JP5946717B2 - 皮膚のしわ形成防止・改善剤及び創傷治癒促進剤 - Google Patents

Description

本願発明は、真皮線維芽細胞におけるタイプ３コラーゲン産生促進剤、皮膚のしわ形成防止・改善剤、及び皮膚の創傷治癒促進剤に関する。

皮膚は、紫外線、乾燥、寒冷、熱、薬物等のさまざまな物理的及び化学的ストレスに日々さらされている。その結果、皮膚の機能低下が引き起こされ、さまざまな皮膚の老化現象が顕在化する。皮膚の老化現象の一つに、しわがある。しわには、表皮性のしわと、真皮性のしわの二種類が存在することが知られている。表皮性のしわは小じわと呼ばれ、皮膚の乾燥により、表皮角質層中の水分量が低下することによって一時的に生じるしわである。小じわの改善方法としては、保湿効果を有する化粧料の使用が一般的である。一方、真皮性のしわは、主に太陽光線に含まれる紫外線によって形成されるしわである。その形成メカニズムとしては、紫外線による真皮線維芽細胞におけるコラーゲン合成能の低下や、マトリックスメタロプロテアーゼの増加によるコラーゲンの分解促進が挙げられる。乾燥に起因する表皮性のしわと紫外線に起因する真皮性のしわでは、組織学的形態、発症メカニズム、治療方法が異なり、紫外線により生じる真皮性のしわは、保湿効果を有する化粧料の使用によって改善させることはできない。これまでに、紫外線によって生じるしわを改善することを目的として、加水分解アーモンドを有効成分とする皮膚のしわ形成防止・改善剤（特許文献１）、ジョチョウケイ、テンキシ及びキセンウの抽出物を有効成分とする紫外線照射に起因するしわの改善剤（特許文献２）が報告されている。

皮膚の創傷治癒は、創傷部の洗浄等の応急処置を施した後、生体の有する治癒力による自然治癒を待つのが一般的である。しかしながら、創傷の程度により自然治癒には長時間を要することがあり、特に高齢者や糖尿病患者等は若者と比較して自然治癒が遅く、創傷治癒を促進する必要がある。皮膚の創傷治癒促進剤としては、塩化リゾチームやソルコセリン等が知られているが、いずれも創傷治癒促進作用が十分であるとはいい難いものであった。皮膚の創傷治癒では、組織の再構築が行われるため、必要な細胞の遊走やコラーゲン等の細胞外マトリックスの産生が促進される。創傷治癒の初期に主に産生されて組織の再構築に重要なタイプ３コラーゲンは、創傷治癒促進効果があり、創傷治癒促進剤として利用されている（非特許文献１、特許文献３）。しかしながら、タイプ３コラーゲンは高価であることや、適切な量を組織に浸透させる必要があった。

ブリオノール酸は、ウリ科の植物より抽出されるトリテルペノイドである。これまでに、ブリオノール酸及びその類似化合物は、抗炎症用及び抗アレルギー用医薬組成物（特許文献４、５）、化粧料及び細胞増殖促進剤（特許文献６）、抗炎症性口腔用組成物（特許文献７）が知られているが、タイプ３コラーゲン産生促進剤、皮膚のしわ形成防止・改善剤、及び皮膚の創傷治癒促進剤に応用した例はない。特許文献６には、上皮細胞の増殖促進作用による整肌効果を有する化粧料が示されているが、これは表皮性の肌性状変化を改善するものであり、真皮性のしわの形成を防止・改善するものではない。

特開２０００−１１９１２５号公報 特開２００６−１９９６１１号公報 特開平７─１７８４４号公報 特開平２─７３０１２号公報 特開平４−２９０８４６号公報 特開平６−１５７２８０号公報 特開平６−３４５６３０号公報

Ｒ．Ｈ．ＣＨＡＭＰＩＯＮ ｅｔ ａｌ，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１：３４２−３４３，１９９８．

本願発明は、紫外線により皮膚に生じるしわの形成を防止・改善させる効果を有する皮膚のしわ形成防止・改善剤、及び皮膚の創傷治癒促進剤を提供することを課題とする。

本願発明者は、この問題点を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、ブリオノール酸若しくはその塩、又はブリオノール酸ジカルボン酸エステル若しくはその塩が、真皮線維芽細胞のタイプ３コラーゲンの産生を高め、優れたしわ形成防止・改善効果、及び皮膚の創傷治癒促進効果が発揮されることを発見し、本願発明を完成するに至った。

すなわち、本願発明は、下記一般式（Ａ）で示されるブリオノール酸若しくはその塩、又はブリオノール酸ジカルボン酸エステル若しくはその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を含有することを特徴とする、タイプ３コラーゲン産生促進剤、皮膚のしわ形成防止・改善剤、及び皮膚の創傷治癒促進剤である。
（化１）一般式（Ａ）

本願発明において、ブリオノール酸若しくはその塩、又はブリオノール酸ジカルボン酸エステル若しくはその塩を用いることにより、タイプ３コラーゲンの産生を促進し、皮膚のしわ形成を防止・改善及び皮膚の創傷治癒を促進することができる。

本願発明に用いるブリオノール酸若しくはその塩、又はブリオノール酸ジカルボン酸エステル若しくはその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物は、下記一般式（Ａ）で示される。
（化１）一般式（Ａ）

一般式（Ａ）で示される化合物は、ブリオノール酸から誘導することができる。ブリオノール酸とは、下記一般式（Ｂ）で示される酸性五環性トリテルペノイドであり、ウリ科植物の培養細胞を低濃度のオーキシンを含む培地中で暗所にて培養することによって生産することができる（特開平２−１０７１９４号公報、Ｐｌａｎｔ ａｎｄ ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．，２５（８）：１５７１−１５７４，１９８４参照）。
（化２）一般式（Ｂ）

例えば、ウリ科植物（ヘチマ、メロン等）のカルスを常法により誘導し、その懸濁培養細胞を作製する。この培養細胞を１０^−６〜１０^−８Ｍの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を含む液体培地に接種し、暗所で１〜３週間、回転振とう培養する。得られた培養細胞を乾燥した後、エタノールで抽出し、濃縮乾固する。得られた抽出物を結晶化させるとブリオノール酸が得られる。また、ウリ科植物、例えば、メロン、カボチャやキカラスウリ等の根から同様にして抽出し、シリカゲルカラムで分画後、再結晶によりブリオノール酸を得ることができる。

ジカルボン酸エステル残基に関して、ジカルボン酸としては、分子内にカルボキシル基を２個有するものであれば特に限定されず、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸等の脂肪族飽和ジカルボン酸、マレイン酸、フマル酸等の脂肪族不飽和ジカルボン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸等の芳香族ジカルボン酸等が例示される。上記ジカルボン酸エステルは、常法によりブリオノール酸を無水コハク酸や無水グルタル酸等と反応させることにより、容易に調製することができる。

ブリオノール酸及びブリオノール酸ジカルボン酸エステルは、塩を形成していてもよく、塩としては、カルボキシル基が、塩を形成しており、生理学的に許容されれば特に制限されるものではない。好適にはナトリウム、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、亜鉛、アルミニウム、アンモニウム等の第四級アミン塩、及びリジン，アルギニン塩等のアミノ酸塩等が例示される。上記塩類は、ブリオノール酸又はブリオノール酸ジカルボン酸エステルから常法により容易に誘導することができる。

本願発明に用いるブリオノール酸若しくはその塩、又はブリオノール酸ジカルボン酸エステル若しくはその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物の配合量は、本願発明の外用剤全量に対し、固形物に換算して、乾燥物として０．０００００１〜１重量％であることが好ましく、０．００００１〜０．１重量％含まれる濃度で使用することが最も好ましい。０．０００００１重量％未満であると本願発明の効果が十分に発揮されにくい場合がある。

以下に、本願発明に用いるブリオノール酸若しくはその塩、又はブリオノール酸ジカルボン酸エステル若しくはその塩の製造例を示す。

製造例１ ブリオノール酸
ヘチマの子葉を４．５×１０^−６Ｍの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）及び２．３×１０^−６Ｍのカイネチンを含むムラシゲとスクーグの寒天培地に置床し、常法によりカルスを誘導した。一ヶ月後、このカルスを同液体培地に入れて９０ｒｐｍで回転振とう培養し、その懸濁培養細胞を調製した。この培養細胞を１０^−７Ｍの２，４−Ｄを含むムラシゲとスクーグの液体培地に接種し、暗所で２週間、回転振とう培養した。得られた培養細胞を凍結乾燥した後、エタノールにて抽出し、抽出液を濃縮乾固した。得られた抽出物をエタノールに再溶解させ、続いて再結晶させブリオノール酸の針状結晶を得た。ブリオノール酸含量は、細胞の乾燥重量に対して１．２％であった。

製造例２ サクシニルブリオノール酸
ブリオノール酸１０ｇ、無水コハク酸６４ｇをピリジン５５０ｍＬに溶解し、１００℃にて８時間反応させた。放冷後、１Ｎ塩酸６．５Ｌ中に反応液を加え、３℃にて放置し、析出した結晶をろ別し、精製水にて洗浄した。
ろ別した固形分をジエチルエーテル３Ｌに溶解し、分液ロートを用いて精製水にて洗浄後、ジエチルエーテルを留去し、乾燥して固形分１３ｇを得た。 固形分１３ｇをエタノール１００ｍＬに加熱溶解し再結晶することにより、白色固形分としてサクシニルブリオノール酸１２ｇを得た。サクシニルブリオノール酸を一般式（Ｃ）に示す。

（化３）一般式（Ｃ）

製造例３ サクシニルブリオノール酸二カリウム
サクシニルブリオノール酸１２ｇを脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）３００ｍＬに溶解し、１Ｎ水酸化カリウム水溶液４５ｍＬを添加した。追加でＴＨＦを徐々に加えて沈殿が生成し始めたら約１時間熟成し、３℃、１日後、ろ別し、黄色固形分１５ｇを得た。
黄色固形分をエタノール１００ｍＬに加熱溶解し、ろ液を３℃、１日後、ろ別、乾燥し、白色〜微黄色固形分のサクシニルブリオノール酸二カリウム１１ｇを得た。サクシニルブリオノール酸二カリウムを一般式（Ｄ）に示す。

（化４）一般式（Ｄ）

処方例１ 軟膏１
成分 配合量（重量％）
１．ブリオノール酸（製造例１） ０．０１
２．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．） ２．０
３．モノステアリン酸グリセリン １０．０
４．流動パラフィン ５．０
５．セタノール ６．０
６．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
７．プロピレングリコール １０．０
８．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜５を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とした。成分６〜８を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とした。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して軟膏１を得た。

処方例２ 軟膏２
処方例１において、ブリオノール酸（製造例１）をサクシニルブリオノール酸（製造例２）に置き換えたものを軟膏２とした。

処方例３ 軟膏３
成分 配合量（重量％）
１．サクシニルブリオノール酸二カリウム（製造例３） ０．０１
２．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．） ２．０
３．モノステアリン酸グリセリン １０．０
４．流動パラフィン ５．０
５．セタノール ６．０
６．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
７．プロピレングリコール １０．０
８．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜５を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とした。成分１及び６〜８を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とした。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して軟膏３を得た。

比較例 従来の軟膏
処方例３において、サクシニルブリオノール酸二カリウム（製造例３）を精製水に置き換えたものを従来の軟膏とした。

処方例４ クリ−ム
成分 配合量（重量％）
１．ブリオノール酸（製造例１） ０．００５
２．スクワラン ５．５
３．オリ−ブ油 ３．０
４．ステアリン酸 ２．０
５．ミツロウ ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエ−テル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ベヘニルアルコ−ル １．５
９．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１０．香料 ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１２．パラオキシ安息香酸エチル ０．０５
１３．１，３−ブチレングリコ−ル ８．５
１４．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。

処方例５ ゲル剤
成分 配合量（重量％）
１．サクシニルブリオノール酸二カリウム（製造例３） １．０
２．エタノール ５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．） ０．１
５．１，３−ブチレングリコール ５．０
６．グリセリン ５．０
７．キサンタンガム ０．１
８．カルボキシビニルポリマー ０．２
９．水酸化カリウム ０．２
１０．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜４と、成分１及び５〜１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。

実験例１ タイプ３コラーゲン産生促進効果の評価
タイプ３コラーゲン産生の指標として、タイプ３コラーゲン ｍＲＮＡ発現量、及びタイプ３コラーゲンの線維構築に必須なプロペプチド切断酵素ｍｅｐｒｉｎα ｍＲＮＡ発現量を用いた。
正常ヒト真皮線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を６０ｍｍディッシュに播種し、コンフルエントになるまで培養した。その後、０．０１６μＭ（０．００７２ｍｇ／ｍＬ）及び０．１６μＭ（０．０７２ｍｇ／ｍＬ）のブリオノール酸（製造例１）、及び０．０１６μＭ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）及び０．１６μＭ（０．１ｍｇ／ｍＬ）のサクシニルブリオノール酸二カリウム（製造例３）を加え、さらに６時間培養した。ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン）にて細胞から総ＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔｗｏ−Ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（インビトロジェン）を用い、ＲＴ−ＰＣＲ法にてタイプ３コラーゲン及びｍｅｐｒｉｎα ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。ＰＣＲ反応は、９５℃にて２分間初期変性を行った後、９５℃：１５秒、６０℃：３１秒を１サイクルとして４０サイクル行った。内部標準としては、β−アクチンを用いた。タイプ３コラーゲン及びｍｅｐｒｉｎα ｍＲＮＡ発現量は、β−アクチン ｍＲＮＡ発現量に対する割合として求めた。なお、タイプ３コラーゲン、ｍｅｐｒｉｎα及びβ−アクチン ｍＲＮＡ発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。

タイプ３コラーゲン用のプライマーセット
ＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧ（配列番号１）
ＧＧＣＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＧＣＴＴ（配列番号２）
ｍｅｐｒｉｎα用のプライマーセット
ＧＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＣＡＣＡＣＴＣＴＴＴＴ（配列番号３）
ＴＴＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＴＴＧＣＣＴＴＣ（配列番号４）
β−アクチン用のプライマーセット
ＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣ（配列番号５）
ＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧ（配列番号６）

実験結果を表１に示した。ブリオノール酸及びサクシニルブリオノール酸二カリウムは、タイプ３コラーゲン及びｍｅｐｒｉｎα ｍＲＮＡ発現を促進した。これらの結果は、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩が、タイプ３コラーゲン産生を促進することにより、優れた皮膚のしわの形成防止・改善効果及び創傷治癒促進効果を有することを示す。

実験例２ 使用試験
処方例１の軟膏１、処方例２の軟膏２、処方例３の軟膏３、比較例の従来の軟膏を用いて、顔面に真皮性しわ（小じわではない）を有する女性被験者各２０名（４０−５０代）を対象に使用試験を実施した。被験者顔面部の真皮性しわに１ヶ月間朝晩１日２回試料を使用してもらい、試験終了後のしわの改善度を、以下に示す判定基準にて視覚評価することにより、「しわに対する改善効果」を判定した。
（判定基準）
有効：しわがかなり目立たなくなった
やや有効：しわが以前より目立たなくなった
効果なし：変化なし

これらの試験結果を表２に示した。その結果、処方例１の軟膏１、処方例２の軟膏２及び処方例３の軟膏３は、比較例の従来の軟膏と比較して、優れたしわの改善作用を示した。処方例４のクリ−ム及び処方例５のゲル剤も同様の試験を行い、優れたしわの改善作用を示した。したがって、本願発明に用いるブリオノール酸若しくはその塩、又はブリオノール酸ジカルボン酸エステル若しくはその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を含有する皮膚外用剤は優れたしわの改善作用を示した。なお、試験期間中、皮膚トラブルは一人もなく、安全性においても問題なかった。また、処方成分の劣化についても問題なかった。

本願発明によれば、優れたタイプ３コラーゲン産生促進作用を有する皮膚のしわ形成防止・改善剤及び皮膚の創傷治癒促進剤を提供できる。医薬品、医薬部外品、化粧料等に利用できる。

Claims (2)

1. 下記一般式（Ａ）で示されるブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を含有することを特徴とするタイプ３コラーゲン産生促進剤。
   （化１）一般式（Ａ）
   
2. 請求項１記載のタイプ３コラーゲン産生促進剤を含有することを特徴とする皮膚のしわ形成防止・改善剤。