間は45分であることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記工程(3)において、C4逆相高速液体クロマトグラフィーにより工程(2)で得られた免疫グロブリンの軽鎖と重鎖を分離することで、前記軽鎖と重鎖のベースライン分離を実現することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記工程(4)において、0〜5分に流路を廃液へ、5〜16分に流路を質量分析計へ切り替え、ポジティブモードで質量分析法のデータを採集することで、エレクトロスプレーイオン化質量分析法により工程(3)で得られた軽鎖と重鎖の分子量を測定し、
質量分析法の条件として、コーンガス流量50.0L/Hr、脱溶媒ガス流量800.0L/Hr、脱溶媒温度500℃、コーン電圧20〜40V、スキャン範囲400〜2500Da、スキャン時間1sであることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記コーン電圧は25〜30Vであることを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンのIgG1とIgG2サブタイプであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンのグリコシル化および末端修飾状況は、免疫グロブリンの軽鎖のN末端におけるピログルタミン酸化、および、重鎖におけるアスパラギン結合グリコシル化、重鎖のN末端におけるピログルタミン酸化、並びに、重鎖のC末端における脱リジンを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 請求項1〜12のいずれかに記載の方法の、免疫グロブリンの精製プロセスにおける免疫グロブリンのグリコシル化および末端修飾状況を測定するためのキットへの使用。
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