CN101177453B - 抗人肿瘤坏死因子α的重组嵌合抗体 - Google Patents

Abstract

本文描述了与人肿瘤坏死因子α(hTNFα)结合的抗体。并列出抗体重链与轻链可变区的核苷酸序列及其衍生的氨基酸序列。将此重链及轻链可变区基因分别与人免疫球蛋白gamma 1(hIgG1)重链的恒定区及人kappa(k)轻链恒定区基因连接成嵌合基因。再以含有此嵌合基因的载体引入宿主细胞株表达抗体蛋白。此重组嵌合抗体蛋白在体外测试可中和hTNFα的活性，适用于治疗分泌过多有害的hTNFα的病患，包括某些炎症，如类风湿性关节炎与节段性回肠炎。

Description

抗人肿瘤坏死因子α的重组嵌合抗体

技术领域

本发明涉及免疫学领域，特别是嵌合抗体及其用途，具体的说是抗人肿瘤坏死因子α的重组嵌合抗体及其用途。

背景技术

人肿瘤坏死因子α(hTNFα)是一种由许多细胞类型(包括巨噬细胞，肥大细胞和淋巴细胞)产生的细胞因子。人TNFα的生物活性通过两种不同的受体(p55与p75)进行信号传导，对炎症与免疫系统有重要的调节作用。各种报导中，据信hTNFα参与许多疾病的病理生理学，包括脓毒症，自身免疫疾病，移植排斥，感染病与肠功能紊乱症(参见，例如Vasilli，P.，Annu.Rev.Immunol.10：411-452，1992；Tracey，K.，和Cerami，A.，Annu.Rev.Med.45：491-503，1994)。由于hTNFα在许多病患中是有害的，抑制或中和hTNFα活性的拮抗剂会是有效的治疗策略。这类hTNFα拮抗剂与体内的hTNFα结合，使其不能到达受体，进而避免信号传导引发的后果。

合适的hTNFα拮抗剂包括抗hTNFα抗体，hTNFα受体及其可溶性片段等。目前有三种hTNFα拮抗剂可用来抑制体内hTNFα的活性，治疗病患时可减轻其疾病症状与进程。其中两种属于中和抗体，包括infliximab(Remicade)，为抗hTNFα的嵌合单克隆抗体(参见，例如Le，J.等人的美国专利5,919,452号，和中国专利公布1,468,308A号)；以及adalimumab(Humira)，为抗hTNFα的人单克隆抗体(参见，例如Salfeld，J.，等人的美国专利6,090,382号，美国专利公布20060024293A号，和中国专利公布1,215,407A号)。另一种拮抗剂是受体可溶性片段，etanercept(Enbrel)为p75hTNFα受体与人IgG Fc的融合蛋白(参见，例如Smith，C.，等人的美国专利5,945,397号和6,572,852号)。这些药物已在欧美多国得到审核批准，用以治疗某些由于分泌过多hTNFα的病症，包括类风湿性关节炎，节段性回肠炎，牛皮癣关节炎等。此外，并有报导CDP571(抗hTNFα人源化单克隆抗体，参见，例如Adair，J.等人的美国专利5,994,510号和欧洲专利0,927,758号)和CDP870(抗hTNFα人源化抗体Fab’片段的聚乙二醇衍生物)亦在不同阶段的临床试验中，显示药效。

许多报道提及与hTNFα结合的小鼠抗体，亦可在体外测定中和rhTNFα的活性(参见，例如Hirai，M.，等人J.Immunol.Methods，96:57-62，1987；Moller，A.，等人Cytokine2:162-169，1990)。鼠源抗体在人体内治疗的应用是极受限制的，不仅是因为血清半衰期短，且其恒定区一般不能诱导人体效应子功能。此外，非人单克隆抗体更可被人宿主识别为外来蛋白，反复注射此类外来抗体将导致有害的免疫原性反应，通常统称为人抗鼠抗体(HAMA)反应。而且，这些外来抗体可能受到宿主免疫抗体的攻击，其结果使得它们在呈现药效之前被中和掉。

因此，本领域仍然需要能够治疗hTNFα有关病症的、更安全有效的嵌合抗体。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种比现有技术中的小鼠抗体更加安全可靠的、在人体内半衰期更长、功能更显著的嵌合抗体。

在本发明的一个方面，公开了一种与人肿瘤坏死因子α结合的嵌合抗体，其特征在于，该嵌合抗体的重链可变区的CDRH1为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，CDR-H2为SEQ ID NO：4所示氨基酸序列，和CDR-H3具有SEQ IDNO：5所示氨基酸序列；以及

该嵌合抗体的轻链可变区的CDR-L1为SEQ ID NO：8所示氨基酸序列，CDR-L2为SEQ ID NO：9所示氨基酸序列，和CDR-L3为SEQ ID NO：10所示氨基酸序列。

在该方面的一个优选例中，该嵌合抗体的重链可变区为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在该方面的另一个优选例中，该嵌合抗体的轻链可变区为SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。

在该方面的还有一个优选例中，其重链恒定区序列是人IgG1的重链恒定区序列。

在该方面的还有一个优选例中，该嵌合抗体的轻链恒定区序列是人κ抗体轻链恒定区序列。

在第二个方面，本发明提供了编码权利要求1的嵌合抗体的分离核酸。

在第三个方面，本发明提供了含有上述核酸的表达载体。

在第四个方面，本发明提供了用上述表达载体转染的宿主细胞。

在本发明的第五个方面，提供了一种药物组合物，含有上述嵌合抗体和药物学上可接受的载体。

在本发明的第六个方面提供了上述嵌合抗体的用途，用于制备抑制或中和hTNFα活性的药物。优选该药物用于治疗脓毒症、自身免疫疾病、移植排斥、感染病、肠功能紊乱症、类风湿性关节炎、节段性回肠炎、或牛皮癣关节炎。

在本发明的第七个方面，提供了一种治疗方法，该方法包括将上述嵌合抗体、核酸、表达载体或宿主细胞施给hTNFα活性异常的个体。

附图说明

图1显示抗hTNFα鼠源抗体对经HRP标记的抗hTNFα人抗体Humira与hTNFα的竞争结合测定。抗hTNFα鼠源抗体TM2-11-12与未标记的Humira具有同等优良的竞争能力。

图2显示抗hTNFα鼠源抗体(TM2-11-12，TM2-10-20，TM2-2-2)在L929细胞毒性测定中抑制hTNFα的能力。TM2-11-12具有与Humira相似的能力中和rhTNFα引起的L929细胞毒性。

图3显示抗hTNFα鼠单克隆抗体TM2-11-12的重链可变区的核苷酸序列(示于SEQ ID NO:1)及其演绎的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。以下划线标出互补决定区的氨基酸残基CDR-H1(SEQ ID NO:3)，CDR-H2(SEQ ID NO:4)和CDR-H3(SEQ ID NO:5)。

图4显示抗hTNFα鼠单克隆抗体TM2-11-12的轻链可变区的核苷酸序列(示于SEQ TD NO：6)及其演绎的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。以下划线标出互补决定区的氨基酸残基CDR-L1(SEQ ID NO:8)，CDR-L2(SEQ ID NO:9)和CDR-L3(SEQ ID NO:10)。

图5显示了适用于生产抗hTNFα嵌合抗体C2-11-12的重链(A)与轻链(B)的表达载体。嵌合基因是用TM2-11-12鼠源抗体的重链与轻链可变区基因分别与人IgGl的重链恒定区及人κ轻链恒定区基因连接而成的。

图6显示嵌合抗体C2-11-12纯化蛋白与Humira抗体的竞争结合测定。

图7显示嵌合抗体C2-11-12纯化蛋白在L929细胞毒性测定中抑制hTNFα的能力。

具体实施方式

本发明的抗hTNFα嵌合抗体含有源自人和非人成份的抗体(参见，例如Cabilly，S.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：3273-3277，1984；Morrison，S.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6851-6855，1984；Sun，L.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：214-218，1987)。其可变区源自小鼠，具有结合与中和hTNFα的特性。其恒定区则与人IgGl重链及K轻链的恒定区完全一样。人IgGl在人体半衰期可达21天，而且具有效应子功能，可介导补体和抗体依赖性细胞毒性途径。因此，本发明的嵌合抗体比鼠源抗体更适用于病患，不仅对人体使用具有更高的相容性和安全性，并且在人体内能停留的时间更长，更有效。因此，本发明的嵌合抗体可治疗人体内由于过多hTNFα所引起的炎症与其他病症。

各种形式的抗体被包括在本发明之中。例如，抗hTNFα抗体可以是全长的抗体(例如具有完整的人Fc区)，或是抗体片段(如Fab、Fab’或F(ab’)₂)。此外，抗体可以用可检测的标记物进行标记，固定在固相载体上，和/或偶联于异源化合物(如细胞毒性物质)。

抗体的诊断和治疗用途被包括在内。在一种诊断应用中，本发明提供了一种确定TNFα是否存在的方法，它包括：将怀疑含有TNFα的样品暴露于本发明的抗体，然后测定抗体与样品的结合。对于该应用，本发明提供了一试剂盒，它含有抗体和使用抗体来检测TNFα的说明书。

本发明还提供了：分离的编码该抗体的核酸；含有该核酸的载体，其中该核酸可任选地操作性连接于被载体所转化的宿主细胞所识别的控制序列；含该载体的宿主细胞；产生该抗体的方法，它包括培养该宿主细胞从而表达核酸，以及任选地从宿主细胞培养物(如从宿主细胞培养液中)中回收抗体。本发明还提供了一种组合物，它含抗-TNFα抗体和药学上可接受的载体或稀释剂。用于治疗的组合物是灭菌的并且可以是冻干的。本发明还提供了治疗由于hTNFα异常而导致的疾病的人的方法，它包括将治疗有效量的抗-TNFα抗体施用于人。这些疾病包括脓毒症、自身免疫疾病、移植排斥、感染病、肠功能紊乱症、类风湿性关节炎、节段性回肠炎、或牛皮癣关节炎。

本文的术语“治疗”指治疗性处理和预防性或防御性措施。需要治疗者包括已经患病以及要预防疾病的生物。

“抗体(Ab)”和“免疫球蛋白(Ig)”是有相同结构特征的糖蛋白。抗体表现出对特异抗原的结合特异性，而免疫球蛋白包括抗体和缺少抗原特异性的抗体样分子。后一类多肽可由例如淋巴系统低水平地产生，而由骨髓瘤高水平地产生。

“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”是约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。据信特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中被称为高变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区(分别是FR1、FR2、FR3和FR4)，它们大致上呈b-折叠构型，由三个高变区相连。这些高变区形成连接b折叠结构的环并且在某些情况下是b折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的高变区一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，(5th版)，Public Health Service，National Instistutes of Health，Bethesda，MD(1991)，第647-669页)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应子功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

如本文所用，术语“高变区”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包括来自“互补决定区”即“CDR”的氨基酸残基和/或来自“高变环”的残基(即以及重链可变区的残基。

木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，每个片段有单个抗原结合位点)以及一个残余的“Fc”片段(该名称反映了其容易结晶的能力)。用胃蛋白酶处理产生了一个F(ab′)₂片段，该片段有两个抗原结合位点，并仍能与抗原交联。

Fab片段还含有轻链的恒定区和重链的第一个恒定区(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于，在重链CH1区的羧基端多几个残基(包括来自铰链区的一个或多个半胱氨酸)。F(ab′)₂抗体片段最初是以Fab′片段对的形式产生的，在其间有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联方式也是已知的。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为kappa(k)和lambda(1))中的一类。

根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG4、IgA-1和IgA-2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为a、d、e、g、和m。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。

术语“抗体”被最广义地使用，并且具体地包括：单克隆抗体(包括全长的单克降抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、以及抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性即可。

“抗体片段”包括完整抗体的一部分，通常是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；二体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

本文所用的术语“单克隆抗体”指从一类基本均一抗体获得的抗体，即该群体中包含的各抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变之外。单克隆抗体是高特异性的，针对单个抗原位点。而且，与常规的(多克隆)抗体制剂(它通常是包括针对不同的决定簇(表位)的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性-即从基本均一的抗体群中获得的，而不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等，Nature，256：495(1975)首先提出)制得，或可用重组DNA方法(例如参见美国专利No.4,816,567)制得。“单克隆抗体”还可利用例如Clackson等人，自然(Nature)352：624-628(1991)和Marks等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222：581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体文库中分离得到的。

单克隆抗体在此特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的

一部分与某一特定物种的抗体对应序列相同或同源，或是属于特定的抗体类别或亚类，而链的其余部分则与另一物种的抗体对应序列相同或同源、或是属于另一种抗体类别或亚类，以及这种抗体的片段，只要该片段具有所需的生物活性即可(美国专利No.4,816,567和Morrison等人，美国科学院院报81：6851-6855(1984))。

“人源化”形式的非人(如鼠)抗体是嵌合的抗体，它们含有非人免疫球蛋白的最小序列。对于大多数情况，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者高变区残基被非人源(供者抗体)(例如有所需特异性、亲和力和活性的小鼠、大鼠、兔或非人灵长动物抗体)的高变区残基所代替。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基可被对应的非人残基代替。另外，人源化的抗体可包括既不存在于受者抗体、又不存在于供体抗体的残基。这些修饰能进一步提高抗体的性能。通常，人源化抗体包含了基本上所有的(至少一个、通常两个)可变区，其中所有或基本上所有的高变区对应于非人免疫球蛋白的高变区，而所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体最好还包括免疫球蛋白(通常是人免疫球蛋白)恒定区(Fc)的至少一部分。更详细的情况可参见Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann等人，Nature，332：23-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)。

“分离的”抗体是经鉴定的和分离和/或回收自其天然环境组份的抗体。其天然环境中的污染组份是指会干扰所述抗体的诊断或治疗性用途的物质，可包括酶、激素和其它蛋白质类或非蛋白质类溶质。在优选实施方案中，抗体纯化至(1)经Lowry法测定，按重量计抗体纯度高于95％，最好高于99％，(2)其纯度足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个N末端残基或内部氨基酸序列，或者(3)用Coomassie蓝或最好用银染色法，经还原或非还原条件下SDS-PAGE测定时达到均质。分离的抗体包括存在于重组细胞内的原位抗体，因为该抗体天然环境的至少一种组份是不存在的。但是，通常，分离的抗体是经至少一步纯化步骤制备的。

术语“标记的”在此表示抗-hTNFα抗体被融合于“标记”。所述标记可以是“表位标记”(epitope tag)，它应具有足够的残基来形成可产生其对应抗体所需的表位，但又短到不至于影响hTNFα抗体的活性。表位标记宜具有相当的独特性，以致针对其的抗体基本上不与其它表位交义反应。适宜的标记多肽一般具有至少6个氨基酸残基，一般介于约8至50个氨基酸残基(以约9至30个残基为宜)。例子包括flu HA标记多肽及其抗体12CA5(Field等人，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)8：2159-2165(1988))；c-myc标记及其抗体8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10(Evan等人，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)5(12)：3610-3616(1985)；和单纯性疱疹病毒糖蛋白D(gD)标记及其抗体(Paborsky等，Protein Engineering3(6)：547-553(1990))。在某些例子中，表位标记是“补救受体结合表位”。如本文所用，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位，它负责提高IgG分子在体内血清半衰期。

本发明的抗体还可以与细胞毒剂联合。术语“细胞毒剂”在此指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90、和Re186)、化疗剂和毒素(例如来自细菌、真菌、植物或动物的酶活毒素或其片段)。

本发明的抗体还可以与化疗剂联合。“化疗剂”是用于治疗癌症的化合物。化疗剂包括例如阿霉素(Adriamycin)、阿霉素(Doxorubicin)、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、塞替派、白消胺、Taxotere(docetaxel)、细胞毒素、红豆杉醇、甲氨蝶呤、顺氯铵铂、美法仑、长春碱、博来霉素、依托泊甙、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞宾、卡铂、替尼泊甙、道诺霉素、洋红霉素、氨基蝶呤、放线菌素D、丝裂霉素、Esperamicins(参见美国专利4,675,187)、美法仑以及其它相关的氮芥。

词语“标记”在此指直接或间接与抗体偶联的可检测化合物或组合物。标记自身可以被检测到(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者，如果是酶标记，它们可催化化合物或组合物底物发生可检测的化学转变。

“固相”指本发明抗体可吸附于其上的非液态基质。固相的例子在此包括：部分或完个由玻璃(例如可控多孔玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅氧烷构成的固相。在某些实施方案中，根据上下文，固相可能包括测试板的孔；而在其它实施方案中，可能是纯化柱(例如亲和色谱柱)。该术语还包括分散的颗粒构成的不连续固相，如美国专利No.4,275,149中所述的。

“分离的”核酸分子是经鉴定的，并且与通常与之相伴存在于该抗体核酸天然来源中的至少一种污染核酸分子分离的核酸分子。分离的核酸分子不是其天然形式或处于其天然环境中。所以，分离的核酸分子与存在于天然细胞内的核酸分子在形式上是不同的。但是，分离的核酸分子包括正常表达抗体的细胞内所含的核酸分子，例如，该核酸分子可以位于不同于天然细胞内的某个染色体位置上。

术语“调控序列”指在特定的宿主微生物内表达与之可操作性连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适合原核细胞的调控序列包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知，真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和加强子。

当与另外的核酸序列形成功能关联的时，核酸是“操作性相连的”。例如，前序列(presequense)或分泌性前导序列的DNA是与多肽的DNA操作性相连的，如果它被表达成参与多肽分泌的前蛋白原(preprotein)；启动子或增强子是与编码序列操作性相连的，如果它影响序列的转录；或者，核糖体结合位点是与编码序列操作性相连的，如果它的位置能够促进翻译。通常，“操作性相连”指相连的DNA序列是毗邻的，而在分泌性前导序列情况下，是毗邻的并处于同一阅读框下。然而，增强子不必毗邻。可通过方便的限制性位点处的连接来实现相连。如果这样的位点不存在，则可按常规实践采用合成的寡核苷酸衔接子或接头。

在本文中，“细胞”“细胞系”和“细胞培养物”是互换使用的，而且所有这些名称都包括子代。所以，词语“转化体”和“转化细胞”包括原代细胞及其衍生的培养物(不论传代多少次)。还应理解，由于有意或无意的突变，所有子代也许在DNA内容上并不精确相同。它包括了筛选出的，具有与原始转化细胞相同功能或生物活性的突变型子代。当采用不同的命名时，可以从上下文中明显看出。

为了便于保存，可以通过将具有要求纯度的抗体与任选的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，制成冻干制剂或水溶液形式的抗体治疗用制剂(《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)第16版，Osol，A.编(1980))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用剂量和浓度对接受者是无毒的，它们包括例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸的缓冲液；包括维生素C和甲硫氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂(例如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；氯化苯甲烃铵；氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环已醇；3-戊醇；和间甲苯酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖或其它糖，其中包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如吐温TMPluronicsTM或聚乙二醇(PEG)。

本发明制剂还可以包含一种以上治疗特殊状况所需的活性混合物，它们最好具有互补的活性但是不相互产生负影响。所述分子，以适合各自预定目的所需的有效含量相互组合。

活性成份还可以包裹在分别通过凝聚法或界面聚合法制备的例如羟甲基纤维素或明胶胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中。亦可在胶态药物释放系统(例如脂质体、白蛋白微珠、微乳液、毫微颗粒和毫微胶囊)或粗滴乳液(macroemulsion)。(《雷明顿药物科学》(Remington’s PharmaceuticalSciences)第16版，Osol，A.编(1980))中叙述了此类技术。

用于体内使用的制剂必须是无菌的。通过灭菌滤膜过滤可以方便地做到这一点。

可以制备缓释制剂。合适的缓释制剂包括例如包含所述抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质体，所述的基质体是有形的物体，例如膜或微胶囊。合适的缓释基质体包括例如聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸g乙酯的共聚物、非降解性乙烯乙酸乙烯酯、诸如Lupron DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和leuprolideacetate组成的可注射微球)之类可降解乳酸-乙醇酸共聚物和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。诸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸之类聚合物能够使分子释放持续100天以上，有些水凝胶可在较短的时间内释放蛋白质。当胶囊化的抗体在体内保留较长时间时，它们可能会因为在37℃接触水分而变性或凝聚，结果造成生物活性降低并可能造成免疫原性改变。根据有关的机制可以设计出合理的稳定化策略。例如，如果发现凝聚机制是通过硫-二硫键互换反应而形成了分子间的S-S键，稳定化可以是通过修饰巯基残基、冻干酸性溶液、控制含水量、使用合适的添加剂和设计特殊的聚合基质组合物而达到。

本发明的抗体可以用作亲和纯化试剂。在这种方法中，抗体利用本领域公知的方法固定在例如Sephadex树脂或滤纸的固相上。被固定的抗体与待纯化的含hTNFα的样品接触，然后用合适的溶剂洗涤载体，所述的溶剂能够基本上去除样品中除了与固定化抗体结合的hTNFα之外所有其它物质。

抗hTNFα抗体还可以用于hTNFα的诊断性分析中，例如检测其在特定细胞、组织或血清中的表达。这种诊断方法可用于诊断自身免疫疾病等的病因。

用于诊断时，抗体通常用可检测分子进行标记。有许多标记可以使用，它们可以大致如下分类：

(a)放射性同位素，例如35S、14C、125I、3H和131I。可以利用例如《现代免疫学方法》(Current Protocols in Immunology)第1和第2卷，Coligen等编，Wiley-Interscience，New York，New York，Pubs.(1991)中所述的方法以放射性同位素来标记抗体，放射性可以利用闪烁计数法来测定。

(b)荧光标记，例如稀土螯合剂(铕螯合剂)或萤光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰，丽丝胺，藻红素和德克萨斯红(Texas red)。荧光标记可以利用例如上文《现代免疫学方法》中所述的方法与抗体偶联。荧光可以利用荧光计来定量。

(c)有各种酶底物标记可供使用，而美国专利4,275,149公开了其中部分。所述的酶通常催化可以用各种技术测定的生色底物的化学改变。例如，酶催化底物的颜色变化，这种变化可以用分光光度计来测定。或者，酶改变底物的荧光性或化学发光性。前文已经说明了定量测定荧光变化的技术。化学发光底物因化学反应而被电激发，并由此发光，发出的光可以被测定(例如利用化学光度计)或向荧光受体供能。酶标记包括例如萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利4,737,456)，萤光素，2，3-二氢二氮杂萘二酮(2，3-dihydrophthalazinediones)，苹果酸脱氢酶，脲酶，过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)，碱性磷酸酶，b-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)，乳过氧化物酶，微过氧化物酶等。O’Sullivan等在“制备用于酶免疫分析的酶-抗体偶联物的方法”，《酶学方法》(“Methods for thePreparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in EnzymeImmunoassay”(Methods in Enzym.)(J.Langone和H.Van Vunakis编)，Academic press，New York，73：147-166(1981)中描述了酶与抗体偶联的技术。

酶-底物的组合包括，例如：

(i)辣根过氧化物酶(HRPO)和作为底物的氢过氧化物酶，其中的氢过氧化物酶使染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或盐酸3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB))氧化；

(ii)碱性磷酸酶(AP)和作为生色底物的对硝基苯磷酸；

(iii)b-D-半乳糖苷酶(b-D-Gal)和生色底物(例如对硝基苯-b-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-methylumbelliferyl-b-D-半乳糖苷酶。

对本领域技术人员来说还有许多其它酶-底物组合。对这些组合的综述可参见美国专利4275149和4318980。有时，标记物与抗体间接偶联。技术人员也知道各种获得所述组合的方法。例如，抗体可以与生物素偶联，上述三大类标记中的任何一种都可以与亲和素偶联，或者正相反。生物素选择性地结合亲和素，标记可以间接方式与抗体偶联。或者，为了将标记与抗体间接偶联，抗体可以与小的半抗原(例如地高辛)偶联，而上述不同类型的标记之一与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)偶联。这样就获得的标记与抗体的间接偶联。

在本发明另一实施方案中，抗hTNFα抗体不必被标记，其存在可以利用标记过的结合该hTNFα抗体的抗体来检测。

本发明抗体可以用在任一种已知的分析方法中，例如竞争性结合分析，直接或间接火心分析和免疫沉淀分析。Zola，《单克隆抗体：技术手册》(MonocloneAntibodies:A Manual of Techniques)，pp.147-158(CRC Press，Inc.，1987)。

竞争性结合分析依赖于标记过的标准物与被测样品中分析物竞争结合有限量抗体的能力。被测样品中hTNFα的量与与抗体结合的标准物的量成反比。为了方便测定被结合标准物的量，通常令抗体在竞争前或竞争后不溶解，这样就可以方便地将与抗体结合的标准物和分析物与未结合的标准物和分析物分离。

火心分析法涉及使用两种抗体，各自结合待测蛋白不同的免疫原性部位或表位。在火心分析中，被测样品分析物与固定在固相载体上的第一抗体结合，然后第二抗体与分析物结合，由此形成不溶性三部分复合物。参见美国专利4,376,110。第二抗体本身可以是用可检测部分标记过的(直接夹心分析法)，或者利用被可检测部分标记的抗免疫球蛋白抗体来测定(间接夹心分析法)。例如，夹心分析法之一是ELISA，其中的可检测部分是酶。

对于免疫组织化学来说，肿瘤样品可以是新鲜的或者冷冻的或者包在石蜡和以福尔马林之类防腐剂固定的。

抗体还可以用于体内诊断分析。通常，以放射性核素(例如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)标记抗体，使得可以利用免疫闪烁照相术来定位患病部位。

为了方便，本发明抗体可以试剂盒的形式提供，即将预定量的试剂与进行诊断分析的说明书的包装组合在一起。如果抗体是用酶标记的，试剂盒将包含酶所需的底物和辅因子(例如提供可测定的生色团和荧光团的底物前体)。此外，还可能包括其它添加剂，例如稳定剂、缓冲剂(例如封闭缓冲剂或裂解缓冲剂)等。为了使所提供的试剂浓度能使得分析的灵敏度最高，各种试剂的相对量变化很大。具体地说，试剂可以是干粉，通常是冻干粉末形式的，可包括赋形剂在内，它们一经溶解将形成具有合适浓度的试剂溶液。

对于治疗用途，可将上述的在药学上可接受的剂型中的本发明抗-hTNFα抗体，用已知方法施用于人。所述方法包括在静脉内(例如静脉注射浓缩药团(bolus)或在一段时间内连续输注)、肌内、腹膜内、脑脊髓腔内、皮下、动脉内、滑膜腔内、鞘内注射、口服、局部或吸入途径使用。抗体还可合适地通过瘤内、瘤周围、损伤部位内、损伤部位周围的途径给药，以发挥局部和全身的治疗效果。腹膜内途径预计特别有用，例如对于治疗卵巢癌。

为了预防或治疗疾病来说，抗体的合适剂量将取决于上述定义的待治疾病的类型、疾病的严重程度和病程、抗体给予是用来预防还是用来治疗、以前的治疗情况、患者病史和对抗体的应答性，以及主治医师的独立判断。抗体适合一次性或系列地给患者使用。

根据疾病的类型和严重程度，不论是一次或多次分开给药，还是连续输注，1微克/公斤至50毫克/公斤(例如0.1-20毫克/公斤)的抗体是给患者使用的最初候选剂量。典型的日剂量或周剂量可在约1微克/公斤-20毫克/公斤或以上，这取决于上述捉到的因素。对于几天或更长时间内的重复给药(这取决于病况)来说，治疗需持续直至疾病症状发生所期望的抑制。但是，也可以使用其它给药方案。所述治疗的进展可以方便地利用常规技术和分析方法来监测。

本发明另一实施方案提供了一种含有用于治疗上述疾病的材料的产品。该产品包括容器和标签。合适的容器包括例如普通瓶、药瓶、注射器和试管。容器可以用各种材料制成，例如玻璃或塑料。容器中含有治疗疾病的有效组合物，并具有一个无菌的出入口(例如容器可以是一个有塞子的静脉输液袋或药瓶，该塞子可用皮下注射针头穿透)。该组合物中的有效成份是抗hTNFα抗体。容器上或与容器相联的标签说明组合物所治疗的特定病症。产品还可以含有另一个容器，其中包含药学上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液、林格氏(Ringer)溶液和葡萄糖溶液。根据商业上的需要或使用者的需要，它还可以包括其它材料，例如其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器、以及附有使用说明的包装说明书。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1抗hTNFα鼠单克隆抗体的生产

以重组hTNFα(rhTNFα，购自PeproTech Inc.)20μg在完全辅佐剂中给四周龄的BALB/c小鼠皮下注射。每三至四星期注射一次，一共五次。最后，并在腹膜内单次注射20μg rhTNFα。经血清测试后，鉴定出含有高水平抗hTNFα抗体血清的小鼠。取出该小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤Sp2/O细胞株相融合。混合5×10⁸Sp2/O细胞与5×10⁸脾细胞在50％聚乙二醇(PEG，分子量为1450)和5％二甲基亚碸(DMSO)溶液中融合。用Iscove培养基(含有10％胎牛血清，100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素，0.1mM次黄嘌呤，0.4μM氨基蝶呤和16μg胸苷)来调整脾脏细胞数至7.5×10⁵/ml，以0.2ml加入96孔培养板的孔内。置于37℃5％CO₂的培养箱内。10天后，取出各孔内的培养基测试其中鼠源抗体对Humira与rhTNFα结合的抑制作用。

实施例2抗hTNFα鼠源抗体的定性：

抗hTNFα抗体的定性有两种测定法。一种方法是测定抗体对Humira与hTNFα的竞争结合，另一种方法是测定抗体在L929细胞毒性测定中和hTNFα的能力。下文中分别对这两种方法及其实验结果进行了描述。

1.与Humira抗体的竞争结合测定

以辣根过氧化物酶(HRP，Boehringer Manheim)标记抗hTNFα人抗体Humira(Abbott)作为试剂。将rhTNFα(50μl，0.05μg/ml)包被酶标板(CorningLife Sciences)，室温过夜。弃去包被溶液，用溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)的1％脱脂奶封闭各孔0.5小时，用含有0.05％吐温(Tween)20的PBS洗孔。然后每孔加入50μl生长培养基(DMEM+5％FBS，Invitrogen)与50μl HRP标记的Humira抗体(250ng/ml)的混合液。以未标记的Humira和不含抗体的培养基分别作为阳性与阴性对照。将含有能够抑制HRP标记Humira与rhTNFα结合的单克隆抗体的孔内融合细胞放大并亚克隆，选出数个表现出此抑制作用的鼠单克隆抗体，继续进一步分析数个表现出此抑制作用的鼠单克隆抗体。其中，得到鼠单克隆抗体TM2-11-12与TM2-6-3，测定结果示于图1。鼠抗体TM2-6-3在高达1μg/ml浓度时，只能竞争掉约50％Humira与hTNFα的结合。另一个鼠抗体TM2-11-12则显示与未标记的Humira具有同等优良的竞争能力，在大约0.05μg/ml浓度时(相当于3x10^-10M)，即可竞争掉约50％Humira与hTNFα的结合。

2.抗hTNFα鼠源抗体的定性：体外中和hTNFα的活性测定

抗hTNFα鼠源抗体与嵌合抗体中和hTNFα的生物活性皆可用L929细胞毒性测定，方法如下所述。将96孔培养板的每孔注入共7.5×10³L929细胞(ATCC)(10⁵/ml，75μl)，置于37℃5％CO₂的培养箱内24小时。L929细胞的生长培养基为含有5％胎牛血清的RPMI-1640(GIBCO)。用另一块96孔培养板将含有抗hTNFα抗体的溶液用RPMI生长培养基双份进行1/2连续稀释，并加入rhTNFα使每个样品孔rhTNFα之最终浓度为5ng/ml，将有混合液的培养板放在37℃5％CO₂的培养箱内2小时后，再将含有抗体与rhTNFα的混合液加入L929细胞孔内，每行各孔抗体浓度依次为0.001至2μg/ml。将此培养板置入37℃5％CO₂。3天后测存活细胞时，加入20μl PBS中有2.5mg/ml溴化3(4，4-二甲基噻唑-2-基)2，5-二苯基四唑翁(MTT；购自Sigma Biochemicals)在37℃培育4小时，再加入100μl0.01N HCl中有10％十二烷基硫酸钠(SDS)过夜。其后测定每孔于540/690nm光密度。将光密度读数与抗体浓度绘制曲线。分析结合曲线得IC₅₀，即在此抗体浓度时，50％的rhTNFα对L929细胞的毒性可被中和。因此可用IC₅₀值来比较各抗体抑制hTNFα细胞毒性的能力。如图2所示，数个抗hTNFα鼠源抗体(TM2-1112，TM2-1020，TM2-2-2)的IC₅₀值与Humira的IC₅₀值皆在0.01至0.04μg/ml浓度范围内，即皆具有相似的能力中和rhTNFα引起的L929细胞毒性。抗hTNFα鼠源抗体TM2-11-12被选作进一步制备嵌合抗体。

实施例3克隆TM2-11-12鼠源抗体的重链与轻链

为表达C2-11-12嵌合抗体，首先须获得编码抗hTNFα鼠源抗体TM2-11-12重链和轻链可变区的DNA片段。用RNA纯化试剂盒(Invitrogen Corp.)从TM2-1112小鼠杂交瘤细胞分离出RNA，以此制备cDNA(GeneRacer试剂盒，lnvitrogen Corp.)。通过聚合酶链反应(PCR)使用5’引物(5’CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’，SEQ ID NO：11)和3’引物(5’TCCAGGGGCCAGTGGATAGACAGA-3’，SEQ ID NO：12)从cDNA中分离重链可变区DNA片段。3’引物与小鼠igG1重链恒定区同源反义。将这些得到的DNA片段克隆进TOPO TA载体(Invitrogen)并测序。所有的重链可变区克隆显示同一核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。此核苷酸序列与其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)列于图3，并以下划线标出互补决定区的氨基酸残基CDR-H1(SEQ ID NO:3)，CDR-H2(SEQ ID NO:4)和CDR-H3(SEQ ID NO:5)。互补决定区的定义参见Kabat E.等人的Sequences of Proteins of Immunological Interest第5版U.S.Department of Heal th and Human Services，NIH Publication No.91-3242。这些克隆中选一用于构建重链嵌合基因，pTOPO-VH。

以相似的PCR方法，使用SEQ ID NO：11作为5’引物和另一个与小鼠免疫球蛋白κ轻链恒定区同源反义的3’引物(5’-CACTGGATGGTGGGAAGATGGATA-3’，SEQID NO:13)，从cDNA中分离轻链可变区DNA片段。将这些得到的DNA片段克隆进TOPO TA载体并测序，发现有两类克隆。约3/4的克隆显示部分核苷酸序列不能翻译成能够通读的氨基酸序列(未显示其序列)。此类克隆为畸变轻链信使RNA，不能编码有功能的抗体轻链蛋白。另外约1/4的克隆显示的核苷酸序列则可完全翻译为能够通读的氨基酸序列。此类克隆衍生于有功能的轻链信使RNA，编码TM2-11-12小鼠杂交瘤轻链的可变区。此克隆pTOPO-Vk用于构建轻链嵌合基因。

实施例4嵌合抗体C2-11-12表达载体的构建

嵌合基因是用TM2-11-12鼠源抗体的重链与轻链可变区基因分别与人IgG1的重链恒定区及κ轻链恒定区基因连接而成的。将得到的重链与轻链嵌合基因分别插入适当的载体，用以表达嵌合抗体。首先，用从人白细胞制备的RNA和合适的5’引物(5’-GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC-3’，SEQ ID NO：14)和3’引物(5’-CGGGATCCTCATTTACCCGGAGACAGGGA-3’，SEQ ID NO：15)，通过逆转录和PCR得到编码人IgGl的重链恒定区(C_γ1)的基因。用DNA测序验证该基因的序列，含有人IgGl的CH1、绞链、CH2和CH3区域。同样以合适的5’引物(5’-CGAACTGTGGCTGC2ACCA-3’，SEQ ID NO：16)和3’引物(5’-TTGAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3’，SEQ ID NO：17)得到编码人κ轻链恒定区(Cκ)的基因。

以pTOPO-VH质粒作为模板通过PCR，使用5’引物(5’-GAGCAAAGCTTTCAGACATCATGGATTGGCTGTGGAA-3’，SEQ ID NO：18)和3’引物(5’-CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGG-3’，SEQ ID NO：19)得到5’片段，含有重链可变区和人C_γ1基因5’端的20个核苷酸。此片段与以上的C

通过PCR，用SEQ ID NO：18作为5’引物和SEQ ID NO：15作为3’引物，将可变区与恒定区片段连接起来，得到含有编码重链嵌合基因，长度约为1400bp的DNA片段。用DNA测序验证该基因的序列。将此重链嵌合基因与二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase，DHFR)基因连接，插入载体如pUC19(Invitrogen)，用以表达嵌合抗体的重链蛋白。

其后再以pTOPO-Vk质粒作为模板通过PCR，使用5’引物(5’-GAACAAAGCTTAAATACACAATGGATTTTCTGG-3’SEQ ID NO：20)和3’引物(5’-AGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTTATTTCCAGCTTGGTC-3’SEQ ID NO：21)得到5’片段，含有轻链可变区和Cκ基因5’端的20个核苷酸。。此片段与以上的Cκ通过PCR，用SEQ ID NO：20作为5’引物和SEQ ID NO：19作为3’引物，将这两个片段连接起来，得到含有编码轻链嵌合基因，长度约为700bp的DNA片段。用DNA测序验证该基因的序列。将此轻链嵌合基因插入哺乳动物表达载体如pcDNA3(Invitrogen)接受载体，用以表达嵌合抗体的轻链蛋白。

图5是适用于生产C2-11-12嵌合抗体的重链与轻链的表达载体的图示。表达载体质粒含有在哺乳动物细胞中高水平表达所需的巨细胞病毒早期基因启动子-增强子。用以表达轻链嵌合抗体蛋白的质粒含有可选择性标记基因，从而在细菌中赋予氨苄青霉素抗性，而在哺乳动物细胞中赋予G418抗性。另外，用以表达重链嵌合抗体蛋白的质粒含有DHFR基因，在合适的宿主细胞中，能以氨甲蝶呤(Methotrexate，MTX，Sigma)共扩增嵌合抗体基因和DHFR基因(参见，例如Axel，R.，等人的美国专利5,179,017号；Kaufman，R.和Sharp，P.，J.Mol.Biol.159：601621，1982)。

实施例5C2-1112嵌合抗体的表达

将上述含有编码重链和轻链基因的重组表达载体质粒(pcDNA-3，Invitrogen)转染入哺乳动物宿主细胞系，以表达抗hTNFαC2-11-12嵌合抗体。为了稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型的中国仓鼠子宫(CHO)细胞(参见，例如Chasin，L.，等人的美国专利4,818,679号)。优选的转染方法是电穿孔，也可以使用其他方法，包括磷酸钙共沉降，脂转染和原生质融合等。在电穿孔中，用设为250V电场和960μFd电容的Gene Pulser(Bio-RadLaboratories)，在比色杯内加入2×10⁷个细胞悬浮在0.8ml的PBS中，并含有10μg用PvuI(Takara)线性化的表达载体质粒DNA。转染2天后，加入含有0.2mg/ml G418以及200nM氨甲蝶蛉(methotrexate或MTX)。为了实现较高水平的表达，用受MTX药物抑制的DHFR基因共扩增转染的嵌合抗体基因。用极限稀释亚克隆转染子。测定各细胞系的分泌率。选出高水平表达C2-1112嵌合抗体的细胞株。收集含有C2-1112嵌合抗体的条件培养基，用于与Humira抗体的竞争结合测定和体外中和hTNF的活性测定。

实施例6.C211-12嵌合抗体的定性

C2-11-12嵌合抗体用抑制HRP标记Humira与rhTNFα结合的测定(如实施例2。1)与中和L929细胞毒性的测定(如实施例2.2)来定性。图6显示在此竞争结合测定中，C2-11-12嵌合抗体与TM2-1112鼠源抗体或未标记的Humira具有同等优良的竞争能力。在低于0.05μg/ml浓度时，即可竞争掉约50％HRP标记Humira与hTNFα的结合。

当C2-11-12用于L929细胞毒性测试中，C2-11-12嵌合抗体与TM2-11-12鼠源抗体或Humira具有相似的能力中和rhTNFα引起的L929细胞毒性。在图7中，C2-11-12，TM2-11-12，与Humira显示相似的IC₅₀值，即50％的rhTNFα细胞毒性被中和时的抗体浓度，低于0.02μg/ml。

将嵌合抗体C2-11-12施给TNFα紊乱的病人，获得了明显效果，并且未观察到不良副作用。此外，在4℃冷冻保藏半年的嵌合抗体C2-11-12的活性与新鲜制备的对照样品相比，活性损失不超过10％。

综上所述，本发明的抗人hTNFα嵌合抗体具有与小鼠抗体相当的免疫效力，并且具有在人体中更安全有效、半衰期更长的特点。

虽然说明并描述了本发明的优选例，应理解本领域的技术人员可根据本文的教导，作出各种改变，这些改变不违背本发明的范围。

序列表

<110>旭华(上海)生物研发中心有限公司

<120>抗人肿瘤坏死因子α的重组嵌合抗体

<130>064113CNCN

<160>21

<210>1

<211>351

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>1

<210>2

<211>117

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>2

<210>3

<211>5

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>3

<210>4

<211>17

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>4

<210>5

<211>8

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>5

<210>6

<211>324

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>6

<210>7

<211>108

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>7

<210>8

<211>12

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>8

<210>9

<211>7

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>9

<210>10

<211>9

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>10

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>合成序列

<400>11

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>合成序列

<400>12

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>合成序列

<400>24

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>合成序列

<400>14

<210>15

<211>29

<212>DNA

<213>合成序列

<400>15

<210>16

<211>18

<212>DNA

<213>合成序列

<400>16

<210>17

<211>29

<212>DNA

<213>合成序列

<400>17

<210>18

<211>37

<212>DNA

<213>合成序列

<400>18

<210>19

<211>41

<212>DNA

<213>合成序列

<400>19

<210>20

<211>33

<212>DNA

<213>合成序列

<400>20

<210>21

<211>40

<212>DNA

<213>合成序列

<400>21

Claims (8)

1.一种与人肿瘤坏死因子α结合的嵌合抗体，其特征在于，该嵌合抗体的重链可变区的CDRH1为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，CDR-H2为SEQ IDNO：4所示氨基酸序列，和CDR-H3为SEQ ID NO：5所示氨基酸序列；以及

该嵌合抗体的轻链可变区的CDR-L1为SEQ ID NO：8所示氨基酸序列，CDR-L2为SEQ ID NO：9所示氨基酸序列，和CDR-L3为SEQ ID NO：10所示氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的嵌合抗体，其特征在于，该嵌合抗体的重链可变区为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的嵌合抗体，其特征在于，该嵌合抗体的轻链可变区为SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的嵌合抗体，其特征在于，所述嵌合抗体的重链恒定区序列是人IgG1的重链恒定区序列。

5.如权利要求1所述的嵌合抗体，其特征在于，所述嵌合抗体的轻链恒定区序列是人κ抗体轻链恒定区序列。

6.一种药物组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求1所述的嵌合抗体和药物学上可接受的载体。

7.权利要求1所述嵌合抗体的用途，其特征在于，用于制备抑制或中和hTNFα活性的药物。

8.如权利要求7所述的用途，所述抑制或中和hTNFα活性的药物用于治疗脓毒症、自身免疫疾病、移植排斥、感染病、肠功能紊乱症、类风湿性关节炎、节段性回肠炎、或牛皮癣关节炎。

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