JP5889527B2 - 癌療法のためのａｂｃｂ５標的化 - Google Patents

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Description

連邦政府により後援された研究
本発明は、ＮＩＨ補助金第１Ｒ０１ＣＡ１１３７９６−０１Ａ１のもと政府の支援でなされた。政府は、本発明に特定の権利を有す。
ヒト悪性メラノーマはかなり化学治療抵抗性の癌である。現在、有効な治療選択肢は多くはない。皮膚の悪性メラノーマは合衆国においてかなり広がっており、生涯の間に６３人のうち１人の男性および女性が罹る。このうち、１１％は、癌がリンパ節の領域まで広がってしまった後、または初期の部位を直接的に超えてしまった後に診断され、３％は癌が既に転移した後に（末期ステージ）診断され、６３．８％および１６．０％の対応する５年間の相対的生存率となっている。
本発明は、少なくとも部分的には、化学抵抗性のＡＢＣＢ５＋腫瘍幹細胞がメラノーマのような癌の発生に寄与し、これらの細胞を標的化して、癌を治療することができるという発見に基づく。ＡＢＣＢ５標的化は、特に、現在難治性の転移性疾患を持つ患者において、播腫性疾患に対する単独型の治療的アプローチとして、または化学治療剤に対して癌細胞を感受性とするための補助的療法として使用することができる。ＡＢＣＢ５標的化治療アプローチの利点は、それが発癌性の幹細胞に向けられ、他方、慣用的な治療剤は腫瘍細胞のバルク集団のみを標的化するということである。
いくつかの態様において、本発明は、細胞を、細胞の細胞内区画へ治療剤を送達するのに有効な量の、治療剤にコンジュゲートしたＡＢＣＢ５に選択的に結合する単離された分子と接触させることによって、治療剤を該細胞の細胞内区画に送達する方法に関する。
いくつかの実施形態において、ＡＢＣＢ５に選択的に結合する単離された分子は単離されたペプチドである。他の実施形態において、それは小分子である。単離されたペプチドは、例えば、抗体、またはその抗原結合断片またはｓｃＦｖであってよい。
治療剤は、いくつかの実施形態において、毒素、ｓｉＲＮＡ、化学治療剤または治療抗体であってよい。
本方法は、いくつかの実施形態において、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＢＭＰＲ１ａ、ＴＩＲ−１、ＶＥ−カドヘリン（ＣＤ１４４）またはネスチンのような表面マーカーに選択的に結合する単離された分子と細胞とを接触させる工程を含む。
本発明のもう１つの態様によると、ＡＢＣＢ５に選択的に結合し、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８よりなる群から選択されるアミノ酸配列、または保存的置換を含有するその機能的に同等な変異体を含む単離されたポリペプチドの組成物が提供され、ここに、該単離されたペプチドはｍＡｂ ３Ｃ２−１Ｄ１２ではない。
本発明の他の態様において、ＡＢＣＢ５に選択的に結合し、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８よりなる群から選択されるアミノ酸配列、または保存的置換を含有するその機能的に同等な変異体を含む単離されたペプチドの組成物が提供される。該単離された抗体または抗体断片は、ヒト被験体において化学的増感を高めるのに有効な量で存在する。
本発明のなおもう１つの態様によると、ＡＢＣＢ５に選択的に結合し、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８よりなる群から選択されるアミノ酸配列、または保存的置換を含有するその機能的に同等な変異体を含む単離されたペプチドの組成物が提供される。該単離されたペプチドは、好ましくは、治療剤とで同時製剤化される。
単離されたペプチドは、いくつかの実施形態において、治療剤にコンジュゲートされる。他の実施形態において、治療剤はカンプトテシン９−ＮＨ２、ミトキサントロン、カンプトテシン７−Ｃｌ、ピラゾフリン、メノガリル、カンプトテシン２０エステル、カンプトテシン、アムサクリン、エトポシド、アントラピラゾール誘導体、テルニポシド、カンプトテシン１１−ホルミル、カンプトテシン１０−ＯＨ、ダウノルビシン、デオキシドキソルビシン（ｄｏｘｙｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、オキサントラゾール、カンプトテシン１１−ＨＯＭｅ、ゾルビシン、ウラシルマスタード、ピペラジンジオン、ヘプスルファム、メルファラン、ビサントレン、トリエチレンメラミン、スピロムスチン、Ｙｏｓｈｉ−８６４、クロラムブシル、ピペラジンマスタード、ヒドロキシ尿素、ポルフィロマイシン、メクロレタミン、フルオロドパン、マイトマイシン、シタラビン（ａｒａＣ）、ジアンヒドロガラクチトール、ゲムシタビン、チオテパ、Ｎ，Ｎ−ジベンジルダウノマイシン、テロキシロンおよびアフィジコリングリシネートよりなる群から選択される。
本発明の他の態様によると、キットが提供される。該キットは、ＡＢＣＢ５に選択的に結合し、かつ１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２よりなる群から選択されるアミノ酸配列、または保存的置換を含有するその機能的に同等な変異体を含む単離されたペプチドを収容する容器、および該単離されたペプチドをヒト被験体に投与するための指示書を含む。
被験体を治療するための方法は、本発明の他の態様に従って提供される。該方法は、ＡＢＣＢ５に選択的に結合し、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８よりなる群から選択されるアミノ酸配列、または保存的置換を含有するその機能的に同等な変異体を含む単離されたペプチドを、癌を治療するのに有効な量にて癌を有する被験体に全身投与することを含む。
本明細書中に記載された組成物のいずれか１つを、癌を治療するのに有効な量にて癌を有する被験体に投与することによって、被験体を治療する方法も提供される。
被験体を治療するための方法は、本発明の他の態様に従って提供される。該方法は、ＡＢＣＢ５に選択的に結合し、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８よりなる群から選択されるアミノ酸配列、または保存的置換を含有するその機能的に同等な変異体を含む単離されたペプチド、および化学治療剤を、癌を治療するのに有効な量にて、癌を有する被験体に投与することを含む。
本発明の他の態様によると、ＡＢＣＢ５に選択的に結合する単離された抗体または抗体断片、および化学治療剤を、癌を治療するのに有効な量にて癌を有する被験体に全身投与することによって被験体を治療する方法が提供される。
本発明は、他の態様において、免疫グロブリン重鎖可変ドメインの単離されたペプチドであり、ここに：（ｉ）ＣＤＲ１−Ｈ１は配列番号３のアミノ酸配列を含み；（ｉｉ）ＣＤＲ２−Ｈ２は配列番号４のアミノ酸配列を含み、および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３−Ｈ３配列、ここに、単離されたペプチドはｍＡｂ ３Ｃ２−１Ｄ１２ではない。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３−Ｈ３は配列番号３のアミノ酸配列を有する。単離されたペプチドはヒトＡＢＣＢ５に結合することができ、抗体であってよい。所望により、単離されたペプチドは、さらに、軽鎖可変ドメインを含み、ここに、ＣＤＲ１−Ｌ１は配列番号６のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２−Ｌ２は配列番号７のアミノ酸配列を含み、および／またはＣＤＲ３−Ｌ３は配列番号８のアミノ酸配列を含む。
他の態様において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを有する単離されたペプチドであり、ここに：（ｉ）ＣＤＲ１−Ｌ１は配列番号６のアミノ酸配列を有し、（ｉｉ）ＣＤＲ２−Ｌ２は配列番号７のアミノ酸配列を有し、および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３−Ｌ３配列は、ここに、単離されたペプチドはｍＡｂ ３Ｃ２−１Ｄ１２ではない。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３−Ｌ３は配列番号８のアミノ酸配列を有する。
少なくとも２つの抗体可変ドメイン：（ａ）本明細書中に記載された単離されるようなペプチドを含む重鎖抗体可変ドメイン、および（ｂ）本明細書中に記載されるような単離されたペプチドを含む軽鎖可変ドメインを含む単離されたペプチドが、本発明の他の態様によって提供される。いくつかの実施形態において、単離されたペプチドは単一鎖Ｆｖである。他の実施形態において、単離されたペプチドはＦａｂ単離ペプチドである。なお他の実施形態において、単離されたペプチドは十分にヒトの単離されたペプチドである。
単離されたペプチドは、さらに、変異体ＣＤＲ１−Ｈ１、ＣＤＲ２−Ｈ２、ＣＤＲ３−Ｈ３に対応する単離されたペプチド可変ドメインについてのフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４を含んでもよく、ここに、該フレームワーク領域は単一のポリペプチド鋳型から得られる、フレームワーク領域の各々は、ポリペプチド配列番号１のフレームワーク領域アミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有してもよい。
いくつかの実施形態において、単離されたペプチドは、さらに、重鎖ポリペプチド可変ドメインのＣ末端領域に連結された二量体化ドメインを含む。二量体化ドメインは、ロイシンジッパードメイン、または少なくとも１つのシステイン残基を有する配列であってよい。二量体化ドメインは、いくつかの実施形態においては、ヒンジ領域を有する。他の実施形態において、二量体化ドメインは単一のシステインである。
いくつかの実施形態において、単離されたペプチドはモノクローナル抗体である。他の実施形態において、それは二重特異性抗体である。なお他の実施形態において、単離されたペプチドは合成抗体である。
本発明のもう１つの実施形態によると、抗ＡＢＣＢ５抗体またはその抗原結合断片が提供される。該抗体はヒト定常領域を有し、ここに、該抗ＡＢＣＢ５抗体、または抗原結合断片は、ｍＡｂ ３Ｃ２−１Ｄ１２のＡＢＣＢ５への結合を競合的に阻害する。いくつかの実施形態において、抗原結合断片はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ＶＨ ｄＡｂ、およびＶＬ ｄＡｂよりなる群から選択される。他の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、免疫グロブリンクラスＩｇＡ、ＩｇＧｂ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＭのものである。なお他の実施形態において、抗体または抗原結合断片はヒト定常領域を含み、ヒト可変フレームワーク領域または抗原結合断片は単一鎖抗体である。単一鎖抗体は、所望により、ラクダ科動物の抗体である。
機能的抗原結合領域を有するヒト化抗体可変ドメインが本発明の他の態様によって提供される。ヒト化抗体可変ドメインは、ヒト可変ドメインに一体化されたｍＡｂ ３Ｃ２−１Ｄ１２のＣＤＲ１−Ｈ１、ＣＤＲ２−Ｈ２、ＣＤＲ３−Ｈ３、ＣＤＲ１−Ｌ１、ＣＤＲ２−Ｌ２、およびＣＤＲ３−Ｌ３に対して少なくとも９０％相同性を有する非ヒトＣＤＲ１−Ｈ１、ＣＤＲ２−Ｈ２、ＣＤＲ３−Ｈ３、ＣＤＲ１−Ｌ１、ＣＤＲ２−Ｌ２、およびＣＤＲ３−Ｌ３を有する。
本発明の他の態様において、キメラ抗体が提供される。該キメラ抗体は、ＡＢＣＢ５に特異的に結合する可変ドメイン、および定常ドメインを有し、ここに、該可変ドメインおよび該定常ドメインは異なる種からのものである。
いくつかの実施形態において、単離されたペプチドはＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ３−Ｈ３のアミノ酸配列、またはその機能的に同等な変異体を有する。他の実施形態において、単離されたペプチドは、ＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ２−Ｈ２のアミノ酸配列、またはその機能的に同等な変異体を有する。他の実施形態において、単離されたペプチドはＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ１−Ｈ１のアミノ酸配列、またはその機能的に同等な変異体を有する。他の実施形態において、単離されたペプチドはＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ３−Ｌ３のアミノ酸配列、またはその機能的に同等な変異体を有する。他の実施形態において、単離されたペプチドは、ＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ２−Ｌ２のアミノ酸配列、またはその機能的に同等な変異体を有する。なお他の実施形態において、単離されたペプチドは、ＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ１−Ｌ１のアミノ酸配列、またはその機能的に同等な変異体を有する。
他の実施形態において、単離されたペプチドは、単離された抗体または抗体断片である。単離された抗体または抗体断片は、所望により、無傷の可溶性モノクローナル抗体であってよい。他の実施形態において、単離された抗体または抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ＶＨ ｄＡｂ、およびＶＬ ｄＡｂよりなる群から選択される単離されたモノクローナル抗体断片である。なお他の実施形態において、単離された抗体または抗体断片は化学的増感を高める。好ましい実施形態において、単離されたペプチドはＡＢＣＢ５に選択的に結合する。なお他の実施形態において、単離された抗体または抗体断片は、ヒト化抗体である。単離されたペプチドは、所望によりｓｃＦｖであってよい。
他の実施形態において、単離されたペプチドは検出可能な標識にコンジュゲートしている。
組成物は、医薬上許容される担体を含んでもよく、所望により、滅菌製剤であってよい。
本発明は、その適用を、以下に記述されまたは図面において示された構成の詳細、および構成要素の配置に制限されない。本発明は、他の実施形態が可能であり、かつ種々の方法で実行し、または行うことができる。また、本明細書中で用いられる用語および専門用語は記述を目的とするものであり、限定的であるとみなされるべきではない。本明細書中において、「包含する」、「含む」、または「有する」、「含有する」、「関連する」、およびその変形の使用は、後にリストされる項目、およびその均等物、ならびに追加の項目を含むことを意図する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
細胞を、該細胞の細胞内区画に治療剤を送達するのに有効な量の、治療剤にコンジュゲートされたＡＢＣＢ５に選択的に結合する単離された分子と接触させることを含む、細胞の細胞内区画に治療剤を送達する方法。
（項目２）
ＡＢＣＢ５に選択的に結合する該単離された分子が単離されたペプチドである、項目１記載の方法。
（項目３）
前記単離されたペプチドが抗体またはその抗原結合断片である、項目２記載の方法。
（項目４）
前記治療剤が毒素である、項目１記載の方法。
（項目５）
前記治療剤がｓｉＲＮＡである、項目１記載の方法。
（項目６）
前記治療剤が化学治療剤である、項目１記載の方法。
（項目７）
前記治療剤が治療抗体である、項目１記載の方法。
（項目８）
さらに細胞を、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ１３３、およびＣＤ１６６よりなる群から選択される表面マーカーに選択的に結合する単離された分子と接触させることを含む、項目１記載の方法。
（項目９）
さらに細胞を、ＢＭＰＲ−１ａ、ＴＩＲ−１、ＶＥ−カドヘリン（ＣＤ１４４）およびネスチンよりなる群から選択される表面マーカーに選択的に結合する単離された分子と接触させることを含む、項目１記載の方法。
（項目１０）
ＡＢＣＢ５に選択的に結合し、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８よりなる群から選択されるアミノ酸配列、または保存的置換を含有するその機能的に同等な変異体を含む単離されたペプチドを含み、ここで、該単離されたペプチドはｍＡｂ ３Ｃ２−１Ｄ１２ではない、組成物。
（項目１１）
ＡＢＣＢ５に選択的に結合し、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８よりなる群から選択されるアミノ酸配列、または保存的置換を含有するその機能的に同等な変異体を含む単離されたペプチドを含み、ここで、該単離されたペプチドはヒト被験体において化学的増感を増強するのに有効な量にて存在する、組成物。
（項目１２）
ＡＢＣＢ５に選択的に結合し、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８よりなる群から選択されるアミノ酸配列、または保存的置換を含有するその機能的に同等な変異体を含む単離されたペプチドを含み、ここで、該単離されたペプチドは治療剤と同時製剤化される、組成物。
（項目１３）
前記単離されたペプチドが治療剤にコンジュゲートされている、項目１２記載の組成物。
（項目１４）
前記治療剤がカンプトテシン９−ＮＨ２、ミトキサントロン、カンプトテシン７−Ｃｌ、ピラゾフリン、メノガリル、カンプトテシン２０エステル、カンプトテシン、アムサクリン、エトポシド、アントラピラゾール誘導体、テルニポシド、カンプトテシン１１−ホルミル、カンプトテシン１０−ＯＨ、ダウノルビシン、デオキシドキソルビシン、ドキソルビシン、オキサントラゾール、カンプトテシン１１−ＨＯＭｅ、ゾルビシン、ウラシルマスタード、ピペラジンジオン、ヘプスルファム、メルファラン、ビサントレン、トリエチレンメラミン、スピロムスチン、Ｙｏｓｈｉ−８６４、クロラムブシル、ピペラジンマスタード、ヒドロキシ尿素、ポルフィロマイシン、メクロレタミン、フルオロドパン、マイトマイシン、シタラビン（ａｒａＣ）、ジアンヒドロガラクチトール、ゲムシタビン、チオテパ、Ｎ，Ｎ−ジベンジルダウノマイシン、テロキシロンおよびアフィジコリングリシネートよりなる群から選択される、項目１２記載の組成物。
（項目１５）
ＡＢＣＢ５に選択的に結合し、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８よりなる群から選択されるアミノ酸配列、または保存的置換を含有するその機能的に同等な変異体を含む単離されたペプチドを収容する容器、および該単離されたペプチドをヒト被験体に投与するための指示書を含む、キット。
（項目１６）
ＡＢＣＢ５に選択的に結合し、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８よりなる群から選択されるアミノ酸配列、または保存的置換を含有するその機能的に同等な変異体を含む単離されたペプチドを、癌を治療するのに有効な量にて癌を有する被験体に全身投与することを含む、被験体を治療する方法。
（項目１７）
項目１０〜１２の組成物のうちのいずれか１つを、癌を治療するのに有効な量にて癌を有する被験体に投与することを含む、被験体を治療する方法。
（項目１８）
ＡＢＣＢ５に選択的に結合し、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８よりなる群から選択されるアミノ酸配列、または保存的置換を含有するその機能的に同等な変異体を含む単離されたペプチド、および化学治療剤を、癌を治療するのに有効な量にて癌を有する被験体に投与することを含む、被験体を治療する方法。
（項目１９）
ＡＢＣＢ５に選択的に結合する単離された抗体または抗体断片、および化学治療剤を、癌を治療するのに有効な量にて癌を有する被験体に全身投与することを含む、被験体を治療する方法。
（項目２０）
免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む単離されたペプチドであって、ここで：（ｉ）ＣＤＲ１−Ｈ１は配列番号３のアミノ酸配列を含み；（ｉｉ）ＣＤＲ２−Ｈ２は配列番号４のアミノ酸配列を含み；および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３−Ｈ３配列、ここで、該単離されたペプチドはｍＡｂ ３Ｃ２−１Ｄ１２ではない、単離されたペプチド。
（項目２１）
前記ＣＤＲ３−Ｈ３が配列番号３のアミノ酸配列を含む、項目２０記載の単離されたペプチド。
（項目２２）
ヒトＡＢＣＢ５に結合する、項目２０記載の単離されたペプチド。
（項目２３）
抗体である、項目２２記載の単離されたペプチド。
（項目２４）
さらに、軽鎖可変ドメインを含み、ここで、ＣＤＲ１−Ｌ１が配列番号６のアミノ酸配列を含む、項目２０記載の単離されたペプチド。
（項目２５）
さらに、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２−Ｌ２を含む、項目２４記載の単離されたペプチド。
（項目２６）
さらに、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３−Ｌ３を含む、項目２４記載の単離されたペプチド。
（項目２７）
免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含み、ここで：（ｉ）ＣＤＲ１−Ｌ１は配列番号６のアミノ酸配列を含み；（ｉｉ）ＣＤＲ２−Ｌ２は配列番号７のアミノ酸配列を含み；および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３−Ｌ３配列、ここに、該単離されたペプチドはｍＡｂ ３Ｃ２−１Ｄ１２ではない、単離されたペプチド。
（項目２８）
前記ＣＤＲ３−Ｌ３が配列番号８のアミノ酸配列を含む、項目２７記載の単離されたペプチド。
（項目２９）
（ａ）項目２０記載の単離されたペプチドを含む重鎖抗体可変ドメイン；および（ｂ）項目２７記載の単離されたペプチドを含む軽鎖抗体可変ドメインを含む少なくとも２つの抗体可変ドメインを含む、単離されたペプチド。
（項目３０）
単一鎖Ｆｖである、項目２９記載の単離されたペプチド。
（項目３１）
Ｆａｂ単離ペプチドである、項目２９記載の単離されたペプチド。
（項目３２）
完全にヒトの単離されたペプチドである、項目２９記載の単離されたペプチド。
（項目３３）
さらに、変異体ＣＤＲ１−Ｈ１、ＣＤＲ２−Ｈ２、ＣＤＲ３−Ｈ３に対応する単離されたペプチド変異体ドメインについてのフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４を含み、ここで、該フレームワーク領域は単一のポリペプチド鋳型から得られる、項目２９記載の単離されたペプチド。
（項目３４）
前記フレームワーク領域の各々が、ポリペプチド配列番号１のフレームワーク領域アミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含む、項目３３記載の単離されたペプチド。
（項目３５）
さらに、重鎖ポリペプチド可変ドメインのＣ末端領域に連結された二量体化ドメインを含む、項目２９記載の単離されたペプチド。
（項目３６）
前記二量体化ドメインがロイシンジッパードメイン、または少なくとも１つのシステイン残基を含む配列を含む、項目３５記載の単離されたペプチド。
（項目３７）
前記二量体化ドメインがポリペプチドからのヒンジ領域、およびロイシンジッパーを含む、項目３５記載の単離されたペプチド。
（項目３８）
前記二量体化ドメインが単一システインである、項目３５記載の単離されたペプチド。
（項目３９）
前記単離されたペプチドがモノクローナル抗体である、項目２０記載の単離されたペプチド。
（項目４０）
前記単離されたペプチドが二重特異性抗体である、項目２０記載の単離されたペプチド。
（項目４１）
前記単離されたペプチドが合成抗体である、項目２０記載の単離されたペプチド。
（項目４２）
少なくとも１つのヒト領域を有する、抗ＡＢＣＢ５抗体またはその抗原結合断片であって、ここで、該抗ＡＢＣＢ５抗体または抗原結合断片はｍＡｂ ３Ｃ２−１Ｄ１２のＡＢＣＢ５への結合を競合的に阻害する、抗ＡＢＣＢ５抗体またはその抗原結合断片。
（項目４３）
前記抗原結合断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’） ２ 、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ＶＨ ｄＡｂ、およびＶＬ ｄＡｂよりなる群から選択される、項目４２記載の抗体。
（項目４４）
前記抗体または抗原結合断片が免疫グロブリンクラスＩｇＡ、ＩｇＧｂ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＭのものである、項目４２記載の抗体。
（項目４５）
前記抗体または抗原結合断片がヒト定常領域およびヒト可変フレームワーク領域を含む、項目４２記載の抗体。
（項目４６）
前記抗原結合断片が単一鎖抗体である、項目４２記載の抗体。
（項目４７）
前記単一鎖抗体がラクダ科動物抗体である、項目４６記載の抗体。
（項目４８）
機能的抗原結合領域を有するヒト化抗体可変ドメインであって、前記ヒト化抗体可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインに一体化されたｍＡｂ ３Ｃ２−１Ｄ１２のＣＤＲ１−Ｈ１、ＣＤＲ２−Ｈ２、ＣＤＲ３−Ｈ３、ＣＤＲ１−Ｌ１、ＣＤＲ２−Ｌ２、およびＣＤＲ３−Ｌ３に対して少なくとも９０％相同性を有する非ヒトＣＤＲ１−Ｈ１、ＣＤＲ２−Ｈ２、ＣＤＲ３−Ｈ３、ＣＤＲ１−Ｌ１、ＣＤＲ２−Ｌ２、およびＣＤＲ３−Ｌ３を含む、ヒト化抗体可変ドメイン。
（項目４９）
ＡＢＣＢ５に特異的に結合する可変ドメイン、および定常ドメインを含み、ここで、該可変ドメインおよび該定常ドメインは異なる種からのものである、キメラ抗体。
（項目５０）
前記単離されたペプチドがＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ３−Ｈ３のアミノ酸配列またはその機能的に同等な変異体を含む、項目１０記載の組成物。
（項目５１）
前記単離されたペプチドがＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ２−Ｈ２のアミノ酸配列またはその機能的に同等な変異体を含む、項目１０記載の組成物。
（項目５２）
前記単離されたペプチドがＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ１−Ｈ１のアミノ酸配列またはその機能的に同等な変異体を含む、項目１０記載の組成物。
（項目５３）
前記単離されたペプチドがＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ３−Ｌ３のアミノ酸配列またはその機能的に同等な変異体を含む、項目１０記載の組成物。
（項目５４）
前記単離されたペプチドがＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ２−Ｌ２のアミノ酸配列またはその機能的に同等な変異体を含む、項目１０記載の組成物。
（項目５５）
前記単離されたペプチドがＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ１−Ｌ１のアミノ酸配列またはその機能的に同等な変異体を含む、項目１０記載の組成物。
（項目５６）
前記単離されたペプチドが単離された抗体または抗体断片である、項目１０記載の組成物。
（項目５７）
前記単離された抗体または抗体断片が完全な可溶性モノクローナル抗体である、項目５６記載の組成物。
（項目５８）
前記単離された抗体または抗体断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’） ２ 、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ＶＨ ｄＡｂ、およびＶＬ ｄＡｂよりなる群から選択される単離されたモノクローナル抗体断片である、項目５６記載の組成物。
（項目５９）
前記単離された抗体または抗体断片が化学増感を増強させる、項目５６記載の組成物。
（項目６０）
前記単離されたペプチドが検出可能な標識にコンジュゲートされている、項目１０記載の組成物。
（項目６１）
さらに、医薬上許容される担体を含む、項目１０記載の組成物。
（項目６２）
前記単離されたペプチドがＡＢＣＢ５に選択的に結合する、項目１０記載の組成物。
（項目６３）
前記単離された抗体または抗体断片がヒト化抗体である、項目５６記載の組成物。
（項目６４）
前記単離されたペプチドがｓｃＦｖである、項目１０記載の組成物。
（項目６５）
ＡＢＣＢ５に選択的に結合し、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８よりなる群から選択されるアミノ酸配列、または保存的置換を含有するその機能的に同等な変異体を含む単離されたペプチドを含む、癌を有する被験体の治療に用いる組成物であって、ここで、該組成物は全身投与のために製剤化される、組成物。
（項目６６）
項目１０〜１２の組成物のいずれか１つを含む、癌を有する被験体の治療用組成物。
（項目６７）
ＡＢＣＢ５に選択的に結合し、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８よりなる群から選択されるアミノ酸配列、または保存的置換を含有するその機能的に同等な変異体を含む単離されたペプチド、および化学治療剤を含む、癌を有する被験体の治療用組成物。
（項目６８）
ＡＢＣＢ５に選択的に結合する単離された抗体または抗体断片、および化学治療剤を含む、癌を有する被験体の治療用組成物であって、ここで、該組成物は全身投与用に製剤化される、組成物。
（項目６９）
ＡＢＣＢ５に選択的に結合し、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８よりなる群から選択されるアミノ酸配列、または保存的置換を含有するその機能的に同等な変異体を含む単離されたペプチドを含む組成物の使用であって、ここで、該組成物は癌を有する被験体の治療において全身投与用に製剤化される、使用。
（項目７０）
癌を有する被験体の治療における、項目１０〜１２の組成物のいずれか１つを含む組成物の使用。
（項目７１）
ＡＢＣＢ５に選択的に結合し、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８よりなる群から選択されるアミノ酸配列、または保存的置換を含有するその機能的に同等な変異体を含む単離されたペプチド、および化学治療剤を含む組成物の、癌を有する被験体の治療における使用。
添付の図面は、スケール通りに描かれることを意図していない。図面中、種々の図面で説明される各同一のまたはほとんど同一の構成要素は、同等の数字によって表わされる。明瞭性の目的で、各図面においては、あらゆる構成要素に記号を付さなくてもよい。図面中：
図１は、ＡＢＣＢ５についてのメラノーマ進行組織マイクロアレイ分析、ならびにＡＢＣＢ５＋メラノーマ集団の特徴付けを図示する一連のイメージおよびグラフである。図１（ａ）は、薄いおよび厚いメラノサイト性母斑対、薄いおよび厚い初代メラノーマ対、リンパ節および内蔵メラノーマ転移についてのＡＢＣＢ５染色強度の有意な差を示す、Ｃｈｒｏｍａｖｉｓｉｏｎ自動細胞イメージシステムによる分析を説明するチャートを示す（薄いもしくは厚い母斑対薄いもしくは厚い初代メラノーマ、または対リンパ節もしくは内臓転移、全てのＰ値＜０．００１；薄い初代メラノーマ対厚い初代メラノーマ、Ｐ＝０．００４；薄いおよび厚い初代メラノーマ対リンパ節転移、Ｐ＝０．０１、リンパ節転移対内臓転移、Ｐ＝０．０２５）。図１（ｂ〜ｃ）は、ＡＢＣＢ５＋メラノーマ集団のいくつかの特徴付けを図示する。図１（ｂ）は、ＡＢＣＢ５、ＣＤ２０、ネスチン、ＴＩＥ−１、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３１、またはＢＭＰＲ１ａの発現についての臨床メラノーマ試料の単一色フローサイトメトリー分析を図示する。示されるのは、ｎ＝６メラノーマ患者についての％陽性細胞である（水平方向の棒線は平均発現を示す）。図１（ｃ）は、二色フローサイトメトリーによって決定されたＡＢＣＢ５＋またはＡＢＣＢ５−臨床メラノーマ細胞によるＣＤ２０、ネスチン、ＴＩＥ−１、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３１、またはＢＭＰＲ１ａの発現を示す。％陽性細胞（平均±ＳＥＭ）は、ｎ＝３〜６メラノーマ患者について示される。 図１は、ＡＢＣＢ５についてのメラノーマ進行組織マイクロアレイ分析、ならびにＡＢＣＢ５＋メラノーマ集団の特徴付けを図示する一連のイメージおよびグラフである。図１（ａ）は、薄いおよび厚いメラノサイト性母斑対、薄いおよび厚い初代メラノーマ対、リンパ節および内蔵メラノーマ転移についてのＡＢＣＢ５染色強度の有意な差を示す、Ｃｈｒｏｍａｖｉｓｉｏｎ自動細胞イメージシステムによる分析を説明するチャートを示す（薄いもしくは厚い母斑対薄いもしくは厚い初代メラノーマ、または対リンパ節もしくは内臓転移、全てのＰ値＜０．００１；薄い初代メラノーマ対厚い初代メラノーマ、Ｐ＝０．００４；薄いおよび厚い初代メラノーマ対リンパ節転移、Ｐ＝０．０１、リンパ節転移対内臓転移、Ｐ＝０．０２５）。図１（ｂ〜ｃ）は、ＡＢＣＢ５＋メラノーマ集団のいくつかの特徴付けを図示する。図１（ｂ）は、ＡＢＣＢ５、ＣＤ２０、ネスチン、ＴＩＥ−１、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３１、またはＢＭＰＲ１ａの発現についての臨床メラノーマ試料の単一色フローサイトメトリー分析を図示する。示されるのは、ｎ＝６メラノーマ患者についての％陽性細胞である（水平方向の棒線は平均発現を示す）。図１（ｃ）は、二色フローサイトメトリーによって決定されたＡＢＣＢ５＋またはＡＢＣＢ５−臨床メラノーマ細胞によるＣＤ２０、ネスチン、ＴＩＥ−１、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３１、またはＢＭＰＲ１ａの発現を示す。％陽性細胞（平均±ＳＥＭ）は、ｎ＝３〜６メラノーマ患者について示される。 図１は、ＡＢＣＢ５についてのメラノーマ進行組織マイクロアレイ分析、ならびにＡＢＣＢ５＋メラノーマ集団の特徴付けを図示する一連のイメージおよびグラフである。図１（ａ）は、薄いおよび厚いメラノサイト性母斑対、薄いおよび厚い初代メラノーマ対、リンパ節および内蔵メラノーマ転移についてのＡＢＣＢ５染色強度の有意な差を示す、Ｃｈｒｏｍａｖｉｓｉｏｎ自動細胞イメージシステムによる分析を説明するチャートを示す（薄いもしくは厚い母斑対薄いもしくは厚い初代メラノーマ、または対リンパ節もしくは内臓転移、全てのＰ値＜０．００１；薄い初代メラノーマ対厚い初代メラノーマ、Ｐ＝０．００４；薄いおよび厚い初代メラノーマ対リンパ節転移、Ｐ＝０．０１、リンパ節転移対内臓転移、Ｐ＝０．０２５）。図１（ｂ〜ｃ）は、ＡＢＣＢ５＋メラノーマ集団のいくつかの特徴付けを図示する。図１（ｂ）は、ＡＢＣＢ５、ＣＤ２０、ネスチン、ＴＩＥ−１、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３１、またはＢＭＰＲ１ａの発現についての臨床メラノーマ試料の単一色フローサイトメトリー分析を図示する。示されるのは、ｎ＝６メラノーマ患者についての％陽性細胞である（水平方向の棒線は平均発現を示す）。図１（ｃ）は、二色フローサイトメトリーによって決定されたＡＢＣＢ５＋またはＡＢＣＢ５−臨床メラノーマ細胞によるＣＤ２０、ネスチン、ＴＩＥ−１、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３１、またはＢＭＰＲ１ａの発現を示す。％陽性細胞（平均±ＳＥＭ）は、ｎ＝３〜６メラノーマ患者について示される。 図２は、マウス腫瘍異種移植モデルに対する、ヒトにおけるＡＢＣＢ５＋メラノーマ細胞サブセットのインビボ腫瘍原性を図示する一連のグラフおよびイメージである。図２（ａ）（左側パネル）は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの皮下異種移植（１０７、１０６、または１０５細胞／接種物）に続いての未分離（ＵＳ）、ＡＢＣＢ５−、またはＡＢＣＢ５＋Ｇ３３６１メラノーマ細胞のインビボ腫瘍形成能力（％）を示すグラフである。（中央のパネル）は、腫瘍形成能力５０％（ＴＦ５０）の決定についての、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの、未分離（ＵＳ）、ＡＢＣＢ５−、またはＡＢＣＢ５＋Ｇ３３６１メラノーマ細胞についての接種された細胞数に対してプロットされた腫瘍形成無しの％接種を示すグラフである。（右側パネル）は、未分離（ＵＳ）、ＡＢＣＢ５−、またはＡＢＣＢ５＋Ｇ３３６１メラノーマ細胞（１０７／接種物）のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの皮下異種移植から８週間後の初代メラノーマ異種移植片の腫瘍容量（平均±ＳＥＭ）を示す。 図２は、マウス腫瘍異種移植モデルに対する、ヒトにおけるＡＢＣＢ５＋メラノーマ細胞サブセットのインビボ腫瘍原性を図示する一連のグラフおよびイメージである。図２（ｂ）（左側パネル）は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの皮下異種移植（２×１０６、２×１０５、または２×１０４細胞／接種物）に続いての未分離（ＵＳ）、ＡＢＣＢ５−、またはＡＢＣＢ５＋Ａ３７１メラノーマ細胞のインビボ腫瘍形成能力（％）を示すグラフである。（中央パネル）は、腫瘍形成能力５０％（ＴＦ５０）の決定についての、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの未分離（ＵＳ）、ＡＢＣＢ５−、またはＡＢＣＢ５＋Ａ３７５メラノーマ細胞についての接種された細胞数に対してプロットされた腫瘍形成無しの％接種を図示する。（右側のパネル）は、未分離（ＵＳ）、ＡＢＣＢ５−、またはＡＢＣＢ５＋Ａ３７５メラノーマ細胞（２×１０５／接種物）のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの皮下異種移植からの５週間後の初代メラノーマ異種移植片の腫瘍容量（平均±ＳＥＭ）を示す。 図２は、マウス腫瘍異種移植モデルに対する、ヒトにおけるＡＢＣＢ５＋メラノーマ細胞サブセットのインビボ腫瘍原性を図示する一連のグラフおよびイメージである。図２（ｃ）（左側パネル）は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける代表的な初代未分離メラノーマ細胞由来異種移植片でのＡＢＣＢ５発現についての免疫組織化学を示し、点線によって分離された３つの区別される領域：ＡＢＣＢ５−／メラニン陰性（パネルの上方左側）、ＡＢＣＢ５−／メラニン陽性（パネルの上方右側）およびＡＢＣＢ５＋／メラニン陰性（パネルの底部半分）を示す。（右側パネル）は、ＡＢＣＢ５（ＦＩＴＣ）およびＶＥ−カドヘリン（テキサスレッド）の共発現についての凍結されたメラノーマ異種移植片切片の免疫蛍光二重染色の一連のイメージである。核は、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールで染色することによって可視化される（ＤＡＰＩ、青色）。 図２は、マウス腫瘍異種移植モデルに対する、ヒトにおけるＡＢＣＢ５＋メラノーマ細胞サブセットのインビボ腫瘍原性を図示する一連のグラフおよびイメージである。図２（ｄ）は、ＡＢＣＢ５＋メラノーマ細胞由来初代腫瘍から単離されたＡＢＣＢ５−またはＡＢＣＢ５＋細胞（１０７／接種物）のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける二次的腫瘍形成能力（％）を図示するグラフである。 図２は、マウス腫瘍異種移植モデルに対する、ヒトにおけるＡＢＣＢ５＋メラノーマ細胞サブセットのインビボ腫瘍原性を図示する一連のグラフおよびイメージである。図２（ｅ）には、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの皮下異種移植から８週間後の未分離（ＵＳ）、ＡＢＣＢ５−またはＡＢＣＢ５＋の新たに患者に由来するメラノーマ細胞（１０６／接種物）のインビボ腫瘍形成能力（％）（左側パネル）および腫瘍容量（平均±ＳＥＭ、右側パネル）を図示する２つのグラフが挙げられる。 図３は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤレシピエントマウスにおけるヒトＡＢＣＢ５＋メラノーマ細胞の腫瘍原性、自己更新および分化のインビボ追跡を図示する。図３（ａ）（左側パネル）は、（大きなパネルに示される）異種移植に先立って、１０％ＡＢＣＢ５＋Ｇ３３６１／ＤｓＲｅｄ２および９０％ＡＢＣＢ５−Ｇ３３６１／ＥＹＦＰ細胞よりなる腫瘍細胞接種物の二色フローサイトメトリー（Ｆ１１（ＥＹＦＰ）対Ｆ１２（ＤｓＲｅｄ２）ドットプロット）を示す。（小さなパネルに示された）対照は、非トランスフェクトＧ３３６１ヒトメラノーマ細胞（頂部）、Ｇ３３６１／ＤｓＲｅｄ２細胞（中央）、およびＧ３３６１／ＥＹＦＰ細胞（底部）である。（右側パネル）は、（大きなパネルに示された）１０％ＡＢＣＢ５＋Ｇ３３６１／ＤｓＲｅｄ２および９０％ＡＢＣＢ５−Ｇ３３６１／ＥＹＦＰ細胞の接種から６週間後に形成された、解離性異種移植片腫瘍の二色フローサイトメトリー（Ｆ１１（ＥＹＦＰ）対Ｆ１２（ＤｓＲｅｄ２）ドットプロット）を示す。（小さなパネルに示された）対照は、非トランスフェクトＧ３３６１ヒトメラノーマ細胞（頂部）、Ｇ３３６１／ＤｓＲｅｄ２細胞（中央）、Ｇ３３６１／ＥＹＦＰ細胞（底部）である。 図３は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤレシピエントマウスにおけるヒトＡＢＣＢ５＋メラノーマ細胞の腫瘍原性、自己更新および分化のインビボ追跡を図示する。図３（ｂ）は、ｔ＝４または６週間（各々、ｎ＝三連）における得られたインビボ腫瘍、および各異種移植された細胞接種（ｎ＝６）についての数週間後メラノーマ細胞接種に対してプロットされた、ＡＢＣＢ５＋起源のＤｓＲｅｄ２＋細胞（％ＤｓＲｅｄ２＋／（％ＤｓＲｅｄ２＋＋％ＥＹＦＰ＋）×１００）、またはＡＢＣＢ５−起源のＥＹＦＰ＋細胞（％ＥＹＦＰ＋／（％ＤｓＲｅｄ２＋＋％ＥＹＦＰ＋）×１００）の平均パーセンテージ（平均±ＳＥＭ）のグラフである。 図３は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤレシピエントマウスにおけるヒトＡＢＣＢ５＋メラノーマ細胞の腫瘍原性、自己更新および分化のインビボ追跡を図示する。図３（ｃ）は、１０％Ｇ３３６１ＤｓＲｅｄ２ ＡＢＣＢ５＋および９０％Ｇ３３６１／ＥＹＦＰ ＡＢＣＢ５−細胞接種のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの皮下異種移植から６週間後の、Ｇ３３６１／ＤｓＲｅｄ２およびＧ３３６１／ＥＹＦＰ細胞（頂部および中央列）、およびインビボ形成腫瘍に由来する凍結組織切片（底部列）の一連のデュアルチャネル蛍光顕微鏡イメージである。左側パネルは明るい視野を示し、中央左側パネルはＤｓＲｅｄ２（ＡＢＣＢ５＋起源）を示し、中央右側パネルはＥＹＦＰ（ＡＢＣＢ５−起源）を示し、最も右側のパネルは融合されたイメージを示す（サイズバー：２５μｍ）。 図３は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤレシピエントマウスにおけるヒトＡＢＣＢ５＋メラノーマ細胞の腫瘍原性、自己更新および分化のインビボ追跡を図示する。図３（ｄ）（左側パネル）は、１０％ＡＢＣＢ５＋Ｇ３３６１／ＤｓＲｅｄ２および９０％ＡＢＣＢ５−Ｇ３３６１／ＥＹＦＰ細胞の接種から６週間後における、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて形成された腫瘍に由来するＡＢＣＢ５＋細胞（頂部）およびＡＢＣＢ５−細胞（底部）でのＤｓＲｅｄ２およびＥＹＦＰ発現のフローサイトメトリー分析を図示する。（右側パネル）は、ｎ＝三連腫瘍に由来するＡＢＣＢ５＋およびＡＢＣＢ５−細胞サブセットにおける、（各々、％ＤｓＲｅｄ２＋／（％ＤｓＲｅｄ２＋＋％ＥＹＦＰ＋）×１００または％ＥＹＦＰ／（％ＤｓＲｅｄ２＋＋％ＥＹＦＰ＋）×１００として計算された）ＤｓＲｅｄ２またはＥＹＦＰ蛍光細胞いずれかの平均パーセンテージ（平均±ＳＤ）を図示するグラフである。 図４は、メラノーマ異種移植片成長に対するＡＢＣＢ５ｍＡｂ効果の分析を表わす一連のグラフおよびイメージである。図４（ａ）は、未処理（ｎ＝１８）、イソタイプ対照ｍＡｂ処理（ｎ＝１０）、または抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ処理（ｎ＝１１）動物についての、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへの皮下メラノーマ細胞接種（１０７細胞／接種物）後の日数に対してプロットされたメラノーマ異種移植片の腫瘍容量（平均±ＳＥＭ）を測定するグラフである。［腹腔内ｍＡｂ投与の日数は矢印によって示される］。 図４は、メラノーマ異種移植片成長に対するＡＢＣＢ５ｍＡｂ効果の分析を表わす一連のグラフおよびイメージである。図４（ｂ）は、未処理（ｎ＝１８）、イソタイプ対象ｍＡｂ処理（ｎ＝１０）、または抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ処理（ｎ＝１１）動物における、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへの皮下メラノーマ細胞接種（１０７細胞／接種物）から５８日後において腫瘍形成速度（％）を測定するグラフである。 図４は、メラノーマ異種移植片成長に対するＡＢＣＢ５ｍＡｂ効果の分析を表わす一連のグラフおよびイメージである。図４（ｃ）は、ヌードマウスにおけるヒトメラノーマ異種移植片のＡＢＣＢ５免疫組織化学（左側パネル）および慣用的な組織学（Ｈ＆Ｅ）（右側パネル）を図示する。（パネルは隣接する切片を表わす）。ＡＢＣＢ５＋領域は（中央点線の左側の）未メラニン化領域と共に分離し、他方、ＡＢＣＢ５−領域は、（中央点線の右側の）粒状茶色−黒色メラニン化を示す領域と関連する。 図４は、メラノーマ異種移植片成長に対するＡＢＣＢ５ｍＡｂ効果の分析を表わす一連のグラフおよびイメージである。図４（ｄ）は、抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ（実線）またはイソタイプ対照ｍＡｂ（陰影）の腹腔内投与から１日後における、メラノーマ異種移植片における表面結合抗体についてのフローサイトメトリー分析（ＦＩＴＣ、Ｆｌ１）を示す。抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ処理マウスから単離された代表的なメラノーマ異種移植片は、イソタイプ対照処理動物に由来するものと比較して２０．５％陽性を呈した。 図４は、メラノーマ異種移植片成長に対するＡＢＣＢ５ｍＡｂ効果の分析を表わす一連のグラフおよびイメージである。図４（ｅ）は、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス脾臓に由来する未標識エフェクター免疫細胞での２４時間共培養（１：４０のエフェクターに対する標的の比率）に続いての、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で逆染色された、抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ、またはイソタイプ対照ｍＡｂで処理されたまたは未処理ＤｉＯ標識メラノーマ標的細胞培養における二色フローサイトメトリーによる抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の評価をまとめる。（左側パネル）は、抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ処理（頂部）、イソタイプ対照ｍＡｂ処理（中央）、またはＡｂ未処理（底部）標的／エフェクター共培養の右上象限で見出された、溶解されたＤＩＯ＋ＰＩ＋標的細胞でのＡＤＣＣの一連の代表的な二色フローサイトメトリー結果である。（右側パネル）は、ＡＤＣＣの分析を図示する（前記した処理群におけるｎ＝六連実験での％平均±ＳＥＭが示される（「ＡＤＣＣ（％）＝（ＤＩＯ＋ＰＩ＋パーセント試料陽性）−（平均Ａｂ未処理ＤＩＯ＋ＰＩ＋パーセント試料陽性）」）。 図５は、異種移植に先立って、未分離、ＡＢＣＢ５＋、またはＡＢＣＢ５−ヒトメラノーマ細胞の特徴付けをまとめる。図５（ａ）は、ヒトＡ３７５メラノーマ細胞の未分離の培養において決定された前方散乱（ＦＳＣ）に対してプロットされた代表的なフローサイトメトリー表面ＡＢＣＢ５発現または対照染色（ＦＩＴＣ、Ｆｌ１）を図示する。 図５は、異種移植に先立って、未分離、ＡＢＣＢ５＋、またはＡＢＣＢ５−ヒトメラノーマ細胞の特徴付けをまとめる。図５（ｂ）は、蛍光色素カルセイン−ＡＭの細胞取り込みおよび酵素活性によって決定された未分離（左側パネル）、ＡＢＣＢ５＋（中央パネル）およびＡＢＣＢ５−（右側パネル）ヒトメラノーマ細胞についての細胞生存率の代表的な単一色フローサイトメトリー分析を図示する。上方パネルは、カルセイン−ＡＭ試料を図示し、下方パネルはカルセイン−ＡＭ無しの対照を図示する。生存細胞はＦＳＣ対Ｆ１２プロットのＲ１ゲートで見出される。 図５は、異種移植に先立って、未分離、ＡＢＣＢ５＋、またはＡＢＣＢ５−ヒトメラノーマ細胞の特徴付けをまとめる。図（ｃ）は、未分離および精製されたＡＢＣＢ５＋またはＡＢＣＢ５＋枯渇（ＡＢＣＢ５−）Ｇ３３６１ヒトメラノーマ細胞のＡＢＣＢ５発現を示すグラフである。 図６は、相対的ＡＢＣＢ５遺伝子発現のメラノーマ細胞培養倍加時間との相関分析をまとめるグラフである。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって決定された相対的ＡＢＣＢ５遺伝子発現（平均±ＳＤ、ｎ＝３の独立した実験）、および１０のメラノーマ細胞系の培養倍加時間のピアソン相関（１、ＬＯＸ ＩＭＶＩ；２、ＳＫ−ＭＥＬ−５；３、Ｍ１４；４、Ａ３７５；５、Ｇ３３６１；６、ＵＡＣＣ−６２；７、ＳＫ−ＭＥＬ−２８；８、ＵＡＣＣ−２５７；９、ＳＫ−ＭＥＬ−２；１０、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ）；ｒはピアソン相関係数である。 図７は、逆転写によるＲＮＡ重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）可変領域（ＶＲ）から生じたｃＤＮＡバンドを図示するゲルである。ＨＣおよびＬＣ ＶＲ ＰＣＲ産物の双方を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ配列決定ベクターｐＣＲ２．１へクローン化し、ＴＯＰ１０細胞に形質転換した。 図８は、３Ｃ２−１Ｄ１２抗体ＨＣ ＶＲアミノ酸配列である。 図９は、３Ｃ２−１Ｄ１２抗体ＨＣ ＶＲヌクレオチド配列である。 図１０は、３Ｃ２−１Ｄ１２抗体ＬＣ ＶＲアミノ酸配列である。 図１１は、３Ｃ２−１Ｄ１２抗体ＬＣ ＶＲヌクレオチド配列である。 図１２は３Ｃ２−１Ｄ１２抗体の全長重鎖ヌクレオチド配列である。 図１３は３Ｃ２−１Ｄ１２抗体の全長軽鎖ヌクレオチド配列である。
腫瘍成長を担う、自己更新および分化が可能な腫瘍開始細胞が、ヒト血液悪性疾患および固形癌で同定された。そのような少数派集団がヒト患者における腫瘍進行に関連する場合、腫瘍開始細胞の特異的標的化は、全身療法に現在抵抗性である癌を根絶するための新規な戦略を提供するであろう。化学抵抗性メディエーターＡＢＣＢ５の発現によって定義されるヒト悪性癌開始細胞が増大した亜集団が、本発明に従って同定された。以下の実施例に示すように、この腫瘍形成性少数派集団の特異的標的化は、腫瘍の成長を抑制する。
本発明者らは、最近、メラノーマ細胞系列の細胞によって優先的に発現されることが示された新規なヒト多薬物耐性トランスポーターであるＡＢＣＢ５をクローン化し、特徴付けた。ＡＢＣＢ５の阻害によって通常、耐性のメラノーマ細胞はドキソルビシンに対して感受性となる。我々は、ＡＢＣＢ５発現が、１）幹細胞表現型および機能の腫瘍形成性メラノーマ細胞をマークし；および２）ＡＢＣＢ５＋メラノーマ幹細胞区画の特異的標的化が、メラノーマ療法に対する新規で高度に有望な幹細胞標的化アプローチを構成することを示した。該データは、実施例部分により詳細に記載される。
さらに、一連の、マウスに対するヒト異種移植実験において、ＡＢＣＢ５＋メラノーマ細胞は、ＡＢＣＢ５−バルク集団よりも大きな腫瘍形成性能力を保有した。さらに、インビボ遺伝子的細胞の運命追跡は、腫瘍形成性ＡＢＣＢ５＋癌細胞がＡＢＣＢ５＋およびＡＢＣＢ５−の子孫を生じさせることができ、他方、ＡＢＣＢ５−細胞は、ＡＢＣＢ５−子孫を専ら生起させることを示した。ヒト悪性疾患における化学的抵抗性のメカニズムおよび癌幹細胞の間の特異的関係のこの同定は、癌療法に対する幹細胞標的化アプローチについての重要な示唆を有する。
また、本発明により、標的化された免疫療法アプローチを介するＡＢＣＢ５＋メラノーマ細胞の除去は、腫瘍細胞のバルク集団に支配的に向けられた療法戦略によって得られるものよりも、持続性の臨床的応答を達成するための新しい戦略を表わすことができることも判明した。従って、我々は、抗ＡＢＣＢ５モノクローナル抗体（ｍＡｂクローン３Ｃ２−１Ｄ１２）の全身投与を介する化学的耐性の腫瘍形成性ヒトＡＢＣＢ５＋メラノーマ幹細胞の選択的除去が、ヌードマウスに対するヒト腫瘍異種移植片に関連するヒト悪性メラノーマの重要な前臨床動物モデルにおける腫瘍形成／腫瘍根絶の阻害を容易とするか否かを調べた。
以下により詳細に示すように、我々は、マウスに対するヒトメラノーマ異種移植片モデルにおいて、インビボ投与された抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂの生物学的利用性およびメラノーマ結合効力／特異性を調べた。抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂの投与の結果、検出可能なインビボ血清レベルが得られるか否かを調べるために、マウス血清を、新たに採取されたヒトメラノーマ細胞培養物と共にインキュベートし、引き続いて、ＦＩＴＣコンジュゲート型ヤギ抗マウスＩｇ二次Ａｂでの細胞の逆染色、および単一色フローサイトメトリーによるその後の分析を行った。抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ処理マウスに由来する全てのテストされた希釈物において、血清とプレインキュベートされたメラノーマ培養物への、ＦＩＴＣコンジュゲート型ヤギ抗マウスＩｇ二次Ａｂの有意な結合が観察された。結合は、イソタイプ対照処理または未処理動物いずれかに由来する血清では観察されなかった。１：１００と低い血清希釈における５．４％ＡＢＣＢ５陽性の検出（図１Ａ）は、インビトロ培養されたＧ３３６１メラノーマ細胞の中でも、以前に報告されたＡＢＣＢ５＋細胞頻度に合致した（Ｆｒａｎｋ，Ｎ．Ｙ．ら、ＡＢＣＢ５−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６５，４３２０−３３（２００５）；Ｆｒａｎｋ，Ｎ．Ｙ．ら、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ ｂｙ ＡＢＣＢ５ Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｅｔｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８，４７１５６−６５（２００３））。これらの知見は、全身投与された抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂの結果、効果的なインビボｍＡｂ血清レベルがもたらされることを示す。本明細書中に記載されたデータは、さらに、全身投与された抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂがインビボにて異種移植されたＡＢＣＢ５＋ヒトメラノーマ細胞に効果的にかつ優先的に結合し、インビボ治療標的化アプローチについてのその適当性に関する証拠を提供することを示す。ヌードマウスへのヒトメラノーマ細胞異種移植片を用い、抗体によるＡＢＣＢ５＋メラノーマ幹細胞区画の特異的標的化が、メラノーマ療法に対する有効な幹細胞標的化アプローチであったことが示された。
本発明は、部分的には、ＡＢＣＢ５に結合するヒトモノクローナル抗体のようなＡＢＣＢ５結合分子の単離および特徴付けが癌の治療で有用であるという発見に基づく。ＡＢＣＢ５は、癌性幹細胞に存在する多薬物耐性トランスポーターである。
かくして、本発明の組成物は、癌を有する、または有する危険性がある被験体の治療で有用であろう。被験体は、ヒトまたは限定されるものではないが、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、および霊長類、例えば、サルを含めた脊椎動物、哺乳動物を意味する。かくして、本発明を用いて、非ヒト被験体において疾患または状態を治療することもできる。例えば、癌は、愛玩動物（すなわち、ネコおよびイヌ）における死の主な原因の１つである。好ましくは、被験体はヒトである。
本明細書中で用いるように、癌のような障害に関して用いる場合、治療、治療された、または治療しているという用語は、治療法がない場合と比較して、疾患と闘うために、疾患が悪くなるのを妨げるために、または疾患の進行を遅らせるために、疾患の発生に対する被験体の抵抗性を増加させる、または換言すれば、被験体が疾患を発生する確率を減少させる予防的処置、ならびに被験体が疾患を発生した後の処置をいう。
癌を発生する危険性がある被験体は、癌を発生する確率が高い者である。これらの被験体には、例えば、その存在が、癌を発生する高い確率に対して相関的関係を有することが示されている遺伝的異常を有する被験体、およびタバコ、アスベスト、または他の化学的毒素のような癌原因剤に曝露された被験体、または従前に癌で治療されたことがあり、明らかな寛解中である被験体を含む。癌を有する危険性がある被験体は、前癌病変を有する被験体も含む。前癌病変とは、改変された特性を有し、皮膚癌に転ずる危険性のある組織の領域である。前癌病変は、例えば、ＵＶ照射、遺伝学、ヒ素、タールまたはｘ線照射のような癌原因への暴露によって引き起こされ得る。
癌を有する被験体は、検出可能な癌性細胞を有する被験体である。癌は悪性または非悪性癌であってよい。癌または腫瘍には、限定されるものではないが、胆管癌；脳癌；乳癌；頸癌；絨毛癌；結腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；表皮内新生物；リンパ腫；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）；メラノーマ；神経芽細胞腫；口腔癌；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；肉腫；皮膚癌；精巣癌；甲状腺癌；および腎臓癌、ならびに他の癌腫および肉腫を含む。好ましくは、癌には、ＡＢＣＢ５を発現する癌幹細胞を含む。
所望により、治療に先立って、ＡＢＣＢ５陽性幹細胞の存在は、本明細書中に記載された結合分子を用いて検出することができる。本発明によって提供される検出または診断方法は、一般に、本発明の１以上の分子を被験体における、または被験体からの試料と接触させることを含む。好ましくは、試料をまず被験体から採取するが、インビボ検出方法も考えられる。試料には、癌幹細胞を保有することが疑われるいずれの体組織または体液も含むことができる。例えば、幹細胞は、通常、腫瘍塊において、または腫瘍塊の周りに見出される。
いくつかの態様において、本発明は、ペプチド、抗体、抗体断片および小分子のような結合性分子を提供する。本発明の分子はＡＢＣＢ５に結合し、腫瘍殺傷を増強させる。該結合分子とは、本明細書中においては、ＡＢＣＢ５に選択的に結合する単離された分子をいう。そのような抗体は、その源にかかわらずＡＢＣＢ５に結合することができるのは理解されるべきである。従って、本発明の抗体は、例えば、メラノーマ細胞ＡＢＣＢ５に結合すると定義され、かつ、例えば、メラノーマ細胞、ならびに乳癌のような他の癌において抗腫瘍効果を検出し、および／またはそれを増強させることができる。
いずれかの特定の理論に拘束されるつもりはないが、腫瘍および癌の治療は、腫瘍形成性幹細胞が慣用的な治療によって有効的に標的化されないが故に失敗するであろうと考えられる。本発明のＡＢＣＢ５結合分子は、特異的に標的化し、これらの細胞の破壊に関与する。かくして、これらの細胞を単独で、または慣用的な療法と組合せて用いる場合、腫瘍の最も攻撃的な細胞が殺傷できる。
抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体媒介細胞傷害性（ＣＤＣ）、または抗体依存性マクロファージ媒介細胞傷害性（ＡＢＭＣ）、および／または幹細胞腫瘍原性に寄与し得るＡＢＣＢ５機能の阻害を含めた抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ治療が、このレシピエントヌードマウスモデルにおいてインビボ腫瘍形成性成長、およびヒトメラノーマ異種移植片の腫瘍生存性を阻害し得るいくつかの可能なメカニズムがある。これらのメカニズムのいずれも、対照と比較して、ＡＢＣＢ５−発現腫瘍細胞サブセットのみを標的化すると予測される。また、我々は、化学増感、またはイムノトキシン媒介細胞除去戦略を介する、ＡＢＣＢ５＋メラノーマ幹細胞の抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ媒介インビボ治療標的化を予測する。さらなる腫瘍幹細胞特異的遺伝子標的に向けての、毒素（化学的または生物学的毒素、放射性核種）、またはＡＢＣＢ５ ｍＡｂコンジュゲート型ｓｉＲＮＡのＡＢＣＢ５−標的化送達は、細胞毒素内在化を必要とするであろうから、我々は、ＡＢＣＢ５＋ヒトメラノーマ細胞への表面結合に続いての抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂの細胞内在化も調べた。結果は、抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂコンジュゲート型毒素が、化学的耐性のＡＢＣＢ５＋ヒトメラノーマ細胞において細胞内区画に特異的に送達できることを示し、臨床的メラノーマおよび他の癌の治療に対するこの新規なアプローチの治療的利点を強調する。
本明細書中で用いられるＡＢＣＢ５に選択的に結合する分子とは、ＡＢＣＢ５と相互作用し、所望により、ＡＢＣＢ５活性に干渉してもよい分子、例えば、小分子、ペプチド、抗体、断片をいう。いくつかの実施形態において、分子はペプチドである。
本発明のペプチドは、最小限、ＡＢＣＢ５に結合する領域を含む。ＡＢＣＢ５−結合領域は、いくつかの実施形態において、本発明の抗体のＡＢＣＢ５−結合領域に由来し、あるいは、それらはそのような領域の機能的に同等な変異体である。従って、抗体由来ＡＢＣＢ５−結合領域の２つの特に重要なクラスは、本明細書中に記載された抗体の可変領域およびＣＤＲである。ＣＤＲおよび可変領域の核酸は、抗体産生細胞からクローン化することができ、または本明細書中に記載された配列に基づいて合成的に調製することができる。
用語「抗体」は、本明細書中においては、最も広い意味で用いられ、具体的には、無傷モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷抗体から形成された多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体断片、所望の生物学的活性を呈する限りはｓｃＦｖのような抗体様分子におよぶ。天然抗体は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロテトラマー糖蛋白質をいう。各重鎖および軽鎖は規則的に間隔が設けられた鎖内ジスルフィドブリッジを有する。各重鎖は、１つの端部において、可変ドメイン（ＶＨ）、続いての多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、１つの端部において可変ドメイン（ＶＬ）およびその他の端部において定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の最初の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメインの間に界面を形成すると考えられる。
可変ドメインのある部分は、抗体の間で配列が専ら異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性に用いられる。しかしながら、変動が抗体の可変ドメイン全体にわたって均一には分布していない。それは、軽鎖および重鎖可変ドメインの双方において、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）または「超可変領域」と呼ばれる３つまたは４つのセグメントに集結される。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、ＣＤＲによって連結された、βシート立体配置をかなり取る４または５のＦＲ領域を含み、それは、βシート構造を連結するループを形成し、ある場合には、βシート構造の部分を形成する。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接して一緒に保持され、他の鎖からのＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２，Ｖｏｌ．Ｉ．ｐａｇｅｓ ６４７−６６９（１９９１）参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に必ずしも直接的には関与しないが、抗体依存性細胞傷害性において抗体の関与のような種々のエフェクター機能を呈する。
超可変領域またはＣＤＲは、本明細書中で用いるように、抗原結合部位を形成し、抗原特異性の主な決定基である、抗体の極端な配列変動の可変領域内のサブ領域を定義する。１つの定義によると、それは軽鎖可変領域における残基（Ｋａｂａｔ命名法）２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、および重鎖可変量基における残基（Ｋａｂａｔ命名法 ３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、９５〜１０２（Ｈ３）であり得る。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｎｎｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．［１９９１］）。
「無傷」抗体は、抗原結合可変領域ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であってよい。好ましくは、無傷抗体は１以上のエフェクター機能を有する。抗体断片の産生のために種々の技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は無傷抗体の蛋白質分解消化を介して誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７（１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）参照）。しかしながら、これらの断片は、今や、組換え宿主細胞によって直接的に産生することができる。例えば、抗体断片は、抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片はＥ．ｃｏｌｉから直接的に回収することができ、化学的にカップリングさせて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２））。もう１つのアプローチによると、Ｆ（ａｂ’）２断片は組換え宿主細胞から直接的に単離することができる。
「抗体断片」は、無傷抗体の一部、好ましくは、無傷抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例にはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；単一鎖抗体分子；および抗体断片から形成された多特異的抗体を含む。抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位、およびその名称は容易に結晶化するその能力を反映する残存「Ｆｃ」断片を持つ、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生じる。ペプシン処理は、２つの抗原組合せ部位を有し、依然として、抗原を架橋させることができるＦ（ａｂ’）２断片を生じる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含有する最小抗体断片である。この領域は、密な非共有結合会合した１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインのダイマーよりなる。各々の可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面の抗原結合部位を規定するのは、この立体配置においてである。集合的に、６つのＣＤＲは、抗原結合特異性を抗体に付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、全結合部位よりも低い親和性におけるものであるが、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。
Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１以上のシステインを含めた重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における数個の残基の付加だけ、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’についての本明細書中についての表示である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、Ｆａｂ’断片の間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として作製された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
用語「Ｆｃ領域」は、無傷抗体のパパイン消化によって生じさせることができる免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するのに用いられる。Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または変異体Ｆｃ領域であってよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、約Ｃｙｓ２２６の位置におけるアミノ酸残基から、または約ＰＲＯ２３０の位置から、Ｆｃ領域のカルボキシル末端へ伸びるように定義される。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、所望により、ＣＨ４ドメインを含んでもよい。「Ｆｃ領域鎖」とは、本明細書中においては、Ｆｃ領域の２つのポリペプチド鎖の１つを意味する。
「ヒンジ領域」およびその変形は、本明細書中で用いるように、例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，ＮＹ）（４ｔｈ ｅｄ．，１９９９）に説明された、当該分野で公知の意味を含む。
その重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに帰属させることができる。免疫グロブリンの５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちいくつかは、さらに、サブクラス（イソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、各々、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配置はよく知られている。
いずれかの脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（Κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に区別されるタイプの１つに帰属させることができる。
好ましくは、ＡＢＣＢ５結合ペプチドは、最小限、本明細書中に記載されたものからの少なくとも１つのＣＤＲ、または本明細書中に記載された配列に由来し得るものを含む。本明細書中で用いるように、ＡＢＣＢ５結合ＣＤＲは本明細書中に記載されたＣＤＲである。ＡＢＣＢ５結合領域はＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ１、ＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ２、またはＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ３であってよく、その全ては、抗体、および本明細書中に開示された抗体の可変鎖に由来する。
本明細書中で用いるように、「ＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ１」は、好ましくは、特異的にＡＢＣＢ５に結合し、本明細書中に記載された抗体の重鎖または軽鎖可変ドメインいずれかに由来するＣＤＲ１である。それは、配列番号３および配列番号６よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。「ＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ２」は、好ましくは特異的にＡＢＣＢ５に結合し、本明細書中に記載された抗体の重鎖または軽鎖可変領域いずれかに由来するＣＤＲ２である。それは、配列番号４および配列番号７よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。「ＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ３」は、好ましくは特異的にＡＢＣＢ５に結合し、本明細書中に記載された抗体の重鎖または軽鎖可変領域いずれかに由来するＣＤＲ３である。それは、配列番号５および配列番号８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。
本明細書中でリストされた配列に加え、本発明は、以下により詳細に記載するように、アミノ酸またはヌクレオチド配列いずれかにおいて保存的置換変異体を含めたこれらの配列の機能的に同等な変異体を含むことを意図する。
本発明のペプチドは、試料において、または被験体からの、ＡＢＣＢ５抗原またはＡＢＣＢ５発現細胞を検出することを目的とする診断方法においてとりわけ有用である。最小限、これらの方法で有用なペプチドは、それが腫瘍殺傷を高めるか否かにかかわらず、ＡＢＣＢ５を認識し、結合するのみを必要とする。抗体は、例えば、診断ＦＡＣＳ分析、ウェスタンブロッティング、および免疫組織化学で使用することができる。そのような抗体はインビボ診断用途で使用することもでき、そこでは、標識コンジュゲート型ｍＡｂを用いて、ＡＢＣＢ５発現腫瘍の化学療法または外科的療法に続いて、腫瘍負荷、腫瘍局所化または残存腫瘍塊を評価することができる。重要な実施形態において、抗体およびその断片は、選択的にＡＢＣＢ５に結合する。いくつかの実施形態において、それは本明細書中に記載された抗体クローンに由来する１以上のＣＤＲを保有するのみである。好ましい実施形態において、ペプチドはＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ３を含み、なおより好ましくは、ペプチドは重鎖ＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ３を含む。ＡＢＣＢ５への結合を行うには、ＣＤＲの全てが必要というのではないことは理解されるべきである。しかしながら、いくつかの実施形態において、ペプチドは本明細書中で開示された所与の抗体クローンのＣＤＲの全てを含む。
さらに、本発明は、本明細書中で提供された可変領域の間のＣＤＲの交換も含むと理解されるべきである。好ましくは、重鎖ＣＤＲをもう１つの重鎖可変領域ＣＤＲと交換し、同様に、軽鎖ＣＤＲはもう１つの軽鎖可変領域ＣＤＲと交換される。
ペプチドはＡＢＣＢ５結合可変領域も含むことができる。ＡＢＣＢ５結合可変領域は、本明細書中に記載された可変領域（好ましくは、抗体可変領域）である。配列番号１は、重鎖可変領域のアミノ酸配列に対応する。配列番号９は、重鎖可変領域のヌクレオチド配列に対応する。配列番号２は、軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対応する。配列番号１０は、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列に対応する。
本発明の核酸またはペプチドは、本明細書中で提供された配列に由来してもよいのは理解されるべきである。全長可変領域、または全長可変領域の断片に対応するペプチドおよび可変領域を含む抗体を生じさせるために、これらの配列は、（例えばＣＤＲによって）クローン化し、ベクターおよび／または細胞に挿入することができる。従って、抗体、または軽鎖および重鎖可変領域の組合せを含むその断片を生じさせることが可能である。
本発明は、抗体、および種々のイソタイプの抗体断片を捕捉することを意図する。抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはｓＩｇＡイソタイプのものであってよい。本発明は、限定されるものではないが鳥類およびサメにおけるＩｇＹのような非ヒト種において同様に見出されるイソタイプを捕捉することを意図する。種々のイソタイプの定常領域をコードするベクターが知られており、既に記載されている（例えば、Ｃｏｌｏｍａら、Ｎｏｖｅｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９２ Ｊｕｌ ３１；１５２（１）：８９−１０４；Ｇｕｔｔｉｅｒｉら、Ｃａｓｓｅｔｔｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎｔｏ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｔａｂｌｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ．Ｈｙｂｒｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ．２００３ Ｊｕｎ；２２（３）：１３５−４５；ＭｃＬｅａｎら、Ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｕｒｉｎｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ｏｃｔ；３７（１４）：８３７−４５；Ｗａｌｌｓら、Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９３ Ｊｕｎ ２５；２１（１２）：２９２１−９；Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇら、Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９７ Ｍａｙ １２；２０４（１）：７７−８７参照）。
本発明のペプチドは単離されたペプチドである。本明細書中で用いるように、用語「単離されたペプチド」は、ペプチドが実質的に純粋であって、それと共に天然でまたはインビボ系において見出すことができる他の物質を、その意図した使用に現実的かつ適切な程度まで実質的に含まないことを意味する。特に、ペプチドは十分に純粋であって、例えば、医薬製剤の生産または配列決定において有用なようにその宿主細胞の他の生物学的構成要素を十分に含まない。本発明の単離されたペプチドは医薬製剤中で医薬上許容される担体と混合することができるので、ペプチドは製剤の小さな重量パーセントを含むのみである。それにもかかわらず、ペプチドは、生体系中でそれが会合することができる物質から実質的に分離されている点において、実質的に純粋である。
本発明のペプチドは好ましくは選択的にＡＢＣＢ５に結合する。本明細書中で用いるように、用語「選択的結合」および「特異的結合」は、非ＡＢＣＢ５由来化合物に対するよりはＡＢＣＢ５およびその断片に対してより大きな親和性でもって結合するペプチドの能力を相互交換的にいうのに用いられる。すなわち、ＡＢＣＢ５に選択的に結合するペプチドは、ＡＢＣＢ５およびその断片に結合するのと同一程度まで、かつ同一親和性でもって非ＡＢＣＢ５由来化合物に結合せず、炭水化物のペプチドミメティックスのようなＡＢＣＢ５のミミック、またはＡＢＣＢ５と同様にＡＢＣＢ５結合ペプチドに結合する抗イデオタイプ抗体の可変領域とされる架橋反応性抗原または分子を例外とする。いくつかの実施形態において、本発明のペプチドはＡＢＣＢ５およびその断片に対してのみ結合する。本明細書中で用いるように、腫瘍細胞ＡＢＣＢ５に選択的にまたは特異的に結合する結合ペプチドもまた、他の源からのＡＢＣＢ５に結合することができ、非ＡＢＣＢ５由来化合物に（たとえあるにしても）より小さな親和性でもって結合するであろう。より小さな親和性には、少なくとも１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、または９５％未満を含むことができる。
「単離された抗体」とは、本明細書中で用いるように、他の細胞物質から実質的に物理的に分離された（例えば、抗体を生じさせる細胞から分離された）、または本発明の診断もしくは治療方法いずれかにおけるその用途を妨げる他の物質から実質的に物理的に分離された抗体をいう。好ましくは、単離された抗体は抗体の均一な集団（例えば、モノクローナル抗体の集団）に存在する。単離された抗体の組成物は、しかしながら、限定されるものではないが、医薬上許容される担体、アジュバント等のような他の化合物と組合せることができる。
（本明細書中に記載されたもののような）単離されたハイブリドーマおよび単離された組換え細胞を含めた「単離された抗体産生細胞」とは、本明細書中で用いるように、他の細胞、他の身体物質（例えば、腹水組織および液）、ならびに例えば、単離された、好ましくは均一な抗体集団の産生においてその用途を妨げる他の物質から実質的に物理的に分離された抗体産生細胞をいう。
かくして、１つの実施形態において、本発明のペプチドは、ＡＢＣＢ５に特異的な単離された無傷可溶性モノクローナル抗体である。本明細書中で用いるように、用語「モノクローナル抗体」とは、同一のエピトープ（すなわち、抗原決定基）に特異的に結合する免疫グロブリンの均一な集団をいう。本発明のペプチドは、１つの実施形態において、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体である。軽鎖および重鎖可変領域のいずれかの組合せを有するモノクローナル抗体は、本発明に含まれる。
本発明は、例えば、３Ｃ２−１Ｄ１２の配列以外の抗体を含むことを意図し、但し、そのような抗体は本明細書中に記載されたモノクローナル抗体の結合特徴を有するものとする。所望により、これらのさらなる抗体は、ＡＢＣＢ５発現癌細胞の腫瘍殺傷も含む。当業者であれば、本明細書中において詳細に記載されたスクリーニングおよび結合アッセイを用いて、このモノクローナル抗体の機能的特徴を有する抗体を容易に同定することができる。
別の記載がない限り、用語「モノクローナル抗体３Ｃ２−１Ｄ１２」または「ｍＡｂ３Ｃ２−１Ｄ１２」とは、ネズミ３Ｃ２−１Ｄ１２抗体、またはそれに由来する抗原結合残基を有する抗体をいう。
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書中で用いるように、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわち、該集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る天然に生じる突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に向けられる。さらに、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含む慣用的な（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一決定基に対して向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それが他の免疫グロブリンによって汚染されていない、ハイブリドーマ培養によって合成される点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるものとしての抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。
モノクローナル抗体は実質的に均一な抗体の集団から得られ、すなわち、該集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る天然に生じる突然変異を除いて同一である。かくして、修飾語「モノクローナル」は、区別される抗体の混合物ではない抗体の特徴を示す。
例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法を用いて作製できるか、または組換えＤＮＡ方法によって作製することができる（米国特許第４，８１６，５６７号）。
ハイブリドーマ方法によっては、マウス、またはハムスターのような他の適当な宿主動物を前記したように免疫化して、免疫化で用いた蛋白質に特異的に結合するであろう抗体を産生する、または産生することができるリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫化することができる。次いで、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いてリンパ球をミエローマ細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
そのように調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、融合していない親ミエローマ細胞の成長または生存を阻害する１以上の物質を含有する適当な培養基に撒き、そこで成長させる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠如する場合、ハイブリドーマのための培養基は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、その物質はＨＧＰＲＴ欠乏細胞の成長を妨げる。
好ましいミエローマ細胞は、効果的に融合し、選択された抗体産生細胞によって抗体の安定な高レベルの産生を支持するものであり、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。これらのうち、好ましいミエローマ細胞系は、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来するもののようなネズミミエローマ系である。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞系もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；およびＢｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。
ハイブリドーマ細胞が成長している培養基を、抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の産生のためにアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈澱、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロ結合アッセイによって決定される。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定することができる。
所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、限界希釈手法によって該クローンをサブクローン化し、標準的な方法によって成長させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的のための適当な培養基には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水液腫瘍としてインビボにて成長させることができる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、適切には、例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような慣用的な抗体精製手法によって培養基、腹水液または血清から分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、（例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）慣用的な手法を用いることによって、容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい源として役立つ。一旦単離されれば、ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、それは、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはそうでなければ抗体蛋白質を産生しないミエローマ細胞のような宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現についての総説には、Ｓｋｅｒｒａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６−２６２（１９９３）およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．，１３０：１５１−１８８（１９９２）を含む。
さらなる実施形態において、モノクローナル抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載された技術を用いて生じた抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）は、各々、ファージライブラリーを用いるネズミおよびヒト抗体の単離を記載する。引き続いての刊行物は、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））による高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生、ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびインビボ組換えを記載する（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））。かくして、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する有益な代替法である。
典型的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインと置き換わり、または抗体の１つの抗原組合せ部位の可変ドメインと置き換わり、抗原に対する特異性を有する１つの抗原組合せ部位、および異なる抗原に対する特異性を有するもう１つの抗原組合せ部位を含むキメラ二価抗体を作製する。
他の実施形態において、ペプチドは抗体断片である。当該分野でよく知られているように、抗体分子の非常に小さな部分にすぎないパラトープは、抗体のそのエピトープへの結合に関与する（一般に、Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６）Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．（１９９１）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７ｔｈ Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；およびＰｉｅｒ ＧＢ，Ｌｙｃｚａｋ ＪＢ，Ｗｅｔｚｌｅｒ ＬＭ，（ｅｄｓ）．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００４）１ｓｔ Ｅｄ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．参照）。抗体のｐＦｃ’およびＦｃ領域は、例えば補体カスケードのエフェクターであり、ファゴサイトーシス細胞上のＦｃ受容体への結合を媒介することができるが、抗原結合には関与しない。Ｆ（ａｂ’）２断片と命名される、ｐＦｃ’領域がそれから酵素的に切断された、またはｐＦｃ’領域なくして産生された抗体は、無傷抗体の抗原結合部位の双方を保有する。単離されたＦ（ａｂ’）２断片は、その２つの抗原結合部位のため二価モノクローナル断片といわれる。同様に、Ｆａｂ断片と命名される、Ｆｃ領域がそれから酵素的に切断された、またはＦｃ領域なくして産生された抗体は、無傷の抗体分子の抗原結合部位の１つを保有する。さらに進めると、Ｆａｂ断片は、共有結合した抗体軽鎖、およびＦｄで示される抗体重鎖の一部（重鎖可変領域）よりなる。Ｆｄ断片は抗体特異性の主な決定基であり（単一のＦｄ断片は、抗体の特異性を改変することなく１０までの異なる軽鎖と会合することができる）、Ｆｄ断片は単離においてエピトープ結合能力を保有する。
用語Ｆａｂ、Ｆｃ、ｐＦｃ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖはどちらかの標準的な免疫学的意味で使用される［Ｋｌｅｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８２）；Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６）Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．（１９９１）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７ｔｈ Ｅｄ．，（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；およびＰｉｅｒ ＧＢ，Ｌｙｃｚａｋ ＪＢ，Ｗｅｔｚｌｅｒ ＬＭ，（ｅｄｓ）．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００４）１ｓｔ Ｅｄ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．］。
他の実施形態において、ＩｇＭ、ならびに本明細書中に記載されたモノクローナル抗体のＣＤＲのいくつかまたは全てを有するヒトＩｇＧ抗体を産生するために、本発明の抗体のＦｃ部分を置き換えることができる。特に重要なのは、ＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ３領域ならびに、より低度は低いが、他のＣＤＲ、および本明細書中に記載されたモノクローナル抗体のフレームワーク領域の部分を含めることである。そのようなヒト抗体は、ＡＢＣＢ５を好ましくは選択的に認識して結合するが、抗体それ自体に対してヒトにおいて免疫応答を誘導しない点で、特別な臨床的用途を有するであろう。
また、本発明は、ＡＢＣＢ５結合ペプチドの機能的に同等な変異体を含むことを意図する。「機能的に同等な変異体」は、本発明のペプチドと同一の機能（すなわち、ＡＢＣＢ５に結合する能力）を有する化合物である。機能的に同等な変異体は、性質がペプチドであり得るがそのように限定されないものである。例えば、それは炭水化物、ペプチドミメティック等であってよい。重要な実施形態において、機能的に同等な変異体は、依然としてＡＢＣＢ５に結合することができる、可変領域またはその中に保存的置換を持つＣＤＲのアミノ酸配列を有するペプチドである。重鎖可変領域（すなわち、配列番号１）からのＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ３の機能的に同等な変異体の例は、好ましくは特異的にＡＢＣＢ５に結合し、所望により、ＡＢＣＢ５発現細胞の腫瘍殺傷を高める配列番号１において保存的置換を有するペプチドである。
用語「アミノ酸配列変異体」とは、ある程度、天然配列ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。該アミノ酸配列変異体は、天然アミノ酸配列のアミノ酸配列内のある位置において置換、欠失および／または挿入を保有する。
「相同性」は、配列を整列させ、必要であれば、ギャップを導入して、最大パーセント相同性を達成した後に同一であるアミノ酸配列変異体における残基のパーセンテージと定義される。整列のための方法およびコンピュータープログラムは当該分野でよく知られている。
本明細書中に記載されるアミノ酸配列修飾が考えられる。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改良するのが望ましいであろう。抗体のアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変化を抗体の核酸に導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはそれへの挿入、および／またはその置換を含む。欠失、挿入、および置換のいずれの組合せによって、最終構築体に到達するようにするが、但し、最終構築体は所望の特徴を保有するものとする。アミノ酸改変は、その配列が作製される時点で被験体の抗体アミノ酸配列に導入してもよい。
突然変異誘発について好ましい位置である抗体のある残基または領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５に記載されたような、「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここに、残基、または標的残基の群が同定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕのような荷電残基）、中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられて、アミノ酸の抗原との相互作用に影響をおよぼす。次いで、置換に対して機能的感受性を示すこれらアミノ酸の位置は、置換の部位に、または該部位に対してさらなるまたは他の変異体を導入することによって改善される。かくして、アミノ酸配列の変動を導入するための部位は予め決定されるが、突然変異の性質は、それ自体、予め決定される必要はない。例えば、与えられた部位において突然変異の性能を分析するために、ａｌａスキャンニングまたはランダム突然変異誘発が標的コドンまたは領域で行われ、発現された免疫グロブリンが所望の活性についてスクリーニングされる。
アミノ酸配列の挿入には、長さが１残基から、１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数アミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を持つ抗体、または細胞傷害性ポリペプチドに融合した抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清中半減期を増加させる、（例えば、ＡＤＥＰＴについての）酵素、またはポリペプチドに対する抗体のＮまたはＣ末端への融合を含む。
もう１つのタイプの変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基によって置換された抗体分子において少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。置換突然変異誘発のための最大の注目すべき部位は、超可変領域を含むが、ＦＲ改変も考えられる。
本明細書中で用いるように、「保存的置換」とは、アミノ酸置換がなされたペプチドの相対的電荷またはサイズの特徴を変化させないアミノ酸置換をいう。アミノ酸の保存的置換には、以下の群：（１）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（２）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（３）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（４）Ａ、Ｇ；（５）Ｓ、Ｔ；（６）Ｑ、Ｎ；および（７）Ｅ、Ｄでアミノ酸の間でなされた置換を含む。
抗体の生物学的特性における実質的修飾は、（ａ）例えば、シートまたはらせん立体配座としての置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクを維持することに対するその効果が有意に異なる置換を選択すうことによって達成される。アミノ酸は、（Ａ．Ｌ．ＬｅｈｎｉｎｇｅｒのＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．，ｐｐ．７３−７５，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５）にて）その側鎖の特性における類似性に従ってグループ分けすることができる：
（１） 非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３） 酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４） 塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
あるいは、天然に生じる残基は、共通の側鎖の特性：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の向きに影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅに基づいてグループに分けることができる。
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーをもう１つのクラスで交換することを含むであろう。そのような置換された残基は、保存的置換部位へ、またはより好ましくは、残りの（非保存的）部位へ導入することもできる。
１つのタイプの置換変異体は、親抗体の１以上の超可変領域残基を置換することを含む（例えば、ヒト化またはヒト抗体）。一般に、さらなる発展のために選択された、得られた変異体は、それらが生じた親抗体に対して改良された生物学的特性を有するであろう。そのような置換変異体を生じさせるための便宜な方法には、ファージディスプレイを用いる親和性突然変異を含む。簡単に述べると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７の部位）を突然変異させて、各部位において全ての可能なアミノ酸置換を生じさせる。そのようにして生じさせた抗体は、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合としてフィラメント状ファージ粒子から提示される。次いで、ファージ提示変異体を、本明細書中に開示されたようにその生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。修飾のための候補超可変領域部位を同定するためには、アラニンスキャニング突然変異誘発を行って、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定することができる。あるいはさらに、抗原抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体および抗原の間の接触点を同定するのが有益であろう。そのような接触残基および隣接残基は、本明細書中で工夫された技術に従った置換のための候補である。一旦そのような変異体が生じたならば、変異体のパネルを本明細書中に記載されたようにスクリーニングに付し、１以上の関連アッセイにおける優れた特性を持つ抗体をさらなる開発のために選択することができる。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該分野で公知の種々の方法によって調製される。これらの方法には、限定されるものではないが、（天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合には）天然源からの単離、またはオリゴヌクレオチド媒介（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および抗体のより初期に調製された変異体、または非変異体バージョンのカセット突然変異誘発を含む。
本発明の免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域に１以上のアミノ酸修飾を導入し、それにより、Ｆｃ領域変異体を生じさせるのが望ましいであろう。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステインを含めた１以上のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含むことができる。
本記載および当該分野の教示に従い、いくつかの実施形態においては、本発明の方法で用いる抗体は、本明細書中に記載されたヒンジ配列突然変異に加えて、例えば、Ｆｃ領域における、野生型カウンターパート抗体と比較して１以上の改変を含んでもよい。それにもかかわらず、これらの抗体は、その野生型カウンターパートと比較して、治療的用途で必要とされる実質的に同一の特徴を保有するであろう。例えば、ある改変がＦｃ領域でなすことができ、これは、例えば、ＷＯ９９／５１６４２に記載されたような、改変された（すなわち、改良されたまたは減少された）Ｃ１ｑ結合および／または補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣ）をもたらすであろう。また、Ｆｃ領域変異体の他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；およびＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。
抗ＡＢＣＢ５抗体の適切な立体配座を維持するのに関与しないいずれのシステイン残基も、一般には、セリンで置換して、分子の酸化的安定性を改良し、異常な架橋を妨げることもできる。逆に、システイン結合を抗体に加えて、（特に、抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合に）その安定性を改良することができる。
抗体のアミノ酸変異体のもう１つのタイプは、抗体の元来のグリコシル化パターンを改変する。改変とは、抗体で見出される１以上の炭水化物部分の欠失、および／または抗体に存在しない１以上のグリコシル化部位の付加を意味する。抗体のリコシル化は、典型的には、Ｎ−結合またはＯ−結合いずれかである。Ｎ−結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着をいう。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここに、Ｘはプロリンを除いたいずれかのアミノ酸）は、炭水化物部分の、アスパラギン側鎖への酵素付着のための認識配列である。かくして、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的グリコシル化部位を生じさせる。Ｏ−結合グリコシル化とは、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンを用いることもできるが、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの付着をいう。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、便宜には、それが（Ｎ−結合グリコシル化部位のための）前記したトリペプチド配列の１以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって達成される。該改変は、１以上のセリンまたはスレオニン残基の（Ｏ−結合グリコシル化部位のための）元来の抗体の配列への付加、またはそれによる置換によってなすこともできる。
機能的同等とは、同等な活性（例えば、ＡＢＣＢ５への結合、またはＡＢＣＢ５発現細胞の殺傷の増強）をいうが、そのような活性のレベルの変動も含む。例えば、機能的同等体は、本明細書中に記載されたモノクローナル抗体クローンよりも小さな、同等な、または大きな親和性でもってＡＢＣＢ５に結合する変異体であり、但し、該変異体は依然として本発明で有用であるものとする（すなわち、それはＡＢＣＢ５に結合し、所望により、腫瘍の殺傷を増強させる）。
そのような置換は、当業者に知られた種々の方法によってなすことができる。例えば、アミノ酸置換は、Ｋｕｎｋｅｌ（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４８８−４９２，１９８５）の方法に従ってＰＣＲ指向性突然変異、部位特異的突然変異誘発によって、または特定のＣＤＲをコードする遺伝子、もしくは本明細書中に記載されたＣＤＲアミノ酸配列を含むペプチドの化学合成によってなすことができる。ＣＤＲ含有ペプチドを改変するためのこれらおよび他の方法は当業者に知られており、そのような方法で、例えば、前記したＳａｍｂｒｏｏｋまたはＡｕｓｕｂｅｌを編集する文献に見出すことができる。しかしながら、いくつかの実施形態においては、ＣＤＲのサイズのため、商業的に入手可能なもののようなペプチドシンセサイザーを用いて変異体ペプチドを合成するのはより便宜であろう。ＡＢＣＢ５結合ＣＤＲの機能的に同等な変異体の活性は、結合アッセイによってテストすることができ、いくつかの場合において、後により詳細に検討する生物学的活性アッセイによってテストすることができる。本明細書中で用いるように、用語「機能的変異体」、「機能的に同等な変異体」、および「機能的に活性な変異体」は相互交換可能に用いられる。
本明細書中で用いるように、用語「機能的に活性な抗体断片」は、各々、好ましくは、特異的にＡＢＣＢ５に結合する能力を保有する本発明のＡＢＣＢ５結合領域を含めた抗体分子の断片を意味する。そのような断片はインビトロおよびインビボ双方にて用いることができる。特に、よく知られた機能的に活性な抗体断片には、限定されるものではないが、抗体のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦｄ断片を含む。無傷抗体のＦｃ断片を欠如するこれらの断片は、より迅速に循環から除去され、無傷抗体よりも少ない非特異的組織結合を有することができる（Ｗａｌｈら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。もう１つの例として、単一鎖抗体は、Ｌａｄｎｅｒらに対する米国特許第４，９４６，７７８号に記載された方法に従って構築することができる。そのような単一鎖抗体は、フレキシブルなリンカー部位によって連結された軽鎖および重鎖の可変領域を含む。単離された可変重鎖単一ドメインを含む単一ドメイン抗体（「Ｆｄ」）を得るための方法も報告されている（例えば、単離された形態で結合するその標的エピトープに対して十分な親和性でもって抗体重鎖可変領域（ＶＨ単一ドメイン抗体）を同定するためのスクリーニングの方法を開示する、Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：６４４−６４６（１９８９）参照）。公知の抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列に基づいて組換えＦｖ断片を作製する方法は、当該分野で知られており、例えば、Ｍｏｏｒｅらの米国特許第４，４６２，３３４号に記載されている。抗体断片の使用および作製を記載する他の文献には、例えば、Ｆａｂ断片（Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５））、Ｆｖ断片（Ｈｏｃｈｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：１１３０（１９７３）；Ｓｈａｒｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５：１５９１（１９７６）；Ｅｈｒｌｉｃｈら、米国特許第４，３５５，０２３号）および抗体分子の部分（Ａｕｄｉｌｏｒｅ−Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ，米国特許第４，４７０，９２５号）を含む。かくして、当業者であれば、ＡＢＣＢ５に対する抗体の特異性を破壊することなく無傷抗体の種々の部分からの抗体断片を構築することができる。
本発明の重要な態様において、機能的に活性な抗体断片は、ＡＢＣＢ５発現細胞の殺傷を増強する能力も保有する。この後者の場合において、抗体断片はＦｃ領域ならびにエピトープ欠乏ドメインを含む。Ｆｃ領域によって、抗体断片はＦｃ受容体陽性細胞に結合することができ、これは、引き続いて、抗体のＦａｂ領域によって結合されるエピトープを貪食する。
本発明の抗ＡＢＣＢ５ペプチドは、さらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含むことができる。非ヒト（例えば、ネズミ）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、または（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗体結合サブ配列のような）その断片である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補的決定領域（ＣＤＲ）からの残基が所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。ヒト化抗体は、レシピエント抗体においても、または輸入されたＣＤＲ、もしくはフレームワーク配列においても見出されない残基も含むこともできる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そこでは、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンの一部を含むであろう。［Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｔ，２：５９３−５９６（１９９２）］。
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該分野でよく知られている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである源から導入された１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「輸入」可変ドメインに由来する「輸入」残基をいう。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列に代えてげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法に従って実質的に行うことができる。［Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］。従って、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、ここに、実質的により程度の低い無傷ヒト可変ドメインが、非ヒト種からの対応する配列によって置き換えられている。現実的には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基および可能性のあるいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体中の類似の部位からの残基によって置き換えられたヒト抗体である。
ヒト化抗体を作製するのに用いるべき、軽鎖および重鎖双方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるのに非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」方法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。次いで、げっ歯類のものに最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として許容される（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。もう１つの方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を用いる。同一のフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に用いることができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
さらに、抗体は、抗原に対する高い親和性、および他の好都合な生物学的特性を保持してヒト化されるのが重要である。この目的を達成するには、好ましい方法に従い、ヒト化抗体は、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析のプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは通常入手可能であり、当業者にとって精通しているものである。選択された候補免疫グロブリン配列の可能な三次元立体配座構造を説明し、提示するコンピュータープログラムが入手可能である。これらの提示の精査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の有望な役割の分析、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響する残基の分析が可能となる。このように、ＦＲ残基を、標的抗原に対する増大した親和性のような所望の抗体特徴が達成されるように、レシピエントおよび輸入配列から選択し、組合せることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合に影響するのに直接的にかつ最も実質的に関与する。
注目する例示的なヒト化抗体は、本明細書中においては、所望により、これらＣＤＲ残基のアミノ酸修飾を含む、可変重鎖相補性決定残基ＤＹＹＭＹ（配列番号３）；ＴＩＮＤＧＧＴＨＴＹ（配列番号４）；および／またはＤＤＹＹＹＧＳＦＨＤＡＭＤＹ（配列番号５）を含み、例えば、ここに、修飾は抗体の親和性を本質的に維持し、または改良する。例えば、注目する抗体変異体は、前記可変重鎖ＣＤＲ配列において約１〜約７、または約５のアミノ酸置換を有することができる。そのような抗体変異体は、親和性成熟によって調製することができる。
ヒト化抗体は、例えば、これまでの段落におけるこれら可変重鎖ドメインＣＤＲ残基に加えて、可変軽鎖ドメイン相補性決定残基ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹＭＨ（配列番号６）；ＬＶＳＮＬＥＳ（配列番号７）；および／またはＱＨＩＲＥＬＴＲ（配列番号８）を含むことができる。そのようなヒト化抗体は、所望により、前記ＣＤＲ残基のアミノ酸修飾を含み、例えば、ここに、該修飾は抗体の親和性を本質的に維持し、または改良する。例えば、注目する抗体変異体は、前記可変軽鎖ＣＤＲ配列において約１〜約７、または約５のアミノ酸置換を有することができる。
本出願では、ＡＢＣＢ５に結合する親和性成熟抗体も考えられる。親抗体はヒト抗体またはヒト化抗体、例えば、各々、配列番号２および１の可変軽鎖および／または重鎖配列を含むものであってよい。親和性成熟化抗体は、好ましくは、ネズミｍＡｂ３Ｃ２−１Ｄ１２のよりも優れた親和性でもってＡＢＣＢ５に結合する。
ヒト化抗体または親和性成熟化抗体の種々の形態が考えられる。例えば、ヒト化抗体または親和性成熟化抗体は、イムノコンジュゲートを生じさせるために所望により１以上の細胞傷害性剤とコンジュゲートしたＦａｂのような抗体断片であってよい。あるいは、ヒト化抗体または親和性成熟化抗体は、無傷ＩｇＧ１抗体のような無傷抗体であってよい。
欧州特許出願０２３９４００は、その全内容をここに引用して援用するが、少なくともネズミ（または他の非ヒト動物）抗体のＣＤＲ部分がヒト化抗体に含まれたヒト化モノクローナル抗体の産生および使用の例示的な教示を提供する。簡単に述べれば、以下の方法は、マウスＣＤＲの少なくとも一部分を含めたヒト化ＣＤＲモノクローナル抗体を構築するのに有用である。Ｉｇ重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒト抗体からのフレームワーク領域を含む可変ドメイン、およびネズミ抗体のＣＤＲ領域を少なくともコードするＤＮＡ配列に操作可能に連結された適当なプロモーターを含めた第一の複製可能な発現ベクターが調製される。所望により、第二の複製可能な発現ベクターが調製され、それは、各々、相補的なヒトＩｇ軽鎖または重鎖の可変ドメインを少なくともコードするＤＮＡ配列に操作可能に連結された適当なプロモーターを含む。次いで、細胞系をベクターで形質転換する。好ましくは、細胞系は、ミエローマ、ハイブリドーマ、トリオーマまたはクワドローマ細胞系のようなリンパ系起源の不滅化哺乳動物細胞系であり、またはウイルスでの形質転換によって不滅化された正常なリンパ系細胞である。次いで、形質転換された細胞系を当業者に知られた条件下で培養して、ヒト化抗体を産生する。
欧州特許出願０２３９４００に記載されたように、複製可能なベクターに挿入されるべき特定の抗体ドメインを作り出すためのいくつかの技術が当該分野でよく知られている（好ましいベクターおよび組換え技術は以下でより詳細に議論する）。例えば、該ドメインをコードするＤＮＡ配列をオリゴヌクレオチド合成によって調製することができる。あるいは、粘着末端を持つ二本鎖合成または制限されたサブクローン化ＣＤＲカセットをフレームワーク領域の接合部に連結できるように、４つのフレームワーク領域が連結部において適当な制限部位と一緒に融合された、ＣＤＲ領域を欠如する合成遺伝子。もう１つの方法は、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発による、可変ＣＤＲ含有ドメインをコードするＤＮＡ配列の調製を含む。これらの方法の各々は当該分野でよく知られている。従って、当業者であれば、そのエピトープに対する抗体の特異性を破壊することなく、ネズミＣＤＲ領域を含有するヒト化抗体を構築することができるであろう。
ヒト化の代替法として、ヒト抗体を生じさせることができる。「ヒト抗体」とは、ヒトによって産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する、および／またはヒト抗体を作製するためのいずれかの技術を用いて作製されているものである。ヒト抗体のこの定義は、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を排除する。例えば、今や、免疫化に際して、内因性免疫グロブリンの産生がない場合においてヒト抗体の十分なレパートリーを生じさせることができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製するのが可能である。例えば、キメラおよび生殖系突然変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失の結果、内因性抗体の産生が完全に阻害されることが記載されている。そのような生殖系突然変異体マウスにおけるヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイの移動の結果、抗原チャレンジに際してヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；および米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５８９，３６９号および第５，５４５，８０７号参照。
あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３（１９９０））を用いて、免疫化されていないドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロにてヒト抗体および抗体断片を産生することができる。この技術に従い、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄのようなフィラメント状バクテリオファージの主要なまたは重要でないコート蛋白質遺伝子のいずれかにインフレームにてクローン化し、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として提示させる。フィラメント状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するために、抗体の機能的特性に基づく選択の結果、それらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子が選択される。かくして、該ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレイは種々の様式で行うことができる；その概説については例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｓ，ａｎｄ Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５６４−５７１（１９９３）参照。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの源をファージディスプレイのために用いることができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムなコンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫化されていないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ（自己抗原を含めた）多様な抗原アレイに対する抗体を、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）によって記載された技術に実質的に従って単離することができる。また、米国特許第５，５６５，３３２号および第５，５７３，９０５号も参照。ヒト抗体はインビトロ活性化Ｂ細胞によって生じさせることもできる（米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号参照）。
ヒトモノクローナル抗体は、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋらに対して発行された米国特許第５，５６７，６１０号、Ｏｓｔｂｅｒｇに対して発行された米国特許第５６５，３５４号，Ｂａｋｅｒらに対して発行された米国特許第５，５７１，８９３号、Ｋｏｚｂｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４），Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７），およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６−９５（１９９１）に記載されたもののような、当該分野で公知の方法いずれかによって作製することもできる。
本発明は、単一鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）の使用も含む。単一鎖可変領域断片は、短い連結ペプチドを用いることによって、軽鎖および／または重鎖可変領域によって作製される。十分な柔軟性および長さを有するいずれのペプチドもｓｃＦｖにおけるリンカーとして用いることができる。通常、リンカーは、免疫原性をほとんどまたは全く有しないように選択される。連結ペプチドの例は、１つの可変領域のカルボキシ末端およびもう１つの可変領域のアミノ末端をブリッジさせる多重ＧＧＧＧＳ残基である。他のリンカー配列も用いることもできる。
重鎖または軽鎖の全てまたはいずれかの部分を、いずれかの組合せで用いることができる。典型的には、全可変領域をｓｃＦｖに含める。例えば、軽鎖可変領域を重鎖可変領域に連結することができる。あるいは、軽鎖可変領域の一部を重鎖可変領域、またはその部分に連結させることができる。また、重鎖可変領域が、注目する抗体からのものであって、軽鎖可変領域がもう１つの免疫グロブリンからのものであるｓｃＦｖが考えられる。
ｓｃＦｖはいずれかの順序、例えばＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨで組立てることができる。特別な発現系におけるこれらの２つの立体配置の発現のレベルに差があってよく、その場合、これらの形態の１つは好ましいであろう。（Ｘ）−リンカー−（Ｘ）−リンカー−（Ｘ）のようなタンデムｓｃＦｖを作製することもでき、ここに、Ｘは注目する抗体からのポリペプチド、またはこれらのポリペプチドと他のポリペプチドとの組合せである。もう１つの実施形態において、単一鎖抗体ポリペプチドはリンカーポリペプチドを有さず、またはまさに短いフレキシブルでないリンカーを有する。可能な立体配置はＶＬ−ＶＨおよびＶＨ−ＶＬである。結合は、鎖内のＶＬおよびＶＨの間の相互作用を可能とするには余りにも短く、鎖は各末端においてＶＬ／ＶＨ抗原結合部位を持つホモダイマーを形成する。そのような分子は「ダイアボディ」として当該分野で呼ばれている。
単一鎖可変領域は、組換えによりまたは合成により生じさせることができる。ｓｃＦｖの合成的産生のためには、自動シンセサイザーを用いることができる。ｓｃＦｖの組換え産生では、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する適当なプラスミドを酵母、植物、昆虫または哺乳動物細胞のような真核生物、またはＥ．ｃｏｌｉのような原核生物いずれかの適当な宿主細胞に導入することができ、発現された蛋白質を、標準的な蛋白質精製技術を用いて単離することができる。
発現の条件は、ｓｃＦｖポリペプチドが最適な第三次構造を取ることができるようにすべきである。用いるプラスミドおよび宿主細胞に依存して、産生の速度を変調する必要があろう。例えば、より弱いプロモーターの使用、またはより低い温度での発現が、適切に折畳まれたｓｃＦｖの原核生物系における産生を最適化するのに必要であり；または、好ましくは、真核生物細胞においてｓｃＦｖを発現させることができる。
用語「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を持つ小さな抗体断片をいい、その断片は、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）における軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とするには余りにも短いリンカーを用いることによって、ドメインは、もう１つの鎖の相補的ドメインと対合し、２つの抗原結合部位を作り出すように促される。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）においてより十分に記載されている。
本明細書中において、モノクローナル抗体は、具体的には、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列に同一であるか、またはそれと相同な「キメラ」抗体を含み、他方、鎖の残りは、もう１つの種に由来する、またはもう１つの抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびに所望の生物学的活性を呈する限りはそのような抗体の断片における対応する配列と同一であるか、またはそれと相同である。
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して抗原特異性を有するモノクローナルな、好ましくは、ヒトまたはヒト化抗体である。この場合には、結合特異性の１つはＡＢＣＢ５についてのものであり、他のものはいずれかの他の抗原についての、好ましくは、細胞表面蛋白質または受容体もしくは受容体サブユニットについてのものである。二重特異性抗体を作製するための方法は当該分野で知られている。伝統的には、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づき、ここに、２つの重鎖は異なる特異性を有する［Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３）］。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のランダム分類のため、これらのハイブリドーマ（クワドローマ）は、１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を生じ、その後、１つのみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によって達成される。同様な手法は、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９において、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
２を超える価数を持つ抗体が考えられる。例えば、三特異的抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
さらに、ＡＢＣＢ５結合ＣＤＲ３領域を含有するものを含めた小さなペプチドは、本発明のペプチドを産生するための組換え手段によって容易に合成、または産生することができる。そのような方法は当業者によく知られている。ペプチドは、例えば、商業的に入手可能な自動ペプチドシンセサイザーを用いて合成することができる。ペプチドは、該ペプチドを発現するＤＮＡを発現ベクターに導入し、該発現ベクターで細胞を形質転換して、ペプチドを生じさせることによって組換え技術により産生することができる。
抗体を含めたペプチドは、当該分野で公知の標準的な結合アッセイを用いてＡＢＣＢ５に結合するその能力についてテストすることができる。適当なアッセイの例としては、ＡＢＣＢ５を（マルチウェルプレートのウェル中のような）表面に固定化し、次いで、標識されたペプチドと接触させることができる。次いで、ＡＢＣＢ５に結合した（かくして、それ自体が表面に固定化されるようになる）ペプチドの量を定量して、特定のペプチドがＡＢＣＢ５に結合するか否かを決定することができる。あるいは、表面に結合していないペプチドの量を測定することもできる。このアッセイの変形において、ペプチドを、ＡＢＣＢ５発現細胞に直接的に結合するその能力についてテストすることができる。
ペプチド結合は、競合アッセイを用いてテストすることもできる。（抗体を含めた）テストすべきペプチドが、モノクローナル抗体または断片の結合の減少によって示されるように、本明細書中に記載されたモノクローナル抗体または抗体断片と競合する場合、該ペプチドおよび該モノクローナル抗体は同一の、または少なくとも重複するエピトープに結合するようである。このアッセイ系において、抗体または抗体断片を標識し、ＡＢＣＢ５を固体表面に固定化する。このようにして、競合抗体を含めた競合ペプチドを同定することができる。本発明は、ＡＢＣＢ５への結合について抗体３Ｃ２ １Ｄ１２（すなわち、３Ｃ２ １Ｄ１２と同一のエピトープを認識し、それに結合する抗体）と競合するペプチドおよび、特に、抗体（およびその断片）を含む。
本発明は、ＡＢＣＢ５に結合し、腫瘍殺傷を増強させる小分子も含む。そのような結合分子は、ファージディスプレイ手法のような慣用的なスクリーニング方法（例えば、Ｈａｒｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２４６８（１９９４）に記載された方法）によって同定することができる。Ｈａｒｔらは、新規なペプチドリガンドを同定するためのフィラメント状ファージディスプレイライブラリーを報告している。一般に、例えば、Ｍ１３またはｆｄファージを用いるファージディスプレイライブラリーは、先の文献に記載されたもののような慣用的な手法を用いて調製される。ライブラリーは、一般に、４〜８０アミノ酸残基を含有するインサートを表示する。該インサートは、所望により、ペプチドの完全に縮退したまたは偏ったアレイを表わす。適当な結合特性を有するリガンドは、標的分子に結合するリガンドをその表面に発現するファージを選択することによって得られる。次いで、これらのファージを数サイクルの再選択に付して、最も有用な結合特徴を有するペプチドリガンド発現ファージを同定する。典型的には、最良の結合特徴（例えば、最高の親和性）を呈するファージは、核酸分析によってさらに特徴付けて、発現ペプチドの最適な長さでファージ表面に発現されたペプチドの特定のアミノ酸配列を同定して、最適な結合を達成する。ファージディスプレイペプチドまたは抗体ライブラリーもまた、Ｂｒｉｓｓｅｔｔｅ Ｒら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ．２００６ Ｍａｙ；９（３）：３６３−９に記載されている。
あるいは、結合分子は、コンビナトリアルライブラリーから同定することができる。多くのタイプのコンビナトリアルライブラリーが記載されている。例えば、（化学分子の足場骨格を有する複数の分子構築体を形成し、論理的な順序のアレイにおいて分子上の少なくとも１つの位置を修飾することによって合成分子構築体のアレイを構築するための方法を記載する）米国特許第５，７１２，１７１号；（特定の物理化学的特性を有するポリマーを作製するための方法を記載する）第５，９６２，４１２号；および（特定のアレイ化化合物を記載する）第５，９６２，７３６号。
他の結合分子は、本明細書中に記載されたガイダンスに従って当業者によって同定することができる。ライブラリー技術を用いて、ＡＢＣＢ５に結合し、その機能を妨げる小ペプチドを含めた小分子を同定することができる。アンタゴニストの同定のためのライブラリーを用いる１つの利点は、小反応容量の（すなわち、合成およびスクリーニング反応における）小さなサイズの数百万の異なる推定候補の容易な操作である。ライブラリーのもう１つの利点は、非ペプチド部分の場合に特に、天然に生じる源を用いてそうでなければ達成できないであろうアンタゴニストを合成する能力である。
小分子ライブラリーは、それからＡＢＣＢ５への結合が推定できる、ＡＢＣＢ５媒介ローダミン１２３流出輸送に対するその変調効果についてスクリーニングすることができる。ＡＢＣＢ５機能の潜在的基質または阻害剤もまた、選択１９９標準抗癌剤についてのＦｒａｎｋらのＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００５に記載されたのと同様に、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの癌細胞系のＮＣＩ−６０パネル全域でのＡＢＣＢ５遺伝子または蛋白質発現を、これらの細胞系についての＞１００，０００化合物の確立された薬物能力と相関させることによって同定することもできる。
これらの化合物のすべてではないにせよ多くが、組換えまたは化学ライブラリーを用いて合成することができる。候補化合物の膨大なアレイが、合成または天然化合物のライブラリーから生じさせることができる。細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、入手可能であるか、または容易に作製することができる。天然および合成により作製されたライブラリー、および化合物は、慣用的な化学的、物理的、および生化学的手段を通じて容易に修飾することができる。さらに、カルシウムチャネルのアンタゴニストに結合し、それにより、アンタゴニストとして作用する化合物を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等のような特異的またはランダムな化学的修飾に付して、同様に、または恐らくはより大きな特異性を持って機能することができる構造的アナログを生じさせることができる。
小分子コンビナトリアルライブラリーを生じさせることもできる。小有機化合物のコンビナトリアルライブラリーは、多様性の１以上の地点において相互に異なり、多工程プロセスを用いて有機的技術によって合成される密接に関連するアナログのコレクションである。コンビナトリアルライブラリーは、膨大な数の小有機化合物を含む。コンビナトリアルライブラリーの１つのタイプは、化合物アレイを生じさせるための平行合成方法によって調製される。「化合物アレイ」は、本明細書中で用いるように、デカルト座標中の空間的アドレスによって同定可能であり、かつ各化合物が共通の分子コア、および１以上の可変構造的多様性エレメントを有するように配置された化合物のコレクションである。そのような化合物アレイにおける化合物は別々の反応容器中で並行して製造され、各化合物はその空間的アドレスによって同定され、追跡される。並行合成混合物および並行合成方法の例には、本明細書中に引用して援用する、１９９５年７月１３日に公開されたＰＣＴ公開特許出願ＷＯ９５／１８９７２、および１９９８年１月２７日に特許付与された米国特許第５，７１２，１７１号、およびその対応するＰＣＴ公開特許出願ＷＯ９６／２２５２９が提供される。
標準的な結合アッセイが当該分野でよく知られており、ＥＬＩＳＡ、（前記した）競合結合アッセイ、サンドイッチアッセイ、放射活性に標識されたペプチドまたは放射標識された抗体を用いる放射受容体アッセイ、イムノアッセイ等を含む多数のこれらは、本発明に適している。アッセイの性質は必須ではないが、但し、少数のペプチドの結合を検出するのに十分に感受性であるものとする。
種々の他の試薬を結合混合物に含めることもできる。これらには、最適な結合を容易とするのに用いることができる、塩、緩衝液、中性蛋白質（例えば、アルブミン）、洗剤等のような試薬を含む。そのような試薬は、反応成分の非特異的またはバックグラウンド相互作用を低下させることもできる。アッセイの効率を改良する他の試薬を用いることもできる。これまでのアッセイ物質の混合物を、モノクローナル抗体がＡＢＣＢ５に通常特異的に結合する条件下でインキュベートする。そのような条件は、好ましくは、生理学的条件を模倣する。成分の添加の順序、インキュベーション温度、インキュベーションの時間、およびアッセイの他のパラメーターは容易に決定することができる。そのような実験は、アッセイパラメーターの最適化を含むのみであり、アッセイの基本的組成を含まない。インキュベーション温度は、典型的には、４℃〜４０℃の間である。インキュベーション時間は、好ましくは、迅速な高スループットスクリーニングを容易とするように最小化され、典型的には、０．１〜１０時間の間である。インキュベーションの後、ペプチドおよびＡＢＣＢ５の間の特異的結合の存在または非存在は、使用者が利用できるいずれの便宜な方法によって検出される。
典型的には、複数のアッセイ混合物を異なる複数ペプチドまたは異なるペプチド濃度にて平行に実行して、種々の濃度に対する異なる応答を得る。これらの濃度のうち１つは陰性対照として、すなわち、ＡＢＣＢ５の０濃度において、またはアッセイ検出の限界未満のＡＢＣＢ５の濃度において働く。
分離工程は、しばしば、未結合ペプチドまたは抗体から分離するのに用いられる。分離工程は種々の方法で達成することができる。便宜には、成分（例えば、ペプチドまたは抗体）の少なくとも１つを、ＡＢＣＢ５への結合を介して固体基材上に固定化する。未結合成分は、結合した画分から容易に分離することができる。固体基材は、広く種々の物質で、広く種々の形状で、例えば、ポリアクリルアミドのカラムもしくはゲル、アガロースまたはセファロース、マイクロタイタープレート、マイクロビーズ、樹脂粒子等にて作製することができる。分離工程は、好ましくは、多数の濯ぎまたは洗浄を含む。例えば、固体基材がマイクロタイタープレートである場合、ウェルを、塩、緩衝液、洗剤、非特異的蛋白質等のような特異的結合に参画しないインキュベーション混合物の成分を典型的には含む洗浄溶液で数回洗浄することができる。固体基材が磁性ビーズである場合、該ビーズを洗浄溶液で１回以上洗浄し、磁石を用いて単離することができる。
本明細書中で記載された分子は、本明細書中においてより詳細に記載されるように、単独または本発明の検出および処理方法にて、検出または細胞傷害性剤のような他の分子とのコンジュゲートにて用いることができる。
典型的には、成分の１つは、通常、検出可能な標識を含むか、またはそれにカップリングされるか、またはコンジュゲートされる。検出可能な標識は、その存在が直接的にまたは間接的に確認することができる部分である。一般に、標識の検出は標識によるエネルギーの放出を含む。標識は、フォトン、または特定の波長の他の原子粒子（例えば、放射能、ルミネセンス、光学的または電子密度等）を発し、および／またはそれを吸収するその能力によって直接的に検出することができる。標識は、それ自体が特定の波長の光を発し、または吸収することができるもう１つの部分（例えば、ＦＬＡＧエピトープのようなエピトープタグ、ホースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素タグ）に結合し、動員し、いくつかの場合には、それを切断するその能力によって間接的に検出することができる。間接的な検出の例は、基材を目に見える産物に切断する第一の酵素標識の使用である。標識は化学物質、ペプチドまたは核酸分子の性質のものであってよいが、そのように限定されるものではない。他の検出可能な標識はＰ３２もしくはＨ３のような放射性同位体、蛍光色素のような発光マーカー、光学的もしくは電子密度マーカー等、またはＦＬＡＧエピトープもしくはＨＡエピトープのようなエピトープタグ、ビオチン、アビジン、およびホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼのような酵素タグを含む。標識は、その合成の間に、またはそれに続いてペプチドに結合することができる。当業者に知られた多くの異なる標識および標識方法がある。本発明で用いることができる標識のタイプの例には酵素、放射性同位体、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物、および生物発光化合物を含む。当業者であれば、本明細書中に記載されたペプチドについての他の適当な標識を知っているか、または常套的実験を用いてそれを確認することができるであろう。さらに、これらの標識の、本発明のペプチドへのカップリングまたはコンジュゲーションは、当業者に共通の標準的技術を用いて行うことができる。
より大きな感度をもたらすことができるもう１つの標識技術は、本明細書中に記載された分子を低分子量のハプテンにカップリングさせることよりなる。続いて、第二の反応によって、これらのハプテンを特異的に改変することができる。例えば、特異的抗ハプテン抗体と反応することができる、アビジン、またはジニトロフェノール、ピリドキサール、またはフルオレセインと反応する、ビオチンのようなハプテンを用いるのが普通である。
検出可能な標識への抗体またはその断片を含めたペプチドのコンジュゲーションは、とりわけ、診断アッセイにおけるそのような薬剤の使用を容易とする。検出可能な標識のもう１つのカテゴリーは、例えば、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）のような（一般に、インビボ検出可能標識という）診断およびイメージング標識：Ｇｄ（ＧＯＴＡ）；核医学のための２０１Ｔｌ、ガンマ放出放射性核種９９ｍＴｃ；陽電子射出断層撮影法（ＰＥＴ）のための陽電子放出同位体、（１８）Ｆ−フルオロデオキシグルコース（（１８）ＦＤＧ）、（１８）Ｆ−フッ化物、銅−６４、ガドジアミド、および２０３ＰｂのようなＰｂ（ＩＩ）の放射性同位体；１１１Ｉｎを含む。
本明細書中に記載されたコンジュゲーションまたは修飾は常套的化学物質を使用し、その化学物質は本発明の一部を形成せず、その化学物質は化学の分野における当業者によく知られている。保護基、ならびにモノおよびヘテロ二官能性リンカーのような公知のリンカーの使用は文献に十分に記載されており、本明細書中においては反復しない。
本明細書中で用いるように、「コンジュゲート型」とは、いずれかの物理化学的手段によって相互に安定に結合した２つの存在を意味する。付着の性質は、それが全存在の有効性を実質的に損なわないようなものであるのは重要である。これらのパラメーターを念頭に置き、当業者に知られたいずれかの共有結合または非共有結合を使用することができる。いくつかの実施形態において、共有結合が好ましい。非共有結合コンジュゲーションには、疎水性相互作用、イオン性相互作用、ビオチン−アビジンおよびビオチン−ストレプトアビジン複合体化のような高い親和性の相互作用、および他の親和性相互作用を含む。付着のそのような手段および方法は当業者によく知られている。
種々の方法を用いて、標識の性質、および他のアッセイ成分に依存して、標識を検出することができる。例えば、固体基材への結合、引き続いて固体基材からの分離の間に、標識を検出することができる。検出は、光学もしくは電子密度、放射性放出、非放射性エネルギー移動等を通じて直接的に検出することができ、または抗体コンジュゲート、ストレプトアビジン−ビオチンコンジュゲート等で間接的に検出することができる。標識を検出するための方法は当該分野でよく知られている。
本発明のコンジュゲートは、化学治療剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、もしくはその断片、または小分子毒素）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）のような細胞傷害性剤にコンジュゲートした抗体も含む。本発明の抗体にコンジュゲートすることができる他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチンおよび５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号、第５，７７０，７１０号に記載された集合的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として知られた薬剤のファミリー、ならびにエスペラミシン（米国特許第５，８７７，２９６号）を含む。コンジュゲートで用いることができる酵素的に活性な毒素およびその断片にはジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからの）エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ蛋白質、ジアンチン蛋白質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ蛋白質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンを含む。
腫瘍の選択的破壊のために、抗体は高度に放射性の原子を含むことができる。種々の放射性同位体がラジオコンジュゲート型抗体の製造で利用できる。その例にはＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１３、およびＬｕの放射性同位体を含む。コンジュゲートを検出のために用いる場合、それはシンチグラフィー実験のための放射性元素、例えば、Ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、またはヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄のような（磁気共鳴イメージング、ＭＲＩとしても知られた）核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージングのためのスピン標識を含むことができる。
放射性標識または他の標識を公知の方法でコンジュゲートに取り込むことができる。例えば、ペプチドを生合成することができ、または、例えば、水素の代わりにフッ素−１９を含む適当なアミノ酸前駆体を用いる化学的アミノ酸合成によって合成することができる。Ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１のような標識をペプチド中のシステイン残基を介して結合させることができる。イットリウム−９０をリシン残基を介して結合させることができる。ＩＯＤＯＧＥＮ方法（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７）を用いて、ヨウ素−１２３を取り込むことができる。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）は詳細に他の方法を記載する。
抗体および細胞傷害性剤のコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミュノチオラン（ＩＴ）、（ジメチルアジピミデートＨＣｌのような）イミドエステルの二官能性誘導体、（ジスクシンイミジルスベレートのような）活性なエステル、（グルタルアルデヒドのような）アルデヒド、（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのような）ビス−アジド化合物、（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンのような）ビス−ジアゾニウム誘導体、（トルエン２，６−ジイソシアネートのような）ジイソシアネート、および（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのような）ビス−活性フッ素化合物のような種々の二官能性蛋白質カップリング剤を用いて作製することができる。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されたように調製することができる、炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのための例示的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６参照。リンカーは細胞における細胞傷害性薬物の放出を容易とする「切断可能なリンカー」であってよい。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１（１９９２）米国特許第５，２０８，０２０号）を用いることができる。
本発明のモノクローナル抗体の特異性を担う配列が決定されている。従って、本発明によるペプチドは組換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。Ｔｈｏｍａｓ Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ大学およびＳｃｒｉｐｐｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｃｏｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のような、この機能を商業的に行う団体が合衆国にある。例えば、可変領域ｃＤＮＡは、（アミノ酸配列に由来する）縮退重または非縮退プライマーを用いてポリメラーゼ鎖反応によって調製することができる。ｃＤＮＡをサブクローンして、慣用的な配列決定反応または機器による配列決定のために十分な量の二本鎖ＤＮＡを生じさせることができる。
抗ＡＢＣＢ５モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインの核酸配列の知識でもって、当業者であれば、この抗体をコードする、または上記した種々の抗体断片、ヒト化抗体、またはポリペプチドをコードする核酸を生じさせることができる。そのような核酸は、本発明のペプチドのクローニングのために、またはそのペプチドの発現のために、組換えベクターを形成する他の核酸に操作可能に連結されると考えられる。本発明は、原核生物または真核生物形質転換、トランスフェクションまたは遺伝子治療のためを問わず、コーディング配列、またはその部分を含有するいずれの組換えベクターを含む。そのようなベクターは当業者に知られた慣用的な分子生物学的技術を用いて調製することができ、それは、ＣＤＲ領域（好ましくはＣＤＲ３領域）、および抗体の特異性に寄与するさらなる可変配列、またはその部分、ならびに他の非特異的ペプチド配列、輸出または分泌のためのシグナル配列を含む（Ｗｈｉｔｔｌｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１：４９９，１９８７およびＢｕｒｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１０２４−１０２７，１９９４）または含まない（Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９０：７８８９，１９９３およびＤｕａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９１：５０７５−５０７９，１９９４）、他の非特異的ペプチド配列および適当なプロモーターを含むであろう。そのようなベクターは、当業者に知られた慣用的な技術によって、原核生物（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５，１９８９，Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：６４４−６４６，１９８９；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１，１９９１およびＢａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：７９７８，９９１）または真核生物（Ｗｈｉｔｔｌｅら、１９８７およびＢｕｒｔｏｎら、１９９４）細胞に形質転換し、トランスフェクトし、または遺伝子治療で用いることができる（Ｍａｒａｓｃｏら、１９９３ ａｎｄ Ｄｕａｎら、１９９４）。
本明細書中で用いるように、「ベクター」は、異なる遺伝子的環境の間の輸送のための、または宿主細胞における発現のための、制限および連結によって所望の配列を挿入することができる多数の核酸のいずれであってもよい。ベクターは、典型的には、ＤＮＡより構成されるが、ＲＮＡベクターも入手可能である。ベクターは、限定されるものではないが、プラスミドおよびファゲミドを含む。クローニングベクターは、宿主細胞において複製することができ、かつベクターを決定可能な様式でそこで切断することができ、かつ新しい組換えベクターが宿主細胞において複製するその能力を保有するように所望のＤＮＡ配列を連結することができる１以上のエンドヌクレアーゼ制限部位によってさらに特徴付けられるものである。プラスミドの場合には、所望の配列の複製は、宿主細菌内でプラスミドのコピー数が増加するにつれて多数回、または有糸分裂によって宿主が再生する前に宿主当たり丁度１回起こり得る。ファージの場合には、複製は、溶解相の間に能動的に、または溶原性相の間に受動的に起こり得る。発現ベクターは、それが調節配列に操作可能に連結され、ＲＮＡ転写体として発現され得るように、制限および連結によって所望のＤＮＡ配列を挿入できるものである。ベクターは、さらに、ベクターで形質転換またはトランスフェクトされている、もしくはされていない細胞の同定で用いるのに適した１以上のマーカー配列を含有することができる。マーカーは、例えば、抗生物質または他の化合物に対する抵抗性または感受性のいずれかを増加または減少させる蛋白質をコードする遺伝子、その活性が、当該分野で知られた標準的なアッセイによって検出可能な酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼ）をコードする遺伝子、および形質転換された、またはトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に目に見えるように影響する遺伝子を含む。好ましいベクターは、それらが操作可能に連結されるＤＮＡセグメントに存在する構造遺伝子産物の自律複製および発現が可能なものである。
本発明の発現ベクターは、本発明のペプチドの１つをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された調節配列を含む。本明細書中で用いるように、用語「調節配列」は、所望のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の転写に必要な、またはそれに導く、および／または得られた転写体の所望のポリペプチドへの翻訳に必要な、またはそれに導くヌクレオチド配列を意味する。調節配列には、限定されるものではないが、オペレーター、プロモーター、およびリボソーム結合配列のような５’−配列、ポリアデニル化シグナルのような３’配列を含む。本発明のベクターは、所望により、蛋白質精製において助けとなる５’リーダーまたはシグナル配列、融合産物をコードする５’または３’配列、および形質転換体の同定または選択で助けとなる種々のマーカーを含んでもよい。適当なベクターの選択および設計は、当業者の能力および分別内のものである。ペプチドの引き続いての精製は、当該分野で公知の種々の標準的手段のいずれかによって達成することができる。
ペプチドをスクリーニングするための、しかしながら本発明のペプチドの大量の産生のためには必ずしも好ましくはない好ましいベクターは、アミノ末端からカルボキシ末端への方向に、（１）原核生物分泌シグナルドメイン、（２）本発明のポリペプチドおよび、所望により、（３）融合蛋白質ドメインを含有する融合ポリペプチドをコードし、かつそれを発現することができるヌクレオチド配列を含有する組換えＤＮＡ分子である。ベクターは、融合ポリペプチドを発現するためのＤＮＡ調節配列、好ましくは原核生物調節配列を含む。そのようなベクターは当業者によって構築することができ、Ｓｍｉｔｈら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５−１３１７，１９８５），Ｃｌａｃｋｓｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８，１９９１）；Ｋａｎｇら（ｉｎ ”Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｖｏｌ．２”，Ｒ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ ａｎｄ Ｄ．Ｒ．Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ １１１−１１８，１９９１）；Ｂａｒｂａｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：７９７８−７９８２，１９９１），Ｒｏｂｅｒｔｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：２４２９−２４３３，１９９２）によって記載されている。
融合ポリペプチドは、本発明のペプチドの精製に有用であり得る。融合ドメインは、例えば、商業的に入手可能なベクターｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のマルトース結合蛋白質のＮｉ＋カラムでの精製を可能とするポリＨｉｓテイルを含む。現在好ましいが、断じて必要ではない融合ドメインはフィラメント状ファージ膜アンカーである。このドメインは、モノクローナル抗体のファージディスプレイライブラリーをスクリーニングするのに特に有用であるが、抗体の大量産生のための用途は低いであろう。フィラメント状ファージ膜アンカーは、好ましくは、フィラメント状ファージ粒子のマトリックスと会合でき、それにより、融合ポリペプチドをファージ表面に一体化させて、特異的抗原またはエピトープへの固相結合を可能とし、それにより、ファゲミドベクターによってコードされる特異的抗体または断片の増大および選択を可能とすることができるｃｐＩＩＩまたはｃｐＶＩＩＩコート蛋白質のドメインである。
分泌シグナルは、グラム陰性細菌のペリプラズム膜のような宿主細胞の蛋白質膜を標的とする蛋白質のリーダーペプチドドメインである。Ｅ．ｃｏｌｉのための好ましい分泌シグナルはｐｅｌＢ分泌シグナルである。Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖａからの変異体を産生する２つのｐｅｌＢ遺伝子からの分泌シグナルドメインの予測されたアミノ酸残基配列はＬｅｉら（Ｎａｔｕｒｅ ３８１：５４３−５４６，１９８８）に記載されている。ｐｅｌＢ蛋白質のリーダー配列は従前は、融合蛋白質のための分泌シグナルとして用いられてきた（Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３，１９８８；Ｓａｓｔｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）８６：５７２８−５７３２，１９８９；およびＭｕｌｌｉｎａｘら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７：８０９５−８０９９，１９９０）。本発明で有用なＥ．ｃｏｌｉからの他の分泌シグナルポリペプチドのためのアミノ酸残基配列は、Ｏｌｉｖｅｒ，Ｉｎ Ｎｅｉｄｈａｒｄ，Ｆ．Ｃ．（ｅｄ．），Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１：５６−６９（１９８７）に見出すことができる。
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて遺伝子発現の高いレベルを達成するためには、多量のｍＲＮＡを生じさせるための強いプロモーターのみならず、該ｍＲＮＡが有効に翻訳されるのを確実とするためのリボソーム結合部位を用いるのが必要である。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、リボソーム結合部位は開始コドン（ＡＵＧ）、および該開始コドンから３〜１１ヌクレオチド上流に位置する、３〜９ヌクレオチド長の配列を含む（Ｓｈｉｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ２５４：３４，１９７５）。シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれる配列ＡＧＧＡＧＧＵは、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端に相補的である。リボソームの、ｍＲＮＡ、および該ｍＲＮＡの３’末端における配列への結合は、いくつかの因子（ｉ）ＳＤ配列および１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端の間の相補性の程度；（ｉｉ）ＳＤ配列およびＡＵＧの間に存在するスペーシングおよびおそらくはＤＮＡ配列によって影響され得る（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７６：７６０．，１９７９ａ：Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７６：５５９６，１９７９ｂ；Ｇｕａｒｅｎｔｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２８，１９８０；およびＧｕａｒｅｎｔｅら、Ｃｅｌｌ ２０：５４３，１９８０）。最適化は、このスペーシングが系統的に改変されたプラスミドにおける遺伝子の発現のレベルを測定することによって達成される。異なるｍＲＮＡの比較は、位置−２０〜＋１３の統計学的に好ましい配列があることを示す（ここに、ＡＵＧのＡは位置０である）（Ｇｏｌｄら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６５，１９８１）。リーダー配列は翻訳に劇的に影響することが示されている（Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９７９ａ，ｂ ｓｕｐｒａ）；および（ｉｉｉ）リボソーム結合に影響するＡＵＧに続いてのヌクレオチド配列（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１８：５３３，１９７８）。
３’調節配列は、異種融合ポリペプチドとインフレームであり、かつそれに操作可能に連結した少なくとも１つの終止（停止）コドンを規定する。
原核生物発現宿主において、利用したベクターは原核生物複製起点またはレプリコン、すなわち、それで形質転換された細菌宿主細胞のような原核生物宿主細胞において組換えＤＮＡ分子の自律複製および維持を染色体外で指令する能力を有するＤＮＡ配列を含む。そのような複製起点は当該分野でよく知られている。好ましい複製起点は、宿主生物において有効なものである。原核生物宿主細胞は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉである。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるベクターの使用のために、好ましい複製起点はｐＢＲ３２２で見出されるＣｏｌＥ１、および種々の他の共通のプラスミドである。また、好ましいのは、ｐＡＣＹＣおよびその誘導体で見出されるｐ１５Ａ複製起点である。ＣｏｌＥ１およびｐ１５Ａレプリコンは分子生物学において広範に利用されており、種々のプラスミド上で利用可能であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）によって記載されている。
さらに、原核生物レプリコンを含む実施形態は、好ましくは、その発現がそれで形質転換された細菌宿主に対して薬物耐性であるような選択的利点を付与する遺伝子も含む。典型的な細菌薬物耐性遺伝子は、アンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン／カナマイシンまたはクロラムフェニコールに対する耐性を付与するものである。ベクターは、典型的には、転写可能なＤＮＡ配列の挿入のための便宜な制限部位も含有する。例示的なベクターはプラスミドｐＵＣ１８およびｐＵＣ１９、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能なｐｃＤＮＡＩＩのような誘導されたベクターである。
本発明のペプチドは、重鎖および軽鎖双方の配列を含めた抗体である場合、これらの配列は別々のベクターにコードされていてもよく、またはより便宜には、単一のベクターによって発現され得る。重鎖および軽鎖は、翻訳の後、または分泌の後には、天然抗体分子のヘテロダイマー構造を形成することができる。そのようなヘテロダイマー抗体は、重鎖および軽鎖の間のジスルフィド結合によって安定化されていてもいなくてもよい。
本発明の無傷抗体、または本発明のＦ（ａｂ’）２、ＦａｂもしくはＦｖ断片抗体のようなヘテロダイマー抗体の発現のためのベクターは、翻訳可能な第一および第二のＤＮＡ配列を受け取り、それを発現するのに適合された組換えＤＮＡ分子である。すなわち、ヘテロダイマー抗体を発現するためのＤＮＡ発現ベクターは、ベクターに存在する２つの別々のカセットに２つの翻訳可能なＤＮＡ配列を独立してクローニング（挿入）して、ヘテロダイマー抗体の第一および第二のポリペプチドを発現する２つの別々のシストロンを形成するための系を提供する。２つのシストロンを発現するためのＤＮＡ発現ベクターは、ジシストロニック発現ベクターといわれる。
好ましくは、ベクターは、インサートＤＮＡへの方向性連結に適合したヌクレオチドの配列を介して操作可能に連結された上流および下流ＤＮＡ調節配列を含む第一のカセットを含む。上流翻訳可能配列は、好ましくは、前記したような分泌シグナルをコードする。カセットは、インサート翻訳可能ＤＮＡ配列が、方向性連結に適合したヌクレオチドの配列を介してカセットに方向性をもって挿入される場合に産生される第一の抗体ポリペプチドを発現するためのＤＮＡ調節配列を含む。
ジシストロン性発現ベクターは、第二の抗体ポリペプチドを発現するための第二のカセットも含有する。第二のカセットは、好ましくは、カセットのリーディングフレームにおける少なくとも１つの停止コドンを典型的には規定するベクターの下流ＤＮＡ配列への方向性連結に適合したヌクレオチドの配列を介してその３’末端に操作可能に連結された、前記したような分泌シグナルをコードする第二の翻訳可能ＤＮＡ配列を含む。第二の翻訳可能ＤＮＡ配列は、５’エレメントを形成するＤＮＡ調節配列に対してその５’末端に対して操作可能に連結している。第二のカセットは、翻訳可能なＤＮＡ配列（インサートＤＮＡ）の挿入に際して、インサートＤＮＡによってコードされるポリペプチドとの分泌シグナルを含む第二の融合ポリペプチドを発現することができる。
本発明のペプチドは、ＣＨＯ細胞、ヒトハイブリドーマ、不滅化Ｂリンパ芽球様細胞等のような真核生物細胞によっても産生され得る。この場合、真核生物調節配列がペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されたベクターが構築される。適当な真核生物ベクターの設計および選択は、当業者の能力および分別内のものである。ペプチドの引き続いての精製は、当該分野で公知の種々の標準的手段のいずれによっても達成することができる。
もう１つの実施形態において、本発明は、本発明のベクターで形質転換またはトランスフェクトされ、従って、それを含めた、原核生物および真核生物双方の宿主細胞を提供する。
グリコシル化抗ＡＢＣＢ５抗体の発現のための適当な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞を含む。多数のバキュロウイルス株および変異体、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ミバエ）、およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉのような宿主からの対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株が公に入手可能であり、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ−１変異体、およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ−５株、およびそのようなウイルスは、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために本発明に従って本明細書中においてウイルスとして用いることができる。
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養物も宿主として利用することができる。
脊椎動物細胞もまた宿主細胞として特に興味深いものである。有用な哺乳動物宿主細胞系の例にはＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓細胞（懸濁培養での成長のためにサブクローンされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；マウス乳頭腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝臓腫細胞系（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
宿主細胞は、抗ＡＢＣＢ５抗体の産生のために前記した発現またはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適した修飾された慣用的な栄養培地中で培養される。
本発明の抗ＡＢＣＢ５抗体を産生するのに用いる宿主細胞は、種々の培地中で培養することができる。ＨａｍのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ修飾イーグル培地（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）のような商業的に入手可能な培地は宿主細胞を培養するのに適している。さらに、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０），米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；もしくは第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国再発行特許第３０，９８５号に記載された培地のいずれも、宿主細胞のための培養基として用いることができる。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／または（インスリン、トランスフェリンまたは表皮成長因子のような）他の成長因子、（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩のような）塩、（ＨＥＰＥＳのような）緩衝液、（アデノシンおよびチミジンのような）ヌクレオチド、（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ．ＴＭ．薬物のような）抗生物質、（マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物と定義される）微量元素、およびグルコースまたは同等なエネルギー源で補足することができる。いずれの他の必要な補足物も、当業者に知られているであろう適切な濃度で含めることもできる。温度、ｐＨ等のような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞と共に従前用いられており、当業者に明らかであろう。
組換え技術を用いる場合、抗体は、ペリプラズム空間において細胞内で産生することができ、または直接的に培地に分泌することができる。抗体が細胞内で産生される場合、第一の工程として、宿主細胞または溶解された断片のいずれかの粒状破片を、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去する。細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドが結合するマトリックスは最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスを利用できる。制御された細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成できるよりも、より速い流速およびより短い処理時間を可能とする。いずれの予備的精製工程に続いて、混合物を、約２．５〜４．５の間のｐＨにて溶出緩衝液を用いる低いｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに付すことができ、好ましくは、低い塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍ塩）にて行うことができる。
核酸との関係で本明細書中で用いられるように、用語「単離された」は：（ｉ）例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された；（ｉｉ）クローニングによって組換えにより産生された；（ｉｉｉ）切断およびゲル分離により精製された；または（ｉｖ）例えば、化学合成によって合成された、を意味する。単離された核酸は、当該分野でよく知られた組換えＤＮＡ技術によって容易に操作可能なものである。かくして、５’および３’制限部位が知られている、またはそれについてポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列が開示されているベクターに含有されたヌクレオチド配列は単離されていると考えられるが、その天然宿主において天然状態で存在する核酸配列はそう考えられてはいない。単離された核酸は実質的に精製されていてもよいが、その必要はない。例えば、クローニングまたは発現ベクター内で単離されている核酸は、それが存在する細胞中に僅かなパーセンテージのみの物質を含むことができる点で純粋ではない。そのような核酸は単離されているが、該用語が本明細書中で用いられているように、それは当業者に知られた標準的技術によって容易に操作できるからである。
本明細書中で用いるように、コーディング配列および調節配列は、調節配列の影響または制御下にコーディング配列の発現または転写を置くように共有結合されている場合に、「操作可能に連結されている」といわれる。コーディング配列が機能的蛋白質に翻訳されるのが望ましい場合、５’調節配列中のプロモーターの誘導の結果、コーディング配列の転写がもたらされ、２つのＤＮＡ配列の間の結合の性質が（１）フレームシフト突然変異の導入をもたらさず、（２）コーディング配列の転写を指令するプロモーター領域の能力に干渉せず、または（３）蛋白質に翻訳されるべき対応するＲＮＡ転写体の能力に干渉しないならば、２つのＤＮＡ配列は操作可能に連結されているといわれる。かくして、プロモーター領域は、プロモーター領域が、得られた転写体が所望の蛋白質またはポリペプチドに翻訳されるようにそのＤＮＡ配列の転写を有効に行うことができる場合、コーディング配列に操作可能に連結されているであろう。
遺伝子発現に必要な調節配列の正確な性質は種または細胞タイプの間で変化し得るが、一般には、必要であれば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等のような各々が転写および翻訳の開始に関連する５’非転写、および５’非翻訳配列を含むべきである。特に、そのような５’非転写調節配列は、操作可能に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。調節配列は、所望により、エンハンサー配列または上流アクチベーター配列も含むことができる。
本発明の組成物および方法は、癌および前癌病変のための他の手法と組合せた利用によって増強させることができる。いくつかの場合において、処置手法は、限定されるものではないが、化学治療剤および放射線を含めた抗癌剤のようなもう１つの治療剤の投与を含む。化学治療剤はメトトレキセート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、タキソール、パクリタキセル、非糖含有クロロエチルニトロソ尿素、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラジリン、メグラミンＧＬＡ、バルルビシン、カルムスタインおよびポリフェルポサン、ＭＭＩ２７０、ＢＡＹ１２−９５６６、ＲＡＳファメシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＲＡＳ ｆａｍｅｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ファメシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＭＭＰ、ダカルバジン、ＬＹ２９４００２、ＰＸ８６６、ＭＴＡ／ＬＹ２３１５１４、ＬＹ２６４６１８／ロメテキソール、グラモレック、ＣＩ−９９４、ＴＮＰ−４７０、ヒカムチン／トポテカン、ＰＫＣ４１２、バルスポダール／ＰＳＣ８３３、ノバントロン／ミトロキンサントロン、メタレット／スラミン、バチマスタット、Ｅ７０７０、ＢＣＨ−４５５６、ＣＳ−６８２、９−ＡＣ、ＡＧ３３４０、ＡＧ３４３３、インセル／ＶＸ−７１０、ＶＸ−８５３、ＺＤ０１０１、ＩＳＩ６４１、ＯＤＮ６９８、ＴＡ２５１６／マルミスタット、ＢＢ２５１６／マルミスタット、ＣＤＰ８４５、Ｄ２１６３、ＰＤ１８３８０５、ＤＸ８９５１ｆ、レモナールＤＰ２２０２、ＦＫ３１７、ピシバニル／ＯＫ−４３２、ＡＤ３２／バルルビシン、メタストロン／ストロンチウム誘導体、テモダール／テモゾロマイド、エバセット／リポソーマルドキソルビシン、ユータキサン／パクリタキセル、タキソール／パクリタキセル、キセロード／カペシタビン、フルツロン／ドキシフルリジン、シクロパックス／経口パクリタキセル、経口タキソイド、ＳＰＵ−０７７／シスプラチン、ＨＭＲ１２７５／フラボピリドール、ＣＰ−３５８（７７４）／ＥＧＦＲ、ＣＰ−６０９（７５４）／ＲＡＳ癌遺伝子阻害剤、ＢＭＳ−１８２７５１／経口白金、ＵＦＴ（テガフール／ウラシル）、エルガミソール（Ｅｒｇａｍｉｓｏｌ）／レバミゾール、エニルウラシル／７７６Ｃ８５／５ＦＵ増強剤、カンプト／レバミソール、カンプトサール／イリノテカン、ツモデックス／ラリトレキセド、ロイスタチン／クラドリビン、パキセクス（Ｐａｘｅｘ）／パクリタキセル、ドキシル／リポソーマルドキソルビシン、カエリクス（Ｃａｅｌｙｘ）／リポソーマルドキソルビシン、フルダラ／フルダラビン、ファルマルビシン／エピルビシン、デポサイト（ＤｅｐｏＣｙｔ）、ＺＤ１８３９、ＬＵ７９５３３／ビス−ナフタルイミド、ＬＵ１０３７９３／ドラスタイン、カエチクス（Ｃａｅｔｙｘ）／リポソーマルドキソルビシン、ゲムザール／ゲムシタビン、ＺＤ０４７３／アノルメド、ＹＭ１１６、ロジン種（ｌｏｄｉｎｅ ｓｅｅｄｓ）、ＣＤＫ４およびＣＤＫ２阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｄ４８０９／デキシフォサミド、アイフェス／メスネックス／イフォサミド、ブモン／テニポシド、パラプラチン／カルボプラチン、プランチノール／シスプラチン、ベペシド／エトポシド、ＺＤ９３３１、タキソテール／ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサンアナログ、ニトロソ尿素、メルフェランおよびシクロホスファミドのようなアルキル化剤、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロロムブシル、シタラビンＨＣｌ、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、エストラムスチンホスフェートナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、フロクスウリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒドロキシ尿素（ヒドロキシカルバミド）、イフォスファミド、インターフェロンアルファ２ａ、アルファ２ｂ、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ−放出因子アナログ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミンＨＣｌ（ナイトロジェンマスタード）、メルカプトプリン、メスナ、ミトタン）、ミトキサントロンＨＣｌ、オクトレオチド、プリカマイシン、プロカルバジンＨＣｌ、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、インターロイキン２、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ；メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、ペントスタチン（２’デオキシコフォルマイシン）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）および硫酸ビンデシンよりなる群から選択することができるが、それに限定されるものではない。
本発明の方法は、外科的処置および放射線のような癌を治療するための療法と共に行うことができる。本発明の方法は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られたプロセスを通じて癌特異的ｍＲＮＡの配列特異的分解を指令する単離された短いＲＮＡである治療剤と組合せて行うこともできる。いくつかの実施形態において、癌特異的ｍＲＮＡはＡＢＣＢ５である。該プロセスは、哺乳動物および他の脊椎動物の胚を含めた広く種々の生物で起こることが知られている。ｄｓＲＮＡは長さが２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）のＲＮＡセグメントまで処理され、さらに、それらはより長いｄｓＲＮＡの非存在下においてＲＮＡ干渉を媒介することが示されている。かくして、これらの２１〜２３ｎｔ断片はＲＮＡ分解の配列特異的メディエーターであって、本明細書中においては、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉといわれる。本発明の方法は、本明細書中で検討された治療的適用に有用な哺乳動物細胞における分解のための癌特異的ｍＲＮＡの標的化を可能とするための、これらの断片（または同一もしくは同様な性質の組換えにより産生され、または化学的に合成されたオリゴヌクレオチド）の使用を含む。
ＲＮＡｉを媒介するＲＮＡの設計の方法、およびＲＮＡの細胞および動物へのトランスフェクションの方法は当該分野でよく知られており、ＲＮＡｉ分子は商業的に容易に入手可能である（Ｖｅｒｍａ Ｎ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．，２８（５）：３９５−４０４（２００４），Ｍｅｌｌｏ Ｃ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，４３１（７００６）３３８−４２（２００４），Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ Ｄ．Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４（６）：４５７−６７（２００３）Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ），Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ，ＵＳＡ），Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ｐａｒｔ ｏｆ Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ），Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ，ＵＳＡ），ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）、およびＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ））。ＲＮＡは、好ましくは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホルアミダイドおよび慣用的なＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて化学的に合成される。最も便宜には、ｓｉＲＮＡは本明細書中にリストされた商業的なＲＮＡオリゴ合成供給業者から得られる。一般に、ＲＮＡは、合成するのが余りにも困難ではなく、ＲＮＡｉに適した量で容易に提供される。典型的な０．２μモルスケールのＲＮＡ合成は、約１ミリグラムのＲＮＡを提供し、これは、２４ウェル組織培養プレート様式を用いる１０００のトランスフェクション実験に十分である。
癌特異的ｃＤＮＡ特異的ｓｉＲＮＡは、好ましくは、５０〜１００ｂｐの開始コドンおよび終止コドン内にはない配列を選択することによって設計され、イントロン領域を回避し、ＡＡＡＡ、ＣＣＣＣのような４以上の塩基のストレッチを回避し、ＧＣ含有量＜３０％または＞６０％を持つ領域を回避し、反復および低い複雑性の配列を回避し、それは単一ヌクレオチド多形部位を回避する。標的配列はほぼ５０％のＧＣ含有量を有することができる。ｓｉＲＮＡ標的化配列は、ＢＬＡＳＴ相同性検索を用いてさらに評価して、他の遺伝子または配列に対する標的の効果を回避することができる。陰性対照は、標的化ｓｉＲＮＡ配列を混ぜることによって設計される。対照ＲＮＡは、好ましくは、ｓｉＲＮＡと同一の長さおよびヌクレオチド組成を有するが、少なくとも４〜５塩基はｓｉＲＮＡに対してミスマッチである。本発明のＲＮＡ分子は３’ヒドロキシル基を含むことができる。ＲＮＡ分子は、一本鎖または二本鎖とすることができ；そのような分子は平滑末端とすることができるか、または長さが約１〜約６ヌクレオチドの突出末端（例えば、５’、３’）（例えば、ピリミジンヌクレオチド、プリンヌクレオチド）を含むことができる。本発明のＲＮＡの安定性をさらに高めるために、３’突出を分解に対して安定化することができる。ＲＮＡは、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチドのようなプリンヌクレオチドを含めることによって安定化させることができる。あるいは、修飾されたアナログによるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、ウリジン２ヌクレオチド３’突出の２’デオキシチミジンによる置換は許容され、ＲＮＡｉの効率に影響しない。２’ヒドロキシルの非存在は、組織培養基における突出のヌクレアーゼ耐性を有意に高める。
本発明の方法に用いるＲＮＡ分子は、当業者に知られた多数の技術を用いて得ることができる。例えば、ＲＮＡは、当該分野で公知の方法を用いて化学的に合成し、または組換えにより産生することができる。そのような方法は、米国公開特許出願第２００２−００８６３５６Ａ１号および第２００３−０２０６８８４Ａ１に記載され、ここに引用してその全体を援用する。
本明細書中に記載された方法を用いて、癌特異的ｍＲＮＡ分解の配列特異的メディエーターとして、癌細胞の機能に寄与する蛋白質を阻害するのに有用であるＲＮＡ分子を同定、または得る。ＡＢＣＢ５の発現は、例えば、蛋白質が翻訳され、かくして、インビボにてその機能を妨げるために、ヒトにおいて阻害することができる。
いずれのＲＮＡも本発明の方法で用いることができ、但し、それは癌特異的遺伝子に対して十分な相同性を有して、ＲＮＡｉを媒介するものとする。本発明で用いるためのＲＮＡは、全癌特異的遺伝子またはその一部に対応することができる。用いることができるＲＮＡの長さに上限はない。例えば、ＲＮＡは、約２１塩基対（ｂｐ）の遺伝子から全長遺伝子以上の範囲とすることができる。１つの実施形態において、本発明の方法に用いるＲＮＡは長さが約１０００ｂｐである。もう１つの実施形態において、ＲＮＡは長さが約５００ｂｐである。なおもう１つの実施形態において、ＲＮＡは長さが約２２ｂｐである。ある実施形態において、本発明のＲＮＡの好ましい長さは２１〜２３ヌクレオチドである。ＡＢＣＢ５の配列は知られている。例えば、（７ｐＰ糖蛋白質としてのＡＢＣＢ５に言及する）米国特許第６８４６８８３号を参照されたい。
本発明のＡＢＣＢ５結合分子は、癌を治療するのに有効な量で被験体に投与される。「癌を治療するのに有効な量」とは、望まれる生物学的効果を認識するのに必要な量または十分な量である。例えば、本発明の化合物の有効量は、（ｉ）癌細胞を殺傷する；（ｉｉ）癌のさらなる成長を阻害する、すなわち、その発達を阻止し、または遅らせる；および／または（ｉｉｉ）癌細胞を抗癌剤もしくは治療剤に対して感受性とするのに必要な量であり得る。本発明のいくつかの態様によると、有効量は、本発明の化合物の単独、または癌医薬との組合せにおける量であり、組合せ、または同時投与され、もしくは単独で投与された場合に、癌の予防または治療のいずれかにおいて癌に対する治療的応答を生じる結果となる。生物学的効果は癌に由来する兆候の緩和および／または絶対的排除であってよい。もう１つの実施形態において、生物学的効果は、例えば、腫瘍の非存在、または癌細胞を含まないバイオプシーもしくは血液スミアーによって証明されるように、癌の完全な排除である。
癌の治療における、または癌を発生する危険性の低下における本発明の化合物の有効量は、用いる具体的な化合物、化合物の送達の様式、およびそれを単独または組合せて用いるか否かに依存して変化し得る。いずれかの特定の適用のための有効量は、治療すべき癌、投与されるべき特定の化合物、被験体のサイズ、疾患または状態の重症度のような因子に依存して変化し得る。当業者であれば、過度な実験の必要なくして、本発明の特定の分子の有効量を経験的に決定することができる。本明細書中に提供される教示と組合せて、種々の活性な化合物、ならびに能力、相対的生物学的利用性、患者の体重、有害な副作用の重篤度、および好ましい投与の様式のような重点（ｗｅｉｇｈｎｉｎｇ）因子の中から選択することによって、有効な予防的または治療的処置養生法を計画することができ、これは実質的な毒性を引き起こさず、依然として、特定の被験体を治療するのに完全に有効である。
本明細書中に記載された化合物の被験体における用量は、典型的には、約０．１μｇ〜１０，０００ｍｇ、より典型的には、約１μｇ〜８０００ｍｇ／日、最も典型的には約１０μｇ〜１００μｇの範囲である。被験体の体重に換算して述べると、典型的な用量は約０．１μｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、より典型的には約１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、最も典型的には約１〜５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。絶対的な量は、同時処置、用量の数、ならびに年齢、身体状態、サイズおよび体重を含めた個々の患者のパラメーターを含めた種々の因子に依存するであろう。これらは当業者によく知られた因子であり、常套的実験の範囲内で取り込むことができる。一般には、最大用量を用いることができ、すなわち、健全な医学的判断に従う最高の安全な用量を用いるのが好ましい。
本発明の分子の複数用量も考えられる。いくつかの例において、本発明の分子を癌医薬と共に投与する場合、分子または癌医薬いずれかの治療用量以下、または双方の治療用量以下を、癌を有するか、または癌を発生する危険性がある被験体の治療に用いる。薬物の２つのクラスを一緒に用いる場合、癌医薬を治療用量以下で投与して、望ましい治療結果を生じさせることができる。「治療用量以下」とは、本明細書中で用いるように、他の薬剤の非存在下で投与された場合、被験体において治療的結果を生じさせるであろう用量未満である用量をいう。かくして、癌医薬の治療用量以下は、本発明の分子の投与の非存在下において被験体において所望の治療的結果を生じないものである。癌医薬の治療用量は、癌の治療のための医薬の分野においてよく知られている。これらの用量はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｉｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．，１９９０；ならびに癌の治療のためのガイドラインとして医学専門が依拠する多くの他の医学文献のような文献に広く記載されてきた。抗体の治療用量も当該分野において記載されてきた。
種々の投与経路を利用できる。選択された特定の様式は、もちろん、選択された特定の抗ＡＢＣＢ５抗体、治療すべき特定の状態、および治療的効果に必要な用量に依存するであろう。本発明の方法は、一般的に言えば、医学的に許容されるいずれの投与の様式を用いて実行することができ、臨床的に許容できない有害効果を引き起こすことなく有効レベルの保護を生じさせるいずれの様式を意味する。用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、および胸骨内注射、または注入技術を含む。他の経路は、限定されるものではないが経口、鼻、皮膚、舌下および局所を含む。
本発明の製剤は、常套的には、医薬上許容される濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合する担体、補助剤および、所望により、他の治療的成分を含有することができる医薬上許容される溶液にて投与される。
本発明の化合物は、医薬を投与するためのいずれかの通常の経路によって投与することができる。治療すべき癌のタイプに応じて、本発明の化合物を吸入し、摂取することができ、または全身経路によって投与することができる。全身経路には経口および非経口を含む。特に肺癌患者において、肺への直接的送達のため、吸入される医薬がいくつかの実施形態においては好ましい。計量用量インハーラーのいくつかのタイプが、正規には、吸入による投与のために用いられる。これらのタイプのデバイスには、計量用量インハーラー（ＭＤＩ）、呼吸作動ＭＤＩ、乾燥粉末インハーラー（ＤＰＩ）、ＭＤＩと組合せたスペーサー／保持チャンバー、およびネブライザーを含む。好ましい投与の経路には、限定されるものではないが、経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、気管内、包膜内、静脈内、吸入、眼、膣および直腸を含む。療法に用いるために、有効量の本発明の化合物を、核酸を罹患した器官または組織に送達するいずれの様式によって被験体に投与することができる。本発明の医薬組成物を「投与すること」は、当業者に知られたいずれの手段によって達成することができる。
本発明の方法によると、ペプチドは医薬組成物に組み込んでもよい。一般に、医薬組成物は本発明のペプチドおよび医薬上許容される担体を含む。ペプチドのための医薬上許容される担体、モノクローナル抗体、および抗体断片は当業者によく知られている。本明細書中で用いるように、医薬上許容される担体は、有効成分の生物学的活性、例えば、ＡＢＣＢ５に結合するペプチドの能力の有効性に干渉しない非毒性物質を意味する。
医薬上許容される担体には、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定化剤、可溶化剤、および当該分野でよく知られた他の物質を含む。ペプチド用の例示的な医薬上許容される担体は、特に、米国特許第５，２１１，６５７号に記載されている。そのような製剤は、常套的には、塩、緩衝剤、保存剤、適合する担体、および、所望により、他の治療剤を含有してもよい。医薬において用いる場合、塩は医薬上許容されるべきであるが、非医薬上許容される塩は、便宜には、その医薬上許容される塩を調製するのに用いることができ、本発明の範囲から排除されない。そのような薬理学的および医薬上許容される塩には、限定されるものではないが、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サルチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等から調製されるものを含む。医薬上許容される塩はまた、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩のようなアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩として調製することができる。
本発明のペプチドは、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、座薬、吸入剤および注射、ならびに経口、非経口、または外科的投与のための通常の方法のような固体、半固体、液体または気体形態の製剤に製剤化することができる。本発明は、インプラントによるような、局所投与のために製剤化される医薬組成物も含む。
経口投与に適した組成物は、カプセル、錠剤、ロゼンジのような、各々が所定量の活性剤を含有する、区別される単位として提供してもよい。他の組成物は、シロップ、エリキシルまたはエマルジョンのような水性液体または非水性液体中の懸濁液を含む。
（ペプチドおよび非ペプチド変異体を含めた）本明細書中に記載された化合物を治療的に用いる場合、ある実施形態においては、望ましい投与様式は肺エアロゾルによるものであってよい。化合物を含有するエアロゾル送達系を調製するための技術は当業者によく知られている。一般に、そのような系はペプチドの生物学的特性を有意に損なわない化合物を利用すべきである（例えば、ここに引用して援用する、Ｓｃｉａｒｒａ ａｎｄ Ｃｕｔｉｅ，“Ａｅｒｏｓｏｌｓ，”ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０，ｐｐ １６９４−１７１２参照）。当業者であれば、過度な実験に頼ることなくエアロゾルを製造するための種々のパラメーターおよび条件を容易に決定することができる。
本発明のペプチドは組織に直接的に投与することができる。好ましくは、組織は、癌幹細胞が見出されるものである。あるいは、組織は癌が生じるようであるものである。直接的組織投与は、直接的注射によって達成することができる。ペプチドは１回投与してもよく、またはそれは複数回で投与してもよい。複数回投与する場合、ペプチドを異なる経路を介して投与してもよい。例えば、最初の（または最初の数回の）投与は冒された組織へ直接的になしてもよく、他方、後者の投与は全身投与であってよい。
経口投与のためには、化合物は、活性化合物を当該分野でよく知られた医薬上許容される担体と組合せることによって容易に製剤化することができる。そのような担体によって、本発明の化合物は、治療すべき被験体による経口接取のため、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として製剤化することができる。経口的使用のための医薬製剤は、所望により、得られた混合物を粉砕し、所望であれば適当な補助剤を加えた後に顆粒の混合物を処理して、錠剤または糖衣錠コアを得ることによって固体賦形剤として得ることができる。適当な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含めた糖；例えば、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のようなセルロース調製物のような充填剤である。所望であれば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸、もしくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような崩壊剤を加えてもよい。所望により、経口製剤は、生理食塩水もしくは内部酸状態を中和するための緩衝液に製剤化してもよく、またはいずれの担体もなくして投与してもよい。
糖衣錠コアには適当なコーティングが施される。この目的では、所望により、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液および適当な有機溶媒または溶媒混合液を含有し得る濃縮された糖溶液を用いてもよい。染料または顔料を、同定または活性化合物用量の異なる組合せを特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えてもよい。
経口的に用いることができる医薬製剤は、ゼラチンで作製された押し込み型カプセル、ならびにゼラチン、およびグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤で作製された密封カプセルを含む。押し込み型カプセルは、ラクトースのような充填剤、澱粉のような結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような活滑剤および、所望により、安定化剤と混合された活性成分を含有することができる。ソフトカプセルにおいて、活性な化合物を脂肪油、流動パラフィン、もしくは液体ポリエチレングリコールのような適当な液体に溶解させ、または懸濁させてもよい。さらに、安定化剤を加えてもよい。経口投与用に製剤化されたマイクロスフィアを用いてもよい。そのようなマイクロスフィアは、当該分野でよく規定されてきた。経口投与用の全ての製剤はそのような製剤に適した用量とすべきである。
口腔投与のために、組成物は慣用的な方法で製剤化された錠剤またはロゼンジの形態とすることができる。
吸入による投与のためには、本発明に従って用いる化合物は、適当なプロペラント、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適当なガスを用いて、圧縮されたパックまたはネブライザーからエアロゾルスプレイ供給の形態で便宜は送達することができる。圧縮されたエアロゾルの場合には、用量単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定することができる。例えば、インハーラーまたはインスフレーターに用いられるゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物、およびラクトースまたは澱粉のような適当な粉末基剤の粉末ミックスを含有するように製剤化してもよい。エアロゾル送達系を調製するための技術は当業者によく知られている。一般に、そのような系は、活性剤の生物学的特性を有意に損なわない成分を利用すべきである（例えば、ここに引用して援用する、Ｓｃｉａｒｒａ ａｎｄ Ｃｕｔｉｅ，“Ａｅｒｏｓｏｌｓ，”ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０，ｐｐ １６９４−１７１２参照）。当業者であれば、過度な実験に頼ることなくエアロゾルを製造するための種々のパラメーターおよび条件を容易に決定することができる。
化合物は、それを全身送達するのが望ましい場合、注射による、例えば、ボーラス注射または連続的注入による非経口投与用に製剤化してもよい。注射用製剤は、単位用量形態にて、例えば、アンプルまたは多用量容器にて、保存剤を加えて提供してもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態となってもよく、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤のような製剤を含有してもよい。
非経口投与用の製剤は、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水性担体には水、アルコール／水性溶液、エマルジョンまたは生理食塩水および緩衝化媒体を含む懸濁液を含む。非経口ビヒクルには塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳化リンゲル、または固定油を含む。静脈内ビヒクルには流体および栄養補給剤、（リンゲルデキストロースに基づくもののような）電解質補充物等を含む。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガス等のような、保存剤および他の添加剤を存在させることもできる。より低い用量は、静脈内投与のような投与の他の形態に由来する。被験体における応答が適用した初期用量において不十分な場合には、より高い用量（または種々のより局所化された送達経路によって有効的により高い用量）を、患者の許容値が許す程度まで使用することができる。一日当たりの複数回用量は、化合物の適当な全身レベルを達成すると考えられる。
なお他の実施形態において、好ましいビヒクルは、哺乳動物受容体への移植に適している生体適合性微粒子またはインプラントである。本発明に従って有用である例示的な生分解性インプラントは、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ／０３３０７（１９９４年３月１５日に出願された米国特許出願第２１３，６６８号に対する優先権を主張する「Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ」と題された公開番号ＷＯ９５／２４９２９）に記載されている。ＰＣＴ／ＵＳ／０３３０７は、生物学的高分子を含有するための生体適合性の、好ましくは生分解性ポリマーマトリックスを記載する。ポリマーマトリックスを用いて、被験体において薬剤の持続放出を達成することができる。本発明の１つの態様に従うと、本明細書中に記載された薬剤は、ＰＣＴ／ＵＳ／０３３０７に開示された生体適合性の、好ましくは生分解性ポリマーマトリックス内にカプセル化、または分散させることができる。ポリマーマトリックスは、好ましくは、マイクロスフィア（ここに、該薬剤は固体ポリマーマトリックス全体に分散している）のような微粒子、またはマイクロカプセル（ここに、該薬剤はポリマーシェルのコアに貯蔵されている）の形態である。該薬剤を含有させるためのポリマーマトリックスの他の形態にはフィルム、コーティング、ゲル、インプラントおよびステントを含む。ポリマーマトリックスデバイスのサイズおよび組成は、マトリックスデバイスが移植される組織において好都合な放出キネティクスをもたらすように選択される。用いるべき送達方法、典型的には、組織への注射、またはエアロゾルによる懸濁液の鼻および／もしくは肺領域への投与方法に従って、ポリマーマトリックスのデバイスのサイズがさらに選択される。ポリマーマトリックスの組成は、双方の好都合な分解速度を有するように、また、生体接着性である物質から形成され、デバイスが血管、肺または他の表面に投与される場合に移動の有効性を増加させるように選択することができる。マトリックスの組成は分解しないように、しかし、長時間にわたって拡散によって放出するように選択することもできる。
非生分解性および生分解性双方のポリマーマトリックスを用いて、本発明の薬剤を被験体に送達することができる。生分解性マトリックスが好ましい。そのようなポリマーは天然または合成ポリマーであってよい。合成ポリマーが好ましい。ポリマーは、一般には、数時間〜１年以上のオーダーで、放出が望まれる時間に基づいて選択される。典型的には、数時間ならびに３〜１２か月の間の範囲の期間にわたる放出が最も望ましい。ポリマーは、所望により、水中にその重量の約９０％まで吸収することができるヒドロゲルの形態であり、さらに、所望により、多価イオンまたは他のポリマーで架橋されている。
一般に、本発明の薬剤は、拡散によって、またはより好ましくは、ポリマーマトリックスの分解によって、生分解性インプラントを用いて送達することができる。生分解性送達系を形成するのに用いることができる例示的な合成ポリマーにはポリアミド、ポリカルボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキサイド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそのコポリマー、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリル酸およびメタクリル酸エステルのポリマー、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシルエチルセルロース、セルローストリアセテート、セルローススルフェートナトリウム塩、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソブロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、ポリ（アクリル酸オクタデシル）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキサイド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレンおよびポリビニルピロリドンを含む。
非生分解性ポリマーの例にはエチレン酢酸ビニル、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリアミド、そのコポリマーおよび混合物を含む。
生分解性ポリマーの例には乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリアンヒドリド、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、およびポリ（ラクチド−コカプロラクトン）のような合成ポリマー、アルギネート、ならびにデキストランおよびセルロースを含めた他の多糖類、コラーゲン、その化学的誘導体（化学基、例えば、アルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者によって常套的になされる他の修飾）、アルブミンおよび他の親水性蛋白質、ゼインおよび他のプロラミンおよび疎水性蛋白質、そのコポリマーおよび混合物のような天然ポリマーを含む。一般に、これらの物質は酵素加水分解またはインビボでの水への暴露によって、表面またはバルク腐食によって分解する。
特に注目する生体接着性ポリマーには、ここに引用してその教示を援用する、Ｈ．Ｓ．Ｓａｗｈｎｅｙ，Ｃ．Ｐ．Ｐａｔｈａｋ ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｈｕｂｅｌｌ ｉｎ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９３，２６，５８１−５８７によって記載された生分解性ヒドロゲル、ならびにポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリアンヒドリド、ポリアクリル酸、アルギネート、キトサン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソブロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、およびポリ（アクリル酸オクタデシル）を含む。
他の送達系には、時間放出、遅延放出または持続放出送達系を含むことができる。そのような系はペプチドの反復投与を回復することができ、被験体および医師に対する便宜を増大させる。放出送達系の多くのタイプは入手可能であり、当業者に知られている。それらにはポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸およびポリアンヒドリドを含む。薬物を含有する前記ポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。送達系には、コレステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸のようなステロール、またはモノ、ジおよびトリグリセリドのような中性脂肪を含む脂質；ヒドロゲル放出系；シラスティック系；ペプチドベースの系；ワックスコーティング；慣用的な結合剤および賦形剤を用いる圧縮錠剤；部分的に融合されたインプラント等である非ポリマー系も含む。具体的な例には、限定されるものではないが、（ａ）米国特許第４，４５２，７７５号、第４，６７５，１８９号、および第５，７３６，１５２号に記載されたもののような、血小板減少剤がマトリックス内の形態で含有される腐食系、ならびに（ｂ）米国特許第３，８５４，４８０号、第５，１３３，３９４号および第５，４０７，６８６号に記載されたようなポリマーからの制御された速度で有効成分が浸透する拡散系を含む。さらに、ポンプベースハードウエア送達系を用いることができ、そのうちいくつかは移植に適合している。
長期持続放出インプラントの使用は、再発性癌を発生する危険性がある被験体の予防的処置に特に適しているであろう。長期放出は、本明細書中で用いるように、インプラントが少なくとも３０日、好ましくは６０日の間、治療レベルの有効成分を送達するように構築され、配置されることを意味する。長期持続放出インプラントは当業者によく知られており、前記したいくつかの放出系を含む。
抗体の治療製剤は、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で、所望の程度の純度を有する抗体を、任意の医薬上許容される担体、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって貯蔵のために調製することができる。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、使用する用量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールのような）保存剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのような蛋白質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含めた単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールのような糖類；ナトリウムのような塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ蛋白質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を含む。
以下の実施例は、本発明の実施の具体的な例を示すために提供され、本発明の範囲を限定する意図はない。当業者に明らかなように、本発明は、種々の組成物および方法においてその適用を見出す。
材料および方法：
メラノーマ細胞および培養方法。軟寒天中でクローン化された単一腫瘍細胞に由来するＧ３３６１ヒト悪性メラノーマ細胞系は、Ｅｍｉｌ Ｆｒｅｉ第三世博士（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から贈られ、Ａ３７５細胞系はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から商業的に入手可能である。全ての細胞系を、従前に記載されているように、加湿インキュベーター中で３７℃および５％ＣＯ２にて、１０％胎児ウシ血清、６ミリモル／Ｌ ＨＥＰＥＳ、２ミリモル／ｌ Ｌ−グルタミン、および１００ＩＵ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。Ｇ３３６１／ＤｓＲｅｄ２およびＧ３３６１／ＥＹＦＰ細胞系は、従前に記載されているように、ネオマイシン耐性カセット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）およびリポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）も含有するｐＤｓＲｅｄ２−ＮｕｃまたはｐＥＹＦＰ−Ｎｕｃ哺乳動物発現ベクターを用い、サルウイルス４０ラージＴ抗原核保持シグナル（Ｋａｌｄｅｒｏｎ，Ｄ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｂ．Ｌ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｗ．Ｄ．＆Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｅ．Ａ ｓｈｏｒｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｂｌｅ ｔｏ ｓｐｅｃｉｆｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ ３９，４９９−５０９（１９８４））と組合せた、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．赤色蛍光蛋白質（ＤｓＲｅｄ２）またはＡｅｑｕｏｒｅａ Ｖｉｃｔｏｒｉａ緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の増強された黄色−緑色変異体（ＥＹＦＰ）いずれかでのＧ３３６１メラノーマ細胞の安定なトランスフェクションによって生じさせた。クローンＧ３３６１／ＤｓＲｅｄおよびＧ３３６１／ＥＹＦＰ培養物は、限界希釈法によって安定にトランスフェクトされた培養物から生じさせた。新鮮な臨床メラノーマ細胞（ｎ＝６患者）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌまたはＷｉｓｔａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡのＩＲＢによって認可されたヒト対象リサーチプロトコルに従って、外科的検体由来のものであった。
抗体。特異的なＩｇＧ１κ抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ ３Ｃ２−１Ｄ１２を、本明細書中において、発現実験に用いた。ＦＩＴＣコンジュゲート型３Ｃ２−１Ｄ１２ ｍＡｂを用いて、分類されたＡＢＣＢ５＋およびＡＢＣＢ５−メラノーマサブセットの純度をアッセイした。未コンジュゲート型またはＦＩＴＣコンジュゲート型ＭＯＰＣ−３１Ｃマウスイソタイプ対照ｍＡｂ、ＦＩＴＣコンジュゲート型ヤギ抗マウスＩｇＧ二次Ａｂ、フィコエリスリン（ＰＥ）コンジュゲート型抗ヒトＣＤ２０、抗ヒトＣＤ３１およびイソタイプ対照ｍＡｂはＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから購入した。アロフィコシアニン（ＡＢＣ）コンジュゲート型およびＰＥコンジュゲート型二次ｍＡｂはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ ｄｉｅｇｏ，ＣＡから購入した。未コンジュゲート型抗ヒトＴＩＥ−１、抗ヒトＢＭＰＲ１ａ、ＰＥコンジュゲート型抗ヒトＶＥ−カドヘリンおよび抗ヒトネスチンｍＡｂはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮから購入した。以下の抗体をＡＢＣＢ５、ＴＩＥ−１およびＶＥ−カドヘリン免疫組織化学および免疫蛍光染色のために用いた：マウス抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ（Ｆｒａｎｋ，Ｎ．Ｙ．ら、ＡＢＣＢ５−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５，４３２０−３３（２００５）；Ｆｒａｎｋ，Ｎ．Ｙ．ら、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ ｂｙ ＡＢＣＢ５ Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８，４７１５６−６５（２００３））、ＨＲＰコンジュゲーデッドウマ抗マウスＩｇＧ二次Ａｂ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、ＦＩＴＣコンジュゲート型ウサギ抗マウスＩｇＧ二次Ａｂ（ＺＹＭＥＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡによって親切にも提供された）未コンジュゲート型ウサギ抗ヒトＶＥ−カドヘリンＡｂ、マウス対照ＩｇＧ Ａｂ（ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）、未コンジュゲート型ウサギ抗ヒトＴＩＥ−１ ｍＡｂ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ＦＩＴＣコンジュゲート型ロバ抗マウスＩｇＧ二次Ａｂ、テキサスレッドコンジュゲート型ロバ抗ウサギＩｇＧ二次Ａｂ、Ｃｙ３コンジュゲート型ロバ抗ウサギＩｇＧ二次Ａｂ、およびウサギ対照ＩｇＧ Ａｂ（全て、Ｊａｃｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）。
組織病理学および免疫組織化学。５ミクロンの厚みのメラノーマ低温切開片を−２０℃アセトン中で５分間固定化した。風乾された切片を、１０μｇ／ｍｌ ＡＢＣＢ５ ｍＡｂと共に４℃にて一晩インキュベートした；１０μｇ／ｍｌマウスＩｇＧを陰性対照として用いた。切片をＰＢＳ×３で５分間洗浄し、ＡＢＣＢ５染色のために１：２００ペルオキシダーゼコンジュゲート型ウマ抗マウスＩｇＧ Ａｂと共にインキュベートした。ＡＢＣＢ５／ＶＥ−カドヘリンまたはＡＢＣＢ５／ＴＩＥ−１蛍光二重標識のために、５μｍメラノーマ切片を−２０℃のアセトン中で５分間固定した。風乾された切片を１０μｇ／ｍｌ ＡＢＣＢ５ ｍＡｂおよび２．５μｇ／ｍｌ ＶＥ−カドヘリンまたはＴＥ−１ Ａｂと共に４℃にて一晩インキュベートし；１０μｇ／ｍｌマウスＩｇＧおよび２．５μｇ／ｍｌウサギＩｇＧを陰性対照として用いた。切片を、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで３回、５分間洗浄し、テキサスレッドコンジュゲート型またはＣｙ３コンジュゲート型ロバ抗ウサギＩｇＧ ＡｂおよびＦＩＴＣコンジュゲート型ウサギ抗マウスＩｇＧ Ａｂの１：１５０希釈と共に室温で３０分間インキュベートした。引き続いての洗浄の後に、切片にＶＥＣＴＡＣＨＩＥＬＤマウンティング培地（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を設置し、カバースリップを載せた。免疫蛍光反応性を、Ｃｙｔｏｖｉｓｉｏｎシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に連結されたＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１／５２システム顕微鏡で観察した。
組織マイクロアレイの設計および分析。メラノーマ細胞腫瘍進行ＴＭＡは、３つの皮膚芽胞（ＳＰＯＲＥＳ）（Ｈａｒｖａｒｄ，Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖｅｎｉａ）の共同努力の産物である。このアレイは４つの主な診断腫瘍タイプ：良性母斑、原発性皮膚メラノーマ、リンパ節転移および内臓転移を表わす腫瘍組織の４８０×０．６ｍｍコアを含有する。症例は、３つの参加した施設の病理学サービスから収集した。品質制御目的では、二連コアを各別々の領域で選択する。母斑および原発性メラノーマはサンプリングされた組織ブロック（２または６コア）の１つの領域または３つの領域いずれかを有し、他方、転移腫瘍は各ブロックからサンプリングされた１つの領域を有した。従って４８０コアは、２４０の区別される組織学的領域からの２つの隣接するコアを表わす。このアレイは３５の母斑からの１３０コア、６０の原発性メラノーマからの２００コアおよび７５の転移病変からの１５０コアを含む。操作的には、薄い母斑および薄いメラノーマは表層／乳頭真皮のみを含み、他方、厚い母斑および厚いメラノーマは、乳頭および深い（網状）真皮双方を含むように成長した。このアレイはＭａｒｋ Ｒｕｂｉｎ博士の研究所（Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｏｓｔｏｎ）で構築した。組織アレイスライドの組織学的切片を５８℃にて２０分間ベーキングし、次いで、以下のように処理した：キシレン×２（１時間、１０分間）、２分間の１００％エタノール×２、２分間の９５％エタノール、および２分間のｄＨ２Ｏ×３。抗原検索は、圧力器中で沸騰させつつ、１０ミリモルのクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０中で１０分間行い、次いで、室温まで冷却した。ＰＢＳ×２で５分間洗浄した後、組織をＰＢＳ中の１０％ウマ血清および１％ＢＳＡで室温にて１時間ブロックし、次いで、５μｇ／ｍｌ ＡＢＣＢ５ ｍＡｂと共に４℃にて一晩インキュベートした。次いで、組織をＰＢＳ０．０５％ｔｗｅｅｎ２０×３で５分間洗浄し、次いで、３％Ｈ２Ｏ２／ＰＢＳで１５分間処理した。ＰＢＳ中ですすいだ後、切片を１：２００ビオチニル化ウマ抗マウスＩｇＧ Ａｂと共に室温にて３０分間インキュベートし、ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ×３中で５分間すすぎ、アビジン−ビオチン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に室温で３０分間インキュベートした。ＮｏｖａＲｅｄ基質（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて免疫反応性を検出した。Ｃｈｒｏｍａｖｉｓｉｏｎ自動細胞イメージングシステム（ＡＣＩＳ）を用いて、ＨＴＭＡ８４組織マイクロアレイ上でＡＢＣＢ５およびｍＩｇＧＩＲの免疫染色強度を定量した。対照スライド強度値（バックグラウンド＋固有のメラニン化）を実験スライドから差し引き、各コアについての強度値の差を取って、真実の染色とした。このグラフ（図１参照）は、９５％信頼区間でもって、各病理学診断について強度の差を示す。関連群の間のＰ値を、独立／標本ｔ検定を用いて計算した。各誤差棒上方の数は、各群内の症例の数を示す。
ＡＢＣＢ５発現のフローサイトメトリー分析。臨床患者由来メラノーマ細胞懸濁液中での、ＡＢＣＢ５と、ＣＤ２０、ＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリン、ＢＭＰＲ１ａ表面マーカーまたはネスチンまたはＴＩＥ−１細胞内マーカーとの同時発現の分析は、従前に記載されているように、二色フローサイトメトリーによって行った。臨床メラノーマ細胞を抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂまたはイソタイプ対照ｍＡｂまたはＡｂ無しと共にインキュベートし、続いてＡＰＣコンジュゲート型ロバ抗マウスＩｇＧで逆染色した。次いで、細胞を、２％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中で固定し（４℃にて３０分間）、引き続いて、ＰＥコンジュゲート型抗ＣＤ２０、抗ＣＤ３１、抗ＶＥ−カドヘリン、抗ネスチンもしくはＰＥコンジュゲート型イソタイプ対照ｍＡｂ、または未コンジュゲート型抗ＢＭＰＲ１ａ、抗ＴＩＥ−１もしくは未コンジュゲート型イソタイプ対照ｍＡｂと共にインキュベートし、続いて、ＰＥまたはＦＩＴＣコンジュゲート型抗免疫グロブリン二次抗体で逆染色した。染色緩衝液または１％サポニン浸透化緩衝液での洗浄工程は各工程の間に行った。引き続いて、記載されるように、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でのＦｌ１（ＦＩＴＣ）またはＦｌ２（ＰＥ）およびＦｌ４（ＡＰＣ）スペクトルにおける蛍光発光の獲得によって、二色フローサイトメトリーを行った。ＡＢＣＢ５＋およびＡＢＣＢ５−細胞による前記リストされたマーカーの発現レベルの統計学的差は、ノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて決定した。Ｐ＜０．０５の両側Ｐ値は有意と考えられた。Ａ３７５メラノーマ細胞を、記載されたように、抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂまたはイソタイプ対照ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）とのインキュベーションによって表面ＡＢＣＢ５発現について分析し、引き続いて、ＦＩＴＣコンジュゲート型ヤギ抗マウス免疫グロブリン二次抗体で逆染色し、および一色フローサイトメトリー（Ｆｌ１）を行った。
細胞の単離。腫瘍細胞接種から８週間後に、犠牲にしたＢａｌｂ／ｃ ＮＯＤ／ＳＣＩＤまたはＢａｌｂ／ｃヌードマウスからの腫瘍の外科的切開に際して、単一細胞懸濁液をヒトメラノーマ異種移植片から生じさせた。各腫瘍を小さな断片（約１ｍｍ３）に切断し、引き続いて、２００ｒｐｍの振盪プラットフォーム上で、０．１ｇ／Ｌ塩化カルシウムおよび５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＳｅｒｖａ ＮＢ６（ＳＥＲＶＡ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する１０ｍｌ滅菌ＰＢＳ中で、腫瘍断片を３７℃で３時間インキュベートし、単一細胞懸濁液を得た。引き続いて、腫瘍細胞を過剰なコラゲナーゼの除去のためにＰＢＳで洗浄した、ＡＢＣＢ５＋細胞を陽性選択によって単離し、記載されたような抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ標識および磁性ビーズ細胞ソーティングを用いてＡＢＣＢ５＋細胞を除去することによってＡＢＣＢ５−細胞集団を生じさせた。簡単に述べると、ヒトメラノーマ異種移植片または臨床メラノーマ試料に由来するヒトＧ３３６１もしくはＡ３７５メラノーマ細胞または単一細胞懸濁液を、抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）で４℃にて３０分間標識し、過剰の抗体除去のために洗浄し、引き続いて、製造業者の推奨に従って、二次抗マウスＩｇＧ ｍＡｂコーティング型磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）とのインキュベーション、およびＭｉｎｉＭＡＣＳ分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中での引き続いてのデュアル通過細胞分離を行った。ＡＢＣＢ５＋細胞単離体およびＡＢＣＢ５−ヒトＧ３３６１メラノーマ細胞の純度は、ＦＩＴＣコンジュゲート型抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂとのインキュベーション、続いての、抗マウスＩｇＧ ｍＡｂコーティング型マイクロビーズインキュベーションおよび磁性細胞ソーティングの後に、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）でのＡＢＣＢ５発現（Ｆｌ１）のフローサイトメトリーによってアッセイした。未分離のＡＢＣＢ５＋およびＡＢＣＢ５−ヒトＧ３３６１メラノーマ細胞の間のＡＢＣＢ５発現の統計学的差は、片側ＡＮＯＶＡを用いて決定し、続いて、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を行った。Ｐ＜０．０５の両側Ｐ値は統計学的に有意と考えられた。
動物。Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスおよびＢａｌｂ／ｃ ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスはＴｈｅ Ｊａｃｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。マウスを、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ＢｏｓｔｏｎおよびＨａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌの制度ガイドラインに従って維持し、認可された実験プロトコルに従って実験を行った。
ヒトメラノーマ異種移植。未分離のＡＢＣＢ５＋またはＡＢＣＢ５−ヒトＧ３３６１（各々、１０７、１０６、または１０５／接種物）、またはヒトＡ３７５（各々、２×１０６、２×１０５、または２×１０４／接種物）、または臨床患者由来メラノーマ細胞（各々、１０６／接種物）、またはＡＢＣＢ５＋由来初代Ｇ３３６１腫瘍異種移植片から単離されたＡＢＣＢ５＋もしくはＡＢＣＢ５−細胞（各々、１０７／接種物）をレシピエントＢａｌｂ／ｃ ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの横腹に片側または両側皮下注射した。腫瘍形成／成長を、過剰な腫瘍サイズがプロトコル規定安楽死をより早く要求しない限り、確立された式［ＴＶ（ｍｍ３）＝π／６×０．５×長さ×（幅）２］に従っての腫瘍容量（ＴＶ）の決定によって、少なくとも８週間の終点まで経時変化として毎週アッセイした。腫瘍形成に関しては、剖検に際して腫瘍組織が同定されなければ、マウスは腫瘍陰性と考えられた。初代および二次的腫瘍形成の統計学的に有意な差は、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ Ｅｘａｃｔ検定を用いて評価した。腫瘍容量の差は、片側ＡＮＯＶＡを用いて決定し、引き続いて、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正またはＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、引き続いて、Ｄｕｎ補正を行い、両側Ｐ値＜０．０５は有意と考えられた。
インビボ遺伝子系列追跡。前記した磁性ビーズ細胞ソーティングを用いて生じさせたＡＢＣＢ５＋／ＤｓＲｅｄ２およびＡＢＣＢ５−／ＥＹＦＰヒトＧ３３６Ｉ腫瘍細胞集団を、各々、１×１０６および９×１０６細胞の相対的存在比で再度構成し、続いて、異種移植に先立って、二色フローサイトメトリー（Ｆｌ１（ＥＹＦＰ）対Ｆｌ２（Ｄｓｒｅｄ２）プロット）によって得られる細胞比率を決定した。Ｇ３３６１／ＤｓＲｅｄ２およびＧ３３６１／ＥＹＦＰ共培養物を、レシピエントＢａｌｂ／ｃ ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右腹に皮下注射した（１０７細胞／接種物）。異種移植から４または６週間後に、腫瘍を採取し、（接着性組織培養プレートにおける付着に際して）腫瘍由来単一細胞懸濁液の二色フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡によるＤｓＲｅｄ２＋およびＥＹＦＰ＋メラノーマ細胞の相対的インビボ存在量の決定のために、ならびに蛍光顕微鏡による５μｍ凍結組織切片の分析のために、単一細胞懸濁液または凍結組織切片を前記したように調製した。さらなる実験において、ＤｓＲｅｄ２＋およびＥＹＦＰ＋メラノーマ細胞の相対的存在量を、前記したように、二色フローサイトメトリーによってＡＢＣＢ＋５またはＡＢＣＢ５−異種移植片由来細胞サブセットにおいて決定し、ＤｓＲｅｄ２＋およびＥＹＦＰ＋腫瘍細胞のパーセンテージを、不対スチューデントｔ検定を用いて統計学的に比較し、Ｐ＜０．０５の両側Ｐ値は統計学的に有意と考えられた。
抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ標的化。未分離のヒトＧ３３６１メラノーマ細胞を、レシピエントＢａｌｂ／ｂヌードマウスに皮下異種移植した（１０７／接種物）。動物に、メラノーマ異種移植の２４時間前に、抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ（クローン３Ｃ２−１Ｄ１２）、イソタイプ対照ｍＡｂ（５００μｇ／注射）を２週間腹腔内注射、またはＡｂを注射しなかった。腫瘍の成長を、前記したように腫瘍容量（ＴＶ）の決定によって経時変化として２週間毎にアッセイした。腫瘍容量の差は、ノンパラメトリック片側ＡＮＯＶＡ（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定）を用いて決定し、続いて、３つの実験群の比較のためにＤｕｎ補正を行い、両側Ｐ値＜０．０５は有意と考えられた。ヌードマウスメラノーマ異種移植片に対する確立されたヒトへのインビボ投与された抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂの結合効率の決定のために、単一細胞懸濁液および凍結された切片を、抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ、ネズミＩｇＧ１κイソタイプ対照ｍＡｂの腹腔内投与、または処理なしに続いて２４時間後に、メラノーマ異種移植片から生じさせた。調製された単一細胞懸濁液を、引き続いて、ＦＩＴＣコンジュゲート型ヤギ抗マウスＩｇ二次Ａｂと共に４℃にて３０分間インキュベートし、前記した一色フローサイトメトリーによって分析し、凍結された切片をＨＲＰコンジュゲート型ウマ抗マウスＩｇ二次Ａｂと共にインキュベートし、上記のように分析した。
ＡＤＣＣおよびＣＤＣの評価。ＡＤＣＣまたはＣＤＣを、従前に記載されたように、二色フローサイトメトリーによって決定した。簡単に述べれば、無血清ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中のヒトＧ３３６１メラノーマ細胞懸濁液を、製造業者の推奨に従って、３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン（ＤｉＯ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で標識した。次いで、３ｍｌ中の平坦底６ウェル培養プレート中で、ＤｉＯ標識メラノーマ細胞をウェル当たり３００，０００細胞の密度にて平板培養し、加湿インキュベーターにて標準培地中で一晩培養した。その後、ＤｉＯ標識メラノーマ標的細胞を、抗ＡＢＣＢ５またはイソタイプ対照ｍＡｂ（各々、２０μ／ｍｌ）の存在下または非存在下にて、３７℃、５％ＣＯ２にて３０分間プレインキュベートし、引き続いて、ＡＤＣＣの評価のために、新たに単離されたＢａｌｂ／ｃヌードマウスエフェクター脾臓細胞（１２×１０６細胞／ウェル、１：４０のエフェクター細胞に対する標的細胞の比率）の有無にて、またはＣＤＣの決定のために５％Ｂｌａｂ／ｃヌードマウス血清の存在下もしくは非存在下にて、３７℃、５％ＣＯ２にてさらに２４時間共培養した。引き続いて細胞およびその上清を採取し、ＤｉＯ＋ＰＩ＋表現型によって認識される溶解された標的細胞と共に、１０μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＤＮ）の添加に際して直ちに、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて二色フローサイトリーによって分析した。３つの処理群についてのＡＤＣＣレベルは以下のように計算した：ＡＤＣＣ（％）＝（ＤＩＯ＋ＰＩＯ＋パーセント試料陽性）−（平均Ａｂ未処理ＤＩＯ＋ＰＩ＋パーセント試料陽性）。ＡＤＣＣのレベルの差はノンパラメトリック片側ＡＶＯＶＡ（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定）、続いての、Ｄｕｎ補正を用いて決定し、両側Ｐ値＜０．０５は有意と考えられた。
細胞生存率測定。細胞生存率は、カルセイン−ＡＭ染色を用いて異種移植に先立って腫瘍細胞接種物において測定した。簡単に述べれば、１×１０６未分離のＡＢＣＢ５＋、またはＡＢＣＢ５−メラノーマ細胞を、カルセイン−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と共に３７℃および５％ＣＯ２で３０分間インキュベートして、基質摂取および蛍光誘導体に対する酵素的活性化を可能とした。引き続いて、細胞を洗浄し、蛍光測定を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎでのＦｌ２発光スペクトルにおいてフローサイトメトリーによって獲得した。暴露されていない試料と比較して、蛍光カルセイン−ＡＭ誘導体の発生を呈する細胞を生きていると考えた。細胞生存率は、トリパンブルー染色排除方法を用いて全ての試料で決定した。
ＲＮＡ抽出およびリアルタイム定量的逆転写ＰＣＲ。Ｇ３３６１およびＡ３７５ヒトメラノーマ細胞からのＲＮＡ抽出および標準ｃＤＮＡ合成反応は、従前に記載されているように、逆転写ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のためのＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ一本鎖合成システムを用いて行った。従前に記載された条件下で、かつ継代数にて、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで維持されたＮＣＩ−６０パネルの８つのさらなるメラノーマ細胞系（ＬＯＸ ＩＭＶＩ、ＳＫ−ＭＥＬ−５、Ｍ１４、ＵＡＣＣ−６２、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＵＡＣＣ−２５７、ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ）から調製された全ＲＮＡは、ＮＣＩ／ＮＩＨ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍによって提供された。相対的ＡＢＣＢ５遺伝子発現についてのリアルタイム定量的逆転写ＰＣＲを、従前に記載されているように行った。ＡＢＣＢ５発現は、ｎ＝３の独立実験において、全ての試料における平均発現に対する試料中での発現レベルの比率によって評価した。ＮＣＩ−６０パネルからの８つのヒトメラノーマ細胞系についての成長のデータ（培養倍加時間）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって得られたものであり、これはオンラインで見出すことができる（ｈｔｔｐ：／／ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｏｃｓ／ｍｉｓｃ／ｃｏｍｍｏｎ＿ｆｉｌｅｓ／ｃｅｌｌ＿ｌｉｓｔ．ｈｔｍｌ）。Ｇ３３６１およびＡ３７５メラノーマ細胞系についての成長キネティクスは、式：集団倍加時間（ｈ）＝Ｔ２−Ｔ１／（ｌｏｇ２（細胞数Ｔ２／細胞数Ｔ１））（式中、Ｔ２およびＴ１は、対数培養成長相における２つの区別される時点（ｈ）を表わす）に従う細胞集計によって我々の研究所で確立された。相対的ＡＢＣＢ５ ｍＲＮＡ発現および培養倍加時間（ｈ）の直線相関を行い、ピアソン相関係数を計算し、ｐ＜０．０５およびｒ＞０．０３またはｒ＜−０．３の基準を用いて、従前に記載されているように、有意な相関を同定した。
実施例１
我々は、まず、より進行した疾患のマーカーであるＣＤ１６６との密接な関連のため、ＡＢＣＢ５の臨床的悪性メラノーマ進行に対する関係を調べた。これは、ＡＢＣＢ５免疫組織化学染色、および４つの主な診断腫瘍タイプ：良性メラノーマ細胞母斑、初代皮膚メラノーマ、リンパ節へのメラノーマ転移、および内臓へのメラノーマ転移（図１ａ）を表わす、４８０人の患者由来メラノーマ組織コア（０．６ｍｍ）を含有する確立されたメラノーマ進行組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）の定量的イメージ分析を介して評価した。我々は、初代または転移性メラノーマが良性メラノーマ細胞母斑よりもＡＢＣＢ５をより有意に発現し（Ｐ＜０．００１）、厚い初代メラノーマが薄い初代メラノーマよりもよりＡＢＣＢ５を発現し（Ｐ＝０．００４）、およびリンパ節へ転移するメラノーマが初代病変よりもよりＡＢＣＢ５を発現する（Ｐ＝０．００１）ことを見出し、ＡＢＣＢ５を、ヒト悪性メラノーマにおける新形成進行の新規な分子マーカーとして同定した。ＡＢＣＢ５発現における見掛けの不均一性が転移で認められ、内臓転移よりもリンパ節におけるより大きな染色が伴った（Ｐ＝０．０２５）。
実施例２
より小さな一連の外科的に切開された臨床メラノーマ（ｎ＝６患者、表１）に新たに由来する単一細胞懸濁液のフローサイトメトリーによってアッセイすると、ＡＢＣＢ５は、６つの検体のうち６つにおいて終始一貫して発現されることも見出され、ＡＢＣＢ５＋腫瘍細胞頻度は１．６〜２０．４％（９．２±３．２％、平均±ＳＥＭ）の範囲であった（図１ｂ、表１）。より原始的な分子表現型に関連する抗原に関するさらなる表現型特徴付けにより、６つの検体のうち３つにおけるＣＤ２０（全ての試料における頻度：０．３±０．２％、平均±ＳＥＭ）、６つのうち６つにおけるネスチン（３１．９±７．８％）、６つのうち６つにおけるＴＩＥ−１（２４．９±６．９％）、６つのうち４つにおけるＶＥ−カドヘリン（０．２±０．１％）、６つのうち６つにおけるＢＭＰＲ１ａ（１．８±１．０％）、および６つの検体のうち５つにおける間質マーカーＣＤ３１（０．８±０．４％）の有意な発現が明らかとなった（図１ｂ）。幹細胞決定基ＣＤ１３３について従前に同定されたＡＢＣＢ５−亜集団と比較したＡＢＣＢ５＋による優先的な発現が、ここに、ネスチン（各々、４９．４５±６．６％対２６．６±４．９％、平均±ＳＥＭ、Ｐ＝０．０２６）、ＴＩＥ−１（５９．４±７．８％対２３．８±７．５％、Ｐ＝０．０１５）、ＶＥ−カドヘリン（６．４±１．２％対０．１±０．１％、Ｐ＝０．０２９）、およびＢＭＰＲ１ａ（３７．０±４．４対２．０±０．２％、Ｐ＝０．００２）について各マーカーを発現する試料中で示されたが、ＣＤ２０（０．２±０．２％対１．１±０．７％、ＮＳ）またはＣＤ３１（２．４±１．２％対０．５±０．３％、ＮＳ）については示されなかった（図１ｃ）。インサイチュ免疫組織化学により、臨床的腫瘍内の少数派亜集団を占めるＡＢＣＢ５＋単一細胞またはクラスターが明らかにされ、陽性に染色された細胞は、主に非メラニン化未分化領域またはＴＩＥ−１発現に相関し、未反応領域はメラニン化されたより分化した領域に対応した。
表１は、メラノーマ部位（転移または初代再発いずれか）を持つ６人の患者の腫瘍の特徴をまとめる。腫瘍は存在するＡＢＣＢ５＋の％によって定量される。また、未分離のＡＢＣＢ５＋またはＡＢＣＢ５−ヒトメラノーマ細胞の複製（ｎ＝２〜１０）接種物を移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの９つの群についての結果（腫瘍を持つマウスの数）のまとめを示す。
実施例３
ＡＢＣＢ５によって規定されるメラノーマ細胞サブセットがＭＭＩＣについて増大されたか否かを決定するために、我々は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス腫瘍異種移植実験に対してヒトにおける樹立されたクローン皮膚ヒトメラノーマ培養物（Ｇ３３６１：２〜１０％ＡＢＣＢ５陽性；Ａ３７５：１〜１０％陽性、図５ａ）、または新たに患者に由来するメラノーマ細胞（図１ｂ、表１）いずれかを用い、インビボにて腫瘍形成を開始するＡＢＣＢ５＋精製（ＡＢＣＢ５＋）対ＡＢＣＢ５＋枯渇（ＡＢＣＢ５−）メラノーマ細胞の能力を比較した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの群に、腫瘍成長を有効に開始することができない細胞用量（Ｇ３３６１：１０５細胞、Ａ３７５：２×１０４細胞）からＡＢＣＢ５＋細胞を用いた場合に腫瘍形成を終始一貫して開始した用量（Ｇ３３６１：１０７細胞鎖、Ａ３７５：２×１０６細胞、新鮮な患者単離体：１０６細胞）までのｌｏｇ倍範囲にわたって、未分離のＡＢＣＢ５＋またはＡＢＣＢ５−ヒトメラノーマ細胞の複製（ｎ＝２〜１０）接種物を移植した。カルセイン−ＡＭ染色によって決定された細胞生存率は、全ての腫瘍細胞接種物において９０％を超え、単離体の間では有意には異ならなかった（図５ｂ）。
ＡＢＣＢ５−Ｇ３３６１メラノーマ細胞を注射した２２匹の集合マウスのうち、最高の細胞用量で移植された１匹のマウスのみが腫瘍を生じた（図２ａ、左側パネル）。対照的に、最高の細胞用量を注射した全てのマウス（図２ａ、左側パネル、図中で提供された個々の用量特異的比較についてのさらなるＰ値）を含めた、ＡＢＣＢ５＋細胞を注射した２０のうち１３が腫瘍を形成し（Ｐ＞０．０００１）、５０％腫瘍形成（ＴＦ５０）に必要な接種用量の比較によって計算して、この細胞サブセットにおける２ｌｏｇ倍のＭＭＩＣについての増大を示す（図２ａ、中央のパネル）。
同様に、ＡＢＣＢ５−Ａ３７５メラノーマ細胞を注射した２１の集合マウスのうち、８匹のマウスのみが腫瘍を発生し、他方、ＡＢＣＢ５＋細胞を注射した２２匹のマウスのうち１６匹が腫瘍を形成し（Ｐ＜０．０５）、ＡＢＣＢ５＋Ａ３７５細胞の中でＭＭＩＣについて＞１ ｌｏｇ倍の増大を示す（図２ｂ、左側および中央パネル）。ＡＢＣＢ５＋細胞精製の結果、Ｇ３３６１メラノーマ細胞を用いて代表的な試料においてアッセイした場合に、未分離培養物における５．０±０．４％〜９９．８±０．８％（平均±ＳＤ、ｎ＝３、Ｐ＜０．００１）までのＡＢＣＢ５＋細胞頻度の１９．８倍増大がもたらされ、ＡＢＣＢ５＋枯渇の結果、５．０±０．４％〜１．１±０．３％（平均±ＳＤ、ｎ＝３、Ｐ＜０．００１）までのＡＢＣＢ５＋細胞頻度の４．７５倍低下がもたらされた（図５ｃ）。ＡＢＣＢ５＋細胞でのこの残存汚染（天然に生じるＡＢＣＢ５＋頻度の２２％）は、最高用量におけるＡＢＣＢ５−接種による観察された腫瘍形成を占めることができ、ＡＢＣＢ５＋集団の中でＭＭＩＣ増大の潜在的過小評価を示唆する。顕著なことには、最高細胞用量において、腫瘍形成がＡＢＣＢ５−細胞注射の結果として実際に起こった場合、腫瘍はＡＢＣＢ５＋異種移植片に由来するものよりも小さなことが終始一貫して判明した（Ｇ３３６１：各々、腫瘍容量（ＴＶ）＝１５±１５対２８６±９０ｍｍ３、平均±ＳＥＭ、Ｐ＜０．０１；Ａ３７５：各々、ＴＶ＝２３９±７０対８３２±１２１ｍｍ３、平均±ＳＥＭ、Ｐ＜０．０５）（図２ａおよび２ｂ）。
メラノーマ培養異種移植片は不均一であり、非メラニン化領域およびＶＥ−カドヘリン発現に主として相関するＡＢＣＢ５＋細胞およびメラニン化領域に対応するＡＢＣＢ５−領域を含んだ（図２ｃ）。ＡＢＣＢ５＋由来初代腫瘍から再度精製されたＡＢＣＢ５＋細胞は、各々、１１レシピエントのうち１１対１２レシピエントのうち７におけるそのＡＢＣＢ５−カウンターパートよりもより有効に二次腫瘍を形成し（Ｐ＝０．０３７）（図２ｄ）、初代腫瘍不均一性を再度樹立した。クローンメラノーマモデル系を用いて得られた結果と合致して、１０６の新たに患者から誘導されたＡＢＣＢ５−メラノーマ細胞を注射した９匹のレシピエントマウスのうち１匹のみが腫瘍を発生し、他方、１０６のＡＢＣＢ５＋メラノーマ細胞の９匹のレシピエント全てが腫瘍を形成し（Ｐ＜０．００１）、ＡＢＣＢ５−対ＡＢＣＢ５＋接種のレシピエントにおいてより小さな平均ＴＶであった（各々、ＴＶ＝２±２対３５±１１ｍｍ３、平均±ＳＥＭ、Ｐ＜０．０１）（図２ｅ、表１）。ＡＢＣＢ５＋メラノーマ細胞から生じた腫瘍は、解離性のある腫瘍検体の免疫組織化学およびフローサイトメトリーによって決定されるように、ＡＢＣＢ５発現に関して天然に生じる腫瘍不均一性を再度樹立し、ＡＢＣＢ５陽性は２〜８％の範囲であった（結果は示さず）。これらの知見は、ＭＭＩＣ頻度が、ＡＢＣＢ５によって規定されたメラノーマ少数派集団において顕著に増大されることを確立する。
実施例４
共異種移植したＡＢＣＢ５＋およびＡＢＣＢ５−亜集団の相対的腫瘍成長寄与を直接的に調べ、かつＡＢＣＢ５＋自己更新および分化能力をさらに調査するために、我々は、インビボ遺伝子的系列追跡を可能とするために我々の実験室で設計されたモデル系である、各々、赤色蛍光蛋白質（ＤｓＲｅｄ２）または増強された黄色−緑色蛍光蛋白質（ＥＹＦＰ）いずれかを発現する安定にトランスフェクトされたＧ３３６１細胞系変異体からＡＢＣＢ５＋またはＡＢＣＢ５−メラノーマ細胞を単離した。我々は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの、各々、１４．０±３．０％および８６．０±３．０％相対的存在量（平均±ＳＤ、ｎ＝６）において再構成されたＡＢＣＢ５＋Ｇ３３６１／ＤｓＲｅｄ２およびＡＢＣＢ５−Ｇ３３６１／ＥＹＦＰ蛍光色素トランスフェクタント共培養物の異種移植の結果、６週間の実験終点における５１．３±１．４％の頻度までの、接種物と比較した実験的腫瘍におけるＡＢＣＢ５＋起源のＤｓＲｅｄ２＋腫瘍細胞の時間依存的系列的に増大する相対的頻度（回帰直線の傾き６．４±１．０、Ｐ＜０．０００１）をもたらした（図３ａ、３ｂおよび３ｃの頂部および底部パネル）。これらの知見によって、競合腫瘍発生モデルにおける、ＡＢＣＢ５＋対共異種移植ＡＢＣＢ５−メラノーマバルク集団のより大きな腫瘍原性を確立した。重要なことには、これらの結果は、腫瘍開始細胞が、さらに、より効率は低いにもかかわらず、より分化した、それ自身の非腫瘍形成性癌についてバルク集団を駆動し、成長する腫瘍塊に寄与することをさらに示す。実験的腫瘍はＤｓＲｅｄ２／ＥＹＦＰ二重陽性メラノーマ細胞（図３ｃ、中央パネル）も含有し、ＡＢＣＢ５＋由来腫瘍細胞が、生理学的ＡＢＣＢ５＋皮膚前駆体（（Ｆｒａｎｋ，Ｎ．Ｙ．ら、ｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ ｂｙ ＡＢＣＢ５ Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８，４７１５６−６５（２００３））と同様に、ＡＢＣＢ５−サブセットとの細胞融合に関わることを示す。
実施例５
１０％ＡＢＣＢ５＋Ｇ３３６１／ＤｓＲｅｄ２および９０％ＡＢＣＢ５−Ｇ３３６１／ＥＹＦＰ蛍光色素トランスフェクタントとの共異種移植から得られる実験的腫瘍からＡＢＣＢ５＋メラノーマ細胞を精製した場合、我々は、蛍光細胞の９２．９±６．４％（平均±ＳＤ、ｎ＝３）がＤｓＲｅｄ２＋表現型（ＡＢＣＢ５＋起源）であることを見出し（図３ｄ、上方左側パネル）、この細胞サブセットの自己更新能力が示される。ＡＢＣＢ５＋単離体の中では、ＥＹＦＰ＋細胞は有意なレベルで見出されず（７．１±６．４％、平均±ＳＤ、ｎ＝３）、観察されたより低い頻度は、共移植されたＡＢＣＢ５−ＥＹＦＰ＋集団の中で測定された残存ＡＢＣＢ５＋細胞汚染によって大きさが十分に占められ（９０％ＥＹＦＰ細胞の１．１％＝０．９９％に対して接種における１０％ＡＢＣＢ５＋ＤｓＲｅｄ２＋細胞）、ＡＢＣＢ５＋腫瘍細胞がＡＢＣＢ５＋接種から生じたにすぎず、ＡＢＣＢ５−細胞は専らＡＢＣＢ５−子孫を生起することを示す。さらに、蛍光ＡＢＣＢ５−腫瘍細胞単離体は、５２．５±０．８％（平均±ＳＤ、ｎ＝３）のＤｓＲｅｄ２陽性（ＡＢＣＢ５＋起源）および４７．５±０．８％のＥＹＦＰ陽性（ＡＢＣＢ５−起源）を呈し（図３ｄ、下方左側パネル）、ＡＢＣＢ５＋メラノーマ細胞が、分化し、ＡＢＣＢ５−腫瘍集団を生起させる能力を保有することを示す。これらの知見は、ＭＭＩＣが増大化されたＡＢＣＢ５＋メラノーマ細胞が自己更新し、より分化したＡＢＣＢ５−腫瘍子孫を生起させるという腫瘍ヒエラルキーの存在を示す。
実施例６
未分離腫瘍バルク集団を異種移植した場合に、ＡＢＣＢ５規定ＭＭＩＣ増大化少数派集団が腫瘍原性に必要とされるか否かをメカニズム的に解明するために、我々は、この細胞サブセットの選択的殺傷が腫瘍の成長および形成を阻害できるか否かを調べた。腫瘍開始細胞の予測分子マーカーは、腫瘍成長のインビボ阻害について今日標的化されていない。我々は、ヒトにおいてＡＢＣＢ５に向けられたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をヌードマウスメラノーマ異種移植片モデルに投与した。なぜならば、ＮＯＤ／ＳＣＩＤと反対に、ヌードマウスは抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）媒介腫瘍細胞殺傷が可能であるからである。メラノーマ細胞をレシピエントＢａｌｂ／ｃヌードマウスに皮下異種移植し、該動物に、メラノーマ異種移植の２４時間前に、抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ、または対照ｍＡｂを２週間毎に皮下注射し、経時変化としてのＴＶ測定によって腫瘍の形成および成長を系列的に評価した。抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂの投与の結果、５８日の観察期間にわたって対照ｍＡｂ処理または未処理マウスで決定されたのと比較して有意に阻害された腫瘍成長がもたらされた（抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ処理（ｎ＝１１マウス、観察期間の間に死滅なし）対対照ｍＡｂ処理（ｎ＝１０マウス、観察期間における１つの死滅を排除）または対未処理（ｎ＝１８マウス、観察期間における１つの死滅を排除）：各々、２３±１６対３２５±７８ｍｍ３、Ｐ＜０．０１、または対２９５±９４ｍｍ３、Ｐ＜０．００１、平均±ＳＥＭ）（図４ａ）。対照ｍＡｂ処理は、処理無しと比較して腫瘍成長の有意な差を示さなかった（図４ａ）。抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ処理は、メラノーマ細胞異種移植に続いて５８日に評価した腫瘍形成を有意に阻害し、１１の抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ処理マウスのうち３のみにおいて、対して１０の対照ｍＡｂ処理マウスのうち１０において、および１８の未処理対照動物のうち１８において腫瘍が検出された（各々、Ｐ＜０．０１およびＰ＜０．００１）（図４ｂ）。
実施例７
未処理ヌードマウスにおいて成長したヒトメラノーマ異種移植片は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤレシピエントにおけるものと同様に、腫瘍不均一性を呈し、未分化の非メラニン化領域、分化したメラニン化領域に対応するＡＢＣＢ５領域と主として相関するＡＢＣＢ５＋細胞の少数派集団を含む（図４ｃ）。インビボ結合効率の分析により、フローサイトメトリーによって（図４ｄ）、また陽性に染色する細胞クラスターの検出による免疫組織化学によって、異種移植片由来細胞懸濁液において定量的に決定されるように、ＡＢＣＢ５＋腫瘍細胞サブセットと大きさにおいて合致して（図４ｃ）、対照ｍＡｂではなく、全身投与された抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂが樹立されたメラノーマ異種移植片において腫瘍細胞のサブセットに結合した（図４ｄ）ことが明らかにされた。
実施例８
腫瘍の形成および成長の抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ媒介阻害のメカニズムを決定するために、免疫エフェクター応答ＡＢＣＣおよび補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を、従前に記載された二色フローサイトメトリーによって評価した。抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ処理、対照ｍＡｂ処理または未処理メラノーマ標的培養物を緑色蛍光膜色素ＤｉＯで標識し、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス脾臓に由来する未標識エフェクター免疫細胞または血清との共培養に続いて、赤色蛍光ヨウ化プロピジウム（それに対して溶解した細胞のみが浸透するＰＩ）で逆染色した。イソタイプ対照ｍＡｂではなく、抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂは、ＤｉＯ／ＰＩ二重陽性細胞のパーセンテージから決定されるように、ＡＢＣＢ５−発現サブセットとサイズが匹敵するメラノーマ亜集団（Ｆｒａｎｋ，Ｎ．Ｙ．ら、ＡＢＣＢ５−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５，４３２０−３３（２００５））において、ＡＤＣＣ媒介メラノーマ標的細胞の死滅を有意に誘導した（各々、２．１±０．４％対０．２±０．２％、Ｐ＜０．０５）（図４ｅ）。エフェクター細胞の非存在下におけるＡｂ処理培養への血清の添加、またはこれらの実験条件下での抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ単独の添加は、対照と比較して有意な細胞死滅を誘導せず（結果は示さず）、ＣＤＣまたは直接的毒性ｍＡｂ効果はこの実験系において腫瘍要害の有意な原因ではないことを示唆する。
樹立されたヒト対ヌードマウスメラノーマ異種移植片に対するＡＢＣＢ５標的化の効果（３つの区別される患者から得られたｎ＝１３、および樹立されたメラノーマ培養から得られたｎ＝１０）を調査して、ＡＤＣＣ媒介ＡＢＣＢ５＋細胞排除を介するＭＭＩＣについての陰性選択は腫瘍の成長を阻害するという仮説を検定した。そのような結果は、ＡＢＣＢ５＋メラノーマサブセットが頑強な腫瘍原性に対して臨界的である場合、動的インビボ状況において観察されるであろう。
異種移植実験で用いたＡＢＣＢ５＋またはＡＢＣＢ５−ヒトメラノーマ細胞の特徴付けを試みた。インビボ抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ投与は、異種移植片が樹立されると（０日）、腫瘍細胞接種から１４日後に開始し、２１日の処理期間にわたってイソタイプ対照ｍＡｂ処理または未処理群で観察された有意な腫瘍成長を排除し（各々、Ｐ＜０．００１およびＰ＜０．００１）、対照ｍＡｂ処理または未処理マウスいずれかにおいて決定されたのと比較して平均腫瘍容量を有意に阻害した（抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ処理（ｎ＝２３マウス）対対照ｍＡｂ処理（ｎ＝２２マウス）、または対未処理（ｎ＝２２マウス）についてのＴＶ：各々、３２．７±９．４対２２６．６±５３．８ｍｍ３、Ｐ＜０．００１、または対１６５．４±３６．９ｍｍ３、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、Ｐ＜０．０１）。ＡＢＣＢ５ ｍＡｂの阻害効果は、新たに患者に由来するメラノーマ異種移植片腫瘍のサブセットが独立して分析された場合にも統計学的に有意であり、イソタイプ対照ｍＡｂ処理または未処理群で観察された有意な腫瘍成長の排除を伴い（各々、Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．００１）、対照ｍＡｂ処理または未処理いずれかにおいて決定されたのと比較して平均ＴＶを有意に阻害した（抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ処理 （ｎ＝１３マウス）対対照ｍＡｂ処理（ｎ＝１２マウス）または対未処理（ｎ＝１２マウス）：各々、２９．６±９．２対２８９．２±９１．８ｍｍ３、Ｐ＜０．０５、または対２２２．９±５７．５ｍｍ３、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、Ｐ＜０．００１）。対照ｍＡｂ処理は、分析した群のいずれかにおける処理無しと比較して、腫瘍成長または腫瘍容量に対して有意な効果を示さなかった。患者由来腫瘍対照群（測定された最大ＴＶ：９７１．５ｍｍ３）における腫瘍負荷および疾患状態のため、適用可能な実験動物プロトコルによって必要とされる処理間隔に従って動物を犠牲とした。
抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ処理患者由来メラノーマ異種移植片の免疫組織化学分析により、隣接切片におけるインビボ結合抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂに対応するＡＢＣＢ５発現（細胞の総じて＜１％）の小さな病巣のみが明らかとされた。ＣＤ１１ｂについて染色されたさらなる隣接切片は、抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ局所化の領域に対応するマクロファージ浸潤を明らかにし、これは、細胞変性および壊死の領域の境界を頻繁に形成した。対照的に、対照ｍＡｂ処理異種移植片により、１０〜１５％ＡＢＣＢ５−反応性細胞が明らかにされ、二次抗Ｉｇ ｍＡｂは隣接する切片において各領域に局所化されなかったが、血管内マウス免疫グロブリンの領域を検出し、ＣＤ１１ｂ＋マクロファージは腫瘍組織を浸潤させなかった。同様な効果が、抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ処理対イソタイプ対照ｍＡｂ処理動物における増強された腫瘍壊死と共に、細胞系由来メラノーマ異種移植片で観察された（各々、３０〜４０％対＜５％壊死細胞）。これらの知見は、ＡＢＣＢ５−規定ＭＭＩＣ増大化少数派集団が腫瘍原性に必要であるという考えをさらに支持する。
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに対するＧ３３６１メラノーマ異種移植片の特徴付けを行った。ＡＢＣＢ５＋領域はメラニン化されていない領域と共に分離し、他方、ＡＢＣＢ５−領域は、粒状茶色−黒色メラニン化を示す領域と相関する。抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂで処理し、かつ抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ、二次抗Ｉｇ ＡｂまたはＣＤ１１ｂ ｍＡｂで染色された異種移植片の免疫組織化学により、前記したのと合致する結果が明らかにされた。初代患者由来異種移植片におけるように、隣接腫瘍切片の免疫組織化学分析により、全身投与された抗ＡＢＣＢ５ ｍＡｂはＡＢＣＢ５＋腫瘍領域に結合し、これはまたＣＤ１１ｂ＋細胞浸潤と相関することが明らかにされた。インビボ投与された抗体がそれに対して局所化されず、かつＣＣＤ１１ｂ−陽性細胞がその中に浸潤しなかったＡＢＣＢ５発現の稀な領域も検出された。
実施例９
抗体３Ｃ１ １Ｄ１２の配列決定：全ＲＮＡは、Ｆｕｓｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｌｔｄの社内ＲＮＡ抽出プロトコルを用いてペレットから抽出した。ｃＤＮＡは、オリゴ（ｄＴ）プライマーでの逆転写によってＲＮＡから作製した。モノクローナル抗体ＤＮＡの重鎖（ＨＣ）可変領域（ＶＲ）および軽鎖（ＬＣ）ＶＲ領域を増幅するために可変ドメインプライマーを用いるＰＣＲ反応は、図７に示されるバンドを与えた。ＨＣおよびＬＣ ＶＲ ＰＣＲ産物の双方をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ配列決定ベクターｐＣＲ２．１にクローン化し、ＴＯＰ１０細胞に形質転換した。重鎖および軽鎖についての陽性クローンを、配列決定分析のために選択した。以下の配列が得られた。
１．シグナル配列（下線を施す）を含めた全長ＨＣのＤＮＡ配列
２．シグナル配列（下線を施す）を含めた全長ＬＣのＤＮＡ配列
３．ＣＲＤ（下線を施す）ＨＣ ＶＲのＤＮＡ配列
４．ＣＲＤ（下線を施す）ＬＣ ＶＲのＤＮＡ配列
５．マークしたフレームワーク領域（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、およびＦ４）およびＣＲＤ（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含めたＨＣ ＶＲのアミノ酸配列。フレームワークおよびＣＤＲ領域はＫａｂａｔ命名法に従って決定する。（Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，ＮＩＨ）。
６．マークされたフレームワーク領域（マークしたフレームワーク領域（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、およびＦ４）およびＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含めたＨＣ ＶＲのアミノ酸配列。フレームワークおよびＣＤＲ領域はＫａｂａｔ命名法に従って決定する（Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，ＮＩＨ）。
７．ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３配列：
ＣＤＲ−Ｈ１： ＤＹＹＭＹ 配列番号３
ＣＤＲ−Ｈ２： ＴＩＮＤＧＧＴＨＴＹ 配列番号４
ＣＤＲ−Ｈ３： ＤＤＹＹＹＧＳＨＦＤＡＭＤＹ 配列番号５
８．ＣＤＲ−Ｌ１、 ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３配列：
ＣＤＲ−Ｌ１： ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹＭＨ 配列番号６
ＣＤＲ−Ｌ２： ＬＶＳＮＬＥＳ 配列番号７
ＣＤＲ−Ｌ３： ＱＨＩＲＥＬＴＲ 配列番号８
実施例１０：将来の研究
我々は、ａ）ヒトメラノーマの２つの相補的源（樹立されたヒトメラノーマ細胞系、ならびに初代および転移性ヒト腫瘍に由来する新たに単離されたメラノーマ細胞）；ｂ）これらの細胞の実験のための２つのモデル系（免疫欠陥マウスにおける腫瘍形成性、およびそれが真性ヒト皮膚異種移植片で起こるのでより関連性のある腫瘍形成性の皮膚スクリーニング）；およびｃ）メラノーマ幹細胞排除のための２つの別の戦略（ＡＢＣＢ５機能的遮断を介する化学増感、およびＡＢＣＢ５＋幹細胞標的に特異的に送達されたイムノトキシンまたは阻害性ｓｉＲＮＡを介する幹細胞殺傷）を使用することによって、メラノーマの成長および進行に影響する能力を研究するであろう。
我々は、ＡＢＣＢ５標的化メラノーマ幹細胞化学的耐性逆転もまた、インビボにて、キメラＲａｇ２−／−マウス／ヒト皮膚異種移植片における腫瘍開始／進行を阻害することができるか否かを調べるであろう。
腫瘍標的化イムノトキシンは、腫瘍部位特異的抗原に向けられたｍＡｂを、毒素、放射性核種および成長因子のような別の無差別に細胞傷害性の薬剤にコンジュゲートすることによって首尾よく構築されている。提案された研究について、我々は、１つのそのような分子、ゲロニン、２９ｋＤａリボソーム不活性化植物毒素の利用にまず焦点を当てるであろう。なぜならば、ゲロニンは、メラノーマ特異的抗原に向けられたイムノコンジュゲートに用いた場合、この提案においても使用されたＡ３７５ヒトメラノーマ異種移植片モデルにおいて腫瘍特異的細胞傷害性を発揮することが既に示されており、ゲロニンイムノコンジュゲートは臨床的開発のための優れた候補であることを示す。他の将来の研究において、我々は、抗メラノーマ効果を発揮することが知られている、例えば、イットリウムに関連する放射線核種イムノコンジュゲートを研究することも考えている。インビボにてＡＢＣＢ＋メラノーマ異種移植片亜集団を選択的に排除するための戦略としてＡＢＣＢ５標的化ゲロニンイムノトキシンを用いる場合、ＡＢＣＢ５標的化ゲロニンイムノトキシンは、従前に記載されたように合成され、精製された、ゲロニン／抗ＡＢＣＢ５ ３Ｃ２−１Ｄ１２ ｍＡｂまたはゲロニン／イソタイプ対照ｍＡｂ化学的コンジュゲートを含むであろう。さらに、腫瘍貫入に関する無傷ｍＡｂイムノコンジュゲートの潜在的制限のため、我々はまた、スプライス重複延長ＰＣＲ方法を用いて、前記したように生じた、抗ＡＢＣＢ５ ３Ｃ２−１Ｄ１２ ｓＦｖ遺伝子のゲロニンＤＮＡへの融合によって構築されるであろう組換え抗ＡＢＣＢ５ ３Ｃ２−１Ｄ１２ ｓＦｖ／ゲロニン融合蛋白質を用いるであろう。組換え融合イムノトキシンを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、従前に記載されているように精製するであろう。組換え対照ｓＦｖ／ゲロニン融合蛋白質を、イソタイプ対照ｍＡｂ産生ネズミハイブリドーマ細胞系から同一手法で生じさせるであろう。
我々はまた、インビボにてＡＢＣＢ５＋メラノーマ腫瘍幹集団を選択的に阻害する戦略として、ｓｉＲＮＡの特異的癌遺伝子へのＡＢＣＢ５抗体媒介標的細胞特異的送達を開発し、それを用いるであろう。細胞への小干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達は、最近まで、そのインビボ治療適用に対して鍵となる障害であったが、ｓｉＲＮＡ送達ビヒクルとしての抗体／プロタミン融合蛋白質に関連する新規なアプローチが、インビボでの実験動物モデルにおいてメラノーマ腫瘍への全身細胞型特異的ｓｉＲＮＡ送達における有効性を最近示しており、ＭＹＣ、ＭＤＭ２およびＶＥＧＦに向けられたｓｉＲＮＡを、Ｂ１６ネズミメラノーマ細胞で発現されたモデル受容体に抗体標的化した場合、インビボメラノーマ成長を阻害するのに有効であることが判明した。このアプローチは、通常は、精子中のＤＮＡを核形成して、種々の特異性のｓｉＲＮＡに結合し、プロタミンがそのようなマーカーに特異的に向けられた抗体Ｆａｂ断片またはｓＦｖに融合した場合、特異的細胞表面マーカーを有する細胞にそれらを送達する、プロタミンの核酸結合特性を利用する。この戦略を利用して、ＡＢＣＢ５発現メラノーマ幹細胞を標的化するために、我々は、スプライス重複延長ＰＣＲ方法を用いて、抗ＡＢＣＢ５ ３Ｃ２−１Ｄ１２ ｓＦｖ遺伝子のプロタミンＤＮＡへの融合によって、組換え抗ＡＢＣＢ５ ３Ｃ２−１Ｄ１２ ｓＦｖ／プロタミン融合蛋白質（ＡＢＣＢ５ ｓＦｖ−Ｐ）を構築するであろう。組換え融合蛋白質ＡＢＣＢ５ ｓＦｖ−Ｐは従前に記載されたように発現され、精製されるであろう。ＡＢＣＢ５ ｓＦｖ−Ｐは、最初に、ＭＹＣに標的化されたｓｉＲＮＡを送達するのに用いられるであろう。というのは、遺伝子標的化ＭＹＣダウンレギュレーションは、ネズミＢ１６メラノーマにおけるのみならず、樹立されたヒトメラノーマ異種移植片を有するマウスにおいて、インビボ腫瘍成長を阻害し、ｐ５３の誘導およびＢｃｌ−２蛋白質の阻害を介する広範な腫瘍細胞アポトーシスに導くからである。我々は、既に、ＡＢＣＢ５＋ヒトメラノーマ亜集団において終始一貫して発現されるＭＹＣを見出している。さらに、ヒトＭＹＣの遺伝子発現はＲＮＡｉアプローチによって有効に阻害することができ、これらの研究において確証されたＭＹＣ標的化ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドはＤｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）から商業的に入手可能である。提案された研究において、ＭＹＣ ｓｉＲＮＡについてのＡＢＣＢ５ ｓＦｖ結合能力、ＡＢＣＢ５ ｓＦＶ−Ｐ−媒介ＭＹＣ ｓｉＲＮＡ標的細胞送達、および得られたＭＹＣ遺伝子の阻害、ならびに腫瘍細胞増殖のＡＢＣＢ５ ｓＦｖ−Ｐ／ＭＹＣ ｓｉＲＮＡ媒介遮断を、正確に従前に記載されたように、ヒトＧ３３６１およびＡ３７５メラノーマ培養物においてインビトロでまず調べられるであろう。
ＡＢＣＢ５＋メラノーマ幹細胞標的化のためのインビボ実験プロトコルでは、正確に既に前記したように、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス、ならびに樹立された細胞系に由来する、またはヒト患者から新たに単離されたいずれかのヒトメラノーマ異種移植片のレシピエントとしてのキメラＲａｇ２−／−／ヒト皮膚キメラマウス双方を利用するヒト対マウス腫瘍異種移植片モデルを使用するであろう。腫瘍開始に対するイムノトキシン（ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ／ゲロニンまたはｓＦｖ／ゲロニン）、またはＡＢＣＢ５ ｓＦｖ−Ｐ／ＭＹＣ ｓｉＲＮＡの効果を評価することを目的とする実験の最初の組において、イムノトキシン（ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ／ゲロニンまたはｓＦｖ／ゲロニンまたは対照）は、尾静脈注射を介して０．２５ｍｌの滅菌ＰＢＳ中で投与され、ＭＹＣ ｓｉＲＮＡに複合体化されたＡＢＣＢ５ ｓＦｖ−Ｐまたは対照は尾静脈注射（１：６のＡＢＣＢ５ ｓＦｖ−Ｐ／全ｓｉＲＮＡのモル比率における１００μｌの注射容量中の８０μｇ ｓｉＲＮＡ）を介して腫瘍移植から０、１および３日後に、以下の処理および対照群への異種移植後０日にランダム化されたヒトメラノーマ細胞異種移植片のネズミレシピエントに投与されるであろう（各メラノーマ細胞系について、およびＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下、またはヒト皮膚／Ｒａｇ２−／−／マウスキメラに皮内異種移植されたｎ＝１０初代メラノーマおよびｎ＝１０転移の各々から新たに単離された各腫瘍細胞検体についてｎ＝１０複製動物）；１）０日目に開始する、ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ／ゲロニン ５００μｇ／マウスｉ．ｖ．ｑ．ｏ．ｄ．；２）０日目に開始する、イソタイプ対照ｍＡｂ／ゲロニン ５００μｇ／マウスｉ．ｖ．ｑ．ｏ．ｄ．；３）０日目に開始する、ＡＢＣＢ５ ｓＦｖ／ゲロニン ５００μｇ／マウスｉ．ｖ．ｑ．ｏ．ｄ．；４）０日目に開始する対照ｓＦｖゲロニン ５００μｇ／マウスｉ．ｖ．ｑ．ｏ．ｄ．；５）０、１および３日目における、ＡＢＣＢ５ ｓＦｖ−Ｐ／ＭＹＣ ｓｉＲＮＡ ｉ．ｖ．；６）０、１および３日目における、ＡＢＣＢ５ ｓＦｖ−Ｐ／対照ｓｉＲＮＡ ｉ．ｖ．；７）０、１および３日目における、ＡＢＣＢ５ ｓＦｖ−Ｐ／ｉ．ｖ．。処理プロトコルを表２にまとめる：
樹立された腫瘍の腫瘍進行に対するイムノトキシン（ＡＢＣＢ５ ｍＡｂ／ゲロニンまたはｓＦｖ／ゲロニン）、またはＡＢＣＢ５ ｓＦｖ−Ｐ／ＭＹＣ ｓｉＲＮＡの効果を評価することを目的とする実験の第二の組において、ヒトメラノーマ細胞異種移植片のマウスレシピエントは、表７にまとめられた処理および対照群へ、（腫瘍が樹立された場合）異種移植後７日目にランダム化されるであろう（各メラノーマ細胞系について、およびＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、皮下、またはヒト皮膚／Ｒａｇ２−／−／マウスキメラに皮内異種移植された、ｎ＝１０初代メラノーマおよびｎ＝１０メラノーマ転移の各々から新たに単離された各腫瘍細胞検体について、ｎ＝１０複製動物）：
臨床的腫瘍形成／成長は、実験の長さ（４５日）について、確立された式［ＴＶ（ｍｍ３）＝π／６×０．５×長さ×（幅）２］に従って腫瘍容量（ＴＶ）の決定によって経時変化として毎日アッセイされるであろう。適用された処理養生法の関数としての腫瘍形成の統計学的に有意な差は、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ Ｅｘａｃｔ検定を用いて評価されるであろう。実験群の間の腫瘍容量の差は、ノンパラメトリックＡＮＯＶＡを用いて決定されるであろう。両側Ｐ値＜０．０５は統計学的に有意と考えられるであろう。実験の４５日目に最初に犠牲とした全ての処理群の動物から切開された各移植された腫瘍異種移植片の免疫蛍光および免疫組織化学分析（［例えば、１０、２０、３０および４５日における］順次の犠牲は、４５日目の知見に基づいて行われ、初代腫瘍の調査に加えて、犠牲にした動物を剖験し、全ての転移を評価し、全ての組織を、適用された処理養生法によって媒介される毒性の証拠について病理学的に評価した）。ＡＢＣＢ５の発現、およびＡＢＣＢ５のＣＤ１３３との共発現は、従前に記載されているように、凍結されたメラノーマ異種移植片切片の順次のＨＲＰ／ＡＰ免疫酵素二重染色によってアッセイされるであろう。腫瘍切片は明視野顕微鏡観察によって分析され、各マーカーについての細胞染色陽性の平均パーセンテージは、従前に記載されているように、各染色条件につき、３つの顕微鏡観察視野（倍率４００×）における細胞数に基づいて半定量的に分類されるであろう（陽性なし：−；＜１０％陽性：＋；１０〜５０％陽性：＋＋；＞５０％陽性：＋＋）。蛍光顕微鏡観察および各蛍光色素のための別々のフィルターを用い、ＲＦＰ陽性細胞（ＡＢＣＢ５＋起源）およびＧＦＰ陽性細胞（ＡＢＣＢ５−起源）を合計し（１００細胞／試料）、各腫瘍内のＲＦＰ／ＧＦＰ細胞比率が計算されるであろう。各処理養生法に付された複製動物に由来する平均比率は、ノンパラメトリックＡＮＯＶＡを用いて統計学的に比較されるであろう。ＡＢＣＢ５＋標的化戦略の有効性を評価するために、ネズミ皮下組織、ヒト皮膚異種移植片において、および転移の部位において成長するアポトーシスメラノーマ細胞は、光学顕微鏡観察に用いられる確立された基準に従って同定され、ＴＵＮＥＬアッセイによって確認されるであろう。我々はまた、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−２、およびＢｃｌ−ＸＬを含めた、アポトーシス経路に関連する蛋白質発現について免疫組織化学的にスクリーニングするであろう。最後に、これらの結果は、細胞増殖関連マーカー（ＭＩＢ−１、ＰＣＮＡおよびサイクリンＤ１／Ｄ３）についてのスクリーニングと相関されるであろう。陽性細胞は断面プロフィールにわたって手動で、および定量の効率をかなり高める共同ＰＩ研究所（ＧＦＭ）において利用可能なコンピューター援助イメージングプログラムの使用によって列挙されるであろう。
本発明の少なくとも１つの実施形態のいくつかの態様をかくして記載してきたが、種々の改変、修飾および改良は当業者に思いつくものであろうと認識されるべきである。そのような改変、修飾、および改良は本開示の一部であることが意図され、本発明の精神および範囲内のものであることが意図される。従って、これまでの記載および図面は単に例である。

Claims (4)

  1. 癌を有する被験体に全身投与するために製剤化された、癌を有する被験体を治療するための組成物であって、該組成物は、有効成分が抗ＡＢＣＢ５抗体からなり、該抗ＡＢＣＢ５抗体は、以下：
    ａ）免疫グロブリン重鎖可変ドメインであって、ここで（ｉ）ＣＤＲ１−Ｈ１は配列番号３のアミノ酸配列を含み；（ｉｉ）ＣＤＲ２−Ｈ２は配列番号４のアミノ酸配列を含み；および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３−Ｈ３は配列番号５のアミノ酸配列を含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、かつ
    ｂ）免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであって、ここで（ｉ）ＣＤＲ１−Ｌ１は配列番号６のアミノ酸配列を含み；（ｉｉ）ＣＤＲ２−Ｌ２は配列番号７のアミノ酸配列を含み；および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３−Ｌ３は配列番号８のアミノ酸配列を含む、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをさらに含む、組成物。
  2. 前記抗ＡＢＣＢ５抗体が、配列番号１の重鎖可変ドメインと配列番号２の軽鎖可変ドメインとを含む、少なくとも２つの抗体可変ドメインを含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記抗ＡＢＣＢ５抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記抗ＡＢＣＢ５抗体が、ＡＢＣＢ５に特異的に結合する可変ドメイン、および定常ドメインを含むキメラ抗体であり、ここで、該可変ドメインおよび該定常ドメインは異なる種からのものである、請求項１に記載の組成物。
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